JP2006262726A - Carbonic anhydrase gene of common oyster - Google Patents
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Abstract
Description
この発明は、マガキの炭酸脱水酵素遺伝子、その遺伝子から作られるプローブやプライマー、これらを利用した貝の選別方法、及び炭酸脱水酵素に関する。 The present invention relates to a oyster carbonic anhydrase gene, probes and primers made from the gene, a shellfish screening method using them, and a carbonic anhydrase.
養殖水産資源として重要なマガキやアコヤ貝は、軟体動物に属し、その初期発生は軟体動物特有の過程を経る。具体的には、初期胚発生が非常に速い、胚由来遺伝子の発現が脊椎動物などに比べて遅く胞胚期以降である、受精後6時間頃のトロコフォア幼生から24時間ぐらいまでのベリジャー幼生の段階での生残率が著しく低下しやすい、などの特徴がある。 The oysters and pearl oysters that are important as aquaculture and fishery resources belong to mollusks, and their initial development goes through a process specific to molluscs. Specifically, early stage embryo development, embryo-derived gene expression is later than vertebrates and later in the blastocyst stage, from the trochophore larvae around 6 hours after fertilization to the stage of Verija larvae around 24 hours There is a feature such as that the survival rate in the market is remarkably reduced.
さて、商業的な観点からは、初期胚発生を順調に進行させ、幼生の段階で生存率を高めることによって、効率的に貝の種苗生産を行うことが重要であり、従来から、なるべく早期に健常な個体（健常貝）を選別する方法が求められている。 From a commercial point of view, it is important to carry out early embryonic development smoothly and increase the survival rate at the larval stage to efficiently produce shellfish seedlings. There is a demand for a method for selecting healthy individuals (normal shellfish).
また、貝類を含む多くの生物において、卵に当初から存在する母性遺伝子由来の転写産物が初期胚発生の順調な進行に重要な役割を果たしていることはすでに示されている（非特許文献１を参照。）。 In addition, in many organisms including shellfish, it has already been shown that transcripts derived from maternal genes that originally exist in eggs play an important role in the smooth progression of early embryogenesis (see Non-Patent Document 1). reference.).
そこで、これを利用して健常貝を選別する方法が考えられてはいるものの、どの遺伝子が前記母性遺伝子に含まれるのかは特定されていない。そのため、卵に当初から存在する母性遺伝子由来の転写産物を指標にして、健常貝を選別することは未だできていない。 Thus, although a method for selecting healthy shellfish using this is considered, it is not specified which gene is included in the maternal gene. For this reason, it has not yet been possible to select healthy shellfish using the transcription product derived from the maternal gene present in the egg as an index.
ところで、貝は貝殻をつけて卵から出てくるが、この貝殻の主成分は炭酸カルシウムであり、この炭酸カルシウムは卵や海水に含まれる炭酸水素イオン及びカルシウムイオンから、炭酸脱水酵素によって作られることが知られている。また、成長段階にある貝の外套膜が、貝殻の形成を制御するとともに、貝殻成分を分泌することも知られている。なお、貝類の炭酸脱水酵素としては、アコヤ貝外套膜の単離された炭酸脱水酵素遺伝子nacreinがある（特許文献１を参照。）
そこで、この発明は、貝の卵に含まれる転写産物の元になる母性遺伝子を単離して、この遺伝子の塩基配列を決定したのち、この遺伝子のDNAからプライマーやプローブを作製し、これらを使用して貝の卵に含まれる前記遺伝子の転写産物を指標に生存確率の高い貝の卵を選別する方法を確立することを課題とする。 Therefore, the present invention isolates a maternal gene that is the source of the transcript contained in shellfish eggs, determines the base sequence of this gene, then creates primers and probes from the DNA of this gene, and uses them. Thus, an object of the present invention is to establish a method for selecting shell eggs having a high survival probability using the transcript of the gene contained in the shell eggs as an index.
