JP2006265210A - Vascular smooth muscle cell proliferation inhibitor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー、これらの硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とし血管平滑筋細胞の増殖を抑制することができる血管平滑筋細胞の増殖抑制剤に関する。 The present invention relates to vascular smoothing comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of N-acetylneuraminic acid, N-acetylneuraminic acid homopolymer, sulfates thereof, and pharmaceutically acceptable salts thereof. The present invention relates to a growth inhibitor of vascular smooth muscle cells capable of suppressing the proliferation of muscle cells.
動脈硬化は心筋梗塞や脳梗塞の基礎病変であるが、この病変は動脈中膜の血管平滑筋細胞が内膜へと遊走し活発に増殖することで形成されるので、血管平滑筋細胞の増殖を阻害することが、その防御及び予防に有効であることが知られている。血管平滑筋細胞の増殖阻害により動脈硬化を有効に抑制する物質について多くの研究者が研究をおこなっている（例えば、特許文献１）。しかし、血管平滑筋細胞の増殖抑制作用を有する物質の多くが内皮細胞の増殖を強く抑制し、動脈瘤の原因箇所となる障害を受けた内皮細胞の修復が遅れることにより、結果として動脈瘤の形成を促すことになり、未だに有用な動脈硬化を抑制するものは見出されていない。
したがって、本発明は、血管平滑筋細胞の増殖を抑制することができる血管平滑筋細胞の増殖抑制剤を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a growth inhibitor of vascular smooth muscle cells capable of suppressing the proliferation of vascular smooth muscle cells.
本発明者は、上記従来技術の問題点に鑑み鋭意検討を重ねた結果、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー、これらの硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種が、血管平滑筋細胞の増殖を抑制すること、さらに前記硫酸エステルが内皮細胞の増殖を阻害しないか又は阻害しても弱いことを見出し、本発明を完成させた。 As a result of intensive studies in view of the above-mentioned problems of the prior art, the present inventor has found that N-acetylneuraminic acid, N-acetylneuraminic acid homopolymers, sulfates thereof, and pharmaceutically acceptable salts thereof. It was found that at least one selected from the group consisting of suppresses the proliferation of vascular smooth muscle cells, and that the sulfate ester does not inhibit or is weak even if inhibited, the present invention is completed. I let you.
すなわち、本発明は下記の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤に係るものである。
項１．Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー、これらの硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
項２．ポリマーの数平均分子量が２〜１０００である項１に記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
項３．有効成分が数平均分子量２〜１０００のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー、これらの硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種である項１に記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
項４．有効成分が数平均分子量６〜５００のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー、これらの硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種である項１に記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
項５．有効成分が数平均分子量１０〜２００のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー、これらの硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種である項１に記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
項６．有効成分がＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステル、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種であって、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ3Ｈ基の数が、０．１〜３である項１〜５のいずれかに記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
項７．有効成分がＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステル、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種であって、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ3Ｈ基の数が、０．２５〜３である項１〜５のいずれかに記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
項８．有効成分がＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステル、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種であって、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ3Ｈ基の数が、１〜３である項１〜５のいずれかに記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
That is, the present invention relates to the following vascular smooth muscle cell proliferation inhibitor.
Item 1. Vascular smooth muscle cells containing as an active ingredient at least one selected from the group consisting of N-acetylneuraminic acid, N-acetylneuraminic acid homopolymers, sulfates thereof, and pharmaceutically acceptable salts thereof Growth inhibitor.
Item 2. Item 2. The growth inhibitor of vascular smooth muscle cells according to Item 1, wherein the polymer has a number average molecular weight of 2 to 1,000.
Item 3. Item 2. The active ingredient is at least one selected from the group consisting of an N-acetylneuraminic acid homopolymer having a number average molecular weight of 2 to 1000, a sulfate thereof, and a pharmaceutically acceptable salt thereof. An inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation.
Item 4. Item 2. The active ingredient is at least one selected from the group consisting of N-acetylneuraminic acid homopolymers having a number average molecular weight of 6 to 500, sulfate esters thereof, and pharmaceutically acceptable salts thereof. An inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation.
