JP2006213678A - Microcapsule composition and method for exposing enzyme or protein - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ウイルスキャプシドなどを利用し、その内部に酵素またはタンパク質を包埋させたマイクロカプセルを作製し、多糖類と混合した組成物を調製することにより内部の酵素またはタンパク質を安定に保持する技術を提供する。 The present invention uses a virus capsid or the like, produces a microcapsule in which an enzyme or protein is embedded, and prepares a composition mixed with a polysaccharide to stably hold the enzyme or protein inside. Provide technology.
酵素は、洗剤、繊維製品の精錬、油脂や澱粉などの分解、食品加工、医薬品、臨床検査、化粧品、さらに有用物質の転換・製造など各種の産業分野に広く用いられている。こうした利用を計る上での問題点は、酵素の安定性が一般的に低く、その要求に対し、満足できない場合が多いことである。これらに対処する方法として酵素の化学修飾が試みられている。例えば、タンパク質分解酵素をポリエチレングリコールで修飾し、熱安定性向上を図る方法(特許文献1)、あるいは、酵素をポリマーシェルに内包し、安定化を計る方法(特許文献2)、などが提案されている。
本発明は、遺伝子組換え技術を用いてウイルス、中でもヒトB型肝炎ウイルスのキャプシドタンパク質もしくはキャプシドタンパク質と目的のタンパク質の融合タンパク質を合成し、適切な条件下得られるマイクロカプセルに酵素またはタンパク質を包埋させ、さらに多糖類と混合した組成物を作製することにより安定に内部の酵素やタンパク質を保持することを可能にする技術を提供することを目的とする。中でも酵素は、安定性が一般的に低く、その要求に対し、満足できない場合が多いことである。即ち、熱を加えられたり、極端に高いpH条件下、界面活性剤や有機溶媒などの混合物の共存下、更に長期保存によって殆どの酵素は、容易に変性して失活する。特に酵素がプロテアーゼの場合、水分率の高い媒体や、水溶液などの剤形中では変性の他に自己消化分解が起こり、室温で保存する間に速やかに失活するため安定な商品を供給することが難しいという問題がある。有用物質の転換、製造などへの応用には、さらに高活性で安定化した酵素の開発が望まれていた。 The present invention uses genetic recombination technology to synthesize viruses, especially human hepatitis B virus capsid protein or a fusion protein of a capsid protein and a target protein, and encapsulates the enzyme or protein in microcapsules obtained under appropriate conditions. An object of the present invention is to provide a technique that makes it possible to stably retain an internal enzyme or protein by embedding and further preparing a composition mixed with a polysaccharide. Among them, enzymes are generally low in stability and often cannot satisfy the requirements. That is, most enzymes are easily denatured and inactivated by long-term storage under the coexistence of a mixture of a surfactant, an organic solvent, or the like under extremely high pH conditions. In particular, when the enzyme is a protease, in the medium with a high water content or in a dosage form such as an aqueous solution, in addition to denaturation, autolytic digestion occurs, and it is quickly deactivated during storage at room temperature. There is a problem that is difficult. For application to the conversion and production of useful substances, it has been desired to develop an enzyme with higher activity and stability.
本発明はウイルスのキャプシドタンパク質などが形成するマイクロカプセルが、その内部に酵素やタンパク質を包埋することにより、安定に内部のタンパク質の活性を保持する。酵素がプロテアーゼの場合、マイクロカプセルにより溶液中でも自己消化分解を防ぎ、室温下での保存においても酵素活性が失活しない。また、多糖類を共存させることにより溶液状態でも安定に保持することができる。 In the present invention, a microcapsule formed by a capsid protein of a virus embeds an enzyme or protein therein, thereby stably retaining the activity of the internal protein. When the enzyme is a protease, the microcapsules prevent self-digestion degradation even in solution, and the enzyme activity is not inactivated even when stored at room temperature. Moreover, it can be stably maintained even in a solution state by allowing the polysaccharide to coexist.
本発明は以下を提供する。 The present invention provides the following.
1.粒子形成能を有するタンパク質からなるマイクロカプセルおよび多糖類を含有するマイクロカプセル組成物。 1. A microcapsule composition comprising a protein having a particle-forming ability and a polysaccharide.
2.マイクロカプセルの内部に酵素またはタンパク質が包埋されている上記1記載のマイクロカプセル組成物。 2. 2. The microcapsule composition according to 1 above, wherein an enzyme or protein is embedded in the microcapsule.
3.粒子形成能を有するタンパク質と酵素またはタンパク質とが融合している上記2記載のマイクロカプセル組成物。 3. 3. The microcapsule composition according to 2 above, wherein a protein having particle forming ability and an enzyme or protein are fused.
4.多糖類がアラビアガム、カラギーナン、トレハロースおよびキトサンから選ばれる少なくとも一種である上記1から3のいずれか一項記載のマイクロカプセル組成物。 4). 4. The microcapsule composition according to any one of 1 to 3 above, wherein the polysaccharide is at least one selected from gum arabic, carrageenan, trehalose and chitosan.
5.粒子形成能を有するタンパク質がウイルスのキャプシドタンパク質若しくはその変異体タンパク質であることを特徴とする上記1から4のいずれか一項記載のマイクロカプセル組成物。 5. 5. The microcapsule composition according to any one of 1 to 4 above, wherein the protein having particle-forming ability is a viral capsid protein or a mutant protein thereof.
6.キャプシドタンパク質がヘパドナウイルス科ウイルスのキャプシドタンパク質であることを特徴とする上記5記載のマイクロカプセル組成物。 6). 6. The microcapsule composition according to 5 above, wherein the capsid protein is a capsid protein of Hepadnaviridae virus.
7.ヘパドナ科ウイルスがB型肝炎ウイルスであることを特徴とする上記6記載のマイクロカプセル組成物。 7). 7. The microcapsule composition according to 6 above, wherein the hepadnavirus is hepatitis B virus.
8.上記2から7のいずれか一項記載のマイクロカプセル組成物に界面活性剤またはアルカリ溶液を添加することによりマイクロカプセル内に包埋されている酵素またはタンパク質を表出化することを特徴とする酵素またはタンパク質の表出化方法。 8). An enzyme characterized by expressing an enzyme or protein embedded in a microcapsule by adding a surfactant or an alkaline solution to the microcapsule composition according to any one of 2 to 7 above Or protein expression method.
本発明は、ウイルスのキャプシドタンパク質などが形成するマイクロカプセルを多糖類と混合した組成物とすることにより安定に保持することが可能である。特に、マイクロカプセル内に酵素またはタンパク質を包埋させる場合、酵素またはタンパク質の活性を安定に保持することが可能になる。さらに、マイクロカプセルを含む組成物に界面活性剤やアルカリ溶液を添加することにより、マイクロカプセル内に包埋された酵素またはタンパク質を表出化することができる。本技術の用途としては、酵素がプロテアーゼの場合、マイクロカプセルにより水溶液などの剤形中でも自己消化分解を防ぎ、室温下での保存においても酵素活性が失活せず安定な商品を供給することが可能になる。 In the present invention, a microcapsule formed by a capsid protein of a virus can be stably maintained by using a composition in which a polysaccharide is mixed with a polysaccharide. In particular, when an enzyme or protein is embedded in a microcapsule, the activity of the enzyme or protein can be stably maintained. Furthermore, the enzyme or protein embedded in the microcapsule can be expressed by adding a surfactant or an alkaline solution to the composition containing the microcapsule. As an application of this technology, when the enzyme is a protease, the microcapsule prevents autolysis and digestion even in a dosage form such as an aqueous solution, and supplies a stable product that does not deactivate the enzyme activity even when stored at room temperature. It becomes possible.
