JP2006211920A - Method for culturing human cell, incubator, and biomedical tissue supply material - Google Patents

Method for culturing human cell, incubator, and biomedical tissue supply material Download PDF

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Tsutomu Nagira
勤 柳楽
Misao Ishiguro
操 石黒
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for culturing a human cell, capable of rapidly repairing a defective part of a biomedical tissue, including a bone tissue, of a human body, by accelerating growth of a human cell, especially, a mesenchymal stem cell in an undifferentiated state, to provide an incubator, and to provide a biomedical tissue supply material. <P>SOLUTION: This method for culturing the human cell comprises culturing the human cell by making an anion-modified hyaluronic acid contained in a culture medium. The mesenchymal stem cell in the undifferentiated state or a mesenchymal stem cell in process of differentiation is preferably used as the human cell. Further, the incubator 1 which has such a structure that a coating containing the anion-modified hyaluronic acid is applied to an inner surface 1a to which the human cell is adhered and on which the cell is cultured is preferably used, instead of adding the hyaluronic acid to the culture medium 2. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

この発明は、ヒト細胞の培養方法、培養容器および生体組織補填体に関するものである。   The present invention relates to a method for culturing human cells, a culture container, and a body tissue complement.

従来、ラット頭蓋冠由来骨芽細胞のＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）活性を促進するために硫酸化ヒアルロン酸を使用することが有効であることが知られている（例えば、非特許文献１）。この非特許文献１によれば、硫酸化ヒアルロン酸がラット頭蓋冠由来骨芽細胞の増殖や分化機能を制御できることが示されている。
「ラット頭蓋冠由来骨芽細胞のＡＬＰase活性を促進する硫酸化ヒアルロン酸の効果」、長幡 操 他４名、繊維学会誌 Conventionally, it is known that it is effective to use sulfated hyaluronic acid in order to promote ALP (alkaline phosphatase) activity of rat calvaria-derived osteoblasts (for example, Non-Patent Document 1). According to this non-patent document 1, it is shown that sulfated hyaluronic acid can control the proliferation and differentiation function of rat calvaria-derived osteoblasts.
"Effects of sulfated hyaluronic acid that promotes ALPase activity in rat calvaria-derived osteoblasts", Osamu Nagahama and 4 others, Journal of the Textile Society of Japan

非特許文献１に記載された発明では、ラットの細胞において、硫酸化ヒアルロン酸が、低濃度の場合には増殖を促進し、高濃度の場合には分化を促進するという効果を奏することができることは示されている。しかしながら、ラットの細胞における効果がそのままヒト細胞への適応可能性を示唆するものではない。   In the invention described in Non-Patent Document 1, in rat cells, sulfated hyaluronic acid can exert an effect of promoting proliferation at a low concentration and promoting differentiation at a high concentration. Is shown. However, the effect on rat cells does not directly suggest the possibility of adaptation to human cells.

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、ヒト細胞、特に、未分化の状態の間葉系幹細胞の増殖を促進し、人体における骨組織をはじめとする生体組織の欠損部を迅速に修復することを可能とするヒト細胞の培養方法、培養容器および生体組織補填体を提供することを目的としている。   The present invention has been made in view of the above-described circumstances, and promotes the proliferation of human cells, particularly mesenchymal stem cells in an undifferentiated state. An object of the present invention is to provide a human cell culture method, a culture vessel, and a biological tissue complement capable of being rapidly repaired.

上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、培地内に陰イオン修飾ヒアルロン酸を含有させてヒト細胞を培養するヒト細胞の培養方法を提供する。
発明者らは、実験研究の結果、陰イオン修飾ヒアルロン酸を培地に添加した場合に、間葉系幹細胞の増殖促進効果があることを確認した。本発明によれば、培地内に含有される陰イオン修飾ヒアルロン酸、例えば、硫酸化ヒアルロン酸の作用により、ヒト細胞の増殖が促進され、ヒト細胞を迅速に必要細胞数まで培養することができる。なお、培地内に陰イオン修飾ヒアルロン酸を含有させる方法としては、培地内に陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加する方法の他に、陰イオン修飾ヒアルロン酸を内表面にコーティングした培養容器を用いて培養することが挙げられる。 In order to achieve the above object, the present invention provides the following means.
The present invention provides a method for culturing human cells, wherein an anion-modified hyaluronic acid is contained in the medium and the human cells are cultured.
As a result of experimental studies, the inventors have confirmed that when anion-modified hyaluronic acid is added to the medium, it has an effect of promoting the growth of mesenchymal stem cells. According to the present invention, the growth of human cells is promoted by the action of anion-modified hyaluronic acid contained in the medium, for example, sulfated hyaluronic acid, and the human cells can be rapidly cultured to the required number of cells. . In addition to the method of adding anion-modified hyaluronic acid in the medium, the method of adding anion-modified hyaluronic acid to the medium was used for culturing using a culture vessel in which an anion-modified hyaluronic acid was coated on the inner surface. To do.

