JP2006288303A - Method for purification of riboflavin glycoside and method for analysis thereof - Google Patents
Method for purification of riboflavin glycoside and method for analysis thereof Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006288303A JP2006288303A JP2005114973A JP2005114973A JP2006288303A JP 2006288303 A JP2006288303 A JP 2006288303A JP 2005114973 A JP2005114973 A JP 2005114973A JP 2005114973 A JP2005114973 A JP 2005114973A JP 2006288303 A JP2006288303 A JP 2006288303A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- riboflavin
- glycoside
- glycosides
- purifying
- analyzing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Description
本発明は、糸状菌（Mucor javanicus等）等の生物由来の酵素を利用してリボフラビンと糖類からリボフラビン配糖体を合成した粗精製物からリボフラビン配糖体を単離するリボフラビン配糖体の精製方法および分析方法に関する。 The present invention relates to purification of a riboflavin glycoside that isolates a riboflavin glycoside from a crude product obtained by synthesizing a riboflavin glycoside from riboflavin and a saccharide using an enzyme derived from an organism such as a filamentous fungus (Mucor javanicus, etc.). The present invention relates to a method and an analysis method.
糸状菌（Mucor Javanicus等）の菌体内に、リボフラビンと糖類からリボフラビン配糖体の一つであるリボフラビングルコシド（riboflavinylglucoside）を生成する酵素が存在することは、本発明者等の研究によって既に報告されている（非特許文献１参照）。近年、各種ビタミンの配糖体の生理活性や薬理研究が進展し、リボフラビン配糖体についても未知の生理活性，薬理効果が期待されており、より高純度で効率のよいリボフラビン配糖体の精製が要請されている。
従来のリボフラビン配糖体の精製方法は、図４に示すように、糸状菌（Mucor javanicus等）由来の酵素、リボフラビン（図中、Ｂ2と表示）およびマルトース等の糖類を反応させてリボフラビン配糖体を生成し（図中、Ｂ2ｇｌと表示）、約１０ｍｌ（培養ビンの１／２５）の反応液をろ紙にスポットし、酢酸エチル：ピリジン：水＝１０：３：３の溶離液で展開する。展開に要する時間は１５時間である。展開した黄色の部分を切り取って集め、水で抽出した後、リボフラビンをエタノールで結晶化させてリボフラビン配糖体を分離するようになっていた。
It has been already reported by the present inventors that an enzyme that produces riboflavin glucoside, which is one of riboflavin glycosides, from riboflavin and saccharides is present in the fungi (Mucor Javanicus, etc.). (See Non-Patent Document 1). In recent years, the physiological activity and pharmacological research of glycosides of various vitamins has progressed, and unknown physiological activity and pharmacological effects of riboflavin glycosides are also expected. Purification of riboflavin glycosides with higher purity and efficiency Is requested.
As shown in FIG. 4, a conventional method for purifying riboflavin glycosides comprises reacting a saccharide such as an enzyme derived from a filamentous fungus (Mucor javanicus, etc.), riboflavin (shown as B 2 in the figure) and maltose, and the like. Glucose was produced (indicated as B 2 gl in the figure), about 10 ml (1/25 of the culture bottle) of the reaction solution was spotted on the filter paper, and eluent of ethyl acetate: pyridine: water = 10: 3: 3 Expand with. The time required for deployment is 15 hours. The developed yellow portion was cut out and collected, extracted with water, and then riboflavin was crystallized with ethanol to separate riboflavin glycosides.
しかし、従来のリボフラビン配糖体の精製方法では、リボフラビンとリボフラビン配糖体を分離できるものの、糖類がリボフラビン配糖体と分離されずに混入してしまい、純度が低くなるという問題があった。また、１回の分離操作に要する時間が、約１週間程度と、長くかかり過ぎるという問題もあった。
一方、反応液の成分分析についても、精製と同じ溶離液を使って、ペーパークロマトグラフィー（ＰＰＣ），薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって行っており、リボフラビン配糖体の定量的な評価ができず、大量に存在する糖類についても検出できなかった。また、従来の方法では大過剰の糖類を必要としていた。
また、精製，分析に使用するピリジン，酢酸エチルは可燃性危険物に属する有機溶媒であり、扱いにくいという問題もあった。
On the other hand, the component analysis of the reaction solution is also performed by paper chromatography (PPC) and thin layer chromatography (TLC) using the same eluent as in the purification, and quantitative evaluation of riboflavin glycosides cannot be performed. Even saccharides present in large quantities could not be detected. Further, the conventional method requires a large excess of sugars.
In addition, pyridine and ethyl acetate used for purification and analysis are organic solvents belonging to flammable hazardous materials, and there is a problem that they are difficult to handle.
