JP2006271375A - METHOD FOR DETECTING alpha-AMINOTRANSFERASE ACTIVITY, METHOD FOR MEASURING SPECIFIC ACTIVITY, SCREENING METHOD AND METHOD FOR DETERMINATING alpha-KETO ACID - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、α−アミノトランスフェラーゼの活性検出方法、比活性測定方法、並びにスクリーニング方法、及びα−ケト酸の定量方法に関する。 The present invention relates to an α-aminotransferase activity detection method, specific activity measurement method, screening method, and α-keto acid quantification method.
心疾患又は肝疾患の場合、アラニントランスアミナーゼやアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが血中に遊離することから、診断や治療の経過観察の指標として、これらアミノトランスフェラーゼの活性測定が繁用されている。 In the case of heart disease or liver disease, since alanine transaminase and aspartate aminotransferase are released into the blood, activity measurement of these aminotransferases is frequently used as an indicator for the follow-up of diagnosis and treatment.
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性の測定は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼに対し、Ｌ−アスパラギン酸及び２−オキソグルタル酸を基質として、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼによって生成されるオキサロ酢酸を、リンゴ酸脱水素酵素によってリンゴ酸に変え、このときの還元型ニコチンアミド補酵素の減少速度を、波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定することにより行われている。 The measurement of aspartate aminotransferase activity was carried out by using oxaloacetate produced by aspartate aminotransferase to malate by malate dehydrogenase using L-aspartate and 2-oxoglutarate as substrates for aspartate aminotransferase. The reduction rate of reduced nicotinamide coenzyme at this time is measured by measuring the absorbance at a wavelength of 340 nm.
しかし上記の方法は、還元型ニコチンアミド補酵素の減少速度を測定する方法であり、十分量の基質を反応系に加えることができないため、反応がすぐに飽和してしまい、定量可能な酵素濃度の上限が低い。従って、アミノトランスフェラーゼ活性の測定には、生成する還元型ニコチンアミド補酵素の吸光度の上昇に基づいて生体物質を測定する方法が好適である。 However, the above method is a method for measuring the decrease rate of reduced nicotinamide coenzyme, and since a sufficient amount of substrate cannot be added to the reaction system, the reaction is saturated immediately, and the quantifiable enzyme concentration The upper limit of is low. Therefore, for measuring aminotransferase activity, a method of measuring a biological substance based on an increase in absorbance of the reduced nicotinamide coenzyme produced is preferable.
アミノトランスフェラーゼにより生成するピルビン酸から、ピルビン酸デヒドロゲナーゼを用いて、還元型ニコチンアミド補酵素を生成させ、吸光度の上昇によりアミノトランスフェラーゼの活性測定を行う方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。また、この反応系はピルビン酸を定量する際にも用いられている。 A method is disclosed in which reduced nicotinamide coenzyme is produced from pyruvate produced by aminotransferase using pyruvate dehydrogenase, and the activity of aminotransferase is measured by increasing the absorbance (see, for example, Patent Document 1). ). This reaction system is also used when quantifying pyruvic acid.
しかしながら、上記の方法では、酵素としてピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体が用いられており、当該酵素複合体は３種の酵素が非共有結合で分子集合した複合体なので、高純度の酵素複合体を得ることが困難である。また、還元作用を示すコエンザイムＡを使用する必要があり、コエンザイムＡが測定値に影響を与えるおそれがあるという難点を有している。
以上のような事情に鑑み、本発明は、定量可能な酵素濃度範囲が広く、簡便にα−アミノトランスフェラーゼの活性を検出できる検出方法やα−ケト酸の定量方法などを提供することを目的としてなされた。 In view of the circumstances as described above, an object of the present invention is to provide a detection method capable of easily detecting the activity of α-aminotransferase, a method for quantifying α-keto acid, and the like, which have a wide quantifiable enzyme concentration range. Was made.
本発明は、以下によって構成される。 The present invention is constituted by the following.
（１）ω−アミノ化合物と、α−アミノトランスフェラーゼが触媒する酵素反応によって生じたα−ケト酸とを基質とし、ω−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物である含アルデヒド化合物を検出することを特徴とする、α−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。 (1) An aldehyde-containing compound which is a reaction product of an enzyme reaction using an ω-aminotransferase and an α-keto acid produced by an enzyme reaction catalyzed by α-aminotransferase as a substrate and ω-aminotransferase as a catalyst. A method for detecting α-aminotransferase activity, which comprises detecting the activity.
（２）含アルデヒド化合物の検出方法が、含アルデヒド化合物を基質とし、酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下、アルデヒドデヒドロゲナーゼを触媒とする酵素反応の生成物である還元型ニコチンアミド補酵素を検出する方法であることを特徴とする、前記第１項に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
(2) The method for detecting an aldehyde-containing compound detects a reduced nicotinamide coenzyme which is a product of an enzyme reaction using an aldehyde-containing compound as a substrate and an aldehyde dehydrogenase as a catalyst in the presence of oxidized nicotinamide coenzyme. The method for detecting α-aminotransferase activity according to the
（３）検体に、α−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸１とアミノ酸を加えてα−ケト酸２を生成させる工程と、α−ケト酸２とω−アミノ化合物とを、それらを基質とするω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させて、含アルデヒド化合物を生成させる工程と、含アルデヒド化合物を検出する工程とを有することを特徴とする、α−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
(3) a step of adding α-
（４）含アルデヒド化合物の検出工程が、酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下、含アルデヒド化合物に、含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型ニコチンアミド補酵素を検出する工程であることを特徴とする、前記第３項に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。 (4) The step of detecting the aldehyde-containing compound detects the reduced nicotinamide coenzyme produced by allowing the aldehyde-containing compound to act on an aldehyde dehydrogenase using the aldehyde-containing compound as a substrate in the presence of the oxidized nicotinamide coenzyme. 4. The method for detecting α-aminotransferase activity according to item 3, wherein the method is a step.
（５）α−アミノトランスフェラーゼが好熱菌由来である、前記第１項〜第４項の何れか１項に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
(5) The method for detecting α-aminotransferase activity according to any one of
（６）ω−アミノトランスフェラーゼが好熱菌由来である、前記第１項〜第４項の何れか１項に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
(6) The method for detecting α-aminotransferase activity according to any one of
（７）アルデヒドデヒドロゲナーゼが好熱菌由来である、前記第４項に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
(7) The method for detecting α-aminotransferase activity according to the
（８）α−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸１及びアミノ酸と、α−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、ω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物とを有する、α−アミノトランスフェラーゼ活性の検出用キット。
(8) ω-aminotransferase and α-aminotransferase using α-
（９）さらに、ω−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素とを有する、前記第８項に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出用キット。
(9) The detection of α-aminotransferase activity according to the
（１０）複数のα−アミノトランスフェラーゼのそれぞれに対し、α−ケト酸を用いて前記第１項〜第７項のいずれか１項に記載の検出方法を行うことを特徴とする、α−ケト酸をアミノ基転移反応によってアミノ酸に変換するためのα−アミノトランスフェラーゼのスクリーニング方法。
(10) The detection method according to any one of
（１１）α−ケト酸１と、このα−ケト酸１を基質とするα−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるアミノ酸と、このα−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、このω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物とを有する、α−ケト酸をアミノ基転移反応によってアミノ酸に変換するためのα−アミノトランスフェラーゼのスクリーニング用キット。
(11) α-
（１２）さらに、ω−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素とを有する、前記第１２項に記載のα−ケト酸をアミノ基転移反応によってアミノ酸に変換するためのα−アミノトランスフェラーゼのスクリーニング用キット。 (12) The α according to the above item 12, further comprising an aldehyde dehydrogenase having an aldehyde-containing compound as a substrate, which is a reaction product of an enzyme reaction catalyzed by ω-aminotransferase, and an oxidized nicotinamide coenzyme. -A screening kit for α-aminotransferase for converting keto acid to amino acid by transamination reaction.
（１３）複数のα−ケト酸のそれぞれに対し、α−アミノトランスフェラーゼを用いて前記第１項〜第７項に記載のいずれかの検出方法を行うことを特徴とする、α−アミノトランスフェラーゼ基質のスクリーニング方法。
(13) An α-aminotransferase substrate, wherein the detection method according to any one of
（１４）α−ケト酸を基質とするα−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるアミノ酸と、このα−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、このω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物とを有する、α−アミノトランスフェラーゼ基質のスクリーニング用キット。
(14) An amino acid that can be a substrate for α-aminotransferase using α-keto acid as a substrate, and ω using α-
（１５）さらに、ω−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素とを有することを特徴とする、前記第１４項に記載の特定のα−アミノトランスフェラーゼ基質のスクリーニング用キット。 (15) The 14th item, further comprising aldehyde dehydrogenase using an aldehyde-containing compound as a substrate, which is a reaction product of an enzyme reaction catalyzed by ω-aminotransferase, and an oxidized nicotinamide coenzyme. A kit for screening for a specific α-aminotransferase substrate according to the item.
（１６）ω−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸とω−アミノ化合物とを、ω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させ、アミノ酸及び含アルデヒド化合物を生成する第１の工程と、生成したアミノ酸のアミノ基を除去することにより、α−ケト酸を再生する第２の工程と、第１の工程及び第２の工程を繰り返すことによってα−ケト酸及び含アルデヒド化合物を増加させる第３の工程と、増加した含アルデヒド化合物を定量する第４の工程とを有することを特徴とする、α−ケト酸の定量方法。 (16) a first step of producing an amino acid and an aldehyde-containing compound by reacting an α-keto acid which can be a substrate of ω-aminotransferase with a ω-amino compound in the presence of ω-aminotransferase, A second step of regenerating α-keto acid by removing the amino group of the amino acid, and a third step of increasing α-keto acid and aldehyde-containing compound by repeating the first step and the second step. And a fourth step of quantifying the increased aldehyde-containing compound, and a method for quantifying α-keto acid.
（１７）第２の工程におけるアミノ酸からのアミノ基の除去方法が、α−アミノトランスフェラーゼを用いた酵素反応であることを特徴とする、前記第１６項に記載のα−ケト酸の定量方法。 (17) The method for quantifying α-keto acid according to item 16, wherein the method for removing an amino group from an amino acid in the second step is an enzymatic reaction using α-aminotransferase.
（１８）第４の工程における含アルデヒド化合物の定量方法が、含アルデヒド化合物に、酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下、含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型ニコチンアミド補酵素を定量する方法である、前記第１６項に記載のα−ケト酸の定量方法。 (18) The method for quantifying an aldehyde-containing compound in the fourth step is a reduced nicotinamide produced by reacting an aldehyde-containing compound with an aldehyde dehydrogenase using the aldehyde-containing compound as a substrate in the presence of an oxidized nicotinamide coenzyme. The method for quantifying α-keto acid according to Item 16, which is a method for quantifying a coenzyme.
（１９）α−アミノトランスフェラーゼが好熱菌由来である、前記第１６項〜第１８項の何れか１項に記載のα−ケト酸の定量方法。 (19) The method for quantifying α-keto acid according to any one of Items 16 to 18, wherein α-aminotransferase is derived from a thermophilic bacterium.
（２０）ω−アミノトランスフェラーゼが好熱菌由来である、前記第１６項〜第１８項の何れか１項に記載のα−ケト酸の定量方法。 (20) The method for quantifying α-keto acid according to any one of items 16 to 18, wherein ω-aminotransferase is derived from a thermophilic bacterium.
（２１）アルデヒドデヒドロゲナーゼが好熱菌由来である、前記第１８項に記載のα−ケト酸の定量方法。 (21) The method for quantifying α-keto acid according to Item 18, wherein the aldehyde dehydrogenase is derived from a thermophilic bacterium.
（２２）ω−アミノトランスフェラーゼと、ω−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるω−アミノ化合物と、ω−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物であるアミノ酸を基質とするα−アミノトランスフェラーゼと、α−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸とを有する、α−ケト酸の定量用キット。 (22) ω-aminotransferase, an ω-amino compound that can be a substrate of ω-aminotransferase, and an α-aminotransferase using an amino acid that is a reaction product of an enzyme reaction catalyzed by ω-aminotransferase as a substrate, A kit for quantification of α-keto acid, comprising α-keto acid which can be a substrate of α-aminotransferase.
（２３）さらに、ω−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素とを有する、前記第２２項に記載のα−ケト酸の定量用キット。 (23) The α according to the above item 22, further comprising an aldehyde dehydrogenase having an aldehyde-containing compound as a substrate, which is a reaction product of an enzyme reaction catalyzed by ω-aminotransferase, and an oxidized nicotinamide coenzyme. -Kit for determination of keto acid.
