JP2006280277A - Method for extracting nucleic acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、粒子による核酸の抽出方法に関する。より詳しくは、アミノ基修飾粒子により多量の核酸を高効率で吸着することができ、かつ吸着された核酸を高効率で脱離することによってターゲットとする核酸をきわめて効率よく抽出することができる核酸抽出方法に関するものである。 The present invention relates to a method for extracting nucleic acid using particles. More specifically, a nucleic acid capable of adsorbing a large amount of nucleic acid with amino group-modified particles with high efficiency and extracting a target nucleic acid with high efficiency by desorbing the adsorbed nucleic acid with high efficiency. It relates to an extraction method.
近年、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸抽出の自動化は、学術分野のみならず医療分野及び産業界においても強く求められているところである。例えば、ヒト全血、血清等に含まれている核酸を自動化抽出し、抽出した核酸をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法により増幅させ、更に増幅させた増幅断片についてＳＮＰ（一塩基多型）の遺伝子型判別を行うこと等が検討されている（例えば非特許文献１参照）。 In recent years, automation of nucleic acid extraction such as DNA or RNA has been strongly demanded not only in the academic field but also in the medical field and industry. For example, nucleic acid contained in human whole blood, serum, etc. is automatically extracted, the extracted nucleic acid is amplified by PCR (polymerase chain reaction) method, and the amplified fragment is further subjected to SNP (single nucleotide polymorphism) gene Performing type discrimination or the like has been studied (for example, see Non-Patent Document 1).
核酸の抽出方法として、カオトロピック塩の存在下、常磁性体の磁性粒子をシリカによりコーティングした磁性粒子を使用し、核酸の吸着、脱離を行う抽出方法が開示されている（例えば特許文献１参照）。 As a nucleic acid extraction method, an extraction method is disclosed in which magnetic particles obtained by coating paramagnetic magnetic particles with silica in the presence of a chaotropic salt are used to adsorb and desorb nucleic acids (see, for example, Patent Document 1). ).
しかしながら、この核酸抽出方法は、吸着、脱離を伴う抽出工程において、カオトロピック塩や、洗浄の際に用いる有機溶媒を使用しなければならないため、抽出後の核酸に有機溶媒が混入することにより酵素阻害等の悪影響を及ぼすという問題点があった。 However, this nucleic acid extraction method requires the use of a chaotropic salt or an organic solvent used for washing in the extraction step involving adsorption and desorption. There was a problem of adverse effects such as inhibition.
さらに、核酸を抽出する方法として、磁気微粒子を使用して、核酸を吸着させ、分離して抽出する方法が開示されている。例えば、特許文献２には、磁気微粒子表面にデンドリマーを形成させ、更にデンドリマー表面をアミノ基で被覆したデンドリマー組成物を使用し、核酸を抽出する方法が開示されている（例えば特許文献２参照）。 Furthermore, as a method for extracting nucleic acid, a method is disclosed in which nucleic acid is adsorbed, separated and extracted using magnetic fine particles. For example, Patent Document 2 discloses a method for extracting nucleic acid using a dendrimer composition in which a dendrimer is formed on the surface of a magnetic fine particle and the surface of the dendrimer is further coated with an amino group (see, for example, Patent Document 2). .
しかしながら、上記核酸の抽出方法においては、水溶液中で、デンドリマー表面に形成されたアミノ基により核酸を効率良く吸着（捕捉）することはできるものの、一旦吸着された核酸はアミノ基と強く相互作用していることから、核酸を脱離して抽出することは困難であった。例えば、デンドリマー表面に形成されたアミノ基に吸着した核酸に、塩化ナトリウム等の水溶液を加えた場合、吸着した核酸の内約４分の１程度しか核酸を脱離し、抽出することができないものとなっていた。 However, although the nucleic acid extraction method can efficiently adsorb (capture) the nucleic acid in the aqueous solution by the amino group formed on the surface of the dendrimer, the nucleic acid once adsorbed strongly interacts with the amino group. Therefore, it was difficult to desorb and extract nucleic acids. For example, when an aqueous solution such as sodium chloride is added to the nucleic acid adsorbed to the amino group formed on the surface of the dendrimer, only about one-fourth of the adsorbed nucleic acid can be desorbed and extracted. It was.
つまり、デンドリマー表面に形成されたアミノ基と相補的に結合した核酸を脱離し抽出するための最適な条件については全く検討されておらず、結局、核酸抽出方法を既存のＰＣＲ法及びＳＮＰ自動検出法に統合することが困難であるという問題点があった。 In other words, the optimal conditions for desorbing and extracting the nucleic acid complementary to the amino group formed on the surface of the dendrimer have not been studied at all. As a result, the nucleic acid extraction method is not limited to the existing PCR method and SNP automatic detection. There was a problem that it was difficult to integrate into the law.
以上のような状況に鑑み、本発明の課題は、水溶液中で多量の核酸を高効率で吸着することができ、吸着された核酸を高効率で脱離し、抽出することができ、かつＰＣＲ法及びＳＮＰ自動検出の統合化が可能な核酸の抽出方法を提供することにある。 In view of the above situation, the problem of the present invention is that a large amount of nucleic acid can be adsorbed with high efficiency in an aqueous solution, adsorbed nucleic acid can be desorbed and extracted with high efficiency, and PCR method And a nucleic acid extraction method capable of integrating SNP automatic detection.
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、粒子の表面に形成されたアミノ基に吸着させた多量の核酸に多価アニオン塩溶液を特定条件下で反応させることにより、該アミノ基に吸着させた核酸を極めて効率良く脱離し、抽出することができることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of earnest research to solve the above-mentioned problems, the present inventors have reacted the polyvalent anion salt solution with a large amount of nucleic acid adsorbed on the amino group formed on the surface of the particle under specific conditions, It has been found that nucleic acids adsorbed to amino groups can be desorbed and extracted very efficiently, and the present invention has been completed.