本発明は上記した従来技術の問題を解決するためになされたもので、その目的とするところは、高純度のリボフラビン配糖体を効率よく精製することができるリボフラビン配糖体の精製方法を提供し、併せて精製されるリボフラビン配糖体の粗精製物を定量的に分析可能とする分析方法を提供することにある。 The present invention has been made to solve the above-described problems of the prior art, and an object of the present invention is to provide a method for purifying a riboflavin glycoside capable of efficiently purifying a high-purity riboflavin glycoside. Another object of the present invention is to provide an analysis method that enables quantitative analysis of a crude product of riboflavin glycosides that are purified together.
本発明者らは、これらの課題を解決するために鋭意研究した結果、液体クロマトグラフィーの手法によって、カラム又はろうと等の充填剤保持体に保持された充填剤にリボフラビンおよびリボフラビン配糖体を吸着させて糖類を分離し、次いで、吸着剤からリボフラビンおよびリボフラビン配糖体を脱離させ、リボフラビン配糖体を再結晶させてリボフラビン配糖体を分離することにより、糖類を含まない純度の高いリボフラビン配糖体を精製することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、生物由来の酵素を利用してリボフラビンと糖類から合成されたリボフラビン配糖体の粗精製物からリボフラビン配糖体を精製するリボフラビン配糖体の精製方法において、粗精製物を、リボフラビンおよびリボフラビン配糖体を吸着する性質の充填剤を詰めた充填剤保持体に入れ、充填剤保持体に糖類を溶出する溶媒を流して粗精製物から糖類を分離し、次いで、充填剤保持体にリボフラビンおよびリボフラビン配糖体を溶出する性質の溶媒を流してリボフラビンおよびリボフラビン配糖体を充填剤保持体から流下させ、リボフラビンおよびリボフラビン配糖体が入った溶液を濃縮乾固し、乾燥物をリボフラビンは溶解しリボフラビン配糖体は難溶の溶媒に溶かしリボフラビン配糖体を再結晶させてリボフラビン配糖体を分離することを特徴とするリボフラビン配糖体の精製方法である。
As a result of diligent research to solve these problems, the present inventors adsorbed riboflavin and riboflavin glycosides to the packing material held in the packing material holding body such as a column or wax by liquid chromatography. Saccharides are separated, and then riboflavin and riboflavin glycosides are desorbed from the adsorbent, and riboflavin glycosides are recrystallized to separate riboflavin glycosides. The present inventors have found that glycosides can be purified and have completed the present invention.
That is, the present invention relates to a method for purifying a riboflavin glycoside by purifying a riboflavin glycoside from a crude riboflavin glycoside synthesized from riboflavin and a saccharide using a biological enzyme. Put riboflavin and a riboflavin glycoside adsorbent into a filler holder packed with a filler, and then separate the saccharide from the crude product by flowing a solvent that elutes saccharides into the filler holder, Run a solvent that elutes riboflavin and riboflavin glycosides into the support to cause riboflavin and riboflavin glycosides to flow down from the filler support, and concentrate and dry the solution containing riboflavin and riboflavin glycosides. Riboflavin glycosides are dissolved by dissolving riboflavin, dissolving riboflavin glycosides in a slightly soluble solvent, and recrystallizing riboflavin glycosides. It is a method for purifying riboflavin glycoside and separating.
また、本発明のリボフラビン配糖体の分析方法は、生物由来の酵素を利用してリボフラビンと糖類からリボフラビン配糖体を合成した粗精製物に含まれる成分を液体クロマトグラフィーにより分析するもので、ＯＤＳカラムを用い、溶離液としてアルコールを用いたことを特徴とする分析方法である。
特に、糖類（二糖類、オリゴ糖類、多糖類、ただし単糖類は除く）から合成されたリボフラビン配糖体の分析に好適である。
アルコールの濃度は、５〜２５重量％が好適で、特に１０重量％とすれば、リボフラビンとリボフラビン配糖体を完全に分離できた。また、緩衝液としてリン酸緩衝液を用いることが好ましく、濃度は１０ｍＭとすることが好適であった。
The method for analyzing riboflavin glycosides of the present invention is to analyze components contained in a crude product obtained by synthesizing riboflavin glycosides from riboflavin and saccharides using an enzyme derived from a living organism by liquid chromatography. This analysis method is characterized by using an ODS column and using alcohol as an eluent.
In particular, it is suitable for analysis of riboflavin glycosides synthesized from saccharides (disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, except monosaccharides).
The alcohol concentration is preferably 5 to 25% by weight, and when it is particularly 10% by weight, riboflavin and riboflavin glycoside were completely separated. Further, it is preferable to use a phosphate buffer as the buffer, and the concentration is preferably 10 mM.