Item 5. Item 2. The active ingredient is at least one selected from the group consisting of N-acetylneuraminic acid homopolymers having a number average molecular weight of 10 to 200, sulfates thereof, and pharmaceutically acceptable salts thereof. An inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation.
Item 6. The active ingredient is at least one selected from the group consisting of N-acetylneuraminic acid sulfate, N-acetylneuraminic acid homopolymer sulfate, and pharmaceutically acceptable salts thereof, Item 6. The growth inhibitor of vascular smooth muscle cells according to any one of Items 1 to 5, wherein the number of SO 3 H groups per molecule of laminic acid residues is 0.1 to 3.
Item 7. The active ingredient is at least one selected from the group consisting of N-acetylneuraminic acid sulfate, N-acetylneuraminic acid homopolymer sulfate, and pharmaceutically acceptable salts thereof, Item 6. The growth inhibitor of vascular smooth muscle cells according to any one of Items 1 to 5, wherein the number of SO 3 H groups per molecule of laminic acid residues is 0.25 to 3.
Item 8. The active ingredient is at least one selected from the group consisting of N-acetylneuraminic acid sulfate, N-acetylneuraminic acid homopolymer sulfate, and pharmaceutically acceptable salts thereof, Item 6. The growth inhibitor of vascular smooth muscle cells according to any one of Items 1 to 5, wherein the number of SO 3 H groups per molecule of laminic acid residues is 1 to 3 .
本発明において、有効成分はＮ−アセチルノイラミン酸（以下、NeuAcと表記することがある）、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー（以下、polyNeuAcと表記することがある）、これらの硫酸エステル（上記２種のアルファベット表記の最後に「-S」を付して表記することがある）及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種である。 In the present invention, the active ingredient is N-acetylneuraminic acid (hereinafter sometimes referred to as NeuAc), N-acetylneuraminic acid homopolymer (hereinafter sometimes referred to as polyNeuAc), sulfates thereof ( And may be described by adding “-S” at the end of the above two alphabets) and at least one selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts thereof.
本発明において、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーは下記式(I)で表されるポリマーを包含する。 In the present invention, the N-acetylneuraminic acid homopolymer includes a polymer represented by the following formula (I).
〔式中、ｎは特に制限されないが、通常２〜１０００の整数、好ましくは６〜５００の整数、より好ましくは１０〜２００の整数を示す。〕
本発明において、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーはｎが１種のみである単一化合物であっても良く、また、ｎの値が異なる他の化合物との混合物（例えばコロミン酸）であってもよい。コロミン酸は公知物質であり、特許第2620795号公報、アグリカルチュラル アンド バイオロジカル ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry） 37, 2105-2110 (1973)などに記載の方法により製造できる。
[Wherein, n is not particularly limited, but usually represents an integer of 2 to 1000, preferably an integer of 6 to 500, more preferably an integer of 10 to 200. ]
In the present invention, the N-acetylneuraminic acid homopolymer may be a single compound in which n is only one kind, or a mixture (for example, colominic acid) with other compounds having different values of n. Also good. Colominic acid is a known substance and can be produced by the method described in Japanese Patent No. 2620795, Agricultural and Biological Chemistry 37, 2105-2110 (1973).
また、本発明において、Ｎ−アセチルノイラミン酸の硫酸エステル（NeuAc-S）はＮ−アセチルノイラミン酸の２，４，７，８及び９位にある少なくとも１種の水酸基が硫酸エステル化したものを包含する。そして、硫酸エステル化の程度は後述のポリマーの硫酸エステルの説明における硫酸エステル化の程度に準ずる。 Further, in the present invention, N-acetylneuraminic acid sulfate ester (NeuAc-S) is a sulfate esterification of at least one hydroxyl group at positions 2, 4, 7, 8 and 9 of N-acetylneuraminic acid. Including things. The degree of sulfate esterification is in accordance with the degree of sulfate esterification in the description of polymer sulfate described below.
また、本発明においてＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの硫酸エステル（polyNeuAc-S）は下記式(II)で表されるポリマーを包含する。 In the present invention, N-acetylneuraminic acid homopolymer sulfate (polyNeuAc-S) includes a polymer represented by the following formula (II).