（２４）比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの所定量に、このα−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸１とアミノ酸を加えてα−ケト酸２を生成させる工程と、α−ケト酸２とω−アミノ化合物とを、それらを基質とするω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させて、含アルデヒド化合物を生成させる工程と、生成した含アルデヒド化合物を定量する工程と、比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを用いることにより生成された含アルデヒド化合物の量と、その際の当該α−アミノトランスフェラーゼの使用量との相関関係に、上記工程で測定した含アルデヒド化合物の生成量を照合し、比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの比活性を算出する工程とを有することを特徴とする、α−アミノトランスフェラーゼの比活性測定方法。
(24) adding α-
（２５）比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの所定量に、α−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸１とアミノ酸を作用させて、α−ケト酸２を生成させる工程と、α−ケト酸２とω−アミノ化合物とを、それらを基質とするω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させて、含アルデヒド化合物を生成させる工程と、この含アルデヒド化合物を、酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下、含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させて、還元型ニコチンアミド補酵素を生成させる工程と、生成した還元型ニコチンアミド補酵素の吸光度を測定する工程と、比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを用いることにより生成された還元型ニコチンアミド補酵素の吸光度、その際の当該α−アミノトランスフェラーゼの使用量との相関関係に、上記工程で測定した還元型ニコチンアミノ補酵素の吸光度を照合し、比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの比活性を算出する工程とを有することを特徴とする、α−アミノトランスフェラーゼの比活性測定方法。
(25) a step of producing α-
（２６）α−アミノトランスフェラーゼが好熱菌由来である、前記第２４項または第２５項に記載のα−アミノトランスフェラーゼの比活性測定方法。 (26) The method for measuring the specific activity of α-aminotransferase according to Item 24 or 25, wherein α-aminotransferase is derived from a thermophilic bacterium.
（２７）ω−アミノトランスフェラーゼが好熱菌由来である、前記第２４項または第２５項に記載のα−アミノトランスフェラーゼの比活性測定方法。 (27) The method for measuring the specific activity of α-aminotransferase according to Item 24 or 25, wherein ω-aminotransferase is derived from a thermophilic bacterium.
（２８）アルデヒドデヒドロゲナーゼが好熱菌由来である、前記第２５項に記載のα−アミノトランスフェラーゼの比活性測定方法。 (28) The method for measuring the specific activity of α-aminotransferase according to Item 25, wherein the aldehyde dehydrogenase is derived from a thermophilic bacterium.
（２９）比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸１及びアミノ酸と、α−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、ω−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるω−アミノ化合物とを有する、α−アミノトランスフェラーゼの比活性測定用キット。
(29) α-
（３０）さらに、ω−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素とを有することを特徴とする、前記第２９項に記載のα−アミノトランスフェラーゼの比活性測定用キット。 (30) The α- of item 29, further comprising an aldehyde dehydrogenase using an aldehyde-containing compound as a substrate, which is a reaction product of ω-aminotransferase, and an oxidized nicotinamide coenzyme. A kit for measuring the specific activity of aminotransferase.
（３１）さらに、比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを含むことを特徴とする前記第２９項または第３０項に記載のα−アミノトランスフェラーゼの比活性測定用キット。
(31) The kit for measuring the specific activity of α-aminotransferase according to
本発明によれば、たとえば、広い酵素濃度範囲で、簡便にα−アミノトランスフェラーゼの活性が検出または定量でき、さらには、α−ケト酸が定量可能である。 According to the present invention, for example, the activity of α-aminotransferase can be easily detected or quantified in a wide enzyme concentration range, and further α-keto acid can be quantified.
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。 Unless otherwise stated in the embodiments and examples, J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K. Struhl (Ed.), Standard Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. The method described in the protocol collection, or a modified or modified method thereof is used. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, unless otherwise explained, protocols attached to them are used.
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。 The objects, features, advantages, and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification. it can. The embodiments and specific examples of the invention described below show preferred embodiments of the present invention and are shown for illustration or explanation, and the present invention is not limited to them. It is not limited. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made based on the description of the present specification within the spirit and scope of the present invention disclosed herein.
＜１＞α−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法
本発明に従って、検体中のα−アミノトランスフェラーゼの活性を検出するスキームを以下に示す。
まず、検体中で、アミノ基受容体としてのα−ケト酸１と、アミノ基供与体としてのアミノ酸１を作用させる。検体にα−アミノトランスフェラーゼの活性がある場合には、その触媒作用によりアミノ酸２とα−ケト酸２が生成する。次に、生成したα−ケト酸２をアミノ基受容体とし、アミノ基供与体としてのω−アミノ化合物を、ω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させて、含アルデヒド化合物を生成させる。この含アルデヒド化合物を検出することにより、α−アミノトランスフェラーゼ活性を検出する。
First, α-
ここで、検体中に、十分なα−ケト酸１、アミノ酸１、ω−アミノ化合物、ω−アミノトランスフェラーゼが含まれていないと、この反応過程は進まないか、反応に時間がかかるため、含アルデヒド化合物が検出できない。そこで、検出の際には、それらのうち不足すると思われる成分を反応液に加えることが好ましい。この場合、α−ケト酸１及びアミノ酸１は、検出するα−アミノトランスフェラーゼの基質になることができる化合物を選択する。α−ケト酸２は、検出対象のα−アミノトランスフェラーゼによって生成されるため、ω−アミノトランスフェラーゼは、その生成されたα−ケト酸２を基質として用いることのできる酵素を選択する。そして、ω−アミノ化合物は、選択されたω−アミノトランスフェラーゼが基質として用いることができる化合物を選択する。
Here, if sufficient α-
アミノ酸１としてはその入手しやすさや溶解性の観点から、グルタミン酸、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、メチオニン、バリン、セリン等のアミノ酸を用いることができる。検出対象のα−アミノトランスフェラーゼがＬ−アミノトランスフェラーゼの場合はＬ−アミノ酸を、Ｄ−アミノトランスフェラーゼの場合はＤ−アミノ酸を、不明の場合はＤＬ−アミノ酸をそれぞれ用いることが好ましい。
As
α−ケト酸１としてはその入手しやすさや溶解性の観点からピルビン酸、２−ケトグルタル酸、オキザロ酢酸、フェニルピルビン酸、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、２−オキソイソペンタン酸、４−メチル−２−オキソペンタン酸、３−メチル−２−オキソペンタン酸、フェニルグリオキシル酸等があげられるが、これらα−ケト酸のうち、使用するω−アミノトランスフェラーゼが基質として認識しない化合物、または認識しても活性が非常に弱い化合物を選択することが好ましい。
As α-
ω−アミノ化合物は、構造の末端にアミノ基を有する化合物を示し、例示すれば、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、プロピレンジアミン、ブチレンジアミン、１−アミノプロパン、１−アミノブタン、１−アミノペンタン、ベンジルアミン、β−アラニン、６−アミノヘキサン酸、５−アミノペンタン酸、４−アミノブタン酸等があげられる。 The ω-amino compound indicates a compound having an amino group at the end of the structure. For example, ethylenediamine, diethylenetriamine, propylenediamine, butylenediamine, 1-aminopropane, 1-aminobutane, 1-aminopentane, benzylamine, β -Alanine, 6-aminohexanoic acid, 5-aminopentanoic acid, 4-aminobutanoic acid and the like.
α−アミノトランスフェラーゼとは、α−アミノ酸のアミノ基をα−ケト酸に転移して、別のα−ケト酸と別のα−アミノ酸を生じる反応を触媒する酵素群のことである。具体的には、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．５）、芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．５７）、ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．９）、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．５２）、セリン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．４５）、セリン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．５１）、アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．４４）、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．４２）、及びＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．２１）等の各ファミリーに属する酵素を例示できる。 α-Aminotransferase is a group of enzymes that catalyze a reaction in which the amino group of an α-amino acid is transferred to α-keto acid to produce another α-keto acid and another α-amino acid. Specifically, aspartate aminotransferase (EC 2.6.1.1), tyrosine aminotransferase (EC 2.6.1.5), aromatic amino acid aminotransferase (EC 2.6.157), Histidinol phosphate aminotransferase (EC 2.6.1.9), phosphoserine aminotransferase (EC 2.6.1.52), serine-glyoxylate aminotransferase (EC 2.6.1.45), Serine-pyruvate aminotransferase (EC 2.6.1.51), alanine-glyoxylate aminotransferase (EC 2.6.1.44), branched chain amino acid aminotransferase (EC 2.6.1.42), And D-alanine aminotransferase (EC2. Enzyme can be exemplified belonging to each family of .1.21) or the like.
また、酵素の具体例としては、Ｅ．ｃｏｌｉのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、酵母のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｔｉｍａのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｅｏｌｉｃｕｓのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉの芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｔｙｒＢ）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓの芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｔｙｒＢ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓの芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓの芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｅｏｌｉｃｕｓの芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼなどが挙げられる。 Specific examples of the enzyme include E.I. E. coli aspartate aminotransferase (aspC), yeast aspartate aminotransferase (AAT2), Bacillus circulans aspartate aminotransferase, Thermus aquaticus aspartate aminotransferase (aspC), Thermotogamer aspartic acid assimilate Aspartate aminotransferase, Sulfolobus solfataricus aspartate aminotransferase, Methanococcus aeolicus aspartate aminotransferase, Methanobacterium thermoau Aspartate aminotransferase otrophicum, E. E. coli aromatic amino acid aminotransferase (tyrB), Paracoccus aromatic amino acid aminotransferase (tyrB), Pyrococcus furiosus aromatic amino acid aminotransferase, Thermococcus litoralis aromatic amino acid aminotransferase, Methanococcus aeolicus Can be mentioned.
その他、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒのヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ（ｈｉｓＣ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｔｉｍａのヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ、酵母のホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＳｅｒＣ）、大腸菌のホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ｓｅｒＣ）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉのホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓのセリン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ｓｇａＡ）、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｍのセリン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ｓｇａＡ）、ウサギのセリン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（Ａｇｘｔ）、マウスのセリン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（Ａｇｘｔ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓのアラニンアミノトランスフェラーゼ、酵母のアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（Ａｇｘ１）などの酵素が挙げられる。 In addition, Acetobacter histidinol phosphate aminotransferase (hisC), Thermotoga martima histidinol phosphate aminotransferase, yeast phosphoserine aminotransferase (SerC), Escherichia coli phosphoserine aminotransferase (serC), Methanosarcina phospho phospho Serine aminotransferase, Myelobacterium extorquens serine-glyoxylate aminotransferase (sgaA), Hyphomicrobium methylovarum serine-glyoxylate aminotransferase (sgaA), Rabbit serine-pyruvate aminotransferase (Agxt) Mouse serine - pyruvate aminotransferase (Agxt), alanine aminotransferase Pyrococcus furiosus, alanine yeast - glyoxylate aminotransferase (AgX1) include enzymes such as.
また、ラットの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（Ｂｃａｔ）、Ｅ．ｃｏｌｉの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｉｌｖＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｅｏｌｉｃｕｓの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．のＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓのＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓのＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓのＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼなどの酵素も挙げることができる。 Also, rat branched chain amino acid aminotransferase (Bcat), E. coli. E. coli branched chain amino acid aminotransferase (ilvE), Bacillus cereus branched chain amino acid aminotransferase, Bacillus anthracis branched chain amino acid aminotransferase, Methanococcus aeolicus branched chain amino acid aminotransferase, Bacillus sp. Enzymes such as D-alanine aminotransferase (dat), Staphylococcus haemolyticus D-alanine aminotransferase (dat), Bacillus cereus D-alanine aminotransferase, Bacillus anthracis D-alanine aminotransferase, and the like.
さらに、近年のゲノム解析の成果より、多くの遺伝子がα−アミノトランスフェラーゼをコードしていることが示唆されている。このようなα−アミノトランスフェラーゼに対しても本発明は使用可能である。具体例としては、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＥ３２９７）やアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＥ１９６４、ＰＡＥ２２５１）など、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｉｓｓｙのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＢ０５２５、ＰＡＢ０７７４，ＰＡＢ１８１０）など、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｕｃａｎｉｕｍのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＴＶＧ０３９３５３５、ＴＶＧ０４８０７０５、ＴＶＧ０５５７３７９）やヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ（ＴＶＧ００７７１５９）などを例示することができる。 Furthermore, recent genome analysis results suggest that many genes encode α-aminotransferase. The present invention can also be used for such an α-aminotransferase. Specific examples include Pyrobaculum aerophyllum branched-chain amino acid aminotransferase (PAE3297) and aspartate aminotransferase (PAE1964, PAE2251), Pyrococcus abissy aspartate aminotransferase (PAB0525, PAB0774, PAB1810), and the like. Examples include transferases (TVG0393535, TVG0480705, TVG0557379) and histidinol phosphate aminotransferase (TVG0077159).