発明者は、マガキ卵中で行われる貝殻の形成には炭酸脱水酵素が関係しているので、マガキの母性遺伝子には炭酸脱水酵素遺伝子も含まれていると考え、この酵素がマガキの外套膜に由来する炭酸脱水酵素と同一の反応を触媒することから、両者をコードする遺伝子の塩基配列は同一又は類似であると予測した。そして、この予測に基づいて貝の外套膜で発現する炭酸脱水酵素遺伝子のDNAを単離し、その塩基配列及びその構造を決定した。なお、このDNAがマガキの卵で発現していること、及びこのDNAがコードする蛋白質の構造について確認した。 The inventor considers that carbonic anhydrase is involved in the formation of shells performed in oyster eggs, so the maternal gene of oysters also includes the carbonic anhydrase gene, which is the mantle of the oyster. Since it catalyzes the same reaction as the carbonic anhydrase derived from, the base sequences of the genes encoding both were predicted to be the same or similar. Based on this prediction, DNA of the carbonic anhydrase gene expressed in the shell membrane of shellfish was isolated, and its base sequence and structure were determined. It was confirmed that this DNA was expressed in oyster eggs and the structure of the protein encoded by this DNA.
すなわち、この発明の炭酸脱水酵素遺伝子は、マガキの外套膜に由来するとともに、2つの炭酸脱水酵素ドメインを重複して備えており、この遺伝子のDNAは配列表１に示す塩基配列を備えている。 That is, the carbonic anhydrase gene of this invention is derived from the mantle of the oyster and has two carbonic anhydrase domains overlappingly. The DNA of this gene has the base sequence shown in Sequence Listing 1. .
そして、この発明のプローブやプライマーは前記DNAの塩基配列に基づいて作製されたものであり、この発明の貝の選別方法は、これらのプローブやプライマーを使用して生存確率の高い貝の卵を選別するものである。また、この発明の炭酸脱水酵素は、前記炭酸脱水酵素遺伝子にコードされたものである。 The probe or primer of the present invention is prepared based on the base sequence of the DNA, and the shellfish selection method of the present invention uses these probes and primers to produce shellfish eggs with a high survival probability. It is what is selected. The carbonic anhydrase of the present invention is encoded by the carbonic anhydrase gene.
この発明によって、マガキの卵に存在する母性遺伝子として新規の炭酸脱水酵素遺伝子を特定することができ、この遺伝子を検出することにより生存確率の高い卵を効率的に選別することが可能となった。そして、この遺伝子を指標にすることにより、貝類の養殖において効率的な種苗生産が可能となり、生産コストを低減化することが期待できる。 According to the present invention, a novel carbonic anhydrase gene can be identified as a maternal gene present in oyster eggs, and it has become possible to efficiently select eggs having a high survival probability by detecting this gene. . By using this gene as an index, efficient seed production can be achieved in shellfish culture, and production costs can be expected to be reduced.
この発明は、マガキの外套膜で特異的に発現する炭酸脱水酵素遺伝子、前記遺伝子のDNA、それから作られるプローブやプライマー、それを利用した貝の選別方法、及び前記DNAにコードされた炭酸脱水酵素である。そこで、これらについて以下に詳説する。 The present invention relates to a carbonic anhydrase gene that is specifically expressed in a mantle envelope, a DNA of the gene, a probe or primer produced therefrom, a shellfish screening method using the gene, and a carbonic anhydrase encoded by the DNA It is. Therefore, these will be described in detail below.
（炭酸脱水酵素遺伝子）
この発明のマガキの炭酸脱水酵素は、マガキの外套膜に由来するものであり、現在までに単離されそのアミノ酸配列が確認された炭酸脱水酵素の炭酸脱水酵素ドメインと類似するアミノ酸配列を、2つ重複して備えている。
(Carbonic anhydrase gene)
The oyster carbonic anhydrase of the present invention is derived from the oyster mantle and has an amino acid sequence similar to the carbonic anhydrase domain of the carbonic anhydrase isolated and confirmed to date. Have two duplicates.
