JP2006271301A

JP2006271301A - Method for high through put analysis of promoter activity

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Publication number: JP2006271301A
Application number: JP2005097819A
Authority: JP
Inventors: Kanako Kobayashi; 加奈子小林; Yuujitsu Asai; 友実浅井; Akio Sugiyama; 明生杉山; Shigeaki Nishii; 重明西井; Yoshihiro Nakajima; 芳浩中島; Katsuhiro Omiya; 克裕近江谷
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Toyobo Co Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Toyobo Co Ltd
Priority date: 2005-03-30
Filing date: 2005-03-30
Publication date: 2006-10-12

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for the high through put analysis of the functions of gene sequences. <P>SOLUTION: This method for the high through put analysis of the functions of the gene sequences comprises a step for cloning a nucleic acid sequence in a plasmid vector having three different luminous enzyme genes originated from luminous beetles to form a plasmid vector for analysis, and a step for measuring the promoter activity of the nucleic acid sequence with a mammal cell transduced with the plasmid vector to transiently or stably express. When T-plasmid vector is used for cloning a target gene sequence, a step for forming the plasmid vector for analysis is high-through-putted. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、複数の核酸配列の機能をハイスループット解析する方法に関する。 The present invention relates to a method for high-throughput analysis of the functions of a plurality of nucleic acid sequences.

遺伝子解析は疾患研究において有用な技術であるが、これまでは少数の遺伝子マーカーの利用や比較的単純な遺伝子疾患の研究に限られていた。しかし、ヒトゲノムのドラフトシークエンス解読が完了し、複数遺伝子の関与する複雑な疾患や患者個人に対応した治療を行うための臨床診断法の開発、新規の医薬品ターゲット同定に関与する遺伝的要因の解析へと研究範囲は拡大している。 Genetic analysis is a useful technique in disease research, but it has so far been limited to the use of a small number of genetic markers and relatively simple genetic diseases. However, after the draft sequence of the human genome has been deciphered, development of clinical diagnostic methods for the treatment of complex diseases involving multiple genes and individual patients, and analysis of genetic factors involved in the identification of new drug targets And the research scope is expanding.

薬剤への反応は個人によって異なるが、こうした薬剤応答性の違いにも遺伝子が関与している。遺伝的要因が薬剤の効き目に影響するという臨床的知見は1950年代にはじめて報告され、これらの知見は統計的観察および薬物代謝に関する生化学的、分子生物学的な研究によって裏付けられている。医薬品および、その候補物質が薬剤応答性に関与する、もしくは関与が推測される遺伝子の発現に与える影響を解析し、理解を深めることは、副作用を最小限に抑えながら薬剤の効果の最適化をはかる上で非常に有効な手段である。 Responses to drugs vary from individual to individual, but genes are also involved in these differences in drug responsiveness. Clinical findings that genetic factors affect drug efficacy were first reported in the 1950s, supported by statistical observations and biochemical and molecular biological studies on drug metabolism. Analyzing the effects of drugs and their candidate substances on the expression of genes involved or suspected of being involved in drug responsiveness can help optimize drug effects while minimizing side effects. It is a very effective means to measure.

遺伝子発現制御機能を解析する手法として、レポーター遺伝子に連結されたシス作用性塩基配列要素（プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの遺伝子発現制御配列或いはその候補）を含むベクターを適当な細胞に導入して、ある条件下において発現されるレポーター酵素の活性測定を行うレポーターアッセイが挙げられる。これまで、レポーター遺伝子として、大腸菌chloramphenicol acethyltransferase(CAT)、ヒトgrowth hormone、alkaline phosphatase、ホタル（Photinus Pyralis）ｌuciferase、大腸菌β-galactosidase、蛍光タンパク質（GFP）などが用いられてきたが、これらの中でluciferase遺伝子の発光を利用したシステムは感度が高く活性測定が簡便なことから、現在特に用いられている。 As a method for analyzing the gene expression control function, a vector containing a cis-acting base sequence element linked to a reporter gene (a gene expression control sequence such as a promoter, enhancer or silencer or a candidate thereof) is introduced into an appropriate cell, Reporter assays that measure the activity of a reporter enzyme that is expressed under certain conditions. Until now, Escherichia coli chloramphenicol acethyltransferase (CAT), human growth hormone, alkaline phosphatase, firefly (Photinus Pyralis) luciferase, Escherichia coli β-galactosidase, fluorescent protein (GFP), etc. have been used as reporter genes. The system using the luminescence of the luciferase gene is currently used because it has high sensitivity and easy activity measurement.

レポーターアッセイのサンプル間には、トランスフェクション効率、細胞死、細胞等によるバラツキなど、レポーターの発現量差をもたらす意図されていない要因が存在する。そのため、試験配列に連結されたレポーター遺伝子とあわせて、コントロールプロモーターに連結された基質特異性（反応性）の異なるレポーター分子を内部標準としてサンプル間を標準化する必要がある。このような場合を含め、2つ以上の遺伝子発現を同時に測定するには、上記の遺伝子を併用する、あるいは異なった基質特異性を示すウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase）を用いるなどの手段がとられて来た。 There are unintended factors between reporter assay samples, such as transfection efficiency, cell death, cell variation, and other factors that cause differences in reporter expression levels. Therefore, it is necessary to standardize between samples using a reporter molecule having different substrate specificity (reactivity) linked to a control promoter as an internal standard together with a reporter gene linked to a test sequence. In order to measure the expression of two or more genes at the same time, including the above cases, measures such as using the above genes together or using Renilla luciferase with different substrate specificities are taken. I came.

