JP2006296318A - Algicidal peptide for algae causing red water and use of the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、赤潮の原因となる珪藻を殺藻するペプチドおよびその利用に関するものである。 The present invention relates to a peptide that kills diatoms that cause red tide and uses thereof.
Skeletonema costatum （以下「S. costatum」と称する）は、主に冬期に有明海で赤潮を形成する珪藻である。上記の通り、赤潮の原因となる藻類（珪藻類、鞭毛藻類等）を総じて赤潮藻類と称する。S. costatumの赤潮形成により海中の栄養分は不足し、赤潮発生領域で養殖しているノリが黒く色付かない「色落ち」現象が生じることが知られている。 Skeletonema costatum (hereinafter referred to as “S. costatum”) is a diatom that forms a red tide in the Ariake Sea mainly in winter. As described above, algae that cause red tides (diatoms, flagellates, etc.) are generally referred to as red tide algae. It is known that the red tide formation of S. costatum causes a lack of nutrients in the sea, and the “color fading” phenomenon occurs in which the laver cultivated in the red tide generation area does not turn black.
一方、赤潮珪藻を殺藻する細菌が存在することが知られている。例えば、有明海から分離された海洋性細菌Pseudoalteromonas sp. A28株（以下、「A28株」と称する）は、S. costatumを殺藻する能力を有することが非特許文献１に記載されている。 On the other hand, it is known that there exists a bacterium that kills red tide diatoms. For example, it is described in Non-Patent Document 1 that a marine bacterium Pseudoalteromonas sp. A28 strain (hereinafter referred to as “A28 strain”) isolated from the Ariake Sea has the ability to kill algae of S. costatum.
図２は、赤潮藻類S. costatumとA28株とを混合培養した結果を示す図であり、混合培養開始時（同図（ａ））および混合培養開始から６日後（同図（ｂ））の状態を示している。同図に示すように、S. costatumとA28株とを６日間混合培養することにより、S. costatumは略完全に殺藻される。この結果から、A28株が赤潮藻類に対する殺藻活性を有していることが理解できる。 FIG. 2 is a diagram showing the results of mixed culture of the red tide algae S. costatum and the A28 strain at the start of mixed culture (FIG. (A)) and 6 days after the start of mixed culture (FIG. (B)). Indicates the state. As shown in the figure, S. costatum is almost completely killed by S. costatum and A28 strain mixed culture for 6 days. From this result, it can be understood that the A28 strain has an algicidal activity against red tide algae.
本発明の発明者らは、非特許文献２に記載の発明において、A28株を単独で培養した液体培地の上清をS. costatum培養液に添加するとS. costatumは殺藻されることから、A28株は何らかの殺藻物質を菌体外に分泌していることを明らかにした。さらに、遺伝学的および生化学的解析から、上記殺藻物質が菌体外分泌セリンプロテアーゼであることを明らかにした。以下にA28株の培養液から上記セリンプロテアーゼを精製した結果を示す。 The inventors of the present invention, in the invention described in Non-Patent Document 2, because S. costatum is algaecidal when the supernatant of a liquid medium obtained by culturing A28 strain alone is added to the S. costatum culture solution. Strain A28 revealed that some algicidal substance was secreted outside the cells. Furthermore, genetic and biochemical analyzes revealed that the algicidal substance is an exocrine serine protease. The results of purifying the serine protease from the culture solution of the A28 strain are shown below.
図３（ａ）はA28株の菌体外分泌セリンプロテアーゼの各精製過程における精製画分のSDS-PAGEの結果を示し、図３（ｂ）は上記セリンプロテアーゼの赤潮藻類（S. costatum）に対する殺藻試験の結果を示す図である。図３（ａ）において、Ａはサイズマーカーを、Ｂは濃縮した培養上清を、ＣはPOROS HQカラム画分を、Ｄは精製酵素画分を、それぞれ電気泳動を行った結果を示している（詳細については非特許文献２を参照）。この結果から、単一のバンドを形成するタンパク質が精製されていることが分かる。 Fig. 3 (a) shows the results of SDS-PAGE of purified fractions in each purification process of the exogenous serine protease of A28 strain, and Fig. 3 (b) shows the killing of the serine protease against red tide algae (S. costatum). It is a figure which shows the result of an algae test. In FIG. 3 (a), A indicates the size marker, B indicates the concentrated culture supernatant, C indicates the POROS HQ column fraction, and D indicates the purified enzyme fraction. (See Non-Patent Document 2 for details). This result shows that the protein which forms a single band is purified.
また、図３（ｂ）に示すように、精製された菌体外セリンプロテアーゼを円形のろ紙に含ませたものをS. costatumが生えている寒天培地上に静置した。コントロールとしてA28株用の新鮮な培養液をろ紙に含ませたものを用いた。その結果、同図に示すように、精製された菌体外セリンプロテアーゼを含ませたろ紙の周辺のS. costatumは殺藻され、培地は透明になった。この結果より、上記菌体外セリンプロテアーゼは赤潮藻類（S. costatum）に対する殺藻活性を示すことが明らかになった。 In addition, as shown in FIG. 3 (b), the purified extracellular serine protease contained in a circular filter paper was allowed to stand on an agar medium where S. costatum grew. As a control, a filter medium containing a fresh culture solution for strain A28 was used. As a result, as shown in the figure, S. costatum around the filter paper containing the purified extracellular serine protease was algae killed and the medium became transparent. From this result, it was revealed that the extracellular serine protease exhibits algicidal activity against red tide algae (S. costatum).
赤潮藻類（S. costatum）に対する殺藻物質がプロテアーゼであることが示されたため、本発明の発明者らは、市販されているプロテアーゼ（アクチナーゼE、ペプシン、トリプシン、ズブチリシン等）の赤潮藻類（S. costatum）に対する殺藻活性を調べた。しかし、いずれのプロテアーゼも赤潮藻類（S. costatum）に対する殺藻活性を示さなかった。この結果から、菌体外プロテアーゼが赤潮藻類（S. costatum）に対する殺藻活性を発揮するためには、タンパク質分解活性だけではなく、それ以外の何らかの機能が必要ではないかと考えられた。
赤潮藻類（特にS. costatum）に対する殺藻物質がプロテアーゼであることが示されたため、当該プロテアーゼを大量生産すれば、赤潮藻類に対する殺藻剤として利用できる。しかしながら、A28株の菌体外セリンプロテアーゼのアミノ酸配列および当該プロテアーゼをコードする遺伝子の塩基配列は明らかになっていないため、遺伝子工学的な手法、例えば大腸菌発現系を用いたタンパク質生産方法、を用いて当該プロテアーゼを生産することはできない。それゆえ、当該プロテアーゼを大量生産し、赤潮藻類に対する殺藻剤として利用することは産業上困難である。 Since it was shown that the algicidal substance for red tide algae (especially S. costatum) is a protease, if the protease is mass-produced, it can be used as an algicide for red tide algae. However, since the amino acid sequence of the extracellular serine protease of the A28 strain and the base sequence of the gene encoding the protease have not been clarified, a genetic engineering technique such as a protein production method using an E. coli expression system is used. Thus, the protease cannot be produced. Therefore, it is industrially difficult to mass-produce the protease and use it as an algicide for red tide algae.
また、上述したように上記プロテアーゼのどの領域が赤潮藻類に対する殺藻に関与しているのかは明らかになっていない。上記領域が明らかになれば、当該領域のみを大腸菌等の宿主内において発現させることにより、当該プロテアーゼの全領域を発現させる場合よりも発現効率を高めることができる可能性があるとともに、外来タンパク質を発現させることによる宿主への悪影響（例えば、宿主菌の増殖効率の低下）を少なくすることができる可能性がある。 In addition, as described above, it is not clear which region of the protease is involved in algicidal activity against red tide algae. If the above region is clarified, expression of only the region in a host such as E. coli may increase the expression efficiency compared to the case where the entire region of the protease is expressed, and the foreign protein There is a possibility that adverse effects on the host due to the expression (for example, reduction in the growth efficiency of host bacteria) can be reduced.
本発明は、上記の問題点を解決するためになされたもので、その目的は、A28株の菌体外セリンプロテアーゼをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を明らかにするとともに、当該プロテアーゼのどの領域が赤潮藻類に対する殺藻活性を有するのかを明らかにすることにより、大量生産が容易な赤潮藻類に対する殺藻活性ペプチドおよび当該ペプチドを含む赤潮藻類に対する殺藻剤を提供することにある。 The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and its purpose is to clarify the DNA sequence of the gene encoding the extracellular serine protease of the A28 strain, and to determine which region of the protease is red tide. It is an object of the present invention to provide an algicidal active peptide against red tide algae that can be easily mass-produced and an algicidal agent against red tide algae containing the peptide by clarifying whether it has algicidal activity against algae.
本発明者らは、上記の課題を解決するために、A28株の菌体外セリンプロテアーゼをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を決定した。この新規遺伝子は、発明者らによりespIと命名された。そして、生化学的な解析から、当該espI遺伝子がコードする菌体外セリンプロテアーゼ（以下、「EspIプロテアーゼ」と称する）のＣ末端領域は、赤潮藻類の細胞に結合する活性を有していること、さらには、当該Ｃ末端領域のみで赤潮藻類を殺藻することができることが明らかとなった。上記の結果から、本発明者らは、EspIプロテアーゼのＣ末端領域が赤潮藻類の殺藻において重要であり、当該Ｃ末端領域を有するペプチドを生産することにより、容易に赤潮藻類殺藻ペプチドを提供できると結論付け、本発明を完成させるに至った。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors isolated a gene encoding an extracellular serine protease of the A28 strain and determined its base sequence. This novel gene was named espI by the inventors. From the biochemical analysis, the C-terminal region of the extracellular serine protease (hereinafter referred to as “EspI protease”) encoded by the espI gene has an activity of binding to red tide algae cells. Furthermore, it was revealed that red tide algae can be killed only by the C-terminal region. From the above results, the present inventors provide the red tide algal algicidal peptide easily by producing a peptide having the C terminal region because the C terminal region of EspI protease is important in the algicidal activity of red tide algae. It was concluded that it was possible to complete the present invention.