(1.粒子形成能タンパク質)
粒子形成能を有するタンパク質としては、昆虫ウイルスがコードするポリヘドリンと呼ばれるタンパク質やさらには種々のウイルスから得られるサブウイルス粒子を適応することができる。たとえば、微生物に感染するバクテリオファージ、動物ウイルス、植物ウイルス、無脊椎動物ウイルス、藻類ウイルスなど、広い範囲のウイルスを用いることができる。より好ましくは、球状ウイルス由来のキャプシドで、B型肝炎ウイルスのコアタンパク質、アデノウイルス、ポリオウイルスなどの動物ウイルス、φX174、MS2などのファージ、カリフラワーモザイクウイルス、トマトブッシースタントウイルス、イネわい化ウイルスなどの植物ウイルス、ガガンボイリデッセントウイルス、ブラックビートルウイルスなどの無脊椎動物ウイルス、ゾウリムシ共生藻ウイルスなどの藻類ウイルスのキャプシドタンパク質を用いることができる。
(1. Particle-forming protein)
As a protein having particle forming ability, a protein called polyhedrin encoded by an insect virus and further subviral particles obtained from various viruses can be applied. For example, a wide range of viruses such as bacteriophages that infect microorganisms, animal viruses, plant viruses, invertebrate viruses, and algal viruses can be used. More preferably, it is a capsid derived from a spherical virus, such as hepatitis B virus core protein, adenovirus, animal virus such as poliovirus, phage such as φX174, MS2, cauliflower mosaic virus, tomato bushy stunt virus, rice dwarf virus, etc. Capsid proteins of algal viruses such as plant viruses, invertebrate viruses such as goatboyidescent virus and black beetle virus, and Paramecium symbiotic algal virus can be used.
(2.マイクロカプセルについて)
マイクロカプセルは、球体直径がおよそ数ミクロン(1ミクロン=1/1600ミリメートル)から1ミリメートル程度の球体の極めて微小な容器で、様々な手法によって作製される。マイクロカプセルにより、その内部に包埋させる物質を次のように取り扱うことが可能になる。
・ 見かけ上、固体として取り扱うことができる。(形態の改変)。
・ 他の物質との反応や混合を避けることができる(隔離効果)。
・ 保存期間を延ばすことができる(安定化効果)。
・ 不安定要素を安定化できる(保護効果)。
・ 放出を制御できる(放出制御)。
(2. About microcapsules)
A microcapsule is a very small container of a sphere having a sphere diameter of approximately several microns (1 micron = 1/1600 millimeter) to 1 millimeter, and is manufactured by various techniques. The microcapsule makes it possible to handle the substance embedded in the inside as follows.
・ Apparently it can be handled as a solid. (Modification of form).
-Reaction and mixing with other substances can be avoided (sequestration effect).
-The storage period can be extended (stabilization effect).
・ Unstable elements can be stabilized (protective effect).
・ Release can be controlled (release control).
すなわち、中身をマイクロカプセル化することにより、内部に包埋させた物質を保護し、必要なときまで他の物質と反応しないように、あるいは混合しないように隔離させたり、あるいは、外部に放出する速度をコントロールすることが可能になる。 That is, by encapsulating the contents, the substance embedded inside is protected, and it is isolated so that it does not react with other substances or mix until necessary, or released to the outside. It becomes possible to control the speed.
(3.マイクロカプセルの選択)
本発明で用いられるマイクロカプセルはキャプシドタンパク質で構成されているものが好ましく、その由来は任意のウイルス由来であってよい。「キャプシド」とは、ウイルスの核酸を包み、その外部形態を形作っている殻構造物をあらわす。また、ウイルスの核酸もしくはその変異体が殻構造物形成に必要な場合には、その核酸も含めて「キャプシド」と呼ぶ。B型肝炎ウイルスなどのように多重に殻構造物で覆われている場合、いずれの殻構造物もキャプシドである。また「キャプシドタンパク質」とは、キャプシドを構成要素であるタンパク質をあらわす。しかし、マイクロカプセルはキャプシドタンパク質に限定されるものではない。フィコシアニン等の円筒状の会合体であってもよいし、人工的に設計された内部に目的分子を導入出来る空間を有したマイクロカプセルであってもよい。
(3. Selection of microcapsules)
The microcapsule used in the present invention is preferably composed of a capsid protein, and its origin may be derived from any virus. “Capsid” refers to a shell structure that encloses the nucleic acid of a virus and forms its external form. In addition, when a nucleic acid of a virus or a variant thereof is necessary for the formation of a shell structure, the nucleic acid is also referred to as “capsid”. When multiple shell structures are covered, such as hepatitis B virus, all shell structures are capsids. “Capsid protein” refers to a protein that is a constituent of capsid. However, microcapsules are not limited to capsid proteins. It may be a cylindrical aggregate such as phycocyanin, or may be a microcapsule having a space in which a target molecule can be introduced inside an artificially designed interior.
キャプシドやフィコシアニンは、内部に何も含まれない状態でも安定で強固な構造を取っていることが知られており、本発明のマイクロカプセル作製には好都合である。 Capsids and phycocyanins are known to have a stable and strong structure even in a state where nothing is contained therein, which is advantageous for producing the microcapsules of the present invention.
多くのキャプシドタンパク質は、そのアミノ酸およびそれをコードする核酸配列が既知で、かつ遺伝子工学的手法で作成可能である上、内部に分子を内包しうるため、本発明には好都合である。特に、B型肝炎ウイルスが属するヘパドナウイルス科ウイルスのキャプシドタンパク質は、大腸菌等を用いた遺伝子工学的手法で容易に作成、精製可能であり、内部に何も含まれない状態でも安定で強固な構造を取っているため、本発明のマイクロカプセルの作成には好都合である。 Many capsid proteins are advantageous for the present invention because their amino acids and the nucleic acid sequences that encode them are known and can be prepared by genetic engineering techniques, and can contain molecules inside. In particular, the capsid protein of the hepadnaviridae virus to which hepatitis B virus belongs can be easily prepared and purified by genetic engineering techniques using Escherichia coli and the like, and is stable and strong even in a state where nothing is contained inside. Because of its structure, it is convenient for making the microcapsules of the present invention.
包埋させる酵素やタンパク質の大きさ、形状に応じて適切なウイルスキャプシドを選択することができる。マイクロカプセルの大きさはマイクロカプセルの結晶のX線結晶構造解析結果の原子座標により測定することができる。内包させた酵素・タンパク質分子全体の大きさ、形状は、電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、X線小角散乱等を用いて測定することができる。たとえば、マイクロカプセルであるB型肝炎ウイルスのコアタンパク質(HBcAg)の内径、すなわち内側の半径はX線結晶構造解析の結果、約11.2nm、内側の表面積は約1576nm2であることが知られている(サマンサ・エー・ワイニー(Samantha A. Wynne et al.:)モレキュラー・セル(Molecular Cell)、ザ・クリスタル・ストラクチャー・オブ・ザ・ヒューマン・ヘパタイテス・ビー・ビロス・キャプシド(The crystal structure of the human hepatitis B virus capsid.)、米国、1999年、第3巻、p.771-780、図1)。このマイクロカプセルは240個のキャプシドタンパク質で形成されているので、1分子あたりのマイクロカプセル内側の表面積は約6.6nm2である。従って、断面積が6.6nm2より小さい分子は、ウイルスキャプシドタンパク質に結合させて、包埋可能であると判断できる。また、分子の長さはマイクロカプセルの内径11.2nm以下である必要がある。すなわち、マイクロカプセルに対しては断面積6.6nm2以下、長さ11.2nm以下の分子を結合させることが好ましい。マイクロカプセル内部に分子が内包可能かどうかは、適切なコンピュータプログラムを用いてマイクロカプセルの原子座標を観察することにより判断することができる。より大きなタンパク質などを内包させる場合には、バクテリオファージφX174やライノウイルス等の表面積が大きなマイクロカプセルを用いることができる。非常に小さなタンパク質を解析する場合には、フィコシアニン等の円柱状のマイクロカプセルも用いることができる。 An appropriate virus capsid can be selected according to the size and shape of the enzyme or protein to be embedded. The size of the microcapsule can be measured by the atomic coordinates of the X-ray crystal structure analysis result of the microcapsule crystal. The size and shape of the entire encapsulated enzyme / protein molecule can be measured using an electron microscope, an atomic force microscope, X-ray small angle scattering, or the like. For example, it is known that the inner diameter of the core protein (HBcAg) of the hepatitis B virus, which is a microcapsule, that is, the inner radius is about 11.2 nm and the inner surface area is about 1576 nm 2 as a result of X-ray crystal structure analysis. (Samantha A. Wynne et al. :) Molecular Cell, The Crystal Structure of the Human Hepatitetes B. Viros Capsid human hepatitis B virus capsid.), USA, 1999, Vol. 3, p. 771-780, Fig. 1). Since this microcapsule is formed of 240 capsid proteins, the surface area inside the microcapsule per molecule is about 6.6 nm 2 . Therefore, it can be determined that molecules having a cross-sectional area smaller than 6.6 nm 2 can be embedded by binding to the viral capsid protein. Further, the length of the molecule needs to be 11.2 nm or less of the inner diameter of the microcapsule. That is, it is preferable to bind molecules having a cross-sectional area of 6.6 nm 2 or less and a length of 11.2 nm or less to the microcapsules. Whether or not molecules can be encapsulated inside the microcapsule can be determined by observing the atomic coordinates of the microcapsule using an appropriate computer program. When encapsulating a larger protein or the like, a microcapsule having a large surface area such as bacteriophage φX174 or rhinovirus can be used. When analyzing very small proteins, cylindrical microcapsules such as phycocyanin can also be used.
