JP2006311857A - Recombinant antibotulinum neurotoxin antibody - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はボツリヌス感染症、ボツリヌス神経毒素中毒症に関する疾患の治療に有用であるボツリヌス神経毒素（BoNTと称すこともある）に対する中和活性を有する遺伝子組換え抗体、該抗体を生産する細胞株、及び該抗体を用いた治療剤に関する。さらには、このような有用な遺伝子組換え抗体の作製に有効なＨ鎖及びＬ鎖の可変領域をコードするＤＮＡ断片に関する。 The present invention relates to a recombinant antibody having neutralizing activity against botulinum neurotoxin (sometimes referred to as BoNT), which is useful for the treatment of botulinum infections and diseases related to botulinum neurotoxinosis, a cell line producing the antibody, And a therapeutic agent using the antibody. Furthermore, the present invention relates to a DNA fragment encoding the variable region of the heavy chain and light chain that is effective for producing such useful recombinant antibodies.
ボツリヌス中毒は、グラム陽性有芽胞性のボツリヌス菌が産生する蛋白性毒素を経口的に接種することにより起こる食餌性中毒と、一歳未満の乳児の腸管内で芽胞が発芽、増殖し、その際産生される毒素により起こる乳児ボツリヌス症に大別される。いずれの中毒においても、毒素は末梢の興奮性シナプスに作用し、神経伝達物質の遊離を阻害することにより弛緩性麻痺を引き起こす。ボツリヌス中毒は他の細菌性食中毒と比べ発生例は稀であるが、致死率がきわめて高く、我が国ではヒトの食餌性中毒事例が報告されている。また、最近ではその高い致死性ゆえにバイオテロの手段として使用されることが懸念されている。現在、ボツリヌス中毒症の治療薬としてＡ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型に対して治療用馬抗毒素が常備されている。ウマ血清を原材料としているこの製剤は、ヒトには異種蛋白であるため、アナフィラキシー等のアレルギー反応を引き起こす危険性がある。乳児ボツリヌス症においてはこのアレルギー反応を回避するために異種蛋白由来の抗体による治療はなされていないのが現状である。この危険性は成人の中毒における治療においても同様であり、ウマ抗毒素に代わるより安全で、高い中和力価を持つ抗毒素製剤の開発が望まれている。 Botulism is a dietary poisoning caused by oral inoculation of protein toxins produced by Gram-positive spore-forming botulinum, and spores germinate and proliferate in the intestinal tract of infants under one year of age. It is roughly divided into infant botulism caused by the toxin produced. In any poisoning, the toxin acts on peripheral excitatory synapses, causing relaxation paralysis by inhibiting neurotransmitter release. Botulism is rare compared to other bacterial food poisonings, but the mortality rate is extremely high, and human dietary poisoning has been reported in Japan. Recently, there is concern about its use as a means of bioterrorism because of its high lethality. Currently, therapeutic equine antitoxins for A, B, E and F types are always available as therapeutic agents for botulism. This preparation, which uses horse serum as a raw material, is a heterologous protein in humans, and therefore has a risk of causing allergic reactions such as anaphylaxis. In infant botulism, in order to avoid this allergic reaction, treatment with an antibody derived from a heterologous protein has not been made. This risk is similar in the treatment of adult addiction, and it is desired to develop an antitoxin preparation that is safer and has a high neutralizing titer instead of the equine antitoxin.
上記のような抗BoNT中和抗体を、ボツリヌス中毒症の患者またはBoNTを不活化したトキソイドで免疫した人から抗ボツリヌスヒト免疫グロブリンを直接採取・調製するやり方があり、実際に「BabyBIG」という商品名で乳児ボツリヌス症を対象に市販されている。しかし、この製剤はボツリヌストキソイドで健常人を免疫して中和抗体価の高い血漿をプールして製造されるために、この方法では倫理的な問題や原材料入手、バイオハザードの問題など数多い問題点が予想され、乳児ボツリヌス症のような疾患に限定された疾患にしか使用できない。すなわち、このようなヒト免疫グロブリン製剤を現在のウマ抗毒素の代わりに広く普及させることはできない。そこで、このような高力価血清の代替品としてBoNT中和活性を有するモノクローナル抗体の使用が考えられる。 There is a method of directly collecting and preparing anti-botulinum human immunoglobulin from a patient with botulinum intoxication or a person who has been immunized with a toxoid that inactivated BoNT as described above. It is marketed for infant botulism by name. However, since this preparation is produced by immunizing healthy individuals with botulinum toxoid and pooling plasma with high neutralizing antibody titer, there are many problems such as ethical problems, raw material acquisition, biohazard problems, etc. Can be used only for diseases limited to diseases such as infant botulism. That is, such human immunoglobulin preparations cannot be widely used in place of current equine antitoxins. Therefore, use of a monoclonal antibody having BoNT neutralizing activity as an alternative to such high-titer serum can be considered.
最近、ボツリヌストキソイドを免疫した人のBリンパ球をソースにしてファージ抗体を作製し、その中から所望の中和抗体を選ぶ方法が試みられているが、BoNT A型毒素に関してそのような人から得られたヒト型中和モノクローナル抗体はそれぞれ単独では中和活性が弱く実用的でなかった。そこで、そのような弱い中和活性を持ったモノクローナル抗体を数種類混合するオリゴクローナルにすることで活性を強化せざるを得なかった。しかしながら、数種類のモノクローナル抗体からなる混合製剤は、抗体の種類が増えるに従って医薬品としての開発・製造コストを上昇させることになり、現実的な価格で医薬品を提供することが難しくなる恐れがある。また、現在のウマ抗毒素についてはＡ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型の毒素に対する抗体が含まれているので、最終的には少なくとも４種類のモノクローナル抗体を混合することになる。それぞれの型に数種類のモノクローナル抗体を混合して、さらにそれらを混合することになれば、開発・製造コストの問題はより厳しさを増すことになる。すなわち、できるだけ一つの毒素の型について一種類のモノクローナル抗体で対応できる方がコスト的に有利である。 Recently, a method has been attempted in which a phage antibody is prepared using B lymphocytes of a person immunized with botulinum toxoid as a source, and a desired neutralizing antibody is selected therefrom. The obtained human neutralizing monoclonal antibodies alone were not practical due to their weak neutralizing activity. Therefore, the activity has to be reinforced by using an oligoclonal mixture of several monoclonal antibodies having such a weak neutralizing activity. However, mixed preparations composed of several types of monoclonal antibodies increase the development and production costs of pharmaceuticals as the number of types of antibodies increases, and it may be difficult to provide pharmaceuticals at realistic prices. In addition, since current horse antitoxins include antibodies against A, B, E, and F type toxins, at least four kinds of monoclonal antibodies are finally mixed. If several types of monoclonal antibodies are mixed in each type and then they are further mixed, the problem of development and manufacturing costs will become more severe. That is, it is advantageous in terms of cost that one type of monoclonal antibody can cope with one toxin type as much as possible.
一方、マウスモノクローナル抗体については、免疫原の選択やマウスへの免疫回数など免疫方法に関してトキソイドをヒトに免疫するよりは、技術的にも倫理的にも制限が少なく、結果的にヒト由来のモノクローナル抗体よりも高力価の抗体を得ることが出来る可能性がある。マウスモノクローナル抗体作製に関する基本的な技術はすでに確立されている。しかし、マウスモノクローナル抗体をヒトに投与すると異種タンパクとして認識され、アナフィラキシーショックや血清病などの副作用を引き起こしたり、はやく体外に排除されたりして、抗体の治療効果を低下させてしまうことから臨床応用が困難であった。 Mouse monoclonal antibodies, on the other hand, are less technically and ethically limited than immunizing humans with toxoids regarding immunization methods such as immunogen selection and the number of immunizations to mice, resulting in human-derived monoclonal antibodies. There is a possibility that an antibody having a higher titer than the antibody can be obtained. Basic techniques for mouse monoclonal antibody production have already been established. However, when a mouse monoclonal antibody is administered to humans, it is recognized as a heterologous protein, causing side effects such as anaphylactic shock and serum sickness, and being eliminated outside the body, which reduces the therapeutic effect of the antibody and clinical application. It was difficult.
そこで、遺伝子組換え技術を利用してマウスなどの動物由来のモノクローナル抗体をキメラ抗体あるいは改変抗体（ＣＤＲ[complementarity determining region]移植抗体、再形成ヒト抗体と言う場合もある）のようなヒト化抗体にする試みが行われている。抗体は重鎖（Ｈ）鎖と軽（Ｌ）鎖からなり、各々、抗原結合活性を担う可変（Ｖ）領域と、補体やFc受容体への結合性を担う定常（Ｃ）領域から構成されている（以下、Ｈ鎖Ｖ領域はVH、Ｌ鎖Ｖ領域はＶＬ、Ｈ鎖Ｃ領域はＣＨ、Ｌ鎖Ｃ領域はＣＬと称することがある）。 Therefore, a humanized antibody such as a monoclonal antibody derived from an animal such as a mouse using a genetic recombination technique, or a chimeric antibody or a modified antibody (sometimes referred to as a CDR [complementarity determining region] transplanted antibody or reshaped human antibody). Attempts have been made. An antibody consists of a heavy (H) chain and a light (L) chain, each of which consists of a variable (V) region responsible for antigen-binding activity and a constant (C) region responsible for binding to complement and Fc receptors. (Hereinafter, the H chain V region may be referred to as VH, the L chain V region as VL, the H chain C region as CH, and the L chain C region as CL).
キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマからクローニングしたＶ遺伝子と、ヒト抗体産生細胞等のヒト細胞からクローニングしたＣ遺伝子とを結合させたマウスV−ヒトＣキメラ抗体遺伝子を動物細胞あるいは微生物細胞等で発現させ、その培養上清中に得られるものである（非特許文献１）。改変抗体はマウスなど動物由来抗体のＣＤＲをヒト抗体のＣＤＲと置換した抗体であり（非特許文献２）、サルを用いた実験ではマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が４〜５倍延長している（非特許文献３）。 The chimeric antibody is a mouse V-human C chimeric antibody gene in which a V gene cloned from a mouse hybridoma producing a mouse monoclonal antibody and a C gene cloned from a human cell such as a human antibody-producing cell are combined with animal cells or microorganisms. It is expressed in cells or the like and obtained in the culture supernatant (Non-patent Document 1). The modified antibody is an antibody in which the CDR of an animal-derived antibody such as a mouse is replaced with the CDR of a human antibody (Non-patent Document 2). In an experiment using monkeys, the immunogenicity is lower than that of a mouse antibody, and the blood half-life is reduced. It is extended 4 to 5 times (Non-Patent Document 3).