即ち、本発明は、学術上または産業上有用な方法・物質として、下記Ａ）〜Ｐ）の発明を含むものである。 That is, the present invention includes the following A) to P) as academically or industrially useful methods and substances.
Ａ）赤潮藻類殺藻活性を有するペプチドであって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
を含むことを特徴とするペプチド。
A) a peptide having red tide algae algicidal activity,
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; or (b) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added,
A peptide characterized by comprising
Ｂ）赤潮藻類殺藻活性を有するペプチドであって、
（ａ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
を含むことを特徴とするペプチド。
B) a peptide having red tide algae algicidal activity,
(A) an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10; or (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10,
A peptide characterized by comprising
Ｃ）Ａのペプチドをコードするポリヌクレオチド。 C) A polynucleotide encoding the peptide of A.
Ｄ）Ｂのペプチドをコードするポリヌクレオチド。 D) A polynucleotide encoding the peptide of B.
Ｅ）配列番号３または１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、赤潮藻類殺藻活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド。 E) It encodes a peptide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 11 and has red tide algae algicidal activity. Polynucleotide.
Ｆ）Ｃ）〜Ｅ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むベクター。 F) A vector comprising the polynucleotide of any one of C) to E).
Ｇ）Ｃ）〜Ｅ）のいずれかのポリヌクレオチドを導入してなる形質転換体。 G) A transformant introduced with the polynucleotide of any one of C) to E).
Ｈ）Ｆ）のベクターを用いることを特徴とするペプチドの製造方法。 H) A method for producing a peptide, comprising using the vector of F).
Ｉ）Ｇの形質転換体を用いることを特徴とするペプチドの製造方法。 I) A method for producing a peptide, comprising using a transformant of G.
Ｊ）Ｃ）〜Ｅ）のいずれかのポリヌクレオチドにおける少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いた検出器具。 J) A detection instrument using, as a probe, at least a part of the base sequence of the polynucleotide of any one of C) to E) or its complementary sequence.
Ｋ）Ａ）またはＢ）のペプチドと結合する抗体。 K) An antibody that binds to the peptide of A) or B).
Ｌ）Ａ）またはＢ）のペプチドを固定してなる担体。 L) A carrier obtained by immobilizing the peptide of A) or B).
Ｍ）Ａ）またはＢ）のペプチドを含むことを特徴とする赤潮藻類殺藻用薬剤。 M) A red tide algae-killing agent comprising the peptide of A) or B).
Ｎ）Ａ）またはＢ）のペプチドを含むことを特徴とする魚用飼料。 N) A fish feed comprising the peptide of A) or B).
Ｏ）Ａ）またはＢ）のペプチドを細胞表層に発現する微生物。 O) A microorganism that expresses the peptide of A) or B) on the cell surface.
Ｐ）Ａ）またはＢ）のペプチドを用いた赤潮藻類の殺藻方法。 P) A method for killing red tide algae using the peptide of A) or B).
本発明に係るペプチドは、赤潮藻類殺藻活性を有するペプチドである。それゆえ、赤潮藻類を効果的に殺藻することができ、赤潮による被害を低減することができる手段を提供できるという効果を奏する。 The peptide according to the present invention is a peptide having red tide algae algicidal activity. Therefore, it is possible to effectively kill the red tide algae and to provide a means capable of reducing damage caused by the red tide.
また本発明に係るペプチドは、比較的小さなサイズのペプチドである。したがって遺伝子工学的手法等によって、本発明に係るペプチドを大量かつ簡便に生産することができるという効果を奏する。 The peptide according to the present invention is a peptide having a relatively small size. Therefore, the peptide according to the present invention can be produced easily and in large quantities by genetic engineering techniques.
本発明の実施の形態について以下に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。 Embodiments of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to the following descriptions.
（１）本発明に係るペプチドおよびその遺伝子の特徴
本発明に係るペプチドは、赤潮藻類の細胞を死に至らしめる活性（赤潮藻類殺藻活性）を有しているものである。上記赤潮藻類殺藻活性とは、赤潮藻類の細胞の生命活動を停止させる活性または当該細胞の増殖を停止させる活性を意味している。上記活性の検出方法としては、図３（ｂ）に示した方法を挙げることができる。すなわち、赤潮藻類が生えている寒天培地等の培地上に、検査対象となるペプチドを含む溶液をしみ込ませたろ紙を静置し、２０℃で一晩培養し、上記ろ紙の周りの藻類が死ぬことにより透明な領域が形成されるかどうかで上記活性を検出できる。また、別の方法として、赤潮藻類の細胞を新鮮な培養液に移植し、さらに検査対象となるペプチドを添加し、２０℃で３〜５日間培養した後に、当該細胞が増殖したかどうかを調べることにより上記活性を検出できる。細胞が増殖したかどうかは、培養液の色の変化を調べることによって確認できるとともに、吸光光度計により培養液の濁度を測定することによっても確認できる。
本実施の形態では、本発明に係るペプチドの一例として、海洋性細菌A28株が分泌するEspIプロテアーゼを挙げて説明する。このEspIプロテアーゼは、赤潮藻類S. costatumを殺藻するプロテアーゼとして、その存在は既に知られていたが、本発明の発明者らによって当該プロテアーゼをコードする遺伝子の塩基配列およびそのアミノ酸配列が明らかになったものである。
(1) Peptide according to the present invention and characteristics of the gene The peptide according to the present invention has an activity (red tide algal algicidal activity) that causes red tide algae cells to die. The red tide algae algicidal activity means an activity for stopping the life activity of cells of the red tide algae or an activity for stopping the proliferation of the cells. Examples of the activity detection method include the method shown in FIG. That is, a filter paper soaked with a solution containing the peptide to be examined is placed on a medium such as an agar medium where red tide algae grow, and cultured overnight at 20 ° C., and the algae around the filter paper die. Thus, the activity can be detected depending on whether a transparent region is formed. As another method, red tide algae cells are transplanted into a fresh culture solution, a peptide to be examined is added, and after culturing at 20 ° C. for 3 to 5 days, it is examined whether the cells have grown. Thus, the activity can be detected. Whether or not the cells have grown can be confirmed by examining the change in the color of the culture solution, and can also be confirmed by measuring the turbidity of the culture solution with an absorptiometer.
In the present embodiment, an EspI protease secreted by the marine bacterium A28 strain will be described as an example of the peptide according to the present invention. The existence of this EspI protease is already known as a protease that kills the red tide algae S. costatum, but the inventors of the present invention have revealed the nucleotide sequence of the gene encoding the protease and the amino acid sequence thereof. It has become.
本発明の発明者らは、大腸菌発現系によりEspIプロテアーゼの全長を含むタンパク質を発現させることを試みた。しかし、大腸菌（BL21（DE3））に当該遺伝子を導入したところ、形質転換株の増殖は非常に悪くなってしまい、EspIプロテアーゼを大量生産できなかった。そこで、A28株のespI遺伝子破壊株を宿主として利用した発現系の構築を試みたが、この系ではespIの遺伝子導入すらできなかった。しかし、EspIプロテアーゼのＣ末端領域のみを発現させることには成功し、当該Ｃ末端領域のみで赤潮藻類殺藻活性を示すことを発見した。 The inventors of the present invention tried to express a protein containing the full length of EspI protease by an E. coli expression system. However, when the gene was introduced into Escherichia coli (BL21 (DE3)), the growth of the transformed strain became very bad, and EspI protease could not be produced in large quantities. Therefore, an attempt was made to construct an expression system using the A28 strain espI gene-disrupted strain as a host, but even this system could not introduce the espI gene. However, the inventors have succeeded in expressing only the C-terminal region of EspI protease, and have found that only the C-terminal region exhibits red algal algicidal activity.
このように上記Ｃ末端領域の発現が容易なのは、当該Ｃ末端領域はプロテアーゼ活性を持たないため、当該Ｃ末端領域を宿主菌内で大量発現させても、当該宿主菌に対して悪影響を及ぼさないためであると推測される。 As described above, the expression of the C-terminal region is easy because the C-terminal region does not have protease activity. Therefore, even if the C-terminal region is expressed in a large amount in the host fungus, it does not adversely affect the host fungus. It is presumed that.
なお、A28株は、S. costatumのみならず、珪藻Skeletonema costatum NIES-324、Eucampia zodiacs、鞭毛藻Chattonella antiquaを殺藻することができる（非特許文献１参照）。この事実から、EspIプロテアーゼは、S. costatumのみならず、Skeletonema costatum NIES-324、Eucampia zodiacs、Chattonella antiqua、さらに上記以外の藻類に対して殺藻活性を有していると推測される。また、藻類以外の微生物、例えばシアノバクテリアなど、に対しても解菌効果（殺菌効果）を有している可能性も考えられる。 Note that the A28 strain can kill not only S. costatum but also diatom Skeletonema costatum NIES-324, Eucampia zodiacs, and flagellar Chatonella antiqua (see Non-Patent Document 1). From this fact, it is speculated that EspI protease has an algicidal activity not only against S. costatum but also against Skeletonema costatum NIES-324, Eucampia zodiacs, Chattonella antiqua, and algae other than the above. In addition, it may be possible to have a bactericidal effect (bactericidal effect) against microorganisms other than algae, such as cyanobacteria.
また、A28株のみならず、その近縁のラインもEspIプロテアーゼと同様の機能を有するプロテアーゼを菌対外に分泌している可能性が考えられる。 Moreover, it is possible that not only the A28 strain but also the close lines secrete a protease having the same function as the EspI protease to the outside of the bacteria.