ヘパドナウイルス科のウイルスの外殻は、脂質膜を含む外側のエンベロープと内側のコアの2重のキャプシドで構成されている。特に、内側のコアキャプシドは、安定なマイクロカプセルを形成することが知られているため、本発明で用いるマイクロカプセルとして好都合である。中でも、B型肝炎ウイルスのコアタンパク質(HBcAg)およびその変異体タンパク質は、強制的にマイクロカプセルを形成させる条件が既知であり、その原子座標がPDBに登録され公開されているため、本発明で用いるマイクロカプセルとして用いるのに特に好都合である。例えば配列番号1に記載したDNAによりコードされるものが好ましい。なお、変異体タンパク質とは、タンパク質を構成しているアミノ酸の一部の配列を他のアミノ酸に置換したり、一部の配列を挿入、もしくは欠損させたものであって、B型肝炎ウイルスのコアタンパク質としての機能を保持したタンパク質をあらわす。同様に、核酸を構成している核酸塩基の一部の配列を他の核酸塩基に置換したり、一部の配列を挿入、もしくは欠損させた、核酸を「変異体(核酸)」と呼ぶ。 The outer shell of the Hepadnaviridae virus is composed of a double capsid with an outer envelope containing a lipid membrane and an inner core. In particular, the inner core capsid is known to form stable microcapsules and is therefore advantageous as a microcapsule for use in the present invention. Among them, the core protein of hepatitis B virus (HBcAg) and its mutant protein have known conditions for forcibly forming microcapsules, and their atomic coordinates are registered and published in PDB. It is particularly convenient to use as a microcapsule to be used. For example, those encoded by the DNA described in SEQ ID NO: 1 are preferred. A mutant protein is a protein in which part of the amino acid constituting the protein is substituted with another amino acid, or part of the sequence is inserted or deleted, Represents a protein that retains its function as a core protein. Similarly, a nucleic acid in which a partial sequence of nucleobases constituting a nucleic acid is replaced with another nucleobase, or a partial sequence is inserted or deleted is referred to as a “mutant (nucleic acid)”.
(4.マイクロカプセルへの酵素またはタンパク質の包埋化)
本発明で用いられる「マイクロカプセルの内部」とは、マイクロカプセル内においてマイクロカプセルを構成するタンパク質間の相互作用に影響を与えない空間を意味する。また、マイクロカプセル内部にタンパク質が配置されている状態を「マイクロカプセルに包埋」されているという。たとえば、会合体としてフィコシアニン等の円筒状のマイクロカプセルを用いる場合には、結合させる分子は完全にマイクロカプセルに覆われている必要はなく、マイクロカプセル内においてウイルスキャプシドタンパク質間の相互作用に影響を与えない円筒の内側に存在すれば、結合させた分子は「マイクロカプセルの内部」にあり、「マイクロカプセルに包埋」されている状態である。また、本発明で用いられる「酵素またはタンパク質」とは、ウイルスキャプシドタンパク質内部に包埋されるものを表す。マイクロカプセル内部に酵素またはタンパク質を包埋させる方法としては、キャプシドタンパク質のみから形成されるマイクロカプセルを低塩もしくはアルカリ条件下分解し、高濃度の酵素やタンパク質の溶液内に入れ、再び高塩条件下、低酸性条件下キャプシドタンパク質を再構成することにより、酵素やタンパク質を包埋化させたマイクロカプセルを得ることができる。ザ・エンボ・ジャーナル(the EMBO Journal vol21 No5 pp876-884 2002)のザ・モルフォジェニック・リンカーペプチド オブ エッチビーブイキャプシド プロテイン フォーム ア モビリティー アレイ オン ザ インテリアー サーフェイス(The morphogenic linker peptide of HBV capsid protein forms a mobile array on the interior surface)では、大腸菌で発現させたキャプシドタンパク質をアルカリ条件下精製し、60mMMgCl2存在下、酸性条件下(pH5)21℃1時間処理することにより再度マイクロカプセルに再構成している。しかし、本報では実際にマイクロカプセル内部に酵素又はタンパク質を包理化させるには至っていない。
(4. Embedding enzymes or proteins in microcapsules)
The “inside of the microcapsule” used in the present invention means a space that does not affect the interaction between proteins constituting the microcapsule in the microcapsule. In addition, the state in which the protein is arranged inside the microcapsule is said to be “embedded in the microcapsule”. For example, when a cylindrical microcapsule such as phycocyanin is used as the aggregate, the molecule to be bound does not need to be completely covered with the microcapsule, and the interaction between the viral capsid proteins is affected in the microcapsule. If it exists inside the cylinder that is not given, the bound molecule is “inside the microcapsule” and is “embedded in the microcapsule”. In addition, the “enzyme or protein” used in the present invention represents one embedded in the viral capsid protein. As a method of embedding an enzyme or protein inside the microcapsule, the microcapsule formed only from the capsid protein is decomposed under a low salt or alkaline condition, placed in a solution of a high concentration enzyme or protein, and then again in a high salt condition. Then, by reconstituting the capsid protein under low acid conditions, a microcapsule in which an enzyme or protein is embedded can be obtained. The morphogenic linker peptide of HBV capsid protein forms a mobile from the EMBO Journal vol21 No5 pp876-884 2002 In the array on the interior surface, the capsid protein expressed in E. coli is purified under alkaline conditions, and reconstituted into microcapsules by treatment in acidic conditions (pH 5) at 21 ° C. for 1 hour in the presence of 60 mM MgCl 2. However, in this report, no enzyme or protein is actually embedded in the microcapsule.
(5.融合タンパク質を利用したマイクロカプセルへの酵素やタンパク質の包埋化)
マイクロカプセルのキャプシドタンパク質と目的タンパク質との結合は、キャプシドタンパク質、目的タンパク質、それぞれを構成するタンパク質を融合させた融合タンパク質を慣用の遺伝子操作によって作成することで達成できる。本発明で用いられる「融合」とは、両タンパク質間をペプチド結合で結合させることを意味する。通常、タンパク質をコードしたDNAの前後または途中にタンパク質もしくはペプチドをコードするDNAを挿入し、そのDNAを用いて融合タンパク質を作製するが、他の方法、たとえば、化学合成によっても融合タンパク質は得られる。目的タンパク質をキャプシドタンパク質に融合させる部位は、マイクロカプセルの内側に露出しているアミノ酸の直前または直後であることが好ましい。
(5. Embedding enzymes and proteins in microcapsules using fusion proteins)
The binding between the capsid protein of the microcapsule and the target protein can be achieved by preparing a fusion protein obtained by fusing the capsid protein, the target protein, and the protein constituting each of the capsid protein by conventional genetic manipulation. The term “fusion” used in the present invention means that both proteins are bound by a peptide bond. Usually, DNA that encodes a protein or peptide is inserted before or after or in the middle of DNA encoding the protein, and the fusion protein is prepared using the DNA. However, the fusion protein can also be obtained by other methods, for example, chemical synthesis. . The site where the target protein is fused to the capsid protein is preferably immediately before or after the amino acid exposed inside the microcapsule.