本発明は以下の事項に関する。すなわち、
（１）粒子の表面に形成されたアミノ基に核酸を吸着させ、該アミノ基に吸着させた核酸を多価アニオン塩溶液と反応させることにより、該アミノ基に吸着させた核酸を脱離させることを特徴とする核酸抽出方法。
（２）前記粒子は、バクテリア由来の磁性体、人工磁性体、金属、プラスチックビーズ、ガラスビーズ、ゲル状物質の粒子から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする（１）に記載の核酸抽出方法。
（３）前記多価アニオン塩溶液は、リン酸塩溶液であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の核酸抽出方法。
（４）前記多価アニオン塩溶液の濃度は、１．０ｍＭ〜５００ｍＭであることを特徴とする（１）ないし（３）のいずれかに記載の核酸抽出方法。
（５）前記アミノ基に吸着させた核酸を前記多価アニオン塩溶液と反応させる温度は、１０℃〜９０℃であることを特徴とする（１）ないし（４）のいずれかに記載の核酸抽出方法。
（６）（１）ないし（５）のいずれかに記載の核酸抽出方法により、抽出した核酸をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法により増幅させ、更に該増幅させた核酸断片をＳＮＰ（一塩基多型）遺伝子型判別を行うことを特徴とするＳＮＰ検出方法に関する。
The present invention relates to the following items. That is,
(1) Nucleic acid is adsorbed on the amino group formed on the surface of the particle, and the nucleic acid adsorbed on the amino group is reacted with a polyvalent anion salt solution to desorb the nucleic acid adsorbed on the amino group. A nucleic acid extraction method characterized by the above.
(2) The nucleic acid according to (1), wherein the particle is at least one selected from bacteria-derived magnetic material, artificial magnetic material, metal, plastic bead, glass bead, and gel substance particle. Extraction method.
(3) The nucleic acid extraction method according to (1) or (2), wherein the polyvalent anion salt solution is a phosphate solution.
(4) The nucleic acid extraction method according to any one of (1) to (3), wherein the concentration of the polyvalent anion salt solution is 1.0 mM to 500 mM.
(5) The nucleic acid according to any one of (1) to (4), wherein a temperature at which the nucleic acid adsorbed on the amino group is reacted with the polyvalent anion salt solution is 10 ° C. to 90 ° C. Extraction method.
(6) The nucleic acid extraction method according to any one of (1) to (5) is used to amplify the extracted nucleic acid by a PCR (polymerase chain reaction) method, and the amplified nucleic acid fragment is further subjected to SNP (single nucleotide polymorphism) A) SNP detection method characterized by genotyping.
本発明の核酸の抽出方法によれば、粒子の表面に形成されたアミノ基により、多量の核酸を吸着することができると同時に、吸着した核酸を極めて効率良く脱離し、抽出することができる。 According to the nucleic acid extraction method of the present invention, a large amount of nucleic acid can be adsorbed by the amino group formed on the surface of the particle, and at the same time, the adsorbed nucleic acid can be desorbed and extracted very efficiently.
さらに、本発明の核酸の抽出方法によれば、抽出した核酸をＰＣＲ法により増幅させることができ、さらに増幅した核酸をＳＮＰ自動検出に供することができる。しかも、本発明の核酸抽出方法は、核酸の吸着、脱離の一連の抽出工程を水溶液中で行うことができるため、従来からＰＣＲ法により核酸の増幅工程において問題となっていた有機溶媒による酵素阻害等の悪影響を防止することができる。 Furthermore, according to the nucleic acid extraction method of the present invention, the extracted nucleic acid can be amplified by the PCR method, and the amplified nucleic acid can be subjected to SNP automatic detection. Moreover, since the nucleic acid extraction method of the present invention can perform a series of extraction steps of nucleic acid adsorption and desorption in an aqueous solution, an enzyme using an organic solvent, which has been a problem in the nucleic acid amplification step by the PCR method. Adverse effects such as inhibition can be prevented.
すなわち、本発明によれば、核酸の吸着及び脱離を水溶液中で効率良く行うことができるため、ＰＣＲ法に最適な核酸の抽出方法を提供することができ、さらには、ＳＮＰ検出の信頼性及び検出精度を向上させることができる。 That is, according to the present invention, nucleic acid can be efficiently adsorbed and desorbed in an aqueous solution, so that it is possible to provide a nucleic acid extraction method that is optimal for the PCR method. In addition, the detection accuracy can be improved.
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
本発明の核酸の抽出方法は、粒子の表面に形成されたアミノ基に多量の核酸を吸着させ、該アミノ基に吸着させた核酸を多価アニオン塩溶液と反応させることにより、核酸を脱離し、抽出することを特徴としている。 In the nucleic acid extraction method of the present invention, a large amount of nucleic acid is adsorbed on the amino group formed on the surface of the particle, and the nucleic acid adsorbed on the amino group is reacted with a polyvalent anion salt solution to desorb the nucleic acid. It is characterized by extracting.
＜アミノ基修飾粒子＞
[粒子について]
本発明の核酸の抽出方法において使用される粒子とは、その表面にアミノ基を形成させることができる粒子であれば特に制限されるものではないが、例えばバクテリア由来の磁性体、人工磁性体、金属、プラスチックビーズ、ガラスビーズ、ゲル状物質を例示することができる。これらの中でも、磁性及び大きさ等の観点からバクテリア由来の磁性体が好ましい。
<Amino group modified particles>
[About particles]
The particle used in the nucleic acid extraction method of the present invention is not particularly limited as long as it is a particle capable of forming an amino group on its surface. For example, bacteria-derived magnetic material, artificial magnetic material, Examples thereof include metals, plastic beads, glass beads, and gel substances. Among these, bacteria-derived magnetic materials are preferable from the viewpoints of magnetism and size.
上記バクテリア由来の磁性体は、酸化鉄で構成された単磁区構造を有し、その大きさが５０〜１００ｎｍであり、特に核酸抽出に適したものである。 The magnetic substance derived from bacteria has a single magnetic domain structure composed of iron oxide and has a size of 50 to 100 nm, and is particularly suitable for nucleic acid extraction.
[粒子の構造]
本発明の核酸の抽出方法においては、上記の粒子の表面に核酸を多量に吸着させるためのアミノ基を形成させる。アミノ基修飾磁気粒子の表面構造は、単層とすることは勿論、さらに表面処理を施し二層以上に分岐を繰り返すデンドリマー状としてもよい。アミノ基修飾磁気微粒子表面のデンドリマーの多層構造は、抽出したい核酸の性質に応じて適宜設定することができる。
[Particle structure]
In the nucleic acid extraction method of the present invention, an amino group for adsorbing a large amount of nucleic acid is formed on the surface of the particles. The surface structure of the amino group-modified magnetic particles may be a single layer or a dendrimer that is further subjected to surface treatment and repeats branching into two or more layers. The multilayer structure of the dendrimer on the surface of the amino group-modified magnetic fine particles can be appropriately set according to the nature of the nucleic acid to be extracted.
上記粒子表面上のアミノ基は、粒子の表面をアミノシラン処理することにより形成される。 The amino group on the particle surface is formed by aminosilane treatment of the particle surface.