このマガキの炭酸脱水酵素として、具体的には、配列番号１に示す塩基配列からなるDNAが例示できる。また、配列番号１に記載のDNAおいて、1又数個の塩基が欠失、置換、挿入された塩基配列からなるDNAであって、炭酸脱水酵素活性を有する蛋白質をコードするDNAもこの発明のDNAに含まれる。 Specific examples of this oyster carbonic anhydrase include DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Further, in the DNA of SEQ ID NO: 1, a DNA comprising a nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, substituted or inserted, and a DNA encoding a protein having carbonic anhydrase activity is also this invention Included in DNA.
（遺伝子の単離）
この遺伝子及びDNAは、例えば次のようにして単離することができる。
(Gene isolation)
This gene and DNA can be isolated, for example, as follows.
炭酸脱水酵素は、そのアミノ酸配列が種を越えて類似していることが知られており、その一部は種の違いにもかかわらず保存されている。そこで、この保存されたアミノ酸配列に対応した塩基配列を参考に複数のプライマーを作製する。 Carbonic anhydrases are known to have similar amino acid sequences across species, and some of them are conserved despite species differences. Therefore, a plurality of primers are prepared with reference to the base sequence corresponding to the conserved amino acid sequence.
一方、マガキ外套膜から単離したtotal RNAを鋳型として、逆転写酵素により逆転写反応を行なえば、１本鎖cDNAが得られる。そして、この１本鎖cDNAを鋳型として使用し、前記複数のプライマーの中から選択したプライマーを組み合わせてPCR反応を行えば、マガキ外套膜の転写産物に由来し、かつ前記保存されたアミノ酸配列に対応した塩基配列を含むDNAが得られる。 On the other hand, if reverse transcription is performed with reverse transcriptase using total RNA isolated from oyster mantle as a template, single-stranded cDNA can be obtained. When this single-stranded cDNA is used as a template and a PCR reaction is performed by combining primers selected from the plurality of primers, the conserved amino acid sequence is derived from the transcript of the oyster mantle. DNA containing the corresponding nucleotide sequence is obtained.
このDNAは、使用したプライマー間の塩基配列しか含んでおらず、言い換えるならば、目的とする炭酸脱水酵素の一部の塩基配列を含む部分DNAでしかない。そこで、この部分の塩基配列をDNAシーケンサーによって決定し、その塩基配列を利用して5′ RACE法及び3′RACE法により、5′末端側及び3′末端側の塩基配列を決定する。 This DNA contains only the base sequence between the primers used, in other words, it is only a partial DNA containing a partial base sequence of the target carbonic anhydrase. Therefore, the base sequence of this portion is determined by a DNA sequencer, and the base sequences of the 5 ′ end side and the 3 ′ end side are determined by the 5 ′ RACE method and the 3 ′ RACE method using the base sequence.
そして、前記部分DNA配列、及びその5′末端側及び3′末端側の塩基配列を適当なコンピュータソフトウエアにより連結すれば、完全長の塩基配列を得ることができる。なお、蛋白質の発現などのため、完全長のDNAが必要な場合には、例えば、DNA中にある制限酵素部位でDNAの切断と結合を行うことなどによって、完全長のDNAを得ることができる。また、完全長DNAの上流及び下流にある塩基配列をプライマーとして使用し、前記total RNAを鋳型として使用としてPCR反応を行うことによっても、完全長のDNAを得ることができる。 A full-length base sequence can be obtained by linking the partial DNA sequence and its 5′-end and 3′-end base sequences with appropriate computer software. If full-length DNA is required for protein expression, etc., full-length DNA can be obtained, for example, by cleaving and binding DNA at a restriction enzyme site in the DNA. . A full-length DNA can also be obtained by using a base sequence upstream and downstream of the full-length DNA as a primer and performing a PCR reaction using the total RNA as a template.