さらに、最近の抗体工学の進歩により、一本鎖抗体（single chain Fv; 以下、scFvと称することもある：非特許文献４）あるいはジスルフィド安定化抗体（disulfide stabilized Fv; 以下、dsFvと称することもある：非特許文献５）といった、より小さな抗体分子の作製が行われている。一本鎖抗体やジスルフィド安定化抗体は完全分子型の抗体に比べ、その分子量が小さいことから組織移行性、血中クリアランスに優れ、完全分子型の抗体とは異なった治療効果も期待されている。 Furthermore, due to recent advances in antibody engineering, single chain antibodies (hereinafter referred to as scFv: non-patent document 4) or disulfide stabilized antibodies (hereinafter referred to as dsFv) may also be referred to. There is a production of smaller antibody molecules such as: Non-Patent Document 5). Single-chain antibodies and disulfide-stabilized antibodies are smaller in molecular weight than full-molecule antibodies, so they have excellent tissue migration and blood clearance, and are expected to have therapeutic effects different from full-molecule antibodies. .
以上述べてきたように、現在のウマ抗毒素は副作用の点で問題がある。その解決策として現在報告されているヒト型モノクローナル抗体では一種類のみで治療効果の優れた抗体はなく、数種類のモノクローナル抗体を混合する製剤となっている。このため、医薬品の開発や製造のコストアップを招き、必然的に高価な医薬品とならざるを得ない。すなわち、治療効果や安全性に優れ、開発や製造コストの面でも実用化が容易な抗ボツリヌス神経毒素抗体の開発が求められている。 As described above, current horse antitoxins have problems in terms of side effects. The human monoclonal antibody currently reported as a solution to this is a single type of antibody that has no therapeutic effect and is a preparation that mixes several types of monoclonal antibodies. For this reason, the cost of drug development and production is increased, and it must be an expensive drug. That is, there is a demand for the development of an anti-botulinum neurotoxin antibody that is excellent in therapeutic effect and safety, and that can be easily put into practical use in terms of development and manufacturing costs.
このような状況において、本発明者らはBoNTに対して中和活性を有するマウスモノクローナル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）から該抗体の可変領域をコードする遺伝子を分離することに成功し、これを用いてマウス−ヒト組換え抗体の発現を試みた結果、神経毒素に対して中和活性を有する組換えBoNT抗体の作製に成功し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、これまでに一切報告されていないボツリヌス中和抗体の可変領域をコードする遺伝子を提供し、これを用いた組換え抗BoNT抗体を提供する。その組換え抗BoNT抗体の形態は、一般的な抗体分子の形態から一つの抗体分子で２つの特異性をもった二重特異性抗体やＶ領域とＣ領域の一部からなる様々な形態までの抗体機能分子を提供することが可能である。従って、本願発明は、様々な形態の組換え抗BoNT抗体遺伝子の作製工程、及びその遺伝子を含有する発現ベクター、さらにはそのベクターを用いて動物細胞及び微生物を形質転換する工程及びその結果もたらされた組換え抗BoNT抗体及び抗体機能分子高産生形質転換体の作製方法をも包含する。 In such a situation, the present inventors succeeded in separating a gene encoding the variable region of the antibody from a mouse monoclonal antibody-producing cell (hybridoma) having neutralizing activity against BoNT, and using this, As a result of trying to express a mouse-human recombinant antibody, the inventors succeeded in producing a recombinant BoNT antibody having neutralizing activity against neurotoxins, and completed the present invention. That is, the present invention provides a gene encoding a variable region of a botulinum neutralizing antibody that has never been reported so far, and provides a recombinant anti-BoNT antibody using the same. The form of the recombinant anti-BoNT antibody ranges from a general antibody molecule form to a bispecific antibody having two specificities in one antibody molecule and various forms composed of a part of V region and C region. It is possible to provide an antibody functional molecule. Accordingly, the present invention provides a process for producing various forms of recombinant anti-BoNT antibody genes, an expression vector containing the gene, a process for transforming animal cells and microorganisms using the vector, and a result thereof. And a method for producing a recombinant anti-BoNT antibody and a transformant with high production of antibody functional molecules.
本発明は、下記１）〜２２）の発明を含むものである。 The present invention includes the following inventions 1) to 22).
１）マウス抗体由来のアミノ酸配列とヒト抗体由来のアミノ酸配列からなる遺伝子組換え抗体であって、少なくとも定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列であることを特徴とし、かつボツリヌス神経毒素に対する中和活性を有する組換えヒト化抗ボツリヌス神経毒素抗体または抗体フラグメント。 1) A recombinant antibody comprising an amino acid sequence derived from a mouse antibody and an amino acid sequence derived from a human antibody, wherein at least the constant region is an amino acid sequence derived from a human antibody, and has a neutralizing activity against a botulinum neurotoxin A recombinant humanized anti-botulinum neurotoxin antibody or antibody fragment having
２）当該組換え抗体の可変領域重鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列が配列番号１１、１５、１９及び２３より選択される１種または２種のアミノ酸配列の全部または一部であり、可変領域軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸配列が配列番号１３、１７、２１及び２５より選択される１種または２種のアミノ酸配列の全部または一部であることを特徴とする上記１）に記載の組換え抗体または抗体フラグメント。 2) The variable region heavy chain (VH) amino acid sequence of the recombinant antibody is all or part of one or two amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 11, 15, 19 and 23, and the variable region light chain The recombinant antibody according to 1) above, wherein the amino acid sequence of the chain (VL) is all or part of one or two amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 13, 17, 21, and 25 Or antibody fragment.
３）当該組換え抗体の可変領域重鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列が配列番号１１、１５、１９及び２３より選択される１種のアミノ酸配列の全部または一部であり、可変領域軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸配列が配列番号１３、１７、２１及び２５より選択される１種のアミノ酸配列の全部または一部であることを特徴とする上記１）または２）に記載の組換え抗体または抗体フラグメント。 3) The amino acid sequence of the variable region heavy chain (VH) of the recombinant antibody is all or part of one amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 11, 15, 19, and 23, and the variable region light chain (VL) The recombinant antibody or antibody fragment according to 1) or 2) above, wherein the amino acid sequence is a whole or part of one amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 13, 17, 21, and 25 .
４）当該組換え抗体の可変領域重鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列が配列番号１１、１５、１９及び２３より選択される２種のアミノ酸配列の全部または一部であり、可変領域軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸配列が配列番号１３、１７、２１及び２５より選択される１種または２種のアミノ酸配列の全部または一部であることを特徴とする二重特異性抗体である上記１）または２）に記載の組換え抗体または抗体フラグメント。 4) The amino acid sequence of the variable region heavy chain (VH) of the recombinant antibody is all or part of two amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 11, 15, 19, and 23, and the variable region light chain (VL) 1) or 2 above, which is a bispecific antibody characterized in that the amino acid sequence is a whole or part of one or two amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 13, 17, 21 and 25 Or a recombinant antibody or antibody fragment thereof.
５）当該組換え抗体フラグメントが抗体機能分子であり、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体及びジスルフィド安定化抗体であるか、または二重特異性抗体及びその類似物であるか、またはチェインシャッフリングによって生成した抗体分子であることを特徴とする、上記１）から４）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。 5) The recombinant antibody fragment is an antibody functional molecule, such as Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, single chain antibody and disulfide stabilized antibody, or bispecific antibody and the like. The recombinant antibody or antibody fragment according to any one of 1) to 4) above, which is an antibody molecule produced by chain shuffling.
６）当該組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体である上記１）から５）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。 6) The recombinant antibody or antibody fragment according to any one of 1) to 5) above, wherein the recombinant antibody is a human chimeric antibody.
７）当該組換え抗体が、ヒト型改変抗体である上記１）から５）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。 7) The recombinant antibody or antibody fragment according to any one of 1) to 5) above, wherein the recombinant antibody is a human modified antibody.
８）当該ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列の一部が、Kabatらの文献（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th. ed. U.S. Department of Health and Human Services (1987)）、またはChothiaらの文献（J. Mol. Biol., 196, 901, 1987）に基づき決定される、配列番号１１、１５、１９及び２３、並びに配列番号１３、１７、２１及び２５の可変領域内の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む上記１）から７）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント 8) A part of the amino acid sequences of the VH and VL are described in Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th. Ed. US Department of Health and Human Services (1987)) or Chothia et al. Mol. Biol., 196, 901, 1987), the complementarity determining regions (CDRs) within the variable regions of SEQ ID NO: 11, 15, 19 and 23 and SEQ ID NOs: 13, 17, 21 and 25. The recombinant antibody or antibody fragment according to any one of 1) to 7) above
９）当該Kabatらの文献により決定される当該ＶＨのＣＤＲ１が配列番号２６、３８、５０及び６２、ＣＤＲ２が配列番号２７、３９、５１及び６３、ＣＤＲ３が２８、４０、５２及び６４からそれぞれ選択され、当該ＶＬのＣＤＲ１が配列番号２９、４１、５３及び６５、ＣＤＲ２が配列番号３０、４２、５４及び６６、ＣＤＲ３が３１、４３、５５及び６７からそれぞれ選択される上記１）から８）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。 9) CDR1 of the VH determined by the literature of Kabat et al. Is selected from SEQ ID NOs: 26, 38, 50 and 62, CDR2 is selected from SEQ ID NOs: 27, 39, 51 and 63, and CDR3 is selected from 28, 40, 52 and 64, respectively. Wherein the CDR1 of the VL is selected from SEQ ID NOs: 29, 41, 53 and 65, CDR2 is selected from SEQ ID NOs: 30, 42, 54 and 66, and CDR3 is selected from 31, 43, 55 and 67, respectively. A recombinant antibody or antibody fragment according to any one.
１０）当該ＶＨのＣＤＲ１〜３の組み合わせが、配列番号２６、２７及び２８、配列番号３８、３９及び４０、配列番号５０、５１及び５２、並びに配列番号６２、６３及び６４から選択され、当該ＶＬのＣＤＲ１〜３の組み合わせが、配列番号２９、３０及び３１、配列番号４１、４２及び４３、配列番号５３、５４及び５５、並びに配列番号６５、６６及び６７から選択される上記１）から９）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。
10) A combination of
１１）当該ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ１〜３の組み合わせが、配列番号２６、２７及び２８並びに配列番号２９、３０及び３１、配列番号３８、３９及び４０並びに配列番号４１、４２及び４３、配列番号５０、５１及び５２並びに配列番号５３、５４及び５５、もしくは、配列番号６２、６３及び６４並びに配列番号６５、６６及び６７から選択される上記１）から１０）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。
11) The combinations of
１２）当該ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１１、１５、１９及び２３より選択され、当該ＶＬのアミノ酸配列が配列番号１３、１７、２１及び２５より選択される上記１）から１１）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。 12) The amino acid sequence of the VH is selected from SEQ ID NOs: 11, 15, 19, and 23, and the amino acid sequence of the VL is selected from SEQ ID NOs: 13, 17, 21, and 25. A recombinant antibody or antibody fragment as described.
１３）当該ＶＨ及びＶＬの組み合わせが、それぞれ配列番号１１及び１３、配列番号１５及び１７、配列番号１９及び２１、もしくは配列番号２３及び２５より選択される上記１）から１２）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。 13) The combination of VH and VL is any one of 1) to 12) above selected from SEQ ID NOs: 11 and 13, SEQ ID NOs: 15 and 17, SEQ ID NOs: 19 and 21, or SEQ ID NOs: 23 and 25, respectively. Recombinant antibodies or antibody fragments.