前記方法では、サンプル間を第２の内部標準用のレポータータンパク質活性で標準化し、サンプル間の第１のレポータータンパク質の活性を比較することによって、第１のレポーター遺伝子に連結されたシス作用性塩基配列要素の活性を解析する。しかしながら、このような比較では、複数のプロモーター活性の動態比較は間接的である。さらに、この比較の間には、実験操作のバラツキなどによる、擬陽性、擬陰性を含んでしまう可能性がある。 In the method, the cis-acting base linked to the first reporter gene is standardized between the samples with the reporter protein activity for the second internal standard, and the activity of the first reporter protein between the samples is compared. Analyzes the activity of array elements. However, in such a comparison, the kinetic comparison of multiple promoter activities is indirect. Furthermore, this comparison may include false positives and false negatives due to variations in experimental operations.

本発明者らは、特許文献1において、前記問題を克服した複数の核酸配列をより直接的に、かつ同時に比較解析するレポーターアッセイシステムとして、鉄道虫由来の赤色発光たんぱく質、イリオモテボタル由来の緑、橙色発光タンパク質を用いて、３つのプロモーター活性を同時に測定する方法を開示している。 The present inventors, in Patent Document 1, as a reporter assay system for more directly and simultaneously comparing and analyzing a plurality of nucleic acid sequences that have overcome the above-mentioned problems, a red luminescent protein derived from a railroad insect, a green derived from Iriomote botal, A method for simultaneously measuring three promoter activities using an orange photoprotein is disclosed.

遺伝子発現制御配列をレポーター遺伝子に連結する方法としては、制限酵素を用いたクローニングが用いられてきた。この方法を実施するためには、機能を調べたい遺伝子配列（標的遺伝子配列）の両端にプラスミドベクター中のマルチクローニング部位に存在する制限酵素認識配列と一致する配列が存在し、かつ遺伝子配列中には、同じ制限酵素認識配列が存在しないことが好ましい。標的遺伝子配列中に適当な制限酵素配列が存在しない場合には、リンカー等による制限酵素認識配列の付加、あるいは部位特異的変異導入法などによる不要な制限酵素認識配列の消去等の煩雑な操作が必要となる。しかし、これらの操作が標的遺伝子配列のプロモーター活性に影響を与える可能性もあり、好ましくない。特に、塩基配列が十分に分かっていない場合や、標的遺伝子配列の周辺配列がよく分からない場合に、クローニングに使用する制限酵素を決定し、実際にクローニングを行う際に、このような問題が生じやすい。 As a method for linking a gene expression control sequence to a reporter gene, cloning using a restriction enzyme has been used. In order to carry out this method, there is a sequence that matches the restriction enzyme recognition sequence present at the multiple cloning site in the plasmid vector at both ends of the gene sequence (target gene sequence) whose function is to be examined, and the gene sequence Preferably do not have the same restriction enzyme recognition sequence. When a suitable restriction enzyme sequence does not exist in the target gene sequence, complicated operations such as addition of a restriction enzyme recognition sequence by a linker, etc., or deletion of an unnecessary restriction enzyme recognition sequence by a site-specific mutagenesis method, etc. Necessary. However, these operations may affect the promoter activity of the target gene sequence, which is not preferable. In particular, when the base sequence is not fully understood or the peripheral sequence of the target gene sequence is not well understood, such a problem occurs when the restriction enzyme used for cloning is determined and cloning is actually performed. Cheap.

膨大な化学物質の中から、作用強度、安全性などに優れた新薬候補をスクリーニングするためには、複数の標的遺伝子をクローニング、あるいは１つずつ精査することが望ましいが、このような場合に前記方法では、目的の達成に多大な労力および時間を要する。
WO2004/099421 Viviani V., Uchida, A., Suenaga, N., Ryufuku, M., and Ohmiya, Y.;Thr226 Is a Key Residue for Bioluminescene Spectra Determination in Beetle Luciferase.;Biochemical and Biophysical Research Communications. 2001;280, 1286-1291 Arashi-Heese, N., Miwa, M., and Shibata, H.;XcmI Site-Containing Vector for Direct Cloning and In Vitro Transcription of PCR Product.;Molecular Biotechnology 1999;12, 281-283 Zhou MY.,Gomez-Sanchez C.;Universal TA Cloning.;Curr. Issues Mol. Biol. 2000;2(1), 1-7 In order to screen for new drug candidates with excellent action strength and safety from a large number of chemical substances, it is desirable to clone multiple target genes or to examine them one by one. The method requires a great deal of labor and time to achieve the objective.
WO2004 / 099421 Viviani V., Uchida, A., Suenaga, N., Ryufuku, M., and Ohmiya, Y .; Thr226 Is a Key Residue for Bioluminescene Spectra Determination in Beetle Luciferase .; Biochemical and Biophysical Research Communications. 2001; 280, 1286 -1291 Arashi-Heese, N., Miwa, M., and Shibata, H.; XcmI Site-Containing Vector for Direct Cloning and In Vitro Transcription of PCR Product.; Molecular Biotechnology 1999; 12, 281-283 Zhou MY., Gomez-Sanchez C .; Universal TA Cloning .; Curr. Issues Mol. Biol. 2000; 2 (1), 1-7

本発明の目的は、複数の遺伝子配列の機能をハイスループット解析する方法を提供することである。具体的には、１種または２種以上の核酸配列を発光甲虫に由来する3種類以上（例えば３〜５種類、好ましくは３種類または４種類）の異なる発光酵素遺伝子のいずれかを有するプラスミドベクターにクローニングし、解析用プラスミドベクターをハイスループット構築するステップと、前記プラスミドベクターの少なくとも１種（好ましくは少なくとも２種）を一過性または安定発現するように導入された哺乳類細胞を用いて、核酸配列のプロモーター活性を測定するステップを含む方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a method for high-throughput analysis of the functions of a plurality of gene sequences. Specifically, a plasmid vector having one or more nucleic acid sequences of any of three or more (for example, 3 to 5, preferably 3 or 4) different luminescent enzyme genes derived from luminescent beetles. A high-throughput construction of a plasmid vector for analysis, and mammalian cells introduced so as to transiently or stably express at least one (preferably at least two) of the plasmid vectors, It is to provide a method comprising measuring the promoter activity of a sequence.

