JP2006271372A - Method for producing sugar chain - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、糖鎖、特にシアル酸含有糖鎖の製造法に関するものである。 The present invention relates to a method for producing a sugar chain, particularly a sialic acid-containing sugar chain.
近年、糖鎖についての研究が急速に進み、その機能が明らかになるにつれ、生理活性を有する糖鎖あるいは複合糖質の医薬品または機能性素材としての用途開発が注目を集めている。特に細胞表面のシアル酸を含有する糖鎖（シアル酸含有糖鎖）は、多くの微生物、ウイルス、毒素等の受容体として機能することが明らかであり、特定のシアル酸含有糖鎖（オリゴ糖）及びその類似体は、それらの感染や結合を阻止するのに有用と考えられている。 In recent years, as research on sugar chains rapidly progresses and their functions become clear, development of uses of physiologically active sugar chains or complex carbohydrates as pharmaceuticals or functional materials has attracted attention. In particular, it is clear that sugar chains containing sialic acid on the cell surface (sialic acid-containing sugar chains) function as receptors for many microorganisms, viruses, toxins, etc., and specific sialic acid-containing sugar chains (oligosaccharides) ) And its analogs are believed to be useful in preventing their infection and binding.
シアル酸含有糖鎖の１つであるシアリルＮ−アセチルラクトサミン（ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、「ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ」）は、リンパ組織や炎症部位への白血球の集積に関与する接着分子・セレクチンのリガンドとして機能することが知られ、またセレクチンとの相互作用を介して癌転移に関与すると言われているシアリルルイスＸ（ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ）やシアリルルイスＡ（ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ）の前駆体となる糖鎖である。 Sialyl N-acetyllactosamine (NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc, “SialylLacNAc”), one of sialic acid-containing sugar chains, functions as a ligand for adhesion molecules and selectins involved in the accumulation of leukocytes in lymphoid tissues and inflamed sites Sialyl Lewis X (NeuAcα2,3Galβ1,4 (Fucα1,3) GlcNAc) and Sialyl Lewis A (NeuAcα2,3Galβ1,4 (Fucα1), which are known to be involved in cancer metastasis through interaction with selectins. 4) A sugar chain that is a precursor of GlcNAc).
さらに、ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃは、インフルエンザウイルス感染時の宿主受容体である複合糖質の糖鎖構造でもあり、ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃをポリグルタミン酸に付与した所謂人工ムチンは、極めて高いインフルエンザウイルス吸着活性を示すことが報告されている。 Furthermore, SialylLacNAc is also a sugar chain structure of a complex carbohydrate that is a host receptor at the time of influenza virus infection, and so-called artificial mucin obtained by adding SialylLacNAc to polyglutamic acid has been reported to exhibit extremely high influenza virus adsorption activity. Yes.
このように、ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃは、機能糖鎖のコア構造であり、複合糖質の医薬品あるいは機能素材としての開発、商品化の重要な基材となる糖鎖（オリゴ糖）である。 Thus, SialylLacNAc is a core structure of a functional sugar chain, and is a sugar chain (oligosaccharide) that is an important base material for development and commercialization of complex carbohydrates as pharmaceuticals or functional materials.
ところで、現在市販されている糖鎖はごく限られた種類のものしかなく、しかも極めて高価である。たとえば、ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃは、試薬レベルでしか製造できず、その大量製造法が確立されていない。 By the way, there are only a limited number of sugar chains currently on the market, and they are extremely expensive. For example, SialylLacNAc can be produced only at the reagent level, and its mass production method has not been established.
従来、糖鎖の製造は、天然物からの抽出法、化学合成法あるいは酵素合成法、さらにはそれらの併用により行われていたが、その中でも酵素合成法が大量製造に適した方法であると考えられている。すなわち、（１）酵素合成法が化学合成法にみられる保護、脱保護といった煩雑な手順を必要とせず、速やかに目的の糖鎖を合成できる点、（２）酵素の基質特異性により、きわめて構造特異性の高い糖鎖を合成できる点などが他の方法より有利と考えられるためである。さらに、近年のＤＮＡ組換え技術の発達により種々の合成酵素が安価にしかも大量に生産できるようになりつつあることが、酵素合成法の優位性をさらに押し上げる結果となっている。 Conventionally, the production of sugar chains has been carried out by extraction from natural products, chemical synthesis or enzyme synthesis, and also a combination thereof. Among them, enzyme synthesis is a method suitable for mass production. It is considered. That is, (1) the enzymatic synthesis method does not require the complicated procedures such as protection and deprotection found in the chemical synthesis method, and the target sugar chain can be synthesized quickly. (2) The enzyme substrate specificity is extremely high. This is because, for example, a sugar chain with high structure specificity can be synthesized, which is considered advantageous over other methods. Furthermore, the fact that various synthetic enzymes can be produced at low cost and in large quantities due to the recent development of DNA recombination technology has further boosted the superiority of enzyme synthesis methods.
酵素合成法により糖鎖を合成する方法としては、糖鎖の加水分解酵素の逆反応を利用する方法および糖転移酵素を利用する方法の２通りの方法が考えられている。前者の方法は、基質として単価の安い単糖を用いることができるという利点はあるものの、反応自体は分解反応の逆反応を利用するものであり、合成収率や複雑な構造を持つ糖鎖合成への応用といった点では必ずしも最良の方法とは考えられていない。 As a method of synthesizing a sugar chain by an enzyme synthesis method, two methods, a method using a reverse reaction of a sugar chain hydrolase and a method using a glycosyltransferase, are considered. Although the former method has the advantage that a monosaccharide with a low unit price can be used as a substrate, the reaction itself uses the reverse reaction of the decomposition reaction, and the synthesis yield and synthesis of a sugar chain having a complex structure It is not always considered to be the best method in terms of application.
一方、後者の糖転移酵素を用いる合成法は、合成収率や複雑な構造を持つ糖鎖合成への応用といった点で前者の方法よりも有利であると考えられており、また、近年のＤＮＡ組換え技術の進歩により各種糖転移酵素の量産化も該技術の実現化への後押しとなっている。しかしながら、糖転移酵素を利用した合成法で用いる糖供与体である糖ヌクレオチドは、一部のものを除き依然として高価で、量的にも試薬レベルのわずかな供給量でしか提供し得ないと言う問題点も指摘されていた。 On the other hand, the latter synthesis method using glycosyltransferase is considered to be more advantageous than the former method in terms of synthesis yield and application to synthesis of sugar chains having a complicated structure. With the progress of recombinant technology, mass production of various glycosyltransferases is also supporting the realization of this technology. However, sugar nucleotides, which are sugar donors used in synthesis methods using glycosyltransferases, are still expensive except for some, and can be provided only in a small amount of reagent level. Problems were also pointed out.
たとえば、糖ヌクレオチドを糖供与体とし、糖転移酵素によりＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを合成する場合、第１段階として糖受容体としてＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、糖供与体としてウリジン５’−二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）、糖転移酵素としてβ１，４−ガラクトース転移酵素を用いてガラクトースを転移させてＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）を合成する。 For example, when SialylLacNAc is synthesized using a sugar nucleotide as a sugar donor and glycosyltransferase, N-acetylglucosamine (GlcNAc) is used as a sugar acceptor as a first step, and uridine 5′-diphosphate galactose (UDP) is used as a sugar donor. -Gal), galactose is transferred using β1,4-galactose transferase as a glycosyltransferase to synthesize N-acetyllactosamine (Galβ1,4GlcNAc).
次に、Ｎ−アセチルラクトサミンを糖受容体とし、シチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を糖供与体とし、シアル酸転移酵素によりシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸、以後「ＮｅｕＡｃ」とも略記）を転移させることで、目的とするＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを合成する。 Next, N-acetyllactosamine is used as a sugar acceptor, cytidine 5′-monophosphoryl N-acetylneuraminic acid (CMP-NeuAc) is used as a sugar donor, and sialic acid (N-acetylneuramin is obtained by sialyltransferase. The desired SialylLacNAc is synthesized by transferring an acid (hereinafter abbreviated as “NeuAc”).
糖転移酵素反応で生成・蓄積するヌクレオチドは、一般には更なる糖転移反応を阻害する。例えば、シアル酸転移反応によりシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）が生成するが、ＣＭＰはシアル酸転移酵素活性を阻害するため、ＣＭＰを反応系より除去しないとシアル酸転移反応の効率は低下する。そのため、通常、ホスファターゼなどの添加によりＣＭＰを分解するなどの操作も必要となり、このような理由からも、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃなどの高価な糖ヌクレオチドを直接原料としてＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを合成することは、実用的な方法とは到底なり得なかった。 Nucleotides generated and accumulated by glycosyltransferase reactions generally inhibit further glycosyltransferase reactions. For example, cytidine 5'-monophosphate (CMP) is produced by sialic acid transfer reaction, but CMP inhibits sialic acid transferase activity, so if CMP is not removed from the reaction system, the efficiency of sialic acid transfer reaction is reduced. . For this reason, an operation such as decomposing CMP by adding phosphatase or the like is usually required, and for this reason, it is practical to synthesize SialylLacNAc using an expensive sugar nucleotide such as CMP-NeuAc directly as a raw material. It could not be the method.