アミノシラン処理は、特に限定されるものではないが、例えばアミノシリル化剤やアミノシランカップリング剤を使用して行うことができる。 The aminosilane treatment is not particularly limited, but can be performed using, for example, an aminosilylating agent or an aminosilane coupling agent.
[アミノシラン処理について]
上記アミノシランカップリング剤により粒子表面にアミノシラン処理を施す際には、粒子に存在するヒドロキシル基を表面に露出させることが好ましい。例えば、粒子としてバクテリア由来の磁性体等の磁性体を採択した場合、該表面をアミノシラン処理するためには粒子表面に存在する脂質二重膜を除去することによって表面のヒドロキシル基を活性化させ、アミノシリル化反応、アミノシランカップリング反応を促進することができる。なお、粒子上の脂質二重膜を除去は、特に限定されるものではないが、粒子を有機溶媒、界面活性剤、強アルカリ等で処理することにより行うことができる。
[Aminosilane treatment]
When the aminosilane treatment is performed on the particle surface with the aminosilane coupling agent, it is preferable to expose the hydroxyl group present on the particle to the surface. For example, when a magnetic substance such as a magnetic substance derived from bacteria is adopted as the particle, the surface hydroxyl group is activated by removing the lipid bilayer existing on the particle surface in order to treat the surface with aminosilane, Aminosilylation reaction and aminosilane coupling reaction can be promoted. The removal of the lipid bilayer on the particles is not particularly limited, but can be performed by treating the particles with an organic solvent, a surfactant, a strong alkali or the like.
アミノシランカップリング剤は、粒子表面のヒドロキシル基をアミノシランカップリングすることができれば、特に制限されるものでないが、例えば、入手し易さの観点から３-[２-(２-アミノエチル)-エチルアミン]-プロピルトリメトキシシラン（ＡＥＥＡ）や３-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）等を使用することができる。また上記シランカップリング剤を溶解させる溶媒としては、上記のアミノカップリング剤を溶解することができれば特に制限されるものではないが、アルコール、炭化水素、芳香族炭化水素等を使用することができ、アミノ基を多量に導入することができることから芳香族炭化水素が好ましく、その中でも特にトルエンを好適に使用することができる。 The aminosilane coupling agent is not particularly limited as long as the hydroxyl group on the particle surface can be aminosilane-coupled. For example, 3- [2- (2-aminoethyl) -ethylamine is available from the viewpoint of availability. ] -Propyltrimethoxysilane (AEEA), 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES), etc. can be used. The solvent for dissolving the silane coupling agent is not particularly limited as long as the amino coupling agent can be dissolved, but alcohol, hydrocarbon, aromatic hydrocarbon, etc. can be used. Aromatic hydrocarbons are preferred because a large amount of amino group can be introduced, and among these, toluene can be used particularly suitably.
本発明の核酸の抽出方法においては、上記粒子を界面活性剤等で脂質二重膜を除去した後、アミノシランカップリング剤を所定時間反応させることによりアミノシラン処理をすることができ、粒子表面にアミノ基を導入することができる。なお、導入されたアミノ基の数は、スクシイミジル基を有し、第１級アミンと１対１で反応するサルフォサクシイミド６-[3'-(2-ピリジルジチオール)-プロピオンアミド]ヘキサノエイト（sulfo-LC-SPDP）と反応させ、ＤＴＴ等のチオール性還元剤によってジスルフィド結合を切断し、遊離する化合物の吸光度を測定することにより定量することができる。なお、得られたアミノ基修飾粒子は、炭化水素、アルコール、超純水等に保存することができる。 In the nucleic acid extraction method of the present invention, after the lipid bilayer membrane is removed from the particles with a surfactant or the like, aminosilane treatment can be performed by reacting the aminosilane coupling agent for a predetermined time. Groups can be introduced. The number of amino groups introduced is sulphosuccinimide 6- [3 ′-(2-pyridyldithiol) -propionamido] hexanoate, which has a succinimidyl group and reacts with a primary amine on a one-to-one basis. It can be quantified by reacting with sulfo-LC-SPDP), cleaving the disulfide bond with a thiol reducing agent such as DTT, and measuring the absorbance of the released compound. The obtained amino group-modified particles can be stored in hydrocarbons, alcohols, ultrapure water or the like.
＜核酸の吸着＞
本発明の核酸の抽出方法においては、血液、血清、バフィーコート、体液、リンパ球、培養細胞、組織等の核酸生体成分が溶解した溶液に上記の粒子を添加し、該溶液中の核酸を粒子表面のアミノ基に吸着させる。すなわち、粒子表面形成されたアミノ基がターゲットとなる核酸との静電相互作用による相補的結合を形成し、これによりターゲットとなる核酸を多量に効率よく吸着することができる。
<Nucleic acid adsorption>
In the nucleic acid extraction method of the present invention, the above-mentioned particles are added to a solution in which nucleic acid biological components such as blood, serum, buffy coat, body fluid, lymphocytes, cultured cells, tissues, etc. are dissolved, and the nucleic acid in the solution is added to the particles. Adsorbed on the amino group on the surface. That is, the amino group formed on the particle surface forms a complementary bond by electrostatic interaction with the target nucleic acid, and thereby the target nucleic acid can be efficiently adsorbed in a large amount.
核酸の吸着量は、添加した核酸溶液中の核酸の量とアミノ基修飾磁性粒子と反応させ洗浄後に上清液から回収された核酸の量との差をとって吸着量とした。なお、核酸の定量は、核酸定量試薬により行うことができる。 The amount of nucleic acid adsorbed was determined by taking the difference between the amount of nucleic acid in the added nucleic acid solution and the amount of nucleic acid recovered from the supernatant after washing with amino group-modified magnetic particles. The nucleic acid can be quantified using a nucleic acid quantification reagent.
＜核酸の脱離＞
[多価アニオン塩溶液について]
本発明において、粒子表面に形成されたアミノ基と静電相互作用による相補的結合により吸着した多量の核酸を効率よく脱離するために多価アニオン塩溶液を使用する。多価アニオン塩溶液中の陰イオンがアミノ基と吸着している核酸に置き換わり、これによって吸着していた核酸の脱離が起こる。
<Desorption of nucleic acid>
[About polyvalent anion salt solution]
In the present invention, a polyvalent anion salt solution is used in order to efficiently desorb a large amount of nucleic acid adsorbed by a complementary bond by an electrostatic interaction with an amino group formed on the particle surface. The anion in the polyvalent anion salt solution is replaced with the nucleic acid adsorbed to the amino group, and the adsorbed nucleic acid is desorbed.