その他、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍのセリン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（Ｔａ１０１８）、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＶＮＧ０３８７Ｇ、ＶＮＧ２１２２Ｇ）など、Ａｅｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＦ０９３３）やヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＦ２００２、ＡＦ２０２４）など、Ｍｅｈｔａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＭＫ１６２７）など、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｉｃｉｎａ ｍａｚｅｉのセリン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＭＭ０２４６）やホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＭＭ２９１１）などのα−アミノトランスフェラーゼを例示することができる。 In addition, Thermoplasma acidophilum serine-glyoxylate aminotransferase (Ta1018), Halobacterium sp. Branched amino acid aminotransferase of Aerchaeoglobus fulgidus (AF0933) and histidinol phosphate aminotransferase (AF2002, AF2024), etc. Branched amino acid aminotransferase (AF2002, AF2024) Examples thereof include α-aminotransferases such as Methanosaricina mazei serine-pyruvate aminotransferase (MM0246) and phosphoserine aminotransferase (MM2911).
また、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＭＪ１００８）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのセリンアミノトランスフェラーゼ（ＰＨ１３０８）、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘのチロシンアミノトランスフェラーゼ（ＡＰＥ２５７５）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＳＴ１２２５）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｅの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＣＥ２０９５）など、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＳＡＶ６８０４）等のα−アミノトランスフェラーゼを例示することもできる。 Also, a branched-chain amino acid aminotransferase (MJ1008) of Methanocaldococcus jannaschii (MJ1008), a serine aminotransferase of Pyrococcus horikoshii (PH1308), a tyrosine aminotransferase of Aeropyrum pernixiparabistine (APE2575), a Sulforidic aminostyltransferase (APE2575) An α-aminotransferase such as Streptomyces avermitilis D-alanine aminotransferase (SAV6804) such as amino acid aminotransferase (CE2095) can also be exemplified.
検体に含まれる酵素は、単独であっても、２種以上であってもよい。酵素の由来は特に制限されず、動物、植物、細菌、酵母、カビ等、どのような生物に由来してもよい。 The enzyme contained in the specimen may be a single enzyme or two or more enzymes. The origin of the enzyme is not particularly limited, and may be derived from any organism such as an animal, a plant, a bacterium, a yeast, or a mold.
ω−アミノトランスフェラーゼとは、ω−アミノ化合物のアミノ基をα−ケト酸に転移して、含アルデヒド化合物とα−アミノ酸を生じる反応を触媒する酵素群のことである。特にここでは、検出するα−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物であるα−ケト酸を基質とするω−アミノトランスフェラーゼを用いる。 The ω-aminotransferase is a group of enzymes that catalyze a reaction in which an amino group of an ω-amino compound is transferred to α-keto acid to produce an aldehyde-containing compound and an α-amino acid. In particular, here, ω-aminotransferase using α-keto acid, which is a reaction product of α-aminotransferase to be detected, as a substrate is used.
本発明で使用できるω−アミノトランスフェラーゼとしては、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１１）、オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１３）、ω−アミノ酸−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１８）、４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１９）、及びＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．６２）等の各ファミリーに属する酵素が例示できる。 Examples of the ω-aminotransferase that can be used in the present invention include acetylornithine aminotransferase (EC 2.6.1.11), ornithine aminotransferase (EC 2.6.1.13), ω-amino acid-pyruvate aminotransferase ( Enzymes belonging to each family such as EC 2.6.1.18), 4-aminobutanoic acid aminotransferase (EC 2.6.1.19), and DAPA aminotransferase (EC 2.6.1.62) it can.
酵素の具体例としては、Ｅ．ｃｏｌｉのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ａｒｇＤ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ａｒｇＤ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａのω−アミノ酸−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ、酵母の４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＵＧＡ１）、Ｅ．ｃｏｌｉの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ｇａｂＴ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＡＢＡ）、Ｂｕｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（ｂｉｏＡ）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍのＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（ｂｉｏＡ）等が挙げられる。 Specific examples of the enzyme include E.I. E. coli acetylornithine aminotransferase (argD), Bacillus subtilis acetylornithine aminotransferase (argD), Pseudomonas putida omega-amino acid-pyruvate aminotransferase, yeast 4-aminobutanoate aminotransferase (UGA1), E. coli. E. coli 4-aminobutanoic acid aminotransferase (gabT), Aspergillus nidulans 4-aminobutanoic acid aminotransferase (GABA), Bucillus subtilis DAPA aminotransferase (bioA), Brevibacterium flavum DAPA aminotransferase (boA) and the like.
さらに、近年のゲノム解析の成果より、多くの遺伝子がω−アミノトランスフェラーゼをコードしていることが示唆されている。このようなω−アミノトランスフェラーゼも本発明に使用可能であることが予想される。具体例としては、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＥ１７９９）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＳＳＯ２７２７、ＳＳＯ３２１１）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＦ１２３２、ＰＦ１４２１）やアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＰＦ１６８５）やＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（ＰＦ１９０６）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＢ００８６、ＰＡＢ１９２１、ＰＡＢ２３８６）やアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＰＡＢ２４４０）等を例示することができる。 Furthermore, recent genome analysis results suggest that many genes encode ω-aminotransferases. It is expected that such ω-aminotransferase can also be used in the present invention. Specific examples include 4-aminobutanoic acid aminotransferase (PAE1799) from Pyrobaculum aerophilum, 4-aminobutanoic acid aminotransferase from Sulfolobus sofaraticus (SSO2727, SSO3211), 4-aminobutanoic acid aminotransferase from Pyrococcus furiosus (PF1232 and PF2132) Aminotransferase (PF1585), DAPA aminotransferase (PF1906), 4-aminobutanoic acid aminotransferase (PAB0086, PAB1921, PAB2386) of Pyrococcus abyssi, acetylornithine aminotransferase (PAB2440), etc. Can Shimesuru.
その他、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（Ｔａ００６８）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡＦ００８０、ＡＦ１８１５）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＭＴＨ１３３７）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＭＭ００４７、ＭＭ１４０６）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＭＡ０１１９、ＭＡ２８５９）、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＭＪ０７２１）やＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（ＭＪ１３００）等のω−アミノトランスフェラーゼを例示することができる。 In addition, Thermoplasma acidophilum 4-aminobutanoic acid aminotransferase (Ta0068), Archaeoglobus fulgidus acetylornithine aminotransferase (AF0080, AF1815), Methanobacterium thermothortinine MM enzyme MG ), Acetylornithine aminotransferase from Methanosarcina acetivorans (MA0119, MA2859), Methanocaldococcus jannasc The ii .omega. aminotransferase such as acetyl ornithine amino transferase (MJ0721) and DAPA aminotransferase (MJ1300) of can be exemplified.
また、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＨ０１３８、ＰＨ０７８２、ＰＨ１４２３）やアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＰＨ１７１６）、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＰＥ０４５７）やアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡＰＥ１４６４）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＣＥ１５２９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＳＡ０１７９、ＳＡ０８１８）やＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（ＳＡ２２１４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＳＡＶ２５８３）やオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＳＡＶ３４２０，ＳＡＶ７１１２）等のω−アミノトランスフェラーゼを例示することもできる。 Also, Pyrococcus horikoshii 4-aminobutanoic acid aminotransferase (PH0138, PH0782, PH1423), acetylornithine aminotransferase (PH1716), Aeropyrum pernix 4-aminobutanoic acid aminotransferase (APE0457), acetylornithine aminotransferase (APE1464), CPE1464 Acetylornithine aminotransferase (CE1529), Staphylococcus aureus ornithine aminotransferase (SA0179, SA0818), DAPA aminotransferase (SA2214), Streptomyces avermiti Examples thereof include ω-aminotransferases such as 4-aminobutanoate aminotransferase (SAV2583) and ornithine aminotransferase (SAV3420, SAV7112) of lis.
これらの酵素は単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。酵素の由来も特に制限されず、動物、植物、細菌、酵母、カビ等いずれに由来する酵素を用いてもよい。 These enzymes may be used alone or in combination of two or more. The origin of the enzyme is not particularly limited, and an enzyme derived from any of animals, plants, bacteria, yeasts, molds and the like may be used.
＜２＞α−アミノトランスフェラーゼのスクリーニング方法
前述のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法を用いて、特定のα−ケト酸からアミノ酸を生成するアミノ基転移反応を触媒する酵素をスクリーニングすることができる。即ち、複数のα−アミノトランスフェラーゼのそれぞれに対し、目的とするアミノ基転移反応の基質であるα−ケト酸１とアミノ酸１、ω−アミノ化合物、及びω−アミノトランスフェラーゼを添加、反応させ、含アルデヒド化合物が検出された場合、その時に用いたα−アミノトランスフェラーゼが、添加したα−ケト酸１を基質として利用でき、そのアミノ基転移反応を触媒することが結論される。ここで用いるα−アミノトランスフェラーゼ、アミノ酸１、ω−アミノ化合物、及びω−アミノトランスフェラーゼは前述のものが例示できる。
<2> Screening Method for α-Aminotransferase An enzyme that catalyzes a transamination reaction that generates an amino acid from a specific α-keto acid can be screened using the above-described method for detecting an α-aminotransferase activity. That is, to each of a plurality of α-aminotransferases, α-
＜３＞α−ケト酸のスクリーニング方法
前述のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法を用いて、特定のα−アミノトランスフェラーゼに対して、その基質となり得るα−ケト酸をスクリーニングすることも可能である。即ち、複数のα−ケト酸のそれぞれに、対象となるα−アミノトランスフェラーゼ、アミノ酸１、ω−アミノ化合物、及びω−アミノトランスフェラーゼを添加、反応させ、含アルデヒド化合物が検出された場合、その時に用いたα−ケト酸が、特定のα−アミノトランスフェラーゼに対する基質であるということが結論される。ここで用いるα−アミノトランスフェラーゼ、アミノ酸１、ω−アミノ化合物、及びω−アミノトランスフェラーゼは前述のものが例示できる。
<3> Screening Method for α-Keto Acid It is also possible to screen for α-keto acid that can serve as a substrate for a specific α-aminotransferase by using the above-described method for detecting α-aminotransferase activity. . That is, when a target α-aminotransferase,
＜４＞α−ケト酸の定量方法
検体中のα−ケト酸を定量するには、まず、定量対象物であるα−ケト酸２と、アミノ基供与体としてのω−アミノ化合物とをω−アミノトランスフェラーゼの存在下反応させ、アミノ酸１と含アルデヒド化合物を生成させる。この時、ω−アミノトランスフェラーゼは、α−ケト酸２を基質として反応できる酵素を選択し、ω−アミノ化合物は、その酵素が基質とできる化合物を選択する。この反応の結果、アミノ酸１と含アルデヒド化合物が生成する。
<4> Method for Quantifying α-Keto Acid To quantify α-keto acid in a sample, first, α-
次にアミノ酸１のアミノ基を除去することにより、α−ケト酸２を再生する、この際、用いる酵素は、アミノ基を付加できる酵素であれば何れでも良く、例えば、α−アミノトランスフェラーゼや、ある種のデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。使用できるα−アミノトランスフェラーゼは、「α−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法」で記述した酵素に準じる。α−アミノトランスフェラーゼを用いる場合に必要なケト酸１は、前述のものが例示できる。また、デヒドロゲナーゼとしては、アラニンデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．１）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．２、Ｅ．Ｃ．１．４．１．３、Ｅ．Ｃ．１．４．１．４）、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．５）などが挙げられる。
Next, the amino group of
こうして再生されたα−ケト酸２は、ω−アミノトランスフェラーゼによって、再びアミノ酸１になり、これらの反応が繰り返されることにより、α−ケト酸２及び前記含アルデヒド化合物は増加する。この反応の繰り返しによって、ごく微量のα−ケト酸２を検出できるようになる。
The α-
一方、既知の濃度のα−ケト酸２を用いて、同様の実験を行い、検量線を作製する。最終的に得られた含アルデヒド化合物を直接または間接的に定量し、検量線と比較することにより、検体中のα−ケト酸２が定量できる。
On the other hand, the same experiment is performed using α-
＜５＞α−アミノトランスフェラーゼの比活性の測定方法
後述の実施例で行ったα−アミノトランスフェラーゼの比活性の測定試験から、α−アミノトランスフェラーゼの使用量と、前述のようにしてα−アミノトランスフェラーゼを用いることにより生成された含アルデヒド化合物の量との間には相関関係があることが明らかになった（実施例「好熱菌α−アミノトランスフェラーゼの検量線の作成」参照）。
<5> Method for Measuring Specific Activity of α-Aminotransferase From the test for measuring the specific activity of α-aminotransferase carried out in Examples described later, the amount of α-aminotransferase used and α-aminotransferase as described above. It was revealed that there is a correlation with the amount of aldehyde-containing compound produced by using (see Example “Preparation of a calibration curve for thermophilic bacterium α-aminotransferase”).