本発明のEspIプロテアーゼは、図１（配列番号２）に示すアミノ酸配列（７１１アミノ酸残基、７３kDa）からなるものである。同図には、EspIプロテアーゼのアミノ酸配列が示されている。同図において、プロセシング後のEspIプロテアーゼ（以下、「成熟プロテアーゼ」と称する）のＮ末端のアミノ酸残基（Ａ１４９）は白抜き文字で表示されており、後述する繰返し領域のアミノ酸配列には二重下線が付されている。また、後述するＣ３、Ｃ５、ＣのＣ末端のアミノ酸残基は太字で示されている。 The EspI protease of the present invention consists of the amino acid sequence (711 amino acid residue, 73 kDa) shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). In the figure, the amino acid sequence of EspI protease is shown. In the figure, the N-terminal amino acid residue (A149) of the processed EspI protease (hereinafter referred to as “mature protease”) is indicated by white letters, and the amino acid sequence of the repeat region described later is doubled. Underlined. The C-terminal amino acid residues of C3, C5, and C described later are shown in bold.
A28株の培養液から精製したEspIプロテアーゼのＮ末端アミノ酸配列および分子量(５０kDa)（非特許文献２参照）を考慮すると、図４に示すように、EspIプロテアーゼの成熟化に伴いＮ末端側の１４８アミノ酸残基とＣ末端側の約７kDaの領域がプロセスされていると考えられ、成熟プロテアーゼのＣ末端はＧ６５０（配列番号２に示すアミノ酸配列の第６５０位のグリシン（Ｇ））の周辺になると推定される。同図には、プロセス領域が白抜きの部分で、成熟プロテアーゼの領域が黒塗りの部分で示されている。さらに同図中において、EspIプロテアーゼをコードする遺伝子の制限酵素サイト地図および当該遺伝子のｃＤＮＡを表す矢印が示されている。 Considering the N-terminal amino acid sequence and molecular weight (50 kDa) of EspI protease purified from the culture solution of A28 strain (see Non-Patent Document 2), as shown in FIG. An amino acid residue and a region of about 7 kDa on the C-terminal side are considered to be processed. When the C-terminus of the mature protease is around G650 (glycine (G) at position 650 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2)) Presumed. In the figure, the process region is indicated by a white portion, and the mature protease region is indicated by a black portion. Further, in the figure, a restriction enzyme site map of a gene encoding EspI protease and an arrow representing the cDNA of the gene are shown.
さらに、EspIプロテアーゼは、Ｃ末端側に２回繰返しアミノ酸配列を有する領域（以下、「繰返し領域」と称す）を備えている。この繰返し領域は、具体的には、図５に示すように、高い相同性を有する２つの領域（以下では、「相同領域Ａ」および「相同領域Ｂ」と称す）が７アミノ酸残基を挟んで隣接しているものである。同図には、相同領域Ａ（４９７〜５９４番目）（配列番号６）および相同領域Ｂ（６０８〜７０５番目）（配列番号７）のアミノ酸配列が上下に並べて示されており、同一のアミノ酸残基は白抜きで示されている。 Further, the EspI protease has a region having an amino acid sequence repeated twice on the C-terminal side (hereinafter referred to as “repeat region”). Specifically, as shown in FIG. 5, this repetitive region includes two regions having high homology (hereinafter referred to as “homology region A” and “homology region B”) sandwiching 7 amino acid residues. Are adjacent to each other. In the same figure, the amino acid sequences of the homologous region A (497th to 594th) (SEQ ID NO: 6) and the homologous region B (608th to 705th) (SEQ ID NO: 7) are shown one above the other. The group is shown in white.
さらに、上記のＣ末端領域は、後述する実施例に示すように、プロテアーゼ活性は有しないが、赤潮藻類の細胞と結合する活性を有しているとともに、赤潮藻類殺藻活性を有している。すなわち、EspIプロテアーゼが有する殺藻活性の少なくとも一部は、Ｃ末端領域（配列番号１または配列番号１０）に由来しており、当該Ｃ末端領域のみで「赤潮藻類殺藻ペプチド」として機能する。以下の説明では、上記Ｃ末端領域のみからなるペプチドを「赤潮藻類殺藻ペプチド」と称する。 Further, the C-terminal region has no protease activity but has an activity of binding to red tide algae cells and has a red tide algae algae killing activity, as shown in Examples described later. . That is, at least a part of the algicidal activity of EspI protease is derived from the C-terminal region (SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 10), and functions as a “red tide algal algicidal peptide” only in the C-terminal region. In the following description, a peptide consisting only of the C-terminal region is referred to as “red tide algal algicidal peptide”.
上記赤潮藻類殺藻ペプチドは、プロテアーゼ活性を有していないため、後述する実施例に示すように、大腸菌発現系において大量発現させることができる。そのため、EspIプロテアーゼ全体を発現させることが出来ないという問題を解決することができ、赤潮藻類殺藻活性を有するペプチドを大量生産することができる。 Since the red tide algae algicidal peptide does not have protease activity, it can be expressed in a large amount in an E. coli expression system, as shown in the Examples described later. Therefore, the problem that the whole EspI protease cannot be expressed can be solved, and a peptide having red tide algal algicidal activity can be mass-produced.
なお、本発明に係るペプチドは、アミノ酸がペプチド結合してなるペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ペプチド以外の構造を含む複合ペプチドであってもよい。したがって、赤潮藻類殺藻ペプチドは、配列番号１または１０に示されるアミノ酸配列以外に、他の構造を含む複合ペプチドであっても良い。ここでいうペプチド以外の構造としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。 The peptide according to the present invention may be any peptide in which amino acids are peptide-bonded, but is not limited thereto, and may be a complex peptide containing a structure other than a peptide. Therefore, the red tide algae algicidal peptide may be a complex peptide containing other structures in addition to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 10. Examples of the structure other than the peptide herein include sugar chains and isoprenoid groups, but are not particularly limited.
あるいは、本発明に係るペプチドは、赤潮殺藻活性を高めるために、他のペプチドと融合させて使用してもよい。例えば、赤潮藻類殺藻ペプチドをEspIプロテアーゼ以外のプロテアーゼと融合させることにより赤潮殺藻活性を高めてもよい。 Alternatively, the peptide according to the present invention may be used by fusing with another peptide in order to enhance the red tide algae killing activity. For example, the red tide algae killing peptide may be enhanced by fusing a red tide algae killing peptide with a protease other than the EspI protease.
また、本発明に係るペプチドは、付加的なペプチドを含むものであってもよい。このようなペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等によって本発明に係るペプチドがエピトープ標識されるような場合が挙げられる。 The peptide according to the present invention may contain an additional peptide. Examples of the case where such a peptide is added include a case where the peptide according to the present invention is epitope-tagged by His, Myc, Flag or the like.
さらに、本発明に係るペプチドは、後述する本発明に係るポリヌクレオチド（本発明に係るペプチドをコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのペプチドを細胞内発現させた状態のものであってもよいし、細胞、組織などから単離精製された状態のものであってもよい。また、上記宿主細胞での発現条件によっては、本発明に係るペプチドは、他のペプチドとつながった融合ペプチドであってもよい。さらに本発明に係るペプチドは、無細胞系によって合成されたものであってもよいし、化学合成されたものであってもよい。 Furthermore, the peptide according to the present invention is a product in which a polynucleotide according to the present invention described later (a gene encoding the peptide according to the present invention) is introduced into a host cell and the peptide is expressed in the cell. Alternatively, it may be isolated and purified from cells, tissues and the like. Depending on the expression conditions in the host cell, the peptide according to the present invention may be a fusion peptide linked to another peptide. Furthermore, the peptide according to the present invention may be synthesized by a cell-free system or may be chemically synthesized.
さらに、本発明に係るペプチドは、その一部が改変された変異ペプチドであってもよい。即ち、本発明に係るペプチドには、（ａ）配列番号１または１０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドのみならず、（ｂ）配列番号１または１０に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、赤潮殺藻活性を有するペプチドも含まれる。すなわち、変異赤潮藻類殺藻ペプチドおよび変異EspIプロテアーゼも、本発明に係るペプチドに含まれる。 Furthermore, the peptide according to the present invention may be a mutant peptide in which a part thereof is modified. That is, the peptide according to the present invention includes not only (a) a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 10, but also (b) one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 10. A peptide having an amino acid sequence in which the amino acid is substituted, deleted, inserted, and / or added, and having red tide algicidal activity is also included. That is, the mutant red tide algal algicidal peptide and the mutant EspI protease are also included in the peptide according to the present invention.
上記「１個またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により置換、欠失、挿入、及び／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のペプチドは、上記（ａ）のペプチドの変異ペプチドである。なお、ここでいう「変異」は、主として公知の変異ペプチド作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異ペプチドを単離精製したものであってもよい。 The above “one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added” means substitution, deletion, insertion, or the like by a known mutant peptide production method such as site-directed mutagenesis. And / or the number of amino acids that can be added (preferably 10 or less, more preferably 7 or less, and even more preferably 5 or less) is substituted, deleted, inserted, and / or added. Thus, the peptide of (b) is a mutant peptide of the peptide of (a). The “mutation” here means a mutation artificially introduced mainly by a known mutant peptide production method, but may be a product obtained by isolating and purifying a similar naturally occurring mutant peptide.
（１−２）本発明に係るポリヌクレオチド
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記（ａ）または（ｂ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびその塩基配列の一部を改変した改変ポリヌクレオチドが含まれる。本発明に係るポリヌクレオチドを適当な宿主（例えば細菌、酵母）に導入すれば、本発明に係るペプチドをその宿主内で発現させることができる。また、例えば、上記（ａ）または（ｂ）のペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当なベクターに導入し、組み換えバキュロウイルスを作成し、このバキュロウイルスに昆虫の組織を感染させると、昆虫の組織において、本発明に係るペプチドを発現させることができる。
(1-2) Polynucleotide according to the present invention The polynucleotide according to the present invention includes a polynucleotide encoding the peptide of (a) or (b) above, and a modified polynucleotide obtained by modifying a part of the base sequence. It is. If the polynucleotide according to the present invention is introduced into an appropriate host (eg, bacteria, yeast), the peptide according to the present invention can be expressed in the host. In addition, for example, when a polynucleotide encoding the peptide (a) or (b) is introduced into an appropriate vector to produce a recombinant baculovirus, and the insect tissue is infected with the baculovirus, The peptide according to the present invention can be expressed.
