JP2006308576A - Method and kit for detecting papilla mucous gland cancer in pancreatic duct and pancreatic cancer by pancreatic juice - Google Patents
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本発明は、膵管内乳頭粘液性腺癌（Intraductal Papillary Mucinous Cartinoma，IPMC）および膵臓癌（特に上皮内癌）の検出法及び検出キットに関する。 The present invention relates to a detection method and a detection kit for intraductal papillary mucinous cartinoma (IPMC) and pancreatic cancer (especially carcinoma in situ).
膵管内乳頭粘液性腫瘍（Intraductal papillary-mucinous tumor, IPMT）は膵管上皮に発生する腫瘍であり病理組織学的には過形成，腺種，腺癌（IPMC）に分類される。現在IPMTの良悪性の鑑別は超音波内視鏡、超音波細径プローブ、CTなどによる画像診断にて腫瘍の結節径を測定することによりなされている。しかしその診断精度は検査医の技量によるところが多く専門的な技術を要し、その診断精度は高いとはいえない。また細胞診や生検による良悪性の鑑別診断においては良好な成績が得られていない。 Intraductal papillary-mucinous tumor (IPMT) is a tumor that occurs in the pancreatic duct epithelium and is classified as hyperplasia, glandular type, or adenocarcinoma (IPMC). Currently, IPMT is differentiated between benign and malignant by measuring the nodule diameter of the tumor by image diagnosis using an ultrasonic endoscope, an ultrasonic thin-diameter probe, CT, and the like. However, the accuracy of the diagnosis depends on the skill of the examiner and requires specialized techniques, and the diagnostic accuracy is not high. Moreover, good results have not been obtained in differential diagnosis of benign and malignant by cytology or biopsy.
KL-6は、II型肺胞上皮細胞等に発現する分子量１００万以上のシアロ糖タンパク質で、クラスター９に分類されているMUC-1に属するムチンである。血清中のKL-6は、間質性肺炎のマーカーとなることが知られている（非特許文献１、特許文献１）。
本発明の課題は、ＩＰＭＣおよび膵臓癌（特に上皮内癌）を検出する方法及びそのためのキットを提供することである。 An object of the present invention is to provide a method for detecting IPMC and pancreatic cancer (particularly carcinoma in situ) and a kit therefor.
本発明者は、鋭意研究した結果、膵液中のKL-6を測定することにより、ＩＰＭＣを検出できること、及び、ＩＰＭＴの良悪性の鑑別が明確に分類できることを見出し、本発明を完成した。また膵臓癌（特に上皮内癌）の診断においても前述のとおり有用な可能性が高い。従って、本発明は、膵液中のKL-6を測定することによりＩＰＭＣまたは膵臓癌（特に上皮内癌）を検出することを特徴とする膵管上皮由来の悪性腫瘍（ＩＰＭＣまたは膵臓癌）の検出法を提供する。 As a result of intensive studies, the present inventor has found that IPMC can be detected by measuring KL-6 in pancreatic juice, and that IPMT can be clearly classified into benign and malignant, and has completed the present invention. In addition, as described above, there is a high possibility of being useful in the diagnosis of pancreatic cancer (especially carcinoma in situ). Accordingly, the present invention provides a method for detecting a malignant tumor (IPMC or pancreatic cancer) derived from pancreatic duct epithelium, characterized by detecting IPMC or pancreatic cancer (particularly carcinoma in situ) by measuring KL-6 in pancreatic juice. I will provide a.
また、本発明は、本発明の検出法に用いるための、抗KL-6抗体を含むＩＰＭＣまたは膵臓癌（特に上皮内癌）の検出キットを提供する。 The present invention also provides a detection kit for IPMC or pancreatic cancer (particularly carcinoma in situ) containing an anti-KL-6 antibody for use in the detection method of the present invention.