融合による結合においては、遺伝子さえあれば容易に慣用の遺伝子操作によって解析目的分子を結合でき、遺伝子を組み込んだ発現ベクターは容易に増幅可能であり、何度でも再現性よく目的タンパク質が同一部位に融合したタンパク質を作成できる。そのため、結合部位を制御する必要が無く、後述の共有結合を形成させた結合に比べて、融合による結合は互いに同一の分子種及び同一の分子数かつ同じ立体構造を有したマイクロカプセルを作成するための有効な手段の一つである。 In fusion binding, as long as there is a gene, the target molecule for analysis can be easily linked by conventional genetic manipulation, and the expression vector incorporating the gene can be easily amplified. Create fused proteins. Therefore, there is no need to control the binding site, and the fusion bond creates microcapsules having the same molecular species, the same number of molecules, and the same three-dimensional structure as compared with the bond that forms the covalent bond described later. It is one of the effective means for this.
(6.融合タンパク質の配列設計)
キャプシドタンパク質と酵素やタンパク質を融合させた融合タンパク質を生産させるためのDNAの設計は慣用の遺伝子操作により以下の様に行うことができる。たとえば、公知の遺伝子操作技術を用いて、HBcAg遺伝子と部分的に相補的なDNAを合成することにより、HBcAgの遺伝子の任意の部分に特定の制限酵素で切断される部分(制限酵素部位)を導入または消失させることおよび導入した制限酵素部位前後に任意のタンパク質をコードするDNAを導入することができる。
(6. Sequence design of fusion protein)
Design of DNA for producing a fusion protein in which a capsid protein is fused with an enzyme or a protein can be performed by conventional genetic manipulation as follows. For example, by synthesizing a DNA that is partially complementary to the HBcAg gene using a known genetic engineering technique, a portion (restriction enzyme site) that can be cleaved with a specific restriction enzyme at any part of the HBcAg gene The DNA encoding any protein can be introduced before or after the introduced restriction enzyme site or the introduced restriction enzyme site.
(7.キャプシドタンパク質の配列情報および遺伝子の入手)
キャプシドタンパク質の遺伝子、すなわちアミノ酸配列をコードするDNAは、ウイルスに感染した患者、動物、細胞、微生物からPCR法により単離することができる。例えば、B型肝炎ウイルスのコアタンパク質(HBcAg)の場合、慢性活動性B型肝炎感染患者の血清から抽出したcDNAライブラリーから、例えば文献(アントニー・トウズ他(Antoine Touze, et al.)、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー(Journal of Clinical Microbiology)、バキュロビロス・エクスプレッション・オブ・キメリック・ヘパタイテス・ビー・ビロス・コア・パーティクルズ・ウイズ・ヘパタイテス・イー・ビロス・エピトープス・アンド・ゼア・ユース・イン・ア・ヘパタイテス・イー・イミュノアッセイ(Baculovirus Expression of Chimeric Hepatitis B Virus Core Particles with Hepatitis E Virus Epitopes and Their Use in a Hepatitis E Immunoassay)、米国、1999年、第37巻、p.438-441)記載のプライマーを用いて、PCR法により単離することができる。B型肝炎ウイルス以外のウイルスのキャプシドタンパク質遺伝子も同様の方法で単離することができる。単離に必要なプライマーは各ウイルスの遺伝子の配列情報を使って設計することができる。ウイルスのDNAおよびアミノ酸配列情報は例えばNCBIのゲノムデータベースに登録されており、インターネット上で公開されている。ウイルスキャプシド以外の遺伝子も同様の方法で入手可能である。例えば、実施例Xのフィコシアニン遺伝子はシアノバクテリアから抽出したcDNAライブラリーを用いてPCR法により単離できる。
(7. Obtaining capsid protein sequence information and genes)
The capsid protein gene, that is, the DNA encoding the amino acid sequence, can be isolated from a virus-infected patient, animal, cell, or microorganism by PCR. For example, in the case of the hepatitis B virus core protein (HBcAg), from a cDNA library extracted from the serum of chronic active hepatitis B infected patients, for example, literature (Antoine Touze et al., Journal)・ Journal of Clinical Microbiology, Baculobilos Expression of Chimeric Hepatitetes B Biros Core Particles with Hepatitetes E Biroth Epitopes and There Youth・ Baculovirus Expression of Chimeric Hepatitis B Virus Core Particles with Hepatitis E Virus Epitopes and Their Use in a Hepatitis E Immunoassay, USA, 1999, Vol. 37, p.438- 441) can be used for isolation by PCR. Capsid protein genes of viruses other than hepatitis B virus can be isolated in the same manner. Primers necessary for isolation can be designed using the sequence information of each virus gene. Viral DNA and amino acid sequence information is registered in the NCBI genome database, for example, and published on the Internet. Genes other than the viral capsid can be obtained in the same manner. For example, the phycocyanin gene of Example X can be isolated by PCR using a cDNA library extracted from cyanobacteria.
また、PCR法で単離できない場合、および人工的に設計した場合は、マイクロカプセルを形成するタンパク質のDNAもしくはアミノ酸配列情報に従って部分的に化学合成したDNAをDNAポリメラーゼ等を用いてつなぎ合わせることでその遺伝子を作成することができる。また、バクテリオファージの遺伝子はたとえば独立行政法人製品評価技術基盤機構・生物遺伝資源センター(NBRC)から有償で入手することができる。 In addition, if it cannot be isolated by PCR, or if it is artificially designed, DNA that has been partially chemically synthesized according to the DNA or amino acid sequence information of the protein that forms the microcapsule can be joined using DNA polymerase, etc. The gene can be created. The bacteriophage gene can be obtained, for example, from the National Institute of Technology and Evaluation / National Biological Resource Center (NBRC) for a fee.
(8.目的タンパク質の入手)
目的タンパク質は、どのような手段で入手してもかまわない。通常次のいずれの方法を用いることで入手できる。化学合成、動植物や微生物などの目的タンパク質を含む物質からの単離・抽出、目的タンパク質であるタンパク質をコードする遺伝子を用いたタンパク発現である。目的タンパク質をキャプシドタンパク質と融合させて生産する場合も同様である。目的タンパク質の遺伝子もまたキャプシド遺伝子と同様の方法で入手可能である。
(8. Obtaining the target protein)
The target protein may be obtained by any means. It can usually be obtained by using any of the following methods. These include chemical synthesis, isolation / extraction from substances containing the target protein, such as animals, plants and microorganisms, and protein expression using a gene encoding the protein that is the target protein. The same applies when producing the target protein by fusing it with the capsid protein. The gene of the target protein can also be obtained in the same manner as the capsid gene.
(9.発現用ベクターの作成)
遺伝子、すなわちPCR産物もしくは化学合成DNAは精製後、適切な制限酵素を用いて、切り出し、発現用ベクターに組み込むことができる。PCR法の場合は、用いたプライマーに、化学合成の場合は合成するDNA配列に予め特定の制限酵素で切断される配列(制限酵素サイト)を組み込んでおけば、発現用ベクターの作成はより容易になる。発現用ベクターは発現用ベクターを組み込ませる予定の宿主の種類に応じて、宿主に適した発現用ベクターを用いることが好ましい。
(9. Preparation of expression vector)
A gene, that is, a PCR product or chemically synthesized DNA can be cut out and purified using an appropriate restriction enzyme and incorporated into an expression vector. In the case of PCR method, the expression vector can be created more easily by incorporating the sequence (restriction enzyme site) that can be cleaved with a specific restriction enzyme into the primer used in the case of chemical synthesis. become. As the expression vector, an expression vector suitable for the host is preferably used depending on the type of host into which the expression vector is to be incorporated.