多価アニオン塩としては、アミノ基との静電相互作用が核酸よりも大きいものであれば良く、特に制限されるものではないが、硫酸塩又はリン酸塩が好ましく、具体的には硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アルミニウム、リン酸水素アンモニウム、リン酸水素カリウム等を例示することができる。これらの中でもリン酸ナトリウム塩緩衝溶液が特に好ましい。なお、上記緩衝溶液には、少量の塩化ナトリウム等の電解質を添加することもでき、溶液のイオン強度を調整することができる。 The polyvalent anion salt is not particularly limited as long as the electrostatic interaction with the amino group is larger than that of the nucleic acid, but is preferably sulfate or phosphate, specifically ammonium sulfate, Examples thereof include sodium sulfate, magnesium sulfate, aluminum sulfate, ammonium hydrogen phosphate, and potassium hydrogen phosphate. Among these, a sodium phosphate buffer solution is particularly preferable. A small amount of electrolyte such as sodium chloride can be added to the buffer solution, and the ionic strength of the solution can be adjusted.
上記多価アニオン塩溶液の濃度は、１．０ｍＭ〜５００ｍＭであることが必要である。濃度が１．０ｍＭ未満であると、核酸の脱離が不十分となり、一方、濃度が５００ｍＭを超えると、分離、抽出後の核酸に支障をきたし、ＰＣＲ法による核酸増幅に障害が生じる。 The concentration of the polyvalent anion salt solution needs to be 1.0 mM to 500 mM. When the concentration is less than 1.0 mM, nucleic acid is not sufficiently desorbed. On the other hand, when the concentration exceeds 500 mM, the nucleic acid after separation and extraction is impaired, and nucleic acid amplification by the PCR method is impaired.
多量の核酸が吸着した粒子上に上記多価アニオン塩溶液を加え、所定の温度にてインキュベートした後、核酸を脱離する。インキュベートする温度としては、１０℃〜９０℃、好ましくは２０℃〜８０℃である。インキュベートする温度が１０℃未満であると核酸の脱離が起こりにくく、９０℃以上であると脱離した核酸に障害を与えることとなり好ましくない。なお、多価アニオン塩溶液の濃度とインキュベートする温度の最適化、ＰＣＲ法の適用を考えると、核酸の脱離する割合が同程度ならば、核酸脱離用多価アニオン塩溶液は低塩下であることが好ましいので、多価アニオン塩の濃度を低く設定するとよい。 The polyvalent anion salt solution is added onto the particles adsorbed with a large amount of nucleic acid, and incubated at a predetermined temperature, and then the nucleic acid is desorbed. The incubation temperature is 10 ° C to 90 ° C, preferably 20 ° C to 80 ° C. If the incubation temperature is less than 10 ° C., the nucleic acid is hardly detached, and if it is 90 ° C. or higher, the detached nucleic acid is undesirably damaged. Considering the optimization of the concentration of the polyvalent anion salt solution, the incubation temperature, and the application of the PCR method, the polyvalent anion salt solution for nucleic acid detachment should be under low salt if the rate of nucleic acid desorption is about the same. It is preferable that the concentration of the polyvalent anion salt is set low.
本発明において、吸着した核酸を多価アニオン塩溶液によって脱離した核酸等の定量は、核酸が吸着した微粒子に多価アニオン塩溶液を加えた後の上澄み溶液に遊離している核酸を測定することにより行う。 In the present invention, quantification of nucleic acid or the like obtained by desorbing adsorbed nucleic acid with a polyvalent anion salt solution is performed by measuring the nucleic acid released in the supernatant solution after adding the polyvalent anion salt solution to the fine particles adsorbed with the nucleic acid. By doing.
＜ＰＣＲ法への適用＞
本発明においては、上記核酸の抽出方法を従来のＰＣＲ法に統合することができる。すなわち、本発明の核酸の抽出方法により吸着、脱離し、抽出した核酸をテンプレートし、核酸増幅物とすることができる。特に、本発明の場合、水溶液で核酸抽出を行うことができるので酵素阻害等の悪影響を防止することができる。ＰＣＲは、核酸抽出物を所定の温度で、所定時間反応、変性させた後、伸長させた。ＰＣＲ法を適用して得られた核酸増幅物は電気泳動後、染色により生じるバンドの有無により、確認することができる。
<Application to PCR method>
In the present invention, the nucleic acid extraction method can be integrated into a conventional PCR method. That is, it can be adsorbed and desorbed by the nucleic acid extraction method of the present invention, and the extracted nucleic acid can be used as a template to obtain a nucleic acid amplification product. In particular, in the case of the present invention, since nucleic acid extraction can be performed with an aqueous solution, adverse effects such as enzyme inhibition can be prevented. In PCR, the nucleic acid extract was reacted and denatured at a predetermined temperature for a predetermined time, and then extended. The nucleic acid amplification product obtained by applying the PCR method can be confirmed by the presence or absence of a band generated by staining after electrophoresis.
さらに本発明においては、核酸抽出方法によって抽出され、ＰＣＲ法により増幅された核酸増幅産物を用いて、更にＳＮＰ自動検出を行うことができる。ＳＮＰ検出は、特に限定されるものでなく、従来の方法にしたがって行うことができる。例えば、核酸増幅産物を緩衝溶液中で固定化した後、アルカリ処理により核酸を１本鎖化とし、標識した検出プローブとハイブリタイズを行い、標識した検出プローブを遊離させることによって行うことができる。 Furthermore, in the present invention, automatic SNP detection can be further performed using a nucleic acid amplification product extracted by the nucleic acid extraction method and amplified by the PCR method. SNP detection is not particularly limited, and can be performed according to a conventional method. For example, after the nucleic acid amplification product is immobilized in a buffer solution, the nucleic acid is made into a single strand by alkali treatment, hybridized with a labeled detection probe, and the labeled detection probe is released.
以下、本発明につき、実施例を用いて説明するが、本発明は、なんらこれに限定されるものではない。
＜粒子の調整＞
粒子として、磁性細菌粒子を使用した。磁性細菌粒子は磁性細菌をＭＳＧＭ培地１００Ｌとし、室温にて７日間、微好気条件下で培養した菌体から分離した。さらに、１００００×g、４℃にて連続遠心集菌し、２０mM トリス塩酸緩衝液(Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、PH7.0)で３回洗浄をした。遠心分離で得られた磁性細菌を トリス塩酸緩衝液(Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、PH7.0)に懸濁し、フレンチプレス（有限会社大岳製作所製、商品名５５０１Ｍ）を使用して１５００ｋｇ／cｍ2で破砕した。その後、ネオジムーボロン（Ｎｄ−Ｂ）磁石を用いて菌体破砕液から磁性細菌粒子を磁気分離した。回収した磁性粒子は、１０ｍＭＰＢＳ緩衝液中に保存した。
Hereinafter, although this invention is demonstrated using an Example, this invention is not limited to this at all.