１４）当該組換え抗体のＶＨ及びＶＬが上記１２）または１３）に記載のアミノ酸配列の組み合わせより選択され、定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列であることを特徴とするヒト型キメラ抗体である上記１）から１３）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。 14) A human chimeric antibody wherein VH and VL of the recombinant antibody are selected from the amino acid sequence combinations described in 12) or 13) above, and the constant region is an amino acid sequence derived from a human antibody. The recombinant antibody or antibody fragment according to any one of 1) to 13) above.
１５）当該組換え抗体のＶＨ及びＶＬ内のＣＤＲが上記８）から１１）に記載のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列の組み合わせより選択され、フレームワーク領域（ＦＲ）の一部がマウス抗体由来であり、その他のＦＲ及び定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列であることを特徴とするヒト型改変抗体である上記１）から１１）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。 15) CDRs in VH and VL of the recombinant antibody are selected from the combinations of the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 described in 8) to 11) above, and a part of the framework region (FR) is derived from a mouse antibody. The recombinant antibody or antibody fragment according to any one of 1) to 11) above, which is a human-type modified antibody, wherein the other FRs and constant regions are amino acid sequences derived from a human antibody.
１６）上記１）から１５）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡ。 16) DNA encoding the recombinant antibody or antibody fragment described in any one of 1) to 15) above.
１７）上記１６）に記載のＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。 17) A transformant obtained by introducing the DNA according to 16) above into a host cell.
１８）当該宿主細胞に導入されるＤＮＡが、２種類以上のＶＨ及び１種または２種以上のＶＬをコードするＤＮＡが導入されることを特徴とする上記１７）記載の形質転換体。 18) The transformant according to 17) above, wherein DNA encoding two or more types of VH and one or more types of VL is introduced into the host cell.
１９）上記１７）または１８）記載の形質転換体にＤＮＡを導入するために使用される組換えベクター。
２０）上記１７）または１８）記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に上記１）から１５）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメントを生成蓄積させ、該培養物から該抗体を採取することを特徴とする組換え抗体の製造方法。
19) A recombinant vector used for introducing DNA into the transformant according to 17) or 18) above.
20) The transformant according to 17) or 18) above is cultured in a medium, and the recombinant antibody or antibody fragment according to any one of 1) to 15) above is produced and accumulated in the culture. A method for producing a recombinant antibody, which comprises collecting the antibody.
２１）上記１）から１５）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメントが、放射性同位元素、蛋白質または低分子の薬剤と化学的または遺伝子工学的に結合させることを特徴とする融合抗体。 21) A fusion antibody, wherein the recombinant antibody or antibody fragment according to any one of 1) to 15) above is chemically or genetically bound to a radioisotope, protein or low molecular weight drug.
２２）上記１）から１５）及び２１）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメントを有効成分として含有する、ボツリヌス感染症またはボツリヌス神経毒素中毒症の治療薬。 22) A therapeutic agent for botulinum infection or botulinum neurotoxin poisoning comprising the recombinant antibody or antibody fragment according to any one of 1) to 15) and 21) as an active ingredient.
このような本願発明の新規組換え抗BoNT抗体によって、開発や製造コストの面で優れ、効果が高く副作用の少ないボツリヌス中毒症の治療薬・予防薬の開発が可能になる。 Such a novel recombinant anti-BoNT antibody of the present invention makes it possible to develop a therapeutic / preventive agent for botulism that is excellent in terms of development and production cost, has high effects, and has few side effects.
本発明に用いる抗BoNTマウスモノクローナル抗体産生細胞は、これまでに確立されているマウスモノクローナル抗体の作製技術を用いて作製される。免疫原としては、例えば、ボツリヌス菌の産生する神経毒、もしくはその毒素活性をホルマリン処理等により失活させたトキソイド、もしくは遺伝子組換え技術を用いて調製される組換え毒素Ｈ鎖、Ｌ鎖、あるいは毒素のペプチド、もしくは該ウイルス蛋白のアミノ酸配列に基づいて調製される好適な合成ペプチド等があげられる。使用可能なボツリヌス菌株の一例として、C. botulinum type A であればいかなる株でも構わないが、望ましくは97株、62-A株、Hall株、Renkon株、CB21株、804-1株、Chiba H株などがあげられる。 The anti-BoNT mouse monoclonal antibody-producing cells used in the present invention are produced using mouse monoclonal antibody production techniques established so far. Examples of the immunogen include a neurotoxin produced by Clostridium botulinum, a toxoid in which its toxin activity has been inactivated by formalin treatment, or the like, or a recombinant toxin H chain, L chain prepared using a gene recombination technique, Alternatively, a toxin peptide or a suitable synthetic peptide prepared based on the amino acid sequence of the viral protein can be used. As an example of usable botulinum strain, any strain of C. botulinum type A may be used, but preferably 97 strain, 62-A strain, Hall strain, Renkon strain, CB21 strain, 804-1 strain, Chiba H Stocks.
マウスを上記のような適当な株の神経毒素を免疫原で免疫し、得られた脾臓細胞をマウスのミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマから、前記の免疫原に反応する細胞を選択し、該細胞を培養することによって調製することができる。 The mouse is immunized with an immunogen of an appropriate strain as described above, the resulting spleen cells are fused with mouse myeloma cells, and cells that react with the immunogen are selected from the resulting hybridomas. Can be prepared by culturing the cells.
更に、このようにして得られた抗ボツリヌス神経毒素マウスモノクローナル抗体産生細胞の中からボツリヌス神経毒素に対して中和活性を有するモノクローナル抗体を産生している細胞を選択することができる。そのような細胞株として本発明者等はボツリヌス神経毒素に対して中和活性を有する抗体を産生する１３種のハイブリドーマの確立に成功しており、中でも６種、更に好ましくは2-4、2-5、9-4、B1の４種が、これらが本発明に用いる最も好ましい細胞株としてあげられる。 Furthermore, from the thus obtained anti-botulinum neurotoxin mouse monoclonal antibody-producing cells, cells producing a monoclonal antibody having neutralizing activity against botulinum neurotoxin can be selected. As such a cell line, the present inventors have succeeded in establishing 13 types of hybridomas that produce antibodies having neutralizing activity against botulinum neurotoxin, among which 6 types, more preferably 2-4, 2 -5, 9-4, and B1 are the most preferred cell lines used in the present invention.
本発明の可変領域をコードする遺伝子断片は、このような抗ボツリヌス神経毒素中和モノクローナル抗体産生細胞より分離され、解析された遺伝子配列である。Ｖ領域遺伝子は通常の遺伝子操作技術により単離することができる。例えば、その細胞の染色体ＤＮＡから常法［例えば、T. Maniatis "Molecular Cloning" Cold Spring Harbor Lab.(1982)参照]に従ってＶ領域遺伝子をクローニングする方法、あるいは、その細胞のｍＲＮＡを材料として常法［例えば、D.M.Glover編集 " DNA cloning Vol.I" IRL press (1985)］によりｃＤＮＡを合成しＶ領域遺伝子をクローニングする方法である。いずれの方法も、Ｖ領域遺伝子クローニングの為のプローブとして、すでに報告されているマウス免疫グロブリン遺伝子の核酸塩基配列［例えば、 坂野ら、Nature, 286,p676,(1980); E.E.Max ら、J. Biol. Chem., 256,p5116,(1981)］を参照して合成したＤＮＡプローブ等を利用することが出来る。 The gene fragment encoding the variable region of the present invention is a gene sequence isolated and analyzed from such anti-botulinum neurotoxin neutralizing monoclonal antibody-producing cells. V region genes can be isolated by conventional genetic engineering techniques. For example, a method of cloning a V region gene from chromosomal DNA of the cell according to a conventional method [see, for example, T. Maniatis “Molecular Cloning” Cold Spring Harbor Lab. (1982)], or a conventional method using mRNA of the cell as a material [For example, DMGlover editing “DNA cloning Vol. I” IRL press (1985)] is a method of synthesizing cDNA and cloning a V region gene. In either method, the nucleobase sequence of the mouse immunoglobulin gene already reported as a probe for cloning the V region gene [e.g., Sakano et al., Nature, 286, p676, (1980); EEMax et al. Biol. Chem., 256, p5116, (1981)] can be used.
また、ＰＣＲ（ポリメレース連鎖反応）を利用したクローニングも可能である［R. Orlandi, et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 86, 3833 (1989); W. D. Huse, et al., Science, 246, 1275 (1989)］。例えば、前述のようにハイブリドーマから調製されたｃＤＮＡを鋳型に、Kabatら[Sequences of Proteins of Immunological Interest 4th ed., Public Health Service, NIH, Washington DC, 1987]の分類したＶ領域とＪ領域の核酸塩基配列をもとにして合成したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを行なうことが可能である。Ｖ領域とＪ領域のＰＣＲ用プライマーは、ＤＮＡ合成受託機関（例えばQIAGEN社）などに依頼すれば容易に入手可能である。この時、5'側にKOZAK配列（Kozak M, J.Mol.Biol., 196, 947 (1987)）及び適切な制限酵素切断部位(例えばHindIIIやBamHI)の配列を付加することが望ましい。これらのプライマーは抗体の種類によって使用可能なプライマーの種類が異なるが、本願発明の４種のハイブリドーマの場合には、好ましくは、配列番号１から９に記載の合成ＤＮＡがプライマーとして用いられる。ＰＣＲ反応は、例えばAdvantage HF-2 PCR Kit（BC Bioscience）を用い、添付のプロトコールに従って行えばよい。ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社）等を用いてクローニングした後、ＤＮＡシークエンサー、例えば、ABI PRISM310 Genetic Analyzer（PEバイオシステムズ社）により決定することが出来る。 Cloning using PCR (polymerase chain reaction) is also possible [R. Orlandi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833 (1989); WD Huse, et al., Science , 246, 1275 (1989)]. For example, nucleic acids of the V region and J region classified by Kabat et al. [Sequences of Proteins of Immunological Interest 4th ed., Public Health Service, NIH, Washington DC, 1987] using cDNA prepared from a hybridoma as described above as a template. PCR can be performed using a DNA primer synthesized based on the base sequence. PCR primers for the V region and the J region can be easily obtained by requesting a DNA synthesis commissioned organization (for example, QIAGEN). At this time, it is desirable to add a KOZAK sequence (Kozak M, J. Mol. Biol., 196, 947 (1987)) and an appropriate restriction enzyme cleavage site (for example, HindIII or BamHI) to the 5 ′ side. Although these primers differ in the types of primers that can be used depending on the type of antibody, in the case of the four hybridomas of the present invention, the synthetic DNAs described in SEQ ID NOs: 1 to 9 are preferably used as primers. The PCR reaction may be performed, for example, using Advantage HF-2 PCR Kit (BC Bioscience) according to the attached protocol. The nucleotide sequence of the DNA fragment obtained by PCR can be determined using a DNA sequencer such as ABI PRISM310 Genetic Analyzer (PE Biosystems) after cloning using a TA cloning kit (Invitrogen) or the like.