〔式中、ｎは前記のとおり。Ｒは同一又は異なって水素原子又はＳＯ3Ｈ基を示す。但し、Ｒで表されるＳＯ3Ｈ基の数はＮ−アセチルノイラミン酸残基１モルに対し通常０．１〜３個、好ましくは０．２５〜３個、より好ましくは１〜３個である。〕
polyNeuAc-Sは、血管内皮細胞の増殖抑制作用が弱い又はその作用がない。本発明者らは、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ3Ｈ基の数が増加するにともなって、その作用が弱まる傾向があることを示唆する実験結果を得ている。このため、血管内皮細胞の増殖抑制が問題となる場合には、polyNeuAc-SにおけるＮ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ3Ｈ基の数は０．１〜３、好ましくは０．２５〜３、より好ましくは１〜３である。
[Wherein n is as defined above. R is the same or different and represents a hydrogen atom or a SO 3 H group. However, the number of SO 3 H groups represented by R is usually 0.1 to 3, preferably 0.25 to 3, more preferably 1 to 3 with respect to 1 mol of N-acetylneuraminic acid residue. It is. ]
polyNeuAc-S has weak or no vascular endothelial cell growth inhibitory action. The present inventors have obtained experimental results suggesting that the action tends to weaken as the number of SO 3 H groups per molecule of N-acetylneuraminic acid residues increases. For this reason, when growth inhibition of vascular endothelial cells becomes a problem, the number of SO 3 H groups per molecule of N-acetylneuraminic acid residue in polyNeuAc-S is 0.1 to 3, preferably 0. It is 25-3, More preferably, it is 1-3.
polyNeuAc-Sはｎが１種のみである単一化合物であっても良く、また、ｎの値が異なる他の化合物との混合物（例えば硫酸化コロミン酸）であってもよい。また、polyNeuAc-Sの分子量は、プルラン、シアル酸オリゴマーなどを標準物質とし、ＨＰＬＣ等により測定することができる。 The polyNeuAc-S may be a single compound in which n is only one kind, or may be a mixture with other compounds having different values of n (for example, sulfated colominic acid). The molecular weight of polyNeuAc-S can be measured by HPLC or the like using pullulan, sialic acid oligomer, etc. as standard substances.
上述のNeuAc-S及びpolyNeuAc-Sは公知物質であり、例えば特許第３０６５９０６号に記載の方法で製造できる。例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー１重量部に対し、溶媒の存在下又は不存在下に触媒０．５〜２００重量部、硫酸化剤０．２〜３０重量部を反応させる。反応時間は０．２〜４８時間程度であり、反応温度は−４０〜９０℃程度である。触媒としては、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミンなどが挙げられ、硫酸化剤としては、クロロスルホン酸、ピペリジン硫酸、サルファトリオキシド・トリメチルアミンなどが挙げられる。触媒としてピリジンなどを過剰量使用する場合には、溶媒を使用する必要はない。溶媒は、必ずしも使用する必要はないが、使用する場合には、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ホルムアミドなどが挙げられる。硫酸化反応の終了後は、公知の方法、例えば濃縮、ゲル濾過、イオン交換などの各種クロマトグラフィー、再沈殿、透析などの後処理によってpolyNeuAc-Sを分離できる。 The above-mentioned NeuAc-S and polyNeuAc-S are known substances and can be produced, for example, by the method described in Japanese Patent No. 3065906. For example, 0.5 to 200 parts by weight of a catalyst and 0.2 to 30 parts by weight of a sulfating agent are reacted with 1 part by weight of an N-acetylneuraminic acid homopolymer in the presence or absence of a solvent. The reaction time is about 0.2 to 48 hours, and the reaction temperature is about -40 to 90 ° C. Examples of the catalyst include pyridine, dimethylaminopyridine, and triethylamine. Examples of the sulfating agent include chlorosulfonic acid, piperidine sulfate, sulfatrioxide, trimethylamine, and the like. When an excessive amount of pyridine or the like is used as a catalyst, it is not necessary to use a solvent. The solvent is not necessarily used, but examples of the solvent include dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, formamide and the like. After completion of the sulfation reaction, polyNeuAc-S can be separated by a known method, for example, various chromatographies such as concentration, gel filtration, ion exchange, re-precipitation, post-treatment such as dialysis.