<Particle adjustment>
Magnetic bacteria particles were used as the particles. The magnetic bacterial particles were separated from the bacterial cells cultured under microaerobic conditions for 7 days at room temperature using magnetic bacteria as 100 L of MSGM medium. Further, the cells were collected by continuous centrifugation at 10000 × g and 4 ° C., and washed 3 times with 20 mM Tris-HCl buffer (Tris-HCl buffer, PH7.0). The magnetic bacteria obtained by centrifugation are suspended in Tris-HCl buffer (Tris-HCl buffer, PH7.0) and crushed at 1500 kg / cm 2 using a French press (trade name 5501M, manufactured by Otake Seisakusho Co., Ltd.). did. Thereafter, magnetic bacterial particles were magnetically separated from the bacterial cell disruption solution using a neodymium-boron (Nd-B) magnet. The collected magnetic particles were stored in 10 mM PBS buffer.
＜磁性細菌粒子の脂質二重膜の除去＞
緩衝溶液に保存した上記磁性細菌微粒子を形成するマグネタイトの結晶表面に存在するヒドロキシル基を露出させるために、ドジデル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ：界面活性剤）により脂質二重膜を除去した。磁性細菌粒子１０ｍｇを１％界面活性剤（ＳＤＳ）溶液１mlに懸濁し、１時間煮沸させた。煮沸段階においては、５分ごとに磁性細菌粒子を超音波分散させた。その後、超純水及びメタノールで洗浄した。
<Removal of lipid bilayer from magnetic bacterial particles>
In order to expose the hydroxyl group present on the surface of the magnetite crystal that forms the magnetic bacterial microparticles stored in the buffer solution, the lipid bilayer was removed with sodium dodider sulfate (SDS: surfactant). 10 mg of magnetic bacterial particles were suspended in 1 ml of 1% surfactant (SDS) solution and boiled for 1 hour. In the boiling stage, magnetic bacterial particles were ultrasonically dispersed every 5 minutes. Thereafter, it was washed with ultrapure water and methanol.
＜アミノ基修飾磁性細菌粒子の作製＞
脂質二重膜を除去した磁性細菌粒子を１ｍｇ取り、粒子表面のヒドロキシル基を活性化させるため表面処理を行った。表面処理は、上記磁性細菌粒子をＡＰＭ溶液（アンモニア過水、水：水酸化アンモニウム：過酸化水素＝５：１：１の割合で混合した溶液）に懸濁させ、６０℃で３０分間、超音波を使用して分散させた。分散後の磁性細菌粒子を超純水で洗浄し、メタノール、メタノール／トルエン（１：１）、脱水トルエンの順に置換し洗浄を行った。次に、アミノシランカップリング剤として、３-[２-(２-アミノエチル)-エチルアミン]-プロピルトリメトキシシラン（ＡＥＥＡ）使用し、該アミノシランカップリング剤をトルエンに溶解して１％溶液とした。この溶液１ｍｌをとり磁性細菌粒子とカップリング反応させた。反応条件は６０℃で１０分間行い、常時超音波で磁性細菌粒子を分散させた。カップリング反応後の磁性細菌粒子を磁気回収し、洗浄を行った。洗浄はエタノール、メタノール置換し、メタノール洗浄は５回繰り返した。
<Preparation of amino group-modified magnetic bacterial particles>
1 mg of magnetic bacterial particles from which the lipid bilayer membrane had been removed was taken and subjected to surface treatment to activate the hydroxyl groups on the particle surface. In the surface treatment, the magnetic bacterial particles are suspended in an APM solution (a mixture of ammonia in water, water: ammonium hydroxide: hydrogen peroxide = 5: 1: 1), and the suspension is kept at 60 ° C. for 30 minutes. Dispersed using acoustic waves. The dispersed magnetic bacterial particles were washed with ultrapure water, and washed with methanol, methanol / toluene (1: 1) and dehydrated toluene in that order. Next, 3- [2- (2-aminoethyl) -ethylamine] -propyltrimethoxysilane (AEEA) was used as an aminosilane coupling agent, and the aminosilane coupling agent was dissolved in toluene to make a 1% solution. . 1 ml of this solution was taken and reacted with magnetic bacterial particles. The reaction was performed at 60 ° C. for 10 minutes, and magnetic bacteria particles were always dispersed with ultrasonic waves. The magnetic bacterial particles after the coupling reaction were magnetically recovered and washed. The washing was replaced with ethanol and methanol, and the methanol washing was repeated 5 times.
このように作製したアミノ基修飾磁性細菌粒子の表面上のアミノ基数をサルフォサクシイミド６-[3'-(2-ピリジルジチオール)-プロピオンアミド]ヘキサノエイト（sulfo-LC-SPDP）を使用し測定した。上記アミノ基修飾磁性細菌粒子を１００μgとり、上澄みを取り除き、超純水で置換した後、５mMのサルフォサクシイミド６-[3'-(2-ピリジルジチオール)-プロピオンアミド]ヘキサノエイト（sulfo-LC-SPDP）、１００μｌに懸濁して、室温にて３０分インキュベートした。磁性細菌粒子を５分毎に超音波により分散させた。分散後、上澄みを磁気分離により取り除いた。 The number of amino groups on the surface of amino group-modified magnetic bacterial particles prepared in this way was measured using sulphosuccinimide 6- [3 '-(2-pyridyldithiol) -propionamide] hexanoate (sulfo-LC-SPDP) did. Take 100 μg of the amino group-modified magnetic bacterial particles, remove the supernatant, replace with ultrapure water, and then add 5 mM sulphosuccinimide 6- [3 ′-(2-pyridyldithiol) -propionamide] hexanoate (sulfo-LC). -SPDP), suspended in 100 μl and incubated at room temperature for 30 minutes. Magnetic bacterial particles were dispersed ultrasonically every 5 minutes. After dispersion, the supernatant was removed by magnetic separation.