このようにして得られたボツリヌス神経毒素中和活性を有する抗体分子の可変領域をコードする遺伝子として、Ｈ鎖、Ｌ鎖それぞれ配列番号１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５のアミノ酸配列をコードする遺伝子断片がその好ましい一例として挙げられる。また、そのような遺伝子の具体的核酸塩基配列の一例としては、Ｈ鎖、Ｌ鎖それぞれ配列番号１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４に示された核酸塩基配列が挙げられる。また、Kabatら（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th. ed. U.S. Department of Health and Human Services (1987)）あるいは／及び、Chothia and Lesk（J.Mol.Biol., 196, 901, 1987）を参照することにより、本発明の抗ボツリヌス神経毒素抗体の抗体活性を決定する可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）の配列を同定することが出来る。 As a gene encoding the variable region of the antibody molecule having botulinum neurotoxin neutralizing activity thus obtained, H chain and L chain are represented by SEQ ID NOs: 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, respectively. A preferred example is a gene fragment encoding an amino acid sequence. Examples of specific nucleobase sequences of such genes include the nucleobase sequences shown in SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, and 24, respectively. . See also Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th. Ed. US Department of Health and Human Services (1987)) and / or Chothia and Lesk (J. Mol. Biol., 196, 901, 1987). By doing so, the sequence of the complementarity determining regions (CDR1 to CDR3) of the variable region that determines the antibody activity of the anti-botulinum neurotoxin antibody of the present invention can be identified.
例えば、Kabatらの定義に従えば、本発明により得られた４種の抗体のＣＤＲは下記の通り同定される。 For example, according to the definition of Kabat et al., The CDRs of four antibodies obtained by the present invention are identified as follows.
１）２−４
ＶＨ：（配列番号１１）
ＶＨ−ＣＤＲ１：Asp Tyr Tyr Met Ser （配列番号２６）
ＶＨ−ＣＤＲ２：Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly （配列番号２７）
ＶＨ−ＣＤＲ３：Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr （配列番号２８）
ＶＬ：（配列番号１３）
ＶＬ−ＣＤＲ１：Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala （配列番号２９）
ＶＬ−ＣＤＲ２：Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser （配列番号３０）
ＶＬ−ＣＤＲ３：His Gln Tyr Leu Ser Ser Arg Thr （配列番号３１）
1) 2-4
VH: (SEQ ID NO: 11)
VH-CDR1: Asp Tyr Tyr Met Ser (SEQ ID NO: 26)
VH-CDR2: Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly (SEQ ID NO: 27)
VH-CDR3: Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr (SEQ ID NO: 28)
VL: (SEQ ID NO: 13)
VL-CDR1: Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala (SEQ ID NO: 29)
VL-CDR2: Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser (SEQ ID NO: 30)
VL-CDR3: His Gln Tyr Leu Ser Ser Arg Thr (SEQ ID NO: 31)
２）２−５
ＶＨ：（配列番号１５）
ＶＨ−ＣＤＲ１：Gly Tyr Tyr Met His （配列番号３８）
ＶＨ−ＣＤＲ２：Arg Val Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly （配列番号３９）
ＶＨ−ＣＤＲ３：Pro Pro Thr Thr Val Val Ala Thr Asp Trp Tyr Phe Asp Val （配列番号４０）
ＶＬ：（配列番号１７）
ＶＬ−ＣＤＲ１：Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala （配列番号４１）
ＶＬ−ＣＤＲ２：Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser （配列番号４２）
ＶＬ−ＣＤＲ３：His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr （配列番号４３）
2) 2-5
VH: (SEQ ID NO: 15)
VH-CDR1: Gly Tyr Tyr Met His (SEQ ID NO: 38)
VH-CDR2: Arg Val Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly (SEQ ID NO: 39)
VH-CDR3: Pro Pro Thr Thr Val Val Ala Thr Asp Trp Tyr Phe Asp Val (SEQ ID NO: 40)
VL: (SEQ ID NO: 17)
VL-CDR1: Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala (SEQ ID NO: 41)
VL-CDR2: Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser (SEQ ID NO: 42)
VL-CDR3: His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr (SEQ ID NO: 43)
３）９−４
ＶＨ：（配列番号１９）
ＶＨ−ＣＤＲ１：Ser Tyr Gly Val His （配列番号５０）
ＶＨ−ＣＤＲ２：Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser （配列番号５１）
ＶＨ−ＣＤＲ３：Lys Arg Gly Tyr Tyr Gly Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr （配列番号５２）
ＶＬ：（配列番号２１）
ＶＬ−ＣＤＲ１：Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His （配列番号５３）
ＶＬ−ＣＤＲ２：Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser （配列番号５４）
ＶＬ−ＣＤＲ３：Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr （配列番号５５）
3) 9-4
VH: (SEQ ID NO: 19)
VH-CDR1: Ser Tyr Gly Val His (SEQ ID NO: 50)
VH-CDR2: Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser (SEQ ID NO: 51)
VH-CDR3: Lys Arg Gly Tyr Tyr Gly Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr (SEQ ID NO: 52)
VL: (SEQ ID NO: 21)
VL-CDR1: Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His (SEQ ID NO: 53)
VL-CDR2: Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser (SEQ ID NO: 54)
VL-CDR3: Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr (SEQ ID NO: 55)
４）Ｂ１
ＶＨ：（配列番号２３）
ＶＨ−ＣＤＲ１：Ser Phe Gly Met His （配列番号６２）
ＶＨ−ＣＤＲ２：Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly （配列番号６３）
ＶＨ−ＣＤＲ３：Lys Gly Phe Gly Ile Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Ala Met Asp Tyr （配列番号６４）
ＶＬ：（配列番号２５）
ＶＬ−ＣＤＲ１：Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala （配列番号６５）
ＶＬ−ＣＤＲ２：Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser （配列番号６６）
ＶＬ−ＣＤＲ３：Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Tyr Thr （配列番号６７）
4) B1
VH: (SEQ ID NO: 23)
VH-CDR1: Ser Phe Gly Met His (SEQ ID NO: 62)
VH-CDR2: Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 63)
VH-CDR3: Lys Gly Phe Gly Ile Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Ala Met Asp Tyr (SEQ ID NO: 64)
VL: (SEQ ID NO: 25)
VL-CDR1: Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala (SEQ ID NO: 65)
VL-CDR2: Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser (SEQ ID NO: 66)
VL-CDR3: Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Tyr Thr (SEQ ID NO: 67)
これらの配列がＣＤＲペプチド、さらには抗体活性の改良を行う際の重要な領域となる。後述の抗体機能分子を作製する際にも、このようなアミノ酸配列が最も重要な情報となりうる。具体的にはそのようなアミノ酸配列をコードした核酸塩基配列を含む遺伝子を用いてそのような抗体機能分子は作製される。そのようなアミノ酸配列をコードした核酸塩基配列であればいかなるコドンからなっても構わないが、その望ましい核酸塩基配列として、配列番号３２〜３７、４４〜４９、５６〜６１、６８〜７３に示される配列があげられる。 These sequences are important regions for improving CDR activity as well as antibody activity. Such amino acid sequences can be the most important information when preparing antibody functional molecules described later. Specifically, such an antibody functional molecule is prepared using a gene containing a nucleobase sequence encoding such an amino acid sequence. Any codon may be used as long as it is a nucleobase sequence that encodes such an amino acid sequence, but preferred nucleobase sequences are shown in SEQ ID NOs: 32-37, 44-49, 56-61, 68-73. Sequence.
このようにしてクローニングされた本願発明のＶ領域遺伝子断片あるいはアミノ酸配列を元にして、ヒト化抗体（マウスヒトキメラ抗体及び改変抗体）が作成可能である。例えば、キメラ抗体についてはM. Bruggemann（Waldmann H (ed) Monoclonal AntibodyTherapy. Prog Allergy. Basel, Karger, 1988, vol 45, pp91）やS. L. Morrison（Advances in Immunology, 44, 65, (1989)）などの文献が、改変抗体については、G. Winter and C. Milstein（Nature 349, 293 (1991)）やM.M.Bendig（Methods, 8, 83 (1995)）などの文献に紹介されている方法に準じて行うことが出来る。 Based on the thus cloned V region gene fragment or amino acid sequence of the present invention, humanized antibodies (mouse human chimeric antibodies and modified antibodies) can be prepared. For example, for chimeric antibodies such as M. Bruggemann (Waldmann H (ed) Monoclonal Antibody Therapy. Prog Allergy. Basel, Karger, 1988, vol 45, pp91) and SL Morrison (Advances in Immunology, 44, 65, (1989)) References to modified antibodies are performed according to methods introduced in references such as G. Winter and C. Milstein (Nature 349, 293 (1991)) and MMBendig (Methods, 8, 83 (1995)). I can do it.
また、これらのＶ領域の情報を元にボツリヌス神経毒素に特異的に反応する低分子の抗体機能分子を作製することが可能である。低分子の抗体機能分子として、例えば、Fragment of antigen binding（Fabと略記する）、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体及びジスルフィド安定化抗体を作製することも可能である。この場合、本願発明のマウス抗体そのものの遺伝情報を利用することもできるが、望ましくは本願発明のマウス抗体の遺伝情報をベースにして作製されたキメラ抗体あるいは改変抗体をベースにすることによって、よりヒトに対して安全性の高い低分子抗体を作製することが出来る。 In addition, it is possible to produce a low-molecular antibody functional molecule that specifically reacts with botulinum neurotoxin based on information on these V regions. As low-molecular weight antibody functional molecules, for example, Fragment of antigen binding (abbreviated as Fab), Fab ′, F (ab ′) 2, single chain antibody and disulfide stabilized antibody can be prepared. In this case, the genetic information of the mouse antibody itself of the present invention can be used, but it is preferable to use a chimeric antibody or a modified antibody based on the genetic information of the mouse antibody of the present invention. A low-molecular antibody that is highly safe for humans can be produced.
一方、抗ボツリヌス神経毒素組換え抗体作製に用いられるヒト免疫グロブリンＨ鎖遺伝子並びにＬ鎖遺伝子のＣ領域遺伝子は、例えば ヒト抗体産生細胞から同様の方法により単離することが出来る。また、Ｃ領域遺伝子はその遺伝子内で再配列を行わないので特にヒトＣ領域遺伝子を単離するために抗体産生細胞を使う必要はなく、その他の組織の細胞でも構わない。単離する方法としては、前述のマウスV領域遺伝子の単離の場合と同様にして行なうことができる。また、Ｃ領域遺伝子の種類としては、特にγ1 鎖、κ鎖に限ったものではなく、μ鎖、α鎖、γ2鎖、γ3鎖、γ4鎖、ε鎖、λ鎖の各鎖の遺伝子でも可能である。しかし、補体活性化能、抗体依存性細胞傷害活性を期待するならば、γ1鎖が望ましい。 On the other hand, the human immunoglobulin H chain gene and the C region gene of the L chain gene used for the production of the anti-botulinum neurotoxin recombinant antibody can be isolated from, for example, human antibody-producing cells by the same method. In addition, since the C region gene is not rearranged within the gene, it is not particularly necessary to use antibody-producing cells to isolate the human C region gene, and cells of other tissues may be used. The isolation method can be performed in the same manner as in the case of isolation of the mouse V region gene described above. In addition, the type of C region gene is not limited to γ1 chain and κ chain, but can be genes of μ chain, α chain, γ2 chain, γ3 chain, γ4 chain, ε chain, and λ chain. It is. However, the γ1 chain is desirable if complement activation ability and antibody-dependent cytotoxic activity are expected.