本発明に係るポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡをも包含する。アンチセンス鎖は、プローブとしてまたはアンチセンス薬剤として利用できる。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明に係るポリヌクレオチドは、上記（ａ）または（ｂ）のペプチドをコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。 The polynucleotide according to the present invention includes not only double-stranded DNA but also single-stranded DNA and RNA such as sense strand and antisense strand constituting the same. The antisense strand can be utilized as a probe or as an antisense agent. DNA includes, for example, cDNA and genomic DNA obtained by cloning, chemical synthesis techniques, or a combination thereof. Further, the polynucleotide according to the present invention includes sequences such as a sequence of an untranslated region (UTR) and a vector sequence (including an expression vector sequence) in addition to the sequence encoding the peptide of (a) or (b). It may be a thing.
本発明に係るポリヌクレオチドの一例として、EspIプロテアーゼをコードする遺伝子（以下、「espI遺伝子」と称する）を挙げることができる。このespI遺伝子は、配列番号５に示される塩基配列を有しており、配列番号４に示される塩基配列（２１３６bp）をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域として有している。また、espI遺伝子は、上記繰返し領域（赤潮藻類殺藻ペプチド）をコードする塩基配列（６２７bp）（配列番号３および１１）を含んでいる。 An example of a polynucleotide according to the present invention includes a gene encoding EspI protease (hereinafter referred to as “espI gene”). This espI gene has the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, and has the base sequence (2136 bp) shown in SEQ ID NO: 4 as an open reading frame (ORF) region. Further, the espI gene contains a base sequence (627 bp) (SEQ ID NOs: 3 and 11) encoding the above repetitive region (red tide algaecidal peptide).
さらに、本発明に係るポリヌクレオチドは、上記配列番号３または１１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに限定されるものではなく、配列番号３または１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれる。なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。 Furthermore, the polynucleotide according to the present invention is not limited to the polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 11, but is complementary to the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 11. And a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a simple base sequence. The above “stringent conditions” means that hybridization occurs only when at least 90% identity, preferably at least 95% identity, most preferably at least 97% identity exists between sequences. Means that.
上記ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook et al. Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。 The hybridization can be performed by a conventionally known method such as the method described in J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Usually, the higher the temperature and the lower the salt concentration, the higher the stringency (harder to hybridize).
（２）本発明に係るペプチドおよびポリヌクレオチドの取得方法
本発明に係るペプチドおよびポリヌクレオチドの取得方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、代表的な方法として次に示す各方法を挙げることができる。
(2) Method for Obtaining Peptide and Polynucleotide According to the Present Invention The method for obtaining the peptide and polynucleotide according to the present invention (production method) is not particularly limited. Can be mentioned.
（２−１）ペプチドの取得方法
本発明に係るペプチドを取得する方法（生産方法）は、上述したように特に限定されるものではないが、まず、本発明に係るペプチドを発現する細胞、組織などから単純精製する方法を挙げることができる。すなわち、A28株の培養液から本発明に係るペプチドを抽出・精製してもよい。精製方法も特に限定されるものではなく、公知の方法でA28株の培養液を濃縮し、公知の方法、例えばカラム等を用いて精製すればよい。
(2-1) Method for Obtaining Peptide The method (production method) for obtaining the peptide according to the present invention is not particularly limited as described above, but first, cells and tissues that express the peptide according to the present invention. A simple purification method can be mentioned. That is, the peptide according to the present invention may be extracted and purified from the culture solution of A28 strain. The purification method is not particularly limited, and the culture solution of the A28 strain may be concentrated by a known method and purified using a known method such as a column.
また、本発明に係るペプチドを取得する方法として、遺伝子組み換え技術等を用いる方法も挙げられる。この場合、例えば、本発明に係るポリヌクレオチドをベクターなどに組み込んだ後、公知の方法により、発現可能に宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されて得られる上記ペプチドを精製するという方法などを採用することができる。遺伝子の導入（形質転換）や遺伝子の発現等の具体的な方法については後述する。 Moreover, as a method for obtaining the peptide according to the present invention, a method using a gene recombination technique or the like can also be mentioned. In this case, for example, after the polynucleotide according to the present invention is incorporated into a vector or the like, it is introduced into a host cell so that it can be expressed by a known method, and the peptide obtained by translation in the cell is purified. Can be adopted. Specific methods such as gene introduction (transformation) and gene expression will be described later.
なお、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の発現のために宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター及び宿主には様々なものが存在するので、目的に応じたものを選択すればよい。産生されたペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のペプチドを精製することが可能である。 In addition, when introducing a foreign gene into a host in this way, there are various expression vectors and hosts incorporating a promoter that functions in the host for the expression of the foreign gene. Just choose. The method of purifying the produced peptide varies depending on the host used and the nature of the peptide, but the target peptide can be purified relatively easily by using a tag or the like.
変異ペプチドを作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部位特異的突然変異誘発法（Hashimoto-Gotoh,Gene 152,271-275(1995)他）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異ペプチドを作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異ペプチド作製法を用いることができる。これら方法を用いることによって、上記（ａ）のペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列において、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異ペプチドの作製には、市販のキットを利用してもよい。 The method for producing the mutant peptide is not particularly limited. For example, site-directed mutagenesis (Hashimoto-Gotoh, Gene 152, 271-275 (1995), etc.), a method of introducing a point mutation into a base sequence using the PCR method, or a method of creating a mutant peptide, or by inserting a transposon A well-known mutant peptide production method such as a mutant strain production method can be used. By using these methods, the base sequence of the cDNA encoding the peptide of (a) above is prepared by modifying so that one or more bases are substituted, deleted, inserted, and / or added. can do. Moreover, you may utilize a commercially available kit for preparation of a mutant peptide.
本発明に係るペプチドの取得方法は、上述に限定されることなく、例えば、化学合成してもよい。例えば、無細胞系のタンパク質合成液を利用して、本発明に係るポリヌクレオチドから本発明に係るペプチドを合成してもよい（無細胞タンパク質合成系による本発明に係るペプチドの合成）。上記「無細胞タンパク質合成系」とは、生細胞を用いずに、遺伝子にコードされた目的タンパク質を生産する技術のことである。例えば、「無細胞タンパク質合成系」としては、小麦胚芽抽出液を用いる方法（BIO INDUSTRY, 17, 20-27, 2000）、カイコ抽出液を用いる方法（特開２００４-３４４０１４）が知られている。この時、市販されているキットを適宜選択の上、利用することができる。上記キットとしては、例えばPROTEIOS TM Wheat germ cell-free protein synthesis kit （東洋紡株式会社製）が挙げられる。 The method for obtaining a peptide according to the present invention is not limited to the above, and may be chemically synthesized, for example. For example, the peptide according to the present invention may be synthesized from the polynucleotide according to the present invention using a cell-free protein synthesis solution (synthesis of the peptide according to the present invention by a cell-free protein synthesis system). The “cell-free protein synthesis system” is a technique for producing a target protein encoded by a gene without using living cells. For example, as a “cell-free protein synthesis system”, a method using a wheat germ extract (BIO INDUSTRY, 17, 20-27, 2000) and a method using a silkworm extract (Japanese Patent Laid-Open No. 2004-344014) are known. . At this time, a commercially available kit can be selected as appropriate and used. Examples of the kit include PROTEIOS ™ wheat germ cell-free protein synthesis kit (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
また本発明に係るポリヌクレオチドを含むことにより、本発明に係るペプチドの無細胞合成系を構成することができる。当該無細胞合成系には、ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、アミノ酸、小麦胚芽抽出液、大腸菌抽出液等が含まれていてもよい。 Moreover, the cell-free synthesis system of the peptide according to the present invention can be constituted by including the polynucleotide according to the present invention. The cell-free synthesis system may contain RNA polymerase, ATP, amino acids, wheat germ extract, E. coli extract and the like.
（２−２）ポリヌクレオチドの取得方法
本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記各塩基配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。
(2-2) Method for Obtaining Polynucleotide The method for obtaining the polynucleotide according to the present invention is not particularly limited, and each of the above base sequences can be obtained by various methods based on the above-described disclosed sequence information and the like. DNA fragments containing can be isolated and cloned.
例えば、上記各ｃＤＮＡ配列の一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、A28株のゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記各ｃＤＮＡ配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。 For example, a probe that specifically hybridizes with a partial sequence of each of the above cDNA sequences may be prepared, and a genomic DNA library or cDNA library of the A28 strain may be screened. As such a probe, any probe of any sequence / length may be used as long as it specifically hybridizes to at least a part of each cDNA sequence or its complementary sequence. Moreover, what is necessary is just to perform about each step in the said screening on the conditions used normally.
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成およびその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。 The clone obtained by the above screening can be analyzed in more detail by preparing a restriction enzyme map and determining its nucleotide sequence (sequencing). By these analyses, it can be easily confirmed whether or not a DNA fragment containing the polynucleotide according to the present invention has been obtained.
また、上記プローブの配列を、細菌のプロテアーゼ遺伝子の間で良好に保存されている領域の中から選択し、他の生物のゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記EspIプロテアーゼと同様の特性を有する、相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。 In addition, if the probe sequence is selected from regions well conserved among bacterial protease genes and genomic DNA (or cDNA) libraries of other organisms are screened, the same as the above EspI protease. It is highly possible to isolate and clone a gene encoding a homologous molecule or a similar molecule having the above characteristics.