次に、超純水１００μｌを加え、超音波で磁性細菌粒子を攪拌することにより該磁性細菌粒子の洗浄を行い、非特異的に吸着したサルフォサクシイミド６-[3'-(2-ピリジルジチオール)-プロピオンアミド]ヘキサノエイト（sulfo-LC-SPDP）を除去した。この工程を３回繰り返し、超純水を除き、２０ｍＭのＤＴＴ２００μｌに粒子を懸濁し、５分毎に超音波で分散させながら、室温で３０分インキュベートした。サルフォサクシイミド６-[3'-(2-ピリジルジチオール)-プロピオンアミド]ヘキサノエイト（sulfo-LC-SPDP）のジスルフィド結合の開裂によって遊離した２−ピリジルチオールの３４３ｎｍの吸収を測定することにより磁性細菌粒子表面上のアミノ基を測定した。なお、２−ピリジルチオールの検出には紫外線可視分光度計（島津製作所製ＵＶ−１６００）により行った。測定の結果、磁性細菌粒子１粒あたり１．２×１０５のアミノ基が存在していることが明らかとなった。 Next, 100 μl of ultrapure water was added, and the magnetic bacterial particles were washed by stirring with ultrasonic waves, and nonspecifically adsorbed sulfosuccinimide 6- [3 ′-(2-pyridyl) Dithiol) -propionamido] hexanoate (sulfo-LC-SPDP) was removed. This process was repeated three times, the ultrapure water was removed, the particles were suspended in 200 μl of 20 mM DTT, and incubated at room temperature for 30 minutes while being dispersed ultrasonically every 5 minutes. The magnetism of sulfosuccinimide 6- [3 '-(2-pyridyldithiol) -propionamide] hexanoate (sulfo-LC-SPDP) is measured by measuring the absorption at 343 nm of 2-pyridylthiol released by cleavage of the disulfide bond. Amino groups on the surface of bacterial particles were measured. In addition, the detection of 2-pyridylthiol was performed with an ultraviolet-visible spectrophotometer (Shimadzu Corporation UV-1600). As a result of the measurement, it was revealed that 1.2 × 10 5 amino groups were present per magnetic bacterial particle.
＜アミノ基修飾磁性細菌粒子によるλＤＮＡの吸着＞
上記アミノ基修飾磁性細菌粒子を使用して、λＤＮＡの吸着を行った。具体的には、上記作製したアミノ基修飾磁性細菌粒子を用い、核酸としてλＤＮＡを採択し、該核酸の吸着、脱離によるλＤＮＡの抽出を行った。具体的には、アミノ基修飾磁性細菌粒子１０μｇに所定の濃度のλＤＮＡ溶液４０μｌを加えた後、２０分間、２５℃でインキュベートし、同時に５分毎に超音波による磁性細菌粒子の分散を行った。その後、加えたλＤＮＡ溶液を回収して、磁性細菌粒子の洗浄を行った。さらに磁性細菌粒子の洗浄を３回繰り返した。加えたλＤＮＡの量から洗浄後に上澄み溶液に存在するλＤＮＡの量の合計を差し引きして、磁性細菌微粒子によるλＤＮＡの吸着量とした。測定の結果、磁性細菌微粒子１０μｇあたり、６００ｎｇのλＤＮＡを吸着することができた。測定結果を図１に示す。
<Adsorption of λDNA by amino group-modified magnetic bacterial particles>
ΛDNA was adsorbed using the amino group-modified magnetic bacterial particles. Specifically, λDNA was adopted as the nucleic acid using the amino group-modified magnetic bacterial particles prepared above, and λDNA was extracted by adsorption and desorption of the nucleic acid. Specifically, 40 μl of a λDNA solution having a predetermined concentration was added to 10 μg of amino group-modified magnetic bacterial particles, and then incubated for 20 minutes at 25 ° C., and at the same time, the magnetic bacterial particles were dispersed by ultrasound every 5 minutes. . Thereafter, the added λDNA solution was recovered, and the magnetic bacterial particles were washed. Furthermore, washing of the magnetic bacteria particles was repeated 3 times. The total amount of λDNA present in the supernatant solution after washing was subtracted from the amount of λDNA added to obtain the amount of λDNA adsorbed by the magnetic bacterial microparticles. As a result of the measurement, 600 ng of λDNA could be adsorbed per 10 μg of magnetic bacterial fine particles. The measurement results are shown in FIG.
＜アミノ基修飾磁性細菌粒子に吸着したλＤＮＡの脱離＞
（実施例１）
アミノ基修飾磁性細菌粒子１０μｇにリン酸ナトリウム緩衝溶液（２０ｍＭ リン酸水素ナトリウム溶液、塩化ナトリウム溶液１１．３７ｇ／１００ｍｌ、ＰＨ８．２、イオン強度を２．０Ｉ）を加え、室温で２０分間インキュベートした。インキュベートと同時に５分ごとに超音波で磁性細菌粒子を攪拌した。２０分間後、磁性細菌粒子を磁気回収して、上澄み液中に存在する脱離したλＤＮＡを定量した。その結果、吸着したλＤＮＡ６００ｎｇの５１％を脱離、抽出することができた。なお、λＤＮＡの定量には、ＤＮＡ定量試薬であるPicoGreen（モレキュラープローブ社製）を使用した。測定結果を図２に示す。
<Desorption of λDNA adsorbed on amino group-modified magnetic bacterial particles>
Example 1
Sodium phosphate buffer solution (20 mM sodium hydrogen phosphate solution, sodium chloride solution 11.37 g / 100 ml, PH 8.2, ionic strength 2.0I) was added to 10 μg of amino group-modified magnetic bacterial particles and incubated at room temperature for 20 minutes. . Simultaneously with the incubation, the magnetic bacterial particles were stirred with an ultrasonic wave every 5 minutes. After 20 minutes, the magnetic bacterial particles were magnetically recovered and the detached λDNA present in the supernatant was quantified. As a result, 51% of 600 ng of adsorbed λDNA could be desorbed and extracted. For quantification of λDNA, PicoGreen (manufactured by Molecular Probes), which is a DNA quantification reagent, was used. The measurement results are shown in FIG.