従って、比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを用いることにより生成された含アルデヒド化合物の量と、その際の当該α−アミノトランスフェラーゼの使用量との相関関係を用いることにより、比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの比活性を測定することができる。即ち、所定量の、比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼに、前述のα−ケト酸１とアミノ酸１とを作用させてα−ケト酸２を生成させた後、生成したα−ケト酸２とω−アミノ化合物とをω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させて、含アルデヒド化合物を生成させ、含アルデヒド化合物の生成量を測定した後、この測定結果を前述の相関関係に照合することにより、比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの比活性を算出することができる。これによって、特定のα−ケト酸１と特定のアミノ酸１とに対する、比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの比活性が測定できる。
Therefore, the specific activity is unknown by using the correlation between the amount of the aldehyde-containing compound produced by using the α-aminotransferase having a known specific activity and the amount of the α-aminotransferase used at that time. The specific activity of α-aminotransferase can be measured. That is, the above-mentioned α-
なお、比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼと、比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼとの種類は、同一であってもよいし、異なるものであってもよい。 The types of α-aminotransferase with unknown specific activity and α-aminotransferase with known specific activity may be the same or different.
ここで、比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを用いることにより生成された含アルデヒド化合物の生成量と、当該α−アミノトランスフェラーゼの使用量との相関関係は、例えば検量線などを作成することによって容易に把握することが可能になる。 Here, the correlation between the amount of aldehyde-containing compound produced by using an α-aminotransferase having a known specific activity and the amount of the α-aminotransferase used can be determined by, for example, creating a calibration curve. It becomes possible to grasp easily.
＜６＞含アルデヒド化合物の検出・定量方法
例えば、生成した含アルデヒド化合物に、酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下アルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型ニコチンアミド補酵素を検出すれば含アルデヒド化合物を検出することができる。この検出方法は、定量性があるため、前述のα−ケト酸やα−アミノトランスフェラーゼの比活性などの定量方法においても用いることができる。また、塩基性フクシンを用いた方法、銀鏡反応やフェーリング反応を用いた方法等を利用してもよい。
<6> Detection and quantification method of aldehyde-containing compound For example, an aldehyde-containing compound can be produced by reacting the produced aldehyde-containing compound with aldehyde dehydrogenase in the presence of oxidized nicotinamide coenzyme and detecting the produced reduced nicotinamide coenzyme. Can be detected. Since this detection method is quantitative, it can also be used in the above-described quantitative methods such as the specific activity of α-keto acid and α-aminotransferase. Further, a method using basic fuchsin, a method using a silver mirror reaction, or a Fering reaction may be used.
アルデヒドデヒドロゲナーゼとしては、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．３）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（１．２．１．１２）、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１５）、こはく酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１６）、アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１９）、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．２８）、及びＬ−アミノアジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．３１）等の各ファミリーに属する酵素が例示できる。 Examples of the aldehyde dehydrogenase include aldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.3), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (1.2.1.12), and malonic acid semialdehyde dehydrogenase (EC 1.2.1. 15) succinic semialdehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.16), aminobutyraldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.19), benzaldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.28), and L- Examples include enzymes belonging to each family such as aminoadipate semialdehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.31).
具体例としては、Ｅ．ｃｏｌｉのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＨ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｋＨ）、酵母のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤ１、ＡＬＤ６、ＡＬＤ２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉのこはく酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｓｕｃＤ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａのベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｘｙｌＣ），Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのＬ−アミノアジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。 Specific examples include E.I. E. coli aldehyde dehydrogenase (aldH), Pseudomonas oleovorans aldehyde dehydrogenase (alkH), yeast aldehyde dehydrogenase (ALD1, ALD6, ALD2), Clostridium kluyveri succinate semialdehyde dehydrogenase (sucD) ondealdehyde sudedealdehyde Examples include L-aminoadipate semialdehyde dehydrogenase from Penicillium chrysogenum.
また、近年のゲノム解析の成果より、多くの遺伝子がアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードしていることが示唆されており、これらも本発明に使用可能であることが予想される。具体例としては、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍｐｅｒｎｉｘのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＰＥ１７８６）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉのメチルマロン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＴ１１１６）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＯ０３１１７）やメチルマロン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＯ１２１８）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＭＭ００４８）やコハク酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＭＭ０８３８、ＭＭ２３４１）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＣＥ００７９、ＣＥ２６２５）等を例示することができる。 In addition, recent genome analysis results suggest that many genes encode aldehyde dehydrogenase, and these are expected to be usable in the present invention. Specific examples include aldehyde dehydrogenase from Aeropyrumpernix (APE1786), methylmalonic acid-semialdehyde dehydrogenase from Sulfolobus tokodaii (ST1116), aldehyde dehydrogenase from Sulfolobus solfataricus (SSO03117), and the aldehyde dehydrogenase from SSO03117 eM adenaldehyde aS Examples include aldehyde dehydrogenase (MM0048), succinic-semialdehyde dehydrogenase (MM0838, MM2341), and aldehyde dehydrogenase (CE0079, CE2625) of Corynebacterium efficiens.
これらの酵素は単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。酵素の由来も特に制限されず、動物、植物、細菌、酵母、カビ等由来の酵素を好適に用いることができる。 These enzymes may be used alone or in combination of two or more. The origin of the enzyme is not particularly limited, and enzymes derived from animals, plants, bacteria, yeasts, molds and the like can be preferably used.
還元型ニコチンアミド補酵素の測定方法は公知の手法を用いることができる。例えば、生成する還元型ニコチンアミド補酵素がＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨである場合は、酸化型ニコチンアミド補酵素が透明であり、還元型ニコチンアミド補酵素が黄色であるため、３４０ｎｍの吸光度の増加量を測定することにより、還元型ニコチンアミド補酵素の生成量を容易に測定できる。また、生成する還元型ニコチンアミド補酵素とテトラゾリウム塩化合物とから、電子キャリアーを介してホルマザン色素を生成させ、このホルマザン色素を比色定量することにより還元型ニコチンアミド補酵素の生成量を定量することもできる。 A known method can be used as a method for measuring reduced nicotinamide coenzyme. For example, when the reduced nicotinamide coenzyme produced is NADH or NADPH, the oxidized nicotinamide coenzyme is transparent and the reduced nicotinamide coenzyme is yellow, so the amount of increase in absorbance at 340 nm is measured. By doing so, the production amount of reduced nicotinamide coenzyme can be easily measured. In addition, the amount of reduced nicotinamide coenzyme produced is quantified by generating formazan dye from the resulting reduced nicotinamide coenzyme and tetrazolium salt compound via an electron carrier and colorimetrically determining the formazan dye. You can also.
ω−アミノ化合物として、ヒポタウリンを用い、ω−アミノトランスフェラーゼを触媒にして反応させると、スルフィノアセトアルデヒドを経て、二酸化硫黄が生成する。この二酸化硫黄はローズアニリンを用いた呈色反応により、還元型ニコチンアミド補酵素の生成量を定量することができる（左右田ら （１９８２）含硫アミノ酸 ５巻２４９頁）。 When hypotaurine is used as the ω-amino compound and reacted with ω-aminotransferase as a catalyst, sulfur dioxide is produced via sulfinoacetaldehyde. This sulfur dioxide can determine the amount of reduced nicotinamide coenzyme produced by a color reaction using rose aniline (Yokota et al. (1982) Sulfur-containing amino acid Vol. 5, p. 249).
＜７＞α−アミノトランスフェラーゼの活性検出用キット
本発明のα−アミノトランスフェラーゼの活性検出用キットは、α−アミノトランスフェラーゼの基質であるα−ケト酸１及びアミノ酸１と、α−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、ω−アミノ化合物とを含有するものである。このキットに更にω−アミノトランスフェラーゼによる反応の生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素とを加えることにより、α−アミノトランスフェラーゼの活性検出をさらに容易に行うことができる。
<7> Kit for detecting activity of α-aminotransferase The kit for detecting activity of α-aminotransferase of the present invention is a reaction by α-
特定のα−ケト酸をアミノ基転移反応によってアミノ酸に変換するためのα−アミノトランスフェラーゼのスクリーニング用キットは、特定のα−ケト酸１と、そのα−ケト酸１を基質とするα−アミノトランスフェラーゼの基質であるアミノ酸と、そのα−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、そのω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物とを含有するものである。このキットに更にω−アミノトランスフェラーゼによる反応の生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素を加えることにより、特定のα−ケト酸をアミノ基転移反応によってアミノ酸に変換するためのα−アミノトランスフェラーゼのスクリーニングを容易に行うことができる。
A screening kit for α-aminotransferase for converting a specific α-keto acid into an amino acid by a transamination reaction includes a specific α-
特定のα−アミノトランスフェラーゼ基質のスクリーニング用キットは、候補となる複数のα−ケト酸１のそれぞれに対し、α−ケト酸１を基質とするα−アミノトランスフェラーゼの基質であるアミノ酸１と、このα−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、このω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物とを有するものである。このキットに更に、ω−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素を加えることにより、特定のα−アミノトランスフェラーゼ基質のスクリーニングを手軽に行えるようになる。
A screening kit for a specific α-aminotransferase substrate comprises, for each of a plurality of candidate α-
α−ケト酸の定量キットは、定量対象であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、このω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物と、このω−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物であるアミノ酸１を基質とするα−アミノトランスフェラーゼと、このα−アミノトランスフェラーゼの基質であるケト酸１を有するものである。このキットに更に、ω−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物である含アルデヒド化合物に特異的なアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素とを加えることにより、この定量方法をより手軽に行うことができるようになる。
The α-keto acid quantification kit comprises an ω-aminotransferase using α-
比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの比活性を定量するためには、比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを用いることにより生成された含アルデヒド化合物の量と、その際の当該α−アミノトランスフェラーゼの使用量との相関関係を用いる場合には、比活性の定量対象のα−アミノトランスフェラーゼの基質であるα−ケト酸１およびアミノ酸１と、このα−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、このω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物を有するキットを用いることが有効である。このキットは、更に、比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを有するものであることが好ましい。含アルデヒド化合物の定量方法として、還元型ニコチンアミド補酵素の吸光度を測定する場合には、このキットに更に、ω−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素とを加えることが好ましい。
In order to quantify the specific activity of an α-aminotransferase having an unknown specific activity, the amount of the aldehyde-containing compound produced by using the α-aminotransferase having a known specific activity, and the α-aminotransferase at that time Is used, the α-
これらのキットに含有される個々の試薬は、トリス緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、ホウ酸緩衝溶液等の緩衝溶液に溶解されていてもよく、粉状の形態で、実験者が試薬の最終調整をするようになっていてもよい。 The individual reagents contained in these kits may be dissolved in a buffer solution such as Tris buffer solution, phosphate buffer solution, borate buffer solution, etc. You may come to do.
＜８＞好熱菌への応用
本発明の、α−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法、α−アミノトランスフェラーゼの比活性の測定方法、α−ケト酸の定量方法、α−アミノトランスフェラーゼやα−ケト酸のスクリーニング方法、あるいはそのための検出用キット、またはスクリーニング用キットは、好熱菌由来の酵素においても用いることができる。
<8> Application to thermophile The method for detecting α-aminotransferase activity, the method for measuring the specific activity of α-aminotransferase, the method for quantifying α-keto acid, α-aminotransferase and α-keto acid of the present invention These screening methods, or detection kits or screening kits therefor can also be used in enzymes derived from thermophilic bacteria.
好熱菌由来の酵素は中温菌由来の酵素に比べ高い耐熱性を有しており、物理化学的なストレスにも耐性が高く、工業的に有用な酵素として最近注目されている。 An enzyme derived from a thermophilic bacterium has higher heat resistance than an enzyme derived from a mesophilic bacterium and has a high resistance to physicochemical stress, and has recently attracted attention as an industrially useful enzyme.
好熱菌由来の酵素は、中温菌由来の酵素が高い活性を示す３０℃から４０℃ではほとんど活性がなく、５０℃から１２０℃の高温で高い活性を示す。従って、好熱菌由来の酵素が活性を示す条件で、中温菌由来の酵素を用いて好熱菌由来の酵素の活性を検出、測定、定量またはスクリーニングすることは困難である。 An enzyme derived from a thermophilic bacterium has little activity at 30 ° C. to 40 ° C. where the enzyme derived from a mesophilic bacterium exhibits high activity, and exhibits high activity at a high temperature of 50 ° C. to 120 ° C. Therefore, it is difficult to detect, measure, quantify, or screen the activity of an enzyme derived from a thermophilic bacterium using an enzyme derived from a mesophilic bacterium under the condition that the enzyme derived from the thermophilic bacterium is active.
