JP2006284395A - Nucleic acid microarray and its manufacturing method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、核酸マイクロアレイおよびその製造方法に関する。詳しくは、プラスチック基材に固定化された核酸マイクロアレイおよびその製造方法に関する。 The present invention relates to a nucleic acid microarray and a method for producing the same. Specifically, the present invention relates to a nucleic acid microarray immobilized on a plastic substrate and a method for producing the same.
ゲノム解析プロジェクトの進展により、種々の生物ゲノムの全塩基配列が解読され、これらの塩基配列情報をもとにして、遺伝子の発現パターンや遺伝子産物の機能を全ゲノムレベルで調べるための新たなプロジェクトが進められている。ＤＮＡチップは、これらの機能解析プロジェクトを飛躍的に進展させるための手段として開発され、ヒト、マウス、酵母等の全遺伝子のジェノタイピングや遺伝子の発現解析にＤＮＡチップ技術が用いられている。 With the progress of the genome analysis project, the entire nucleotide sequences of various organism genomes have been decoded, and a new project to investigate gene expression patterns and gene product functions at the genome level based on these nucleotide sequence information Is underway. The DNA chip has been developed as a means for making significant progress in these functional analysis projects, and the DNA chip technology is used for genotyping of all genes such as humans, mice, and yeast, and gene expression analysis.
現在用いられているＤＮＡチップ（あるいはＤＮＡマイクロアレイ）を作製する方法は、大別してAffymetrix社方式とスタンフォード方式とがある。前者の方法によるＤＮＡチップは、フォトリソグラフィーと光照射化学合成を組み合わせてガラス基板上で２０〜２５マー程度のオリゴヌクレオチドを高密度に合成することにより作製される（特許文献１〜３を参照）。後者の方法によるＤＮＡチップは、典型的には、あらかじめ調製されたＤＮＡ断片をスライドガラス上に高密度にスポットすることにより作製される（特許文献４、５を参照）。 Currently used methods for producing DNA chips (or DNA microarrays) are roughly classified into Affymetrix and Stanford methods. A DNA chip by the former method is produced by combining photolithography and light irradiation chemical synthesis to synthesize oligonucleotides of about 20 to 25 mer on a glass substrate at high density (see Patent Documents 1 to 3). . A DNA chip by the latter method is typically produced by spotting a DNA fragment prepared in advance on a slide glass at a high density (see Patent Documents 4 and 5).
一方、ガラス基板の代わりに、種々のプラスチック樹脂を用いたバイオチップも検討されている（特許文献６を参照）が、未処理の樹脂はＤＮＡとの結合性が低く、樹脂の基材の表面を修飾する方法がなされる。例えば、特許文献６には、基材の表面修飾方法として、アルデヒド基を導入する方法が開示されており、アルデヒド基との反応性を高めるためにはＤＮＡにアミノ基を導入する必要があることが記載されている。 On the other hand, biochips using various plastic resins instead of glass substrates have been studied (see Patent Document 6), but untreated resins have low DNA binding properties, and the surface of the resin base material. A method of modifying is made. For example, Patent Document 6 discloses a method for introducing an aldehyde group as a surface modification method for a substrate, and it is necessary to introduce an amino group into DNA in order to increase the reactivity with the aldehyde group. Is described.
しかしながら、上記のＤＮＡチップは、ガラス基板のチップでは作製が大掛かりでコストが高い。樹脂製のチップはコストの面で有利であるが、ＤＮＡの基材への固定がガラス基板のチップよりも劣り、固定の強固さと解析力の向上が未解決であった。
今後、医療現場においては、費用が安価で、いわゆるベッドサイドでも検出・解析が可能なテーラーメイド医療に適するＤＮＡチップ（マイクロアレイ）が求められている。本発明は、かかるＤＮＡマイクロアレイおよびその製造方法などを提供することを目的とする。
However, the above-described DNA chip is large in production and expensive in the case of a glass substrate chip. Although the resin chip is advantageous in terms of cost, the fixation of DNA to the base material is inferior to the chip of the glass substrate, and the immobilization of the fixation and the improvement of analysis power have not been solved.
In the future, in the medical field, there is a need for a DNA chip (microarray) suitable for tailor-made medicine that is inexpensive and can be detected and analyzed even at the so-called bedside. It is an object of the present invention to provide such a DNA microarray and a method for producing the same.
本発明者らは、疎水性のプラスチック表面に親水性のＤＮＡを固定させるべく鋭意検討した結果、特定の表面処理と固定方法を組み合わせることにより上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to immobilize hydrophilic DNA on a hydrophobic plastic surface, the present inventors have found that the above object can be achieved by combining a specific surface treatment with an immobilization method, and complete the present invention. It came.
即ち、本発明は下記の通りである。
（１） イオン化ガスとして不活性ガスを用いてイオンビーム処理された、または不活性ガス雰囲気下でプラズマ処理されたプラスチック基材上に核酸をＵＶ照射により固定化してなる核酸マイクロアレイ。
（２） 前記プラスチックがポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリエチレンおよびポリメチルペンテンからなる群より選ばれたものである前記（１）に記載の核酸マイクロアレイ。
（３） 前記プラスチック基材の表面粗さＲａ（ＪＩＳ Ｂ ０６０１−１９９４）が０．０６〜０．５μｍである前記（１）または（２）に記載の核酸マイクロアレイ。
（４） 前記核酸が５０塩基以上の長さを有するものである前記（１）〜（３）いずれかに記載の核酸マイクロアレイ。
（５） 前記不活性ガスが窒素ガスである前記（１）〜（４）いずれかに記載の核酸マイクロアレイ。
（６） プラスチック基材を、イオン化ガスとして不活性ガスを用いてイオンビーム処理または不活性ガス雰囲気下でプラズマ処理する工程、および
処理後のプラスチック基材上に核酸をＵＶ照射により固定する工程
を含む核酸マイクロアレイの製造方法。
（７） 前記プラスチックがポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリエチレンおよびポリメチルペンテンからなる群より選ばれたものである前記（６）に記載の製造方法。
（８） 前記不活性ガスが窒素ガスである前記（６）または（７）に記載の製造方法。
（９） 前記処理工程後のプラスチック基材と水との接触角θが６０°以下である前記（６）〜（８）いずれかに記載の製造方法。
（１０） 前記核酸が５０塩基以上の長さを有するものである前記（６）〜（９）いずれかに記載の製造方法。
（１１） 前記（１）〜（５）いずれかに記載の核酸マイクロアレイまたは前記（６）〜（１０）いずれかに記載の製造方法により得られる核酸マイクロアレイと分析対象の核酸を含む試料とを接触させる工程、および
前記接触工程により形成された核酸ハイブリッドを検出する工程
を含む、特定の塩基配列を有する核酸の検出方法。
（１２） 前記核酸ハイブリッドが標識されている前記（１１）に記載の検出方法。
（１３） 前記標識がアルカリホスファターゼである前記（１２）に記載の検出方法。
That is, the present invention is as follows.
(1) A nucleic acid microarray obtained by immobilizing nucleic acids by UV irradiation on a plastic substrate that has been ion beam processed using an inert gas as an ionized gas or plasma-treated in an inert gas atmosphere.
(2) The nucleic acid microarray according to (1), wherein the plastic is selected from the group consisting of polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate, polypropylene, polyethylene terephthalate, polystyrene, polyethylene, and polymethylpentene.
(3) The nucleic acid microarray according to (1) or (2), wherein the plastic substrate has a surface roughness Ra (JIS B 0601-1994) of 0.06 to 0.5 μm.
(4) The nucleic acid microarray according to any one of (1) to (3), wherein the nucleic acid has a length of 50 bases or more.
(5) The nucleic acid microarray according to any one of (1) to (4), wherein the inert gas is nitrogen gas.
(6) A step of plasma-treating a plastic substrate using an inert gas as an ionizing gas in an ion beam treatment or an inert gas atmosphere, and a step of fixing nucleic acid on the treated plastic substrate by UV irradiation A method for producing a nucleic acid microarray.