本発明者らは、核酸配列のクローニングに、Tプラスミドベクターを用いることで解析用プラスミドベクターを構築するステップのハイスループット化が可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。 The present inventors have found that by using a T plasmid vector for cloning of a nucleic acid sequence, it is possible to increase the throughput of the step of constructing a plasmid vector for analysis, and the present invention has been completed.

本発明は以下のような構成から成る。
１．複数の核酸配列の機能をハイスループット解析する方法であって、核酸配列を発光甲虫に由来する異なる発光酵素遺伝子を有する複数のプラスミドベクターの少なくとも１種にクローニングし、解析用プラスミドベクターを構築するステップと、前記プラスミドベクターを一過性または安定発現するように導入された哺乳類細胞を用いて、核酸配列のプロモーター活性を測定するステップを含む上記方法。
２．複数の核酸配列の機能をハイスループット解析する方法であって、発光甲虫に由来する異なる発光波長スペクトルを有する発光酵素遺伝子を含む２種以上のTプラスミドベクターに２種以上の遺伝子配列を各々クローニングし、解析用プラスミドベクターを構築するステップと、前記プラスミドベクターを一過性または安定発現するように導入された哺乳類細胞を用いて、核酸配列のプロモーター活性を測定するステップを含む、方法。
３．発光酵素遺伝子が、鉄道虫由来ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来ルシフェラーゼ、及びそれらの変異体からなる群より選択される項１または２に記載の方法。
４．発光甲虫に由来する少なくとも１種の発光酵素遺伝子が最大発光波長600nm以上を有する赤色発光酵素遺伝子であることを特徴とする項１または２に記載の方法。
５．発光甲虫に由来する異なる発光波長スペクトルを有する少なくとも１種の発光酵素遺伝子は、定常発現プロモーターの制御下に置かれ、これ以外の２種類以上の発光酵素遺伝子は２種以上の核酸配列と連結されていることを特徴とする項１〜４のいずれかに記載の方法。
６．核酸配列が、発光甲虫に由来する発光酵素遺伝子を含むTプラスミドベクターにクローニングされることを特徴とする項１〜５のいずれかに記載の方法。
７．核酸配列が、発光甲虫に由来する発光酵素遺伝子を含むTプラスミドベクター及びDNAリガーゼを含むTAクローニングキットを使用してクローニングされることを特徴とする項１〜６のいずれかに記載の方法。
８． (A) 複数の標的遺伝子配列をPCR増幅する工程、（B）PCR増幅した各々の標的遺伝子配列をTAクローニング法にて発光甲虫に由来する異なる発光酵素遺伝子に連結し、解析用プラスミドベクターを構築する工程、（C）構築した解析用プラスミドベクターを宿主細胞に形質転換し、増殖させた後、解析用プラスミドベクターを抽出・精製する工程、（D）前記プラスミドベクターを一過性または安定発現するように哺乳類細胞へ導入する工程、（E）前記哺乳類細胞を用いて標的遺伝子配列のプロモーター活性を測定する工程を含むことを特徴とする、複数の標的遺伝子配列の機能をハイスループット解析する方法。
９．上記(A)〜（E）工程の少なくとも１つが、オートメーションによって実施または支援されることを特徴とする、項８に記載の方法。 The present invention has the following configuration.
1. A method for high-throughput analysis of the functions of a plurality of nucleic acid sequences, comprising cloning a nucleic acid sequence into at least one of a plurality of plasmid vectors having different luminescent enzyme genes derived from luminescent beetles, and constructing a plasmid vector for analysis And measuring the promoter activity of the nucleic acid sequence using mammalian cells introduced so as to transiently or stably express the plasmid vector.
2. A method for high-throughput analysis of the functions of a plurality of nucleic acid sequences, wherein two or more gene sequences are each cloned into two or more T plasmid vectors containing luminescent enzyme genes having different emission wavelength spectra derived from luminescent beetles. A method comprising: constructing a plasmid vector for analysis; and measuring a promoter activity of a nucleic acid sequence using a mammalian cell introduced so as to transiently or stably express the plasmid vector.
3. Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein the luminescent enzyme gene is selected from the group consisting of railroad worm-derived luciferase, Iriomote botal luciferase, and variants thereof.
4). Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein the at least one luminescent enzyme gene derived from a luminescent beetle is a red luminescent enzyme gene having a maximum emission wavelength of 600 nm or more.
5. At least one luminescent enzyme gene having a different emission wavelength spectrum derived from a luminescent beetle is placed under the control of a constant expression promoter, and the other two or more luminescent enzyme genes are linked to two or more nucleic acid sequences. Item 5. The method according to any one of Items 1 to 4, wherein:
6). Item 6. The method according to any one of Items 1 to 5, wherein the nucleic acid sequence is cloned into a T plasmid vector containing a luminescent enzyme gene derived from a luminescent beetle.
7). Item 7. The method according to any one of Items 1 to 6, wherein the nucleic acid sequence is cloned using a T plasmid vector containing a luminescent enzyme gene derived from a luminescent beetle and a TA cloning kit containing a DNA ligase.
8). (A) PCR amplification of multiple target gene sequences, (B) PCR amplified target gene sequences are ligated to different luminescent enzyme genes derived from luminescent beetles by TA cloning to construct a plasmid vector for analysis (C) Transforming the constructed plasmid vector for analysis into a host cell and growing it, then extracting and purifying the plasmid vector for analysis, (D) Transiently or stably expressing the plasmid vector A method for high-throughput analysis of the functions of a plurality of target gene sequences, comprising the step of introducing into a mammalian cell, and (E) measuring the promoter activity of the target gene sequence using the mammalian cell.
9. Item 9. The method according to Item 8, wherein at least one of the steps (A) to (E) is performed or supported by automation.