（プローブ及びプライマー）
また、この発明のDNAは、その全部又は一部及びそれらの転写産物をプローブとして使用することができ、その一部をプライマーとして使用することができる。ここで、一部とは、プライマー又はプローブとして使用するDNAが、この発明のDNA（例えば、配列番号１に記載のDNA）に含まれる少なくとも10個、好ましくは15個、さらに好ましくは約20〜30個の塩基配列に対応するヌクレオチドからなることを意味する。なお、プローブとして使用する場合には、さらに高分子のもの、例えばこの発明のDNAそのものやその転写産物であっても使用することができる。
(Probes and primers)
In addition, the DNA of the present invention can be used as a probe for all or a part thereof and their transcripts, and a part thereof can be used as a primer. Here, the term “part” means that at least 10, preferably 15, and more preferably about 20 to about DNA used as a primer or probe is contained in the DNA of the present invention (for example, the DNA described in SEQ ID NO: 1). It means that it consists of nucleotides corresponding to 30 base sequences. In addition, when used as a probe, even a polymer such as the DNA itself of the present invention or its transcription product can be used.
これらのプローブ及びプライマーは、例えば、DNA合成装置によって合成したDNA、この発明のDNAを制限酵素により部分消化したDNA、この発明のDNAやその部分配列を組み換えたベクターからT7 RNA polymerase等のRNA polymeraseを使用して作製したRNAプローブなどである。また、プローブやプライマーについては標識物質により標識してあるほうがよい。 These probes and primers include, for example, DNA synthesized by a DNA synthesizer, DNA obtained by partially digesting the DNA of the present invention with a restriction enzyme, and RNA polymerase such as T7 RNA polymerase from the DNA of the present invention and a vector obtained by recombining the partial sequence. RNA probe produced using Also, the probe or primer should be labeled with a labeling substance.
ここで、標識物質としては、例えばジゴキシゲニン（DIGシステム、Boehringer Mannheim）、蛍光物質、放射性同位体などの検出可能なものが挙げることができ、標識は、例えば標識物質を化学的にDNAに結合させる、DNAを合成する際にすでに標識したヌクレヲチドを使用してDNAを合成するなどによって行うことができる。 Here, examples of the labeling substance include detectable substances such as digoxigenin (DIG system, Boehringer Mannheim), fluorescent substances, and radioisotopes. The labeling substance chemically binds the labeling substance to DNA, for example. For example, DNA can be synthesized by using a nucleotide already labeled when synthesizing DNA.
（貝の選別方法）
この発明の貝類の選別方法は、前記DNAプローブ、又はDNAプライマーの少なくとも何れか一方を使用して、前記炭酸脱水酵素遺伝子の転写産物を検出することにより、生存確率の高い貝の卵を選別するものである。
(Shellfish sorting method)
The method for selecting shellfish according to the present invention selects shellfish eggs having a high survival probability by detecting a transcript of the carbonic anhydrase gene using at least one of the DNA probe and the DNA primer. Is.
具体的には、この発明のプローブを使用して、この発明の炭酸脱水酵素遺伝子の転写産物を検出するには、被検体からtotal RNAを抽出し、抽出したtotal RNAとこの発明のプローブとのハイブリダイゼーションを行い、ハイブリッド形成の有無を検出すればよい。なお、プローブとRNAとのハイブリダイゼーションは、通常の方法により、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、in situ ハイブリダイゼーション等の方法により行うことができる。そして、形成したハイブリッドの有無は、目視よって直接検出してもよく、X線フィルムや蛍光顕微鏡などを介して間接的に検出する。 Specifically, in order to detect the transcript of the carbonic anhydrase gene of the present invention using the probe of the present invention, total RNA is extracted from the subject, and the extracted total RNA and the probe of the present invention are extracted. Hybridization may be performed to detect the presence or absence of hybridization. The probe and RNA can be hybridized by an ordinary method, for example, a method such as Northern hybridization, dot blot hybridization, or in situ hybridization. The presence / absence of the formed hybrid may be directly detected visually or indirectly through an X-ray film or a fluorescence microscope.
また、この発明のプライマーを使用する場合には、被検体からtotal RNAを抽出し、これに対してRT-PCRを行い、このRT-PCR産物を電気泳動して、適切なバンドの形成を検出すればよい。 In addition, when using the primer of the present invention, total RNA is extracted from the specimen, RT-PCR is performed on this, and this RT-PCR product is electrophoresed to detect the formation of an appropriate band. do it.