このため、糖ヌクレオチドのサイクル合成と糖転移反応の組み合せによる糖鎖の合成法が考案されている。糖ヌクレオチドのサイクル合成は、糖転移反応により生成するヌクレオシド５’−ジリン酸（ＮＤＰ）あるいはヌクレオシド５’−モノリン酸（ＮＭＰ）をリン酸化して糖転移酵素活性を阻害するＮＤＰあるいはＮＭＰの蓄積を排除するとともに、糖ヌクレオチド合成の基質となるヌクレオシド５’−トリリン酸（ＮＴＰ）まで再生し、酵素的に糖ヌクレオチドを再生させるというものである。 For this reason, a method for synthesizing sugar chains by combining a cycle synthesis of sugar nucleotides and a sugar transfer reaction has been devised. The cyclic synthesis of sugar nucleotides involves the accumulation of NDP or NMP which inhibits glycosyltransferase activity by phosphorylating nucleoside 5'-diphosphate (NDP) or nucleoside 5'-monophosphate (NMP) produced by transglycosylation. In addition to eliminating the nucleoside 5′-triphosphate (NTP), which is a substrate for sugar nucleotide synthesis, the sugar nucleotide is regenerated enzymatically.
ＮＭＰもしくはＮＤＰからのＮＴＰの再生には、（１）MyokinaseやPyruvate kinaseなどの酵素、及びアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）あるいはホスホエノールピルビン酸などのリン酸供与体を用いてＮＭＰもしくはＮＤＰを酵素的にリン酸化する方法（Pure & Appl. Chem., 65, 803-808 (1993), J. Am. Chem., 113, 6300-6302 (1991), U.S. Patent 5,728,554、Nature Biotech., 16, 769-772 (1998)）、（２）微生物生菌体（Corynebacterium ammnoniagenusや大腸菌）を用いてＮＭＰもしくはＮＤＰをリン酸化する方法（Nature Biotech. 16, 847-850 (1998), Carbohydorate Res. 316, 179-183 (1999), Appl. Microbiol. Biotechnol., 53: 257-261 (2000), Org. Biomol. Chem., 1, 3058 (2003), Appl. Environ. Microbiol., 69, 2110 (2003)）、及び（３）酵母菌体を用いる方法（特開２００２−３３５９８８）が報告されている。 For the regeneration of NTP from NMP or NDP, (1) NMP or NDP using an enzyme such as Myokinase or Pyruvate kinase and a phosphate donor such as adenosine 5′-triphosphate (ATP) or phosphoenolpyruvate. (Pure & Appl. Chem., 65, 803-808 (1993), J. Am. Chem., 113, 6300-6302 (1991), US Patent 5,728,554, Nature Biotech., 16 , 769-772 (1998)), (2) A method of phosphorylating NMP or NDP using a living microorganism (Corynebacterium ammnoniagenus or E. coli) (Nature Biotech. 16, 847-850 (1998), Carbohydorate Res. 316 , 179-183 (1999), Appl. Microbiol. Biotechnol., 53: 257-261 (2000), Org. Biomol. Chem., 1, 3058 (2003), Appl. Environ. Microbiol., 69, 2110 (2003 )), And (3) a method using yeast cells (JP 2002-335988) has been reported.
しかしながら、上記（１）の方法は、リン酸供与体となるＡＴＰあるいはホスホエノールピルビン酸が高価であるという問題がある。また、ＮＴＰを基質とした糖ヌクレオチド合成の際にピロリン酸が生成するが、蓄積したピロリン酸は糖ヌクレオチド合成を抑制するため、ピロリン酸分解酵素を添加して無機リン酸に分解する必要がある。さらに、無機リン酸は反応の進行と共に蓄積するが、糖転移酵素反応に必要な金属イオン（マグネシウムあるいはマンガンなど）と不溶性沈殿を形成するため、酵素反応の進行が抑制される。そのため、反応途中に金属イオンを再添加するなど煩雑な工程とならざるを得ない問題もあり、実用化に適していない。 However, the method (1) has a problem that ATP or phosphoenolpyruvate serving as a phosphate donor is expensive. In addition, pyrophosphate is generated during sugar nucleotide synthesis using NTP as a substrate, but the accumulated pyrophosphate must be decomposed into inorganic phosphate by adding pyrophosphate-degrading enzyme to suppress sugar nucleotide synthesis. . In addition, inorganic phosphate accumulates with the progress of the reaction, but forms an insoluble precipitate with metal ions (such as magnesium or manganese) necessary for the glycosyltransferase reaction, so that the progress of the enzyme reaction is suppressed. Therefore, there is a problem that a complicated process such as re-addition of metal ions during the reaction is unavoidable, which is not suitable for practical use.
また、上記（２）の方法においては、ＮＭＰもしくはＮＤＰのリン酸化反応に膨大な微生物菌体量が必要であるため、その調製のための設備及びコスト面での問題がある。また、Corynebacterium菌や大腸菌自身のピロリン酸分解活性は低く、pyrophophatase添加あるいは該酵素生産菌の添加も必要となる問題がある。 In the method (2), a huge amount of microbial cells is required for the phosphorylation reaction of NMP or NDP, and there are problems in equipment and cost for the preparation. In addition, Corynebacterium bacteria and Escherichia coli themselves have low pyrophosphate-degrading activity, and there is a problem that it is necessary to add pyrohophatase or the enzyme-producing bacteria.
さらに、上記（１）〜（３）の方法では、１種類の糖ヌクレオチドをサイクル合成させて糖転移反応を行わせた報告のみで、複数の糖ヌクレオチドをサイクル合成させて、複数の異なる糖転移反応を起こさせ、オリゴ糖の伸長に成功した例は報告されていない。 Furthermore, in the methods (1) to (3) described above, only a plurality of sugar nucleotides can be synthesized by cyclic synthesis of a plurality of sugar nucleotides only by a report in which one type of sugar nucleotide is synthesized by cycle synthesis. There have been no reports of successful reactions and oligosaccharide extension.
従って、ＵＤＰ−Ｇａｌのサイクル合成に伴うガラクトース転移反応のみで合成できるＮ−アセチルラクトサミンの大量製造は可能である（Carbohydr. Res., 316, 179 (1999)、特開２００２−３３５９８８）が、２段階の異なる糖転移反応を必要とするＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを合成できるかは不明であり、効率的な製造法は確立されていない。 Therefore, mass production of N-acetyllactosamine that can be synthesized only by the galactose transfer reaction accompanying the cycle synthesis of UDP-Gal is possible (Carbohydr. Res., 316, 179 (1999), JP 2002-335988). It is unclear whether SialylLacNAc that requires two different glycosyltransferase reactions can be synthesized, and an efficient production method has not been established.
一方、シアル酸含有糖鎖製造上の問題として、シアル酸転移反応の際使用するシアル酸の供与体であるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃが高価な原料であることは前述したが、糖部分であるＮｅｕＡｃ自身も高価であり、糖ヌクレオチドのサイクル合成を利用したとしてもＮｅｕＡｃの直接使用は製造コストを押し上げる要因となる。そのため、安価な原料であるＧｌｃＮＡｃを原料とするＮｅｕＡｃの製造法（特開平５−２１１８８４、特開平２００１−１３６９８２）、及びＧｌｃＮＡｃとＣＭＰを原料とするＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法（国際公開ＷＯ２００１／００９８３０）が開発されているが、これらの系を利用したＣＮＰ−ＮｅｕＡｃのサイクル合成をオリゴ糖へのシアル酸転移反応に適用できるかどうかは不明であり、そのことに関する報告もない。 On the other hand, as a problem in the production of sialic acid-containing sugar chains, as described above, CMP-NeuAc, which is a donor of sialic acid used in the sialic acid transfer reaction, is an expensive raw material. Even if the cycle synthesis of sugar nucleotides is used, the direct use of NeuAc is a factor that increases the manufacturing cost. Therefore, a method for producing NeuAc using GlcNAc, which is an inexpensive raw material (Japanese Patent Laid-Open Nos. 5-211884 and 2001-136882), and a method for producing CMP-NeuAc using GlcNAc and CMP (International Publication WO2001 / 009830). However, it is unclear whether cyclic synthesis of CNP-NeuAc using these systems can be applied to sialic acid transfer reaction to oligosaccharides, and there is no report on this.