上記発明においては、前記ヒト細胞が間葉系細胞からなることとしてもよい。
発明者らは、ヒト細胞が未分化の状態の間葉系細胞であっても、陰イオン修飾ヒアルロン酸によってその増殖が促進されることを確認した。本発明によれば、間葉系細胞の増殖を促進して、迅速に必要細胞数まで培養し、種々の生体組織における欠損部の修復に適用することが可能となる。 In the above invention, the human cell may be a mesenchymal cell.
The inventors have confirmed that even if the human cells are undifferentiated mesenchymal cells, their proliferation is promoted by anion-modified hyaluronic acid. ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it becomes possible to accelerate | stimulate the proliferation of a mesenchymal cell, to culture | cultivate to a required cell number rapidly, and to apply to the repair of the defect part in various biological tissues.

また、本発明は、ヒト細胞を付着させて培養する内表面に、陰イオン修飾ヒアルロン酸をコーティングしてなる培養容器を提供する。
培養容器内に所定の培地を貯留してヒト細胞を投入することにより、ヒト細胞が培養容器の底面等の内表面に付着して成長を開始する。この場合に、内表面に陰イオン修飾ヒアルロン酸がコーティングされていることによって、陰イオン修飾ヒアルロン酸による細胞増殖促進効果が発揮され、ヒト細胞を迅速に必要細胞数まで増殖させることができる。また、培地内に溶出した陰イオン修飾ヒアルロン酸によってもヒト細胞の増殖が促進されることになる。 The present invention also provides a culture container in which an anion-modified hyaluronic acid is coated on the inner surface where human cells are attached and cultured.
By storing a predetermined medium in the culture container and introducing human cells, the human cells adhere to the inner surface such as the bottom surface of the culture container and start growing. In this case, by coating the inner surface with anion-modified hyaluronic acid, the effect of promoting cell growth by anion-modified hyaluronic acid is exerted, and human cells can be rapidly grown to the required number of cells. The growth of human cells is also promoted by anion-modified hyaluronic acid eluted in the medium.

また、本発明は、ヒト細胞と陰イオン修飾ヒアルロン酸水溶液とを混合してなる生体組織補填体を提供する。
陰イオン修飾ヒアルロン酸はヒト細胞の増殖効果を備えるので、これらを混合してなる本発明の生体組織補填体によれば、生体組織の欠損部に充填することにより、欠損部を迅速に修復することができる。特に、陰イオン修飾ヒアルロン酸水溶液は、ある程度の粘性を有するゲル状に形成されるので、本発明の生体組織補填体は、注射器等によって人体の表皮を貫通して、少ない侵襲で欠損部に注入することができる。また、陰イオン修飾ヒアルロン酸水溶液の粘性によって、欠損部に補填された状態でヒト細胞が周囲に分散しないように保持され、欠損部の修復効果を高めることができる。特に、ヒト細胞として軟骨細胞を採用した場合に、陰イオン修飾ヒアルロン酸の軟骨組織との高い親和性によって、生体組織補填体を軟骨組織に接着状態に保持することができる。これによっても、欠損部の修復効果を高めることができる。 The present invention also provides a biological tissue complement comprising a mixture of human cells and an anion-modified hyaluronic acid aqueous solution.
Since anion-modified hyaluronic acid has a proliferating effect on human cells, according to the biological tissue complement of the present invention formed by mixing these, the defective portion of the biological tissue is quickly repaired by filling the defective portion of the biological tissue. be able to. In particular, since the anion-modified hyaluronic acid aqueous solution is formed into a gel having a certain degree of viscosity, the biological tissue filling material of the present invention penetrates the human epidermis with a syringe or the like and is injected into the defect with less invasiveness. can do. Furthermore, the viscosity of the anion-modified hyaluronic acid aqueous solution keeps the human cells from being dispersed around in the state of being filled in the defect part, and can enhance the repair effect of the defect part. In particular, when chondrocytes are employed as human cells, the biological tissue complement can be maintained in an adhesive state to the cartilage tissue due to the high affinity of the anion-modified hyaluronic acid with the cartilage tissue. Also by this, the effect of repairing the defect can be enhanced.