例えば、超好熱菌由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのスクリーニングをする場合には、Ｌ−アスパラギン酸及び目的とするアミノ酸に対応するα−ケト酸を基質として、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼによって酵素反応温度が７０℃から１００℃でオキサロ酢酸を生成させる（一回目の酵素反応）。その後反応容器を室温まで冷却し、リンゴ酸脱水素酵素及び還元型ニコチンアミド補酵素を加え、二回目の酵素反応を行い、還元型ニコチンアミド補酵素の減少速度を波長３４０ｎｍで測定する。このように試薬の添加や冷却といった煩雑な操作が必要になる。 For example, when screening for an aspartate aminotransferase derived from a hyperthermophilic bacterium, the enzyme reaction temperature is 70 by L-aspartate and α-keto acid corresponding to the target amino acid as a substrate. Oxaloacetic acid is produced at from 1 to 100 ° C. (first enzyme reaction). Thereafter, the reaction vessel is cooled to room temperature, malate dehydrogenase and reduced nicotinamide coenzyme are added, a second enzymatic reaction is performed, and the reduction rate of reduced nicotinamide coenzyme is measured at a wavelength of 340 nm. Thus, complicated operations such as addition of reagents and cooling are required.
従って、好熱菌由来のα−アミノトランスフェラーゼを検出対象とする場合、好熱菌由来のω−アミノトランスフェラーゼと、好熱菌由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼを組み合わせて用いることで、工業的に有用な好熱菌由来の酵素活性を煩雑な操作を必要とせず、簡便に検出、測定、定量またはスクリーニングすることができる。 Therefore, when α-aminotransferase derived from thermophile is to be detected, an industrially useful thermophile can be obtained by using a combination of ω-aminotransferase derived from thermophile and aldehyde dehydrogenase derived from thermophile. The enzyme activity derived from bacteria can be easily detected, measured, quantified or screened without requiring complicated operations.
ここで、好熱菌由来のα−アミノトランスフェラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｔｉｍａのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＥ３２９７）やアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＥ１９６４、ＰＡＥ２２５１）など、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｉｓｓｙのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＢ０５２５、ＰＡＢ０７７４，ＰＡＢ１８１０）などが例示できる。 Here, the α-aminotransferase derived from thermophilic bacteria includes Thermus aquaticus aspartate aminotransferase (aspC), Thermotoga martima aspartate aminotransferase, Thermus thermophilus aspartate aminotransferase, Sulfols amino acid transferase, Pyrococcus abissy aspartate aminotransferase (PAB0525, PE) such as Pyrobaculum aerophilum branched chain amino acid aminotransferase (PAE3297) and aspartate aminotransferase (PAE1964, PAE2251). B0774, PAB1810), and others.
その他、Ａｅｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＦ０９３３）やヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＦ２００２、ＡＦ２０２４）など、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＭＪ１００８）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのセリンアミノトランスフェラーゼ（ＰＨ１３０８）、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘのチロシンアミノトランスフェラーゼ（ＡＰＥ２５７５）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＳＴ１２２５）などの好熱菌由来のα−アミノトランスフェラーゼも例示できる。検出対象としては、これらの酵素が単独で含まれていても、複数が含まれていてもよい。また、使用対象としては、これらの酵素は単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。 In addition, branched chain amino acid aminotransferase (MJ1008), Pyrococcus thioscher phashicus phosphotransferase from Mechanocococcus jannaschii, such as branched chain amino acid aminotransferase (AF0933) of Aerchaeoglobus fulgidus and histidinol phosphate aminotransferase (AF2002, AF2024) Examples also include α-aminotransferases derived from thermophilic bacteria such as tyrosine aminotransferase (APE2575) from Aeropyrum pernix and aspartate aminotransferase (ST1225) from Sulfolobus tokodaii. As a detection target, these enzymes may be contained singly or plurally. Moreover, as an object of use, these enzymes may be used alone or in combination of two or more.
また、好熱菌由来のω−アミノトランスフェラーゼとしては、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＥ１７９９）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＳＳＯ２７２７、ＳＳＯ３２１１）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＦ１２３２、ＰＦ１４２１）やアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＰＦ１６８５）やＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（ＰＦ１９０６）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＢ００８６、ＰＡＢ１９２１、ＰＡＢ２３８６）やアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＰＡＢ２４４０）などが例示できる。 Further, as ω-aminotransferase derived from thermophile, 4-aminobutanoic acid aminotransferase (PAE1799) of Pyrobacterium aerophilum, 4-aminobutanoic acid aminotransferase (SSO2727, SSO3211) of Sulfolobus solfataricus, 4-aminobutanoic acid of Pyrococcus furiosus Transferases (PF1232, PF1421), acetylornithine aminotransferase (PF1685), DAPA aminotransferase (PF1906), 4-aminobutanoic acid aminotransferase (PAB0086, PAB1921, PAB2386) and acetylornithine aminoton from Pyrococcus abyssi A transferase (PAB2440) etc. can be illustrated.
その他、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（Ｔａ００６８）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡＦ００８０、ＡＦ１８１５）、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＭＪ０７２１）やＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（ＭＪ１３００）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＨ０１３８、ＰＨ０７８２、ＰＨ１４２３）やアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＰＨ１７１６）、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＰＥ０４５７）やアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡＰＥ１４６４）などの好熱菌由来のω−アミノトランスフェラーゼも例示できる。これらの酵素は単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。 In addition, Thermoplasma acidophilum 4-aminobutanoic acid aminotransferase (Ta0068), Archaeoglobus fulgidus acetylornithine aminotransferase (AF0080, AF1815), Methanocaldococcus jannaschii acetylornithine aminotransferase 1PhM -Aminobutanoic acid aminotransferase (PH0138, PH0782, PH1423), acetylornithine aminotransferase (PH1716), 4-aminobutanoic acid aminotransferase of Aeropyrum pernix Examples also include ω-aminotransferases derived from thermophilic bacteria such as ase (APE0457) and acetylornithine aminotransferase (APE1464). These enzymes may be used alone or in combination of two or more.
好熱菌由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼとしては、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍｐｅｒｎｉｘのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＰＥ１７８６）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉのメチルマロン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＴ１１１６）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＯ０３１１７）やメチルマロン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＯ１２１８）などが例示できる。これらの酵素は単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。 The aldehyde dehydrogenase derived from thermophile includes aldehyde dehydrogenase from Aeropyrumpernix (APE1786), methylmalonic acid-semialdehyde dehydrogenase from Sulfolobus tokodaiii (ST1116), aldehyde dehydrogenase from Sulfolobus solfatericus (SS03 dehydrogenase from S18 and aldehyde dehydrogenase from S03 And the like. These enzymes may be used alone or in combination of two or more.
中温菌由来のα−アミノトランスフェラーゼの活性検出方法において、好熱菌由来のω−アミノトランスフェラーゼを用いるのも有効である。すなわち、最初から反応系に全て必要な試薬を添加しておき、中温菌由来の酵素が十分な活性を持つ好適な温度で酵素反応を行い、α−ケト酸２を生成させる。次に新たに試薬等を加えることなく、好熱菌由来の酵素が十分な活性を持つ好適な温度まで昇温し、酵素反応を行う。このとき、昇温により中温菌由来の酵素を失活させることができる。そして反応後の還元型ニコチンアミド補酵素を常法により定量すればよい。ω−アミノトランスフェラーゼ反応のための昇温により、同時に中温菌由来の酵素を失活させることができるため、実験手順が省けるだけでなく、より正確に酵素活性を検出することができる。
In the method for detecting the activity of α-aminotransferase derived from mesophilic bacteria, it is also effective to use ω-aminotransferase derived from thermophilic bacteria. That is, all necessary reagents are added to the reaction system from the beginning, and an enzyme reaction is performed at a suitable temperature at which an enzyme derived from mesophilic bacteria has sufficient activity to produce α-
このような中温菌由来のα−アミノトランスフェラーゼと好熱菌由来のω−アミノトランスフェラーゼの組み合わせは、α−アミノトランスフェラーゼやα−ケト酸のスクリーニング方法や、α−アミノトランスフェラーゼの測定方法などにも、有効に応用されうる。 Such a combination of α-aminotransferase derived from mesophilic bacteria and ω-aminotransferase derived from thermophilic bacteria can be used as a screening method for α-aminotransferase and α-keto acid, a method for measuring α-aminotransferase, and the like. It can be effectively applied.
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited to these Examples.
［１］酵素調製方法
１．トランスアミナーゼ（ＡＰＥ２２４８）
（１）遺伝子組換え細胞の作成方法
外来遺伝子として、超好熱菌エアロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＡＰＥ２２４８）（配列番号１）を用いた。
[1] Enzyme preparation method Transaminase (APE2248)
(1) Method for preparing genetically modified cells As a foreign gene, a transaminase gene (APE2248) (SEQ ID NO: 1) of the hyperthermophile Aeropyrum pernix was used.
まず、配列番号１に示すヌクレオチド配列をエアロパイラム・ペルニクスのゲノムから、ＰＣＲ反応で増幅し抽出した。ＰＣＲ反応のためのプライマーには配列番号２および３に示すオリゴヌクレオチドを用いた。 First, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 was amplified and extracted from the genome of Aeropyram pernicus by PCR reaction. The oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 2 and 3 were used as primers for the PCR reaction.
従って、増幅したＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１に示したヌクレオチド配列から終止コドンを除いた配列とHis-tagをコードする配列との融合配列となる。ＰＣＲ反応は、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績株式会社製）を用い、同酵素のプロトコールに従った。反応終了後、ＧＦＸ ＰＣＲ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）を用いて、キットのプロトコールに従い精製し、０．１μg／μｌのＤＮＡ溶液を得た。 Therefore, the nucleotide sequence of the amplified DNA is a fusion sequence of a sequence obtained by removing the stop codon from the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a sequence encoding His-tag. The PCR reaction was performed using KOD plus polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and following the protocol of the enzyme. After completion of the reaction, purification was performed according to the protocol of the kit using GFX PCR and Gel Band Purification Kit (manufactured by Amersham) to obtain a 0.1 μg / μl DNA solution.
次に、制限酵素ＸｈｏＩ １μｌ、ＮｄｅＩ １μｌ、１０×Ｈ Ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ（以上、タカラバイオ株式会社製）及び上記で得たＤＮＡ溶液４３μｌを混合し、３７℃で、一晩酵素消化を行った。 Next, 1 μl of restriction enzyme XhoI, 1 μl of NdeI, 5 μl of 10 × H Buffer (manufactured by Takara Bio Inc.) and 43 μl of the DNA solution obtained above were mixed and subjected to enzymatic digestion at 37 ° C. overnight.
別途、ｐＥＴ２１ａ（＋）（０．５μｇ／μｌ）（Ｎｏｖａｇｅｎ製）２μｌ、ＸｈｏＩ １μｌ、ＮｄｅＩ １μｌ 及び１０×Ｈ Ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ（以上、タカラバイオ株式会社製）を混合し、３７℃で、一晩酵素消化を行った。こうして得られた制限酵素消化したゲノムＤＮＡ及びプラスミドを、それぞれ電気泳動し、両方の必要な部分をまとめ、ＧＦＸ ＰＣＲ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）を用いて、キットのプロトコールに従い精製した。精製物をイソプロパノールで沈殿させ、７０％エタノールでリンスした後乾燥させたものを５μｌの滅菌水に溶解した。このＤＮＡ溶液に対し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２ ｓｏｌ Ｉ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、キットのプロトコールに従いライゲーションし、フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール等で精製した。精製したプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株をエレクトロポレーション法により形質転換した。 Separately, 2 μl of pET21a (+) (0.5 μg / μl) (manufactured by Novagen), 1 μl of XhoI, 1 μl of NdeI and 5 μl of 10 × H Buffer (manufactured by Takara Bio Inc.) are mixed overnight at 37 ° C. Digestion was performed. The restriction enzyme-digested genomic DNA and plasmid thus obtained were each electrophoresed, and both necessary portions were collected and purified using GFX PCR and Gel Band Purification Kit (manufactured by Amersham) according to the protocol of the kit. The purified product was precipitated with isopropanol, rinsed with 70% ethanol and dried, and dissolved in 5 μl of sterile water. For this DNA solution, DNA Ligation Kit ver. 2 sol I (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for ligation according to the protocol of the kit and purified with phenol-chloroform-isoamyl alcohol or the like. Escherichia coli JM109 strain was transformed by the electroporation method using the purified plasmid.
形質転換した菌を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ平板寒天培地（１Ｌ中にトリプトン１０ｇ、酵母エキス ５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇを含む）に植菌し、３７℃で、一晩培養した。寒天培地上に形成されたシングルコロニーの中から、コロニーを無作為にいくつか選択し、選択した各コロニーを直接反応溶液に懸濁し、コロニーダイレクトＰＣＲを行うことで目的の断片をもつクローンのスクリーニングを行った。コロニーダイレクトＰＣＲは以下の手順にて行った。
Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製） ０．５μｌ
緩衝液（１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ、タカラバイオ株式会社製） ５μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ、タカラバイオ株式会社製） ４μｌ
配列番号４のプライマーＤＮＡ（１００ ｐｍｏｌ／μｌ） ０．５μｌ
配列番号５のプライマーＤＮＡ（１００ ｐｍｏｌ／μｌ） ０．５μｌ
各コロニー中の大腸菌 微量
を混合し、水を加えて、全量５０μｌに調製した。
The transformed bacteria were inoculated into LB plate agar medium (containing 10 g of tryptone, 5 g of yeast extract, and 10 g of NaCl in 1 L) containing 50 μg / ml ampicillin and cultured at 37 ° C. overnight. Screening for clones with the desired fragment by randomly selecting several colonies from single colonies formed on the agar medium, suspending each selected colony directly in the reaction solution and performing colony direct PCR Went. Colony direct PCR was performed according to the following procedure.