(7) The production method according to (6), wherein the plastic is selected from the group consisting of polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate, polypropylene, polyethylene terephthalate, polystyrene, polyethylene, and polymethylpentene.
(8) The manufacturing method according to (6) or (7), wherein the inert gas is nitrogen gas.
(9) The manufacturing method according to any one of (6) to (8), wherein a contact angle θ between the plastic substrate after the treatment step and water is 60 ° or less.
(10) The production method according to any one of (6) to (9), wherein the nucleic acid has a length of 50 bases or more.
(11) Contact the nucleic acid microarray according to any one of (1) to (5) or the nucleic acid microarray obtained by the production method according to any one of (6) to (10) and a sample containing the nucleic acid to be analyzed And a method for detecting a nucleic acid having a specific base sequence, comprising a step of detecting the nucleic acid hybrid formed by the contacting step.
(12) The detection method according to (11), wherein the nucleic acid hybrid is labeled.
(13) The detection method according to (12), wherein the label is alkaline phosphatase.
本発明の核酸マイクロアレイによると、取り扱いの容易なプラスチック基材上に強固かつハイブリダイズに適するように核酸が固定化されているため、ＤＮＡの発現解析やジェノタイピング等の検査が低費用で高感度に行うことができる。本発明のマイクロアレイの製造方法によると、前記核酸マイクロアレイを安価で効率良く製造することができる。本発明の核酸の検出方法によると、本発明の核酸マイクロアレイを用いることにより、従来に比べて、ＤＮＡの発現解析やジェノタイピング等の検査を低費用で高感度に行うことができる。また、本発明の核酸の検出方法によると、特定の標識を核酸ハイブリッドに導入することにより、大掛かりな検出装置を使用せずにいわゆるベッドサイドで核酸の検出および判定が可能となる。 According to the nucleic acid microarray of the present invention, the nucleic acid is immobilized on a plastic substrate that is easy to handle so that it is strong and suitable for hybridization, so that DNA expression analysis, genotyping, and other tests are inexpensive and highly sensitive. Can be done. According to the method for producing a microarray of the present invention, the nucleic acid microarray can be produced inexpensively and efficiently. According to the nucleic acid detection method of the present invention, by using the nucleic acid microarray of the present invention, DNA expression analysis, genotyping, and other tests can be performed at low cost and with high sensitivity. In addition, according to the nucleic acid detection method of the present invention, by introducing a specific label into the nucleic acid hybrid, nucleic acid can be detected and determined at the so-called bedside without using a large-scale detection apparatus.
本発明は、イオン化ガスとして不活性ガスを用いてイオンビーム処理された、または不活性ガス雰囲気下でプラズマ処理されたプラスチック基材上に核酸をＵＶ照射により固定化してなる核酸マイクロアレイを提供する。 The present invention provides a nucleic acid microarray obtained by immobilizing nucleic acids by UV irradiation on a plastic substrate that has been ion beam processed using an inert gas as an ionizing gas, or plasma processed in an inert gas atmosphere.
本発明において、核酸マイクロアレイとは、プラスチック基材上に核酸（プローブともいう）が搭載されているものをいう。 In the present invention, the nucleic acid microarray refers to a nucleic acid (also referred to as a probe) mounted on a plastic substrate.
本発明における核酸（プローブともいう）とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはそれらの誘導体をいう。前記核酸（プローブ）は、天然由来であっても人工的に合成されたものであっても、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。また、前記ＤＮＡは、天然もしくは合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ等、特に限定されるものではない。前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡまたはｒＲＮＡ等、特に限定されるものではない。前記ＰＮＡは、ペプチド骨格に核酸塩基をもつ分子をいう。前記誘導体とは、前記ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡを本発明の目的の範囲内で適宜修飾したものをいう。 The nucleic acid (also referred to as a probe) in the present invention refers to DNA, RNA, PNA or a derivative thereof. The nucleic acid (probe) may be naturally derived, artificially synthesized, single-stranded or double-stranded. The DNA is not particularly limited, such as natural or synthetic DNA, cDNA reverse transcribed from mRNA, and the like. The RNA is not particularly limited, such as mRNA, cRNA or rRNA. The PNA refers to a molecule having a nucleobase in the peptide backbone. The derivative means a product obtained by appropriately modifying the DNA, RNA, or PNA within the scope of the object of the present invention.
上記ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡの中では、製造コスト、種々の酵素が使用できる点および用途範囲が広い面で、一本鎖のＤＮＡが好ましいが、これに限定されるものではない。前記用途範囲とは、例えば、患者個人の薬剤感受性の予測、病原菌のもしくは耐性の判定ならびに個人の体質の判定などがあげられ、一般的にはテーラーメード医療と呼ばれる分野での用途を指すが、これに限定されるものではない。
ここで、本発明の核酸マイクロアレイは、核酸（プローブ）が一本鎖のＤＮＡである場合、一般にＤＮＡチップとも呼ばれる。
Among the DNA, RNA, and PNA, single-stranded DNA is preferable in terms of production cost, the point that various enzymes can be used, and a wide range of applications, but is not limited thereto. Examples of the range of use include prediction of drug susceptibility of individual patients, determination of pathogenic bacteria or resistance, and determination of individual constitution, and generally refers to use in a field called tailor-made medicine. It is not limited to.
Here, the nucleic acid microarray of the present invention is generally called a DNA chip when the nucleic acid (probe) is a single-stranded DNA.
本発明の核酸マイクロアレイの基材に使用されるプラスチックとは、水との接触角θが約６５°以上の疎水性プラスチックをいう。具体的には、汎用の疎水性プラスチックが限定なく使用可能であり、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリエチレンおよびポリメチルペンテンなどが好適な例としてあげられる。安価で取り扱いの容易さから、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネートおよびポリプロピレンがより好ましいが、これに限定されるものではない。 The plastic used for the base material of the nucleic acid microarray of the present invention refers to a hydrophobic plastic having a contact angle θ with water of about 65 ° or more. Specifically, general-purpose hydrophobic plastics can be used without limitation, and suitable examples include polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate, polypropylene, polyethylene terephthalate, polystyrene, polyethylene, and polymethylpentene. Polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate, and polypropylene are more preferable because of low cost and ease of handling, but are not limited thereto.
前記プラスチック基材の形状としては、例えば、基板、容器、フィルムおよびチューブなどがあげられる。中でも取り扱いの容易性などを考慮すれば、基板が好ましいが、これに限定されるものではない。 Examples of the shape of the plastic substrate include a substrate, a container, a film, and a tube. Of these, a substrate is preferable in consideration of ease of handling, but is not limited thereto.
前記基材の大きさは、マイクロアレイの使用目的に応じて適宜決定することができ、特に限定されるものではない。例えば、基板の場合、ベッドサイドでの取り扱いの容易性の観点から、約１〜１００００ｍｍ２、好ましくは約１０〜１０００ｍｍ２である。 The size of the substrate can be appropriately determined according to the purpose of use of the microarray, and is not particularly limited. For example, in the case of a substrate, from the viewpoint of ease of handling at the bedside, the thickness is about 1 to 10,000 mm 2 , preferably about 10 to 1000 mm 2 .
本発明において、前記基材は、イオン化ガスとして不活性ガスを用いてイオンビーム処理されるか、または不活性ガス雰囲気下でプラズマ処理される。前記不活性ガスは、固定する核酸がＤＮＡまたはＲＮＡの場合、後記本発明の製造方法に記載されるように、窒素ガスが好ましい。イオンビーム処理およびプラズマ処理の方法は、後記本発明の製造方法において説明する。 In the present invention, the substrate is subjected to ion beam treatment using an inert gas as an ionization gas or plasma treatment in an inert gas atmosphere. When the nucleic acid to be immobilized is DNA or RNA, the inert gas is preferably nitrogen gas as described in the production method of the present invention described later. The ion beam treatment and plasma treatment methods will be described later in the production method of the present invention.