（炭酸脱水酵素）
この発明の炭酸脱水酵素は、この発明の炭酸脱水酵素遺伝子にコードされており、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質である。また、この炭酸脱水酵素は前記遺伝子を組み替えた発現ベクターが形質転換された形質転換体を培養したのち、この形質転換体から分離・精製することによって作製できる。
(Carbonic anhydrase)
The carbonic anhydrase of the present invention is encoded by the carbonic anhydrase gene of the present invention and is, for example, a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. In addition, this carbonic anhydrase can be produced by culturing a transformant transformed with an expression vector in which the above gene is recombined, and then separating and purifying it from this transformant.
ここで、前記発現ベクターは、炭酸脱水酵素遺伝子を発現に適したベクターのプロモーター下流に制限酵素とDNAリガーゼを使用して組換えることにより作製することができる。なお、このベクターは宿主内で複製、増幅可能であれば特に限定されない。プロモーターおよびターミネーターに関しても、炭酸脱水酵素遺伝子の発現に使用する宿主に対応したものであれば特に限定せずに使用でき、宿主に応じて適切に組み合わせて使用できる。 Here, the expression vector can be prepared by recombining a carbonic anhydrase gene downstream of the promoter of a vector suitable for expression using a restriction enzyme and DNA ligase. This vector is not particularly limited as long as it can be replicated and amplified in the host. The promoter and terminator can also be used without particular limitation as long as they correspond to the host used for the expression of the carbonic anhydrase gene, and can be used in appropriate combinations depending on the host.
このようにして得られた発現ベクターは、宿主に応じてコンピテントセル法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等により宿主に形質転換し、形質転換体を作製する。ここで、宿主としては大腸菌等の細菌、貝類の培養細胞をはじめとする動物細胞などが挙げられる。 The expression vector thus obtained is transformed into a host by a competent cell method, electroporation method, calcium phosphate method or the like according to the host to produce a transformant. Examples of the host include bacteria such as Escherichia coli and animal cells including cultured cells of shellfish.
このようにして作製した形質転換体をその宿主に応じた適切な培地中で培養したのち、産生した炭酸脱水酵素を分離、精製する。より具体的には、培養は温度が通常20℃〜45℃、pHが通常pH5〜8の範囲で行ない、必要に応じて通気、攪拌を行なう。また形質転換体からの炭酸脱水酵素の分離、精製は、公知の分離、精製法、例えば、塩析法、溶媒沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどを組み合わせて行う。 The transformant thus prepared is cultured in an appropriate medium according to the host, and the produced carbonic anhydrase is separated and purified. More specifically, the culture is carried out at a temperature of usually 20 ° C. to 45 ° C. and a pH of usually 5 to 8, with aeration and agitation as necessary. In addition, separation and purification of carbonic anhydrase from the transformant is performed by combining known separation and purification methods such as salting out method, solvent precipitation method, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography and the like. .
なお、この炭酸脱水酵素の全部または一部（部分）をエピトープとして使用して抗体を作製し、この抗体によってこの発明の炭酸脱水酵素を検出することにより、貝の卵の選別を行うこともできる。ここで、エピトープとは、ポリペプチドの抗原決定基を意味し、一般に少なくとも６個のアミノ酸で構成されるものである。 It is also possible to produce shellfish eggs by preparing an antibody using the whole or part (part) of this carbonic anhydrase as an epitope and detecting the carbonic anhydrase of the present invention using this antibody. . Here, an epitope means an antigenic determinant of a polypeptide and is generally composed of at least 6 amino acids.
以下、この発明を実施に例によってより詳細に説明するが、以下の実施例によりこの発明の特許請求の範囲はいかなる意味でも限定的に解釈されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. However, the scope of the claims of the present invention is not construed as being limited in any way by the following examples.