Ex Taq polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) 0.5 μl
Buffer solution (10 × Ex Taq Buffer, manufactured by Takara Bio Inc.) 5 μl
dNTP (2.5 mM each, manufactured by Takara Bio Inc.) 4 μl
SEQ ID NO: 4 primer DNA (100 pmol / μl) 0.5 μl
SEQ ID NO: 5 primer DNA (100 pmol / μl) 0.5 μl
A small amount of E. coli in each colony was mixed and water was added to prepare a total volume of 50 μl.
市販の温度サイクリング装置（ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いて９４℃、で３分恒温後、〔９４℃、６０秒−５６℃、６０秒−７２℃、１４０秒〕のサイクルを２５回繰り返した。反応終了後、１％アガロース電気泳動により、目的の断片の増幅が行われているかを確認し、陽性コロニーを得た。この形質転換体を増幅し、目的のトランスアミナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドを調製した。組換えプラスミドに含まれる目的のＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、ＤＮＡ配列に間違いがないことを確認した。 After a constant temperature of 94 ° C. for 3 minutes using a commercially available temperature cycling device (RoboCycler, manufactured by STRATAGENE), the cycle of [94 ° C., 60 seconds-56 ° C., 60 seconds-72 ° C., 140 seconds] was repeated 25 times. . After completion of the reaction, it was confirmed by 1% agarose electrophoresis whether the target fragment was amplified, and a positive colony was obtained. This transformant was amplified and a recombinant plasmid containing the target transaminase gene was prepared. The base sequence of the target DNA fragment contained in the recombinant plasmid was determined, and it was confirmed that there was no mistake in the DNA sequence.
こうして得た組換えプラスミドを用いて、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）株の形質転換を行った。形質転換した大腸菌は、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ平板寒天培地に植菌し、３７℃で培養した。 Using the recombinant plasmid thus obtained, the Rosetta (DE3) strain was transformed. The transformed Escherichia coli was inoculated into an LB plate agar medium containing 50 μg / ml ampicillin and 34 μg / ml chloramphenicol, and cultured at 37 ° C.
（２）タンパク質の発現誘導
（１）で得た組換え大腸菌は、５０μｇ／ｍｌアンピシリンと３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地５ｍｌに植菌し、一晩３７℃で前培養した。次に、５０μｇ／ｍｌアンピシリンと３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地５００ｍｌに、前培養した菌液５ｍｌを植菌し、３７℃でＯＤ６６０が１．０になるまで本培養した。ここにＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように添加し、４６℃で２０時間培養し、トランスアミナーゼ遺伝子の発現を誘導した。
(2) Induction of protein expression The recombinant E. coli obtained in (1) was inoculated into 5 ml of LB medium containing 50 μg / ml ampicillin and 34 μg / ml chloramphenicol and pre-cultured overnight at 37 ° C. Next, 5 ml of the pre-cultured bacterial solution was inoculated into 500 ml of LB medium containing 50 μg / ml ampicillin and 34 μg / ml chloramphenicol, and main culture was performed at 37 ° C. until OD660 reached 1.0. IPTG was added to a final concentration of 1 mM and cultured at 46 ° C. for 20 hours to induce transaminase gene expression.
培養後菌液を集菌し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗菌し、１ｍＭのピリドキサールリン酸を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕後遠心分離し、上清を無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液を８０℃で３０分熱処理することにより大腸菌由来のアミノトランスフェラーゼを失活させ、遠心して不溶物を除き、上清を粗酵素液とした。このように、好熱菌のアミノトランスフェラーゼを用いることにより、精製段階で、大腸菌等から混入したアミノトランスフェラーゼを容易に失活させることができる。 After cultivation, the bacterial solution was collected, washed with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), and suspended in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 1 mM pyridoxal phosphate. The cell suspension was sonicated and centrifuged, and the supernatant was used as a cell-free extract. The cell-free extract was heat-treated at 80 ° C. for 30 minutes to inactivate aminotransferase derived from Escherichia coli, centrifuged to remove insoluble matters, and the supernatant was used as a crude enzyme solution. Thus, by using a thermophilic aminotransferase, the aminotransferase mixed from Escherichia coli and the like can be easily inactivated at the purification stage.
粗酵素液を等量のサンプル緩衝液（０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．８）、４％ＳＤＳ、１２％βメルカプトエタノール、２０％グリセロール、ここに微量のブロモフェノールブルーを含む）と混合し、含まれる可溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析したところ、誘導されたタンパク質のバンドがはっきりと確認できた。 The crude enzyme solution is mixed with an equal volume of sample buffer (0.1 M Tris-HCl (pH 6.8), 4% SDS, 12% β-mercaptoethanol, 20% glycerol, containing a trace amount of bromophenol blue), When the soluble protein contained was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, the induced protein band was clearly confirmed.
（３）酵素の精製
熱処理した粗酵素液から、Ｐｒｏｔｉｎｏ Ｎｉ２０００（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）のプロトコールに従い、His-tagを利用してタンパク質を精製した。５００ｍｌの培養液から１．８ｍｇの精製酵素を得た。
(3) Purification of enzyme Protein was purified from the heat-treated crude enzyme solution using His-tag according to the protocol of Protino Ni2000 (Macheley-Nagel). 1.8 mg of purified enzyme was obtained from 500 ml of the culture solution.
（４）酵素活性の確認方法
４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのアラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、またはロイシンをアミノ基の供与体として含む反応液１９０μｌに、（３）で精製した酵素（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて８０℃で２分間酵素反応を行った。反応後、３０％トリクロロ酢酸水溶液５０μｌを加えて反応を停止した。反応系中に生成したグルタミン酸は、Ｍａｒｆｅｙ’ｓ試薬を用いて誘導体化し、ＨＰＬＣで定量した。酵素活性の測定結果を図１に示す。
(4) Enzyme
２．トランスアミナーゼ（ＰＨ１３７１）
外来遺伝子として、超好熱菌パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｉｉ）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＰＨ１３７１）を用いた他は、ＡＰＥ２２４８に準じて組替え大腸菌を得、タンパク質を発現誘導し、粗酵素液を得た。なお、誘導培養は２５℃で２０時間行った。ここで用いたＰＨ１３７１のヌクレオチド配列を配列番号６に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号７および８に示した。
粗酵素液中の可溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析したところ、誘導されたタンパク質のバンドが確認できた。
また、ＡＰＥ２２４８と同様の手法で、酵素活性を測定した。酵素活性の測定結果を図１に示す。
2. Transaminase (PH1371)
Recombinant Escherichia coli was obtained according to APE2248, except that the transaminase gene (PH1371) of the hyperthermophilic bacterium Pyrococcus horikoshii was used as a foreign gene, and protein expression was induced to obtain a crude enzyme solution. Induction culture was performed at 25 ° C. for 20 hours. The nucleotide sequence of PH1371 used here is shown in SEQ ID NO: 6, and primers for PCR reaction are shown in SEQ ID NOs: 7 and 8.
When the soluble protein in the crude enzyme solution was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, an induced protein band could be confirmed.
Moreover, the enzyme activity was measured by the same method as APE2248. The measurement result of enzyme activity is shown in FIG.
３．トランスアミナーゼ（ＡＰＥ０１６９）
外来遺伝子として、超好熱菌エアロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＡＰＥ０１６９）を用いた他は、ＡＰＥ２２４８に準じて組替え大腸菌を得、タンパク質を発現誘導し、粗酵素液を得た。なお、ＰＣＲ生成物とベクターの消化にはＮｏｔＩ １μｌとＮｄｅＩ １μｌを用いた。誘導培養は２５℃で２０時間行った。ここで用いたＡＰＥ０１６９のヌクレオチド配列を配列番号９に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号１０および１１に示した。
粗酵素中の可溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析したところ、誘導されたタンパク質のバンドが確認できた。
また、ＡＰＥ２２４８と同様の手法で、酵素活性を測定した。酵素活性の測定結果を図１に示す。
3. Transaminase (APE0169)
Recombinant Escherichia coli was obtained according to APE2248 except that the transaminase gene (APE0169) of the hyperthermophile Aeropyrum pernix was used as a foreign gene, and protein expression was induced to obtain a crude enzyme solution. Note that 1 μl of NotI and 1 μl of NdeI were used for digesting the PCR product and the vector. Induction culture was performed at 25 ° C. for 20 hours. The nucleotide sequence of APE0169 used here is shown in SEQ ID NO: 9, and primers for PCR reaction are shown in SEQ ID NOs: 10 and 11.
When the soluble protein in the crude enzyme was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, an induced protein band could be confirmed.
Moreover, the enzyme activity was measured by the same method as APE2248. The measurement result of enzyme activity is shown in FIG.
４．トランスアミナーゼ（ＳＴ１２１７）
外来遺伝子として、超好熱菌スルホロバス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＳＴ１２１７）を用いた他は、ＡＰＥ２２４８に準じて組替え大腸菌を得、タンパク質を発現誘導し、粗酵素液を得た。なお、誘導培養は２５℃で２０時間行った。ここで用いたＳＴ１２１７のヌクレオチド配列を配列番号１２に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号１３および１４に示した。
粗酵素液中の可溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した。誘導されたタンパク質のバンドが確認できた。
また、ＡＰＥ２２４８と同様の手法で、酵素活性を測定した。酵素活性の測定結果を図１に示す。
4). Transaminase (ST1217)
Recombinant Escherichia coli was obtained according to APE2248 except that the transaminase gene (ST1217) of the hyperthermophilic bacterium Sulfolobus tokodaii was used as a foreign gene, and protein expression was induced to obtain a crude enzyme solution. Induction culture was performed at 25 ° C. for 20 hours. The nucleotide sequence of ST1217 used here is shown in SEQ ID NO: 12, and primers for PCR reaction are shown in SEQ ID NOs: 13 and 14.
Soluble protein in the crude enzyme solution was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Induced protein bands were confirmed.
Moreover, the enzyme activity was measured by the same method as APE2248. The measurement result of enzyme activity is shown in FIG.
５．トランスアミナーゼ（ＳＴ１４１１）
外来遺伝子として、超好熱菌スルホロバス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＳＴ１４１１）を用いた他は、ＡＰＥ２２４８に準じて組替え大腸菌を得、タンパク質を発現誘導し、粗酵素液を得た。なお、誘導培養は２５℃で２０時間行った。ここで用いたＳＴ１４１１のヌクレオチド配列を配列番号１５に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号１６および１７に示した。
粗酵素液中の可溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した。誘導されたタンパク質のバンドが確認できた。
また、ＡＰＥ２２４８と同様の手法で、酵素活性を測定した。酵素活性の測定結果を図１に示す。
5. Transaminase (ST1411)
Recombinant Escherichia coli was obtained according to APE2248 except that the transaminase gene (ST1411) of the hyperthermophilic bacterium Sulfolobus tokodaiii was used as a foreign gene, and protein expression was induced to obtain a crude enzyme solution. Induction culture was performed at 25 ° C. for 20 hours. The nucleotide sequence of ST1411 used here is shown in SEQ ID NO: 15, and primers for PCR reaction are shown in SEQ ID NOs: 16 and 17.
Soluble protein in the crude enzyme solution was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Induced protein bands were confirmed.
Moreover, the enzyme activity was measured by the same method as APE2248. The measurement result of enzyme activity is shown in FIG.
６．トランスアミナーゼ（ＳＴ０１９１）
外来遺伝子として、超好熱菌スルホロバス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＳＴ０１９１）を用いた他は、ＡＰＥ２２４８に準じて組替え大腸菌を得、タンパク質を発現誘導し、粗酵素液を得た。なお、誘導培養は２５℃で２０時間行った。ここで用いたＳＴ０１９１のヌクレオチド配列を配列番号１８に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号１９および２０に示した。
粗酵素液中の可溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した。誘導されたタンパク質のバンドが確認できた。
6). Transaminase (ST0191)
Recombinant Escherichia coli was obtained according to APE2248 except that the transaminase gene (ST0191) of the hyperthermophilic bacterium Sulfolobus tokodaii was used as a foreign gene, and protein expression was induced to obtain a crude enzyme solution. Induction culture was performed at 25 ° C. for 20 hours. The nucleotide sequence of ST0191 used here is shown in SEQ ID NO: 18, and primers for PCR reaction are shown in SEQ ID NOs: 19 and 20.