本発明のマイクロアレイにおけるプラスチック基材の表面粗さＲａ（ＪＩＳ Ｂ ０６０１−１９９４）は、核酸の固定をより強固にするという観点から、０．０６〜０．５μｍが好ましく、０．０８〜０．４５μｍがより好ましい。前記表面粗さＲａは、レーザ顕微鏡により測定した値である。表面粗さを前記所定の範囲内に調整するためには、後述するイオンビーム処理またはプラズマ処理の条件を適宜調整すればよい。 The surface roughness Ra (JIS B 0601-1994) of the plastic substrate in the microarray of the present invention is preferably 0.06 to 0.5 μm, more preferably 0.08 to 0. 0. More preferably, it is 45 μm. The surface roughness Ra is a value measured with a laser microscope. In order to adjust the surface roughness within the predetermined range, conditions for ion beam processing or plasma processing described later may be appropriately adjusted.
また、前記プラスチックは、自体公知の方法により製造することができる。例えば、ラジカル重合、カチオン重合およびアニオン重合などがあげられ、製造コストの観点からラジカル重合が好ましい。また、数平均分子量は、成形の容易性の観点から、約１，０００〜１，０００，０００、好ましくは約２，０００〜５００，０００、さらに好ましくは約５，０００〜３００，０００であるが、これに限定されるものではない。また、前記プラスチック基材の成形方法は、自体公知の方法により行うことができる。例えば、基板の場合、押出成形または圧縮成形等があげられ、成形容易性の観点から押出成形が好ましい。 The plastic can be produced by a method known per se. For example, radical polymerization, cationic polymerization, anionic polymerization and the like can be mentioned, and radical polymerization is preferable from the viewpoint of production cost. The number average molecular weight is about 1,000 to 1,000,000, preferably about 2,000 to 500,000, more preferably about 5,000 to 300,000, from the viewpoint of ease of molding. However, the present invention is not limited to this. The plastic substrate can be molded by a method known per se. For example, in the case of a substrate, extrusion molding or compression molding can be mentioned, and extrusion molding is preferred from the viewpoint of ease of molding.
本発明の核酸マイクロアレイに搭載される核酸（プローブ）の種類は、用途目的に応じて適宜設定することができる。例えば、患者個人の薬剤感受性の予測に用いる場合は、一般に一塩基多型（ＳＮＰ：Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を検出することから、検出すべき各多型部位における多型の数の総和である。さらに詳しく説明すると、特開２０００−３５０６００号公報で開示されている骨粗鬆症治療薬剤の感受性を予測する場合には、ＶＤＲ遺伝子のイントロン８上のＢｓｍＩ制限酵素断片長多型と、ＡｐｏＥ遺伝子のＨｈａＩ制限酵素断片長多型およびＥＲ遺伝子のイントロン１上のＸｂａＩ制限酵素断片長多型を検出する。前記ＶＤＲ遺伝子のイントロン８上のＢｓｍＩ制限酵素断片長多型は２種類、前記ＡｐｏＥ遺伝子のＨｈａＩ制限酵素断片長多型は３種類、前記ＥＲ遺伝子のイントロン１上のＸｂａＩ制限酵素断片長多型は２種類であるため、その総和は７となる。したがって、核酸マイクロアレイに搭載される核酸（プローブ）の種類は、７種類と設定することができる。さらに、対照として任意の塩基配列を有する核酸も搭載してもよい。以上に具体例を示して説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。 The type of nucleic acid (probe) mounted on the nucleic acid microarray of the present invention can be appropriately set according to the purpose of use. For example, when used for predicting the drug sensitivity of an individual patient, since a single nucleotide polymorphism (SNP) is generally detected, it is the sum of the number of polymorphisms at each polymorphic site to be detected. More specifically, when predicting the susceptibility of the osteoporosis therapeutic agent disclosed in JP 2000-350600 A, the BsmI restriction fragment length polymorphism on intron 8 of the VDR gene and the HhaI restriction of the ApoE gene The enzyme fragment length polymorphism and the XbaI restriction fragment length polymorphism on intron 1 of the ER gene are detected. There are two types of BsmI restriction fragment length polymorphism on intron 8 of the VDR gene, three types of HhaI restriction fragment length polymorphism of the ApoE gene, and XbaI restriction fragment length polymorphism on intron 1 of the ER gene is Since there are two types, the sum is 7. Therefore, the types of nucleic acids (probes) mounted on the nucleic acid microarray can be set to seven types. Furthermore, a nucleic acid having an arbitrary base sequence may be mounted as a control. Although a specific example has been described above, the present invention is not limited to this.
本発明における核酸（プローブ）の長さは、ＵＶ照射によりプラスチック基材への固定が容易である上で、測定対象の核酸とハイブリダイズすることができるものであれば、少なくとも５０塩基であればよい。中でも、非特異吸着の頻度の観点から、５０〜５００塩基、好ましくは約２００〜４００塩基である。 The length of the nucleic acid (probe) in the present invention is at least 50 bases as long as it can be easily immobilized on a plastic substrate by UV irradiation and can hybridize with the nucleic acid to be measured. Good. Among these, from the viewpoint of the frequency of nonspecific adsorption, it is 50 to 500 bases, preferably about 200 to 400 bases.
固定化される核酸は、天然由来の核酸の場合、公知の方法により単離、精製し、必要に応じて酵素等で所定の長さに切断することにより調製したものを用いることができる。合成核酸の場合、核酸の種類に応じて公知の合成方法により調製したものを用いることができる。ＤＮＡの場合、逆転写反応やポリメラーゼ連鎖反応等により調製したものを好適に使用することができる。 In the case of a nucleic acid to be immobilized, in the case of a nucleic acid derived from nature, a nucleic acid prepared by isolation and purification by a known method and cleaving to a predetermined length with an enzyme or the like can be used as necessary. In the case of a synthetic nucleic acid, a nucleic acid prepared by a known synthesis method can be used depending on the type of nucleic acid. In the case of DNA, those prepared by reverse transcription reaction, polymerase chain reaction, etc. can be suitably used.
しかしながら、検出に必要な塩基配列の長さは、約１０〜３０塩基程度であることが一般的である。このような場合、上記のようにして調製した核酸配列の末端に、検出に影響しないような配列を付加することにより、上記の５０塩基以上の長さを達成することができる。例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ、ポリｄＣおよびポリｄＧからなる群より選ばれるオリゴマーを付加することがあげられ、吸着強度および非特異吸着の頻度の観点から、ポリｄＴオリゴマーを付加することが好ましい。前記ポリｄＴオリゴマーの付加は、ターミナルトランスフェラーゼなどにより付加することが可能であるが、これに限定されるものではない。 However, the length of the base sequence necessary for detection is generally about 10 to 30 bases. In such a case, the above length of 50 bases or more can be achieved by adding a sequence that does not affect the detection to the end of the nucleic acid sequence prepared as described above. For example, an oligomer selected from the group consisting of poly dT, poly dA, poly dC and poly dG can be added, and it is preferable to add a poly dT oligomer from the viewpoint of adsorption strength and nonspecific adsorption frequency. The poly dT oligomer can be added by terminal transferase or the like, but is not limited thereto.
本発明の核酸マイクロアレイは、前記プラスチック基材上に前記核酸をＵＶ照射により固定化してなるものであり、固定化方法は、後記本発明の製造方法において説明する。 The nucleic acid microarray of the present invention is formed by immobilizing the nucleic acid on the plastic substrate by UV irradiation, and the immobilization method will be described later in the production method of the present invention.
本発明の核酸マイクロアレイの製造方法は、プラスチック基材を、イオン化ガスとして不活性ガスを用いてイオンビーム処理または不活性ガス雰囲気下でプラズマ処理する工程、および
処理後のプラスチック基材上に核酸をＵＶ照射により固定する工程
を含むことを特徴とする。
The method for producing a nucleic acid microarray of the present invention comprises a step of subjecting a plastic substrate to an ion beam treatment using an inert gas as an ionizing gas or a plasma treatment in an inert gas atmosphere, and a nucleic acid to the treated plastic substrate. A step of fixing by UV irradiation is included.