本発明によれば、ＩＰＭＣを、侵襲性が低い方法で精度よく検出でき、また、IPMTの良悪性の鑑別診断が可能である。さらに現在臨床的に診断が困難な浸潤前の膵臓癌（上皮内癌）の存在診断に有用である可能性が高い。 According to the present invention, IPMC can be accurately detected by a less invasive method, and benign / malignant differential diagnosis of IPMT is possible. Furthermore, it is likely to be useful for the diagnosis of the presence of pancreatic cancer (intraepithelial carcinoma) before invasion, which is currently difficult to diagnose clinically.
＜１＞本発明の検出法
本発明の検出法は、膵液中のKL-6を測定することによりＩＰＭＣまたは膵臓癌（特に上皮内癌）を検出することを特徴とする。本発明の検出法は、通常には、膵液中のKL-6を測定する工程、及び、測定結果に基づきＩＰＭＣまたは膵臓癌（特に上皮内癌）を検出する工程を含む。
<1> Detection Method of the Present Invention The detection method of the present invention is characterized by detecting IPMC or pancreatic cancer (particularly carcinoma in situ) by measuring KL-6 in pancreatic juice. The detection method of the present invention usually comprises a step of measuring KL-6 in pancreatic juice and a step of detecting IPMC or pancreatic cancer (particularly carcinoma in situ) based on the measurement result.
膵液中のKL-6の測定は、KL-6の通常の測定法によって行うことができる。例えば、抗KL
-6抗体を用いた免疫学的方法が挙げられる。
Measurement of KL-6 in pancreatic juice can be carried out by a usual measurement method for KL-6. For example, anti-KL
An immunological method using -6 antibody.
抗KL-6抗体は、KL-6を抗原として用いて、通常の方法により作成することができる（例えば、Kohno N. et al., Jap. J. Clin. Oncol. 18:203-26, 1988参照）。 An anti-KL-6 antibody can be prepared by a conventional method using KL-6 as an antigen (for example, Kohno N. et al., Jap. J. Clin. Oncol. 18: 203-26, 1988). reference).
例えば、哺乳動物（例えばマウス、ハムスター又はウサギ）を、該哺乳動物において免疫応答を引き起こす免疫原の形態のKL-6で免疫することができる。FK-6は、公知の方法により精製することができる。 For example, a mammal (eg, a mouse, hamster or rabbit) can be immunized with KL-6 in the form of an immunogen that elicits an immune response in the mammal. FK-6 can be purified by a known method.
精製されたKL-6又はその一部をアジュバントと共に免疫後、抗血清を得ることができ、所望なら抗血清からポリクローナル抗体を単離することができる。また、モノクローナル抗体を産生するには、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫動物より回収し、標準的な細胞融合法によりミエローマ細胞と融合させて細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を得る。かかる技術は当該技術分野では確立された方法であり、適当なマニュアル（Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Mannual, 1998, Cold Spring Harbor Laboratory）に準じて行うことができる。更に、モノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbar et al., Immunol. Today, 4: 72, 1983）、EBV-ハイブリドーマ法（Cole et al., Monoclonal Antibody inCancer Therapy, 1985, Allen
R. Bliss, Inc., pages 77-96）、コンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング（Huse et al., Science, 246: 1275, 1989）等他の方法により作製してもよい。
Antiserum can be obtained after immunization of purified KL-6 or a part thereof with an adjuvant, and if desired, polyclonal antibodies can be isolated from the antiserum. In order to produce a monoclonal antibody, antibody-producing cells (lymphocytes) are collected from an immunized animal and fused with myeloma cells by a standard cell fusion method to immortalize the cells to obtain hybridoma cells. Such a technique is an established method in the art, and can be performed according to an appropriate manual (Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, 1998, Cold Spring Harbor Laboratory). Furthermore, the monoclonal antibody is a human B cell hybridoma method (Kozbar et al., Immunol. Today, 4: 72, 1983), an EBV-hybridoma method (Cole et al., Monoclonal Antibody in Cancer Therapy, 1985, Allen
R. Bliss, Inc., pages 77-96) and combinatorial antibody library screening (Huse et al., Science, 246: 1275, 1989).
抗KL-6抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。 The anti-KL-6 antibody may be polyclonal or monoclonal, but is preferably a monoclonal antibody.