本発明を実施することにより、迅速及び／また複数の標的遺伝子配列をレポーター遺伝子（発光甲虫に由来する発光酵素遺伝子）に連結した解析用プラスミドベクターを構築することが可能となる。さらに、前記プラスミドベクターを用いて、迅速及び／また複数の標的遺伝子配列の遺伝子制御機能を解析することが可能となる。 By carrying out the present invention, it is possible to construct an analysis plasmid vector in which a plurality of target gene sequences are linked to a reporter gene (a luminescent enzyme gene derived from a luminescent beetle) quickly and / or. Furthermore, it becomes possible to analyze the gene regulatory function of a plurality of target gene sequences quickly and / or using the plasmid vector.

本発明の好ましい実施形態では、(i)TAクローニングによるクローニングの簡便化、(ii)複数（２種以上）の発光酵素遺伝子を用いることによる複数の核酸配列の同時評価、の2点によって解析のハイスループット化を実現できた。 In a preferred embodiment of the present invention, analysis is performed by two points: (i) simplification of cloning by TA cloning, and (ii) simultaneous evaluation of a plurality of nucleic acid sequences by using a plurality (two or more) of luminescent enzyme genes. High throughput was achieved.

本発明は複数の遺伝子配列（核酸配列）の機能をハイスループット解析する方法である。具体的には、核酸配列を発光甲虫に由来する3種類以上の異なる発光酵素遺伝子を有する３種類以上のプラスミドベクターの少なくとも１種類（好ましくは少なくとも２種類）にクローニングし、解析用プラスミドベクターをハイスループット構築するステップと、前記プラスミドベクターを一過性または安定発現するように導入された哺乳類細胞を用いて、核酸配列のプロモーター活性を測定するステップを含む方法である。 The present invention is a method for high-throughput analysis of the functions of a plurality of gene sequences (nucleic acid sequences). Specifically, the nucleic acid sequence is cloned into at least one (preferably at least two) of three or more plasmid vectors having three or more different luminescent enzyme genes derived from luminescent beetles, and the analysis plasmid vector is A method comprising a step of constructing a throughput and a step of measuring a promoter activity of a nucleic acid sequence using a mammalian cell introduced so as to transiently or stably express the plasmid vector.

レポーター遺伝子は、発光甲虫由来の異なる発光波長スペクトルを有する３種類またはそれ以上（３種類、４種類、または５種類、好ましくは３〜４種類）の発光酵素遺伝子を用いることが好ましく、それらは鉄道虫由来ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来ルシフェラーゼ、およびそれらの変異体からなる群より選択されることが好ましい。なお、３種類またはそれ以上の発光酵素遺伝子のうち少なくとも１種は最大発光波長600nm以上を有するルシフェラーゼであることが好ましい。発光甲虫由来のルシフェラーゼとしては、ホタル科、ホタルモドキ科、コメツキ科、ヒカリコメツキ科、イリオモテボタル科が挙げられる。中でも、ホタルモドキ科鉄道虫、とりわけPhrixothrix hirtus由来の赤色発光ルシフェラーゼを含むものが好ましい。前記ルシフェラーゼは現在までに見つかっている赤色ルシフェラーゼの中では最長の630nm付近に最大発光波長を有し、発光スペクトルはpHに対して安定である（非特許文献1）。 As the reporter gene, it is preferable to use three or more (three, four, or five, preferably three to four) luminescent enzyme genes having different emission wavelength spectra derived from luminescent beetles, which are railroads. It is preferably selected from the group consisting of insect-derived luciferase, Iriomote botal-derived luciferase, and variants thereof. It should be noted that at least one of the three or more luminescent enzyme genes is preferably a luciferase having a maximum emission wavelength of 600 nm or more. Examples of the luciferase derived from the luminescent beetle include the firefly family, the firefly family, the rice family, the lighthouse family, and the Iriomote family. Among them, firefly moths, particularly those containing red light emitting luciferase derived from Phrixothrix hirtus are preferable. The luciferase has a maximum emission wavelength in the vicinity of the longest 630 nm among the red luciferases found so far, and the emission spectrum is stable with respect to pH (Non-patent Document 1).

本発明における「核酸配列」とは、シス作用性塩基配列要素（プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの遺伝子発現制御配列）、あるいはその可能性があると考えられる塩基配列である。Herpes simplex virus thymidine kinase (HSVｔｋ) 由来のプロモーターやCytomegalovirus (CMV) 由来のプロモーターの最小単位に連結されたシス作用性塩基配列であってもよい。前記プロモーターは、哺乳類またはウイルスのゲノムDNA、RNA、ライブラリーなどからクローニングされる。 The “nucleic acid sequence” in the present invention is a cis-acting base sequence element (gene expression control sequence such as promoter, enhancer, silencer, etc.), or a base sequence considered to be possible. It may be a cis-acting base sequence linked to the minimum unit of a promoter derived from Herpes simplex virus thymidine kinase (HSVtk) or a promoter derived from Cytomegalovirus (CMV). The promoter is cloned from mammalian or viral genomic DNA, RNA, libraries, and the like.