(10.マイクロカプセルの作成)
マイクロカプセルは、慣用のタンパク質生産のための遺伝子組換え体を用い、作成することができる。例えば、キャプシドタンパク質の遺伝子を組み込んだ発現ベクターを大腸菌などの微生物、酵母、植物体あるいは植物細胞、動物細胞あるいはトランスジェニック動物、昆虫細胞あるいは昆虫などの宿主に感染またはリポソームなどとともに取り込ませて、形質転換して、タンパク質発現することが可能である。また、宿主を用いることなく、無細胞タンパク質発現系を用いて作成することもできる。無細胞タンパク質発現キットは、例えばロッシュリサーチ社から販売されており、タンパク質を簡便かつ短時間で作成することができ、有用な手段の一つである。
(10. Preparation of microcapsules)
A microcapsule can be prepared using a gene recombinant for conventional protein production. For example, an expression vector into which a capsid protein gene has been incorporated is incorporated into a host such as a microorganism such as Escherichia coli, yeast, a plant body or plant cell, an animal cell or transgenic animal, an insect cell or an insect together with a liposome, etc. It is possible to convert and protein expression. Moreover, it can also create using a cell-free protein expression system, without using a host. A cell-free protein expression kit is commercially available from, for example, Roche Research, and is a useful means that can produce a protein simply and in a short time.
マイクロカプセルの構成には、ウイルスのキャプシドである場合には、ウイルスのキャプシドの種類によって形成する特定の条件を用いて、マイクロカプセルを形成させることができる。例えば、キャプシドタンパク質(HBcAg)を大腸菌菌体内に大量かつ高濃度に発現させることによって、マイクロカプセルを形成させる。また、マイクロカプセルがバクテリオファージMS2のキャプシドである場合には、19塩基からなる特定の配列を含んだRNAと結合し、そのRNAとの結合により、強制的に形成させることができる。 When the microcapsule is a virus capsid, the microcapsule can be formed using specific conditions depending on the type of virus capsid. For example, microcapsules are formed by expressing a large amount of capsid protein (HBcAg) in Escherichia coli cells at a high concentration. In addition, when the microcapsule is a capsid of bacteriophage MS2, it can be forcibly formed by binding to RNA containing a specific sequence consisting of 19 bases and binding to that RNA.
一方で、キャプシドタンパク質がマイクロカプセルを構成していない場合でも、適当な条件下酵素やタンパク質を包埋するマイクロカプセルを作成しうる。例えば、高濃度の酵素やタンパク質溶液にキャプシドタンパク質を入れ、透析操作などにより、低酸性条件下、または高塩濃度の溶液に置換することによってキャプシドタンパク質の再構成がおき、酵素やタンパク質を包埋したマイクロカプセルを作製しうる。 On the other hand, even when the capsid protein does not constitute a microcapsule, a microcapsule that embeds an enzyme or protein under appropriate conditions can be prepared. For example, the capsid protein is reconstituted by placing the capsid protein in a high-concentration enzyme or protein solution and substituting it with a solution with a low salt condition or high salt concentration by dialysis, etc., thereby embedding the enzyme or protein. Microcapsules can be made.
(11.精製)
マイクロカプセルはキャプシドタンパク質に比べ、大きくかつ高分子量である。この大きさおよび分子量の違いを利用して、例えば公知の精製法であるゲルクロマトグラフィー等の分子ふるいや遠心操作でマイクロカプセルを形成しないものや不純物を取り除けば、マイクロカプセルは容易に精製することができる。例えば、B型肝炎ウイルスのキャプシドタンパク質の場合、蔗糖密度勾配法を用いた遠心操作で容易に精製することができる。
(11. Purification)
Microcapsules are larger and higher in molecular weight than capsid proteins. Utilizing this difference in size and molecular weight, the microcapsules can be easily purified by removing molecular sieves such as gel chromatography, which is a known purification method, and those that do not form microcapsules by centrifugation and impurities. Can do. For example, the capsid protein of hepatitis B virus can be easily purified by centrifugation using a sucrose density gradient method.
(12.多糖類)
2つの単糖類がグリコシド結合することによって二糖類が生じ、このグリコシド結合が連続することで生じる高分子化合物を多糖類である。分子式は(C6H10O5)nで表される。代表的な多糖類として、でんぷんやセルロースがあげられる。本発明で使用する多糖類は、好ましくはアラビアガム、カラギーナン、キトサン、トレハロースである。多糖類は、食品や医薬品と混合することにより安定化効果をもたらし、また化合物やタンパク質の保護効果がある。
(12. Polysaccharides)
A disaccharide is produced by the glycosidic bond between two monosaccharides, and the polymer compound produced by the continuous glycosidic bond is a polysaccharide. The molecular formula is represented by (C 6 H 10 O 5 ) n. Typical polysaccharides include starch and cellulose. The polysaccharide used in the present invention is preferably gum arabic, carrageenan, chitosan or trehalose. Polysaccharides provide a stabilizing effect when mixed with foods and pharmaceuticals, and also have a protective effect on compounds and proteins.
中でもトレハロースは、2分子のグルコースが結合した非還元性の二糖である。トレハロースは自然界では動植物、微生物にわたって広く遊離の状態で存在している。パン酵母やビール酵母などの酵母類にも多く含まれ、古くから人々に食されてきた糖質として知られている。近年、保湿効果の高い糖として注目されており、乾燥している環境下から細胞を保護する働きがあることがわかった。また、アラビアガムは医薬品と混合し、その安定化・保護効果を目的に配合されている。 Among them, trehalose is a non-reducing disaccharide in which two molecules of glucose are bound. In nature, trehalose exists widely in a free state across animals and plants and microorganisms. It is also abundant in yeasts such as baker's yeast and beer yeast, and is known as a carbohydrate that has been eaten by people since ancient times. In recent years, it has attracted attention as a sugar having a high moisturizing effect, and has been found to have a function of protecting cells from a dry environment. Gum arabic is mixed with pharmaceuticals and blended for the purpose of stabilizing and protecting the gum.
(13.マイクロカプセルと多糖類との混合溶液)
マイクロカプセルは、内包する酵素やタンパク質の性質にもよるが、酸性溶液(pH5)または塩を含む溶液(Mg)で調製することにより安定性が向上する。さらに、多糖類を混合した溶液ではさらに内部の酵素やタンパク質の活性を安定に保持することが可能になる。例えば、アラビアガム、カラギーナン、トレハロースまたはキトサンなどの多糖類とマイクロカプセルを含む溶液(1〜10%溶液)、マイクロカプセル(0.01〜10mg/mL)を混合することで内部の酵素やタンパク質を安定に保持することが可能になる。また、マイクロカプセルと多糖類の溶液を、室温(17〜37℃)条件下で自然乾燥させた時、包埋させたタンパク質も安定に保持される。
(13. Mixed solution of microcapsules and polysaccharides)
Depending on the nature of the encapsulated enzyme or protein, microcapsules can be improved in stability by being prepared with an acidic solution (pH 5) or a solution (Mg) containing a salt. Furthermore, the solution in which the polysaccharide is mixed can further stably maintain the activity of the internal enzyme and protein. For example, by mixing polysaccharides such as gum arabic, carrageenan, trehalose or chitosan with a solution containing microcapsules (1-10% solution) or microcapsules (0.01-10 mg / mL), the internal enzymes and proteins can be stabilized. It becomes possible to hold. In addition, when the microcapsule and polysaccharide solution is naturally dried at room temperature (17 to 37 ° C.), the embedded protein is stably retained.
(14.マイクロカプセルのバイオチップへの応用)
本発明のマイクロカプセルを含む溶液と多糖類を共存させることにより乾燥状態下でも適応可能チップを作製することが可能になる。中でもチップを用いることにより、分子間相互作用を検出する、プロテインチップやバイオセンサーに応用できる。
(14. Application of microcapsules to biochips)
By allowing the solution containing the microcapsules of the present invention and the polysaccharide to coexist, it is possible to produce an adaptable chip even in a dry state. Above all, by using a chip, it can be applied to protein chips and biosensors that detect intermolecular interactions.
すなわちウイルスのキャプシドタンパク質が形成するマイクロカプセルの相互作用に影響を与えない空間に酵素やタンパク質を人工的に配置し、ガラス基板などの固相に安定に酵素やタンパク質を固定化することが可能になる。 In other words, enzymes and proteins can be artificially placed in a space that does not affect the interaction of the microcapsules formed by the virus capsid protein, and the enzymes and proteins can be stably immobilized on a solid phase such as a glass substrate. Become.