上記発明においては、前記ヒト細胞が間葉系細胞からなることとしてもよい。
このように構成することで、修復すべき欠損部が存在する生体組織に合わせて、間葉系細胞をその生体組織へ分化誘導させることができる。したがって、任意の生体組織の欠損部に適用することができる。この場合において、陰イオン修飾ヒアルロン酸によって未分化の状態の間葉系細胞もその増殖を促進されるので、補填後、早期に必要細胞数まで増殖させ、生体組織細胞への分化により、迅速に欠損部を修復することが可能となる。 In the above invention, the human cell may be a mesenchymal cell.
By comprising in this way, a mesenchymal cell can be induced to differentiate into the living tissue in accordance with the living tissue where the defect to be repaired exists. Therefore, the present invention can be applied to a defect portion of any living tissue. In this case, since the proliferation of undifferentiated mesenchymal cells is also promoted by anion-modified hyaluronic acid, it is proliferated to the required number of cells at an early stage after supplementation and rapidly differentiated into living tissue cells. It becomes possible to repair the defect.

また、上記発明においては、さらに生体親和性材料からなる生体組織補填材を混合してなることとしてもよい。
このようにすることで、生体親和性材料、例えば、リン酸カルシウム多孔体からなる生体組織補填材を足場として、生体組織、例えば、骨組織や軟骨組織への分化を誘導し、生体組織に形成された欠損部を迅速に修復することができる。 Moreover, in the said invention, it is good also as mixing the biological tissue filling material which consists of biocompatible material further.
In this way, a biocompatible material, for example, a biological tissue filling material composed of a calcium phosphate porous body, is used as a scaffold to induce differentiation into a biological tissue, for example, a bone tissue or a cartilage tissue. Defects can be repaired quickly.

さらに、上記発明においては、生体親和性材料からなる生体組織補填材が、粉状または顆粒状であることが好ましい。
このようにすることで、流動性を有する生体組織補填体を製造することができる。したがって、人体の表皮を大きく切開することなく、低侵襲で、骨組織の欠損部に注入することができる。この場合においても、粘性を有する陰イオン修飾ヒアルロン酸によって、生体組織補填材およびヒト細胞を一纏まりにするので、生体組織補填材が欠損部以外の部分に付着してしまうことを防止して、取扱性を向上することができる。また、粘性の高い陰イオン修飾ヒアルロン酸によって、ヒト細胞が欠損部から流出しないように保持し、欠損部の修復を効率的に行わせることができる。 Furthermore, in the said invention, it is preferable that the biological tissue filling material which consists of biocompatible materials is a powder form or a granular form.
By doing in this way, the biological tissue complement which has fluidity | liquidity can be manufactured. Therefore, it is possible to inject into a bone tissue defect portion with minimal invasiveness without greatly incising the epidermis of the human body. Even in this case, the anion-modified hyaluronic acid having viscosity makes the living tissue filling material and human cells together, so that the living tissue filling material is prevented from adhering to a portion other than the defective portion, Handleability can be improved. In addition, the highly viscous anion-modified hyaluronic acid can be used to hold human cells so that they do not flow out of the defect, and the defect can be repaired efficiently.

本発明によれば、ヒト細胞、特に、未分化の状態の間葉系幹細胞の増殖を促進し、人体における骨組織をはじめとする生体組織の欠損部を迅速に修復することができるという効果を奏する。   According to the present invention, it is possible to promote the proliferation of human cells, particularly mesenchymal stem cells in an undifferentiated state, and to rapidly repair defects in biological tissues such as bone tissues in the human body. Play.

本発明の一実施形態に係るヒト細胞の培養方法について、図１〜図４を参照して、以下に説明する。
本実施形態に係る培養方法は、培養容器内に貯留した所定の培地内に陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加して所定の培養条件に維持し、ヒト細胞を培養する方法である。 A human cell culture method according to an embodiment of the present invention will be described below with reference to FIGS.
The culture method according to the present embodiment is a method for culturing human cells by adding anion-modified hyaluronic acid to a predetermined medium stored in a culture vessel and maintaining the culture conditions.

本実施形態に係る培養方法によれば、培養容器内に貯留された培地に投入されたヒト細胞が、培養容器底面に接着して成長する際に、培地内に添加されている陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用によって、その増殖が促進されるので、早期に十分な細胞数まで増殖することができる。特に、ヒト細胞が、未分化の状態の間葉系幹細胞である場合においても、陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用によって、その増殖を促進されるので、必要細胞数まで早期に増殖させることができる。   According to the culture method according to the present embodiment, the anion-modified hyaluron added to the culture medium when the human cells put in the culture medium stored in the culture container adhere to the bottom of the culture container and grow. Since the growth is promoted by the action of the acid, it can grow to a sufficient number of cells at an early stage. In particular, even when human cells are mesenchymal stem cells in an undifferentiated state, their proliferation is promoted by the action of anion-modified hyaluronic acid, so that they can be proliferated to the required number of cells at an early stage.