Soluble protein in the crude enzyme solution was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Induced protein bands were confirmed.
４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのオルニチン、アセチルオルニチン、４−アミノブタン酸、５−アミノペンタン酸、β−アラニン、４−アミノブタン、または５−アミノペンタンをアミノ基の供与体として含む反応液１９０μｌに、上記１．の（３）と同様の操作で精製した酵素（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて８０℃で５分間酵素反応を行った。反応後、３０％トリクロロ酢酸水溶液５０μｌを加えて反応を停止した。反応系中に生成したグルタミン酸は、Ｍａｒｆｅｙ’ｓ試薬を用いて誘導体化し、ＨＰＬＣで定量した。 40 mM 2-oxoglutarate, 0.5 mM pyridoxal phosphate, 100 mM phosphate buffer (pH 7.5), and 40 mM ornithine, acetylornithine, 4-aminobutanoic acid, 5-aminopentanoic acid, β-alanine, To 190 μl of a reaction solution containing 4-aminobutane or 5-aminopentane as an amino group donor, 10 μl of the enzyme (0.05 μg / μl) purified by the same procedure as in (3) was added, and the enzyme reaction was performed at 80 ° C. for 5 minutes. After the reaction, 50 μl of 30% aqueous trichloroacetic acid was added to stop the reaction. Glutamic acid produced in the reaction system was derivatized using Marfey's reagent and quantified by HPLC.
結果を表１に示す。
７．デヒドロゲナーゼ（ＳＴ００６４）
外来遺伝子として、超好熱菌スルホロバス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ）のデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＳＴ００６４）を用いた他は、ＡＰＥ２２４８に準じて組替え大腸菌を得、タンパク質を発現誘導し、粗酵素液を得た。なお、誘導培養は２５℃で２０時間行った。ここで用いたＳＴ００６４のヌクレオチド配列を配列番号２１に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号２２および２３に示した。
粗酵素液中の可溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した。誘導されたタンパク質のバンドが確認できた。
7). Dehydrogenase (ST0064)
Recombinant Escherichia coli was obtained according to APE2248 except that the dehydrogenase gene (ST0064) of the hyperthermophilic bacterium Sulfolobus tokodaii was used as the foreign gene, and protein expression was induced to obtain a crude enzyme solution. Induction culture was performed at 25 ° C. for 20 hours. The nucleotide sequence of ST0064 used here is shown in SEQ ID NO: 21, and primers for PCR reaction are shown in SEQ ID NOs: 22 and 23.
Soluble protein in the crude enzyme solution was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Induced protein bands were confirmed.
１０ｍＭのグルタルアルデヒドまたはグリセルアルデヒド、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および１０ｍＭのニコチンアミド補酵素（酸化型）を含む反応液６００μｌに、上記１．の（３）と同様な操作で精製した酵素（０．２μｇ/μｌ）を２０μｌ加えて５０℃で６０分間酵素反応を行った。反応後、直ちに氷冷して反応を停止した。反応系中に生成したニコチンアミド補酵素（還元型）を分光高度計を用いて３４０ｎｍの波長で測定し、酵素活性を求めた。 To 600 μl of a reaction solution containing 10 mM glutaraldehyde or glyceraldehyde, 100 mM phosphate buffer (pH 7.5), and 10 mM nicotinamide coenzyme (oxidized form), the above 1. 20 μl of the enzyme (0.2 μg / μl) purified by the same procedure as in (3) was added, and the enzyme reaction was performed at 50 ° C. for 60 minutes. Immediately after the reaction, the reaction was stopped by cooling with ice. Nicotinamide coenzyme (reduced form) produced in the reaction system was measured with a spectrophotometer at a wavelength of 340 nm to determine enzyme activity.
結果を表２に示す。
［２］α−アミノトランスフェラーゼのスクリーニング
ａ．４−フルオロフェニルグリオキシル酸、ｂ．２，４，６−トリメチルフェニルグリオキシル酸、ｃ．２−メトキシフェニルグリオキシル酸、ｄ．２，５−ジメチルフェニルグリオキシル酸、ｅ．３−メトキシフェニルグリオキシル酸、ｆ．ビフェニル−４−グリオキシル酸、ｇ．４−メトキシフェニルグリオキシル酸、ｈ．トリメチルグリオキシル酸、ｊ．３，４，５−トリメトキシフェニルグリオキシル酸、ｋ．インドール−３−グリオキシル酸、ｌ．２−メチルインドール−３−グリオキシル酸 ｍ．３，４，５−トリフルオロフェニルグリオキシル酸、ｎ．ナフタレン−１−グリオキシル酸、ｏ．チオフェン−２−グリオキシル酸を用い、各ケト酸を基質とするα−アミノトランスフェラーゼをスクリーニングした。候補となるα−アミノトランスフェラーゼには、ＰＨ１３７１、ＡＰＥ０１６９、ＡＰＥ２２４８、ＳＴ１２１７、ＳＴ１４１１を用いた。
[2] Screening for α-aminotransferase a. 4-fluorophenylglyoxylic acid, b. 2,4,6-trimethylphenylglyoxylic acid, c. 2-methoxyphenylglyoxylic acid, d. 2,5-dimethylphenylglyoxylic acid, e. 3-methoxyphenylglyoxylic acid, f. Biphenyl-4-glyoxylic acid, g. 4-methoxyphenylglyoxylic acid, h. Trimethylglyoxylic acid, j. 3,4,5-trimethoxyphenylglyoxylic acid, k. Indole-3-glyoxylic acid, l. 2-methylindole-3-glyoxylic acid m. 3,4,5-trifluorophenylglyoxylic acid, n. Naphthalene-1-glyoxylic acid, o. Using thiophene-2-glyoxylic acid, α-aminotransferase using each keto acid as a substrate was screened. PH1371, APE0169, APE2248, ST1217, and ST1411 were used as candidate α-aminotransferases.
１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２ｍＭ α−ケト酸、５ｍＭ Ｌ−アラニン、５ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、４０ｍＭ ５−アミノペンタン酸、１ｍＭ ＮＡＤ＋、１０μＭ ピリドキサール−５′−リン酸、０．２μｇのα−アミノトランスフェラーゼ、２μｇのＳＴ０１９１（ω−アミノトランスフェラーゼ）、４０μｇのＳＴ００６４（アルデヒドデヒドロゲナーゼ）、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（ナカライテスク、電子キャリアーおよびテトラゾリウム塩を含む） ５μｌ/ｍｌを含む反応液２００μｌを調製し、７０℃で３０分間反応させた。反応終了後、反応液を手早く氷冷し、反応液の４９０ｎｍにおける吸収を測定した。
100 mM phosphate buffer (pH 7.5), 2 mM α-keto acid, 5 mM L-alanine, 5 mM L-glutamic acid, 40 mM 5-aminopentanoic acid, 1 mM NAD + , 10 μM pyridoxal-5′-phosphate, 0.2
測定結果を表３に示した。なお、表中、目視で着色が認められたものは太字で示した。
これとは別に、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（ナカライテスク）を含まない他は上記と同様の手法で酵素反応を行い、生成したアミノ酸をマススペクトルにて分析した。その結果、着色が確認できた酵素／ケト酸の組み合わせでは、各アミノ酸に相当する分子量のピークを確認できた。 Apart from this, an enzyme reaction was carried out in the same manner as described above except that Cell Count Reagent (Nacalai Tesque) was not included, and the produced amino acids were analyzed by mass spectrum. As a result, in the enzyme / keto acid combination in which coloring was confirmed, a peak of molecular weight corresponding to each amino acid could be confirmed.
本スクリーニング方法を利用することにより、各α−アミノトランスフェラーゼの活性を確認することができた。例えば、ＳＴ１４１１は４−フルオロフェニルグリオキシル酸や４−メトキシフェニルグリオキシル酸を、対応するアミノ酸に変換できることが示された。 By using this screening method, the activity of each α-aminotransferase could be confirmed. For example, ST1411 was shown to be able to convert 4-fluorophenylglyoxylic acid and 4-methoxyphenylglyoxylic acid into the corresponding amino acids.
また、本スクリーニング方法を利用することにより、各ケト酸を特異的に基質とするα−アミノトランスフェラーゼが特定され、従って各アミノ酸合成に有用なα−アミノトランスフェラーゼが明らかとなった。例えば、４−メトキシフェニルグリシン（ｇに対応するアミノ酸）の合成にはＳＴ１４１１が有用であり、２，５−ジメチルフェニルグリシン（ｄに対応するアミノ酸）の合成にはＡＰＥ０１６９が有用であることが明らかとなった。 Furthermore, by using this screening method, α-aminotransferases using specific keto acids as substrates were identified, and thus α-aminotransferases useful for the synthesis of each amino acid were clarified. For example, ST1411 is useful for the synthesis of 4-methoxyphenylglycine (amino acid corresponding to g), and APE0169 is useful for the synthesis of 2,5-dimethylphenylglycine (amino acid corresponding to d). It became.
［３］α−アミノトランスフェラーゼの比活性測定
（１）好熱菌α−アミノトランスフェラーゼの検量線の作成
１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ３−メチル−２−オキソペンタン酸、１０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、１００ｍＭ ５−アミノペンタン酸、５ｍＭ ＮＡＤＰ＋、１０μＭ ピリドキサール−５′−リン酸、０．００５〜０．０５μｇ ＳＴ１４１１、1μｇ ＳＴ０１９１、１０μｇ ＳＴ００６４、１５μｌ／ｍｌ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（ナカライテスク、電子キャリアーおよびテトラゾリウム塩を含む）を含む反応液２００μｌをマイクロプレート上に調製し、マイクロプレート対応のサーマルサイクラーを用いて酵素反応を行った。サーマルサイクラーのプログラムは７０℃（１０分）→４℃（１０分）とした。反応終了後、マイクロプレートリーダーを用いてＡ４９０の値を測定し（表４）、検量線を作成した（図２）。
表４及び図２に示すように、反応液中の酵素量と上述の反応によって生成されたホルマザンの吸光度（Ａ４９０）の値との間に良好な直線関係が認められたため、本反応系を用いてα−アミノトランスフェラーゼの比活性を測定可能なことが示された。 As shown in Table 4 and FIG. 2, a good linear relationship was observed between the amount of enzyme in the reaction solution and the absorbance (A490) of formazan produced by the above reaction. It was shown that the specific activity of α-aminotransferase can be measured.
次に、検量線作成に用いたＳＴ１４１１の３−メチル−２−オキソペンタン酸からのイソロイシンの生成活性を測定した。１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ピリドキサール−５′−リン酸、２０ｍＭ ３−メチル−２−オキソペンタン酸、２０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、１μｇ ＳＴ１４１１を含む反応液 ２００μｌを７０℃で５分間反応させ、生成したイソロイシンをＨＰＬＣで定量した。その結果、ＳＴ１４１１のイソロイシン合成活性は１３４Ｕ／ｍｇであった。 Next, the activity of producing isoleucine from 3-methyl-2-oxopentanoic acid of ST1411, which was used for preparing a calibration curve, was measured. Reaction of 200 μl of a reaction solution containing 100 mM phosphate buffer (pH 7.5), 1 mM pyridoxal-5′-phosphate, 20 mM 3-methyl-2-oxopentanoic acid, 20 mM L-glutamic acid, 1 μg ST1411, for 5 minutes at 70 ° C. The resulting isoleucine was quantified by HPLC. As a result, the activity of synthesizing isoleucine of ST1411 was 134 U / mg.
（２）好熱菌α−アミノトランスフェラーゼの比活性測定
１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２ｍＭ 表５に示す各ケト酸（非天然アミノ酸合成用ケト酸）、１０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、１００ｍＭ ５−アミノペンタン酸、５ｍＭ ＮＡＤＰ＋、１０μＭ ピリドキサール−５′−リン酸、０．０２μｇ α−アミノトランスフェラーゼ、1μｇ ＳＴ０１９１、１０μｇ ＳＴ００６４、１５μｌ／ｍｌ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（ナカライテスク）を含む反応液２００μｌをマイクロプレート上に調製し、マイクロプレート対応のサーマルサイクラーを用いて酵素反応を行った。サーマルサイクラーのプログラムは７０℃（１０分）→４℃（１０分）とした。反応終了後、マイクロプレートリーダーを用いてＡ４９０の値を測定した。
(2) Specific activity measurement of thermophilic bacterium α-
一方、比活性を容易に求めることができるように、上記検量線（図２）のＸ軸の値を、あらかじめ比活性を表すように変換した。即ち、本実験では、０．０２μｇの酵素を用いたため、上記検量線（図２）のＸ軸の値（α−アミノトランスフェラーゼの添加量：Ｘ１）に対し、１３４Ｕ／ｍｇ・Ｘ１×１０−３ｍｇ（酵素の絶対量）／０．０２×１０−３ｍｇの値（α−アミノトランスフェラーゼの比活性：Ｘ２）を求め、α−アミノトランスフェラーゼの添加量（Ｘ１）をα−アミノトランスフェラーゼの比活性（Ｘ２）に変換して図３のＸ軸とした。 On the other hand, the X-axis value of the calibration curve (FIG. 2) was converted in advance to represent the specific activity so that the specific activity could be easily determined. That is, in this experiment, 0.02 μg of enzyme was used, and therefore 134 U / mg · X 1 × 10 with respect to the X-axis value (α-aminotransferase added amount: X 1 ) of the calibration curve (FIG. 2). -3 mg (absolute amount of enzyme) /0.02×10 -3 mg (specific activity of α-aminotransferase: X 2 ) was determined, and the amount of α-aminotransferase added (X 1 ) was determined as α-amino and the X-axis of FIG. 3 is converted to specific activity of transferase (X 2).