前記イオンビーム処理とは、不活性ガスをイオン化し、電圧をかけて高速加速して得られるイオンビームをプラスチック基材表面に照射し、衝突させることによって発生したエネルギーにより、イオン注入、膜形成、エッチングおよび濡れ性の向上の効果を付与する表面処理方法をいう。 The ion beam treatment refers to ion implantation, film formation, and energy generated by ionizing an inert gas and irradiating and colliding an ion beam obtained by high-speed acceleration by applying a voltage to the surface of the plastic substrate. A surface treatment method that imparts an effect of improving etching and wettability.
前記イオンビーム処理における不活性ガスとしては、イオンビーム処理後の核酸固定の効率を高める観点から窒素ガスおよびアルゴンガスが好ましい。リン酸骨格を有する（ポリアニオンである）ＤＮＡまたはＲＮＡを用いる場合は、前記プラスチック基材表面の濡れ性の向上および当該表面のイオンチャージによって、より強固に固定することができる点で、窒素ガスがより好ましい。 As the inert gas in the ion beam treatment, nitrogen gas and argon gas are preferable from the viewpoint of increasing the efficiency of nucleic acid fixation after the ion beam treatment. When DNA or RNA having a phosphate skeleton (which is a polyanion) is used, nitrogen gas can be more firmly fixed by improving the wettability of the plastic substrate surface and ion charging of the surface. More preferred.
イオンビーム処理の方法は、特に限定されるものではないが、例えば、減圧下で、磁場中の電子のサイクロトロン共鳴（Electron Cyclotron Resonance:ECR） を利用したＥＣＲイオン銃を搭載した装置から得られたイオンビームを、約３００〜７００Ｖの加速エネルギーで、約１×１０２０ｉｏｎ／ｃｍ２のドーズ量で照射する方法があげられる。使用する装置としては、例えば、エリオニクス製の小型ＥＣＲイオンシャーワ装置（ＥＩＳ−２００ＥＲ）等があげられるが、これに限定されるものではない。かかる処理の回数は、所望の濡れ性および表面粗さを得る限りにおいては特に限定されないが、濡れ性の劣化を抑制できる観点から、１回あたり０．２５〜２．０×１０２０ｉｏｎ／ｃｍ２のドーズ量を、少なくとも５回以上、好ましくは１０回以上照射することが好ましいが、これに限定されるものではない。 The ion beam processing method is not particularly limited. For example, the ion beam processing method was obtained from an apparatus equipped with an ECR ion gun using electron cyclotron resonance (ECR) under a reduced pressure. There is a method of irradiating an ion beam with an acceleration energy of about 300 to 700 V at a dose of about 1 × 10 20 ions / cm 2 . Examples of the apparatus to be used include, but are not limited to, a small ECR ion shower apparatus (EIS-200ER) manufactured by Elionix. The number of such treatments is not particularly limited as long as desired wettability and surface roughness are obtained, but from the viewpoint of suppressing deterioration of wettability, 0.25 to 2.0 × 10 20 ions / cm per time. The dose of 2 is preferably irradiated at least 5 times or more, preferably 10 times or more, but is not limited thereto.
前記プラズマ処理とは、不活性ガス雰囲気下で放電することにより、前記不活性ガスの電離作用によって生じるプラズマを固体表面に照射し、この表面をエッチング、濡れ性の向上および官能基の導入などの効果を付与する処理をいう。上記放電としては、コロナ放電（高圧低温プラズマ）、アーク放電（高圧高温プラズマ）およびグロー放電（低圧低温プラズマ）などが挙げられ、中でも表面処理の反応性の観点から、コロナ放電が好ましいが、これに限定されるものではない。 The plasma treatment is performed by irradiating the solid surface with plasma generated by the ionizing action of the inert gas by discharging in an inert gas atmosphere, etching the surface, improving wettability, and introducing functional groups. It refers to a process that provides an effect. Examples of the discharge include corona discharge (high pressure and low temperature plasma), arc discharge (high pressure and high temperature plasma), glow discharge (low pressure and low temperature plasma), and among these, corona discharge is preferable from the viewpoint of surface treatment reactivity. It is not limited to.
前記プラズマ処理における不活性ガスとしては、窒素ガス、アルゴンガス、酸素ガス、ヘリウムガス、ネオンガスおよびキセノンガス等があげられるが、プラズマ処理後の核酸固定の効率を高める観点から窒素ガスおよびアルゴンガスが好ましい。リン酸骨格を有する（ポリアニオンである）ＤＮＡまたはＲＮＡを用いる場合は、前記プラスチック基材の表面にアミン基および／またはアミノ基を発生させ、当該表面の濡れ性の向上および当該表面のイオンチャージによって、より強固に固定することができる点で、窒素ガスがより好ましい。 Examples of the inert gas in the plasma treatment include nitrogen gas, argon gas, oxygen gas, helium gas, neon gas, and xenon gas. From the viewpoint of increasing the efficiency of nucleic acid fixation after the plasma treatment, nitrogen gas and argon gas are used. preferable. When DNA or RNA having a phosphate skeleton (which is a polyanion) is used, an amine group and / or an amino group is generated on the surface of the plastic substrate, thereby improving wettability of the surface and ion charging of the surface. Nitrogen gas is more preferable because it can be more firmly fixed.
前記プラズマ処理の方法は、特に限定されるものではないが、例えば、コロナ放電を用いる場合、前記基材を密閉容器に入れ、約２５〜５０℃の窒素ガス雰囲気（約１０〜２０Ｐａ）下で、出力約１００〜５００Ｗで放電し、約１００〜１０００秒処理する方法などがあげられる。使用する装置としては、例えば、ヤマト科学社製の小型高性能プラズマ表面処理装置（ＰＤＣ２００シリーズ）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。かかる処理の回数は、所望の濡れ性および表面粗さを得る限りにおいては特に限定されないが、通常１〜１０回程度である。 The method of the plasma treatment is not particularly limited. For example, when corona discharge is used, the base material is put in a sealed container, and a nitrogen gas atmosphere (about 10 to 20 Pa) at about 25 to 50 ° C. And a method of discharging at an output of about 100 to 500 W and treating for about 100 to 1000 seconds. Examples of the apparatus used include, but are not limited to, a small high-performance plasma surface treatment apparatus (PDC200 series) manufactured by Yamato Scientific. The number of such treatments is not particularly limited as long as desired wettability and surface roughness are obtained, but is usually about 1 to 10 times.
前記イオンビーム処理またはプラズマ処理することにより、プラスチック基材の表面の濡れ性が上昇する。前記濡れ性は、プラスチック基材と水との接触角θを測定することにより決定することができる。処理後の水の接触角θは、核酸の固定強度の観点から、６０°以下、好ましくは４０°以下、特に好ましくは２０°以下である。なお、処理前の基材の表面の水の接触角θは、例えば、ポリメチルメタクリレートでは、約８０°、ポリカーボネートでは約７６°程度である。接触角θは、０．２５μＬの蒸留水を滴下し、光学顕微鏡で測定した値である。 By performing the ion beam treatment or plasma treatment, the wettability of the surface of the plastic substrate is increased. The wettability can be determined by measuring the contact angle θ between the plastic substrate and water. The contact angle θ of water after the treatment is 60 ° or less, preferably 40 ° or less, particularly preferably 20 ° or less, from the viewpoint of nucleic acid fixation strength. The contact angle θ of water on the surface of the base material before treatment is, for example, about 80 ° for polymethyl methacrylate and about 76 ° for polycarbonate. The contact angle θ is a value measured with an optical microscope by dropping 0.25 μL of distilled water.