また、マイクロカプセルを含む溶液に界面活性剤やアルカリ溶液を添加することにより、包埋させたタンパク質を表出化することが可能になる。すなわち、界面活性剤としては、イオン性界面活性剤に代表されるSDSなどであり、アルカリ溶液としては、好ましくは包埋しているタンパク質の高次構造を壊さないTris緩衝液(pH9-11)が挙げられる。 Further, by adding a surfactant or an alkaline solution to a solution containing microcapsules, it becomes possible to express the embedded protein. That is, the surfactant is SDS represented by an ionic surfactant, and the alkaline solution is preferably a Tris buffer (pH9-11) that does not break the higher-order structure of the embedded protein. Is mentioned.
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、何らこれに限定されるものではない。本発明の範囲は、実施例に示す特定の実施形態よりも、発明の詳細な説明の項目中で記述した内容により、請求の範囲が定義されるべきものである。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to this at all. The scope of the present invention should be defined by the contents described in the detailed description of the invention rather than the specific embodiments shown in the Examples.
参考例1 キャプシドタンパク質(HBcAg)とGFPの融合タンパク質の作製
1. 遺伝子の調製
HBcAgの遺伝子及びクラゲ由来緑色蛍光タンパク質GFP遺伝子及び発現ベクターを材料として、制限酵素及びDNAポリメラーゼを用いて、発現ベクターのマルチクローニングサイトの5‘側にHBcAgの1〜149番アミノ酸をコードする遺伝子(配列番号1)を、さらにその下流にGFPを導入した。GFP遺伝子(配列番号2)はClontech社製の遺伝子を用いた。HBcAg遺伝子は、慢性活動性B型肝炎患者の血清より作成したcDNAライブラリーを用いて、クローニングした遺伝子を用いた。発現ベクターはNovagen社製pET20b+を使用した。
Reference Example 1 Preparation of capsid protein (HBcAg) and GFP fusion protein Gene preparation
Using HBcAg gene and jellyfish-derived green fluorescent protein GFP gene and expression vector as materials, restriction enzyme and DNA polymerase are used to encode a gene encoding amino acids 1-149 of HBcAg on the 5 ′ side of the multiple cloning site of the expression vector ( SEQ ID NO: 1) was further introduced downstream of GFP. As the GFP gene (SEQ ID NO: 2), a gene manufactured by Clontech was used. As the HBcAg gene, a cloned gene was used using a cDNA library prepared from the serum of a chronic active hepatitis B patient. As an expression vector, pET20b + manufactured by Novagen was used.
2. マイクロカプセルの調製
1.で得られた遺伝子を用いて、次のように発現誘導、溶菌、遠心、硫安沈殿、透析、蔗糖密度勾配法およびゲル濾過クロマトグラフィーによる精製を行い高純度に精製したマイクロカプセルを得た。
2. Preparation of microcapsules Using the gene obtained in the above, microcapsules purified with high purity were obtained by expression induction, lysis, centrifugation, ammonium sulfate precipitation, dialysis, sucrose density gradient method and gel filtration chromatography as follows.
すなわち、HBcAgのみの発現用ベクターおよびGFP融合タンパク質を発現する発現ベクターを大腸菌BL21に組み込み、16時間培養後、IPTG(ispporpyl-β-D-thiogalactopyranoside)を使って発現誘導した。さらに3時間培養後、15分間8,000rpmで遠心操作し集菌した。このように菌体内に高濃度の融合タンパク質を発現させることによって、融合タンパク質はマイクロカプセルを形成した。形成されたマイクロカプセルを単離精製するため、さらに以下の操作を行った。PBSバッファーにて菌を懸濁し、超音波にて10秒間3回破砕した。さらに、20分間10,000rpmで遠心操作をして、細胞片を取り除いた。遠心操作後の上澄みに硫安((NH4)2SO4)を濃度20%になるように加え、マイクロカプセルを沈殿させた。ペレット(沈殿物)をPBSバッファーに再溶解させ、蔗糖密度勾配法(60%〜5%)により、分取した。このとき、分取すべきマイクロカプセルを含んだ画分は、SDS-PAGEを使って確認した。その結果、蔗糖濃度が30〜50%濃度中に回収されることが判明した。さらに、ゲル濾過クロマトグラフィー(ハイロードスーパーデックス300 HR26/60 、ファルマシア社)により精製し、5mM Tris-HCl, 150mM NaCl溶液を用いて透析した結果、高純度に精製されたマイクロカプセル溶液を得た。 That is, an expression vector containing only HBcAg and an expression vector expressing a GFP fusion protein were incorporated into E. coli BL21, cultured for 16 hours, and induced for expression using IPTG (ispporpyl-β-D-thiogalactopyranoside). After further culturing for 3 hours, the cells were collected by centrifugation at 8,000 rpm for 15 minutes. Thus, by expressing a high concentration of the fusion protein in the microbial cells, the fusion protein formed microcapsules. In order to isolate and purify the formed microcapsules, the following operation was further performed. Bacteria were suspended in PBS buffer and disrupted 3 times for 10 seconds with ultrasound. Further, centrifugation was performed at 10,000 rpm for 20 minutes to remove cell debris. Ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 SO 4 ) was added to the supernatant after centrifugation to a concentration of 20% to precipitate microcapsules. The pellet (precipitate) was redissolved in PBS buffer and fractionated by the sucrose density gradient method (60% to 5%). At this time, the fraction containing the microcapsules to be collected was confirmed using SDS-PAGE. As a result, it was found that the sucrose concentration was recovered in a concentration of 30 to 50%. Furthermore, it was purified by gel filtration chromatography (High Road Superdex 300 HR26 / 60, Pharmacia) and dialyzed using 5 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl solution, and a highly purified microcapsule solution was obtained. .
実施例1〜4、比較例1〜6(タンパク質安定化評価)
GFPを包埋したマイクロカプセル溶液(1mg/ml)10μLに水、天然多糖類である5%アラビアガム(和光純薬社製)、10%ゼラチン(シグマ社製)、キトサン(和光純薬社製)または1%カラギーナン(和光純薬社製)10μLと混合し、マイクロカプセル溶液を得た。ガラス基板上に塗布し、自然乾燥させた。同様にフリーのGFP(マイクロカプセルなし)(ロシュ社製)(1mg/ml)10μLに水、天然多糖類である5%アラビアガム(和光純薬社製)、10%ゼラチン(シグマ社製)、キトサン(和光純薬社製)または1%カラギーナン(和光純薬社製)10μLと混合し、ガラス基板上に塗布し、自然乾燥させた。室温状態下で20日間保存し、そのガラス基板を254nmの紫外線照射を行うことによりGFPの活性である緑色蛍光を比較した。その結果を表1に示す。
Examples 1-4, Comparative Examples 1-6 (protein stabilization evaluation)
GFP-embedded microcapsule solution (1 mg / ml) in 10 μL water, natural polysaccharide 5% gum arabic (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 10% gelatin (manufactured by Sigma), chitosan (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Or 10% of 1% carrageenan (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to obtain a microcapsule solution. It apply | coated on the glass substrate and air-dried. Similarly, free GFP (without microcapsules) (Roche) (1 mg / ml) in 10 μL of water, natural polysaccharide 5% gum arabic (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 10% gelatin (manufactured by Sigma), The mixture was mixed with 10 μL of chitosan (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or 1% carrageenan (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), coated on a glass substrate, and air dried. The glass substrate was stored at room temperature for 20 days, and the glass substrate was irradiated with UV light at 254 nm to compare the green fluorescence that is the activity of GFP. The results are shown in Table 1.
有意にマイクカプセルに包埋されたGFPにおいて、天然多糖類であるアラビアガムまたはカラギーナンと混合した場合で活性を保持していた。すなわち、GFP単独よりもマイクロカプセルに包埋し、さらに保存剤を添加することにより有意にタンパク質を安定にガラス基板に固定することが可能ではないかと考えられる。 Significantly, GFP embedded in microphone capsules retained activity when mixed with gum arabic or carrageenan, which are natural polysaccharides. That is, it is considered that it is possible to immobilize proteins on a glass substrate significantly stably by embedding them in microcapsules rather than GFP alone and adding a preservative.