（実施例２及び３、比較例１）
多価アニオン塩溶液として、リン酸ナトリウム緩衝溶液に代えて、実施例２：トリス塩酸緩衝液(Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー)、実施例３：ヘペス緩衝液（ＨＥＰＥＳバッファー）、比較例１：塩化ナトリウム溶液を使用した以外は実施例１と同様にしてλＤＮＡの脱離、抽出を行い、同様に抽出したλＤＮＡの割合を測定した。測定結果を図２に示す。
(Examples 2 and 3, Comparative Example 1)
As a polyvalent anion salt solution, instead of sodium phosphate buffer solution, Example 2: Tris-HCl buffer (Tris-HCl buffer), Example 3: Hepes buffer (HEPES buffer), Comparative example 1: Sodium chloride solution ΛDNA was desorbed and extracted in the same manner as in Example 1 except that was used, and the proportion of λDNA extracted was measured in the same manner. The measurement results are shown in FIG.
＜リン酸ナトリウム緩衝溶液の濃度について＞
（実施例４〜実施例７）
多価アニオン塩溶液として、リン酸ナトリウム緩衝溶液を使用し、ＤＮＡ脱離の温度を２５℃とし、その濃度を変化させた以外は、実施例１と同様にしてλＤＮＡの脱離、抽出を行った。λＤＮＡの抽出量の測定結果を図３に示す。
（実施例８〜実施例１１）
λＤＮＡ脱離の温度を８０℃とした以外は実施例４と同様にしてλＤＮＡの脱離、抽出を行った。λＤＮＡの抽出量の測定結果を図３に示す。
<Concentration of sodium phosphate buffer solution>
(Example 4 to Example 7)
ΛDNA was desorbed and extracted in the same manner as in Example 1 except that a sodium phosphate buffer solution was used as the polyvalent anion salt solution, the temperature of DNA desorption was 25 ° C., and the concentration was changed. It was. The measurement results of the amount of λDNA extracted are shown in FIG.
(Examples 8 to 11)
λDNA was desorbed and extracted in the same manner as in Example 4 except that the temperature of λDNA desorption was 80 ° C. The measurement results of the amount of λDNA extracted are shown in FIG.
図１〜図３からも明らかなように、多価アニオン塩溶液として、リン酸ナトリウム緩衝溶液を使用し、温度を８０℃に設定することにより、アミノ基修飾磁性細菌粒子に吸着した多量のλＤＮＡをほぼ１００％という極めて高効率で脱離し、抽出することができることが理解される。 As is clear from FIGS. 1 to 3, by using a sodium phosphate buffer solution as the polyvalent anion salt solution and setting the temperature to 80 ° C., a large amount of λDNA adsorbed on the amino group-modified magnetic bacterial particles. Can be desorbed and extracted with a very high efficiency of almost 100%.
＜抽出したλＤＮＡのＰＣＲ法による増幅＞
（実施例１２）
８７ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液を使用し、脱離し抽出したλＤＮＡを１．０μｌ採取し、全量５０μｌで、ＰＣＲを行った。ＰＣＲのターゲットとしては、λＤＮＡに特異な配列でリアルタイムＰＣＲの推奨されているプロトコル（Biocompare@：The buyer's guide for life science）に用いられているものを使用した。
<Amplification of extracted λDNA by PCR method>
(Example 12)
Using 87 mM sodium phosphate buffer solution, 1.0 μl of the desorbed and extracted λDNA was collected, and PCR was performed in a total volume of 50 μl. As a PCR target, a sequence specific to λDNA and used in a protocol recommended for real-time PCR (Biocompare @: The buyer's guide for life science) was used.
その配列は、フォワードプライマー:5'-ＧＣＡＡＧＴＡＴＣＧＴＴＴＣＣＡＣＣＧＴ-３'およびリバースプライマー: 5'-ＴＴＡＴＡＡＧＴＣＴＡＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＣ-３'である。 The sequences are: forward primer: 5′-GCAAGTATCGTTTCACCACCGT-3 ′ and reverse primer: 5′-TTATAAGTCTAATGAAGAAAATCCC-3 ′.
ＰＣＲ反応は２．５Ｕ ＴａｑＤＮＡ ポリメラーゼ 、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．２μＭ プライマー、１．５ｍＭの塩化マグネシウムを含むＰＣＲ中バッファー中、全量５０μｌで行った。ＰＣＲ反応の条件は、９５℃で１０秒、６０℃で１５秒、７２℃で２０秒を３５サイクルで行い、その後７２℃で５分間伸長させた。ＰＣＲ反応後のＰＣＲ増幅産物は３．０％アガロースを用いて電気泳動を行い、電気泳動後エチルブロマイドで染色して確認をした。結果を図４に示す。なお、電気泳動は、パルスフィールド電気泳動用関連機器CHEF−Mapper(バイオラッド社製)を使用して行った。 The PCR reaction was performed in a total volume of 50 μl in a buffer during PCR containing 2.5 U Taq DNA polymerase, 0.2 mM dNTPs, 0.2 μM primer, 1.5 mM magnesium chloride. The PCR reaction conditions were 95 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 15 seconds and 72 ° C. for 20 seconds in 35 cycles, followed by extension at 72 ° C. for 5 minutes. The PCR amplification product after the PCR reaction was subjected to electrophoresis using 3.0% agarose, and after electrophoresis, it was stained with ethyl bromide for confirmation. The results are shown in FIG. Electrophoresis was performed using a related device CHEF-Mapper (manufactured by Bio-Rad) for pulse field electrophoresis.
（実施例１３）
リン酸ナトリウム緩衝溶液の濃度を６９０ｍＭとした以外は実施例１２と同様にして行った。抽出したλＤＮＡのＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ増幅産物の電気泳動を行った。結果を図４に示す。
(Example 13)
The same operation as in Example 12 was carried out except that the concentration of the sodium phosphate buffer solution was changed to 690 mM. The extracted λDNA was subjected to PCR reaction, and the PCR amplification product was electrophoresed. The results are shown in FIG.
図４から、リン酸ナトリウム緩衝溶液の濃度を８７ｍＭとした場合にはＰＣＲ阻害性が全く見られないことが明瞭に理解される。 From FIG. 4, it is clearly understood that no PCR inhibition is observed when the concentration of the sodium phosphate buffer solution is 87 mM.