（１）nacrein遺伝子を基にしたdegenerateプライマーの合成
アコヤ貝外套膜のcDNAライブラリーから単離された炭酸脱水酵素遺伝子nacreinは、ヒトをはじめとする哺乳類の様々な炭酸脱水酵素(ヒト：CA2)と相同性がある。なかでも、図１に示すようにN末端領域において四角で囲んだRQSPとGSEH配列は高度に保存されている。そこでこの2つのアミノ酸配列に相当する以下のdegenerateプライマーを合成した。なお、degenerateプライマーの塩基配列を表１に示す。また、下記プライマー配列は定法に従って右側が5′末端、左側が3′である。
(1) Synthesis of degenerate primer based on nacrein gene The carbonic anhydrase gene nacrein isolated from the cDNA library of the pearl oyster mantle is a variety of carbonic anhydrases in humans and other mammals (human: CA2). And has homology. In particular, as shown in FIG. 1, the RQSP and GSEH sequences surrounded by a square in the N-terminal region are highly conserved. Therefore, the following degenerate primers corresponding to these two amino acid sequences were synthesized. The base sequence of the degenerate primer is shown in Table 1. Further, the following primer sequences are 5 ′ end on the right side and 3 ′ on the left side according to a conventional method.
（２）マガキ外套膜由来RNAを用いたRT-PCR
まず、マガキ外套膜1 gに対してTrizol試薬（インビトロジェン社、アメリカ）10倍量を加えポリトロンホモジナイザーにて破砕した。遠心後、上清を回収し、1/5量のクロロホルムを加え攪拌した。遠心後、上清を回収し、イソプロパノール沈殿を行った。沈殿を乾燥後、滅菌水に溶解させた。なお、その濃度はO.D.260 nmの値から推定した。
(2) RT-PCR using oyster mantle-derived RNA
First, 10 times the amount of Trizol reagent (Invitrogen, USA) was added to 1 g of oyster mantle, and the mixture was crushed with a polytron homogenizer. After centrifugation, the supernatant was collected, and 1/5 volume of chloroform was added and stirred. After centrifugation, the supernatant was collected and subjected to isopropanol precipitation. The precipitate was dried and dissolved in sterilized water. The concentration was estimated from the value of OD 260 nm .
つぎに、このようにして抽出したtotal RNAを使用して、RT-PCR反応をおこなった。具体的には、まず、total RNA5μg, オリゴdTプライマー1μgに対して、逆転写酵素（Superscript II、インビトロジェン社、アメリカ）を加えて、40℃で2時間おくことにより1本鎖cDNAを得た。そして、この1本鎖cDNAを使用して、上記のプライマーの組み合わせ32通りに対してPCR反応を行った。その結果、5′端側プライマーに NacU5-1: 5′-MRMCARTCICCAAT-3′（配列番号３）、3′末端側プライマーにNacU3-4: 5′-TRTGYTCITGNCC-3′（配列番号４）を用いた場合に、PCR反応において明確なバンドが形成された。なお、配列中のIはイノシンを意味している。 Next, RT-PCR reaction was performed using the total RNA thus extracted. Specifically, first, reverse transcriptase (Superscript II, Invitrogen, USA) was added to 5 μg of total RNA and 1 μg of oligo dT primer, and a single-stranded cDNA was obtained by leaving at 40 ° C. for 2 hours. Then, using this single-stranded cDNA, PCR reaction was performed on 32 combinations of the above primers. As a result, NacU5-1: 5'-MRMCARTCICCAAT-3 '(SEQ ID NO: 3) was used as the 5' end primer, and NacU3-4: 5'-TRTGYTCITGNCC-3 '(SEQ ID NO: 4) was used as the 3' end primer. A clear band was formed in the PCR reaction. In the sequence, I means inosine.
なお、前記PCR反応には、DNAポリメラーゼとしてAmpliTaq Gold (アプライドバイオシステムズ社、アメリカ)を使用し、反応装置としてGeneAmp PCR system 9700(アプライドバイオシステムズ社)を使用した。また、PCR反応は、95℃、30秒の変性工程、55度、30秒のアーニリング工程、68℃、30秒の伸張工程からなる反応サイクルを30サイクル行った。 In the PCR reaction, AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, USA) was used as a DNA polymerase, and GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems) was used as a reaction apparatus. The PCR reaction was carried out by 30 reaction cycles consisting of a denaturation step at 95 ° C. for 30 seconds, an annealing step at 55 ° C. for 30 seconds, and an extension step at 68 ° C. for 30 seconds.