１）リボフラビン配糖体の粗精製物の生成
リボフラビン配糖体の粗精製物は、リボフラビンと糖類に、生物由来の酵素液を添加し、ｐＨを整えた緩衝液中で所定温度に維持し所定時間反応させて生成する。温度条件は３７℃、反応時間は４８時間の条件が好適である。
1) Production of a crude product of riboflavin glycosides A crude product of riboflavin glycosides is prepared by adding a biological enzyme solution to riboflavin and saccharides and maintaining the pH at a predetermined temperature in a buffer solution. Produced by reacting for hours. The temperature condition is preferably 37 ° C. and the reaction time is 48 hours.
酵素は、糸状菌（Mucor javanicus等）に由来するものが好適である。酵素は細胞内に存在しているので、これらの菌を培養して乾燥させ、そのまますりつぶしたのち少量の水を加えて遠心分離し、その上清を酵素液とする。
糸状菌の他に、麹菌（Aspergillus oryzae）等の菌類、牛，羊，ラットおよびモルモット等の動物の血清、肝臓抽出物等にも、リボフラビンと糖類を反応させてリボフラビン配糖体を生成する酵素の存在が知られており、これらの菌類および動物の血清、肝臓抽出物等も利用可能である。
これらの酵素は、糖転移反応を触媒する酵素（トランスグルコシダーゼ）で、酵素によって糖類の単糖と単糖をつないでいるグリコシド結合を切断すると同時に新しくリボフラビンと結合をつくる。この酵素反応で用いられる糖類としては、単糖類を除く各種の二糖類（ラクトース、マルトース、セロビオース、メリビオース、ゲンチオビオースなど）、三糖類、オリゴ糖（数個の単糖が結合している化合物）およびスターチ等の多糖類が使用可能であり、酵素によってリボフラビンに末端の糖を転移させる。糖類については、単糖類以外であればよく、その種類は限定されないが、二糖類、オリゴ糖、多糖類が本発明のリボフラビン配糖体を得るのに適している。
もっとも、本発明は上記酵素に限定する趣旨ではなく、単糖，多糖に限らず、リボフラビンに糖類を結合する生物由来の種々の酵素が利用可能であり、生成されるリボフラビン配糖体もリボフラビンに単糖が結合したものに限定されず、リボフラビンに多糖類が結合したものも含まれる。
The enzyme is preferably derived from a filamentous fungus (Mucor javanicus or the like). Since the enzyme is present in the cells, these bacteria are cultured and dried, ground as it is, added with a small amount of water and centrifuged, and the supernatant is used as an enzyme solution.
In addition to filamentous fungi, enzymes that produce riboflavin glycosides by reacting riboflavin with sugars such as fungi such as Aspergillus oryzae, serum of animals such as cattle, sheep, rats and guinea pigs, liver extracts, etc. These fungi and animal sera, liver extracts and the like can also be used.
These enzymes are enzymes (transglucosidases) that catalyze a transglycosylation reaction, and the enzyme cleaves a glycosidic bond that connects a monosaccharide to a saccharide and simultaneously forms a new bond with riboflavin. As saccharides used in this enzymatic reaction, various disaccharides (such as lactose, maltose, cellobiose, melibiose, gentiobiose) other than monosaccharides, trisaccharides, oligosaccharides (compounds in which several monosaccharides are bonded) and Polysaccharides such as starch can be used, and the terminal sugar is transferred to riboflavin by an enzyme. The saccharides may be other than monosaccharides, and the types thereof are not limited, but disaccharides, oligosaccharides, and polysaccharides are suitable for obtaining the riboflavin glycoside of the present invention.
However, the present invention is not intended to be limited to the above-mentioned enzymes, and is not limited to monosaccharides and polysaccharides, and various enzymes derived from organisms that bind saccharides to riboflavin can be used, and the riboflavin glycosides produced can also be converted to riboflavin. It is not limited to those bound with monosaccharides, but includes those wherein polysaccharides are bound to riboflavin.
２）リボフラビン配糖体の精製
リボフラビン配糖体の精製工程は、試料の粗精製物から蛋白質や核酸を含む巨大分子を除く除蛋白工程と、充填剤により、粗精製物から余分な糖類を除く脱糖工程と、充填剤保持体からリボフラビンおよびリボフラビン配糖体を離脱させるリボフラビン，リボフラビン配糖体流去工程と、リボフラビン配糖体を再結晶させてリボフラビン配糖体を分離する再結晶工程と、から構成される。
2) Purification of riboflavin glycosides The purification process of riboflavin glycosides includes a deproteinization step in which macromolecules containing proteins and nucleic acids are removed from the crudely purified sample, and extra saccharides are removed from the crudely purified product by a filler. A desugaring step, a riboflavin and riboflavin glycoside removal step for releasing riboflavin and riboflavin glycoside from the filler carrier, and a recrystallization step for recrystallizing the riboflavin glycoside to separate the riboflavin glycoside. Is composed of.