免疫学的方法は、抗KL-6抗体を用いる他は通常の方法と同様でよい。免疫学的方法には、その検出方法によって、放射性物質標識物を用いる方法、ラテックス凝集方法、蛍光標識物を用いる方法、電気化学発光を用いる方法、酵素を用いる方法などがあり、特に限定されるものではないが、本発明の検出法は、安全で簡便なことから酵素免疫測定法（ELISA）または電気化学発光法（ECL）であることが好ましい。 The immunological method may be the same as the usual method except that an anti-KL-6 antibody is used. Depending on the detection method, immunological methods include a method using a radioactive substance label, a latex agglutination method, a method using a fluorescent label, a method using electrochemiluminescence, a method using an enzyme, and the like, and are particularly limited. Although not intended, the detection method of the present invention is preferably enzyme immunoassay (ELISA) or electrochemiluminescence (ECL) because it is safe and simple.
ELISAにおいては、その測定方式として様々な方法が知られているが、特に簡便で定量性が高い方法としてペルオキシダーゼを標識酵素として用いたサンドイッチ方式を用いることが好ましい。具体的には、抗KL-6抗体をマイクロプレートやカップの底面などの固相に吸着させる。次に、固相への自然吸着を低減するためにミルクカゼインなどのブロッキングタンパク質を吸着させる。そこへあらかじめ濃度の明らかな標準KL-6溶液と試料（必要により希釈）を加えて一定時間静置する。試料中のKL-6を固相上の抗体に免疫学的に結合させた後に固相を洗浄し、今度はペルオキシダーゼなどの酵素標識した抗体を適当な濃度で加える。一定時間静置して固相上の抗体とKL-6と標識抗体の三者の複合体を固相上に形成させる。その後に固相を洗浄して、過酸化水素とABTS等の酵素基質及び発色剤の混合溶液を添加し標識酵素による発色を得る。酵素反応を、阻害剤の添加などにより停止させた後に、その発色の吸光度をプレートリーダー等の機器により測定する。試料の吸光度と標準品の吸光度を、検量線等を用いて比較することにより試料中のFK-6量を知ることができる。 In ELISA, various methods are known as its measurement method, but it is preferable to use a sandwich method using peroxidase as a labeling enzyme as a particularly simple and highly quantitative method. Specifically, the anti-KL-6 antibody is adsorbed on a solid phase such as a microplate or a cup bottom. Next, a blocking protein such as milk casein is adsorbed in order to reduce spontaneous adsorption to the solid phase. Add standard KL-6 solution with clear concentration and sample (diluted if necessary) in advance, and let stand for a certain period of time. After the KL-6 in the sample is immunologically bound to the antibody on the solid phase, the solid phase is washed, and then an enzyme-labeled antibody such as peroxidase is added at an appropriate concentration. Allow to stand for a certain period of time to form a complex of the antibody on the solid phase, KL-6 and labeled antibody on the solid phase. Thereafter, the solid phase is washed, and a mixed solution of an enzyme substrate such as hydrogen peroxide and ABTS and a color former is added to obtain color by the labeling enzyme. After stopping the enzyme reaction by adding an inhibitor or the like, the absorbance of the developed color is measured with an instrument such as a plate reader. The amount of FK-6 in the sample can be determined by comparing the absorbance of the sample with the absorbance of the standard product using a calibration curve or the like.
ECLにおいては、上記ELISAの酵素標識した抗体に代えて、ルテニウム等の金属錯体で標識した抗体を用い、電圧を加えてその発光を計測する。 In ECL, an antibody labeled with a metal complex such as ruthenium is used in place of the enzyme-labeled antibody of the ELISA, and the luminescence is measured by applying voltage.