作成した図３を用いて、測定したＡ４９０の値から各ケト酸に対するＳＴ１４１１とＡＰＥ０１６９との比活性を算出し、定量した。 Using FIG. 3 prepared, the specific activity of ST1411 and APE0169 for each keto acid was calculated and quantified from the measured value of A490.
結果を表５に示す。
［４］α−ケト酸の検出及び定量
１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ３−メチル−α−ケト吉草酸、４０ｍＭ ５−アミノペンタン酸、１ｍＭ ＮＡＤ＋、１０μＭ ピリドキサール−５′−リン酸、２μｇ ＳＴ１４１１（α−アミノトランスフェラーゼ）、２０μｇ ＳＴ０１９１（ω−アミノトランスフェラーゼ）、４０μｇ ＳＴ００６４（アルデヒドデヒドロゲナーゼ）、０−５０μＭ ２−オキソグルタル酸を含む反応液２００μｌを調製し、７０℃で３０分間反応させた。反応終了後、反応溶液を素早く氷冷して反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｐｌｕｓ３８４、モレキュラーデバイス社製）を用いて３４０ｎｍにおける吸光度を測定した（○）。コントロール（▲）として、ＳＴ１４１１を反応液中に加えていないものも同様に行い、加えたものと比較した。結果を図４に示す。
[4] Detection and quantification of α-
コントロールでは、２−オキソグルタル酸濃度が１−５０μＭの時、Ａ３４０の増加はほとんど見られなかった。一方、ＳＴ１４１１を入れた実験系では、Ａ３４０の増加が見られ、ＳＴ１４１１の反応により、反応液中の２−オキソグルタル酸が増幅し、その結果測定感度が上昇していることが示された。２−オキソグルタル酸濃度が１−５０μＭの時に、２−オキソグルタル酸濃度とＡ３４０の値には直線的な相関性があり、このことからα−ケト酸の定量が可能であることが示唆された。 In the control, when the 2-oxoglutarate concentration was 1-50 μM, almost no increase in A340 was observed. On the other hand, in the experimental system in which ST1411 was added, A340 increased, and 2-oxoglutaric acid in the reaction solution was amplified by the reaction of ST1411, and as a result, the measurement sensitivity increased. When the 2-oxoglutarate concentration was 1-50 μM, there was a linear correlation between the 2-oxoglutarate concentration and the A340 value, suggesting that α-keto acid can be quantified.
Claims (31)
α−ケト酸２とω−アミノ化合物とを、それらを基質とするω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させて、含アルデヒド化合物を生成させる工程と、
含アルデヒド化合物を検出する工程と、
を有することを特徴とする、α−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。 Adding α-keto acid 1 and an amino acid, which can be a substrate for α-aminotransferase, to produce α-keto acid 2 in a specimen;
reacting α-keto acid 2 with an ω-amino compound in the presence of ω-aminotransferase using them as a substrate to form an aldehyde-containing compound;
Detecting an aldehyde-containing compound;
A method for detecting an α-aminotransferase activity, comprising:
α−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、
ω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物と、
を有する、α−アミノトランスフェラーゼ活性の検出用キット。 α-keto acid 1 and an amino acid, which can be a substrate for α-aminotransferase,
ω-aminotransferase using α-keto acid 2 as a substrate, which is a reaction product of α-aminotransferase,
an ω-amino compound that is a substrate for ω-aminotransferase;
A kit for detecting α-aminotransferase activity, comprising:
酸化型ニコチンアミド補酵素と
を有する、請求項８に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出用キット。 Furthermore, an aldehyde dehydrogenase using an aldehyde-containing compound that is a reaction product of ω-aminotransferase as a substrate,
The kit for detecting an α-aminotransferase activity according to claim 8, comprising oxidized nicotinamide coenzyme.
このα−ケト酸１を基質とするα−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるアミノ酸と、
このα−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、
このω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物と
を有する、α−ケト酸をアミノ基転移反応によってアミノ酸に変換するためのα−アミノトランスフェラーゼのスクリーニング用キット。 α-keto acid 1;
An amino acid that can be a substrate of α-aminotransferase using α-keto acid 1 as a substrate;
Ω-aminotransferase using α-keto acid 2 as a substrate, which is a reaction product of an enzyme reaction catalyzed by this α-aminotransferase,
An α-aminotransferase screening kit for converting α-keto acid into an amino acid by a transamination reaction, comprising an ω-amino compound that is a substrate of this ω-aminotransferase.
酸化型ニコチンアミド補酵素と
を有する、請求項１２に記載のα−ケト酸をアミノ基転移反応によってアミノ酸に変換するためのα−アミノトランスフェラーゼのスクリーニング用キット。 Furthermore, an aldehyde dehydrogenase having an aldehyde-containing compound as a substrate, which is a reaction product of an enzyme reaction catalyzed by ω-aminotransferase,
A kit for screening an α-aminotransferase for converting an α-keto acid according to claim 12, which has an oxidized nicotinamide coenzyme into an amino acid by a transamination reaction.
このα−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、
このω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物と
を有する、α−アミノトランスフェラーゼ基質のスクリーニング用キット。 an amino acid that can be a substrate of α-aminotransferase using α-keto acid 1 as a substrate;
Ω-aminotransferase using α-keto acid 2 as a substrate, which is a reaction product of an enzyme reaction catalyzed by this α-aminotransferase,
A kit for screening an α-aminotransferase substrate, comprising a ω-amino compound which is a substrate of the ω-aminotransferase.
酸化型ニコチンアミド補酵素と、
を有することを特徴とする、請求項１４に記載のα−アミノトランスフェラーゼ基質のスクリーニング用キット。 Furthermore, an aldehyde dehydrogenase having an aldehyde-containing compound as a substrate, which is a reaction product of an enzyme reaction catalyzed by ω-aminotransferase,
Oxidized nicotinamide coenzyme,
The kit for screening an α-aminotransferase substrate according to claim 14, comprising:
生成したアミノ酸のアミノ基を除去することにより、α−ケト酸を再生する第２の工程と、
第１の工程及び第２の工程を繰り返すことによってα−ケト酸及び含アルデヒド化合物を増加させる第３の工程と、
増加した含アルデヒド化合物を定量する第４の工程と
を有することを特徴とする、α−ケト酸の定量方法。 a first step of reacting an α-keto acid, which can be a substrate of ω-aminotransferase, with a ω-amino compound in the presence of ω-aminotransferase to produce an amino acid and an aldehyde-containing compound;
A second step of regenerating the α-keto acid by removing the amino group of the produced amino acid;
A third step of increasing the α-keto acid and the aldehyde-containing compound by repeating the first step and the second step;
And a fourth step of quantifying the increased aldehyde-containing compound. A method for quantifying α-keto acid.
ω−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるω−アミノ化合物と、
ω−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物であるアミノ酸を基質とするα−アミノトランスフェラーゼと、
α−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸と
を有する、α−ケト酸の定量用キット。 ω-aminotransferase;
an ω-amino compound that can be a substrate for ω-aminotransferase;
an α-aminotransferase using an amino acid as a substrate as a reaction product of an enzyme reaction catalyzed by ω-aminotransferase;
A kit for quantification of α-keto acid, comprising α-keto acid which can be a substrate of α-aminotransferase.
酸化型ニコチンアミド補酵素と、
を有する、請求項２２に記載のα−ケト酸の定量用キット。 Furthermore, an aldehyde dehydrogenase having an aldehyde-containing compound as a substrate, which is a reaction product of an enzyme reaction catalyzed by ω-aminotransferase,
Oxidized nicotinamide coenzyme,
The kit for quantification of α-keto acid according to claim 22, comprising:
α−ケト酸２とω−アミノ化合物とを、それらを基質とするω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させて、含アルデヒド化合物を生成させる工程と、
生成した含アルデヒド化合物を定量する工程と、
比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを用いることにより生成された含アルデヒド化合物の量と、その際の当該α−アミノトランスフェラーゼの使用量との相関関係に、上記工程で測定した含アルデヒド化合物の生成量を照合し、比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの比活性を算出する工程と、
を有することを特徴とする、α−アミノトランスフェラーゼの比活性測定方法。 Adding α-keto acid 1 and an amino acid, which can be a substrate of the α-aminotransferase, to a predetermined amount of α-aminotransferase whose specific activity is unknown, to generate α-keto acid 2;
reacting α-keto acid 2 with an ω-amino compound in the presence of ω-aminotransferase using them as a substrate to form an aldehyde-containing compound;
Quantifying the generated aldehyde-containing compound;
Production of the aldehyde-containing compound measured in the above step is correlated with the amount of the aldehyde-containing compound produced by using the α-aminotransferase having a known specific activity and the amount of the α-aminotransferase used at that time. Collating the amounts and calculating the specific activity of α-aminotransferase whose specific activity is unknown,
A method for measuring the specific activity of α-aminotransferase, comprising:
α−ケト酸２とω−アミノ化合物とを、それらを基質とするω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させて、含アルデヒド化合物を生成させる工程と、
この含アルデヒド化合物を、酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下、含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させて、還元型ニコチンアミド補酵素を生成させる工程と、
生成した還元型ニコチンアミド補酵素の吸光度を測定する工程と、
比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを用いることにより生成された還元型ニコチンアミド補酵素の吸光度、その際の当該α−アミノトランスフェラーゼの使用量との相関関係に、上記工程で測定した還元型ニコチンアミノ補酵素の吸光度を照合し、比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの比活性を算出する工程と
を有することを特徴とする、α−アミノトランスフェラーゼの比活性測定方法。 A step of producing α-keto acid 2 by allowing α-keto acid 1 and an amino acid, which can be a substrate of α-aminotransferase, to act on a predetermined amount of α-aminotransferase whose specific activity is unknown;
reacting α-keto acid 2 with an ω-amino compound in the presence of ω-aminotransferase using them as a substrate to form an aldehyde-containing compound;
A step of reacting the aldehyde-containing compound with aldehyde dehydrogenase using the aldehyde-containing compound as a substrate in the presence of an oxidized nicotinamide coenzyme to produce a reduced nicotinamide coenzyme;
Measuring the absorbance of the produced reduced nicotinamide coenzyme;
The reduced nicotine measured in the above step was correlated with the absorbance of the reduced nicotinamide coenzyme produced by using an α-aminotransferase having a known specific activity and the amount of the α-aminotransferase used at that time. A method for measuring the specific activity of α-aminotransferase, comprising: comparing the absorbance of amino coenzyme and calculating the specific activity of α-aminotransferase whose specific activity is unknown.
α−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、
ω−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるω−アミノ化合物と、
を有する、α−アミノトランスフェラーゼの比活性測定用キット。 Α-keto acid 1 and an amino acid which can be a substrate of α-aminotransferase whose specific activity is unknown;
ω-aminotransferase using α-keto acid 2 as a substrate, which is a reaction product of an enzyme reaction catalyzed by α-aminotransferase,
an ω-amino compound that can be a substrate for ω-aminotransferase;
A kit for measuring the specific activity of α-aminotransferase, comprising:
酸化型ニコチンアミド補酵素と
を有することを特徴とする、請求項２９に記載のα−アミノトランスフェラーゼの比活性測定用キット。 Furthermore, an aldehyde dehydrogenase using an aldehyde-containing compound that is a reaction product of ω-aminotransferase as a substrate,
30. The kit for measuring the specific activity of α-aminotransferase according to claim 29, comprising an oxidized nicotinamide coenzyme.
The kit for measuring the specific activity of α-aminotransferase according to claim 29 or 30, further comprising α-aminotransferase having a known specific activity.
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| JP2006055244A JP2006271375A (en) | 2005-03-02 | 2006-03-01 | METHOD FOR DETECTING alpha-AMINOTRANSFERASE ACTIVITY, METHOD FOR MEASURING SPECIFIC ACTIVITY, SCREENING METHOD AND METHOD FOR DETERMINATING alpha-KETO ACID |
Applications Claiming Priority (2)
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| JP2005058194 | 2005-03-02 | ||
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