また、本発明において上述のNeuAc、NeuAc-S、polyNeuAc及びpolyNeuAc-Sの薬学的に許容される塩は、これらのナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属塩などを包含する。なお、硫酸エステルの薬学的に許容される塩の場合、硫酸基に塩が導入される。このため、薬学的に許容される塩において、上述のＮ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ3Ｈ基数は、塩が導入されていない硫酸基及び前記塩が導入された硫酸基の総数に読み替えるものとする。 In the present invention, the above-mentioned NeuAc, NeuAc-S, polyNeuAc and polyNeuAc-S pharmaceutically acceptable salts are alkali metal salts such as sodium, potassium and lithium, alkaline earth metals such as magnesium and calcium. Includes salt and the like. In the case of a pharmaceutically acceptable salt of sulfate ester, the salt is introduced into the sulfate group. For this reason, in the pharmaceutically acceptable salt, the number of SO 3 H groups per molecule of the N-acetylneuraminic acid residue described above is that of the sulfate group into which the salt is not introduced and the sulfate group into which the salt is introduced. It shall be read as the total number.
これらの塩は、水酸化ナトリウム、炭酸カリウムなどの塩で中和することで製造することもでき、また、いったん遊離の酸として得た後、それを用いて塩の形態としてもよい。更に、イオン交換樹脂、イオン交換ゲル、イオン交換セルロースカラムを用いて塩の形態にしても良い。 These salts can also be produced by neutralization with a salt such as sodium hydroxide or potassium carbonate, or once obtained as a free acid, it can be used in the form of a salt. Furthermore, you may make into the form of a salt using an ion exchange resin, an ion exchange gel, and an ion exchange cellulose column.
本発明の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤を注射剤として調製する場合、添加剤としては、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などが挙げられ、これらを常法、例えば適当量配合することにより、注射剤用製剤とすることができる。該製剤は、静脈内、筋肉内、皮下または腹腔内に投与される。また、本発明の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤を経口剤として調製する場合の添加剤（例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、乳剤）としては、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、矯臭剤、矯味剤などが挙げられ、これらを常法、例えば造粒、打錠、混合などの方法により、経口剤とすることができる。また、本発明の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤をパップ剤、坐剤として調製する場合の添加剤としては、基剤、界面活性剤などが挙げられ、これらを常法により坐剤とすることができる。さらに、添加剤としては、上記に例示したものだけでなく、各々の製剤を調製する際に通常用いられている添加剤も適当量使用することができる。 When the vascular smooth muscle cell growth inhibitor of the present invention is prepared as an injection, examples of additives include pH adjusters, buffers, stabilizers, isotonic agents, local anesthetics, and the like. It can be set as the formulation for injection by mix | blending an appropriate amount, for example by a conventional method. The formulation is administered intravenously, intramuscularly, subcutaneously or intraperitoneally. In addition, as an additive (for example, tablet, capsule, granule, fine granule, emulsion) when preparing the growth inhibitor of vascular smooth muscle cells of the present invention as an oral agent, an excipient, a disintegrant, Lubricants, binders, flavoring agents, flavoring agents and the like can be mentioned, and these can be made into oral preparations by conventional methods such as granulation, tableting, and mixing. In addition, the additives for preparing the growth inhibitor of vascular smooth muscle cells of the present invention as a poultice or suppository include bases, surfactants, etc., and these should be used as suppositories by conventional methods. Can do. Furthermore, as an additive, not only what was illustrated above but the additive normally used when preparing each formulation can also be used in an appropriate amount.
上記の各種製剤中に配合される有効成分の量は、投与すべき患者の年齢、性別、体重、症状などにより変動するが、一般的には、ヒト成人に対する１投与単位当たり、経口剤では１〜１００ｍｇ程度、注射剤では０．１〜２０ｍｇ程度、坐剤では１〜５０ｍｇ程度であるのが好ましく、ヒト成人１日当たりの投与量としては、剤型によって異なるが、１〜１０００ｍｇ程度、好ましくは１０〜２００ｍｇ程度である。 The amount of the active ingredient incorporated in the above-mentioned various preparations varies depending on the age, sex, weight, symptom, etc. of the patient to be administered, but in general, it is 1 per oral dosage unit for a human adult. It is preferably about 100 mg, about 0.1 to 20 mg for injections, and about 1 to 50 mg for suppositories. The dose per day for a human adult varies depending on the dosage form, but about 1 to 1000 mg, preferably It is about 10-200 mg.