２−１）除蛋白工程
除蛋白工程は、粗精製物から、主として酵素液に含まれていた蛋白質および核酸等の巨大分子を除去する工程で、遠心分離や濾過によって機械的に分離する。核酸は蛋白質ではないが、便宜上除蛋白工程と呼ぶものとする。除蛋白工程は、遠心分離により巨大分子を除去し、その上清を濾過して遠心分離で除去できなかった蛋白質や核酸を除去することが好ましい。
遠心分離工程は、粗精製物を遠心分離機にかけて蛋白質等を沈殿させ、上清をデカンテーションする。この工程で細胞破砕物由来の巨大分子（蛋白質や核酸）が除去される。
遠心分離は、４５００ｒｐｍ程度の回転数で、２０分程度行うことが効果的である。
遠心分離で除去できなかった比較的低分子の蛋白質や核酸を除去する濾過材としては種々の濾過材を利用可能であるが、メンブランフィルタが好適である。
2-1) Deproteinization step The deproteinization step is a step of removing macromolecules such as proteins and nucleic acids mainly contained in the enzyme solution from the roughly purified product, and mechanically separated by centrifugation or filtration. Although the nucleic acid is not a protein, it is referred to as a deproteinization step for convenience. In the deproteinization step, it is preferable to remove macromolecules by centrifugation, filter the supernatant, and remove proteins and nucleic acids that could not be removed by centrifugation.
In the centrifugation step, the crude product is centrifuged to precipitate proteins and the supernatant is decanted. In this step, macromolecules (proteins and nucleic acids) derived from cell debris are removed.
It is effective to perform the centrifugation for about 20 minutes at a rotational speed of about 4500 rpm.
Various filter media can be used as filter media for removing relatively low molecular weight proteins and nucleic acids that could not be removed by centrifugation, but membrane filters are preferred.
２−２）脱糖工程
脱糖工程は、まず、リボフラビンおよびリボフラビン配糖体を吸着する性質の充填剤を充填した保持体としてのカラムまたはろうとに除蛋白した粗精製物を入れる。粗精製物の溶液中のリボフラビンおよびリボフラビン配糖体が充填剤に吸着される。
充填剤としては、多孔質有機高分子粒子が好適である。多孔質有機高分子粒子としては、スチレン−ジビニルベンゼン系重合体が好適で、たとえば、ダイヤイオンＨＰ２０（三菱化学（株）の商品名）等が利用可能である。
粗精製物を入れた充填剤保持体に、糖類を溶出する溶媒を流して洗浄し、糖類を除去する。
糖類を溶出する溶媒としては、充填剤に吸着されたリボフラビン，リボフラビン配糖体は溶出せず糖類のみを溶出させる溶媒であり、水，アセトン等が適用可能で、特に、水が好適である。充填された粗精製物中の糖の量，カラムまたはろうとの大きさ，温度条件等にもよるが、水を総量で３リットル程度流せば糖を完全に除去することができる。
2-2) Desugaring step In the desugaring step, first, a crudely purified product deproteinized is put into a column or a funnel as a support packed with a packing having a property of adsorbing riboflavin and a riboflavin glycoside. Riboflavin and riboflavin glycoside in the solution of the crude product are adsorbed on the filler.
As the filler, porous organic polymer particles are suitable. As the porous organic polymer particles, a styrene-divinylbenzene polymer is suitable, and for example, Diaion HP20 (trade name of Mitsubishi Chemical Corporation) can be used.
A solvent for eluting the saccharide is washed by flowing the filler holding body containing the roughly purified product to remove the saccharide.
As a solvent for eluting saccharides, riboflavin and riboflavin glycoside adsorbed on the filler are not eluted, but only saccharides are eluted, and water, acetone and the like are applicable, and water is particularly preferable. Although depending on the amount of sugar in the packed crude product, the size of the column or funnel, the temperature conditions, etc., sugar can be completely removed by flowing water in a total amount of about 3 liters.