このように、ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを糖転移酵素を用いて製造する場合、現状ではＧｌｃＮＡｃへのガラクト−ス転移反応を行わせ、Ｎ−アセチルラクトサミンを生成させ、合成反応液からＮ−アセチルラクトサミンを精製し、次にシアル酸転移反応によりシアル酸（ＮｅｕＡｃ）を付与させてＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを合成し、合成反応液から目的物質を精製するという２段階の煩雑な製造工程が必要であり、必ずしも実用的な製法とは言えない。 Thus, when producing SialylLacNAc using a glycosyltransferase, at present, galactose transfer reaction to GlcNAc is performed to produce N-acetyllactosamine, and N-acetyllactosamine is purified from the synthesis reaction solution. Then, sialic acid (NeuAc) is added by sialic acid transfer reaction to synthesize SialylLacNAc and the target substance is purified from the synthesis reaction solution, which requires a practical production method. It can not be said.
また、原料として使用するシアル酸（ＮｅｕＡｃ）は高価であり、ＮｅｕＡｃの直接使用も工業化においては大きな問題となる。 Further, sialic acid (NeuAc) used as a raw material is expensive, and the direct use of NeuAc is also a big problem in industrialization.
従って、ＵＤＰ−ＧａｌとＣＭＰ−ＮｅｕＡｃのサイクル合成と糖転移酵素を組み合わせたＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの実用的な製造法、より効率的には、糖原料としてＮｅｕＡｃを使用せず、代わりにＧｌｃＮＡｃを原料とするＮｅｕＡｃ合成を伴うＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの製造法を提供することができれば、工業的に極めて有利な方法となり得る。 Therefore, a practical method for producing SialylLacNAc by combining cyclic synthesis of UDP-Gal and CMP-NeuAc and glycosyltransferase, more efficiently, NeuAc is not used as a sugar raw material, but NeuAc is used instead of GlcNAc as a raw material. If a method for producing SialylLacNAc with synthesis can be provided, it can be an industrially extremely advantageous method.
本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、（１）酵母菌体は、長時間に渡り高いヌクレオチドのリン酸化活性及びピロリン酸分解活性を保持し、酵母菌体を利用することで連続的な複数の糖ヌクレオチドのサイクル合成が可能であり、連続的な複数の糖転移反応をワンポットで実行できること、（２）このような系は３糖以上のすべての糖鎖合成に利用できること、（３）さらに、ＧｌｃＮＡｃを原料とするＮｅｕＡｃ合成系を上記糖鎖合成系に組み合わせることで、高価なＮｅｕＡｃを使用せずにシアル酸含有糖鎖が製造可能であることを見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明は、以下の通りのものである。 As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have (1) yeast cells retain high nucleotide phosphorylation activity and pyrophosphate decomposition activity for a long time, and use yeast cells. It is possible to perform cyclic synthesis of a plurality of continuous sugar nucleotides, and to perform a plurality of continuous sugar transfer reactions in one pot. (2) Such a system is suitable for synthesizing all sugar chains of three or more sugars. (3) Further, it was found that a sialic acid-containing sugar chain can be produced without using expensive NeuAc by combining a NeuAc synthesis system using GlcNAc as a raw material with the above sugar chain synthesis system. Completed the invention. Therefore, the present invention is as follows.
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ 複数の糖転移酵素を用いて、糖供与体としての糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ１）を糖受容体（Ｂ）に転移させて糖鎖（Ａ１−Ｂ）を合成し、次いで糖供与体としての別の糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ２）を得られた糖鎖（Ａ１−Ｂ）に転移させて新たな糖鎖（Ａ２−Ａ１−Ｂ）を合成し、このような反応を複数回繰り返して目的とする糖鎖（Ａｎ−・・・Ａ２−Ａ１−Ｂ）（ただし、ｎは整数を示す）を製造する方法において、（ａ）酵母菌体を併用する、（ｂ）糖ヌクレオチドをヌクレオチドと糖から系内で合成及び再生する、（ｃ）途中で精製処理を行わない、ことを特徴とする糖鎖の製造法。
That is, the present invention is as follows.
[1] A sugar chain (A1-B) is synthesized by transferring a sugar moiety (A1) of a sugar nucleotide as a sugar donor to a sugar acceptor (B) using a plurality of glycosyltransferases, and then sugar donation The sugar part (A2) of another sugar nucleotide as a body is transferred to the obtained sugar chain (A1-B) to synthesize a new sugar chain (A2-A1-B), and such a reaction is repeated several times. In the method for producing a target sugar chain (An-... A2-A1-B) (where n represents an integer) repeatedly, (a) a yeast cell is used in combination, (b) a sugar nucleotide A method for producing a sugar chain, characterized in that it is synthesized and regenerated from a nucleotide and a sugar in the system, and (c) no purification treatment is performed in the middle.
［２］ １以上の糖転移酵素と糖ヌクレオチドを用いて、糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ）を糖受容体（Ｂ）に転移させて糖鎖（Ａｍ・・・Ａ１−Ｂ）（ただし、ｍは１以上の整数を示す）を調製し、最後に糖供与体としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を用い、シアル酸転移酵素によりシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を糖鎖（Ａｍ−・・・−Ａ１−Ｂ）に転移させ、目的とするシアル酸含有糖鎖（シアリル化Ａｍ−・・・−Ａ１−Ｂ）を合成する、上記［１］記載の製造法。 [2] Using one or more glycosyltransferases and sugar nucleotides, the sugar moiety (A) of the sugar nucleotide is transferred to the sugar receptor (B) to form a sugar chain (Am ... A1-B) (where m Is an integer of 1 or more), and finally cytidine 5′-monophosphoryl N-acetylneuraminic acid (CMP-NeuAc) is used as a sugar donor, and sialic acid (N-acetylneutonic acid) is obtained by sialyltransferase. [Laminic acid] is transferred to a sugar chain (Am-... -A1-B) to synthesize a target sialic acid-containing sugar chain (sialylated Am -...- A1-B) [1] The manufacturing method described.
［３］ 糖供与体としてウリジン５’−二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）、糖転移酵素としてガラクトース転移酵素を用いてガラクトースを糖受容のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に転移させてＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）を合成し、次いで、糖供与体としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を用い、シアル酸転移酵素によりシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）をＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）転移させ、シアリルＮ−アセチルラクトサミン（ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）を合成する、上記［１］記載の製造法。 [3] Using uridine 5′-diphosphate galactose (UDP-Gal) as a sugar donor and galactose transferase as a glycosyltransferase, galactose is transferred to N-acetylglucosamine (GlcNAc), which is a sugar acceptor. Lactosamine (Galβ1,4GlcNAc) was synthesized, then cytidine 5′-monophosphoryl N-acetylneuraminic acid (CMP-NeuAc) was used as a sugar donor, and sialic acid (N-acetylneuramin) by sialyltransferase The method according to [1] above, wherein the acid is transferred to N-acetyllactosamine (Galβ1,4GlcNAc) to synthesize sialyl N-acetyllactosamine (NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc).
［４］Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）とシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、上記［２］又は［３］記載の製造法。
［５］Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）とウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、上記［２］又は［３］記載の製造法。
[4] Synthesis and regeneration of cytidine 5′-monophosphoryl N-acetylneuraminic acid (CMP-NeuAc) using N-acetylneuraminic acid (NeuAc) and cytidine 5′-monophosphate (CMP) as raw materials, [2] or [3].
[5] Synthesis and regeneration of cytidine 5′-monophosphoryl N-acetylneuraminic acid (CMP-NeuAc) using N-acetylneuraminic acid (NeuAc) and uridine 5′-monophosphate (UMP) as raw materials, [2] or [3].
［６］Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、上記［２］又は［３］記載の製造法。
［７］Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、上記［２］又は［３］記載の製造法。
[6] Synthesis and regeneration of cytidine 5′-monophosphoryl N-acetylneuraminic acid (CMP-NeuAc) using N-acetylglucosamine (GlcNAc) and cytidine 5′-monophosphate (CMP) as raw materials [2] Or the manufacturing method of [3] description.
[7] Synthesizing and regenerating cytidine 5′-monophosphoryl N-acetylneuraminic acid (CMP-NeuAc) using N-acetylglucosamine (GlcNAc) and uridine 5′-monophosphate (UMP) as raw materials [2] Or the manufacturing method of [3] description.
本発明により、医薬品あるいは機能性素材となる複合糖質の用途開発、製造のための基材となる糖鎖、特にシアル酸含有糖鎖、具体的にはＳｉｌｙｌＬａｃＮＡｃの安価かつ効率的に製造することが可能となった。 According to the present invention, low-cost and efficient production of sugar chains, particularly sialic acid-containing sugar chains, specifically SilylLacNAc, which are used as base materials for the development and manufacture of glycoconjugates as pharmaceuticals or functional materials. Became possible.