本発明の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤は、血管平滑筋細胞の増殖を有意に抑制する。また、硫酸エステルを有効成分とすることによって、内皮細胞の増殖を阻害しないか又は阻害しても弱い。 The growth inhibitor of vascular smooth muscle cells of the present invention significantly suppresses the proliferation of vascular smooth muscle cells. Further, by using sulfate ester as an active ingredient, the proliferation of endothelial cells is not inhibited or even inhibited.
以下、本発明を参考例及び試験例等を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。 Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using a reference example, a test example, etc., this invention is not limited to these.
参考例１：polyNeuAc-S（硫酸化コロミン酸）の調製
ジメチルホルムアミド２０ｍｌにpolyNeuAc（コロミン酸）９０ｍｇ、サルファトリオキシド・ピリジン錯体４７７ｍｇ及びジメチルアミノピリジン３７ｍｇを加え、３０℃にて２４時間撹拌した。反応後、氷冷し、反応液を１Ｍ炭酸水素ナトリウム５０ｍｌに滴下し、中和した。中和後、濾過により固形物を分離し、透析チューブ（VISKASE SALES CORP.、孔の直径：24オングストローム）を用いて、透析を行った。透析後、ナトリウムイオン型のイオン交換樹脂（アンバーライトIR-120B、オルガノ株式会社製）カラムに通した。カラム流出液を減圧下で濃縮し、凍結乾燥により、１２６ｍｇのpolyNeuAc-Sを得た。得られたpolyNeuAc-Sの平均分子量は22,000ダルトンで、硫酸基含量は１３．４4%（Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ3Ｈ基の数は２．５）であった。
Reference Example 1: Preparation of polyNeuAc-S (sulfated colominic acid) To 20 ml of dimethylformamide, 90 mg of polyNeuAc (colominic acid), 477 mg of sulfatrioxide / pyridine complex and 37 mg of dimethylaminopyridine were added and stirred at 30 ° C. for 24 hours. After the reaction, the reaction mixture was ice-cooled, and the reaction solution was added dropwise to 50 ml of 1M sodium hydrogen carbonate to neutralize. After neutralization, the solid was separated by filtration and dialyzed using a dialysis tube (VISKASE SALES CORP., Pore diameter: 24 Å). After dialysis, the solution was passed through a sodium ion type ion exchange resin (Amberlite IR-120B, manufactured by Organo Corporation) column. The column effluent was concentrated under reduced pressure and freeze-dried to obtain 126 mg of polyNeuAc-S. The obtained polyNeuAc-S had an average molecular weight of 22,000 daltons and a sulfate group content of 13.44% (the number of SO 3 H groups per molecule of N-acetylneuraminic acid residue was 2.5).