処理工程終了後、核酸を基材の表面に固定させる。核酸の固定は、前記核酸の溶液を調製し、前記イオンビーム処理またはプラズマ処理後のプラスチック基材に、当該溶液をスポッティングし、ＵＶ照射することにより行う。前記溶液は、リン酸緩衝液などの水系の溶媒を用いることが一般的である。また、スポッティング方法は特に限定されるものではないが、例えば、ディスペンサー（武蔵エンジニアリング社製のＳＭＰ−３など）を用いて行う方法があげられる。本発明においては、イオンビーム処理またはプラズマ処理により、
１）プラスチック基材表面を荒くすることで、表面積を増加させることにより、核酸の固定に適した表面形状の作製が達成されること、および
２）プラスチック基材表面の親水性を上げることで、前記プラスチック基材の前記溶液に対する濡れ性が向上すること
の両条件により、前記核酸を容易に固定することができる。すなわち、ＵＶ照射によりプラスチック基材への核酸の固定を行う場合、核酸固定時の表面の形状および表面の親水度が重要なファクターとなり、片方の条件のみ達成したのでは核酸の強固な固定は達成されない。プラズマ処理またはイオンビーム処理は、この２条件を達成するのに適した方法である。
After the treatment step, the nucleic acid is immobilized on the surface of the substrate. The nucleic acid is immobilized by preparing a solution of the nucleic acid, spotting the solution on the plastic substrate after the ion beam treatment or plasma treatment, and irradiating with UV. The solution generally uses an aqueous solvent such as a phosphate buffer. The spotting method is not particularly limited, and examples thereof include a method of using a dispenser (such as SMP-3 manufactured by Musashi Engineering). In the present invention, by ion beam treatment or plasma treatment,
1) By making the surface of the plastic substrate rough, by increasing the surface area, it is possible to produce a surface shape suitable for immobilization of nucleic acids, and 2) by increasing the hydrophilicity of the surface of the plastic substrate, The nucleic acid can be easily fixed under both conditions that the wettability of the plastic substrate to the solution is improved. In other words, when nucleic acid is immobilized on a plastic substrate by UV irradiation, the shape of the surface and the hydrophilicity of the surface at the time of nucleic acid immobilization are important factors. If only one of the conditions is achieved, strong nucleic acid immobilization is achieved. Not. Plasma treatment or ion beam treatment is a suitable method for achieving these two conditions.
前記ＵＶ照射は、通常約２５０〜３５０ｎｍの波長のＵＶを使用し、約５０００〜８０００μｗ／ｃｍ２で１〜１０分程度照射するが、これに限定されるものではない。 For the UV irradiation, UV having a wavelength of about 250 to 350 nm is usually used, and irradiation is performed at about 5000 to 8000 μw / cm 2 for about 1 to 10 minutes, but is not limited thereto.
核酸（プローブ）の固定終了後、非特異吸着を低下させる観点から、洗浄またはブロッキング処理を行ってもよい。 After completion of the fixation of the nucleic acid (probe), washing or blocking treatment may be performed from the viewpoint of reducing nonspecific adsorption.
このようにして得られた本発明の核酸マイクロアレイは、下記本発明の検出方法に好適に用いられうる。 The nucleic acid microarray of the present invention thus obtained can be suitably used for the following detection method of the present invention.
本発明の特定の塩基配列を有する核酸の検出方法は、
前記核酸マイクロアレイまたは前記製造方法により得られる核酸マイクロアレイと分析対象の核酸を含む試料とを接触させる工程、および
前記接触工程により形成された核酸ハイブリッドを検出する工程
を含むことを特徴とする。
The method for detecting a nucleic acid having a specific base sequence of the present invention comprises:
The method includes a step of bringing the nucleic acid microarray obtained by the nucleic acid microarray or the manufacturing method into contact with a sample containing the nucleic acid to be analyzed, and a step of detecting the nucleic acid hybrid formed by the contacting step.
（１）接触工程
（１−１）分析対象の核酸（標的）の前処理
分析対象の核酸（標的）としては、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料またはＲＮＡ断片試料を用いることができる。前記標的核酸は、遺伝子発現を調べる目的では、生体の細胞や組織サンプルから単離することができる。標的核酸がｍＲＮＡの場合、逆転写反応によりｃＤＮＡとすることが好ましい。前記標的核酸は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域の核酸を増幅させることが好ましいが、これに限定されるものではない。
(1) Contact process (1-1) Pretreatment of nucleic acid (target) to be analyzed As a nucleic acid (target) to be analyzed, a DNA fragment sample or RNA fragment sample whose sequence or function is unknown can be used. . The target nucleic acid can be isolated from a living cell or tissue sample for the purpose of examining gene expression. When the target nucleic acid is mRNA, it is preferably converted to cDNA by reverse transcription reaction. For the purpose of examining gene mutation and polymorphism, the target nucleic acid is preferably amplified by a reaction system containing a labeled primer or labeled dNTP, but is not limited thereto.
標的核酸の増幅方法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、Invader法など特に限定されるものではなく、それぞれの方法に適した試薬および装置を用いて増幅することができる。 A method for amplifying the target nucleic acid is not particularly limited, such as a PCR method, a LAMP method, and an Invader method.
標的核酸の増幅の際に、核酸の検出を容易ならしめるために、標識することが好ましい。標識方法としては、ＲＩ法と非ＲＩ法とがあるが、取り扱いの容易さから非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法としては、蛍光標識法、酵素標識法等があげられる。蛍光標識としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができ、シアニン色素（例えば、Ｃｙ ＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2 −アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などがあげられるが、これに限定されるものではない。酵素標識としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどがあげられるが、これに限定されるものではない。 In order to facilitate detection of the nucleic acid during amplification of the target nucleic acid, labeling is preferred. The labeling method includes an RI method and a non-RI method, but it is preferable to use the non-RI method because of easy handling. Non-RI methods include fluorescent labeling and enzyme labeling. Any fluorescent label can be used as long as it can bind to the base moiety of the nucleic acid, such as a cyanine dye (for example, Cy3, Cy5 of Cy Dye ™ series), rhodamine 6G reagent, N-acetoxy-N 2 —. Examples thereof include, but are not limited to, acetylaminofluorene (AAF) and AAIF (iodine derivative of AAF). Examples of enzyme labels include, but are not limited to, alkaline phosphatase and peroxidase.
（１−２）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションは、標的核酸、好ましくは標識した標的核酸が溶解あるいは分散した水性液を、本発明の核酸マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、目視または装置などで検出を容易にする観点から、１〜１００μＬの範囲にあることが好ましいが、これに限定されるものではない。ハイブリダイゼーションは、標的核酸とアレイに固定化された核酸とがハイブリッドを形成可能な条件下で行えばよいが、通常、約２５〜７０℃の温度範囲で、約１０分〜２４時間の範囲で実施することが好ましいが、これに限定されるものではない。ハイブリダイゼーション終了後、洗浄液を用いて洗浄を行い、未反応の標的核酸を除去する。洗浄液としては、緩衝液に界面活性剤を含有するものが例示される。
(1-2) Hybridization Hybridization can be performed by spotting an aqueous solution in which a target nucleic acid, preferably a labeled target nucleic acid is dissolved or dispersed, onto the nucleic acid microarray of the present invention. The amount of spotting is preferably in the range of 1 to 100 μL from the viewpoint of facilitating detection visually or with an apparatus, but is not limited thereto. Hybridization may be performed under conditions that allow the target nucleic acid and the nucleic acid immobilized on the array to form a hybrid, and is usually in the temperature range of about 25 to 70 ° C. and in the range of about 10 minutes to 24 hours. Although it is preferable to implement, it is not limited to this. After completion of hybridization, washing is performed using a washing solution to remove unreacted target nucleic acid. Examples of the washing solution include those containing a surfactant in a buffer solution.
（２）前記接触工程により形成された核酸ハイブリッドを検出する工程
検出方法は、標識に応じて適宜設定することができる。ＲＩ標識の場合は、オートラジオグラフィーにより検出することができる。蛍光標識の場合は、それぞれの蛍光標識に適した励起波長の光を照射し、その蛍光強度を測定することにより、検出することができる。酵素標識の場合、各酵素の基質を添加して測定することができる。アルカリホスファターゼを用いた場合、例えば、基質としてｐ−ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルりん酸 ｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰ）を添加し、その発色の程度を目視または、ＣＣＤカメラおよびデンシトメーターにより測定することができるが、これに限定されるものではない。
(2) The process of detecting the nucleic acid hybrid formed by the said contact process The detection method can be suitably set according to a label | marker. In the case of RI labeling, it can be detected by autoradiography. In the case of a fluorescent label, it can be detected by irradiating light having an excitation wavelength suitable for each fluorescent label and measuring the fluorescence intensity. In the case of enzyme labeling, measurement can be performed by adding a substrate for each enzyme. When alkaline phosphatase is used, for example, p-nitroblue tetrazolium (NBT) and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt (BCIP) are added as substrates, and the degree of color development is visually observed. Alternatively, it can be measured by a CCD camera and a densitometer, but is not limited thereto.