本発明は、上述したように、複数の糖転移酵素を用いて、糖供与体としての糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ１）を糖受容体（Ｂ）に転移させて糖鎖（Ａ１−Ｂ）を合成し、次いで糖供与体としての別の糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ２）を得られた糖鎖（Ａ１−Ｂ）に転移させて新たな糖鎖（Ａ２−Ａ１−Ｂ）を合成し、このような反応を複数回繰り返して目的とする糖鎖（Ａｎ−・・・Ａ２−Ａ１−Ｂ）（ただし、ｎは整数を示す）を製造する方法において、（ａ）酵母菌体を併用する、（ｂ）糖ヌクレオチドをヌクレオチドと糖から系内で合成及び再生する、（ｃ）途中で精製処理を行わない、ことを特徴とする糖鎖の製造法に関するものである。 As described above, the present invention uses a plurality of glycosyltransferases to transfer a sugar moiety (A1) of a sugar nucleotide as a sugar donor to a sugar acceptor (B) to thereby convert a sugar chain (A1-B). Synthesizing, and then transferring the sugar moiety (A2) of another sugar nucleotide as a sugar donor to the obtained sugar chain (A1-B) to synthesize a new sugar chain (A2-A1-B). In a method for producing a target sugar chain (An -... A2-A1-B) (where n represents an integer) by repeating such a reaction a plurality of times, (a) using yeast cells together, The present invention relates to a method for producing a sugar chain, characterized in that (b) a sugar nucleotide is synthesized and regenerated from the nucleotide and sugar in the system, and (c) no purification treatment is performed in the middle.
使用する糖転移酵素としては、目的とする糖鎖に応じ、公知の糖転移酵素の中から適宜選択して使用すればよい。そのような糖転移酵素としては、グルコース転移酵素、ガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルクルコサミン転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、シアル酸転移酵素、フコース転移酵素、マンノース転移酵素、グルクロン酸転移酵素などを例示することができる。 The glycosyltransferase used may be appropriately selected from known glycosyltransferases according to the target sugar chain. Examples of such glycosyltransferases include glucose transferase, galactose transferase, N-acetylcurcosamine transferase, N-acetylgalactosamine transferase, sialyltransferase, fucose transferase, mannose transferase, glucuronic acid transferase and the like. Can be illustrated.
このような糖転移酵素は、当該活性を有する限りどのような形態であってもよい。なお、酵素調製の簡便さと共に調製効率を高めるため、該酵素遺伝子をクローン化し、微生物菌体内で大量発現させ、該酵素の大量調製を行う、いわゆる遺伝子操作技術を用いた酵素生産が最も都合が良い。使用する酵素標品としては具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素調製物などを例示することができる。 Such a glycosyltransferase may be in any form as long as it has the activity. In order to increase the preparation efficiency as well as the ease of enzyme preparation, the enzyme production using the so-called gene manipulation technique, in which the enzyme gene is cloned, expressed in large quantities in microbial cells, and the enzyme is prepared in large quantities, is most convenient. good. Specific examples of the enzyme preparation to be used include microbial cells, processed products of the cells, enzyme preparations obtained from the processed products, and the like.
微生物の菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。具体的に、大腸菌（Escherichia coli）属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、２０〜５０℃で５〜５０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することにより糖転移酵素活性を有する微生物菌体を調製することができる。 Preparation of the microbial cells can be performed by a method of collecting the cells by centrifugation or the like after culturing by a conventional method using a medium in which the microorganism can grow. Specifically, taking bacteria belonging to Escherichia coli as an example, bouillon medium, LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% sodium chloride) or 2 × YT medium ( 1.6% tryptone, 1% yeast extract, 0.5% salt, etc.) can be used. After inoculating the medium with the inoculum, culture is carried out at 20-50 ° C. for about 5-50 hours with stirring as necessary. The microbial cells having glycosyltransferase activity can be prepared by collecting the microbial cells by centrifuging the obtained culture solution.
微生物の菌体処理物としては、上記微生物菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。 Processed microorganism cells include mechanical destruction (using a Waring blender, French press, homogenizer, mortar, etc.), freeze-thawing, self-digestion, drying (by freeze-drying, air drying, etc.), enzyme treatment ( Lysozyme), sonication, chemical treatment (by acid, alkali treatment, etc.), etc. be able to.
酵素調製物としては、上記菌体処理物から当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示することができる。 As the enzyme preparation, the fraction having the enzyme activity from the above-mentioned processed bacterial cell product is purified by usual enzyme purification means (salting out treatment, isoelectric point precipitation treatment, organic solvent precipitation treatment, dialysis treatment, various chromatographic treatments, etc. A crude enzyme or a purified enzyme obtained by applying ().
糖供与体としての糖ヌクレオチドは、糖ヌクレオチドそのものを反応系に添加するのではなく、酵母菌体や合成酵素を用いてヌクレオチドと糖から系内で合成及び再生する。
使用するヌクレオチド（ＮＭＰ，ＮＤＰ，ＮＴＰ）は、糖ヌクレオチドに応じて市販の製品を使用することができる。具体的には、ウリジン５’−モノリン酸、シチジン５’−モノリン酸、グアノシン５’−モノリン酸などを例示することができ、使用濃度としては１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜５０ｍＭの範囲から適宜設定できる。
また、糖も糖ヌクレオチドに応じて対応する市販の製品が使用できる。具体的には、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、マンノースなど例示することでき、使用濃度としては、１〜２００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭの範囲から適宜設定できる。
Sugar nucleotides as sugar donors are synthesized and regenerated in the system from nucleotides and sugars using yeast cells or synthetic enzymes, rather than adding the sugar nucleotides themselves to the reaction system.
As the nucleotide (NMP, NDP, NTP) to be used, a commercially available product can be used according to the sugar nucleotide. Specifically, uridine 5′-monophosphate, cytidine 5′-monophosphate, guanosine 5′-monophosphate and the like can be exemplified, and the concentration used is appropriately 1 to 200 mM, preferably 10 to 50 mM. Can be set.
Also, commercially available products corresponding to sugars can be used according to sugar nucleotides. Specifically, glucose, galactose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, N-acetylneuraminic acid, mannose and the like can be exemplified, and the concentration used is from 1 to 200 mM, preferably from 20 to 100 mM. It can be set appropriately.
添加する酵母菌体としては、市販のパン酵母あるいはワイン酵母などを使用することができる。このような酵母菌体は、生酵母、乾燥酵母いずれであってもかまわないが、反応収率の点からは乾燥酵母を用いるのが好ましい。添加量は１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜５％の範囲から適宜設定できる。 As the yeast cells to be added, commercially available baker's yeast or wine yeast can be used. Such yeast cells may be either live yeast or dry yeast, but it is preferable to use dry yeast from the viewpoint of reaction yield. The addition amount can be appropriately set within the range of 1 to 10% (w / v), preferably 2 to 5%.
上記酵母菌体によりヌクレオチドと糖をから目的とする糖ヌクレオチドを合成できない場合には、合成に必要な公知の酵素を反応系に添加する。そのような酵素としては、ガラクトキナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼ等のキナーゼ類、ヘキソース１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ等のトランスフェラーゼ類、ＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、ＧＤＰマンノースピロホスホリラーゼ等の糖ヌクレオチドピロホスホリラーゼ類、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ（合成酵素）、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｐ２−エピメラーゼなどのエピメラ−ゼ類、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼなどを例示することができ、目的とする糖鎖に必要な糖ヌクレオチドの合成に必須な各種酵素を前記転移酵素と同様に調製して使用すればよい。 When the target sugar nucleotide cannot be synthesized from nucleotide and sugar by the yeast cells, a known enzyme necessary for synthesis is added to the reaction system. Examples of such enzymes include kinases such as galactokinase, N-acetylglucosamine kinase, N-acetylgalactosamine kinase, transferases such as hexose 1-phosphate uridylyltransferase, UDP glucose pyrophosphorylase, GDP mannose pyrophosphorylase, etc. Examples of sugar nucleotide pyrophosphorylases, CMP-NeuAc synthetase (synthetic enzyme), epimerases such as N-acetylglucosamine 6-P2-epimerase, N-acetylneuraminic acid lyase, etc. Various enzymes essential for the synthesis of sugar nucleotides necessary for sugar chains may be prepared and used in the same manner as the transferase.
糖受容体としては、目的とする糖鎖に応じて、単糖、オリゴ糖、およびそれらを直接又はスペーサーを介して担体に結合させた担持物を使用することができる。 As the sugar receptor, monosaccharides, oligosaccharides, and a support obtained by binding them to a carrier directly or via a spacer can be used depending on the target sugar chain.