試験例１：培養血管平滑筋細胞を用いたin vitroの実験
ウシ大動脈血管平滑筋細胞を、ウシ大動脈からArteriosclerosis, 91, 207, 1991に記載の方法により単離し、１０％ウシ胎児血清（FBS）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ニッスイ製薬社製）中にて３７℃、９５％空気−５％二酸化炭素の雰囲気下で培養した。４〜１０回継代した培養細胞を２％トリプシンと０．０２％エチレンジアミン−テトラ酢酸２ナトリウムの混合物で細胞をIWAKI培養ペトリ皿から取り出し、１００×ｇ、４℃で１０分遠心分離して集めた。このウシ大動脈血管平滑筋細胞を２４穴培養プレートに5,000 cells/cm2の密度で播種し、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコ変法イーグル培地中で２４時間上記と同じ条件で培養後、新鮮な同培地中でpolyNeuAc（平均分子量17,000）または参考例１で得られたのpolyNeuAc-S（０，２５，５０，１００ｍｇ／ｍｌ）存在下でさらに0〜72時間培養し、培養終了時の細胞数を粒子計測器（CDA-500）で測定した。培養４８時間後の細胞数を表１に示し、培養０，２４，４８，７２時間後の細胞数を表２に示した。
データはそれぞれ４回の試験結果の平均値±標準誤差で表し、結果についてはＡＮＯＶＡ検定による統計処理を行った。
Test Example 1: In vitro experiment using cultured vascular smooth muscle cells Bovine aortic vascular smooth muscle cells were isolated from bovine aorta by the method described in Arteriosclerosis, 91, 207, 1991, and 10% fetal bovine serum (FBS) In Dulbecco's modified Eagle medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) at 37 ° C. in an atmosphere of 95% air-5% carbon dioxide. Cultured cells passaged 4-10 times were removed from the IWAKI culture petri dish with a mixture of 2% trypsin and 0.02% ethylenediamine-disodium tetraacetate and collected by centrifugation at 100 × g for 10 minutes at 4 ° C. It was. The bovine aortic vascular smooth muscle cells were seeded in a 24-well culture plate at a density of 5,000 cells / cm 2 , cultured in Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% FBS for 24 hours under the same conditions as described above, and then in fresh same medium. Cultivated in the presence of polyNeuAc (average molecular weight 17,000) or polyNeuAc-S (0, 25, 50, 100 mg / ml) obtained in Reference Example 1 for 0 to 72 hours, and the number of cells at the end of culture was measured Measured with a device (CDA-500). The number of cells after 48 hours of culture is shown in Table 1, and the number of cells after 0, 24, 48, and 72 hours of culture is shown in Table 2.
Each data is expressed as an average value ± standard error of four test results, and the results were subjected to statistical processing by ANOVA test.
血管平滑筋細胞数は、２５μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌのpolyNeuAc（平均分子量17,000）または参考例１で得られたpolyNeuAc-Sの添加後４８時間の培養で無添加群（０μｇ／ｍｌ）に比較して有意に減少し、血管平滑筋細胞増殖抑制作用がみられた。また、その阻害作用は試料容量依存的であった。また、５０μｇ／ｍｌの阻害率は、polyNeuAcで約３５％、polyNeuAc-Sで約４４%であった。 The number of vascular smooth muscle cells was compared with the non-added group (0 μg / ml) in the culture for 48 hours after addition of polyNeuAc (average molecular weight 17,000) of 25 μg / ml to 100 μg / ml or polyNeuAc-S obtained in Reference Example 1. The vascular smooth muscle cell proliferation inhibitory effect was observed. Moreover, the inhibitory effect was dependent on the sample volume. Moreover, the inhibition rate of 50 μg / ml was about 35% for polyNeuAc and about 44% for polyNeuAc-S.
５０μｇ／ｍｌのpolyNeuAcまたはpolyNeuAc-Sの添加後２４時間から７２時間の培養により、血管平滑筋細胞数は、無添加群に比較して有意に減少し、血管平滑筋細胞増殖抑制作用がみられた。また、その阻害作用は培養時間依存的であった。また、４８時間後の阻害率は、polyNeuAcまたはpolyNeuAc-S共に約３２%であった。 By culturing 24 to 72 hours after the addition of 50 μg / ml polyNeuAc or polyNeuAc-S, the number of vascular smooth muscle cells was significantly reduced compared to the non-added group, and an inhibitory effect on vascular smooth muscle cell proliferation was observed. It was. In addition, the inhibitory action was dependent on the culture time. The inhibition rate after 48 hours was about 32% for both polyNeuAc and polyNeuAc-S.