２−３）リボフラビン，リボフラビン配糖体流去工程
脱糖した後、充填剤保持体にリボフラビンおよびリボフラビン配糖体を溶出する性質の溶媒を流し、充填剤に吸着されているリボフラビンおよびリボフラビン配糖体を溶出して充填剤保持体から流下させる。この時点で、溶液中にはリボフラビンとリボフラビン配糖体のみが残っている。
この流去工程で使用するリボフラビンおよびリボフラビン配糖体を溶出する溶媒としては、アルコールが有効であり、特にメタノール，エタノールが好適である。メタノールとエタノールでは、エタノールの方が好ましい。エタノールの濃度としては、１０〜１００％程度のものが好適である。
2-3) Riboflavin and riboflavin glycoside removal process
After desugaring, a solvent having a property of eluting riboflavin and riboflavin glycoside is passed through the filler holder, and riboflavin and riboflavin glycoside adsorbed on the filler are eluted and flowed down from the filler holder. At this point, only riboflavin and riboflavin glycosides remain in the solution.
Alcohol is effective as a solvent for eluting riboflavin and riboflavin glycoside used in this run-off process, and methanol and ethanol are particularly preferable. Of methanol and ethanol, ethanol is preferred. The ethanol concentration is preferably about 10 to 100%.
２−４）再結晶工程
再結晶工程では、まず、リボフラビンおよびリボフラビン配糖体が入った溶液を濃縮乾固する。エバポレータあるいは凍結乾燥により濃縮し、最終的に真空乾燥などによって乾燥させる。
そして、乾燥物を、リボフラビンは溶解可能でリボフラビン配糖体は難溶の溶媒によりリボフラビン配糖体を再結晶させてリボフラビン配糖体を分離する。再結晶に使用する溶媒としては無水エタノールが好適である。
2-4) Recrystallization step In the recrystallization step, first, a solution containing riboflavin and a riboflavin glycoside is concentrated and dried. Concentrate by evaporator or freeze-drying and finally dry by vacuum drying or the like.
Then, the riboflavin glycoside is recrystallized from the dried product by using a solvent in which riboflavin can be dissolved and riboflavin glycoside is hardly soluble to separate the riboflavin glycoside. As the solvent used for recrystallization, anhydrous ethanol is suitable.
このように、本発明によれば、リボフラビンと糖類を反応させたリボフラビン配糖体の粗精製物から、多孔質有機高分子粒子を利用して糖類を分離し、次いで、リボフラビンとリボフラビン配糖体を溶出し、無水エタノールによってリボフラビン配糖体を再結晶させてリボフラビン配糖体を精製したので、糖類の混入が無くほぼ１００％の高純度のリボフラビン配糖体を精製することができた。
また、カラムまたはろうとを用いるので、一回で処理できるスケールが大きくなった。
さらに、溶出液としては、エタノールや水を使うので、安全でかつ安価に精製できる。
また、分離操作に要する時間も従来は約１週間かかっていたのに対して、約２日で分離することができるようになった。
As described above, according to the present invention, saccharides are separated from the riboflavin glycoside crude product obtained by reacting riboflavin with saccharides using porous organic polymer particles, and then riboflavin and riboflavin glycosides are used. The riboflavin glycoside was purified by recrystallizing the riboflavin glycoside with absolute ethanol, so that it was possible to purify the riboflavin glycoside having a purity of almost 100% without any saccharide contamination.
In addition, since a column or a funnel is used, the scale that can be processed at once is increased.
Furthermore, since ethanol or water is used as the eluent, it can be purified safely and inexpensively.
In addition, the separation operation conventionally takes about one week, but the separation can be performed in about two days.
３）リボフラビン配糖体の分析
上記したリボフラビン配糖体の粗精製物に含まれる成分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析する。
この分析には、ＯＤＳカラムを用い、溶離液としてアルコールを用いる。ＯＤＳカラムは、公知のシルカゲルの担体にオクタデシルシリル基を化学結合した充填剤が詰められたカラムである。
アルコールとしては、メタノール、エタノール等が利用可能で、特にエタノールが好適である。アルコールの濃度は、５〜３０重量％、特に１０重量％とすることが好適である。
3) Analysis of Riboflavin Glycoside The components contained in the crude purified product of the above riboflavin glycoside are analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC).
This analysis uses an ODS column and alcohol as the eluent. The ODS column is a column in which a known silica gel carrier is packed with a filler in which octadecylsilyl groups are chemically bonded.
As the alcohol, methanol, ethanol or the like can be used, and ethanol is particularly preferable. The concentration of the alcohol is preferably 5 to 30% by weight, particularly 10% by weight.
また、緩衝液としてリン酸緩衝液を使用することが好適である。リン酸緩衝液の濃度は１０ｍＭとすることが好ましい。緩衝液としては、リン酸緩衝液に限定されるものではなく、分析対象の成分と反応せず、ｐＨを一定に保つものであればよい。
成分分析は、リボフラビン配糖体の粗精製物をＯＤＳカラムに注入し、アルコールを溶離液として溶出させることにより、リボフラビンとリボフラビン配糖体を分離する。
検出器としては、紫外線吸収検出器が用いられる。アルコール濃度は１５〜３０％ではピークが不明瞭となるが、１０％では完全に分離することができる。
また、検出器として、示差屈折率検出器（ＲＩ検出器）を用いることにより、マルトースとグルコースについても確認できた。
In addition, it is preferable to use a phosphate buffer as the buffer. The concentration of the phosphate buffer is preferably 10 mM. The buffer solution is not limited to the phosphate buffer solution, and may be any buffer solution that does not react with the component to be analyzed and keeps the pH constant.