単糖としては、ガラクトース、グルコース、マンノース、フルクトース、リボース、アラビノース、キシロース、キシリロース、リブロース、エリトロース、トレオース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、タガトース、ソルボース、プシコース、Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトヘプトース、Ｄ−グリセロ−グルコヘプトース、ＤＬ−グリセロ−Ｄ−マンノヘプトース、アロヘプツロース、アルトヘプツロース、タロヘプツロース、マンノヘプツロース、オクツロース、ノヌロース、Ｄ−グリセロ−Ｌ−ガラクトオクツロース、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノオクツロース、ノムロース、フコース、ラムノース、アロメチロース、キノボース、アンチアロース、タロメチロース、ジキタロース、ジギドキソース、シマロース、チベロース、アベロース、パラトース、コリトース、アスカリロース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、イズロン酸、グルロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチル−Ｏ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコイルノイラミン酸、ムラミン酸、並びにその誘導体が挙げられる。 Monosaccharides include galactose, glucose, mannose, fructose, ribose, arabinose, xylose, xylose, ribulose, erythrose, threose, lyxose, allose, altrose, gulose, idose, talose, tagatose, sorbose, psicose, D-glycero- D-galactoheptose, D-glycero-glucoheptose, DL-glycero-D-mannoheptose, aloheptulose, altoheptulose, taroheptulose, mannoheptulose, octulose, nonulose, D-glycero-L-galactooctulose, D- Glycero-D-mannooctulose, nomulose, fucose, rhamnose, allomethylose, quinobose, antiallose, taromethylose, diquitarose, digitokisose Cimarose, Tiberose, Abelose, Palatose, Coritose, Ascarylose, Glucuronic acid, Galacturonic acid, Mannuronic acid, Iduronic acid, Gururonic acid, Glucosamine, Galactosamine, Mannosamine, Neuraminic acid, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, N-acetyl Mannosamine, N-acetylneuraminic acid, N-acetyl-O-acetylneuraminic acid, N-glycolneuraminic acid, muramic acid, and derivatives thereof may be mentioned.
オリゴ糖としては、例えばマルトース、セロビオース、ラクトース、キシロビオース、イソマルトース、ケンチオビオース、メリビオース、プランテオビオース、ルチノース、プリメベロース、ビシアノース、ニゲロース、ラミナリビオース、ツラノース、コージビオース、ソホロース、スクロース、トレハロース、キトビース、ヒアロビオウロン酸、コンドロシン、セロビオウロン酸、ラフィノース、ゲンチアノース、メレジトース、ブランテオース、ケストース、マルトトリオース、パノース、イソマルトトリオース、スタキオース、ベルバスコース、シクロデキストリン、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、乳汁オリゴ糖（例えばフコシルラクトース、シアリルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースなど）、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルマタンなどのグリコサミノグリカン、ＡＢＯ型血液型糖鎖、各種Ｎ−結合型糖鎖、各種ムチン（Ｏ−結合）型糖鎖、スフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質などの糖脂質糖鎖、並びに以上の誘導体などが挙げられる。 Examples of oligosaccharides include maltose, cellobiose, lactose, xylobiose, isomaltose, kenthiobiose, melibiose, planteobiose, lutinose, primebellose, vicyanose, nigerose, laminaribiose, tulanose, cordobiose, sophorose, sucrose, chitobee , Hyarobiouronic acid, chondrosin, cellobiouronic acid, raffinose, gentianose, melezitose, blanteose, kestose, maltotriose, panose, isomaltotriose, stachyose, verbusose, cyclodextrin, starch, cellulose, chitin, chitosan, milk oligosaccharide (For example, fucosyl lactose, sialyl lactose, lacto-N-tetraose, lacto-N-fucopene Ose, lacto-N-neotetraose, etc.), glycosaminoglycans such as hyaluronic acid, chondroitin, dermatan, ABO blood group sugar chains, various N-linked sugar chains, various mucin (O-linked) sugar chains , Glycolipid sugar chains such as glycosphingolipids and glyceroglycolipids, and the above derivatives.
担体としては、例えば、タンパク質、脂質、核酸などの生体試料、金、白金などの金属微粒子、鉄、酸化鉄などの磁性金属微粒子、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、アガロース、デキストランなどの高分子ポリマーなどが挙げられる。これらの担体と糖鎖とのスペーサーとしては、例えば（ポリ）エチレングリコール、種々のアルキル鎖（例えば、炭素数１〜２０のアルキル）などが挙げられる。 Examples of the carrier include biological samples such as proteins, lipids, and nucleic acids, metal fine particles such as gold and platinum, magnetic metal fine particles such as iron and iron oxide, and polymer polymers such as polystyrene, polyacrylamide, agarose, and dextran. It is done. Examples of the spacer between the carrier and the sugar chain include (poly) ethylene glycol, various alkyl chains (for example, alkyl having 1 to 20 carbon atoms), and the like.
上記ヌクレオチド、糖、酵母菌体、糖受容体以外に、好ましくは無機リン酸とエネルギー源を反応系に添加する。使用する無機リン酸としては、リン酸カリウムなどをそのまま使用することもできるが、リン酸緩衝液の形態で使用するのが好ましい。使用濃度は、たとえば１〜５００ｍＭ、好ましくは５０〜２００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。また、リン酸緩衝液のｐＨも６．０〜８．０の範囲から適宜設定すればよい。また、エネルギー源としては、グルコース、フラクトースなどの糖類、酢酸、クエン酸などの有機酸を使用することができる。 In addition to the nucleotides, sugars, yeast cells, and sugar receptors, preferably inorganic phosphoric acid and an energy source are added to the reaction system. As the inorganic phosphoric acid to be used, potassium phosphate or the like can be used as it is, but it is preferably used in the form of a phosphate buffer. The use concentration can be appropriately set, for example, in the range of 1 to 500 mM, preferably 50 to 200 mM. Further, the pH of the phosphate buffer may be set as appropriate from the range of 6.0 to 8.0. As the energy source, saccharides such as glucose and fructose, and organic acids such as acetic acid and citric acid can be used.
糖鎖の合成反応は、転移酵素毎に、リン酸緩衝液などの緩衝液中、５〜３５℃以下、好ましくは１０〜３０℃で１〜４０時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。なお、各転移反応間で単離精製処理を行う必要はない。 The sugar chain synthesis reaction is carried out by reacting with each transferase in a buffer solution such as a phosphate buffer at 5 to 35 ° C. or less, preferably at 10 to 30 ° C. for about 1 to 40 hours with stirring as necessary. Can be implemented. It is not necessary to perform isolation and purification treatment between the transfer reactions.
ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを例に挙げ、本発明を具体的に説明すると、ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの製造の第１段階のＮ−アセチルラクトサミンの合成には、リン酸緩衝液中に酵母、ウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）、ガラクトース、ガラクトース転移の基質（受容体）となるＧｌｃＮＡｃ、エネルギー源としてグルコースなどの糖類、ウリジン５’−ジリン酸（ＵＤＰ）−グルコースからのＵＤＰ−ガラクトース合成に関与する酵素（ガラクトキナーゼ及びヘキソース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ），さらにβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを添加し、５〜３５℃以下、好ましくは１０〜３０℃で１〜４０時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。 Taking SialylLacNAc as an example, the present invention will be described in detail. For the synthesis of N-acetyllactosamine in the first stage of the production of SialylLacNAc, yeast, uridine 5′-monophosphate (UMP) was added in a phosphate buffer. , Galactose, GlcNAc serving as a substrate (receptor) for galactose transfer, sugars such as glucose as an energy source, uridine 5′-diphosphate (UDP) -enzymes involved in UDP-galactose synthesis from glucose (galactokinase and hexose- 1-phosphate uridyltransferase) and β1,4-galactosyltransferase, and the reaction can be carried out by stirring at 5 to 35 ° C., preferably 10 to 30 ° C. for about 1 to 40 hours, with stirring as necessary. .
次ぎに、第２段階として、Ｎ−アセチルラクトサミン生成後、これを単離精製することなく、当該合成液にＣＭＰ、ＮｅｕＡｃ、シアリルトランスフェラーゼを添加し、エネルギー源として糖類をさらに添加し、５〜３５℃以下、好ましくは１０〜３０℃で１〜４０時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。なお、３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ合成の場合にはα２，３−シアリルトランスフェラーゼ、６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを合成する場合には、α２，６−シアリルトランスフェラーゼを用いれば良い。 Next, as a second step, after producing N-acetyllactosamine, without isolating and purifying it, CMP, NeuAc, sialyltransferase is added to the synthesis solution, saccharides are further added as an energy source, The reaction can be carried out at 35 ° C. or lower, preferably 10 to 30 ° C. for about 1 to 40 hours with stirring as necessary. In the case of synthesis of 3'-SialylLacNAc, α2,3-sialyltransferase may be used, and in the case of synthesis of 6'-SialylLacNAc, α2,6-sialyltransferase may be used.