３種類またはそれ以上の異なる発光酵素遺伝子の少なくとも１種類は、定常発現プロモーターに連結されるのが好ましい。定常発現プロモーターに連結されたレポータータンパク質（発光酵素）の活性は、サンプル間のトランスフェクション効率、細胞数、細胞の生育状態のバラツキを標準化するために用いることが望ましい。定常発現プロモーターとしては、ウイルス由来のHSVtkプロモーター、CMVプロモーター、SV40プロモーター、哺乳類細胞由来のハウスキーピング遺伝子プロモーターなどが用いられる。 At least one of the three or more different luminescent enzyme genes is preferably linked to a constant expression promoter. The activity of a reporter protein (luminescent enzyme) linked to a constant expression promoter is desirably used to standardize transfection efficiency between samples, the number of cells, and variations in cell growth state. As the constant expression promoter, virus-derived HSVtk promoter, CMV promoter, SV40 promoter, mammalian cell-derived housekeeping gene promoter, and the like are used.

標的遺伝子配列を得るために用いられる一般的な方法として、哺乳類またはウィルスのゲノムDNA、RNA、ライブラリーなどを鋳型としたPCR（Polymerase Chain Reaction）法が挙げられる。PCR法は試験管内で特定のDNA断片を指数関数的に増幅させることができる方法であり、耐熱性DNAポリメラーゼを用いることで可能となる。 A general method used for obtaining a target gene sequence is a PCR (Polymerase Chain Reaction) method using mammalian or viral genomic DNA, RNA, library or the like as a template. The PCR method is a method capable of amplifying a specific DNA fragment exponentially in a test tube, and can be achieved by using a thermostable DNA polymerase.

代表的な耐熱性DNAポリメラーゼであるPolI型DNAポリメラーゼ、または、これを含む混合型DNAポリメラーゼを用いてPCR増幅されたDNA断片の多くは3’端にデオキシアデニン（dA）の突出を持つという特徴がある。DNA断片を挿入したいプラスミドベクターの3’端にdTの突出を作り、Tプラスミドベクター化することで、dAとdTの相補性を利用したクローニングが可能となる。この方法をTAクローニング法と言い、遺伝子配列のクローニング法として広く用いられている。 Most DNA fragments PCR-amplified using PolI-type DNA polymerase, which is a typical thermostable DNA polymerase, or mixed DNA polymerase containing this, have a deoxyadenine (dA) overhang at the 3 'end. There is. By making a dT overhang at the 3 'end of the plasmid vector into which the DNA fragment is to be inserted and making it a T plasmid vector, cloning using the complementarity of dA and dT becomes possible. This method is called TA cloning and is widely used as a method for cloning gene sequences.

Tプラスミドベクター化の方法としては、XcmI、MboII、HphI、MnlI、AhdI、Eam1105Iなどの3’端に1塩基突出末端作製可能な制限酵素を用いて、3’dT突出末端を作製する方法（非特許文献2）と、AluI、DpnI、RsaI、AfeI、DraI、EcoRV、HaeIIIなどの平滑末端を作製可能な制限酵素で処理した後、Taq DNAポリメラーゼ、あるいはターミナルデオキシトランスフェラーゼのようなDNA断片の3’端へ塩基を付加する活性を有する酵素を用いて、3’dT突出末端を作製する方法（非特許文献3）が挙げられる。 As a method for T plasmid vectorization, a 3′dT overhanging end is prepared using a restriction enzyme capable of producing a 1 base overhanging end at the 3 ′ end such as XcmI, MboII, HphI, MnlI, AhdI, Eam1105I. Patent Document 2) and 3 ′ of DNA fragments such as Taq DNA polymerase or terminal deoxytransferase after treatment with blunt ends such as AluI, DpnI, RsaI, AfeI, DraI, EcoRV, HaeIII. Examples include a method for producing a 3′dT protruding end using an enzyme having an activity of adding a base to the end (Non-patent Document 3).

PolI型DNAポリメラーゼとともに汎用されているα型DNAポリメラーゼによってPCR増幅されたDNA断片は3’端にdA突出を持たない平滑末端型DNA断片であるが、3’端にdAの突出を作製する処理を行うことでTAクローニング法によるクローニングは可能となる。 DNA fragment PCR amplified by α-type DNA polymerase, which is widely used with PolI-type DNA polymerase, is a blunt-ended DNA fragment that does not have a dA overhang at the 3 'end, but a process that creates a dA overhang at the 3' end By performing the above, cloning by the TA cloning method becomes possible.

α型DNAポリメラーゼによりPCR増幅されたDNA断片の3’端にdA突出を作製する方法としては、Taq DNAポリメラーゼ、あるいはターミナルデオキシトランスフェラーゼのような遺伝子配列の3’端へ塩基を付加する活性を有する酵素で処理する方法が挙げられる。 As a method for creating a dA overhang at the 3 ′ end of a DNA fragment PCR amplified by α-type DNA polymerase, it has the activity of adding a base to the 3 ′ end of a gene sequence such as Taq DNA polymerase or terminal deoxytransferase. The method of processing with an enzyme is mentioned.