以下、固相抗体と標識抗体に同一の抗KL-6マウスモノクローナル抗体（以下、抗KL-6モノクローナル抗体）を用いたサンドイッチ型酵素免疫測定法（Enzyme Immunoassay; EIA）を例として、手順を説明する。 The procedure is described below using a sandwich enzyme immunoassay (EIA) as an example using the same anti-KL-6 mouse monoclonal antibody (hereinafter referred to as anti-KL-6 monoclonal antibody) for the solid phase antibody and the labeled antibody. To do.
(1)抗KL-6モノクローナル抗体を固相化させたカップ内に検体を加える。これにより、KL-6はその量に応じてカップ内の固相抗体と結合する。
(2)次に未反応物を洗浄除去し、酵素標識抗KL-6モノクローナル抗体を加えて反応させる。これにより、結合したKL-6の量に応じた固相抗体−抗原−酵素標識抗体から成るサンドイッチ結合物を形成される。
(3)未反応酵素標識抗体を洗浄除去した後、基質液をカップ内に加える。これにより、結合した酵素標識抗体により基質が分解され発色する。
(4)固相に結合した酵素の活性は検体中のKL-6量を反映しているので、反応液の吸光度を測定し、その値を標準抗原の吸光度と対比することにより検体中のKL-6濃度を測定する。
(1) Add a sample into a cup in which an anti-KL-6 monoclonal antibody is immobilized. Thereby, KL-6 binds to the solid phase antibody in the cup according to the amount.
(2) Next, unreacted substances are washed away, and an enzyme-labeled anti-KL-6 monoclonal antibody is added and reacted. As a result, a sandwich conjugate comprising a solid phase antibody-antigen-enzyme labeled antibody according to the amount of bound KL-6 is formed.
(3) After washing away unreacted enzyme-labeled antibody, the substrate solution is added to the cup. As a result, the substrate is decomposed by the bound enzyme-labeled antibody to develop color.
(4) Since the activity of the enzyme bound to the solid phase reflects the amount of KL-6 in the sample, the absorbance of the reaction solution is measured, and the value is compared with the absorbance of the standard antigen. -6 Measure the concentration.
またKL-6濃度は、市販の測定キット、例えばエイテストKL-6（エーザイ社製）を用いて測定してもよい。 The KL-6 concentration may be measured using a commercially available measurement kit such as Eitest KL-6 (manufactured by Eisai Co., Ltd.).
測定結果に基づくＩＰＭＣまたは膵臓癌（特に上皮内癌）の検出は、通常には、KL-6値が健常人の値よりも大きい場合にＩＰＭＣまたは膵臓癌（特に上皮内癌）である（またはＩＰＭＣおよび膵臓癌（特に上皮内癌）である可能性が高い）と判定することにより行われる。比較においては、健常人における値のばらつきを考慮して、統計的に有意に大きい場合にＩＰＭＣであるとしてもよい。カットオフ値を標準偏差などに基づいて定め（例えば、平均値＋１標準偏差）、カットオフ値との比較により判定してもよい。 Detection of IPMC or pancreatic cancer (especially carcinoma in situ) based on the measurement results is usually IPMC or pancreatic cancer (especially carcinoma in situ) when the KL-6 value is greater than that of healthy individuals (or IPMC and pancreatic cancer (especially cancer in situ) are determined). In the comparison, IPMC may be used when the value is statistically significantly large in consideration of variation in values in healthy persons. The cut-off value may be determined based on a standard deviation (for example, average value + 1 standard deviation), and may be determined by comparison with the cut-off value.
本発明の検出法は、造影ＣＴ検査によるＩＰＭＣ検出と組み合わせてもよい。 The detection method of the present invention may be combined with IPMC detection by contrast CT examination.