実施例5〜8、比較例7〜11(タンパク質の表出化)
参考例1の2で得られたマイクロカプセルを含む溶液について以下のような処理を実施した。
Examples 5-8, comparative examples 7-11 (expression of protein)
The following treatment was performed on the solution containing the microcapsules obtained in 2 of Reference Example 1.
比較例7:未処理(ア)。 Comparative Example 7: Untreated (A).
比較例8:抗GFP抗体(ロシュ社製)を固定化したビーズ(アマシャム社製)に添加し(免疫沈降)、その上清を回収(イ)。 Comparative Example 8: Anti-GFP antibody (manufactured by Roche) was added to the immobilized beads (manufactured by Amersham) (immunoprecipitation), and the supernatant was recovered (I).
実施例5:アルカリ溶液(0.2M Tris-HCl Buffer(pH10))で透析し、得られたマイクロカプセル溶液を抗GFP抗体(ロシュ社製)を固定化したビーズ(アマシャム社製)に添加し(免疫沈降)、その上清を回収(ウ)。 Example 5: Dialysis with an alkaline solution (0.2 M Tris-HCl Buffer (pH 10)), and the resulting microcapsule solution was added to beads (Amersham) on which an anti-GFP antibody (Roche) was immobilized ( (Immunoprecipitation) and recovering the supernatant (c).
実施例6:アルカリ溶液(0.02M Tris-HCl Buffer(pH10))で透析し、得られたマイクロカプセル溶液を抗GFP抗体(ロシュ社製)を固定化したビーズ(アマシャム社製)に添加し(免疫沈降)、その上清を回収(エ)。 Example 6: Dialyzed with an alkaline solution (0.02M Tris-HCl Buffer (pH 10)), and the resulting microcapsule solution was added to beads (Amersham) immobilized with anti-GFP antibody (Roche) ( (Immunoprecipitation) and recovering the supernatant (D).
実施例7:界面活性剤溶液(10%SDS)を2倍量添加し室温で1時間処理後、得られたマイクロカプセル溶液を抗GFP抗体(ロシュ社製)を固定化したビーズ(アマシャム社製)に添加し(免疫沈降)、その上清を回収(オ)。 Example 7: After adding 2 times the amount of a surfactant solution (10% SDS) and treating at room temperature for 1 hour, beads obtained by immobilizing an anti-GFP antibody (Roche) on the resulting microcapsule solution (Amersham) ) (Immunoprecipitation) and recover the supernatant (e).
実施例8:界面活性剤溶液(1%SDS)を2倍量添加し室温で1時間処理後、得られたマイクロカプセル溶液を抗GFP抗体(ロシュ社製)を固定化したビーズ(アマシャム社製)に添加し(免疫沈降)、その上清を回収(カ)。 Example 8: After adding a double amount of a surfactant solution (1% SDS) and treating at room temperature for 1 hour, beads obtained by immobilizing an anti-GFP antibody (Roche) on the resulting microcapsule solution (Amersham) ) (Immunoprecipitation) and recover the supernatant (f).
比較例9:フリーのGFP(ロシュ社製)(1mg/ml)を抗GFP抗体(ロシュ社製)を固定化したビーズ(アマシャム社製)に添加し(免疫沈降)、その上清を回収(キ)。 Comparative Example 9: Free GFP (Roche) (1 mg / ml) was added to an anti-GFP antibody (Roche) -immobilized beads (Amersham) (immunoprecipitation), and the supernatant was recovered ( G).
比較例10:フリーのGFP(ロシュ社製)(1mg/ml)をアルカリ溶液(0.02M Tris-HCl Buffer(pH10))で透析し、得られたマイクロカプセル溶液を抗GFP抗体(ロシュ社製)を固定化したビーズ(アマシャム社製)に添加し(免疫沈降)、その上清を回収(ク)。 Comparative Example 10: Free GFP (Roche) (1 mg / ml) was dialyzed with an alkaline solution (0.02M Tris-HCl Buffer (pH 10)), and the resulting microcapsule solution was anti-GFP antibody (Roche) Is added to the immobilized beads (manufactured by Amersham) (immunoprecipitation), and the supernatant is recovered (ku).
比較例11:フリーのGFP(ロシュ社製)(1mg/ml)を界面活性剤溶液(1%SDS)を2倍量添加し室温で1時間処理後、得られたマイクロカプセル溶液を抗GFP抗体(ロシュ社製)を固定化したビーズ(アマシャム社製)に添加し(免疫沈降)、その上清を回収(ケ)。 Comparative Example 11: Free GFP (Roche) (1 mg / ml) was added twice with a surfactant solution (1% SDS) and treated at room temperature for 1 hour, and the resulting microcapsule solution was treated with anti-GFP antibody. (Roche) was added to the immobilized beads (Amersham) (immunoprecipitation), and the supernatant was recovered (K).
上記9種類のサンプルを電気泳動(SDS PAGE)した。SDS PAGEの条件は12.5%アクリルアミドゲルを使用し、SDS存在下サンプルを溶解し1000V、20mA下70分通電した。得られたゲルおよびPVDF膜(ATTO 社製)を用いてブロッティング装置(ATTO社製)に設置し、150mA下25分間通電させた。その後得られた膜を10%ブロックエース(大日本製薬社製)で一晩ブロッキングを行った後、抗GFP抗体(ロシュ社製)で3時間処理した後、0.01%Tween20を含む洗浄液で洗浄した後、抗マウス抗体−HRP conjugate(アマシャム社製)で2時間処理した。膜を充分に洗浄液で洗浄し、ウエスタンブロット ディテクション システム(アマシャム社製)による発色を行った。 The nine types of samples were electrophoresed (SDS PAGE). SDS PAGE conditions were as follows: 12.5% acrylamide gel was used. The sample was dissolved in the presence of SDS and energized for 70 minutes at 1000 V and 20 mA. The obtained gel and PVDF membrane (manufactured by ATTO) were installed in a blotting apparatus (manufactured by ATTO) and energized for 25 minutes at 150 mA. The resulting membrane was blocked overnight with 10% Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), treated with anti-GFP antibody (Roche) for 3 hours, and then washed with a washing solution containing 0.01% Tween20. Then, it was treated with anti-mouse antibody-HRP conjugate (Amersham) for 2 hours. The membrane was thoroughly washed with a washing solution and developed with a Western blot detection system (Amersham).
その結果、界面活性剤またはアルカリ溶液を添加したマイクロカプセル内のGFP(分子量約66000)のみ反応が確認された(図2−ウ〜カ)。すなわち、コントロールであるアはSDS PAGE内のSDSにより壊れて抗体と反応するが、イではマイクロカプセルの構造を有しているため、ビーズに固定化されたGFP抗体 と反応しないので、回収した上清中にはGFPが存在しない。よって、検出されなかった。ウ〜カはマイクロカプセルはアルカリ条件または界面活性剤存在下で高次構造が壊れ、包埋された酵素やタンパク質が表出したものと考えられる。また、キの実験からGFP(分子量26000)と抗GFP抗体は反応し、ク・ケからはGFP(分子量26000)とビーズに固定化された抗GFP抗体の反応はアルカリ溶液やSDSでは阻害されていないことが明らかである。 As a result, the reaction was confirmed only for GFP (molecular weight of about 66000) in the microcapsule to which the surfactant or the alkaline solution was added (FIG. 2-U to K). In other words, the control a is broken by SDS in the SDS PAGE and reacts with the antibody. However, because it has a microcapsule structure, it does not react with the GFP antibody immobilized on the beads. There is no GFP in Kiyomizu. Therefore, it was not detected. It is considered that the microcapsules have a higher order structure broken under alkaline conditions or in the presence of a surfactant, and the embedded enzymes and proteins are exposed. In addition, GFP (molecular weight 26000) and anti-GFP antibody reacted from Ki's experiment, and the reaction between GFP (molecular weight 26000) and anti-GFP antibody immobilized on beads was inhibited by alkaline solution or SDS. Obviously not.