TAクローニングを実施する際には、TプラスミドベクターのdTと標的遺伝子配列のdAを連結する酵素であるT4 DNAリガーゼが必要となる。より簡便かつ迅速にTAクローニングを行うため、TプラスミドベクターおよびT4 DNAリガーゼは、これらを含むTAクローニングキットとして供給されることが好ましい。また、前記キットにはT4 DNAリガーゼによる連結反応（ライゲーション反応）に適した組成の緩衝液、さらに、平滑末端型DNA断片の3’端にdAを付加する物質が含まれていてもよい。 When performing TA cloning, T4 DNA ligase, an enzyme that links dT of the T plasmid vector and dA of the target gene sequence, is required. In order to perform TA cloning more simply and rapidly, it is preferable that the T plasmid vector and T4 DNA ligase are supplied as a TA cloning kit containing them. In addition, the kit may contain a buffer solution having a composition suitable for a ligation reaction (ligation reaction) with T4 DNA ligase, and further a substance that adds dA to the 3 'end of the blunt-ended DNA fragment.

本発明は（A）プロモーターなどの標的遺伝子配列（核酸配列）をPCR増幅すること、（B）PCR増幅した標的遺伝子配列をTAクローニング法にてレポーター遺伝子（発光甲虫に由来する発光酵素遺伝子）に連結し、解析用プラスミドベクターを構築すること、（C）構築した解析用プラスミドベクターを適当な宿主細胞に形質転換し、増殖させた後、解析用プラスミドベクターを抽出・精製すること、（D）前記プラスミドベクターを一過性または安定発現するように哺乳類細胞へ導入すること、（E）前記哺乳類細胞を用いて核酸配列のプロモーター活性を測定すること、を含んでなり、上記ステップの少なくとも１つが、オートメーションによって実施または支援されることが好ましい。 The present invention includes (A) PCR amplification of a target gene sequence (nucleic acid sequence) such as a promoter, (B) The PCR amplified target gene sequence is converted into a reporter gene (a luminescent enzyme gene derived from a luminescent beetle) by a TA cloning method. Ligating and constructing a plasmid vector for analysis, (C) Transforming the constructed plasmid vector for analysis into an appropriate host cell and growing it, then extracting and purifying the plasmid vector for analysis (D) Introducing the plasmid vector into a mammalian cell for transient or stable expression, and (E) measuring the promoter activity of the nucleic acid sequence using the mammalian cell, wherein at least one of the above steps comprises Preferably implemented or supported by automation.

上記(A)〜(E)の工程は、ウェルを有するプレート上で全ての操作を行うことができるため、自動化に適しており、ハイスループット解析に適している。 The steps (A) to (E) are suitable for automation because all operations can be performed on a plate having wells, and are suitable for high-throughput analysis.

解析した結果は、創薬などに利用されうる。 The analysis result can be used for drug discovery.