In the component analysis, riboflavin and riboflavin glycoside are separated by injecting a crude purified product of riboflavin glycoside onto an ODS column and eluting alcohol as an eluent.
An ultraviolet absorption detector is used as the detector. When the alcohol concentration is 15 to 30%, the peak is unclear, but when the alcohol concentration is 10%, it can be completely separated.
Moreover, maltose and glucose were also confirmed by using a differential refractive index detector (RI detector) as a detector.
以下に、本発明の具体的態様を実施例により更に詳細に説明する。
（１）リボフラビングルコシドの生成
図２に示すように、リボフラビン（Ｂ2：０．０５ｇ）、マルトース（２．５ｇ）に、糸状菌（Mucor Javanicus等）由来の酵素液を添加し、ｐＨ４．３（２０℃）のクエン酸/ＮａＯＨ緩衝液中で３７℃で４８時間反応させて反応液中に、リボフラビンにグルコースが結合したリボフラビン配糖体としてのリボフラビングルコシドを生成した。
酵素液は、糸状菌（Mucor Javanicus等）の粉末乾燥菌体をそのまま乳鉢ですりつぶしたのち少量の水を加えて４５００ｒｐｍで遠心分離し、その上清である。
Hereinafter, specific embodiments of the present invention will be described in more detail by way of examples.
(1) Production of Riboflavin Glucoside As shown in FIG. 2, an enzyme solution derived from filamentous fungi (Mucor Javanicus, etc.) is added to riboflavin (B 2 : 0.05 g) and maltose (2.5 g), and pH is 4.3. A riboflavin glucoside was produced as a riboflavin glycoside in which glucose was bound to riboflavin in a reaction solution at 37 ° C. for 48 hours in a citrate / NaOH buffer solution (20 ° C.).
The enzyme solution is a supernatant obtained by grinding powder-dried cells of filamentous fungi (Mucor Javanicus, etc.) in a mortar as they are, adding a small amount of water, and centrifuging at 4500 rpm.
（２）リボフラビングルコシドの精製
リボフラビン配糖体が含まれる粗精製物７５０ｍｌを、回転数４５００ｒｐｍで２０分間遠心分離することにより、細胞由来の酵素を含む蛋白や核酸等を沈殿させ、上清をデカンテーションし、さらに遠心分離で除去できなかった蛋白等を、細孔径が０．２μｍのメンブランフィルターで濾過して７５０ｍｌの濾液を得た。
この濾液１００ｍｌを、図１に示すように、多孔質有機高分子粒子を充填したＨＰ−２０カラム（内径１００．０ｍｍ，長さ５０〜１００ｍｍ）に充填し、水１０１約３リットルを通水して洗浄し、濾液から未反応のマルトースや副生成物のグルコース等の糖類１０２を除去した。
(2) Purification of riboflavin glucoside 750 ml of a crude product containing riboflavin glycosides is centrifuged at 4500 rpm for 20 minutes to precipitate cell-derived enzyme-containing proteins and nucleic acids, and the supernatant is decaned. Then, proteins that could not be removed by centrifugation were filtered through a membrane filter having a pore size of 0.2 μm to obtain 750 ml of a filtrate.
As shown in FIG. 1, 100 ml of this filtrate is packed into an HP-20 column (inner diameter 100.0 mm, length 50 to 100 mm) packed with porous organic polymer particles, and about 3 liters of
次いで、１００％未満のエタノール１０３を用い、ＨＰ−２０充填剤に吸着されたリボフラビンとリボフラビングルコシドをエタノールに溶出させてカラムから流去する。
この溶出液をエバポレータにより濃縮乾固して約１８０ｍｇの乾燥物を得た。
この乾燥物をごく少量の水に溶解せしめ、無水エタノール１０５をまぜて冷暗所に１〜２日放置し、結晶化したリボフラビングルコシド１０４を約１０５ｍｇ得た。
図４に示した従来方法の場合には、酢酸エチル：ピリジン：水＝１０：３：３の溶離液を用いて、ペーパークロマトグラフィーにより試料をろ紙上に展開するだけなので、精製物１１０のリボフラビングルコシドに糖類が大量に混入してしまう。
Next, riboflavin and riboflavin glucoside adsorbed on the HP-20 packing material are eluted with ethanol using less than 100
The eluate was concentrated to dryness with an evaporator to obtain about 180 mg of a dried product.