図１は、本実施形態に係るヒト細胞の培養方法によるヒト細胞の増殖度の陰イオン修飾ヒアルロン酸濃度依存性を、ヒアルロン酸との対比において示したグラフである。図１のグラフは、陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加しない場合を１００としたときの相対細胞数を陰イオン修飾ヒアルロン酸およびヒアルロン酸の濃度毎に示したものである。   FIG. 1 is a graph showing the anion-modified hyaluronic acid concentration dependence of the degree of proliferation of human cells by the human cell culture method according to this embodiment in comparison with hyaluronic acid. The graph of FIG. 1 shows the relative number of cells for each concentration of anion-modified hyaluronic acid and hyaluronic acid, where 100 is the case where no anion-modified hyaluronic acid is added.

ここでは、培地として、例えば、間葉系幹細胞用基本培地ＭＳＣＢＭに三光純薬のブレットキットＭＳＣＧＭ間葉系幹細胞用培地を添加して使用し、ヒト細胞として、例えば、ヒト間葉系幹細胞を使用し、それぞれ、５％ＣＯ２濃度、３７℃で、１週間にわたって培養した場合の相対細胞数を示している。
これによれば、陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加した培地中では、ヒト間葉系幹細胞は、陰イオン修飾ヒアルロン酸の濃度が高いほど細胞数が増えており、添加しない場合と比較して濃度５μｇ／ｍｌのときに、最大で約２５％増加していることがわかる。これに対して、ヒアルロン酸を添加した場合の細胞の増殖度は、最大で５％程度である。したがって、陰イオン修飾ヒアルロン酸が、未分化の状態の間葉系幹細胞に対して、増殖を促進する効果を有することがわかる。 Here, as a medium, for example, Sanko Junyaku bullet kit MSCGM mesenchymal stem cell medium is added to the basic medium MSCBM for mesenchymal stem cells and used as human cells, for example, human mesenchymal stem cells are used. The relative cell numbers when cultured for 1 week at a concentration of 5% CO 2 and 37 ° C. are shown.
According to this, in the medium supplemented with anion-modified hyaluronic acid, the number of cells in human mesenchymal stem cells increases as the concentration of anion-modified hyaluronic acid increases. It can be seen that the maximum increase is about 25% at / ml. On the other hand, the degree of proliferation of cells when hyaluronic acid is added is about 5% at the maximum. Therefore, it can be seen that anion-modified hyaluronic acid has an effect of promoting proliferation of undifferentiated mesenchymal stem cells.

図２は、本実施形態に係るヒト細胞の培養方法によるヒト細胞の増殖度の陰イオン修飾ヒアルロン酸濃度依存性を、ヒアルロン酸との対比において示した図１と同様のグラフである。
ここでは、培地として、骨芽細胞分化誘導培地（ブレットキット骨芽細胞分化用培地（三光純薬社製））を用いた点を除き、図１の場合と同様の条件で培養している。 FIG. 2 is a graph similar to FIG. 1 showing the anion-modified hyaluronic acid concentration dependence of the degree of proliferation of human cells by the human cell culture method according to the present embodiment in comparison with hyaluronic acid.
Here, the culture is performed under the same conditions as in FIG. 1 except that an osteoblast differentiation induction medium (Brett kit osteoblast differentiation medium (manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.)) is used as the medium.

これによれば、陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加した骨芽細胞分化誘導培地中において、ヒト間葉系幹細胞は骨芽細胞に分化しながら同時に増殖し、図１の場合と同様に、陰イオン修飾ヒアルロン酸の添加濃度が高いほど骨芽細胞の細胞数が増えていることがわかる。図２によれば、骨芽細胞は、陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加していない場合と比較して、濃度５０μｇ／ｍｌのときに最大で約４０％増加していることがわかる。これに対してヒアルロン酸を添加した場合においては、その添加濃度に関わらず、骨芽細胞の増殖促進効果がほとんど認められない。   According to this, human mesenchymal stem cells proliferate at the same time while differentiating into osteoblasts in an osteoblast differentiation-inducing medium supplemented with anion-modified hyaluronic acid, and anion-modified as in FIG. It can be seen that the higher the concentration of hyaluronic acid, the greater the number of osteoblasts. As can be seen from FIG. 2, osteoblasts increase by about 40% at the maximum when the concentration is 50 μg / ml, compared to the case where no anion-modified hyaluronic acid is added. On the other hand, when hyaluronic acid is added, the effect of promoting the proliferation of osteoblasts is hardly observed regardless of the concentration of the added hyaluronic acid.