第２段階のシアル酸転移反応を行う際、ＣＭＰ添加の代わりに、ＣＴＰ合成酵素とグルタミンなどアミノ基の供与体を添加することにより合成反応液中に生成しているＵＴＰをＣＴＰに変換させること（国際公開ＷＯ９９／４９０７３）でＣＭＰ−ＮｅｕＡｃのサイクル合成を可能ならしめシアル酸転移反応を実施することもできる。 When performing the second-stage sialic acid transfer reaction, instead of adding CMP, by adding an amino group donor such as CTP synthase and glutamine, the UTP generated in the synthesis reaction solution is converted to CTP. (International Publication WO99 / 49073), it is also possible to carry out a cyclic synthesis of CMP-NeuAc and to carry out a sialic acid transfer reaction.
さらに、第２段階のＮｅｕＡｃ添加の代わりに公知のＧｌｃＮＡｃからのＮｅｕＡｃ変換活性を有する組換え大腸菌（国際公開ＷＯ２００４／００９８３０）などＮｅｕＡｃ合成系を添加して残存するＧｌｃＮＡｃをＮｅｕＡｃへ変換させることで、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃのサイクル合成を可能ならしめシアル酸転移反応を実施することも可能である。 Furthermore, instead of adding NeuAc in the second step, a NeuAc synthesis system such as recombinant Escherichia coli having NeuAc conversion activity from known GlcNAc (International Publication WO2004 / 009830) is added to convert the remaining GlcNAc to NeuAc, It is also possible to carry out a sialic acid transfer reaction by enabling cyclic synthesis of CMP-NeuAc.
こうして合成して得られたＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ等の糖鎖は、通常のオリゴ糖の精製法（ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析など）を用いて単離精製することができる。 The sugar chains such as SialylLacNAc obtained by synthesis in this way can be isolated and purified using a conventional oligosaccharide purification method (gel filtration, ion exchange chromatography, adsorption chromatography, salting out, etc.).
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、実施例において、反応液中のオリゴ糖の定量はＤＩＯＮＥＸ法により行った。すなわち、分離には日本ダイオネクス社製のＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１カラムを用い、溶出液として０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液および０．１Ｍ水酸化ナトリウム＋０．５Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を用いた。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but it is clear that the present invention is not limited thereto. In the examples, the oligosaccharides in the reaction solution were quantified by the DIONEX method. That is, for separation, a CarboPacPA1 column manufactured by Nippon Dionex Co., Ltd. was used, and 0.1M sodium hydroxide aqueous solution and 0.1M sodium hydroxide + 0.5M sodium acetate aqueous solution were used as eluents.
本実施例で使用した糖転移酵素（β１，４−ガラクトース転移酵素及びα２，３−シアル酸転移酵素）及びＵＤＰ−Ｇａｌ合成に使用した大腸菌酵素（ガラクトキナーゼ及びヘキソース１―リン酸ウリジルトランスフェラーゼ）、並びに大腸菌ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素の調製及び活性の測定は、公知の方法（特開２００２−３３５９８８）に従って実施した。また、大腸菌ＣＴＰ合成酵素は、公知の方法（国際公開ＷＯ９９／４９０７３）に従って調製し、活性を測定した。 Glycosyltransferases (β1,4-galactosyltransferase and α2,3-sialyltransferase) used in this example and E. coli enzymes (galactokinase and hexose 1-phosphate uridyltransferase) used for UDP-Gal synthesis , And preparation of E. coli CMP-NeuAc synthase and measurement of activity were performed according to a known method (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-335988). E. coli CTP synthase was prepared according to a known method (International Publication WO99 / 49073) and the activity was measured.
実施例１：３’-ＳｉｌａｙｌＬＡｃＮＡｃの合成（１）
（ＮｅｕＡｃとＣＭＰからのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの再生利用）
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭ ＵＭＰ、５０ｍＭガラクトース、１００ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、４００ｍＭグルコースを含む溶液に、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素液（０．１ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、ガラクトキナーゼ活性（７．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びヘキソース１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素液（３．２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）および乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）３．０％（ｗ／ｖ）を添加し、２５℃で撹拌しつつ反応を行った。反応開始１８時間後にＮ−アセチルラクトサミンは、３０．３ｍＭ生成していた。
Example 1: Synthesis of 3'-SiylLAcNAc (1)
(Reuse of CMP-NeuAc from NeuAc and CMP)
In a solution containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), 40 mM magnesium chloride, 20 mM UMP, 50 mM galactose, 100 mM GlcNAc, 400 mM glucose, an enzyme solution having β1,4-galactosyltransferase activity (0.1 units / ml reaction) Solution), galactokinase activity (7.5 units / ml reaction solution) and hexose 1-phosphate uridylyltransferase activity enzyme solution (3.2 units / ml reaction solution) and dried baker's yeast (Oriental Yeast Industry) 3. 0% (w / v) was added, and the reaction was carried out with stirring at 25 ° C. N-acetyllactosamine was produced at 30.3 mM 18 hours after the start of the reaction.
次に、このＮ−アセチルラクトサミン合成液に５０ｍＭ ＮｅｕＡｃ、３０ｍＭ ＣＭＰ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素液（１．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びα２，３−シアリルトランスフェラーゼ酵素液（０．４ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を添加し、２５℃で攪拌を続けた。また、反応１８、２８、４０時間後にグルコースを２００ｍＭ添加した。その結果、反応開始４８時間後に２５．３ｍＭ（１７．１ｇ／Ｌ）の３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの生成が認められた。 Next, 50 mM NeuAc, 30 mM CMP, CMP-NeuAc synthetase solution (1.5 units / ml reaction solution) and α2,3-sialyltransferase enzyme solution (0.4 units / ml reaction solution) were added to this N-acetyllactosamine synthesis solution. ) Was added and stirring was continued at 25 ° C. In addition, 200 mM of glucose was added after 18, 28, and 40 hours of reaction. As a result, production of 25.3 mM (17.1 g / L) of 3'-SialylLacNAc was observed 48 hours after the start of the reaction.
実施例２：３’-ＳｉｌａｙｌＬＡｃＮＡｃの合成（２）
（ＮｅｕＡｃとＵＭＰからのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの再生利用）
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭ ＵＭＰ、５０ｍＭガラクトース、１００ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、４００ｍＭグルコースを含む溶液に、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素液（０．１ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、ガラクトキナーゼ（７．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びヘキソース１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（３．２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）および乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）３．０％を添加し、２５℃で撹拌しつつ反応を行った。
Example 2: Synthesis of 3'-SilaylLAcNAc (2)
(Recycling of CMP-NeuAc from NeuAc and UMP)
In a solution containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), 40 mM magnesium chloride, 20 mM UMP, 50 mM galactose, 100 mM GlcNAc, 400 mM glucose, an enzyme solution having β1,4-galactosyltransferase activity (0.1 units / ml reaction) Solution), galactokinase (7.5 units / ml reaction solution) and hexose 1-phosphate uridylyltransferase (3.2 units / ml reaction solution) and dry bread yeast (Oriental Yeast Industry) 3.0%, The reaction was carried out with stirring at 25 ° C.
反応開始１８時間後（Ｎ−アセチルラクトサミンは、２９．９ｍＭ生成）に、５０ｍＭ ＮｅｕＡｃ、３０ｍＭグルタミン、大腸菌ＣＴＰ合成酵素液（１．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素液（１．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びα２，３−シアリルトランスフェラーゼ酵素液（０．４ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を添加し、２５℃で撹拌を継続した。また、反応１８、２６、４０時間後にグルコースを２００ｍＭ添加した。その結果、反応開始４６時間後に３８．０ｍＭ（２５．７ｇ／Ｌ）の３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの生成が確認された。 18 hours after the start of the reaction (N-acetyllactosamine is 29.9 mM produced), 50 mM NeuAc, 30 mM glutamine, E. coli CTP synthase solution (1.5 units / ml reaction solution), CMP-NeuAc synthase solution (1. 5 units / ml reaction solution) and α2,3-sialyltransferase enzyme solution (0.4 units / ml reaction solution) were added, and stirring was continued at 25 ° C. In addition, 200 mM of glucose was added after 18, 26 and 40 hours of reaction. As a result, it was confirmed that 38.0 mM (25.7 g / L) of 3'-SialylLacNAc was produced 46 hours after the start of the reaction.