＜ヒト全血からのＤＮＡ吸着と分離、抽出及びＰＣＲ法による増幅＞
（実施例１５）
ヒト全血１５μｌに対して、溶解バッファー（５．０Ｍ Urea、４％ Tween 20 、２０mM MES PH 5.0 、Protenase K ０．１mg／ｍｌ）を２５μｌ加え、これに実施例１で用いたアミノ基修飾磁性細菌粒子を１０μｇ混合した。これを５６℃で２０分間インキュベートし、同時に５分毎に超音波で該磁性細菌粒子を分散させた。その後、磁性細菌粒子を磁気回収した後、磁性細菌粒子を溶解バッファーで３回洗浄した。さらに、濃度８７ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液を４０μｌ加え、２０分間インキュベートした。同時に５分毎に超音波により、磁性細菌粒子を磁気回収して、上澄み溶液のλＤＮＡを実施例１と同様に定量した。
<Adsorption and separation of DNA from human whole blood, extraction and amplification by PCR method>
(Example 15)
25 μl of lysis buffer (5.0 M Urea, 4% Tween 20, 20 mM MES PH 5.0, Protenase K 0.1 mg / ml) was added to 15 μl of human whole blood, and the amino group-modified magnetism used in Example 1 was added thereto. 10 μg of bacterial particles were mixed. This was incubated at 56 ° C. for 20 minutes, and at the same time, the magnetic bacterial particles were dispersed with ultrasonic waves every 5 minutes. Thereafter, the magnetic bacterial particles were magnetically recovered, and then the magnetic bacterial particles were washed with a lysis buffer three times. Furthermore, 40 μl of 87 mM sodium phosphate buffer solution was added and incubated for 20 minutes. At the same time, magnetic bacteria particles were magnetically collected by ultrasonic waves every 5 minutes, and λDNA of the supernatant solution was quantified in the same manner as in Example 1.
その結果、λＤＮＡ抽出量は、２３０ｎｇ／１５μｌ-Ｂｌｏｏｄであり、これを濃度換算すると、５．７ｎｇ／μｌであった。更にλＤＮＡ抽出後の上澄み溶液１μｌをＰＣＲのテンプレートとし、その阻害性を検出した（ターゲットはアルデヒド脱酵素ＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基変異を含む６３ｂｐ）。測定結果を図５に示す。 As a result, the amount of λDNA extracted was 230 ng / 15 μl-Blood, which was 5.7 ng / μl in terms of concentration. Furthermore, 1 μl of the supernatant solution after λDNA extraction was used as a template for PCR, and its inhibition was detected (target was 63 bp containing a single base mutation of aldehyde dehydrogenase ALDH2 gene). The measurement results are shown in FIG.
図５に示すように、ヒト全血から多量の核酸を吸着、分離し抽出することができ、しかも抽出した核酸をＰＣＲにより増幅することができる。また、増幅された核酸は、ＰＣＲ阻害性を有していないものであることが明瞭に理解される。 As shown in FIG. 5, a large amount of nucleic acid can be adsorbed, separated and extracted from human whole blood, and the extracted nucleic acid can be amplified by PCR. In addition, it is clearly understood that the amplified nucleic acid has no PCR inhibitory property.
＜増幅されたλＤＮＡのＳＮＰ検出＞
（実施例１６）
上記実施例１５で得られた１０μｌのＰＣＲ増幅産物（片側の鎖にビオチン標識されている。）を２５μｇのストレプトアビジン固定化磁性ビーズ（ダイナル社製、商品名Ｍ−２８０）を含む１２．５μｌのＴＥＮバッファー中（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー 1ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ 塩化ナトリウム溶液）で反応させ、ビーズ上にＰＣＲ産物を固定化した。
<SNP detection of amplified λDNA>
(Example 16)
12.5 μl containing 25 μg of streptavidin-immobilized magnetic beads (manufactured by Dynal, trade name M-280) of 10 μl of the PCR amplification product obtained in Example 15 (labeled with biotin on one side). In TEN buffer (10 mM Tris-HCl buffer 1 mM EDTA, 2 M sodium chloride solution), and the PCR product was immobilized on the beads.
次に、５０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を用いて、ビーズ上のＰＣＲ産物をアルカリによる一本鎖化処理を行った後、５０ｐモルのＣｙ３もしくはＣｙ５標識されたＡＬＤＨ２遺伝子型判別用の検出プローブ（ＡＬＤＨ２＊１検出プローブ：5'-ＴＴＣＡＣＴＴＣＡＧＴＧＴＡＴ、ＡＬＤＨ２＊２検出プローブ：5'-ＴＴＣＡＣＴＴＴＡＧＴＧＴＡＴと２５℃でハイブリタイズさせた。その後３２℃まで加熱し、同温度のままＰＢＳバッファーを用いて３回洗浄することにより、未ハイブリタイズ、もしくは非特異吸着した検出したプローブを除去した。 Next, the PCR product on the beads was subjected to single-stranded treatment with alkali using 50 mM aqueous sodium hydroxide solution, and then 50 pmol of Cy3 or Cy5 labeled ALDH2 genotyping detection probe (ALDH2). * 1 Detection probe: 5′-TTCACTTCAGTGTAT, ALDH2 * 2 Detection probe: Hybridized with 5′-TTCACTTTAGTGATAT at 25 ° C. Heat to 32 ° C., then wash 3 times with PBS buffer at the same temperature. The detected probe that was not hybridized or non-specifically adsorbed was removed.
更に、８０℃で粒子上のＰＣＲ産物からハイブリタイズした検出プローブを遊離させ、標識されたＣｙ３もしくはＣｙ５の蛍光物質の蛍光強度をマイクリプレートリーダーにて測定した。測定結果を図６に示す。 Further, the detection probe hybridized from the PCR product on the particles was released at 80 ° C., and the fluorescence intensity of the labeled Cy3 or Cy5 fluorescent substance was measured with a microplate reader. The measurement results are shown in FIG.
図６に示すように、増幅された核酸に対して遺伝子型の判別が可能であることが示された。 As shown in FIG. 6, it was shown that genotype discrimination was possible for the amplified nucleic acid.
本発明の核酸の抽出方法は、核酸抽出の自動化技術に貢献することができるものであり、遺伝子診断やオーダーメイド医療等の発展が著しい医療分野の技術革新に寄与することができる。また、既存のＰＣＲ法及びＳＮＰ自動検出の統合化が可能なものとなり、遺伝子解析技術の向上に大きく寄与することができる革新的な技術となる。 The nucleic acid extraction method of the present invention can contribute to the automation technology of nucleic acid extraction, and can contribute to technological innovation in the medical field where remarkable developments such as genetic diagnosis and custom-made medical treatment are made. Moreover, it becomes possible to integrate the existing PCR method and SNP automatic detection, and it will be an innovative technology that can greatly contribute to the improvement of gene analysis technology.
Claims (6)
A nucleic acid extraction method according to any one of claims 1 to 5, wherein the extracted nucleic acid is amplified by a PCR (polymerase chain reaction) method, and the amplified nucleic acid fragment is further subjected to SNP (single nucleotide polymorphism). A SNP detection method comprising genotyping.
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