本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記各ｃＤＮＡ配列のうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてA28株のゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。 In addition to the screening method described above, the method for obtaining the polynucleotide according to the present invention includes a method using an amplification means such as PCR. For example, among the above cDNA sequences, primers are prepared from the 5 ′ side and 3 ′ side sequences (or their complementary sequences), and the genomic DNA (or cDNA) of the A28 strain is used as a template using these primers. By performing PCR or the like and amplifying the DNA region sandwiched between both primers, a large amount of DNA fragments containing the polynucleotide according to the present invention can be obtained.
（３）本発明に係るペプチドおよびポリヌクレオチドの利用方法（有用性）
本発明に係るペプチドは、赤潮殺藻活性を有する新規のペプチドである。そして、当該ペプチドをコードする遺伝子の塩基配列が明らかになったとともに、当該ペプチドを効率良く宿主細胞内で発現させることも可能となった。それゆえ、本発明に係るペプチドは赤潮藻類殺藻用薬剤として産業上利用することができる。
(3) Utilization method (usefulness) of peptide and polynucleotide according to the present invention
The peptide according to the present invention is a novel peptide having red tide algae killing activity. Then, the base sequence of the gene encoding the peptide has been clarified, and the peptide can be efficiently expressed in the host cell. Therefore, the peptide according to the present invention can be used industrially as a red tide algae-killing agent.
そこで、本発明の利用方法として、薬剤、形質転換体、ベクター、検出器具、抗体を例に挙げてより具体的に説明する。 Therefore, the method of using the present invention will be described more specifically by taking drugs, transformants, vectors, detection instruments, and antibodies as examples.
（３−１）ベクター
本発明に係るベクターは、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものである。例えば、ｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、当該ベクターの作製方法も公知の方法の中から選択すればよい。
(3-1) Vector The vector according to the present invention comprises a polynucleotide encoding the peptide (a) or (b). For example, a recombinant expression vector into which cDNA is inserted can be mentioned. For the production of the vector, a plasmid, phage, cosmid or the like can be used, but it is not particularly limited. In addition, a method for producing the vector may be selected from known methods.
ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだものをベクターとして用いればよい。 The specific type of vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in a host cell may be appropriately selected. That is, according to the type of the host cell, a promoter sequence may be appropriately selected in order to reliably express the gene, and a vector obtained by incorporating this and the polynucleotide of the present invention into various plasmids may be used as the vector.
本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカー遺伝子と本発明に係るポリヌクレオチドとを含むプラスミド等を発現ベクターとして宿主細胞に導入する。これによって当該マーカー遺伝子の発現から本発明に係るポリヌクレオチドの導入を確認することができる。あるいは、本発明に係るペプチドを融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）をマーカーとして用い、本発明に係るペプチドをＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。 In order to confirm whether or not the polynucleotide according to the present invention has been introduced into the host cell, and whether or not it is reliably expressed in the host cell, various markers may be used. For example, a gene deleted in the host cell is used as a marker, and a plasmid containing this marker gene and the polynucleotide of the present invention is introduced into the host cell as an expression vector. Thereby, the introduction of the polynucleotide according to the present invention can be confirmed from the expression of the marker gene. Alternatively, the peptide according to the present invention may be expressed as a fusion protein. For example, the green fluorescent protein (GFP) derived from Aequorea jellyfish may be used as a marker, and the peptide according to the present invention may be expressed as a GFP fusion protein. Good.
上記宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、カイコガ由来の細胞をはじめとして、キイロショウジョウバエ等の昆虫、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeや分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、線虫Caenorhabditis elegans、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。 The host cell is not particularly limited, and various conventionally known cells can be suitably used. Specifically, for example, silkworm-derived cells, insects such as Drosophila melanogaster, bacteria such as Escherichia coli, yeast (budding yeast Saccharomyces cerevisiae and fission yeast Schizosaccharomyces pombe), nematode Caenorhabditis elegans, Xenopus laevis (Xenopus laevis) oocytes and the like can be mentioned, but are not particularly limited.
上記ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るペプチドを昆虫細胞で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を好適に採用することができる。 A method for introducing the vector into a host cell, that is, a transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, or a DEAE dextran method can be suitably used. In addition, for example, when the peptide according to the present invention is transferred and expressed in insect cells, an expression system using baculovirus can be preferably employed.
（３−２）形質転換体
本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチド、すなわち、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体である。ここで、「ポリヌクレオチドが導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む意味である。
(3-2) Transformant The transformant according to the present invention is a transformant into which the polynucleotide according to the present invention, that is, the polynucleotide encoding the peptide of (a) or (b) is introduced. . Here, “the polynucleotide has been introduced” means that it is introduced into the target cell (host cell) so as to be expressed by a known genetic engineering technique (gene manipulation technique). The “transformant” means not only cells / tissues / organs but also individual organisms.
本発明に係る形質転換体の作製方法（生産方法）は、上述したベクターを用いて、宿主を形質転換する方法を挙げることができる。また、形質転換の対象となる宿主も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物や動物を挙げることができる。また、プロモーターやベクターを適切に選択すれば、植物も形質転換の対象とすることが可能である。 Examples of the method for producing a transformant (production method) according to the present invention include a method for transforming a host using the above-described vector. Further, the host to be transformed is not particularly limited, and examples thereof include various microorganisms and animals exemplified in the host cell. In addition, if a promoter or vector is appropriately selected, a plant can be a target for transformation.
また、大腸菌や酵母を宿主細胞として用いた場合には、アーミング技術を用いて細胞表層に本発明に係るペプチドをディスプレーすることが可能である（Bio Industry, 6, 49（2001）、Bio Industry, 6, 57（2001）を参照）。例えば、酵母細胞表層ディスプレーでは、ＧＰＩアンカーを介して細胞壁グルカン層に共有結合している表層タンパク質（例えば、alpha-アグルチニン）のＮ末端に、本発明に係るペプチドを融合させることにより、当該酵母細胞の表層において本発明に係るペプチドを発現させることができる。 In addition, when E. coli or yeast is used as a host cell, it is possible to display the peptide according to the present invention on the cell surface using arming technology (Bio Industry, 6, 49 (2001), Bio Industry, 6, 57 (2001)). For example, in the yeast cell surface display, the yeast cell is fused by fusing the peptide of the present invention to the N-terminus of a surface protein (for example, alpha-agglutinin) covalently bound to a cell wall glucan layer via a GPI anchor. The peptide according to the present invention can be expressed in the surface layer.
細胞表層ディスプレーの利点のひとつは、目的タンパク質（ペプチド）が宿主細胞表層に発現するため、目的タンパク質を精製することなく、当該目的タンパク質の活性を利用することができることである。例えば、本発明に係るペプチドを大腸菌の細胞表層にて発現させた場合には、当該大腸菌を赤潮藻類と混合することにより当該赤潮藻類を殺藻することができる。この手法を用いれば、大腸菌から本発明に係るペプチドを抽出する時間と労力を節約することができる。 One advantage of the cell surface display is that the target protein (peptide) is expressed on the surface of the host cell, so that the activity of the target protein can be used without purifying the target protein. For example, when the peptide according to the present invention is expressed in the cell surface layer of E. coli, the red tide algae can be killed by mixing the E. coli with the red tide algae. By using this method, time and labor for extracting the peptide of the present invention from E. coli can be saved.
また、宿主細胞が増殖できる環境下では、当該宿主細胞の増殖に伴って本発明に係るペプチドも生産されることになり、海洋、養殖場、生簀等において自己増殖する赤潮殺藻細胞を実現することができる。 In addition, in an environment in which host cells can grow, the peptide according to the present invention will be produced as the host cells grow, thereby realizing red tide algae cells that self-grow in the ocean, aquaculture, ginger, etc. be able to.
（３−３）本発明に係るペプチドの生産方法
上記本発明に係るベクターおよび形質転換体を用いることによって本発明に係るペプチドの生産を行うことができる。
(3-3) Method for producing peptide according to the present invention The peptide according to the present invention can be produced by using the vector and the transformant according to the present invention.
一実施形態において、本発明に係るペプチドの生産方法は、本発明に係るペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター（上記本発明に係るベクター）を用いることを特徴とする。 In one embodiment, the method for producing a peptide according to the present invention is characterized by using a vector (the vector according to the present invention) containing a polynucleotide encoding the peptide according to the present invention.
本実施形態の１つの局面において、本実施形態に係るペプチドの生産方法は、上記ベクターを無細胞タンパク質合成系に用いることが好ましい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットを用いればよい。好ましくは、本実施形態に係るペプチドの生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。 In one aspect of this embodiment, the peptide production method according to this embodiment preferably uses the vector in a cell-free protein synthesis system. When using a cell-free protein synthesis system, various commercially available kits may be used. Preferably, the method for producing a peptide according to the present embodiment includes a step of incubating the vector and a cell-free protein synthesis solution.
本実施形態の他の局面において、本実施形態に係るペプチドの生産方法は、組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明に係るポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記ペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ＤＮＡを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。 In another aspect of this embodiment, the method for producing a peptide according to this embodiment preferably uses a recombinant expression system. When a recombinant expression system is used, the polynucleotide according to the present invention is incorporated into a recombinant expression vector, and then introduced into a host so that it can be expressed by a known method, and the peptide obtained by being translated in the host is purified. A method etc. can be adopted. The recombinant expression vector may or may not be a plasmid, as long as the target DNA can be introduced into the host. Preferably, the method for producing a peptide according to the present embodiment includes a step of introducing the vector into a host.
このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、発現ベクターは、外来遺伝子を発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え発現系により生産されたペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のペプチドを精製することが可能である。 Thus, when introducing a foreign gene into a host, the expression vector preferably incorporates a promoter that functions in the host so as to express the foreign gene. The method of purifying a peptide produced by a recombinant expression system varies depending on the host used and the nature of the peptide, but the target peptide can be purified relatively easily by using a tag or the like.