図３は、図２の各場合におけるヒト間葉系幹細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示すグラフである。これによれば、陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加した骨芽細胞分化誘導培地中に投入されたヒト間葉系幹細胞は骨芽細胞に分化し、陰イオン修飾ヒアルロン酸の濃度が高くなればなるほど高いアルカリフォスファターゼ活性を示していることがわかる。また、ヒアルロン酸を添加した場合、ヒト間葉系幹細胞から分化した骨芽細胞は、添加しない場合よりも低いアルカリフォスファターゼ活性を示している。   FIG. 3 is a graph showing alkaline phosphatase (ALP) activity of human mesenchymal stem cells in each case of FIG. According to this, human mesenchymal stem cells introduced into the osteoblast differentiation induction medium supplemented with anion-modified hyaluronic acid differentiate into osteoblasts, and the higher the concentration of anion-modified hyaluronic acid, the higher It turns out that alkaline phosphatase activity is shown. When hyaluronic acid is added, osteoblasts differentiated from human mesenchymal stem cells show lower alkaline phosphatase activity than when no hyaluronic acid is added.

さらに、図４は、図２の各場合におけるカルシウム沈着の検出結果である。陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加した場合においては、多くのカルシウムが蓄積されている。
これら図１〜図４に示される本実施形態に係るヒト細胞の培養方法によれば、ヒト間葉系幹細胞の培養において、陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用により、未分化の状態のヒト間葉系幹細胞の増殖を促進することができるとともに、骨芽細胞に分化させた後においても、分化後の骨芽細胞の増殖を促進することができる。本実施形態に係る培養方法によれば、ヒト間葉系幹細胞の増殖促進作用および分化後の骨芽細胞の増殖促進作用は、いずれも陰イオン修飾ヒアルロン酸の濃度が高いほど顕著に現れることがわかる。 Further, FIG. 4 shows detection results of calcium deposition in each case of FIG. When anion-modified hyaluronic acid is added, a lot of calcium is accumulated.
According to the method for culturing human cells according to this embodiment shown in FIGS. 1 to 4, in the culture of human mesenchymal stem cells, the human mesenchymal system in an undifferentiated state by the action of anion-modified hyaluronic acid. Proliferation of stem cells can be promoted, and proliferation of differentiated osteoblasts can be promoted even after differentiation into osteoblasts. According to the culture method according to the present embodiment, the growth promoting action of human mesenchymal stem cells and the growth promoting action of differentiated osteoblasts both appear more markedly as the concentration of anion-modified hyaluronic acid is higher. Recognize.

次に、本発明の一実施形態に係る培養容器について、図５〜図９を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る培養容器１は、図５に示されるように、培地２を貯留するディッシュ状の容器であって、ヒト細胞３を接着させる底面１ａに陰イオン修飾ヒアルロン酸からなるコーティング４が施されたものである。 Next, a culture vessel according to an embodiment of the present invention will be described below with reference to FIGS.
As shown in FIG. 5, the culture container 1 according to the present embodiment is a dish-shaped container that stores the culture medium 2, and has a coating 4 made of anion-modified hyaluronic acid on the bottom surface 1 a to which the human cells 3 are adhered. It has been applied.

本実施形態に係る培養容器１によれば、培養容器１内に貯留された培地２に投入されたヒト細胞３が、培養容器底面１ａに接着して成長する際に、底面１ａにコーティングされている陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用によって、その増殖が促進されるので、早期に十分な細胞数まで増殖することができる。特に、ヒト細胞３が、未分化の状態の間葉系幹細胞である場合においても、コーティングされた陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用によって、その増殖が促進されるので、必要細胞数まで早期に増殖させることができる。   According to the culture container 1 according to the present embodiment, when the human cells 3 put in the culture medium 2 stored in the culture container 1 are adhered to the culture container bottom surface 1a and grow, the bottom surface 1a is coated. Since the growth is promoted by the action of the anion-modified hyaluronic acid, it is possible to proliferate to a sufficient number of cells at an early stage. In particular, even when the human cell 3 is a mesenchymal stem cell in an undifferentiated state, the proliferation is promoted by the action of the coated anion-modified hyaluronic acid. be able to.