参考例2 キャプシドタンパク質(HBcAg)とリゾチームの融合タンパク質の作製
1. 遺伝子の調製
HBcAgの遺伝子及びヒトリゾチームタンパク質Lys遺伝子及び発現ベクターを材料として、制限酵素及びDNAポリメラーゼを用いて、発現ベクターのマルチクローニングサイトの5‘側にHBcAgの1〜149番アミノ酸をコードする遺伝子1(配列番号1)を、さらにその下流にヒトリゾチームを導入した。Lys遺伝子(配列番号3)は宝酒造社製のヒトPlacenta cDNAライブラリーから遺伝子クローニングを行い取得した。HBcAg遺伝子は、慢性活動性B型肝炎患者の血清より作成したcDNAライブラリーを用いて、クローニングした遺伝子を用いた。発現ベクターはNovagen社製pET20b+を使用した。
Reference Example 2 Preparation of fusion protein of capsid protein (HBcAg) and lysozyme Gene preparation
Using HBcAg gene and human lysozyme protein Lys gene and expression vector as materials, restriction enzyme and DNA polymerase are used as a gene 1 (sequence) encoding amino acids 1-149 of HBcAg on the 5 ′ side of the multiple cloning site of the expression vector. Number 1) was further introduced downstream of human lysozyme. The Lys gene (SEQ ID NO: 3) was obtained by gene cloning from a human placenta cDNA library manufactured by Takara Shuzo. As the HBcAg gene, a cloned gene was used using a cDNA library prepared from the serum of a chronic active hepatitis B patient. As an expression vector, pET20b + manufactured by Novagen was used.
2. マイクロカプセルの調製
1.で得られた遺伝子を用いて、次のように発現誘導、溶菌、遠心、硫安沈殿、透析、蔗糖密度勾配法およびゲル濾過クロマトグラフィーによる精製を行い高純度に精製したマイクロカプセルを得た。
2. Preparation of microcapsules Using the gene obtained in the above, microcapsules purified with high purity were obtained by expression induction, lysis, centrifugation, ammonium sulfate precipitation, dialysis, sucrose density gradient method and gel filtration chromatography as follows.
すなわち、HBcAgのみの発現用ベクターおよびヒトリゾチームを含む融合タンパク質を発現する発現ベクターを大腸菌BL21に組み込み、16時間培養後、IPTG(ispporpyl-β-D-thiogalactopyranoside)を使って発現誘導した。さらに3時間培養後、15分間8,000rpmで遠心操作し集菌した。このように菌体内に高濃度の融合タンパク質を発現させることによって、融合タンパク質はマイクロカプセルを形成した。形成されたマイクロカプセルを単離精製するため、さらに以下の操作を行った。PBSバッファーにて菌を懸濁し、超音波にて10秒間3回破砕した。さらに、20分間10,000rpmで遠心操作をして、細胞片を取り除いた。遠心操作後の上澄みに硫安((NH4)2SO4)を濃度20%になるように加え、マイクロカプセルを沈殿させた。ペレット(沈殿物)をPBSバッファーに再溶解させ、蔗糖密度勾配法(60%〜5%)により、分取した。このとき、分取すべきマイクロカプセルを含んだ画分は、SDS-PAGEを使って確認した。その結果、蔗糖濃度が30〜50%濃度中に回収されることが判明した。さらに、ゲル濾過クロマトグラフィー(ハイロードスーパーデックス300 HR26/60 、ファルマシア社)により精製し、5mM Tris-HCl, 150mM NaCl溶液を用いて透析した結果、高純度に精製されたマイクロカプセル溶液を得た。 That is, an expression vector for expressing only HBcAg and an expression vector for expressing a fusion protein containing human lysozyme were incorporated into E. coli BL21, cultured for 16 hours, and induced for expression using IPTG (ispporpyl-β-D-thiogalactopyranoside). After further culturing for 3 hours, the cells were collected by centrifugation at 8,000 rpm for 15 minutes. Thus, by expressing a high concentration of the fusion protein in the microbial cells, the fusion protein formed microcapsules. In order to isolate and purify the formed microcapsules, the following operation was further performed. Bacteria were suspended in PBS buffer and disrupted 3 times for 10 seconds with ultrasound. Further, centrifugation was performed at 10,000 rpm for 20 minutes to remove cell debris. Ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 SO 4 ) was added to the supernatant after centrifugation to a concentration of 20% to precipitate microcapsules. The pellet (precipitate) was redissolved in PBS buffer and fractionated by the sucrose density gradient method (60% to 5%). At this time, the fraction containing the microcapsules to be collected was confirmed using SDS-PAGE. As a result, it was found that the sucrose concentration was recovered in a concentration of 30 to 50%. Furthermore, it was purified by gel filtration chromatography (High Road Superdex 300 HR26 / 60, Pharmacia) and dialyzed using 5 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl solution, and a highly purified microcapsule solution was obtained. .
実施例9、比較例12(タンパク質安定化および表出化評価)
ヒトリゾチームを包埋したマイクロカプセル溶液(1mg/ml)10μL、天然多糖類である5%アラビアガム(和光純薬社製)10μLと混合し、マイクロカプセル溶液を得た。同様にフリーのヒトリゾチーム(マイクロカプセルなし)(フナコシ社製)(1mg/ml)10μLに水、天然多糖類である5%アラビアガム(和光純薬社製)10μLと混合し、室温状態下で20日間保存した。次にマイクロカプセル溶液とフリーのヒトリゾチーム溶液(マイクロカプセルなし)をアルカリ溶液である0.2MTris-HCl(pH10)溶液を等量加え、室温で1時間処理した。次に、ミクロコッカス・リゾデイティカス(Micorococcus Lysodeikticus)培養液2.9mLを調製し、上記溶液0.1mLまたはリゾチーム標準溶液(和光純薬社製)0.1mLを添加し、室温条件下5分放置した。次に培養液のみ、または培養液にマイクロカプセル溶液を添加したものの吸光度OD450を測定しリゾチームの生物活性(RBA:Retained Biological activity)を測定したところ、マイクロカプセル溶液でRBA55%、フリーのヒトリゾチームで30%、リゾチーム標準溶液添加で59%であった。すなわち、マイクロカプセル内のリゾチームは安定に保持され、アルカリ溶液を添加することにより外部に表出し、プロテアーゼ活性を発現したものと推察される。
Example 9, Comparative Example 12 (protein stabilization and expression evaluation)
A microcapsule solution (1 mg / ml) embedded with human lysozyme and 10 μL of 5% gum arabic (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), a natural polysaccharide, were mixed to obtain a microcapsule solution. In the same way, mix human free lysozyme (without microcapsules) (Funakoshi Co., Ltd.) (1 mg / ml) with 10 μL of water and natural polysaccharide 5% gum arabic (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at room temperature. Stored for 20 days. Next, the microcapsule solution and free human lysozyme solution (without microcapsules) were added with equal amounts of 0.2 MTris-HCl (pH 10) solution, which was an alkaline solution, and treated at room temperature for 1 hour. Next, 2.9 mL of a Micrococcus lysodeikticus culture solution was prepared, 0.1 mL of the above solution or 0.1 mL of lysozyme standard solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes. Next, when the absorbance OD450 of the culture solution alone or the microcapsule solution added to the culture solution was measured to measure the biological activity (RBA) of the lysozyme, the microcapsule solution was RBA 55%, free human lysozyme. 30% and 59% with lysozyme standard solution addition. That is, it is presumed that the lysozyme in the microcapsule was stably maintained, and was exposed to the outside by adding an alkaline solution to express protease activity.
本発明は、酵素の安定化方法に限らず、酵素洗剤、プロテインチップ、バイオセンサー用途などにも応用することができるが、その応用範囲が、これらに限定されるものではない。 The present invention can be applied not only to enzyme stabilization methods but also to enzyme detergents, protein chips, biosensor applications, and the like, but the application range is not limited thereto.
A:内側の半径(11.2 nm)
B:内側の表面積(1576 nm2)
A: Inner radius (11.2 nm)
B: Inner surface area (1576 nm 2 )
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