本実施形態に係るペプチドの生産方法は、本発明に係るペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。 It is preferable that the method for producing a peptide according to the present embodiment further includes a step of purifying the peptide from a cell or tissue extract containing the peptide according to the present invention. The step of purifying the peptide is to prepare a cell extract from the cells or tissues by a well-known method (for example, a method in which the cell or tissue is disrupted and then centrifuged to collect the soluble fraction), and then from this cell extract Well-known methods (eg ammonium sulfate precipitation or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography, and lectin chromatography) The step of purifying by is preferable, but not limited thereto. Most preferably, high performance liquid chromatography (“HPLC”) is used for purification.
別の実施形態において、本発明に係るペプチドの生産方法は、本発明に係るペプチドを天然に発現する細胞または組織から当該ペプチドを精製することを特徴とする。本実施形態に係るペプチドの生産方法は、後述する抗体を用いて本発明に係るペプチドを天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することが好ましい。また、本実施形態に係るペプチドの生産方法は、上述したペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。 In another embodiment, the method for producing a peptide according to the present invention is characterized in that the peptide is purified from cells or tissues that naturally express the peptide according to the present invention. The method for producing a peptide according to this embodiment preferably includes a step of identifying a cell or tissue that naturally expresses the peptide according to the present invention using an antibody described later. Moreover, it is preferable that the production method of the peptide which concerns on this embodiment further includes the process of refine | purifying the peptide mentioned above.
（３−４）薬剤
本発明には、本発明に係るペプチドを含む赤潮藻類殺藻用薬剤も含まれる。例えば、本発明に係る赤潮藻類殺藻用薬剤の一例として、本発明に係るペプチドを粉末化または固形化した薬剤が挙げられる。当該薬剤は、本発明に係るペプチドを主成分とするものであってもよいし、本発明に係るペプチドと本発明に係るペプチド以外のペプチドとの混合物であってもよく、本発明に係るペプチドの一部を含むものであってもよい。
(3-4) Drug The present invention also includes a red tide algae killing drug containing the peptide according to the present invention. For example, as an example of the red tide algae algae killing agent according to the present invention, a drug obtained by pulverizing or solidifying the peptide according to the present invention can be mentioned. The drug may be composed mainly of the peptide according to the present invention, or may be a mixture of the peptide according to the present invention and a peptide other than the peptide according to the present invention. May be included.
例えば、精製された本発明に係るペプチドを粉末状や顆粒状にしたもの、本発明に係るペプチドを発現している大腸菌や酵母を粉末化したもの、本発明に係るペプチドを魚の餌と混合したものであってもよい。上記餌は特に限定されず、ペースト状の餌に本発明に係るペプチドを練りこんでもよいし、顆粒状の餌と本発明に係るペプチドとを混ぜてもよい。 For example, the purified peptide according to the present invention in powder or granule form, the powdered Escherichia coli or yeast expressing the peptide according to the present invention, and the peptide according to the present invention mixed with fish food It may be a thing. The bait is not particularly limited, and the peptide according to the present invention may be kneaded into a paste bait, or the granular bait and the peptide according to the present invention may be mixed.
また、上記赤潮藻類殺藻用薬剤の別の例として、本発明に係るペプチドを細胞外に分泌する細胞を培養した培養液を簡易精製したものを挙げることができる。例えば、細胞外への分泌に関わるシグナルペプチドと本発明に係るペプチドとを融合させた融合ペプチドを発現する大腸菌を作製し、当該大腸菌を培養することにより上記融合ペプチドを培養液中に分泌させれば、当該培養液をろ過等により簡易精製することにより赤潮藻類殺藻用薬剤として利用することができる。 Another example of the red tide algae-killing agent is that obtained by simply purifying a culture solution obtained by culturing cells that secrete the peptide of the present invention to the outside of the cell. For example, by producing E. coli that expresses a fusion peptide in which a signal peptide involved in extracellular secretion and the peptide of the present invention are fused, the fusion peptide can be secreted into the culture medium by culturing the E. coli. For example, the culture solution can be used as a red tide algae-killing agent by simple purification by filtration or the like.
さらに、上記赤潮藻類殺藻用薬剤の別の形態として、本発明に係るペプチドを担体に固定したものを挙げることができる。例えば、漁業用のネットに本発明に係るペプチドを公知の方法によって固定化させてもよい。これにより赤潮防御用のネットを実現することができる。この赤潮防御用ネットを養殖場の周囲に張り巡らせることにより、当該養殖場を赤潮から保護することができる。このように本発明に係るペプチドを担体に固定することにより、本発明に係るペプチドを海洋等に拡散させることなく赤潮藻類を殺藻することができる。なお、上記担体は、ネット状のものに限定されず、球体状、粒状、板状、膜状、糸状のものであってもよい。 Furthermore, as another form of the above red tide algae killing agent, there can be mentioned one in which the peptide according to the present invention is immobilized on a carrier. For example, the peptide according to the present invention may be immobilized on a fishing net by a known method. As a result, a net for preventing red tide can be realized. By spreading the red tide defense net around the farm, the farm can be protected from the red tide. Thus, by fixing the peptide according to the present invention to a carrier, the red tide algae can be killed without diffusing the peptide according to the present invention into the ocean or the like. The carrier is not limited to a net shape, and may be a spherical shape, a granular shape, a plate shape, a film shape, or a thread shape.
（３−５）本発明にかかる検出器具
本発明に係る検出器具は、本発明に係るポリヌクレオチドにおける少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いたものである。本発明に係る検出器具は、種々の条件下において、本発明に係るポリヌクレオチドの検出・測定などに利用することができる。具体的には、例えば、本発明に係るポリヌクレオチドが導入された形質転換体の存在を確認する場合に利用することができ、本発明に係るポリヌクレオチドが無断使用されているかどうかを簡単に調べることができる。
(3-5) Detection instrument according to the present invention The detection instrument according to the present invention uses at least a part of the base sequence or its complementary sequence in the polynucleotide according to the present invention as a probe. The detection instrument according to the present invention can be used for detection and measurement of the polynucleotide according to the present invention under various conditions. Specifically, for example, it can be used when confirming the presence of a transformant introduced with a polynucleotide according to the present invention, and it is simply examined whether or not the polynucleotide according to the present invention is used without permission. be able to.
本発明に係る検出器具としては、例えば、本発明のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする上記プローブを基板（担体）上に固定化したＤＮＡチップが挙げられる。ここで「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含するものとする。 Examples of the detection instrument according to the present invention include a DNA chip in which the probe that specifically hybridizes with the polynucleotide of the present invention is immobilized on a substrate (carrier). Here, the “DNA chip” mainly means a synthetic DNA chip using a synthesized oligonucleotide as a probe, but also includes an affixed DNA microarray using a cDNA such as a PCR product as a probe.
プローブとして用いる配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する従来公知の方法によって決定することができる。具体的には、例えば、ＳＡＧＥ：Serial Analysis of Gene Expression法（Science 276:1268, 1997; Cell 88:243, 1997; Science 270:484, 1995; Nature 389:300, 1997; 米国特許第5,695,937 号）等を挙げることができる。 The sequence used as a probe can be determined by a conventionally known method for specifying a characteristic sequence from a cDNA sequence. Specifically, for example, SAGE: Serial Analysis of Gene Expression method (Science 276: 1268, 1997; Cell 88: 243, 1997; Science 270: 484, 1995; Nature 389: 300, 1997; US Pat. No. 5,695,937) Etc.
なお、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドとして合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フォトリソグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基板上で該オリゴヌクレオチドを合成すればよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合には、アレイ機を用いて基板上に貼り付ければよい。 In addition, what is necessary is just to employ | adopt a well-known method for manufacture of a DNA chip. For example, when a synthetic oligonucleotide is used as the oligonucleotide, the oligonucleotide may be synthesized on a substrate by a combination of a photolithography technique and a solid phase DNA synthesis technique. On the other hand, when cDNA is used as the oligonucleotide, it may be attached to the substrate using an array machine.
また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、当該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置してＤＮＡの検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なるＤＮＡを並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基板上に固定してＤＮＡチップを構成してもよい。 Further, similarly to a general DNA chip, a perfect match probe (oligonucleotide) and a mismatch probe in which one base is substituted in the perfect match probe may be arranged to further improve the DNA detection accuracy. Furthermore, in order to detect different DNAs in parallel, a plurality of types of oligonucleotides may be fixed on the same substrate to constitute a DNA chip.
（３−６）抗体
本発明に係る抗体は、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチド（本発明に係るペプチド）、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。公知の方法としては、例えば、文献（Harlowらの「Antibodies : A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988))、岩崎らの「単クローン抗体 ハイブリドーマとELISA,講談社(1991)」」に記載の方法が挙げられる。
(3-6) Antibody The antibody according to the present invention is obtained as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody by a known method using the peptide (a) or (b) (peptide according to the present invention) or a partial peptide thereof as an antigen. Antibody. Examples of known methods include those described in the literature (Harlow et al., “Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988))”, Iwasaki et al., “Monoclonal antibody hybridomas and ELISA, Kodansha (1991)”. The method described is mentioned.
このようにして得られる抗体は、本発明に係るペプチドの検出・測定などに利用できる。例えば、A28株の培養液中にEspIプロテアーゼがどの程度分泌されているのかを調べる場合に上記抗体を利用できる。その他、ペプチドの精製用リガンドとしても利用できる。すなわち、上記抗体を樹脂ビーズ等の担体に固定し、本発明に係るペプチドを含む溶液中で上記担体と上記ペプチドとをインキュベートし、上記ペプチドを上記抗体に結合させることにより、当該ペプチドを精製することができる。 The antibody thus obtained can be used for detection and measurement of the peptide of the present invention. For example, the above-described antibody can be used to examine how much EspI protease is secreted in the culture solution of A28 strain. In addition, it can be used as a ligand for peptide purification. That is, the peptide is purified by immobilizing the antibody on a carrier such as resin beads, incubating the carrier and the peptide in a solution containing the peptide according to the present invention, and binding the peptide to the antibody. be able to.