実施例３：３’-ＳｉｌａｙｌＬＡｃＮＡｃの合成（３）
（ＧｌｃＮＡｃとＣＭＰからのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの再生利用）
Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｐ２−エピメラーゼ、及びＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＴｒｃ−ＮＥＮＢ（国際公開番号ＷＯ２００４／００９８３０）を用いて大腸菌ＤＨ１株（ＡＴＣＣ３３８４９）を常法（「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition」(Sambrookら編、Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)）に従い形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換体ＤＨ１／ｐＴｒｃ−ＮＥＮＢを取得した。得られた形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地５００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌体数が４ｘ１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃度０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧ（isopropylβ-D-thiogalactopyranoside）を添加し、さらに３７℃で１８時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分）により菌体を回収した。
Example 3: Synthesis of 3'-SilaylLAcNAc (3)
(Recycling of CMP-NeuAc from GlcNAc and CMP)
Using the plasmid pTrc-NENB (International Publication No. WO2004 / 009830) containing N-acetylglucosamine 6-P2-epimerase and N-acetylneuraminate lyase gene, E. coli DH1 strain (ATCC33849) was prepared by a conventional method (“Molecular Cloning”). , A Laboratory Manual, Second Edition "(edited by Sambrook et al., Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)) to obtain ampicillin resistant transformant DH1 / pTrc-NENB. The transformant was inoculated into 500 ml of 2 × YT medium containing 100 μg / ml ampicillin and cultured with shaking at 37 ° C. When the number of cells reached 4 × 10 8 cells / ml, the final concentration of the culture solution was 0. Add IPTG (isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) to 2 mM, and further 18 hours at 37 ° C After end of the shaking culture was continued. Culture was harvested by centrifugation (9,000 × g, 10 min).
２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭ ＵＭＰ、５０ｍＭガラクトース、１００ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、２００ｍＭフルクトースを含む溶液に、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素液（０．１ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、ガラクトキナーゼ（２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びヘキソース１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）および乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）４．０％（ｗ／ｖ）を添加し、２８℃で撹拌しつつ反応を行った。 In a solution containing 200 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), 30 mM magnesium chloride, 20 mM UMP, 50 mM galactose, 100 mM GlcNAc, 200 mM fructose, β1,4-galactosyltransferase enzyme solution (0.1 units / ml reaction solution), Galactokinase (20 units / ml reaction solution) and hexose 1-phosphate uridylyltransferase (10 units / ml reaction solution) and dry baker's yeast (Oriental Yeast Co., Ltd.) 4.0% (w / v) were added and 28 ° C. The reaction was carried out with stirring.
反応開始８時間後（Ｎ−アセチルラクトサミンは３１．３ｍＭ生成）に、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＣＭＰ、０．５％キシレン、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素液（１．７ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ（０．１ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及び前述の回収した大腸菌ＤＨ１／ｐＴｒｃ−ＮＥＮＢ菌体（反応液の５倍量の培養液分の菌体）を添加した。また、反応開始８、２８、４０時間後にグルコースを２００ｍＭ添加した。反応５０時間後に１３．４ｍＭ（９．０ｇ／Ｌ）の３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの生成が確認された。 8 hours after the start of the reaction (N-acetyllactosamine was produced at 31.3 mM), 100 mM sodium pyruvate, 20 mM CMP, 0.5% xylene, CMP-NeuAc synthetase solution (1.7 units / ml reaction solution), α2 , 3-sialyltransferase (0.1 units / ml reaction solution) and the recovered E. coli DH1 / pTrc-NENB cells (5 times the amount of the culture solution of the reaction solution) were added. Moreover, 200 mM of glucose was added 8, 28, and 40 hours after the start of the reaction. After 50 hours of reaction, formation of 13.4 mM (9.0 g / L) of 3'-SialylLacNAc was confirmed.
実施例４：６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの合成
（１）フォトバクテリウム・ダムセラ由来β-ガラクトシドα２，６-シアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のクローニング
フォトバクテリウム・ダムセラ ｓｕｂｓｐ. ｄａｍｓｅｌａ (ＮＢＲＣ Ｎｏ.１５６３３叉はＡＴＣＣ ３３５３９)からの染色体ＤＮＡの調製は、該菌の凍結乾燥菌体を１００μLの５０ｍM トリス塩酸緩衝液(ｐＨ ８．０), ２０ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁したのちに１０μLの１０％ＳＤＳ溶液を添加して室温で５分静置により溶菌させ、この溶菌液からフェノール抽出ならびにエタノール沈殿により得られた沈殿を２０μLのＴＥバッファー(１０ｍM トリス塩酸緩衝液(ｐＨ ８．０), １ｍＭ ＥＤＴＡ)に溶解することにより行った。
Example 4: Synthesis of 6'-SialylLacNAc (1) Cloning of a gene encoding β-galactoside α2,6-sialyltransferase derived from Photobacterium damsella Photobacterium damsella subsp. Damsela (NBRC No. 15633 or ATCC The chromosomal DNA from 33539) was prepared by suspending the lyophilized cells of the bacterium in 100 μL of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) and 20 mM EDTA, and then adding 10 μL of 10% SDS solution. By lysing at room temperature for 5 minutes, the precipitate obtained by phenol extraction and ethanol precipitation from this lysate is dissolved in 20 μL of TE buffer (10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 1 mM EDTA). went.
以上のように調製したＤＮＡを鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡ（A）および(B)を常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりフォトバクテリウム・ダムセラのβ-ガラクトシドα２，６-シアリルトランスフェラーゼをコードするｂｓｔ遺伝子（Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ ｔｏ ＮＣＢＩ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０１２２８５）を含む領域のＤＮＡを増幅した。 Using the DNA prepared as described above as a template, the following two kinds of primer DNAs (A) and (B) were synthesized according to a conventional method, and β-galactoside α2,6-sialyl of Photobacterium damsella was synthesized by PCR. The DNA of the region containing the bst gene encoding transferase (Submitted to NCBI, Accession No. AB012285) was amplified.
プライマー（Ａ）：５’-GTGTGGCATAGTACGCACTT-３’
プライマー（Ｂ）：５’-AGGTCGCCACATTTACGATG-３’
Primer (A): 5'-GTGTGGCATAGTACGCACTT-3 '
Primer (B): 5'-AGGTCGCCACATTTACGATG-3 '
ＰＣＲによるｂｓｔ遺伝子を含む領域のＤＮＡ増幅は、反応液１００μｌ（１０ｘＰｙｒｏｂｅｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ(タカラバイオ社) １０μｌ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１ｎｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）および（Ｂ）各々０．２μＭ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ(タカラバイオ社) ２．５ｕｎｉｔｓ）をＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（４７℃、１分）、伸長反応（７２℃、２分）のステップを３６回繰り返すことにより行った。 DNA amplification of the region containing the bst gene by PCR was performed using 100 μl of reaction solution (10 × Pyrobest Buffer (Takara Bio Inc.) 10 μl, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dCTP, 0.2 mM dTTP, template DNA 0.1 ng , Primer DNA (A) and (B) 0.2 μM each, Pyrobest DNA polymerase (Takara Bio Inc. 2.5 units) using DNA Thermal Cycler Dice (Takara Bio Inc.), heat denaturation (94 ° C., 1 minute) The steps of annealing (47 ° C., 1 minute) and extension reaction (72 ° C., 2 minutes) were repeated 36 times.
増幅後のＤＮＡを、文献（Molecular Cloning、(Maniatisら編、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New YorK(1982)）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、２．３ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡ（C）および（D）を使って、ＰＣＲ法によりフォトバクテリウム・ダムセラのｂｓｔ遺伝子を増幅した。 The amplified DNA is separated by agarose gel electrophoresis according to the method of literature (Molecular Cloning, edited by Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New YorK (1982)), and a 2.3 kb DNA fragment is purified. The bst gene of Photobacterium damsella was amplified by PCR using the following two types of primers DNA (C) and (D) using the DNA as a template.
プライマー（C）：５’-CTTGGATCCTGTAATAGTGACAATACCAGC-３’
プライマー（D）：５’-TAAGTCGACTTAAGCCCAGAACAGAACATC-３’
Primer (C): 5'-CTTGGATCCTGTAATAGTGACAATACCAGC-3 '
Primer (D): 5'-TAAGTCGACTTAAGCCCAGAACAGAACATC-3 '
ＰＣＲによるｂｓｔ遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ（１０ｘＰｙｒｏｂｅｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ(タカラバイオ社) １０μｌ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１ｎｇ、プライマーＤＮＡ（Ｃ）および（Ｄ）各々０．２μＭ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ(タカラバイオ社) ２．５ｕｎｉｔｓ）をＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ(タカラバイオ社)を用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５２℃、１分）、伸長反応（７２℃、２分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。 The amplification of the bst gene by PCR was performed using 100 μl of a reaction solution (10 × Pyrobest Buffer (Takara Bio Inc.) 10 μl, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dCTP, 0.2 mM dTTP, template DNA 0.1 ng, primer DNA ( C) and (D) 0.2 μM each, Pyrobest DNA polymerase (Takara Bio Inc. 2.5 units) using DNA Thermal Cycler Dice (Takara Bio Inc.), heat denaturation (94 ° C., 1 minute), annealing (52 The step of elongation reaction (72 ° C., 2 minutes) was repeated 30 times.