さらに、抗体機能分子として二重特異性抗体（bispecific抗体あるいはbifunctional抗体と呼ぶことがある）が挙げられる。本願発明の特徴の一つに、抗ボツリヌス神経毒素抗体に関して初めて二重特異性抗体の可能性を開示したことが挙げられる。抗体１分子は２個の抗原結合部位を有するが、それぞれの抗原結合部位が異なる抗原に結合する抗体、すなわち２つの特異性を持った抗体のことを二重特異性抗体という。通常、二重特異性抗体は細胞融合法と化学合成法の２つの方法で作製される。細胞融合法では、２つの異なるモノクローナル抗体産生細胞をさらに融合することによって作製する事が出来る。化学合成法は、２つの抗体分子を一旦還元してＨ鎖間のＳＳ結合を解離させ、これらを混合して再び酸化することによって作製するものである。しかし、これらの作製方法は技術的には難しく、目的の二重特異性抗体以外の組み合わせが出来る上に、異なったＶＨとＶＬの組み合わせも出来ることから、得られる二重特異性抗体の収量が非常に少ないという問題を抱えていた。 Furthermore, bispecific antibodies (sometimes referred to as bispecific antibodies or bifunctional antibodies) are mentioned as antibody functional molecules. One of the features of the present invention is the first disclosure of the possibility of a bispecific antibody for an anti-botulinum neurotoxin antibody. An antibody molecule has two antigen-binding sites, and each antibody-binding site binds to a different antigen, that is, an antibody having two specificities is called a bispecific antibody. Usually, bispecific antibodies are produced by two methods, a cell fusion method and a chemical synthesis method. The cell fusion method can be prepared by further fusing two different monoclonal antibody-producing cells. The chemical synthesis method is prepared by once reducing two antibody molecules to dissociate SS bonds between H chains, mixing them, and oxidizing again. However, these production methods are technically difficult, and combinations other than the target bispecific antibody can be made, and also different VH and VL combinations can be made, so that the yield of the obtained bispecific antibody is high. I had the problem of very few.
本願発明では、ＶＨ領域の数を２種類から３種類に増やすことも可能で、さらには、ＶＬ領域も１種類に限定する必要もなく、２種類、３種類と増やすことが可能である。例えば、2-4と2-5のＶＨ領域と、アミノ酸配列において１アミノ酸しか違いがない2-4と2-5のＶＬ領域のいずれ、あるいはその両方とに組合せにおいても結合活性、中和活性とも保持している。さらには、2-4のＶＨ領域、ＶＬ領域と全く相同性のない9-4のＶＨ領域、ＶＬ領域と2-4のＶＨ領域、ＶＬ領域と組み合わせることによって、結合活性、中和活性とも保持している抗体の組合せを作ることができた。このようにボツリヌス毒素に結合しないかも知れない抗体成分の混入を防ぐことができ、目的の二重特異性抗体の効率を向上させている。このような二重特異性抗体の望ましいＶＨ領域として配列番号１１、１５、１９に示すアミノ酸配列の全部または一部を持つようなＶＨ領域があげられる。また望ましいＶＬ領域として配列番号１３、１７、２１に示すアミノ酸配列の全部または一部を持つようなＶＬ領域があげられる。ＶＬ領域については、配列番号１３、１７、２１のいずれか一つだけを利用してもいいし、２種類、あるいは全てをを利用しても構わない。
１種類のモノクローナル抗体より、個々の中和活性は低くとも異なるエピトープを認識する複数のモノクローナル抗体を混合したときの方が、毒素の中和能が高いという報告（Nowakowski Aら、Proc Natl Acad Sci USA., 99, 11346(2002)）がある。このような知見から、複数の中和抗体を混合した製剤を想定した場合、問題になるのは開発や製造のコストである。１つの細胞が１つの抗体を産生し、それらを混合する場合、前述のコストはその抗体数に比例して増大する。本願発明は、それらの課題に対する一つの解決策を示している。
また本願発明は、抗体機能分子として前述の二重特異性抗体だけを示すものではなく、二重特異性抗体の類似物として、例えば、ヒンジ領域のCys残基による自発的な２量体化、両親媒性ペプチドの導入によるＦabの２量体化や、２つの１本鎖抗体（scFv）をペプチドリンカーで結合させるscFvの２量体化（BiscFv）、特異性の異なる２つの抗体におけるお互いのドメインを入れ替えて、非共有結合的に２量体化（diabody）なども、本願発明のＶ領域を用いることにより作製することが可能である。
In the present invention, the number of VH regions can be increased from two types to three types, and further, the VL regions need not be limited to one type, and can be increased to two types and three types. For example, the binding activity and neutralizing activity of the 2-4 and 2-5 VH regions and the 2-4 and 2-5 VL regions, which differ only by one amino acid in the amino acid sequence, or a combination of both. Both. Furthermore, the binding activity and neutralization activity are retained by combining the 2-4 VH region, the 9-4 VH region, which has no homology with the VL region, and the VL region with the 2-4 VH region, VL region. Could make a combination of antibodies. Thus, contamination of antibody components that may not bind to botulinum toxin can be prevented, and the efficiency of the target bispecific antibody is improved. Examples of desirable VH regions of such bispecific antibodies include VH regions having all or part of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 11, 15, and 19. Examples of desirable VL regions include VL regions having all or part of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 13, 17, and 21. As for the VL region, only one of SEQ ID NOS: 13, 17, and 21 may be used, or two or all of them may be used.
It is reported that the ability to neutralize toxins is higher when a mixture of monoclonal antibodies recognizing different epitopes, although each neutralizing activity is low (Nowakowski A et al., Proc Natl Acad Sci). USA., 99, 11346 (2002)). From such knowledge, when a preparation in which a plurality of neutralizing antibodies are mixed is assumed, the problem is the cost of development and production. If one cell produces one antibody and mixes them, the aforementioned costs increase in proportion to the number of antibodies. The present invention shows one solution to these problems.
The present invention does not only show the above-mentioned bispecific antibody as an antibody functional molecule, but as a bispecific antibody analog, for example, spontaneous dimerization with a Cys residue in the hinge region, Dimerization of Fab by introduction of amphipathic peptides, dimerization of scFv (BiscFv) in which two single-chain antibodies (scFv) are bound by a peptide linker, and two antibodies with different specificities Non-covalent dimerization and the like can be produced by using the V region of the present invention by exchanging domains.
さらに、抗体機能分子として、本願発明の抗ボツリヌス神経毒素抗体可変領域をコードする遺伝子断片を用いて、結合活性を強化した新しい抗体が作製可能である。すなわち、本発明により提供される抗ボツリヌス神経毒素抗体可変領域をコードする遺伝子断片は、ボツリヌス神経毒素に対して中和活性を有する抗体分子の可変領域の特異的アミノ酸配列もしくは核酸塩基配列を開示するものであり、この領域、ドメインを用いて新しい抗体作製の可能性をも提供する物である。例えば、エクソンシャフリング（exon shuffling）やチェインシャフリング（chain shuffling）と言われているファージディスプレイライブラリーを応用する方法があげられる。すなわち、ファージ上に発現さる際に、抗体可変領域のＶＨあるいはＶＬ遺伝子の一方を固定化し、他方をＶ遺伝子ライブラリーと結合させたファージライブラリーを構築し、もとの抗体より抗原に対する特異性が高い抗体可変領域の組み合わせをスクリーニングする方法が考えられる。あるいは、ＣＤＲのみを人工的に入れ替えるＣＤＲシャフリングや単純にＣＤＲにランダム変異を導入して、親和性や特異性を向上させる方法が考えられる。 Furthermore, a new antibody with enhanced binding activity can be produced using a gene fragment encoding the anti-botulinum neurotoxin antibody variable region of the present invention as an antibody functional molecule. That is, the gene fragment encoding the anti-botulinum neurotoxin antibody variable region provided by the present invention discloses the specific amino acid sequence or nucleobase sequence of the variable region of an antibody molecule having neutralizing activity against botulinum neurotoxin. It is a thing which also provides the possibility of producing a new antibody using this region and domain. For example, there is a method of applying a phage display library which is called exon shuffling or chain shuffling. That is, when expressed on a phage, a phage library is constructed in which one of the VH or VL genes of the antibody variable region is immobilized and the other is bound to the V gene library. A method of screening a combination of antibody variable regions having a high A is considered. Alternatively, CDR shuffling in which only the CDR is artificially replaced or a random mutation is simply introduced into the CDR to improve affinity and specificity.
以上のようにして得られるV領域を利用して作製された抗ボツリヌス神経毒素抗体分子をコードする遺伝子を発現させる場合は通常の組換えタンパク質が発現される産生系ならどの様なものでも利用可能であるが、抗体の通常形態である完全分子なら動物細胞での発現が望ましい。また、前述の一本鎖抗体のような低分子抗体の形態なら、動物細胞以外に大腸菌、酵母などの微生物の中から適切なものを選択することができるが、その場合の発現用ベクターとしては、それぞれの宿主に適切なものを選択する必要がある。また、適切なシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡを発現用ベクターに挿入することで一本鎖抗体を細胞外に分泌させ、ペリプラズマ領域に輸送させ、あるいは細胞内に留まらせることができる。 When a gene encoding an anti-botulinum neurotoxin antibody molecule produced using the V region obtained as described above is expressed, any production system capable of expressing a normal recombinant protein can be used. However, expression in animal cells is desirable for complete molecules that are the normal form of antibodies. In addition, in the case of a low-molecular antibody form such as the above-mentioned single-chain antibody, an appropriate one can be selected from microorganisms such as E. coli and yeast in addition to animal cells. It is necessary to select an appropriate one for each host. Further, by inserting cDNA encoding an appropriate signal peptide into an expression vector, the single-chain antibody can be secreted outside the cell, transported to the periplasmic region, or can remain in the cell.
ここでは最も一般的な、動物細胞での発現について述べる。動物細胞を宿主とする発現ベクターには特段の制約はないが、プラスミド、ウイルスベクター等を用いることができる。当該発現ベクターに含まれるプロモーターは、宿主として用いる動物細胞との組み合わせにより、SV40初期、SV40後期、サイトメガロウイルスプロモーター、ニワトリβアクチンなど、最終的にアッセンブルした抗体及び抗体機能分子が得られるのであれば如何なるものでも良い。好ましくは、ニワトリβ−アクチンプロモーター系発現プラスミドpCAGG（特許第２８２４４３４号）が使用される。選択や遺伝子増幅のマーカー遺伝子として、アミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子やジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子、ピューロマイシン耐性酵素遺伝子、グルタミン合成酵素(GS)遺伝子など一般に知られる選択や遺伝子増幅用のマーカー遺伝子（Kriegler M著、加藤郁之進 監訳、ラボマニュアル動物細胞の遺伝子工学、宝酒造(1994)）が利用できる。 Here we describe the most common expression in animal cells. There are no particular restrictions on the expression vector using animal cells as a host, but plasmids, viral vectors, and the like can be used. The promoter contained in the expression vector can be used in combination with animal cells used as a host to obtain the final assembled antibody and antibody functional molecule, such as early SV40, late SV40, cytomegalovirus promoter, chicken β-actin, etc. Anything is acceptable. Preferably, the chicken β-actin promoter system expression plasmid pCAGG (Japanese Patent No. 2824434) is used. As a marker gene for selection and gene amplification, aminoglycoside 3 'phosphotransferase (neo) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene, puromycin resistance enzyme gene, glutamine synthase (GS) gene, etc. Marker gene (Kriegler M, supervised by Yasuyuki Kato, laboratory manual, genetic engineering of animal cells, Takara Shuzo (1994)) can be used.