アルカリホスファターゼ標識と基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰとの組み合わせによる検出方法は、測定結果が目視観察できることから、臨床診断に好適に用いられうる。 A detection method using a combination of an alkaline phosphatase label and a substrate NBT / BCIP can be suitably used for clinical diagnosis because the measurement result can be visually observed.
本発明の核酸マイクロアレイは、遺伝子発現モニタリング、ジェノタイピング、および遺伝子多型のスクリーニング等様々な用途に使用することができる。臨床においては、臨床診断およびテーラーメード医療等への応用が期待される。 The nucleic acid microarray of the present invention can be used for various applications such as gene expression monitoring, genotyping, and screening of gene polymorphism. In clinical practice, application to clinical diagnosis and tailor-made medicine is expected.
以下実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を何ら限定するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the examples are described for explaining the present invention, and do not limit the present invention in any way.
実施例１：イオンビームによるＤＮＡマイクロアレイ（ポリカーボネート基板）の製造
イオンビーム照射
プラスチック基材として押出成形されたポリカーボネート（ＰＣ）基板を用いた。
イオンビーム源として、小型ＥＣＲイオンシャワー装置（エリオニクス製、ＥIＳ−２００ＥＲ）を用いた。ＰＣ基板を基板ホルダに取り付け、チャンバー内を約５．０×１０−３〜３．０×１０−４Ｐａに排気した後、窒素を２．３８ｓｃｃｍでチャンバー内に導入した。そして、プラズマ源内で５０Ｗのマイクロ波を照射することにより窒素イオンを引き出し、６００ｅＶの電圧で加速することでＰＣ基板表面に照射した。
Example 1 Production of DNA Microarray (Polycarbonate Substrate) by Ion Beam Ion Beam Irradiation An extruded polycarbonate (PC) substrate was used as a plastic substrate.
As an ion beam source, a small ECR ion shower device (manufactured by Elionix, EIS-200ER) was used. The PC substrate was attached to the substrate holder, and the inside of the chamber was evacuated to about 5.0 × 10 −3 to 3.0 × 10 −4 Pa, and then nitrogen was introduced into the chamber at 2.38 sccm. Nitrogen ions were extracted by irradiating a 50 W microwave in the plasma source, and accelerated at a voltage of 600 eV to irradiate the PC substrate surface.
ＤＮＡプローブ
ＤＮＡプローブとしては、配列番号１および２に示されるＤＮＡプローブ（シグマジェノシスジャパン社提供）を用いた。配列番号１のＤＮＡプローブは、第１エクソンと第２エクソンの間のイントロン領域内に存在するエストロゲン受容体対立遺伝子（ＸｂａＩ多型）のうち、制限酵素ＸｂａＩにより切断される配列（Ｘ型）を検出することができるものである。一方、配列番号２のＤＮＡプローブは、エストロゲン受容体対立遺伝子（ＸｂａＩ多型）のうち、制限酵素ＸｂａＩにより切断されない配列（ｘ型）を検出することができるものである。これらのＤＮＡプローブに３’末端をターミナルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いて、ポリチミンの付加を行った。具体的には、ターミナルトランスフェラーゼ（２０ｕｎｉｔ／μｌ）を４μｌ、デオキシチミジン三リン酸（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を１０μｌ、配列番号１および２のＤＮＡプローブ（５０ｍＭ）を４μｌ、製品添付のＮＥＢｕｆｆｅｒ４を５μｌ、および製品添付のカコジル酸緩衝液を５μｌ含んだ精製水５０μｌを調製した後、３７℃で４時間反応させ、製品添付の２０Ｘ ＳＳＣ緩衝液５０μｌを加えることで、ポリチミン付加された核酸プローブ（平均約４００ｂｐ長）２ｐｍｏｌ／μｌをそれぞれ得た。
DNA probe As the DNA probe, the DNA probes shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 (provided by Sigma Genosys Japan) were used. The DNA probe of SEQ ID NO: 1 comprises a sequence (X type) cleaved by the restriction enzyme XbaI among the estrogen receptor alleles (XbaI polymorphism) existing in the intron region between the first exon and the second exon. It can be detected. On the other hand, the DNA probe of SEQ ID NO: 2 can detect a sequence (x-type) that is not cleaved by the restriction enzyme XbaI among estrogen receptor alleles (XbaI polymorphism). Polythymine was added to these DNA probes using terminal transferase (manufactured by New England Biolab) at the 3 ′ end. Specifically, 4 μl of terminal transferase (20 units / μl), 10 μl of deoxythymidine triphosphate (10 pmol / μl), 4 μl of the DNA probes (50 mM) of SEQ ID NOs: 1 and 2, 5 μl of NEBuffer 4 attached to the product, and After preparing 50 μl of purified water containing 5 μl of the cacodylate buffer attached to the product, reacting at 37 ° C. for 4 hours, and adding 50 μl of the 20 × SSC buffer attached to the product, the polytimine-added nucleic acid probe (average of about 400 bp) Long) 2 pmol / μl were obtained.
Ｘ型検出用プローブ（配列番号１）：tctggagttg ggatga
ｘ型検出用プローブ（配列番号２）：gtggtctaga gttggg
X-type detection probe (SEQ ID NO: 1): tctggagttg ggatga
x-type detection probe (SEQ ID NO: 2): gtggtctaga gttggg
ＤＮＡプローブの固定
次に、ポリチミン付加された配列番号１または２の核酸プローブを、それぞれ１．０ｐｍｏｌ／μｌとなるように、製品添付の１０Ｘ ＳＳＣ緩衝液で希釈し、前記イオンビーム処理されたＰＣ基板上にそれぞれ０．５μＬずつ塗布し、３１２ｎｍの紫外線を２分間照射して固定化することで、核酸マイクロアレイを製造した。
Immobilization of DNA probe Next, the polythymine-added nucleic acid probe of SEQ ID NO: 1 or 2 was diluted with 10X SSC buffer attached to the product so as to be 1.0 pmol / μl, respectively, and the ion beam treated PC A nucleic acid microarray was manufactured by applying 0.5 μL each on a substrate and immobilizing it by irradiation with 312 nm ultraviolet rays for 2 minutes.
比較例１：未処理のＰＣ基板を用いたＤＮＡマイクロアレイの製造
実施例１において、イオンビーム照射しないこと以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡマイクロアレイを製造した。
Comparative Example 1: Production of DNA microarray using untreated PC substrate A DNA microarray was produced in the same manner as in Example 1 except that ion beam irradiation was not performed in Example 1.
実験例１：ＤＮＡマイクロアレイを用いた検査１
検体のゲノムＤＮＡの増幅
ｘｘ型の検体のゲノムＤＮＡを、配列番号３に示された塩基配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号４に示された塩基配列を有し、かつ５’末端にビオチンを結合させたリバースプライマー、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いたＰＣＲ法によりＸｂａＩ多型を含む塩基配列の増幅を行った。増幅反応は、変性過程を９４℃、３０秒、アニール過程を５５℃、２０秒、鎖伸長過程を７２℃、２０秒の１サイクルを３０サイクル行った。
Experimental Example 1: Examination 1 using DNA microarray
Amplification of specimen genomic DNA The genomic DNA of specimen xx type has a forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, and binds biotin to the 5 'end. The base sequence containing the XbaI polymorphism was amplified by the PCR method using the reverse primer and Taq DNA polymerase (Roche Diagnostics). In the amplification reaction, the denaturation process was 94 ° C. for 30 seconds, the annealing process was 55 ° C. for 20 seconds, the chain extension process was 72 ° C. for 20 seconds, and 30 cycles for 30 cycles.