遺伝子増幅後、ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、１．５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２-６（特開２００１−１０３９７３）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（タカラバイオ株式会社より入手）を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐ１２-６-ｐｓｔΔＮを単離した。 After gene amplification, the DNA was separated by agarose gel electrophoresis, and a 1.5 kb DNA fragment was purified. The obtained DNA fragment was cleaved with restriction enzymes BamHI and SalI and ligated with plasmid pTrc12-6 (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-103973) digested with restriction enzymes BamHI and SalI using T4 DNA ligase. Escherichia coli K12 strain JM109 (obtained from Takara Bio Inc.) was transformed with the ligation reaction solution, and plasmid p12-6-pstΔN was isolated from the obtained kanamycin resistant transformant.
（２）α２,６-シアリルトランスフェラーゼ酵素液の調製
プラスミドｐ１２-６-ｐｓｔΔＮを保持する大腸菌ＪＭ１０９株を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．１５％グルコース）１００ｍｌに植菌し、３０℃で振とう培養した。５時間後培養液に最終濃度０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１８℃で２０時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、２．５ｍｌの緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５））に懸濁した。ブランソン社製超音波破砕機（モデル４５０ソニファー）を用いて氷冷下で超音波処理を行い（５０Ｗ，２分，３回）、４℃、１２，０００ｘｇの条件下で２０分間遠心分離し、可溶性画分（上清）を回収した。
(2) Preparation of α2,6-sialyltransferase enzyme solution Escherichia coli JM109 strain carrying plasmid p12-6-pstΔN was added to a medium containing 2 μg / ml kanamycin (2% peptone, 1% yeast extract, 0.5% (NaCl, 0.15% glucose) was inoculated into 100 ml, and cultured with shaking at 30 ° C. After 5 hours, IPTG was added to the culture solution to a final concentration of 0.2 mM, and shaking culture was further continued at 18 ° C. for 20 hours. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation (9,000 × g, 10 minutes) and suspended in 2.5 ml of a buffer (20 mM sodium acetate (pH 5.5)). Perform ultrasonic treatment under ice-cooling using a Branson ultrasonic crusher (Model 450 Sonifer) (50 W, 2 minutes, 3 times), centrifuge at 4 ° C., 12,000 × g for 20 minutes, The soluble fraction (supernatant) was collected.
このように得られた上清画分を酵素標品とし、酵素標品におけるα２，６シアリルトランスフェラーゼ活性を測定した。その結果、０．４４ ｕｎｉｔｓ／ｍｉｎ／ｍｌ 酵素液であった。 The supernatant fraction thus obtained was used as an enzyme preparation, and α2,6-sialyltransferase activity in the enzyme preparation was measured. As a result, the enzyme solution was 0.44 units / min / ml.
なお、α２，６シアリルトランスフェラーゼ活性は、以下に示す方法でＣＭＰ−ＮｅｕＡｃとＮ−アセチルラクトサミンから６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃへの転換活性を測定、算出したものである。すなわち、２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５０ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、１０ｍＭ Ｎ−アセチルラクトサミンにα２，６シアリルトランスフェラーゼ酵素標品を添加して３７℃で１０分反応させる。反応液を３分間の煮沸にて反応を停止し、ＨＰＡＥＣ−ＣＤ（High-perfoemance anione-exchange chromatography coupled with conductimetric detection）による糖分析を行う。分離にはダイオネクス社製のＣａｒｂｏｐａｃ ＰＡ１カラム（４×２５０ｍｍ）を用い、溶出液として（Ａ）０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液と（Ｂ）０．１Ｍ ＮａＯＨ，０．５Ｍ 酢酸ナトリウム溶液の濃度勾配（０−１０分：Ｂ＝０％、１０−２５分：Ｂ＝４５％、２５−３０分：Ｂ＝１００％）を用いる。ＨＰＡＥＣ−ＣＤ分析結果から反応液中のＬａｃＮＡｃ消費量および６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの生成量を算出し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＮｅｕＡｃをＮ−アセチルラクトサミンに転移させる活性を１ｕｎｉｔとする。 The α2,6 sialyltransferase activity is obtained by measuring and calculating the conversion activity from CMP-NeuAc and N-acetyllactosamine to 6'-SialylLacNAc by the method shown below. That is, an α2,6-sialyltransferase enzyme preparation is added to 25 mM Tris-HCl buffer (pH 5.5), 50 mM CMP-NeuAc, and 10 mM N-acetyllactosamine and reacted at 37 ° C. for 10 minutes. The reaction is stopped by boiling for 3 minutes, and sugar analysis is performed by HPAEC-CD (High-perfoemance anion-exchange chromatography coupled with conductimetric detection). For separation, a Carbonac PA1 column (4 × 250 mm) manufactured by Dionex was used, and a concentration gradient (0−0.1 M NaOH solution and (B) 0.1 M NaOH, 0.5 M sodium acetate solution was used as an eluent. 10 minutes: B = 0%, 10-25 minutes: B = 45%, 25-30 minutes: B = 100%). The amount of LacNAc consumed in the reaction solution and the amount of 6'-SialylLacNAc produced are calculated from the HPAEC-CD analysis results, and the activity for transferring 1 μmole of NeuAc to N-acetyllactosamine per minute at 37 ° C. is defined as 1 unit.
（３）６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの合成
２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＵＭＰ、５０ｍＭガラクトース、５０ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、２００ｍＭフルクトースを含む液にβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素液（０．１８ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、ガラクトキナーゼ活性（４５．６ｕｎｉｔｓ/ｍｌ反応液）及びヘキソース１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性（２６．５ｕｎｉｔｓ/ｍｌ反応液）を有する酵素液、および乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）３．０％（ｗ/ｖ）を添加し、２８℃で攪拌しつつ反応を行った。反応開始７時間後にＮ−アセチルラクトサミンは、２０．２ｍＭ生成していた。
(3) Synthesis of 6′-SialylLacNAc Enzyme having β1,4-galactosyltransferase activity in a solution containing 200 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), 40 mM magnesium chloride, 10 mM UMP, 50 mM galactose, 50 mM GlcNAc, 200 mM fructose Solution (0.18 units / ml reaction solution), enzyme solution having galactokinase activity (45.6 units / ml reaction solution) and hexose 1-phosphate uridyl transferase activity (26.5 units / ml reaction solution), and dried bread Yeast (Oriental Yeast Industry) 3.0% (w / v) was added, and the reaction was carried out with stirring at 28 ° C. 7 hours after the start of the reaction, 20.2 mM of N-acetyllactosamine was produced.
次に、このＮ−アセチルラクトサミン合成液に５０ｍＭ ＮｅｕＡｃ、１０ｍＭ ＣＭＰ、ＣＭＰ-ＮｅｕＡｃ合成酵素液（５．８ｕｎｉｔｓ/ｍｌ反応液）及びα２，６−シアリルトランスフェラーゼ酵素液（０．０４ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を添加し、２８℃で攪拌を続けた。また、反応開始７、２２、３０時間後にグルコースを２００ｍM添加した。その結果、反応開始４６時間後に３５．６ｍM（２４．１ｇ/Ｌ）の６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの生成が認められた。
なお、フォトバクテリウム・ダムセラ ｓｕｂｓｐ. ｄａｍｓｅｌａは独立行政法人製品評価技術機構より入手可能である。
Next, 50 mM NeuAc, 10 mM CMP, CMP-NeuAc synthetase solution (5.8 units / ml reaction solution) and α2,6-sialyltransferase enzyme solution (0.04 units / ml reaction solution) were added to this N-acetyllactosamine synthesis solution. ) Was added and stirring was continued at 28 ° C. In addition, 200 mM of glucose was added 7, 22, and 30 hours after the start of the reaction. As a result, 46 hours after the start of the reaction, 35.6 mM (24.1 g / L) of 6′-SialylLacNAc was produced.
Photobacterium damsela subsp. Damsela is available from the National Institute for Product Evaluation Technology.
Claims (7)
The cytidine 5'-monophosphoryl N-acetylneuraminic acid (CMP-NeuAc) is synthesized and regenerated using N-acetylglucosamine (GlcNAc) and uridine 5'-monophosphate (UMP) as raw materials. Manufacturing method.
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