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 Embodiments will be described below in more detail with reference to the accompanying drawings. Of course, the present invention is not limited to the following examples, and it goes without saying that various aspects are possible in detail. Further, the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made within the scope shown in the claims, and the present invention is also applied to the embodiments obtained by appropriately combining the disclosed technical means. It is included in the technical scope of the invention.
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。 Moreover, all the academic literatures and patent literatures described in this specification are incorporated herein by reference.
〔実施例１：赤潮殺藻セリンプロテアーゼをコードする遺伝子の単離および同定〕
A28株のゲノムＤＮＡライブラリーから赤潮殺藻プロテアーゼをコードする遺伝子を単離するために、培養液から精製した赤潮殺藻プロテアーゼのＮ末端のアミノ酸配列をアミノ酸シークエンスにより決定し（非特許文献２参照）、当該アミノ酸配列（ＡＴＰＮＤＰ（配列番号８））に基づいてＤＮＡプローブ（ＧＣＮＡＣＮＣＣＮＡＡＹＧＡＹＣＣ）（配列番号９）を作製した。このＤＮＡプローブを用いて、A28株のゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、目的遺伝子を単離した。
[Example 1: Isolation and identification of gene encoding red tide algae serine protease]
In order to isolate the gene encoding red tide algae protease from the genomic DNA library of A28 strain, the amino acid sequence of the N terminus of the red tide algae protease purified from the culture solution was determined by amino acid sequence (see Non-patent Document 2). ), A DNA probe (GCNACNCCNAAYGAYCC) (SEQ ID NO: 9) was prepared based on the amino acid sequence (ATPNDP (SEQ ID NO: 8)). Using this DNA probe, a genomic DNA library of the A28 strain was screened and the target gene was isolated.
単離した遺伝子の全塩基配列（配列番号５）を決定し、解析したところ、当該遺伝子は２１３６bpのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域（配列番号４）を有しており、７１１アミノ酸残基（推定７３kDa）からなるプロテアーゼ（配列番号２）をコードしていることが明らかとなった。そこで、上記遺伝子は、espI遺伝子と命名され、当該espI遺伝子がコードするプロテアーゼはEspIプロテアーゼと命名された。 When the entire base sequence (SEQ ID NO: 5) of the isolated gene was determined and analyzed, the gene has a 2136 bp open reading frame (ORF) region (SEQ ID NO: 4), and 711 amino acid residues (presumed) It was revealed that it encodes a protease (SEQ ID NO: 2) consisting of 73 kDa). Therefore, the gene was named espI gene, and the protease encoded by the espI gene was named EspI protease.
〔実施例２：Ｃ末端領域のアミノ酸配列の解析〕
EspIプロテアーゼの推定アミノ酸配列を解析したところ、Ｃ末端領域に互いに特異性の高い領域が２箇所存在することが明らかになった。そこで、これらの領域は相同領域Ａ（配列番号６）および相同領域Ｂ（配列番号７）と名付けられた。相同領域ＡおよびＢは、図５に示すように、５３％の相同性を示している。同図において、上段に相同領域Ａのアミノ酸配列が、下段に相同領域Ｂのアミノ酸配列が示されており、同一のアミノ酸残基は白抜きで示されている。そして、図１に示すように、相同領域ＡおよびＢは２回繰返しアミノ酸配列を有する領域（繰返し領域）を形成している。
[Example 2: Analysis of amino acid sequence of C-terminal region]
Analysis of the deduced amino acid sequence of EspI protease revealed that there were two highly specific regions in the C-terminal region. Therefore, these regions were named as homologous region A (SEQ ID NO: 6) and homologous region B (SEQ ID NO: 7). Homology regions A and B show 53% homology as shown in FIG. In the figure, the amino acid sequence of the homologous region A is shown in the upper part, the amino acid sequence of the homologous region B is shown in the lower part, and the same amino acid residues are shown in white. As shown in FIG. 1, the homologous regions A and B form a region (repeated region) having an amino acid sequence repeated twice.
EspIプロテアーゼのアミノ酸配列と、他の生物のプロテアーゼのアミノ酸配列とを比較したところ、海洋性細菌のAlteromonas sp. O-7株が生産するセリンプロテアーゼ(AspI)と高い相同性を示すことが明らかとなった。AspIも、EspIプロテアーゼと同様に、Ｃ末端領域に繰返し配列を含む領域を有しており、この領域は成熟化に伴うプロセッシングで削除されることが明らかとなっている（Biosci. Biotechnol. Biochem., 60:1284-1288 (1996)）。上記相同領域のアミノ酸配列と高い相同性を有するアミノ酸配列は、セリンプロテアーゼのみならずPseudoalteromonas、 Alteromonas、VibrioおよびMycococcusのメタルプロテアーゼでも保存されていることが分かった。いずれのプロテアーゼでもこの保存アミノ酸配列を有する領域はプロセッシングで失われるため、当該領域は細胞外への分泌に関与していると考えられている。 Comparison of the amino acid sequence of EspI protease and the amino acid sequence of proteases from other organisms revealed that it showed high homology with the serine protease (AspI) produced by the marine bacterium Alteromonas sp. O-7. became. AspI, like EspI protease, has a region containing a repetitive sequence in the C-terminal region, and it has been revealed that this region is deleted by processing accompanying maturation (Biosci. Biotechnol. Biochem. 60: 1284-1288 (1996)). It was found that amino acid sequences having high homology with the amino acid sequences of the above homologous regions are conserved not only by serine proteases but also by metalloproteases of Pseudoalteromonas, Alteromonas, Vibrio and Mycococcus. In any protease, the region having this conserved amino acid sequence is lost by processing, and it is considered that the region is involved in extracellular secretion.
一方、EspIプロテアーゼにおいては、上記繰返し領域は成熟プロテアーゼにおいても部分的に残されている。詳細に説明すると、EspIプロテアーゼのＣ末端側のプロセッシングは相同領域Ｂの中央部分（Ｇ６５０（配列番号２に示すアミノ酸配列の第６５０位のグリシン（Ｇ））の周辺）において行われると推定され、成熟プロテアーゼは相同領域Ａの全体および相同領域ＢのＮ末端側半分を有していると考えられる。したがって、EspIプロテアーゼは、プロセッシング後も上記繰返し領域を保有している点において既知のプロテアーゼとは異なっている。 On the other hand, in EspI protease, the above repeat region is partially left in mature protease. More specifically, it is presumed that the C-terminal processing of EspI protease is carried out in the central part of homology region B (G650 (around glycine (G) at position 650 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2)), The mature protease is considered to have the entire homologous region A and the N-terminal half of the homologous region B. Thus, EspI protease differs from known proteases in that it retains the above repeat region after processing.
〔実施例３：Ｃ末端領域の赤潮藻類結合能の検証〕
EspIプロテアーゼはプロセッシング後も上記繰返し領域を保有していること、および、当該繰返し領域を持たない市販のプロテアーゼは赤潮藻類殺藻活性を示さないことから本発明の発明者らは、当該繰返し領域が赤潮藻類殺藻に関与しているのではないかと考えた。そこで、一つの可能性として、上記繰返し領域が赤潮藻類に結合する能力を有している可能性を考え、この可能性を検証する実験を行った。
[Example 3: Verification of red tide algae binding ability of C-terminal region]
Since the EspI protease retains the above-mentioned repeat region even after processing, and the commercially available protease that does not have the repeat region does not show red tide algal algicidal activity, the inventors of the present invention have said repeat region. I thought that it might be involved in red tide algae killing. Therefore, as one possibility, we considered the possibility that the repetitive region has the ability to bind to red tide algae, and conducted an experiment to verify this possibility.
具体的には、図４に示す、相同領域Ａのみを含む領域Ｃ３（Gly489〜Glu567）、相同領域Ａと相同領域ＢのＣ末端側半分とを含む領域Ｃ５（Gly489〜Gly650）、相同領域Ａと相同領域Ｂとを含む領域Ｃ（Gly489〜Pro711）をそれぞれHisタグが付加されたGFP（green fluorescent protein）と融合させたGFP融合タンパク質（GFP::Ｃ３、GFP::Ｃ５、GFP::Ｃ）を作製し、当該GFP融合タンパク質が赤潮藻類に結合するかどうかを調べた。 Specifically, the region C3 (Gly489 to Glu567) including only the homologous region A, the region C5 (Gly489 to Gly650) including the homologous region A and the C-terminal half of the homologous region B, and the homologous region A shown in FIG. And GFP fusion proteins (GFP :: C3, GFP :: C5, GFP :: C) obtained by fusing the region C (Gly489 to Pro711) including the homologous region B with GFP (green fluorescent protein) to which the His tag is added. ) And examined whether the GFP fusion protein binds to red tide algae.
上記GFP融合タンパク質は、大腸菌発現系を用いて生産され、当該大腸菌のタンパク質抽出液をNiカラム（アマシャム社製）を用いて精製することにより取得された。また、GFP融合タンパク質と赤潮細胞との結合の有無は、GFP融合タンパク質を含む改変ＳＷIII培地（非特許文献１参照）中で赤潮細胞（S. costatum）をインキュベート（室温、５分間）した後に当該赤潮細胞を洗浄し、GFP由来の緑色蛍光を検出することにより調べられた。 The GFP fusion protein was produced using an E. coli expression system, and was obtained by purifying the protein extract of the E. coli using a Ni column (Amersham). In addition, the presence or absence of binding between the GFP fusion protein and the red tide cells is determined after incubating the red tide cells (S. costatum) in a modified SWIII medium (see Non-Patent Document 1) containing the GFP fusion protein (room temperature, 5 minutes). Red tide cells were washed and examined by detecting GFP-derived green fluorescence.