Ｈ鎖Ｌ鎖の遺伝子を動物細胞に導入する際の組み合わせや形態、比率に特段の制約はない。Ｈ鎖Ｌ鎖の遺伝子を同じベクター内に組み込み同時に動物細胞内に導入する方法でも良いし、Ｈ鎖Ｌ鎖の遺伝子を別々のベクターに組み込み、同時期に、あるいは別々の時期に選択マーカーを変えて動物細胞に順次導入してもよい。また、その構成比もＨ鎖Ｌ鎖が１：１になるようにする必要はなく、どの様な比率でも構わない。 There are no particular restrictions on the combination, form, and ratio when introducing the H-chain and L-chain genes into animal cells. Alternatively, the H chain and L chain genes may be incorporated into the same vector and simultaneously introduced into animal cells, or the H chain and L chain genes may be incorporated into different vectors and the selection marker may be changed at the same time or at different times. May be sequentially introduced into animal cells. Further, the composition ratio is not required to be 1: 1 for the H chain and L chain, and any ratio may be used.
発現ベクターを導入する宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞やSP2/0等マウスミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、ＣＯＳ細胞など様々な動物細胞が利用可能であるが、発現ベクターに使用されるプロモーター、選択及び遺伝子増幅用マーカー遺伝子に合わせて適当な細胞を選択すれば良い。例えば、ニワトリβ−アクチンプロモーター系発現プラスミドを用いて構築した発現ベクターには、ＣＨＯ細胞などが使用される。 As host cells into which expression vectors are introduced, various animal cells such as Chinese hamster ovary (CHO) cells, mouse myeloma cells such as SP2 / 0, BHK cells, 293 cells, and COS cells can be used. Appropriate cells may be selected according to the promoter gene, selection and gene amplification marker gene. For example, CHO cells are used as an expression vector constructed using a chicken β-actin promoter system expression plasmid.
宿主細胞の形質転換するときには公知の方法を利用すればよい。例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、リポフェクチン系のリポソームを用いる方法、プロトプラストポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーション法などが利用でき、使用する宿主細胞により適当な方法を選択すればよい（Molecular Cloning (3rd Ed.), Vol 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)）。
A known method may be used when transforming a host cell. For example, calcium phosphate method, DEAE dextran method, method using lipofectin-based liposome, protoplast polyethylene glycol fusion method, electroporation method and the like can be used, and an appropriate method may be selected depending on the host cell to be used (Molecular Cloning (3rd Ed.),
形質転換細胞の選択・増殖には、一般に動物細胞を形質転換する時に行われる方法を使用すればよい。例えば、形質転換後の細胞は、CHO-S-SFMII培地（GIBCO-BRL）、IS CHO-V培地(アイエスジャパン)、YMM培地等無血清培地やMEMアルファ培地、RPMI培地、ダルベッコMEM培地（いずれもGIBCO-BRL）に５〜10％程度のウシ胎児血清を添加した血清培地などの一般的に動物細胞培養に用いられる培地に、使用する選択マーカーに合わせてメトトレキサート、G418等を添加した選択培地を用いて、適宜培地交換をしながら、37℃前後で10〜14日間程度培養される。この培養により、形質転換されていない細胞は死滅し、形質転換した細胞のみが増殖してくる。更に、形質転換細胞に対して、限界希釈法などの方法により、目的とする抗体産生細胞株の選択及びクローン化が行われる。 For selection / proliferation of transformed cells, a method generally used when transforming animal cells may be used. For example, cells after transformation include CHO-S-SFMII medium (GIBCO-BRL), IS CHO-V medium (IS Japan), serum-free medium such as YMM medium, MEM alpha medium, RPMI medium, Dulbecco MEM medium (all GIBCO-BRL) is a medium that is generally used for animal cell culture, such as a serum medium supplemented with about 5-10% fetal bovine serum, and a selective medium that is supplemented with methotrexate, G418, etc. according to the selection marker used. Is cultured for about 10 to 14 days at around 37 ° C. while appropriately changing the medium. By this culture, untransformed cells die and only transformed cells grow. Furthermore, the target antibody-producing cell line is selected and cloned from the transformed cells by a method such as limiting dilution.
このようにして得られる本発明の組換え抗体は、ボツリヌス神経毒素に対して中和活性を有していることが確認され、本発明によりこれまでになかった抗ボツリヌス神経毒素組換え抗体を調製することが可能となった。このような抗ボツリヌス神経毒素組換え抗体は、ボツリヌス中毒症の臨床において、これまでになかった有効な治療剤となりうるものである。さらに、 本発明により提供される抗ボツリヌス神経毒素抗体可変領域をコードする遺伝子断片は、ボツリヌス神経毒素に対して中和活性を有する抗体分子の可変領域の特異的アミノ酸配列もしくは核酸塩基配列を開示するものであり、今後、さらに進んだ遺伝子組換え技術を応用して目的の抗体分子を修飾、または一部置換等することにより、より優れた抗ボツリヌス神経毒素組換え抗体分子の開発を可能にするものである。 The recombinant antibody of the present invention thus obtained was confirmed to have neutralizing activity against botulinum neurotoxin, and an anti-botulinum neurotoxin recombinant antibody that had never been prepared according to the present invention was prepared. It became possible to do. Such an anti-botulinum neurotoxin recombinant antibody can be an effective therapeutic agent that has never been available in clinical practice of botulism. Furthermore, the gene fragment encoding the anti-botulinum neurotoxin antibody variable region provided by the present invention discloses the specific amino acid sequence or nucleobase sequence of the variable region of an antibody molecule having neutralizing activity against botulinum neurotoxin. In the future, it will be possible to develop better anti-botulinum neurotoxin recombinant antibody molecules by applying further advanced gene recombination technology to modify or partially replace the target antibody molecule. Is.
以下に、実施例を挙げて本願発明をさらに具体的に説明するが、この例示に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
以下に示す実施例では、特に断りのない限り、和光純薬、宝酒造、東洋紡及びNew England BioLabs社、アマシャムバイオサイエンス社、バイオラド社、シグマ社、ギブコ社製の試薬を使用した。 In the examples shown below, Wako Pure Chemicals, Takara Shuzo, Toyobo and New England BioLabs, Amersham Biosciences, Biorad, Sigma, and Gibco were used unless otherwise specified.
《実施例１：マウスハイブリドーマの調製》
現在治療用毒素として使用されているC. botulinum type A 62A株より精製したＡ型神経毒素をＢ型神経毒素で行われた方法に準拠して（Infect. Immun. 18: 761-766, 1977）、ホルマリンで不活化したトキソイドを免疫抗原に用いた。上記のトキソイドとFreund’s Complete Adjuvant（Difco）を等量混合しBALB/cマウス１匹当たり毒素蛋白量で0.25mgを腹腔内に接種した。初回免疫後、４及び８週目にFreund’s Incomplete Adjuvant（Difco）を用いて同量を追加免疫した。１０日後、部分採血を行い、ELISAにより抗原結合抗体価を測定した。ELISAには、Ａ型神経毒素（0.5μg/well）をコートしたプレート（FALCON, Flexible Plate）を用い、ブロッキングには0.2％BSA、２次抗体にはペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG(H+L)（1：5000，BioRad）、基質はオルソフェニレンジアミン（Nacalai Tesque）を使用した。反応は基質反応以外全て37℃２時間で行った。基質の発色反応は37℃30分で行った。トキソイド免疫後の血中のボツリヌスＡ型神経毒素に対するELISA抗体価は３回の免疫でマウス５匹中４匹が100,000倍以上に上昇していた。ELISA抗体価が500,000倍以上のマウスにおいて順次、Ａ型神経毒素（10μg／マウス；106LD50/マウス）を腹腔内に投与した。３〜４日後に脾細胞を調製し、ポリエチレングリコール法によりミエローマ細胞（P3U1）と細胞融合を行った。脾細胞とP3U1を10：3の割合で混合し、50% PEG4000(MERCK) /10% DMSO(SIGMA)を用いて細胞融合を行った。DMEM (DIFCO)/15% FCS (GIBCO)/HAT (SIGMA)を用いて細胞を選択した。
得られたハイブリドーマの培養上清中のELISA抗体価を測定し、限界希釈法により中和活性のある抗体を産生しているハイブリドーマのクローニングを２〜３回行った結果、抗体陽性ハイブリドーマが37クローン得られた。
Example 1: Preparation of mouse hybridoma
A type A neurotoxin purified from the C. botulinum type A 62A strain, which is currently used as a therapeutic toxin, according to the method performed with type B neurotoxin (Infect. Immun. 18: 761-766, 1977) Toxoid inactivated with formalin was used as an immunizing antigen. The above-mentioned toxoid and Freund's Complete Adjuvant (Difco) were mixed in equal amounts, and 0.25 mg of toxin protein was inoculated intraperitoneally per BALB / c mouse. After the first immunization, the same amount was boosted using Freund's Incomplete Adjuvant (Difco) at 4 and 8 weeks. Ten days later, partial blood collection was performed, and the antigen-binding antibody titer was measured by ELISA. For ELISA, a plate coated with type A neurotoxin (0.5 μg / well) (FALCON, Flexible Plate) was used, 0.2% BSA for blocking, and peroxidase-labeled anti-mouse IgG (H + L) (secondary antibody) 1: 5000, BioRad), and orthophenylenediamine (Nacalai Tesque) was used as a substrate. All reactions except substrate reaction were performed at 37 ° C. for 2 hours. The substrate color reaction was performed at 37 ° C. for 30 minutes. The ELISA antibody titer against botulinum type A neurotoxin in the blood after toxoid immunization increased more than 100,000 times in 4 out of 5 mice after 3 immunizations. In mice whose ELISA antibody titers were 500,000 times or more, type A neurotoxin (10 μg / mouse; 106LD50 / mouse) was administered intraperitoneally. Three to four days later, spleen cells were prepared and fused with myeloma cells (P3U1) by the polyethylene glycol method. Spleen cells and P3U1 were mixed at a ratio of 10: 3, and cell fusion was performed using 50% PEG4000 (MERCK) / 10% DMSO (SIGMA). Cells were selected using DMEM (DIFCO) / 15% FCS (GIBCO) / HAT (SIGMA).
The ELISA antibody titer in the culture supernatant of the obtained hybridoma was measured, and as a result of cloning the hybridoma producing the antibody having neutralizing activity by the limiting dilution method 2-3 times, 37 antibody-positive hybridomas were obtained. Obtained.