以下、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
実施例１ｃ−fosプロモーターのクローニング
ヒトゲノムDNA 20 ngを鋳型として、オリゴヌクレオチド1、2（PRORIGO）（配列番号1 、2）を用いて、5% DMSO存在下でc-fosプロモーターをKOD -Plus-（東洋紡績）によりPCR増幅した。SLR TA Cloning Kit for KOD（東洋紡績）を用いて、増幅断片と赤色発光ルシフェラーゼベクターpSLR-Tを連結した(pSLR-cfos1)。
実施例２変異型（欠失型）ｃ−fosプロモーターのクローニング
pSLR-cfosを鋳型として、オリゴヌクレオチド3（PRORIGO）（配列番号3）及び2を用いて、KOD -Plus-(東洋紡績)によりPCR増幅した。SLO TA Cloning Kit for KOD（東洋紡績）を用いて、増幅断片と橙色発光ルシフェラーゼベクターpSLO-Tを連結した(pSLO-cfos2)。
実施例３ CHO-K1細胞へのトランスフェクション及び培養
CHO-K1細胞1×10⁵ cellずつを12ウェルプレートへ播種し、Ham’s F12（日水製薬）＋10% FCS 中で培養した。翌日、各ウェルにpSLG-HSVtk 0.1μg（定常発現プロモーター制御下に緑色発光ルシフェラーゼを連結したベクター、東洋紡績）、pSLR-cfos1 0.5μg、pSLO-cfos2 0.4μg を100μl Opti-MEM(GIBCO)で希釈された3μl GeneJuice(Novagen社)と混合し、無血清培地Ham’s F12中でトランスフェクションした。翌日、未処理、1μM PMA (TPA、Sigma)、10% FCSを加え、さらに3時間培養した。
実施例４ルシフェラーゼ活性測定
細胞をPBS(-)でリンス後、ピッカジーン細胞溶解剤Lcβ（東洋インキ）で細胞を溶解し、発光基質（東洋インキ）を加え、緑色、橙色、赤色発光ルシフェラーゼの相対発光量を光分離機能付きルミノメーター、AB-2250型ルミネッセンサーMCA（アトー社）を用いて測定した。図2は、緑色ルシフェラーゼの相対発光量をもとにサンプル間を標準化し、未処理サンプルを1として、赤色ルシフェラーゼ（SLR）、橙色ルシフェラーゼ(SLO)の相対比を示したグラフであり、正常型プロモーターでは血清やPMAの添加に対する応答性が認められる同一サンプル内で、変異型（欠失型）プロモーターでは応答性が消失していることを示唆するグラフである。
実施例5 annexin6プロモーターのクローニング
ヒトゲノムDNA 20 ngを鋳型として、オリゴヌクレオチド4、5（PRORIGO）（配列番号4、5）を用いて、5% DMSO存在下でannexin6プロモーターをKOD -Plus-（東洋紡績）によりPCR増幅した。SLR TA Cloning Kit for KOD（東洋紡績）を用いて、増幅断片と赤色発光ルシフェラーゼベクターpSLR-Tを連結した(pSLR-annexin6)。
実施例６ CHO-K1細胞へのトランスフェクション及び培養
CHO-K1細胞1×10⁵ cellずつを12ウェルプレートへ播種し、Ham’s F12（日水製薬）＋10% FCS 中で培養した。翌日、各ウェルにpSLG-HSVtk 0.1μg（定常発現プロモーター制御下に緑色発光ルシフェラーゼを連結したベクター、東洋紡績）、pSLR-annexin6 0.5μg、pSLO-cfos 0.4μg を100μl Opti-MEM(GIBCO)で希釈された3μl GeneJuice(Novagen社)と混合し、無血清培地Ham’s F12中でトランスフェクションした。翌日、未処理、10% FCSを加え、さらに3時間培養した。
実施例７ルシフェラーゼ活性測定
細胞をPBS(-)でリンス後、ピッカジーン細胞溶解剤Lcβ（東洋インキ）で細胞を溶解し、発光基質（東洋インキ）を加え、緑色、橙色、赤色発光ルシフェラーゼの相対発光量を光分離機能付きルミノメーター、AB-2250型ルミネッセンサーMCA（アトー社）を用いて測定した。図3は、緑色ルシフェラーゼの相対発光量をもとにサンプル間を標準化し、未処理サンプルを1として、赤色ルシフェラーゼ（SLR）、橙色ルシフェラーゼ(SLO)の相対比を示したグラフであり、血清刺激応答型c-fosプロモーター(SLO)では血清の添加に対する応答性が認められる同一サンプル内で、血清刺激応答エレメントを含まない非応答型annexin-6プロモーターでは応答性が消失していることを示唆するグラフである。 Hereinafter, the effects of the present invention will be further clarified by illustrating examples of the present invention.
Example 1 Cloning of c-fos Promoter Using 20 ng of human genomic DNA as a template, oligonucleotides 1 and 2 (PRORIGO) (SEQ ID NOs: 1 and 2) were used to convert the c-fos promoter into KOD-Plus in the presence of 5% DMSO. -PCR amplified by (Toyobo). Using SLR TA Cloning Kit for KOD (Toyobo Co., Ltd.), the amplified fragment and the red light emitting luciferase vector pSLR-T were ligated (pSLR-cfos1).
Example 2 Cloning of mutant (deletion) c-fos promoter
PCR amplification was performed with KOD-Plus- (Toyobo) using pSLR-cfos as a template and oligonucleotide 3 (PRORIGO) (SEQ ID NO: 3) and 2. Using the SLO TA Cloning Kit for KOD (Toyobo Co., Ltd.), the amplified fragment and the orange-emitting luciferase vector pSLO-T were ligated (pSLO-cfos2).
Example 3 Transfection and culture of CHO-K1 cells
CHO-K1 cells (1 × 10 ⁵ cells) were seeded in 12-well plates and cultured in Ham's F12 (Nissui Pharmaceutical) + 10% FCS. The next day, 0.1 μg of pSLG-HSVtk in each well (vector with luminescent luciferase linked to a constant expression promoter, Toyobo), 0.5 μg of pSLR-cfos1 and 0.4 μg of pSLO-cfos2 diluted with 100 μl Opti-MEM (GIBCO) The resulting mixture was mixed with 3 μl of GeneJuice (Novagen) and transfected in serum-free medium Ham's F12. The next day, untreated, 1 μM PMA (TPA, Sigma) and 10% FCS were added, and the cells were further cultured for 3 hours.
Example 4 Measurement of luciferase activity After rinsing the cells with PBS (-), the cells were lysed with the Picker Gene cell lysing agent Lcβ (Toyo Ink), added with a luminescent substrate (Toyo Ink), and the relative luminescence of green, orange, and red luminescent luciferases The amount was measured using a luminometer with a light separation function, AB-2250 type luminescence sensor MCA (Ato). Figure 2 is a graph showing the relative ratio of red luciferase (SLR) and orange luciferase (SLO), with the untreated sample as 1, normalized between samples based on the relative luminescence of green luciferase. In the same sample where responsiveness to the addition of serum or PMA is observed with the promoter, this is a graph suggesting that the responsiveness is lost with the mutant (deletion type) promoter.
Example 5 Cloning of annexin6 promoter Using 20 ng of human genomic DNA as a template, oligonucleotides 4 and 5 (PRORIGO) (SEQ ID NOs: 4 and 5) were used to make the annexin6 promoter KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.) in the presence of 5% DMSO. ) PCR amplification. Using the SLR TA Cloning Kit for KOD (Toyobo Co., Ltd.), the amplified fragment and the red light emitting luciferase vector pSLR-T were ligated (pSLR-annexin6).
Example 6 Transfection and culture of CHO-K1 cells
CHO-K1 cells (1 × 10 ⁵ cells) were seeded in 12-well plates and cultured in Ham's F12 (Nissui Pharmaceutical) + 10% FCS. The next day, 0.1 μg of pSLG-HSVtk in each well (vector with luminescent luciferase linked to a constant expression promoter, Toyobo), 0.5 μg of pSLR-annexin6, 0.4 μg of pSLO-cfos diluted with 100 μl Opti-MEM (GIBCO) The resulting mixture was mixed with 3 μl of GeneJuice (Novagen) and transfected in serum-free medium Ham's F12. The next day, untreated, 10% FCS was added, and further cultured for 3 hours.
Example 7 Measurement of luciferase activity After rinsing cells with PBS (-), the cells were lysed with Pickagene cell lysing agent Lcβ (Toyo Ink), luminescent substrate (Toyo Ink) was added, and the relative luminescence of green, orange and red luminescent luciferases The amount was measured using a luminometer with a light separation function, AB-2250 type luminescence sensor MCA (Ato). Fig. 3 is a graph showing the relative ratio of red luciferase (SLR) and orange luciferase (SLO) relative to samples based on the relative luminescence of green luciferase and untreated samples as 1. The response-type c-fos promoter (SLO) suggests that the non-response type annexin-6 promoter that does not contain a serum stimulation response element has lost its responsiveness within the same sample where responsiveness to serum addition is observed It is a graph.