This dried product was dissolved in a very small amount of water, mixed with
In the case of the conventional method shown in FIG. 4, the sample is simply developed on a filter paper by paper chromatography using an eluent of ethyl acetate: pyridine: water = 10: 3: 3. A large amount of saccharide is mixed into glucoside.
（３）リボフラビングルコシドの分析
リボフラビングルコシドの粗精製物について、次の条件の高速液体クロマトグラフィーで分析した。
ＯＤＳカラムとして、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（野村化学（株）の登録商標）ＯＤＳ−ＵＧ−５を用いた。このＯＤＳカラムは内径２．５ｍｍ、長さ３００ｍｍのカラムである。
このＯＤＳカラムに、試料を１０μｌ注入し、移動相として固定相より極性が高い１０％エタノール／１０ｍＭリン酸緩液の混合液を流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで通液した。カラムの温度は４０°Ｃである。
紫外線吸収検出器には、ＪａｓｃｏＵＶ−２０７０（日本分光株式会社の商品名）を用い、波長２８０ｎｍまたは４６０ｎｍとしてクロマトグラムを記録することにより、図３に示すようにリボフラビンとリボフラビングルコシドのピークが得られた。
また、示差屈折検出器として、Ｊａｓｃｏ ＲＩ−２０３０（日本分光株式会社の商品名）を用いることより、同条件にて、保持時間１．６分付近にマルトースとグルコースを確認できた。
なお、上記実施例では、精製されるリボフラビン配糖体として、リボフラビングルコシド（Ribofravinylglucoside）を例にとって説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、リボフラビンガラクトシド（Riboflavinylgalactoside）等の他の単糖類が結合したもの、リボフラビンマルトシド（Riboflavinylmaltoside）,リボフラビンメルビオシド（Riboflavinylmelibioside）等、二糖類，多糖類が結合した各種リボフラビン配糖体についても適用可能である。
(3) Analysis of riboflavin glucoside The crude product of riboflavin glucoside was analyzed by high performance liquid chromatography under the following conditions.
As the ODS column, Develosil (registered trademark of Nomura Chemical Co., Ltd.) ODS-UG-5 was used. This ODS column is a column having an inner diameter of 2.5 mm and a length of 300 mm.
10 μl of the sample was injected into this ODS column, and a 10% ethanol / 10 mM phosphate-free mixed liquid having a polarity higher than that of the stationary phase as a mobile phase was passed at a flow rate of 1.0 ml / min. The column temperature is 40 ° C.
As the ultraviolet absorption detector, Jasco UV-2070 (trade name of JASCO Corporation) is used, and the chromatogram is recorded at a wavelength of 280 nm or 460 nm, whereby peaks of riboflavin and riboflavin glucoside are obtained as shown in FIG. It was.
Further, by using Jasco RI-2030 (trade name of JASCO Corporation) as a differential refraction detector, maltose and glucose were confirmed in the vicinity of a retention time of 1.6 minutes under the same conditions.
In the above examples, riboflavin glucoside was described as an example of the riboflavin glycoside to be purified. However, the present invention is not limited to this, and other simple substances such as riboflavin galactoside (Riboflavinylgalactoside) are used. Various riboflavin glycosides bound with disaccharides and polysaccharides such as those bound with saccharides, riboflavin maltoside, Riboflavinyl melibioside, and the like can also be applied.
１０１ 水
１０２ 糖類
１０３ エタノール
１０４ リボフラビングルコシド（精製物）
１０５ 無水エタノール
105 absolute ethanol
Claims (16)
粗精製物を、リボフラビンおよびリボフラビン配糖体を吸着する性質の充填剤を詰めた充填剤保持体に入れ、該カラムに糖類を溶出する溶媒を流して粗精製物から糖類を分離し、
次いで、充填剤保持体にリボフラビンおよびリボフラビン配糖体を溶出する性質の溶媒を流してリボフラビンおよびリボフラビン配糖体を充填剤保持体から流下させ、
リボフラビンおよびリボフラビン配糖体が入った溶液を濃縮乾固し、
乾燥物を、リボフラビンは溶解し、リボフラビン配糖体は難溶の溶媒に溶かしリボフラビン配糖体を再結晶させてリボフラビン配糖体を分離することを特徴とするリボフラビン配糖体の精製方法。 In a method for purifying riboflavin glycosides, the riboflavin glycoside is purified from a crude product of riboflavin glycosides synthesized from riboflavin and saccharides using an enzyme derived from a living organism.
The crude product is put into a packing material holder packed with a packing material having the property of adsorbing riboflavin and riboflavin glycoside, and the saccharide is separated from the crude product by flowing a solvent for eluting the saccharide to the column.