＜２＞本発明の検出キット
本発明の検出キットは、本発明の検出法に用いるためのＩＰＭＣまたは膵臓癌（特に上皮内癌）の検出キットであり、抗KL-6抗体を含むことを特徴とする。
<2> Detection Kit of the Present Invention The detection kit of the present invention is a detection kit for IPMC or pancreatic cancer (particularly carcinoma in situ) for use in the detection method of the present invention, and comprises an anti-KL-6 antibody. And
本発明の検出キットの構成は、抗KL-6抗体を用いる他は、通常の免疫学的測定キットと同様でよい。抗KL-6抗体については、本発明の検出法に関して説明した通りである。 The configuration of the detection kit of the present invention may be the same as that of a normal immunoassay kit except that an anti-KL-6 antibody is used. The anti-KL-6 antibody is as described for the detection method of the present invention.
本発明の検出キットは、固相に固定された抗KL-6抗体、及び、酵素により標識されている抗KL-6抗体を含むことが好ましい。固相としては、通常のサンドイッチ法に使用されるものが挙げられ、形状や材質は特に限定されない。具体的には、マイクロタイタープレート、カップなどが挙げられる。抗体の固相への固定は、通常の方法に従って行うことができる。標識としては、通常のサンドイッチ法に使用されるものが挙げられ、例えば、放射性物質、ラテックス、蛍光物質、化学発光物質、金属コロイド粒子、酵素、ECLに用いる金属錯体などが挙げられる。本発明の検出キットにおいては、標識は酵素または金属錯体であることが好ましい。標識と抗体との結合は、通常の方法に従って行うことができる。本発明の検出キットにおける抗体は溶液とされたものでも、凍結乾燥されたものであってもよい。 The detection kit of the present invention preferably contains an anti-KL-6 antibody immobilized on a solid phase and an anti-KL-6 antibody labeled with an enzyme. Examples of the solid phase include those used in ordinary sandwich methods, and the shape and material are not particularly limited. Specific examples include a microtiter plate and a cup. Immobilization of the antibody to the solid phase can be performed according to a usual method. Examples of the label include those used in a normal sandwich method, and examples include radioactive substances, latexes, fluorescent substances, chemiluminescent substances, metal colloid particles, enzymes, and metal complexes used for ECL. In the detection kit of the present invention, the label is preferably an enzyme or a metal complex. The label and the antibody can be bound according to a usual method. The antibody in the detection kit of the present invention may be a solution or lyophilized.
本発明の検出キットは、抗KL-6抗体の他に、免疫学的測定キットが通常に含む構成要素を含んでもよい。このような構成要素としては、標準抗原、試料希釈液、固相抗体（例えば、抗体を固相化したカップ）、反応用緩衝液、洗浄液、及び、標識抗体（例えば、酵素で標識した抗体）の１種または２種以上が挙げられる。標識が酵素の場合には、さらに酵素反応に必要な構成要素（例えば、酵素基質、発色剤、反応停止液など）を含んでもよい。 In addition to the anti-KL-6 antibody, the detection kit of the present invention may contain components that are usually included in an immunological measurement kit. Such components include standard antigen, sample diluent, solid phase antibody (for example, a cup in which the antibody is immobilized), reaction buffer, washing solution, and labeled antibody (for example, an antibody labeled with an enzyme). 1 type, or 2 or more types. When the label is an enzyme, it may further contain components necessary for the enzyme reaction (for example, an enzyme substrate, a color former, a reaction stop solution, etc.).
本発明の検出キットは、ＩＰＭＣの診断薬として使用できる。 The detection kit of the present invention can be used as a diagnostic agent for IPMC.
本発明の実施例を以下に示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。 Examples of the present invention are shown below, but the present invention is not limited to the examples.
各種膵臓疾患患者の膵液１９検体（膵炎３例、ＩＰＭＴ１２例、ＩＰＭＣ２例、膵癌２例）における、KL-6、CA19-9及びCEAを測定した。 KL-6, CA19-9 and CEA were measured in 19 specimens of pancreatic juice (3 cases of pancreatitis, 12 cases of IPMT, 2 cases of IPMC, 2 cases of pancreatic cancer) from patients with various pancreatic diseases.