《実施例２．マウス抗体の中和活性》
これら37クローンについて産生する抗体の毒素中和活性を調べた。中和活性は、ボツリヌス神経毒素（200ipLD50/ml）とハイブリドーマ培養上清を等量混合し、室温で３０分反応させた後、マウスの腹腔内へ0.5ml接種し、毒素を培地のみと混合したサンプルをコントロールとし、コントロールが死亡した時点における、試験群の臨床症状（麻痺の程度）により判定した。その結果、13クローンについて、コントロールと比較して延命あるいは症状の緩和が観察された。このうち６クローンについては症状の緩和が著しく、特に４クローン（2-4,2-5,9-4,B1）については６時間まで毒素の中毒症状を示さず、さらに３クローン（2-4,2-5,9-4）については毒素を完全中和した（表１）。
Example 2 Mouse antibody neutralizing activity >>
The antibody produced from these 37 clones was examined for toxin neutralizing activity. Neutralizing activity was determined by mixing equal amounts of botulinum neurotoxin (200ipLD50 / ml) and hybridoma culture supernatant, reacting at room temperature for 30 minutes, inoculating 0.5 ml into the peritoneal cavity of mice, and mixing the toxin with the medium alone. The sample was used as a control, and the determination was made based on the clinical symptoms (degree of paralysis) in the test group when the control died. As a result, about 13 clones were observed to prolong life or alleviate symptoms compared to controls. Of these, 6 clones showed marked relief, especially 4 clones (2-4,2-5,9-4, B1) did not show toxin intoxication until 6 hours, and 3 clones (2-4 , 2-5, 9-4), the toxin was completely neutralized (Table 1).
中和活性のある13クローンの抗体についてイムノブロッティングによる毒素との反応性を検討した。7.5%ポリアクリルアミドゲルにＡ型精製毒素を２ＭＥ処理後１レーンあたり0.2μgアプライし、SDS-PAGEを行った。泳動蛋白をニトロセルロース膜（MILLIPORE, Immobilon-P）にセミドライブロッティング装置（ホライズンブロット、ATTO）を用いて転写した後、ハイブリドーマ培養上清を反応させた。２次抗体は、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgGヤギ抗体(1:3000 BioRad)、発色基質は4-chloro-1-naphtol（Nacalai Tesque）を用いた。その結果、３クローン（2-2，4-3，9-4）がいずれも神経毒素重鎖と反応した（図１）。以上の結果からマウス−ヒトキメラ抗体用のハイブリドーマとして中和活性の高い2-4,2-5,9-4,B1の４クローンを選定した。 Thirteen clone antibodies with neutralizing activity were examined for reactivity with toxin by immunoblotting. A 7.5% polyacrylamide gel was treated with 2ME of purified A-type toxin, 0.2 μg per lane was applied, and SDS-PAGE was performed. The electrophoretic protein was transferred to a nitrocellulose membrane (MILLIPORE, Immobilon-P) using a semi-dry blotting apparatus (horizon blot, ATTO), and then the hybridoma culture supernatant was reacted. The secondary antibody was a peroxidase-labeled anti-mouse IgG goat antibody (1: 3000 BioRad), and the chromogenic substrate was 4-chloro-1-naphtol (Nacalai Tesque). As a result, all three clones (2-2, 4-3, 9-4) reacted with the neurotoxin heavy chain (FIG. 1). From the above results, 4 clones 2-4, 2-5, 9-4, and B1 having high neutralizing activity were selected as hybridomas for mouse-human chimeric antibodies.
《実施例３：V領域遺伝子クローニング》
マウスモノクローナル抗体のＶ領域遺伝子は、RT-PCR法によって単離した。2-4,2-5,9-4,B1の４種の各ハイブリドーマよりQuickPrep micro mRNA Purification Kit (Amersham Bioscience)を用いてmRNAを抽出し、Superscript II 逆転写酵素(Invitrogen)によるｃＤＮＡ合成を行った。これをテンプレートとし、プライマーとしてKozak配列及び必要なスプライシングシグナル、酵素サイト（HindIII、BamHI）を持ったオリゴマーをVH、VL領域遺伝子用にそれぞれのV領域及びJ領域のサブグループ毎に作製し（配列番号１〜９）、Advantage HF-2 PCR Kit（BD Bioscience）を用いて当該キットのプロトコールに従ってＰＣＲ反応を行った。その結果、ＶＨ、ＶＬ領域それぞれにＰＣＲ増幅バンドが複数検出された。その中からサイズ的に既知のＶＨ、ＶＬ領域のｃＤＮＡ遺伝子と一致しているバンドを選び、ＴＡクローニングキット（Invitrogen）を用いてクローニングし、ABI PRISM310 Genetic Analyzer（PEバイオシステムズ）を用いてその核酸塩基配列の決定を行った。これらの複数のバンドから、開始コドンからＪ領域までＶ領域内で正しいオープンリーディングフレームを取る遺伝子を選んだ結果、それぞれのハイブリドーマ毎に一対のＶＨ、ＶＬ領域遺伝子の組み合わせが得られた。その核酸塩基及びアミノ酸配列を配列番号１０〜２５にそれぞれ示す。また、各ＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列について相同性を比較したところ、ＶＨ領域間では相同性は認められなかったが、ＶＬ領域については2-4と2-5において121番目のアミノ酸１個のみ違い（2-4:R/2-5:Y）がみられたが、それ以外のＶＬ領域間では相同性はなかった。
<< Example 3: V region gene cloning >>
The mouse monoclonal antibody V region gene was isolated by RT-PCR. MRNA was extracted from each of the four hybridomas 2-4, 2-5, 9-4, and B1 using QuickPrep micro mRNA Purification Kit (Amersham Bioscience), and cDNA synthesis was performed using Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen). It was. Using this as a template, oligomers with Kozak sequences and necessary splicing signals and enzyme sites (HindIII, BamHI) as primers were prepared for VH and VL region genes for each V region and J region subgroup (sequence) No. 1-9), PCR was performed according to the protocol of the kit using Advantage HF-2 PCR Kit (BD Bioscience). As a result, a plurality of PCR amplification bands were detected in each of the VH and VL regions. A band that matches the cDNA genes of VH and VL regions known in size is selected from them, cloned using TA cloning kit (Invitrogen), and nucleic acid using ABI PRISM310 Genetic Analyzer (PE Biosystems). The base sequence was determined. As a result of selecting a gene taking a correct open reading frame in the V region from the start codon to the J region from these plural bands, a pair of VH and VL region genes was obtained for each hybridoma. The nucleobase and amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 10 to 25, respectively. In addition, when the homology was compared for the amino acid sequences of each VH region and VL region, no homology was found between the VH regions, but for the VL region, one amino acid at position 121 in 2-4 and 2-5. Only the difference (2-4: R / 2-5: Y) was observed, but there was no homology between the other VL regions.
《実施例４：キメラ抗体産生細胞の作製》
このようにして得たＶＨ、ＶＬ領域遺伝子をHindIIIとBamHI（TAKARA）で消化し、それぞれを、発現ベクターであるCAG-γ１、CAG-1κ（J. Immnol., 167, 3266, 2001）の同サイトに組み込み、キメラ抗体発現ベクターを構築した。CAG-γ１は、ヒト抗体C領域γ１鎖の遺伝子及び選択マーカーとしてのネオマイシン耐性遺伝子（neor）を持ち、CAG-κはヒト抗体C領域κ鎖の遺伝子及び選択マーカーとしてのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（dhfr）を持っている。構築したキメラ抗体発現プラスミドを用い以下に述べる方法にてCHO DG44（Urlaub Gら, Somatic cell. Mol. Genet., 12, 555 (1986)、以下CHO）細胞を形質転換した。形質転換の前日にCHO細胞を6 well プレートに1-0.5×105cells/２ml/wellの細胞密度で10％ウシ胎児血清（FCS、GIBCO-BRL社製）を含むYMM培地（インシュリン・トランスフェリン・エタノールアミン・亜セレン酸ナトリウムを含むアミノ酸・ビタミンを強化した核酸不含MEMアルファ培地）を用い播種した。37℃、５％CO2培養装置で一夜培養の後、リポソーム系形質転換試薬、TransIT-LT1（宝）あるいはリポフェクトアミン2000（インビトロジェン）を用いて、あらかじめキメラ抗体Ｈ鎖及びＬ鎖遺伝子発現プラスミドを等量混合し、PvuIで消化・線状化しておいたものを導入DNAとして、それぞれのプロトコールに従いトランスフェクションを行った。37℃、５％CO2培養装置で一夜培養した後、選択培地、10%透析FCS(d-FCS：GIBCO-BRL社製)、0.5 mg/ml Geneticin（G418：GIBCO-BRL社製）、300nM メトトレキサート（MTX：和光純薬工業製）を含むYMM培地に培地交換した。３〜４日毎に培地を交換しながら37℃、５％CO2培養装置で培養を続けることで選択を行い、形質転換体を得た。得られた形質転換細胞の培養上清中に含まれるキメラ抗体の濃度は、ヤギ由来抗ヒトIgG Fc抗体（CAPPEL）とプロテインA-HRP（ZYMED社）を用いたサンドイッチELISA法により測定した。この際、市販のヒトIgG1抗体（Biogenesis）の希釈系列を作製し、それを標準試料とした。このELISA法により得られた形質転換細胞の中から抗体産生量の高い細胞をスクリーニングし、次いで限界希釈法によるクローニングを行って。最終的に得られた9-4、B1、2-4、2-5由来の４種のキメラ抗体産生細胞は各々AC94、ACB1、AC24、AC25と名付けた。
Example 4: Production of chimeric antibody-producing cells
The VH and VL region genes thus obtained were digested with HindIII and BamHI (TAKARA), and the respective genes were the same as the expression vectors CAG-γ1 and CAG-1κ (J. Immnol., 167, 3266, 2001). It was incorporated into the site and a chimeric antibody expression vector was constructed. CAG-γ1 has a human antibody C region γ1 chain gene and a neomycin resistance gene (neor) as a selectable marker, and CAG-κ is a human antibody C region κ chain gene and a dihydrofolate reductase gene (selective marker). dhfr). Using the constructed chimeric antibody expression plasmid, CHO DG44 (Urlaub G et al., Somatic cell. Mol. Genet., 12, 555 (1986), hereinafter CHO) cells were transformed by the method described below. The day before transformation, CHO cells were placed in a 6-well plate at a cell density of 1-0.5 × 10 5 cells / 2 ml / well and YMM medium containing 10% fetal calf serum (FCS, manufactured by GIBCO-BRL) (insulin transferrin, Nucleic acid-free MEM alpha medium enriched with amino acids / vitamins containing ethanolamine / sodium selenite). After overnight culture at 37 ° C in a 5% CO 2 culture device, use a liposomal transformation reagent, TransIT-LT1 (Treasure) or Lipofectamine 2000 (Invitrogen) to obtain chimeric antibody H chain and L chain gene expression plasmids in advance. Equal amounts were mixed, and transfection was performed according to each protocol using the DNA digested and linearized with PvuI as the introduced DNA. After overnight culture at 37 ° C., 5% CO 2 incubator, selective medium, 10% dialyzed FCS (d-FCS: GIBCO-BRL), 0.5 mg / ml Geneticin (G418: GIBCO-BRL), 300 nM The medium was replaced with a YMM medium containing methotrexate (MTX: manufactured by Wako Pure Chemical Industries). Selection was performed by continuing the culture in a 37 ° C., 5% CO 2 culture apparatus while changing the medium every 3 to 4 days, and transformants were obtained. The concentration of the chimeric antibody contained in the culture supernatant of the obtained transformed cells was measured by a sandwich ELISA method using goat-derived anti-human IgG Fc antibody (CAPPEL) and protein A-HRP (ZYMED). At this time, a dilution series of a commercially available human IgG1 antibody (Biogenesis) was prepared and used as a standard sample. From the transformed cells obtained by this ELISA method, screen for cells with high antibody production, and then perform cloning by limiting dilution. The finally obtained 4 types of chimeric antibody-producing cells derived from 9-4, B1, 2-4, and 2-5 were named AC94, ACB1, AC24, and AC25, respectively.