Next, a solvent having a property of eluting riboflavin and riboflavin glycosides is caused to flow through the filler holder to cause riboflavin and riboflavin glycosides to flow down from the filler holder,
Concentrate the solution containing riboflavin and riboflavin glycosides to dryness,
A method for purifying a riboflavin glycoside, wherein the dried product is dissolved in riboflavin, the riboflavin glycoside is dissolved in a hardly soluble solvent, and the riboflavin glycoside is separated by recrystallization.
液体クロマトグラフィーにＯＤＳカラムを用い、溶離液としてアルコールを用いたことを特徴とするリボフラビン配糖体の分析方法。 Analyze the components contained in crude riboflavin glycosides synthesized from riboflavin and saccharides (disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, except monosaccharides) using biologically derived enzymes by liquid chromatography. A method for analyzing riboflavin glycosides,
A method for analyzing a riboflavin glycoside, wherein an ODS column is used for liquid chromatography and alcohol is used as an eluent.
The method for analyzing a riboflavin glycoside according to claim 9, wherein the detection of the fractionated component of the riboflavin glycoside is performed by an ultraviolet detector, and the detection of the fractionated component of the saccharide is performed by a differential liquid refractive index detector.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005114973A JP2006288303A (en) | 2005-04-12 | 2005-04-12 | Method for purification of riboflavin glycoside and method for analysis thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005114973A JP2006288303A (en) | 2005-04-12 | 2005-04-12 | Method for purification of riboflavin glycoside and method for analysis thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006288303A true JP2006288303A (en) | 2006-10-26 |
Family
ID=37409600
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005114973A Pending JP2006288303A (en) | 2005-04-12 | 2005-04-12 | Method for purification of riboflavin glycoside and method for analysis thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2006288303A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101936901A (en) * | 2009-06-30 | 2011-01-05 | 怀亚特技术公司 | The characterizing method of macromolecular reversible association in the solution of high concentration |
| CN101441202B (en) * | 2008-12-29 | 2011-08-10 | 河南工业大学 | Method for detecting fungal polysaccharide |
-
2005
- 2005-04-12 JP JP2005114973A patent/JP2006288303A/en active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101441202B (en) * | 2008-12-29 | 2011-08-10 | 河南工业大学 | Method for detecting fungal polysaccharide |
| CN101936901A (en) * | 2009-06-30 | 2011-01-05 | 怀亚特技术公司 | The characterizing method of macromolecular reversible association in the solution of high concentration |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5709797A (en) | Method of isolating cyclosporins | |
| JP5603505B2 (en) | New compounds in Manuka honey and their use | |
| JPS6361056B2 (en) | ||
| KR20110028295A (en) | Method for preparation of sugar chain sample, sugar chain sample, and method for analysis of sugar chain | |
| US8173837B1 (en) | Process for the production of L-citrulline from watermelon flesh and rind | |
| CN109053720B (en) | Alkaloid compound and preparation method and application thereof | |
| JP2009142238A (en) | Method for isolating and detecting cell surface sugar chain | |
| JP2006288303A (en) | Method for purification of riboflavin glycoside and method for analysis thereof | |
| CN102443031B (en) | Separation and purification method of c-di-GMP (cyclic diguanylate) | |
| US20080146789A1 (en) | Methods for the separation of biological molecules using dioxolane | |
| Chaga et al. | Isolation and characterization of catalase from Penicillium chrysogenum | |
| TWI406860B (en) | Purification of mupirocin | |
| CN1321123C (en) | High purity yolk cephalin preparation method | |
| CN111239314A (en) | Separation and analysis method of chitin oligosaccharide | |
| CN104428308B (en) | The separation method of ring-type macrolides compound | |
| JP6332600B2 (en) | Method for producing polyamine conjugate | |
| CN104447950A (en) | Romidepsin separation and purification method | |
| NO320104B1 (en) | Process for the preparation of baccatin in the presence of an enzyme and an acetyl donor, the enzyme, a process for its preparation and a process for the preparation of taxol and / or taxol derivatives. | |
| CN114660187A (en) | Preparation method of beta-nicotinamide mononucleotide | |
| JP2009089689A (en) | Method for producing ferulic acid ester compound by enzymatic method | |
| JPS62246575A (en) | Method for purifying pyrroloquinolinequinone | |
| JP5322602B2 (en) | Method for producing anti-ice nuclear activator | |
| JP3560626B2 (en) | Recovery of useful substances | |
| SU1478112A1 (en) | Method of obtaining sorbent for separation of biological fluids by liquid chromatography | |
| JP2006308508A (en) | Simple method for purifying cylindrospermopsin |