検体は、側視型十二指腸内視鏡を用い、十二指腸主乳頭に「コントアERCPカニュレ3086」を挿入し、膵管内にあることをレントゲン透視及び吸引で黄色の胆汁が引けないことにより確認し、５〜１０分程度弱い陰圧をかけて３ｍｌ程度採取した。 Using a side-view type duodenoscope, insert the “Contour ERCP cannula 3086” into the main papilla of the duodenum and confirm that it is in the pancreatic duct by X-ray fluoroscopy and aspiration. About 3 ml was collected under a negative pressure of about 10 minutes.
KL-6は、エイテストKL-6（エーザイ社製）にて測定した。CA19-9は、CA19-9 RIAキット「TFB」（FUJI REBIO DIAGNOSTICS社製）にて測定した。CEAは、アーキテクトCEA（ダイナボット社製）にて測定した。 KL-6 was measured with E-test KL-6 (manufactured by Eisai Co., Ltd.). CA19-9 was measured with a CA19-9 RIA kit “TFB” (manufactured by FUJI REBIO DIAGNOSTICS). CEA was measured by Architect CEA (manufactured by Dynabot).
結果を図１〜３に示す。それぞれ図２及び３に示す、CA19-9及びCEAの測定値は、膵炎、ＩＰＭＴ、ＩＰＭＣ及び膵癌で分布が重なっており診断の指標することは難しいと考えられた。これに対し図１に示すKL-6の測定値は、膵炎、ＩＰＭＴと比べてＩＰＭＣ及び膵癌、特にＩＰＭＣで高値を示し、ＩＰＭＣ及び膵癌の指標として有用であると考えられた。KL-6値を指標とすることにより、ＩＰＭＣ及び膵癌が明確に検出できること、ＩＰＭＴの良悪性を明確に診断できることが判明した。 The results are shown in FIGS. The measured values of CA19-9 and CEA shown in FIGS. 2 and 3, respectively, are overlapped in pancreatitis, IPMT, IPMC, and pancreatic cancer, and it was considered difficult to provide an index for diagnosis. On the other hand, the measured values of KL-6 shown in FIG. 1 were higher in IPMC and pancreatic cancer, particularly IPMC than pancreatitis and IPMT, and were considered useful as indicators of IPMC and pancreatic cancer. It was found that by using the KL-6 value as an index, IPMC and pancreatic cancer can be clearly detected and IPMT benign and malignant can be clearly diagnosed.
更に各種膵臓疾患患者の症例数を増やして（膵炎１０例、ＩＰＭＴ１４例、ＩＰＭＣ４例、膵癌１３例）、膵液検体におけるKL-6を測定した。結果を図４に示す。なお、実施例１における膵炎の検体のうち、検体が適切に採取されていないことが判明した１例、及び、慢性膵炎の特殊型（groove pancreatitis）と判明した１例は除外した。 Furthermore, the number of patients with various pancreatic diseases was increased (10 cases of pancreatitis, 14 cases of IPMT, 4 cases of IPMC, 13 cases of pancreatic cancer), and KL-6 in the pancreatic juice specimen was measured. The results are shown in FIG. In addition, among the samples of pancreatitis in Example 1, one case where it was found that the sample was not properly collected and one case where it was found that it was a special type of chronic pancreatitis (groove pancreatitis) were excluded.
カットオフ値を膵炎患者の最高値が超えない10U/mlに設定すると、ＩＰＭＴで１／１４例が、ＩＰＭＣで４／４例が、膵癌で５／１３例がカットオフ値以上の値を示した。KL-6が高値を示す患者はＩＰＭＣあるいは膵癌であり、KL-6は特異性高くＩＰＭＣ及び膵癌を検出できることが明らかとなった。 When the cut-off value is set to 10 U / ml, which does not exceed the maximum value for patients with pancreatitis, 1/14 cases in IPMT, 4/4 cases in IPMC, and 5/13 cases in pancreatic cancer show values that are higher than the cut-off value. It was. It was revealed that patients with high KL-6 levels have IPMC or pancreatic cancer, and KL-6 can detect IPMC and pancreatic cancer with high specificity.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20060704 |