図６は、本実施形態に係るヒト細胞３の培養方法によるヒト細胞３の増殖度の陰イオン修飾ヒアルロン酸密度依存性を示すグラフである。ここでは、培地２として、例えば、極東製薬のＫ−１１０ＴｙｐｅＩＩ培地、カルシウム濃度０．２０ｍＭを使用し、ヒト細胞３として、例えば、ヒト表皮角化細胞を使用し、培養容器１のコーティング４における陰イオン修飾ヒアルロン酸の密度を変えて、５％ＣＯ２濃度、３７℃で６日間培養した場合の培養数を示している。これによれば、陰イオン修飾ヒアルロン酸の密度に依存して、密度が高くなればなるほど、ヒト表皮角化細胞３の増殖が低下していることがわかる。分化が促進されると、増殖は抑制されるので、この増殖度の低下はヒト表皮角化細胞３の分化を反映しているものと考えられる。   FIG. 6 is a graph showing the anion-modified hyaluronic acid density dependence of the degree of proliferation of human cells 3 by the method for culturing human cells 3 according to this embodiment. Here, for example, K-110 Type II medium of Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd., calcium concentration 0.20 mM is used as the medium 2, and for example, human epidermal keratinocytes are used as the human cells 3, and the shadow in the coating 4 of the culture container 1 is used. The number of cultures is shown when the density of ion-modified hyaluronic acid is changed and cultured at 37 ° C. for 6 days at 5% CO 2 concentration. This shows that the higher the density, the lower the proliferation of human epidermal keratinocytes 3, depending on the density of the anion-modified hyaluronic acid. When differentiation is promoted, proliferation is suppressed, and this decrease in the degree of proliferation is considered to reflect the differentiation of human epidermal keratinocytes 3.

また、図７は、本実施形態に係るヒト細胞３の培養方法によるヒト細胞３の相対移行距離の陰イオン修飾ヒアルロン酸密度依存性を示すグラフである。培養条件は上記と同様である。ヒト表皮角化細胞３の細胞間連絡機構を解析した結果、陰イオン修飾ヒアルロン酸をコーティングした培養容器１で培養したヒト表皮角化細胞３は、その機能が亢進されていることが明らかである。そして、その機能の亢進は、陰イオン修飾ヒアルロン酸の密度の上昇とともに向上していることがわかる。細胞間連絡機構は、細胞の分化と密接に関わっているため、これによっても、陰イオン修飾ヒアルロン酸によって分化が促進されていることがわかる。   FIG. 7 is a graph showing the anion-modified hyaluronic acid density dependence of the relative migration distance of the human cell 3 by the human cell 3 culture method according to the present embodiment. The culture conditions are the same as above. As a result of analyzing the intercellular communication mechanism of human epidermal keratinocytes 3, it is clear that the function of human epidermal keratinocytes 3 cultured in the culture vessel 1 coated with anion-modified hyaluronic acid is enhanced. . And it turns out that the enhancement of the function is improved with the increase in the density of anion-modified hyaluronic acid. Since the intercellular communication mechanism is closely related to cell differentiation, it can be seen that differentiation is also promoted by anion-modified hyaluronic acid.

また、図８は、ヒト表皮角化細胞３の分化マーカーであるインボルクリンを定量ＰＣＲで検出した結果を示すグラフである。図８によれば、陰イオン修飾ヒアルロン酸の密度が高くなるにつれて、インボルクリンの発現量が著しく増加していることがわかる。図９は、図８の各密度の場合における細胞の状態を示している。   FIG. 8 is a graph showing the results of detecting involucrin, which is a differentiation marker of human epidermal keratinocytes 3, by quantitative PCR. FIG. 8 shows that the expression level of involucrin is remarkably increased as the density of the anion-modified hyaluronic acid is increased. FIG. 9 shows the state of cells in each density case of FIG.

本実施形態に係る培養容器１によれば、第１の実施形態における培養方法の場合と同様に、表面にコーティングされた陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用により、ヒト細胞３の増殖を促進することができる。また、ヒト表皮角化細胞３においては、陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用により、分化を促進することができる。
さらに、培養容器１の内表面にコーティングする陰イオン修飾ヒアルロン酸の密度を調節することにより、ヒト細胞３の増殖やヒト表皮角化細胞３の分化を制御することができるという効果がある。 According to the culture container 1 according to the present embodiment, the growth of the human cell 3 can be promoted by the action of the anion-modified hyaluronic acid coated on the surface as in the case of the culture method in the first embodiment. it can. In human epidermal keratinocytes 3, differentiation can be promoted by the action of anion-modified hyaluronic acid.
Furthermore, by adjusting the density of the anion-modified hyaluronic acid coated on the inner surface of the culture vessel 1, there is an effect that the proliferation of the human cells 3 and the differentiation of the human epidermal keratinocytes 3 can be controlled.