フォワードプライマー（配列番号３）：gttccaaatg tcccagccgt
リバースプライマー（配列番号４）：cctgcaccag aatatgttac c
Forward primer (SEQ ID NO: 3): gttccaaatg tcccagccgt
Reverse primer (SEQ ID NO: 4): cctgcaccag aatatgttac c
核酸の検出
増幅したＤＮＡ溶液２０μＬに、水酸化ナトリウム（５Ｍ）、エチレンジアミン四酢酸（０．０５Ｍ）の溶液（２０μＬ）を加えてよく攪拌し、５分間放置して、増幅したＤＮＡを1本鎖に変性させた。変性ＤＮＡを含む溶液に、ドデシル硫酸ナトリウム（０．０１ｗ／ｖ％）、塩化ナトリウム（１．８ｗ／ｖ％）およびクエン酸ナトリウム（１．０ｗ／ｖ％）を含む溶液（１ｍＬ）を加え、実施例１または比較例１のマイクロアレイ１枚を浸潤させ、反応温度４５℃で３０分間振とうしてハイブリダイゼーションを行った。その後、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを加え、さらにｐ−ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルりん酸 ｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰ）を加えて、各プローブと結合した試料に結合したアルカリホスファターゼによる発色反応を行った。つまり、核酸の検出が正確な場合は、配列番号１の配列を含むＤＮＡプローブは発色せず、配列番号２の配列を含むＤＮＡプローブは発色することになる。
Nucleic acid detection To 20 μL of the amplified DNA solution, a solution (20 μL) of sodium hydroxide (5 M) and ethylenediaminetetraacetic acid (0.05 M) is added and stirred well, left for 5 minutes, and the amplified DNA is single-stranded. To be denatured. To a solution containing denatured DNA, a solution (1 mL) containing sodium dodecyl sulfate (0.01 w / v%), sodium chloride (1.8 w / v%) and sodium citrate (1.0 w / v%) is added, One microarray of Example 1 or Comparative Example 1 was infiltrated, and hybridization was performed by shaking at a reaction temperature of 45 ° C. for 30 minutes. Thereafter, alkaline phosphatase-labeled streptavidin was added, and p-nitroblue tetrazolium (NBT) and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt (BCIP) were added, and the sample was bound to each probe. A color reaction with alkaline phosphatase bound to was performed. That is, when nucleic acid detection is accurate, the DNA probe containing the sequence of SEQ ID NO: 1 does not develop color, and the DNA probe containing the sequence of SEQ ID NO: 2 develops color.
発色した結果を図１に示す。実施例１のＰＣ基板から作製された核酸マイクロアレイは目視で容易に判定できるのに対し、比較例１のＰＣ基板から作製された核酸マイクロアレイはほとんど発色しなかった。このことにより、イオンビーム照射が核酸のプラスチック基板への固定に有効であることが示された。 The result of color development is shown in FIG. The nucleic acid microarray prepared from the PC substrate of Example 1 can be easily determined visually, whereas the nucleic acid microarray prepared from the PC substrate of Comparative Example 1 hardly developed color. This shows that ion beam irradiation is effective for immobilizing nucleic acids on plastic substrates.
実施例２：イオンビームによるＤＮＡマイクロアレイ（ＰＭＭＡ基板）の製造１
実施例１において、基板としてポリカーボネートの代わりにＰＭＭＡを用い、プローブとして、配列番号２の塩基配列にポリチミンを付加した核酸のみを固定したこと以外は、実施例１と同様にして、ＤＮＡマイクロアレイを製造した。
Example 2: Production 1 of DNA microarray (PMMA substrate) by ion beam
In Example 1, a DNA microarray was produced in the same manner as in Example 1 except that PMMA was used as the substrate instead of polycarbonate, and only the nucleic acid obtained by adding polythymine to the base sequence of SEQ ID NO: 2 was immobilized as the probe. did.
実施例３：イオンビームによるＤＮＡマイクロアレイ（ＰＭＭＡ基板）の製造２
実施例２において、不活性ガスとして、窒素ガスの代わりにアルゴンを用いたこと以外は実施例２と同様にして、ＤＮＡマイクロアレイを製造した。
Example 3: Production of DNA microarray (PMMA substrate) by ion beam 2
In Example 2, a DNA microarray was produced in the same manner as in Example 2 except that argon was used instead of nitrogen gas as the inert gas.
比較例２：未処理のＰＭＭＡ基板を用いたＤＮＡマイクロアレイの製造
実施例１において、イオンビーム照射しないこと以外は実施例２と同様にして、ＤＮＡマイクロアレイを製造した。
Comparative Example 2: Production of DNA microarray using untreated PMMA substrate A DNA microarray was produced in the same manner as in Example 2 except that ion beam irradiation was not performed in Example 1.
実験例２：ＤＮＡマイクロアレイを用いた検査２
実施例１および比較例１のＰＣ基板製のマイクロアレイの代わりに、実施例２、３および比較例２のＰＭＭＡ基板製のマイクロアレイを用いたこと以外は実験例１と同様にして、ｘｘ型の変異を含む核酸の検出を行った。
Experimental Example 2: Examination 2 using DNA microarray
The xx-type mutation was carried out in the same manner as in Experimental Example 1, except that the PMMA substrate microarrays of Examples 2 and 3 and Comparative Example 2 were used instead of the PC substrate microarrays of Example 1 and Comparative Example 1. Nucleic acid containing was detected.
発色した結果を図２に示す。実施例２および３のＤＮＡマイクロアレイは目視で容易に判定できるのに対し、比較例２のＤＮＡマイクロアレイはほとんど発色しなかった。また、実施例２のマイクロアレイの方が、実施例３のマイクロアレイよりも発色の度合いが良好であった。 The result of color development is shown in FIG. While the DNA microarrays of Examples 2 and 3 can be easily determined visually, the DNA microarray of Comparative Example 2 hardly developed color. In addition, the degree of color development was better in the microarray of Example 2 than in the microarray of Example 3.
実験例３：イオンビーム処理後のＰＭＭＡ基板の接触角測定
実施例２、３のＤＮＡマイクロアレイ製造時において、核酸固定直前のＰＭＭＡ基板と水との接触角θ(°)を測定した。具体的には，実施例２および３におけるイオンビーム照射直後のＰＭＭＡ基板表面に０．２５μＬの蒸留水を滴下し、光学顕微鏡で測定した。
図３にＰＭＭＡ基板に各種イオンビームを照射したときのイオンドーズ量（単位面積当りのイオン数）に伴う水とＰＭＭＡ基板との接触角の変化を示す。図３に示すように、アルゴンおよび窒素イオンをそれぞれ照射した結果、ドーズ量が増加するに従ってＰＭＭＡと水との接触角が初期約８０°であったものが、いずれの場合も２０°以下に減少した。定量的には、接触角がそれぞれ実施例２では９０％、実施例３では８４％減少した。以上のことから、イオンビーム照射により、核酸固定時におけるプラスチック基材と水との接触角が６０°以下であることがわかった。
Experimental Example 3: Measurement of contact angle of PMMA substrate after ion beam treatment In the production of DNA microarrays of Examples 2 and 3, the contact angle θ (°) between the PMMA substrate and water immediately before nucleic acid fixation was measured. Specifically, 0.25 μL of distilled water was dropped on the surface of the PMMA substrate immediately after ion beam irradiation in Examples 2 and 3, and measurement was performed with an optical microscope.
FIG. 3 shows a change in contact angle between water and the PMMA substrate according to the ion dose amount (number of ions per unit area) when various ion beams are irradiated to the PMMA substrate. As shown in FIG. 3, as a result of irradiation with argon and nitrogen ions, the contact angle between PMMA and water was initially about 80 ° as the dose increased. In either case, the contact angle decreased to 20 ° or less. did. Quantitatively, the contact angles decreased by 90% in Example 2 and 84% in Example 3, respectively. From the above, it was found that the contact angle between the plastic substrate and water at the time of nucleic acid fixation was 60 ° or less by ion beam irradiation.