試験例２：血管平滑筋細胞における[ 3 H]ラベルしたチミジンの取込み量の測定
ウシ大動脈血管平滑筋細胞を６穴培養プレートに5,000 cells/cm2の密度で播種し、１０%牛胎児血清含有ダルベッコ返法イーグル培地中で２４時間培養後、新鮮な同培地中でpolyNeuAcまたはpolyNeuAc-S（０，２５，５０，１００ｍｇ／ｍｌ）存在下で更に７２時培養し、培養終了前６時間にＤＮＡの合成を調べるために２０ｋＢｑ／ｍｌの[3H]ラベルしたチミジン（NEN Life Science Products社製）を添加した。培養終了後、培地を捨て、細胞をカルシウム及びマグネシウム及び含有しないリン酸緩衝液で洗った。細胞を新鮮な同緩衝液存在下ゴムベラ（ラバーポリスマン）でかきとって回収後、超音波処理によって細胞を破砕した。この細胞破砕物について５%トリクロロ酢酸にて沈殿を形成させ、その不溶性画分への放射活性の取込みを液体シンチレーションカウンターで測定した。別に細胞破砕液中のDNA量を蛍光分析法で測定した。結果を表３に示した。
Test Example 2: Measurement of [ 3 H] -labeled thymidine incorporation in vascular smooth muscle cells Bovine aortic vascular smooth muscle cells were seeded in a 6-well culture plate at a density of 5,000 cells / cm 2 and contained 10% fetal bovine serum. After culturing in Dulbecco's return Eagle medium for 24 hours, the cells are further cultured in the same medium in the presence of polyNeuAc or polyNeuAc-S (0, 25, 50, 100 mg / ml) for 72 hours. 20 kBq / ml [ 3 H] -labeled thymidine (NEN Life Science Products) was added. After completion of the culture, the medium was discarded, and the cells were washed with calcium and magnesium and a phosphate buffer containing no cells. The cells were collected by scraping with a rubber spatula (rubber policeman) in the presence of the same buffer, and then disrupted by sonication. The cell disruption was precipitated with 5% trichloroacetic acid, and the incorporation of radioactivity into the insoluble fraction was measured with a liquid scintillation counter. Separately, the amount of DNA in the cell lysate was measured by fluorescence analysis. The results are shown in Table 3.
血管平滑筋細胞のＤＮＡ合成は、７２時間の培養で無添加群に比べて２５μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌのpolyNeuAcまたはpolyNeuAc-Sにおいて有意な抑制が認められ、細胞の増殖阻害作用は、平滑筋細胞のＤＮＡ合成阻害によるものであることが示唆された。 The DNA synthesis of vascular smooth muscle cells was significantly suppressed in polyNeuAc or polyNeuAc-S at 25 μg / ml to 100 μg / ml compared to the non-added group after 72 hours of culture. It was suggested that this was due to inhibition of cellular DNA synthesis.
試験例３：培養血管内皮細胞を用いたin vitroの実験
ウシ大動脈血管内皮細胞を、In Vitro,19, 394, 1983に記載の方法により単離し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ニッスイ製薬社製）中にて３７℃、９５％空気−５％二酸化炭素の雰囲気下で培養した。４〜１０回継代した培養細胞を２％トリプシンと０．０２％エチレンジアミン−テトラ酢酸２ナトリウムの混合物で細胞をＩＷＡＫＩ培養ペトリ皿から取り出し、１００×ｇ、４℃で１０分遠心分離して集めた。この血管内皮細胞を２４穴培養プレートに5,000 cells/cm2の密度で播種し、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコ変法イーグル培地中で２４時間上記と同じ条件で培養後、新鮮な同培地中で参考例１で得られたpolyNeuAc-S（０，５０μｇ／ｍｌ）存在下でさらに４８時間培養し、培養終了時の細胞数を粒子計測器（CDA-500）で測定した。結果を表４に示した。
データはそれぞれ４回の試験結果の平均値±標準誤差で表し、結果についてはＡＮＯＶＡ検定による統計処理を行った。
Test Example 3: In Vitro Experiment Using Cultured Vascular Endothelial Cells Bovine aortic vascular endothelial cells were isolated by the method described in In Vitro, 19, 394, 1983, and Dulbecco's modification containing 10% fetal bovine serum (FBS) The cells were cultured in a method Eagle medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) in an atmosphere of 37 ° C. and 95% air-5% carbon dioxide. Cultured cells that were passaged 4-10 times were removed from the IWAKI culture Petri dish with a mixture of 2% trypsin and 0.02% ethylenediamine-disodium tetraacetate and collected by centrifugation at 100 xg for 10 minutes at 4 ° C. It was. These vascular endothelial cells were seeded in a 24-well culture plate at a density of 5,000 cells / cm 2 , cultured in Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% FBS for 24 hours under the same conditions as described above, and then fresh in the same medium. The cells were further cultured for 48 hours in the presence of polyNeuAc-S (0, 50 μg / ml) obtained in 1, and the number of cells at the end of the culture was measured with a particle counter (CDA-500). The results are shown in Table 4.