また、従来のヒト表皮角化細胞の分化促進には、マウス３Ｔ３細胞等の生体由来材料を直接フィーダーレイヤーとして前記角化細胞と接触させる方法が知られているが、生体由来材料であるために、感染する可能性が考えられていた。上記の陰イオン修飾ヒアルロン酸は半合成機能性ポリマー材料であり、上記感染の可能性を回避しながらヒト表皮角化細胞を分化促進することが可能となる。   In addition, for the promotion of differentiation of conventional human epidermal keratinocytes, there is known a method in which a biological material such as mouse 3T3 cells is brought into direct contact with the keratinocytes as a feeder layer. The possibility of infection was considered. The above anion-modified hyaluronic acid is a semi-synthetic functional polymer material that can promote differentiation of human epidermal keratinocytes while avoiding the possibility of infection.

次に、本発明の一実施形態に係る生体組織補填体について説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体は、ヒト細胞と陰イオン修飾ヒアルロン酸とを混合したものである。ヒト細胞としては、例えば、ヒト間葉系幹細胞を使用し、陰イオン修飾ヒアルロン酸としては、例えば、分子量数万〜２００万の硫酸化ヒアルロン酸を使用する。 Next, a biological tissue filling body according to an embodiment of the present invention will be described.
The biological tissue complement according to this embodiment is a mixture of human cells and anion-modified hyaluronic acid. As human cells, for example, human mesenchymal stem cells are used, and as the anion-modified hyaluronic acid, for example, sulfated hyaluronic acid having a molecular weight of tens of thousands to 2 million is used.

本実施形態に係る生体組織補填体によれば、上述したように陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用により、ヒト間葉系幹細胞の増殖が促進される。また、本実施形態に係る生体組織補填体によれば、流動性を有するので、注射器によって患部に注入することができる。したがって、人体の表皮を大きく切開することなく、注射針を刺すだけで患部に注入して欠損部を補填することができる。   According to the biological tissue complement according to the present embodiment, the proliferation of human mesenchymal stem cells is promoted by the action of the anion-modified hyaluronic acid as described above. Moreover, according to the biological tissue filling body according to the present embodiment, since it has fluidity, it can be injected into the affected area with a syringe. Therefore, it is possible to make up for the defect by injecting into the affected area simply by inserting the injection needle without making a large incision in the epidermis of the human body.

また、特に、分子量の高い硫酸化ヒアルロン酸を使用することにより、生体組織補填体の粘性をある程度高く保持することができる。したがって、欠損部に補填された後に、含有しているヒト間葉系幹細胞が欠損部から外部に漏出しないように止めておくことができる。その結果、欠損部内に保持したヒト間葉系幹細胞の増殖を陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用によって促進し、また、生体内における分化誘導因子の作用により、ヒト間葉系幹細胞を欠損部の形成されている生体組織へ分化させて生体組織の形成作用を促進することができる。   In particular, by using sulfated hyaluronic acid having a high molecular weight, it is possible to maintain the viscosity of the body tissue complement to a certain degree. Therefore, it is possible to stop the contained human mesenchymal stem cells from leaking outside from the defect portion after the defect portion is filled. As a result, the growth of human mesenchymal stem cells retained in the defect is promoted by the action of anion-modified hyaluronic acid, and the action of the differentiation inducing factor in vivo forms human mesenchymal stem cells. It can be differentiated into a living tissue and the forming action of the living tissue can be promoted.

特に、欠損部が軟骨組織に形成されている場合においては、陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用によって生体組織補填体の軟骨組織への親和性を向上し、ヒト間葉系幹細胞を軟骨組織に接着状態に維持することができる。したがって、効率的に軟骨組織の再生を図ることができる。   In particular, when the defect is formed in the cartilage tissue, the affinity of the biological tissue complement to the cartilage tissue is improved by the action of the anion-modified hyaluronic acid, and the human mesenchymal stem cells adhere to the cartilage tissue. Can be maintained. Therefore, cartilage tissue can be efficiently regenerated.