実施例４：プラズマ処理法によるＤＮＡマイクロアレイの製造
実施例１において、イオンビーム処理の代わりにプラズマ処理を施したこと以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡマイクロアレイを製造した。プラズマ処理は、小型高性能プラズマ表面処理装置（ヤマト科学社製、ＰＤＣ２００シリーズ）を用いた。ＰＣ基板を窒素雰囲気下のチャンバー内に配置し、約２５℃、高圧（約２０Ｐａ）下、出力５００Ｗで約６００秒処理した。
Example 4: Production of DNA microarray by plasma treatment method A DNA microarray was produced in the same manner as in Example 1 except that in Example 1, plasma treatment was performed instead of ion beam treatment. For the plasma treatment, a small high-performance plasma surface treatment apparatus (manufactured by Yamato Kagaku Co., Ltd., PDC200 series) was used. The PC substrate was placed in a chamber under a nitrogen atmosphere and treated at about 25 ° C. under high pressure (about 20 Pa) at an output of 500 W for about 600 seconds.
比較例３：未処理のＰＣ基板を用いたＤＮＡマイクロアレイの製造
実施例４において、プラズマ処理しないこと以外は実施例４と同様にして、ＤＮＡマイクロアレイを製造した。
Comparative Example 3: Production of DNA microarray using untreated PC substrate A DNA microarray was produced in the same manner as in Example 4 except that plasma treatment was not performed in Example 4.
実験例３：ＤＮＡマイクロアレイを用いた検査３
実験例１において、実施例１および比較例１のマイクロアレイの代わりに、実施例４および比較例３のマイクロアレイを用いたこと以外は実験例１と同様にして、ｘｘ型の変異を含む核酸の検出を行った。
Experimental Example 3: Inspection 3 using DNA microarray
In Experimental Example 1, detection of a nucleic acid containing an xx type mutation was performed in the same manner as in Experimental Example 1, except that the microarray of Example 4 and Comparative Example 3 was used instead of the microarray of Example 1 and Comparative Example 1. Went.
発色した結果を図４に示す。実施例４のマイクロアレイは目視で容易に判定できるのに対し、比較例３のマイクロアレイはほとんど発色しなかった。このことにより、プラズマ処理が核酸のプラスチック基板への固定に有効であることが示された。 The result of color development is shown in FIG. While the microarray of Example 4 can be easily determined visually, the microarray of Comparative Example 3 hardly developed color. This indicates that the plasma treatment is effective for immobilizing nucleic acids on a plastic substrate.
実験例４：ＤＮＡマイクロアレイ用基板の表面粗さの測定
実施例１〜４および比較例１〜３で用いたプラスチック基板の表面粗さＲａを、レーザ顕微鏡（キーエンス社製）を用いて測定した。具体的には、観察視野内の表面粗さの平均を製品添付の解析ソフトを用いて測定した。その結果を表１に示す。
Experimental Example 4: Measurement of surface roughness of substrate for DNA microarray The surface roughness Ra of the plastic substrate used in Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 3 was measured using a laser microscope (manufactured by Keyence Corporation). Specifically, the average surface roughness in the observation field was measured using analysis software attached to the product. The results are shown in Table 1.
実験例５：ＤＮＡマイクロアレイ用基板の表面分析
実施例２、３および比較例２のＰＭＭＡ基板の表面における元素組成比を、Ｘ線光電子分光分析装置（ＸＰＳ、アルバックファイ社製）を用いて測定した。具体的には、Ｘ線源としてＡｌ Ｋα線を用い、約２５℃、減圧下（約１０−５Ｐａ以下）で帯電中和銃を用いながら測定した（分析面積：直径８００μｍ）。
Experimental Example 5: Surface analysis of DNA microarray substrate The elemental composition ratios on the surfaces of the PMMA substrates of Examples 2 and 3 and Comparative Example 2 were measured using an X-ray photoelectron spectrometer (XPS, ULVAC-PHI). . Specifically, Al Kα ray was used as an X-ray source, and measurement was performed at about 25 ° C. under reduced pressure (about 10 −5 Pa or less) using a charged neutralization gun (analysis area: diameter 800 μm).
その結果を表２に示す。実施例３のアルゴンイオンビーム照射後および比較例２の未処理の基板表面よりも、実施例２の窒素イオンビーム照射後の基板表面の方が窒素の元素組成比が増加していることから、ＰＭＭＡ基板表面にアミン基および／またはアミノ基が発生していることが推測される。 The results are shown in Table 2. Since the substrate surface after the nitrogen ion beam irradiation of Example 2 is increased after the argon ion beam irradiation of Example 3 and the untreated substrate surface of Comparative Example 2, the elemental composition ratio of nitrogen is increased. It is presumed that amine groups and / or amino groups are generated on the surface of the PMMA substrate.
Claims (13)
処理後のプラスチック基材上に核酸をＵＶ照射により固定する工程
を含む核酸マイクロアレイの製造方法。 A nucleic acid microarray comprising a step of subjecting a plastic substrate to an ion beam treatment using an inert gas as an ionizing gas or a plasma treatment in an inert gas atmosphere, and a step of fixing nucleic acid on the treated plastic substrate by UV irradiation. Manufacturing method.
前記接触工程により形成された核酸ハイブリッドを検出する工程
を含む、特定の塩基配列を有する核酸の検出方法。 A step of bringing the nucleic acid microarray according to any one of claims 1 to 5 or the nucleic acid microarray obtained by the production method according to any one of claims 6 to 10 into contact with a sample containing the nucleic acid to be analyzed, and the contact step. A method for detecting a nucleic acid having a specific base sequence, which comprises a step of detecting a prepared nucleic acid hybrid.
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| JP2009092592A (en) * | 2007-10-11 | 2009-04-30 | Toyobo Co Ltd | Nucleic acid immobilizing substrate, method for manufacturing same, nucleic acid testing device, method for manufacturing same and nucleic acid testing method |
| JP2015519882A (en) * | 2012-04-09 | 2015-07-16 | エーピーディーエヌ （ビー．ブイ．アイ．） インコーポレイテッド | Plasma treatment for DNA binding |
| GB2535969A (en) * | 2014-09-19 | 2016-09-07 | P2I Ltd | Solid Phase Synthesis and Products Obtained thereby |
| WO2020105628A1 (en) * | 2018-11-21 | 2020-05-28 | 株式会社ヨコオ | Method for detecting target nucleic acid and package for target nucleic acid detection |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003161731A (en) * | 2001-11-27 | 2003-06-06 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | Plastic substrate for microchip and manufacturing method and usage method thereof |
| JP2003183425A (en) * | 2001-12-17 | 2003-07-03 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | Plastic substrate for microchip and method for producing the same |
| US20030198968A1 (en) * | 2002-04-23 | 2003-10-23 | Matson Robert S. | Polymer-coated substrates for immobilization of biomolecules and cells |
| WO2004111648A2 (en) * | 2003-06-12 | 2004-12-23 | Plasso Technology Ltd | Plasma polymerisation methods for the deposition of chemical gradients and surfaces displaying a gradient of immobilised biomolecules |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003161731A (en) * | 2001-11-27 | 2003-06-06 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | Plastic substrate for microchip and manufacturing method and usage method thereof |
| JP2003183425A (en) * | 2001-12-17 | 2003-07-03 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | Plastic substrate for microchip and method for producing the same |
| US20030198968A1 (en) * | 2002-04-23 | 2003-10-23 | Matson Robert S. | Polymer-coated substrates for immobilization of biomolecules and cells |
| WO2004111648A2 (en) * | 2003-06-12 | 2004-12-23 | Plasso Technology Ltd | Plasma polymerisation methods for the deposition of chemical gradients and surfaces displaying a gradient of immobilised biomolecules |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009092592A (en) * | 2007-10-11 | 2009-04-30 | Toyobo Co Ltd | Nucleic acid immobilizing substrate, method for manufacturing same, nucleic acid testing device, method for manufacturing same and nucleic acid testing method |
| JP2015519882A (en) * | 2012-04-09 | 2015-07-16 | エーピーディーエヌ （ビー．ブイ．アイ．） インコーポレイテッド | Plasma treatment for DNA binding |
| GB2535969A (en) * | 2014-09-19 | 2016-09-07 | P2I Ltd | Solid Phase Synthesis and Products Obtained thereby |
| WO2020105628A1 (en) * | 2018-11-21 | 2020-05-28 | 株式会社ヨコオ | Method for detecting target nucleic acid and package for target nucleic acid detection |
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