つぎに、前記反応において確認されたcDNA断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、当該cDNA断片をGFX gel band purification kit (アマシャムバイオサイエンス社、アメリカ)により精製した。精製したcDNA断片は、pGEM T-easy vector（プロメガ社、アメリカ）EcoRIの部位に挿入したのち、大量に増幅した。そして、cDNA断片の塩基配列をアプライドバイオシステムズ社のABI PRISM 377 DNA シークエンサーにより決定した。 Next, the cDNA fragments confirmed in the reaction were separated by agarose gel electrophoresis, and the cDNA fragments were purified by GFX gel band purification kit (Amersham Biosciences, USA). The purified cDNA fragment was inserted at the site of pGEM T-easy vector (Promega, USA) EcoRI and then amplified in large quantities. The nucleotide sequence of the cDNA fragment was determined using an ABI PRISM 377 DNA sequencer manufactured by Applied Biosystems.
（３）マガキ新規炭酸脱水酵素遺伝子の完全長cDNAの単離
前記塩基配列をもとにして、クロンテック社のSMART RACE cDNA Amplification kitによって5′ RACE及び3′RACE法を行い、5′端および3′端のcDNAを得た。なお、5′RACE法及び3′RACE法は、添付のマニュアルに沿って行った。また、5′ RACE法用のプライマーとして5′-CATTGAGGGTGGGGTCATAGATGGC-3′（配列番号５）を、3′RACE法用のプライマーとしては5′-CTGCAGTATATAGCACCGCCCAGTT-3′（配列番号６）を使用した。
(3) Isolation of full-length cDNA of magaki novel carbonic anhydrase gene Based on the above base sequence, 5 ′ RACE and 3 ′ RACE methods were performed using Clontech's SMART RACE cDNA Amplification kit. A 'end cDNA was obtained. The 5′RACE method and the 3′RACE method were performed in accordance with the attached manual. Further, 5′-CATTGAGGGTGGGGTCATAGATGGC-3 ′ (SEQ ID NO: 5) was used as a primer for 5 ′ RACE method, and 5′-CTGCAGTATATAGCACCGCCCAGTT-3 ′ (SEQ ID NO: 6) was used as a primer for 3 ′ RACE method.
このようにして単離したcDNA断片は、前記（２）と同様の方法にて塩基配列を決定した。そして、決定した塩基配列を遺伝子解析ソフトウェアGenetyx Mac（ゼネティックス社）により連結し、アミノ酸への翻訳操作を行った。予想されるアミノ酸配列に関しては、Genetyx Macを用いて、哺乳類の炭酸脱水酵素の配列と比較することにより機能ドメインを特定した。なお、決定した炭酸脱水酵素遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に、それがコードする炭酸脱水酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。 The nucleotide sequence of the thus isolated cDNA fragment was determined by the same method as in (2) above. Then, the determined base sequence was ligated by gene analysis software Genetyx Mac (Genetics) and translated into amino acids. With regard to the predicted amino acid sequence, Genetyx Mac was used to identify functional domains by comparison with mammalian carbonic anhydrase sequences. The determined nucleotide sequence of the carbonic anhydrase gene is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the amino acid sequence of the carbonic anhydrase encoded by it is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
その結果、この発明により特定した遺伝子は、通常の炭酸脱水酵素遺伝子とは異なり、図２に示すように、2つの炭酸脱水酵素（CA）ドメインからなる非常に特異なタンパク質をコードしていることが明らかとなった。 As a result, the gene specified by the present invention differs from the normal carbonic anhydrase gene, and encodes a very specific protein consisting of two carbonic anhydrase (CA) domains as shown in FIG. Became clear.