薬剤応答遺伝子などをクローニングすることでレポーターアッセイによる薬剤スクリーニング、未知試料中の刺激因子の存在の有無の検査などへの利用が可能であり、創薬などの産業界に寄与することが大である。 Cloning drug responsive genes can be used for drug screening by reporter assay, testing for the presence or absence of stimulating factors in unknown samples, etc., and contributes greatly to the industry such as drug discovery. .

正常型c-fosプロモーター、欠失型c-fosプロモーターの配列上の比較図である。It is a comparison figure on the sequence of a normal type c-fos promoter and a deletion type c-fos promoter. 緑色ルシフェラーゼの相対発光量をもとにサンプル間を標準化し、未処理サンプルを1として、赤色ルシフェラーゼ（SLR）、橙色ルシフェラーゼ(SLO)の相対比を示したグラフであり、正常型c-fosプロモーターでは血清やPMAの添加に対する応答性が認められる同一サンプル内で、多型（欠失型）プロモーターc-fos2では応答性が消失していることを示唆するグラフである。This graph shows the relative ratio of red luciferase (SLR) and orange luciferase (SLO) with the untreated sample taken as 1, based on the relative luminescence of green luciferase, and the normal c-fos promoter In the same sample where responsiveness to the addition of serum or PMA is observed, the polymorphic (deletion type) promoter c-fos2 is a graph suggesting that responsiveness is lost. 緑色ルシフェラーゼの相対発光量をもとにサンプル間を標準化し、未処理サンプルを1として、赤色ルシフェラーゼ（SLR）、橙色ルシフェラーゼ(SLO)の相対比を示したグラフであり、血清刺激応答型c-fosプロモーター(SLO)では血清の添加に対する応答性が認められる同一サンプル内で、血清刺激応答エレメントを含まない非応答型annexin-6プロモーターでは応答性が消失していることを示唆するグラフである。This is a graph showing the relative ratio of red luciferase (SLR) and orange luciferase (SLO) relative to the sample based on the relative luminescence of green luciferase, with the untreated sample being 1, and the serum stimulation response type c- The fos promoter (SLO) is a graph suggesting that responsiveness is lost in the non-responding type annexin-6 promoter containing no serum stimulation response element in the same sample in which responsiveness to the addition of serum is observed.

Claims

A method for high-throughput analysis of the functions of a plurality of nucleic acid sequences, comprising cloning a nucleic acid sequence into at least one of a plurality of plasmid vectors having different luminescent enzyme genes derived from luminescent beetles, and constructing a plasmid vector for analysis And measuring the promoter activity of the nucleic acid sequence using mammalian cells introduced so as to transiently or stably express the plasmid vector.

A method for high-throughput analysis of the functions of a plurality of nucleic acid sequences, wherein two or more gene sequences are each cloned into two or more T plasmid vectors containing luminescent enzyme genes having different emission wavelength spectra derived from luminescent beetles. A method comprising: constructing a plasmid vector for analysis; and measuring a promoter activity of a nucleic acid sequence using a mammalian cell introduced so as to transiently or stably express the plasmid vector.

The method according to claim 1 or 2, wherein the luminescent enzyme gene is selected from the group consisting of a railworm-derived luciferase, an Iriomote botulinum luciferase, and variants thereof.

The method according to claim 1 or 2, wherein at least one luminescent enzyme gene derived from a luminescent beetle is a red luminescent enzyme gene having a maximum emission wavelength of 600 nm or more.

At least one luminescent enzyme gene having a different emission wavelength spectrum derived from a luminescent beetle is placed under the control of a constant expression promoter, and the other two or more luminescent enzyme genes are linked to two or more nucleic acid sequences. The method according to claim 1, wherein:

6. The method according to claim 1, wherein the nucleic acid sequence is cloned into a T plasmid vector containing a luminescent enzyme gene derived from a luminescent beetle.

The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the nucleic acid sequence is cloned using a T plasmid vector containing a luminescent enzyme gene derived from a luminescent beetle and a TA cloning kit containing a DNA ligase.

(A) PCR amplification of multiple target gene sequences, (B) PCR amplified target gene sequences are ligated to different luminescent enzyme genes derived from luminescent beetles by TA cloning to construct a plasmid vector for analysis (C) Transforming the constructed plasmid vector for analysis into a host cell and growing it, and then extracting and purifying the plasmid vector for analysis, (D) Transiently or stably expressing the plasmid vector A method for high-throughput analysis of the functions of a plurality of target gene sequences, comprising the step of introducing into a mammalian cell, and (E) measuring the promoter activity of the target gene sequence using the mammalian cell.

The method according to claim 8, wherein at least one of the steps (A) to (E) is performed or supported by automation.