2-4と2-5抗体の間でＶＬ領域がほとんど同じであることから、このＶＬをＬ鎖にして2-4及び2-5のＶＨ鎖と一つの細胞内で発現させることにより、簡単に2-4と2-5の2つの特性をもった二重特異性抗体を作製することが出来る。 Since the VL region is almost the same between the 2-4 and 2-5 antibodies, it is easy to express this VL in the L chain as 2-4 and 2-5 VH chains in one cell. In addition, bispecific antibodies having 2-4 and 2-5 characteristics can be prepared.
《実施例５：キメラ抗体の活性》
得られたキメラ抗体の神経毒素に対する結合活性をＡ型神経毒素（0.5μg/well）をコートしたプレート（FALCON, Flexible Plate）を用いて測定した。ブロッキングには0.2％BSA、２次抗体にはペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG(H+L)（1：5000，BioRad）、基質はオルソフェニレンジアミン（Nacalai Tesque）を使用した。反応は基質反応以外全て37℃２時間で行った。基質の発色反応は37℃30分で行った。これらの細胞の培養上清中の抗ボツリヌス神経毒素キメラモノクローナル抗体（抗体濃度は20〜100μg/ml）はELISAによって期待通りに毒素と結合することが示された（図２Ａ〜Ｃ）。
Example 5 Activity of Chimeric Antibody
The binding activity of the obtained chimeric antibody to neurotoxin was measured using a plate (FALCON, Flexible Plate) coated with type A neurotoxin (0.5 μg / well). 0.2% BSA was used for blocking, peroxidase-labeled anti-human IgG (H + L) (1: 5000, BioRad) was used for the secondary antibody, and orthophenylenediamine (Nacalai Tesque) was used for the substrate. All reactions except substrate reaction were performed at 37 ° C. for 2 hours. The substrate color reaction was performed at 37 ° C. for 30 minutes. The anti-botulinum neurotoxin chimeric monoclonal antibody (antibody concentration 20-100 μg / ml) in the culture supernatant of these cells was shown to bind to the toxin as expected by ELISA (FIGS. 2A-C).
さらにイムノブロッティングによる毒素との反応性を検討した。7.5%ポリアクリルアミドゲルにＡ型精製毒素を2ME処理後１レーンあたり0.2μgアプライし、SDS-PAGEを行った。泳動蛋白をニトロセルロース膜にセミドライブロッティング装置を用いて転写した後、培養上清と反応させた。２次抗体は、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgGヤギ抗体(1:3000 BioRad)、発色基質は4-chloro-1-naphtol（Nacalai Tesque）を用いた。この結果、AC24は軽鎖とAC94は神経毒素重鎖と反応していることが示唆された（図３、４）。AC25及びACB1はいずれも明確な毒素結合活性は確認できなかった。 Furthermore, the reactivity with the toxin by immunoblotting was examined. A 7.5% polyacrylamide gel was treated with 2ME of purified type A toxin, 0.2 μg per lane was applied, and SDS-PAGE was performed. The electrophoretic protein was transferred to a nitrocellulose membrane using a semi-driving apparatus and then reacted with the culture supernatant. The secondary antibody was a peroxidase-labeled anti-human IgG goat antibody (1: 3000 BioRad), and the chromogenic substrate was 4-chloro-1-naphtol (Nacalai Tesque). As a result, it was suggested that AC24 reacted with the light chain and AC94 reacted with the neurotoxin heavy chain (FIGS. 3 and 4). Neither AC25 nor ACB1 was able to confirm clear toxin binding activity.
また、各キメラ抗体の培養上清中の毒素中和活性を調べた。前述の中和活性測定と同様に、ボツリヌス神経毒素と培養上清を等量混合し、室温で30分反応させた後、マウスの腹腔内へ0.5ml接種した。毒素を培地のみと混合したコントロールが死亡した時点における、試験群の臨床症状を調べた結果、AC24、AC25、AC94、ACB1は全例が生存しており、その後も生存を続け、最終的には表１で示した2-4、2-5、9-4、B1同様の結果になった。 Moreover, the toxin neutralization activity in the culture supernatant of each chimeric antibody was examined. Similar to the above-described measurement of neutralizing activity, an equal amount of botulinum neurotoxin and culture supernatant were mixed and reacted at room temperature for 30 minutes, and then 0.5 ml was inoculated into the abdominal cavity of the mouse. As a result of investigating the clinical symptoms of the test group at the time of death of the control mixed with toxin only in the medium, all cases of AC24, AC25, AC94, and ACB1 survived, and continued to survive. The results were similar to 2-4, 2-5, 9-4, and B1 shown in Table 1.
《実施例６：二重特異性抗体》
抗A型神経毒素中和キメラ抗体のうち、AC25、AC94のそれぞれとAC24とH鎖L鎖遺伝子の交換発現実験を行った。それぞれの組合せH鎖L鎖遺伝子発現ベクターを、CHO-DG44細胞に導入し、新たに４種のキメラ抗体産生細胞（AC2425、AC2524、AC2494、AC9424）を得た。これらの細胞の培養上清中のキメラ抗体(抗体濃度14.9〜40.5μg/ml)の毒素結合能をELISAによって調べたところ、図５に示すように、いずれの抗体も毒素と結合することが示された。特に、AC9424は強い結合活性を示した。また、各培養上清中の毒素中和活性を調べたところ、表２に示すようにAC2425、AC2524は強い中和活性を示し、AC2494、AC9424はコントロールと比較して延命あるいは症状の緩和が観察された。以上のようにAC24とAC25抗体のH鎖L鎖交換を行ったところ、そのいずれの場合も毒素結合能と中和活性を保持していた。
Example 6: Bispecific antibody
Among the anti-type A neurotoxin neutralizing chimeric antibodies, exchange expression experiments of AC25, AC94, AC24 and H chain L chain genes were performed. Each combined H chain L chain gene expression vector was introduced into CHO-DG44 cells, and four new chimeric antibody-producing cells (AC2425, AC2524, AC2494, AC9424) were obtained. When the toxin-binding ability of the chimeric antibody (antibody concentration: 14.9 to 40.5 μg / ml) in the culture supernatant of these cells was examined by ELISA, as shown in FIG. 5, it was shown that any antibody bound to the toxin. It was done. In particular, AC9424 showed strong binding activity. Moreover, when the toxin neutralizing activity in each culture supernatant was examined, as shown in Table 2, AC2425 and AC2524 showed strong neutralizing activity, and AC2494 and AC9424 were observed to prolong life or alleviate symptoms compared to controls. It was done. As described above, H24 / L chain exchange between AC24 and AC25 antibodies was carried out. In both cases, toxin binding ability and neutralizing activity were retained.
さらに驚いたことに、ほとんど相同性のないAC24とAC94のH鎖L鎖を交換した場合でも、弱い中和活性と結合活性が認められた（表３）。 Even more surprisingly, even when AC24 and AC94 H chains and L chains with little homology were exchanged, weak neutralizing activity and binding activity were observed (Table 3).
以上の結果より、H鎖としてAC24、AC25、AC94由来を、L鎖としてAC24由来を持ったミックスキメラ抗体が１個の細胞で産生可能であると考えられた。L鎖としてはAC25もしくはAC94も使用可能であり、さらには、AC24、AC25、AC94、全てのH鎖L鎖の任意の組合せが可能であることをも示している。これらの可能性から、これら３種類の抗体を別々に調製して混合した場合と同様に中和力価の向上が期待でき、さらに、３種の抗体の混合製剤よりも、開発時や製造時に低コストになると示唆された。 From the above results, it was considered that a mixed chimeric antibody having AC24, AC25, and AC94 origin as the H chain and AC24 origin as the L chain can be produced in one cell. It is also shown that AC25 or AC94 can be used as the L chain, and that any combination of AC24, AC25, AC94 and all H chains and L chains is possible. From these possibilities, the neutralization titer can be expected to improve in the same way as when these three types of antibodies are separately prepared and mixed, and moreover at the time of development and manufacturing than the mixed preparation of the three types of antibodies. It was suggested that the cost would be low.
本願発明によって得られる抗ボツリヌス神経毒素組換え抗体は、ボツリヌス神経毒素に対して高力価の中和活性を有しており、これまでになかったボツリヌス神経毒素に対する二重特異性抗体をも含有するものである。このような抗ボツリヌス神経毒素組換え抗体は、ボツリヌス中毒症の臨床において、これまでになかった有効な治療剤となりうるものである。さらに、本発明により提供される抗ボツリヌス神経毒素抗体可変領域をコードする遺伝子断片は、ボツリヌス神経毒素に対して中和活性を有する抗体分子の可変領域の特異的アミノ酸配列もしくは核酸塩基配列を開示するものであり、今後、さらに進んだ遺伝子組換え技術を応用して目的の抗体分子を修飾、または一部置換等することにより、より優れた抗ボツリヌス神経毒素組換え抗体分子の開発を可能にするものである。 The anti-botulinum neurotoxin recombinant antibody obtained by the present invention has a high-titer neutralizing activity against botulinum neurotoxin, and also contains a bispecific antibody against botulinum neurotoxin that has never existed before To do. Such an anti-botulinum neurotoxin recombinant antibody can be an effective therapeutic agent that has never been available in clinical practice of botulism. Furthermore, the gene fragment encoding the anti-botulinum neurotoxin antibody variable region provided by the present invention discloses the specific amino acid sequence or nucleobase sequence of the variable region of an antibody molecule having neutralizing activity against botulinum neurotoxin. In the future, it will be possible to develop better anti-botulinum neurotoxin recombinant antibody molecules by applying further advanced gene recombination technology to modify or partially replace the target antibody molecule. Is.
このように、本願発明の方法により得られる抗ボツリヌス神経毒素組換え抗体産生細胞及び当該細胞により得られる抗ボツリヌス神経毒素組換え抗体は、医療及び研究分野において多大なる貢献をするものである。 Thus, the anti-botulinum neurotoxin recombinant antibody-producing cells obtained by the method of the present invention and the anti-botulinum neurotoxin recombinant antibody obtained by the cells greatly contribute to the medical and research fields.
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