その結果が図６に示されている。同図は、Ｃ３（図６（ａ））、Ｃ５(図６（ｂ）)、Ｃ(図６（ｃ）)の各GFP融合タンパク質でそれぞれ処理された赤潮藻類を示している。GFP蛍光を発している部分が密集している部分は矢印で示されている。同図（ａ）〜（ｃ）に示すように、GFP::Ｃ３で処理した場合には、わずかなGFP蛍光が検出できるのみであったが、GFP::Ｃ５の場合には細胞全域にGFP蛍光が検出され、GFP::Ｃの場合にはさらに強いGFP蛍光が検出された。特に、GFP::Ｃの場合には、矢印で示す赤潮細胞の連結部分に強いGFP蛍光が検出された。なお、GFPのみで処理した場合には、まったくGFP蛍光は検出されなかった（データ示さず）。 The result is shown in FIG. The figure shows red tide algae treated with GFP fusion proteins of C3 (FIG. 6 (a)), C5 (FIG. 6 (b)), and C (FIG. 6 (c)). The portion where the portions emitting GFP fluorescence are dense is indicated by arrows. As shown in (a) to (c) of the figure, when treated with GFP :: C3, only a small amount of GFP fluorescence could be detected. Fluorescence was detected, and in the case of GFP :: C, stronger GFP fluorescence was detected. In particular, in the case of GFP :: C, strong GFP fluorescence was detected at the junction of red tide cells indicated by arrows. When treated with GFP alone, no GFP fluorescence was detected (data not shown).
上記の結果から、Ｃ３よりもＣ５、Ｃ５よりもＣがより強く赤潮藻類と結合することが明らかとなった。すなわち、Ｃ末端領域をより多く含む融合タンパク質がより高い結合能を有することが明らかとなった。 From the above results, it has been clarified that C5 binds to red tide algae more strongly than C3 and C5 than C3. That is, it became clear that the fusion protein containing more C-terminal regions has a higher binding ability.
〔実施例４：赤潮細胞結合領域を用いた赤潮藻類の殺藻試験〕
上記実施例３において用いられたＣ３、Ｃ５、Ｃの各GFP融合タンパク質は、いずれもプロテアーゼ活性は有していなかった（データ示さず）。そこで、本発明の発明者らは、EspIプロテアーゼのＣ末端領域により赤潮藻類に結合し、Ｎ末端側の領域が有するプロテアーゼ活性によって当該赤潮藻類が殺されるのだろうと推測した。そこで、上記Ｃ末端領域のみで赤潮殺藻活性を持つかどうかを調べるために、上記GFP融合タンパク質を用いて赤潮藻類の殺藻試験を行った。
[Example 4: Algaecidal test of red tide algae using red tide cell binding region]
None of the C3, C5, and C GFP fusion proteins used in Example 3 above had protease activity (data not shown). Therefore, the inventors of the present invention speculated that the red tide algae would be killed by the protease activity possessed by the N-terminal region by binding to the red tide algae through the C-terminal region of EspI protease. Therefore, in order to examine whether or not only the C-terminal region has red tide algae killing activity, a red tide algae algae kill test was performed using the GFP fusion protein.
具体的には、S. costatumを改変ＳＷIII培地に植え、１２時間周期の明暗条件下（２２℃）で１週間培養したものを前培養液とし、この前培養液１０μlを新鮮な改変ＳＷIII培地２００μlに植え、さらにGFPまたはGFP融合タンパク質を含む改変ＳＷIII培地３０μlを添加した。そして、この混合液を１２時間周期の明暗条件下（２２℃）で一定期間培養した。なお、GFPまたはGFP融合タンパク質の終濃度は２．５mg/mlであり、S. costatumの初発細胞濃度は約２×１０５/mlである。 Specifically, S. costatum was planted in a modified SWIII medium and cultured for one week under a 12 hour light / dark condition (22 ° C.) as a preculture, and 10 μl of this preculture was added to 200 μl of fresh modified SWIII medium. And 30 μl of a modified SWIII medium containing GFP or GFP fusion protein was added. And this liquid mixture was culture | cultivated for a fixed period on the light-dark conditions (22 degreeC) of a 12 hour period. The final concentration of GFP or GFP fusion protein is 2.5 mg / ml, and the initial cell concentration of S. costatum is about 2 × 10 5 / ml.
図７は、GFP融合タンパク質を用いた赤潮藻類に対する殺藻試験の結果を示す図である。同図には、Ｃ３、Ｃ５、Ｃの各GFP融合タンパク質をS. costatumの培養液に添加し、０、３、５日間培養した結果が示されており、コントロールとしてGFPのみを添加した場合および何も添加しなかった場合の結果も示されている。赤潮細胞が正常に増殖すれば、培養液は茶色く（同図においては黒く）なってゆき、赤潮細胞が死滅すれば培養液には顕著な変化は起こらない。 FIG. 7 is a diagram showing the results of an algicidal test for red tide algae using GFP fusion protein. The figure shows the results of adding C3, C5, and C GFP fusion proteins to the culture medium of S. costatum and culturing for 0, 3, and 5 days. When GFP alone was added as a control and The results when nothing was added are also shown. If red tide cells grow normally, the culture will turn brown (black in the figure), and if the red tide cells die, there will be no significant change in the culture.
図７に示すように、何も添加しなかった場合、GFPのみを添加した場合には、赤潮藻類は顕著に増殖し、GFP::Ｃ３を添加した場合にも、ほぼ同様に増殖した。一方、GFP::Ｃ５およびGFP::Ｃを添加した場合には、赤潮藻類の増殖が抑制された。また、GFP::Ｃ５とGFP::Ｃとを比較した場合には、GFP::Ｃの方が増殖抑制効果は高かった。上記の結果から、Ｃ５およびＣの各GFP融合タンパク質が赤潮藻類に対する殺藻活性を有しており、当該赤潮藻類に対する殺藻活性は、Ｃ末端領域の赤潮細胞への結合能と正の相関があることが明らかとなった。 As shown in FIG. 7, when nothing was added, when only GFP was added, the red tide algae proliferated remarkably, and when GFP :: C3 was added, it proliferated almost in the same manner. On the other hand, when GFP :: C5 and GFP :: C were added, the growth of red tide algae was suppressed. Moreover, when GFP :: C5 and GFP :: C were compared, GFP :: C had a higher growth inhibitory effect. From the above results, each of the C5 and C GFP fusion proteins has an algicidal activity against red tide algae, and the algicidal activity against the red tide algae has a positive correlation with the binding ability to red tide cells in the C-terminal region. It became clear that there was.
上記の結果をさらに確認するために、Ｃの領域のＮ末端にHisタグが付加されたペプチド（Hisタグペプチド）を発現させ、当該Hisタグペプチドを用いて赤潮藻類に対する殺藻試験を行った。なお、上記Hisタグペプチドは、Ｃの領域をコードするＤＮＡ断片をHisタグ付加タンパク質発現用ベクター（pIVEX2.4a、ロシュ社製）に組み込み、当該ベクターを大腸菌BL21（DE3）に導入した後に発現誘導することにより生産された。そして、生産されたペプチドは、GFP融合タンパク質の場合と同様にNiカラムを用いて精製された。 In order to further confirm the above results, a peptide with a His tag added to the N-terminus of the C region (His tag peptide) was expressed, and an algicidal test against red tide algae was performed using the His tag peptide. The His-tagged peptide is induced after the DNA fragment encoding the C region is incorporated into a His-tagged protein expression vector (pIVEX2.4a, Roche) and the vector is introduced into E. coli BL21 (DE3). It was produced by doing. The produced peptide was purified using a Ni column as in the case of the GFP fusion protein.
図８には、上記のHisタグペプチドを、それぞれ０、１５６．３、３１２．５μg/mlの濃度になるように、S. costatumの培養液に添加し、０および５日間培養した結果が示されている。同図に示すように、Hisタグを付加した場合でも、Ｃの領域は赤潮藻類に対する殺藻活性を示した。この結果から、EspIプロテアーゼのＣ末端の繰返し領域が赤潮藻類に対する殺藻活性を持つことが確認された。 FIG. 8 shows the result of adding the above His-tag peptide to the culture solution of S. costatum at concentrations of 0, 156.3 and 312.5 μg / ml and culturing for 0 and 5 days, respectively. Has been. As shown in the figure, even when the His tag was added, the region C showed algicidal activity against red tide algae. From this result, it was confirmed that the C-terminal repetitive region of EspI protease has algicidal activity against red tide algae.
本発明に係るペプチドは、赤潮藻類に対する殺藻活性を有している。それゆえ本発明は漁場等を赤潮から保護する薬剤や赤潮防御ネット等を構成することができ、水産業、養殖業等に利用可能である。 The peptide according to the present invention has an algicidal activity against red tide algae. Therefore, the present invention can constitute a chemical for protecting fishing grounds and the like from red tides, a red tide defense net, and the like, and can be used for fisheries, aquaculture, and the like.
Claims (16)
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
を含むことを特徴とするペプチド。 A peptide having red tide algae algicidal activity,
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; or (b) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added,
A peptide characterized by comprising
（ａ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
を含むことを特徴とするペプチド。 A peptide having red tide algae algicidal activity,
(A) an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10; or (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10,
A peptide characterized by comprising
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|---|---|---|---|---|
| JP2008193982A (en) * | 2007-02-14 | 2008-08-28 | National Univ Corp Shizuoka Univ | Method for producing vitamin b12, and material for producing vitamin b12 |
| WO2008153272A1 (en) * | 2007-06-11 | 2008-12-18 | Korea Ocean Research & Development Institute | Protease having algicidal activity, gene encoding the same and algicidal formulation comprising the same |
| CN104140963A (en) * | 2014-06-26 | 2014-11-12 | 浙江大学 | Preparation method of compound microbial algaecide |
-
2005
- 2005-04-21 JP JP2005124258A patent/JP2006296318A/en active Pending
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