Each data is expressed as an average value ± standard error of four test results, and the results were subjected to statistical processing by ANOVA test.
polyNeuAc-Sは内皮細胞の増殖を抑制せず、むしろ増加傾向であった。平滑筋細胞の増殖抑制効果は、動脈硬化のリスク低減として好ましく、更には内皮筋細胞の増殖に影響を与えない、より好ましくは内皮筋細胞の増殖を促進する物質であり、polyNeuAc-Sはその物質に該当する。 polyNeuAc-S did not inhibit the proliferation of endothelial cells, but rather increased. The smooth muscle cell growth inhibitory effect is preferable as a risk reduction of arteriosclerosis, and further, does not affect the proliferation of endothelial muscle cells, more preferably promotes the proliferation of endothelial muscle cells, and polyNeuAc-S Applicable to substances.
試験例４：血管内皮細胞における[ 3 H]ラベルしたチミジンの取込み量の測定
ウシ大動脈血管平滑筋細胞に代えてウシ大動脈血管内皮細胞を使用し、被験試料を参考例１で得られたpolyNeuAc-Sのみとし、被検試料濃度を５０μｇ／ｍｌとし、培養時間を４８時間とした以外は試験例２と同様にしてチミジン取り込み量を測定した。結果を表５に示した。
Test Example 4: Measurement of [ 3 H] -labeled thymidine incorporation in vascular endothelial cells Bovine aortic vascular endothelial cells were used instead of bovine aortic vascular smooth muscle cells, and the test sample was polyNeuAc- obtained in Reference Example 1 The amount of thymidine incorporated was measured in the same manner as in Test Example 2 except that S was used, the test sample concentration was 50 μg / ml, and the culture time was 48 hours. The results are shown in Table 5.
血管内皮細胞のDNA合成は、無添加群に比べて５０μｇ／ｍｌのpolyNeuAc-Sにおいて抑制が認められず増加傾向であり、試験例３と同様の結果が得られた。 The DNA synthesis of vascular endothelial cells showed an increasing tendency with no inhibition observed in 50 μg / ml polyNeuAc-S compared to the non-added group, and the same results as in Test Example 3 were obtained.
本発明の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤は、心筋梗塞や脳梗塞などの動脈硬化の基礎病変に対して有用であると考えられる。
The growth inhibitor of vascular smooth muscle cells of the present invention is considered useful for basic lesions of arteriosclerosis such as myocardial infarction and cerebral infarction.
Claims (8)
The active ingredient is at least one selected from the group consisting of N-acetylneuraminic acid sulfate, N-acetylneuraminic acid homopolymer sulfate, and pharmaceutically acceptable salts thereof, The growth inhibitor of vascular smooth muscle cells according to any one of claims 1 to 5, wherein the number of SO 3 H groups per molecule of laminic acid residues is 1 to 3 .
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|---|---|---|---|---|
| JP2006342131A (en) * | 2005-06-10 | 2006-12-21 | Okayama Univ | Mobilizing agent for leukocyte and/or hemopoietic stem cell, and precursor cell |
| EP2116139A1 (en) * | 2008-05-08 | 2009-11-11 | Nestec S.A. | Sialic acid to support brain health in the elderly |
| WO2016137963A1 (en) * | 2015-02-25 | 2016-09-01 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Sialylation-increasing therapies for diseases associated with oxidative stress |
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2005
- 2005-03-25 JP JP2005089626A patent/JP2006265210A/en active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006342131A (en) * | 2005-06-10 | 2006-12-21 | Okayama Univ | Mobilizing agent for leukocyte and/or hemopoietic stem cell, and precursor cell |
| EP2116139A1 (en) * | 2008-05-08 | 2009-11-11 | Nestec S.A. | Sialic acid to support brain health in the elderly |
| WO2016137963A1 (en) * | 2015-02-25 | 2016-09-01 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Sialylation-increasing therapies for diseases associated with oxidative stress |
| US10493087B2 (en) | 2015-02-25 | 2019-12-03 | The United States of America, as represented by National Institute of Health | Sialylation-increasing therapies for diseases associated with oxidative stress |
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