（４）マガキ新規炭酸脱水酵素遺伝子のノーザンハイブリダイゼーション
この発明で単離したマガキ新規炭酸脱水酵素遺伝子の発現領域を明らかにするために、マガキの各種組織を用いたノーザンハイブリダイゼーションを行った。
(4) Northern hybridization of oyster novel carbonic anhydrase gene In order to clarify the expression region of the oyster novel carbonic anhydrase gene isolated in the present invention, Northern hybridization using various tissues of oyster was performed.
具体的には、まず、マガキの外套膜、鰓、中腸、未受精卵から単離したtotal RNAを、定法に沿って、電気泳動してその大きさごとに分離し、メンブレンにブロッティングした。なお、ブロッティング用のメンブレンとしてはHybond-N+(アマシャムバイオサイエンス社、アメリカ)を使用した。 Specifically, first, total RNA isolated from oyster mantle, cocoon, midgut, and unfertilized egg was electrophoresed according to a standard method, separated according to size, and blotted onto a membrane. Hybond-N + (Amersham Biosciences, USA) was used as a membrane for blotting.
つぎに、（３）で特定したマガキ新規炭酸脱水酵素遺伝子（配列番号１）の5'末領域約500塩基をRediprime II DNA labeling system (アマシャムバイオサイエンス社、アメリカ)によりα-32P-dCTPで標識して、プローブを作製した。 Next, about 500 bases of the 5 'terminal region of the oyster novel carbonic anhydrase gene (SEQ ID NO: 1) identified in (3) was α- 32 P-dCTP by Rediprime II DNA labeling system (Amersham Biosciences, USA). Labeled to make a probe.
そして、前記メンブレン及びプローブを使用して60℃で一晩ハイブリダイゼーションを、行い、65℃の0.5X SSC中にて30分間、2回洗浄したのち、BAS2500（フジフイルム）によりシグナルを検出した。その結果を図３に示す。なお、図３において、レーン１は中腸、レーン２は鰓、レーン３は外套膜、レーン４は卵に由来するtotal RNAを泳動した結果である。 Then, hybridization was performed overnight at 60 ° C. using the membrane and probe, washed twice in 0.5 × SSC at 65 ° C. for 30 minutes, and then the signal was detected by BAS2500 (Fujifilm). The result is shown in FIG. In FIG. 3, lane 1 is the midgut, lane 2 is sputum, lane 3 is the mantle, and lane 4 is the result of electrophoresis of total RNA derived from eggs.
この図からも明らかなように、ノーザンハイブリダイゼーションの結果、レーン３の外套膜由来のtotal RNAとの間にはごく僅かなシグナルしか確認できなかったのに対して、レーン４の卵由来のtotal RNAとの間には強いシグナルが確認できた。このことは、この発明の炭酸脱水酵素遺伝子（配列番号１）が、外套膜よりはむしろ卵で多く発現しており、この遺伝子が母性遺伝子の一つであることを示している。そのため、この発明の炭酸脱水酵素遺伝子（配列番号１）を検出することによって、健常個体を効率よく選別することができる。 As is apparent from this figure, as a result of Northern hybridization, only a very small signal could be confirmed with the total RNA derived from the mantle in lane 3, whereas the total derived from the egg in lane 4 A strong signal was confirmed with RNA. This indicates that the carbonic anhydrase gene (SEQ ID NO: 1) of the present invention is expressed more in the egg than in the mantle, and this gene is one of the maternal genes. Therefore, healthy individuals can be efficiently selected by detecting the carbonic anhydrase gene (SEQ ID NO: 1) of the present invention.
Claims (7)
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるDNA、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列において1個又は数個の塩基が欠失、置換、挿入された塩基配列からなり、炭酸脱水酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA。 The carbonic anhydrase gene comprising the DNA of any of the following (a) or (b):
(A) DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(B) DNA encoding a protein having a carbonic anhydrase activity, comprising a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or inserted in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1983054A1 (en) | 2007-04-20 | 2008-10-22 | Georg-August-Universität Göttingen | Carbonic anhydrase and methods using the same |
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2005
- 2005-03-22 JP JP2005082068A patent/JP2006262726A/en active Pending
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