なお、未分化のヒト間葉系幹細胞を採用することにより、分化誘導因子の選択によって任意のヒト細胞に分化させることができるので、あらゆる生体組織の欠損部に補填することができる。ヒト間葉系幹細胞の代わりに、所定のヒト細胞、例えば、骨芽細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、軟骨細胞等を直接用いて生体組織補填体を構成することにしてもよい。これらの場合には、それぞれの生体組織に特化して欠損部の修復を図ることができる。   By adopting undifferentiated human mesenchymal stem cells, it is possible to differentiate into any human cell by selecting a differentiation-inducing factor, so that it can be compensated for any defect part of living tissue. Instead of human mesenchymal stem cells, a human tissue complement may be formed by directly using predetermined human cells such as osteoblasts, adipocytes, muscle cells, chondrocytes and the like. In these cases, the defect can be repaired by specializing in each living tissue.

また、本実施形態においては、ヒト間葉系幹細胞と陰イオン修飾ヒアルロン酸とを混合してなる生体組織補填体を例示して説明したが、これに、βリン酸三カルシウムのようなリン酸カルシウム多孔体の粉体または顆粒体を混合してもよい。このように構成することにより、リン酸カルシウム多孔体を足場としてヒト間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させ、骨組織の形成作用を促進して骨欠損部を迅速に修復することができる。   Further, in the present embodiment, a biological tissue complement formed by mixing human mesenchymal stem cells and anion-modified hyaluronic acid has been described as an example, but this includes a calcium phosphate porous material such as β-tricalcium phosphate. Body powders or granules may be mixed. By comprising in this way, a human mesenchymal stem cell can be differentiated into an osteoblast by using a calcium phosphate porous body as a scaffold, a bone tissue forming action is promoted, and a bone defect part can be repaired rapidly.

特に、粉体状または顆粒体状のリン酸カルシウム多孔体を使用することにより、ある程度流動性を有する生体組織補填体が構成されている。そして、粘性を有する陰イオン修飾ヒアルロン酸の水溶液によってリン酸カルシウム多孔体が、一纏まりに保持されるので、骨欠損部への補填時に周囲に付着して炎症を起こす等の不都合の発生を防止することができる。   In particular, by using a powdered or granular calcium phosphate porous body, a biological tissue filling body having a certain degree of fluidity is configured. And since the calcium phosphate porous material is held together by the aqueous solution of viscous anion-modified hyaluronic acid, it prevents the occurrence of inconveniences such as adhesion to the surroundings and causing inflammation when filling the bone defect. Can do.

次に、陰イオン修飾ヒアルロン酸を軟骨分化用培地に添加して、軟骨分化マーカの発現を検討した実施例について、以下に説明する。
軟骨分化用培地としては、ブレットキット軟骨細胞分化用培地（三光純薬社製）を用い、ヒト細胞としてヒト間葉系幹細胞を用い、陰イオン修飾ヒアルロン酸として、濃度０．００５％（５０μｇ／ｍｌ）の硫酸化ヒアルロン酸を添加した。そして、５％ＣＯ２濃度、３７℃で培養し、７日、１４日、２１日経過した場合のアグリカンおよびコラーゲンタイプ２を軟骨分化マーカとしてそれぞれ測定した。比較例として、陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加しない場合、および、ヒアルロン酸を添加した場合について併せて示す。 Next, examples in which anion-modified hyaluronic acid was added to a cartilage differentiation medium and the expression of cartilage differentiation markers was examined will be described below.
As a medium for cartilage differentiation, Brett kit chondrocyte differentiation medium (manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.) is used, human mesenchymal stem cells are used as human cells, and anion-modified hyaluronic acid is used at a concentration of 0.005% (50 μg / ml) of sulfated hyaluronic acid. Then, the cells were cultured at 5% CO 2 concentration at 37 ° C., and aggrecan and collagen type 2 after 7 days, 14 days, and 21 days were measured as cartilage differentiation markers. As comparative examples, the case where no anion-modified hyaluronic acid is added and the case where hyaluronic acid is added are also shown.

その結果、ヒト間葉系幹細胞から軟骨分化させたとき、陰イオン修飾ヒアルロン酸が存在すると、軟骨に分化したときに発生する物質であるアグリカンが、培養１４日、２１日目において、また、コラーゲンタイプ２が、培養２１日目において有意に高く産生されていることがわかった。したがって、陰イオン修飾ヒアルロン酸は軟骨再生用材料としても有用である。   As a result, when anion-modified hyaluronic acid is present when cartilage differentiation is performed from human mesenchymal stem cells, aggrecan, which is a substance that is generated when cartilage is differentiated, is expressed on the 14th and 21st day of culture, and on collagen. Type 2 was found to be significantly higher produced on day 21 of culture. Therefore, anion-modified hyaluronic acid is also useful as a cartilage regeneration material.

本発明の一実施形態に係るヒト細胞の培養方法によるヒト間葉系幹細胞の増殖度の陰イオン修飾ヒアルロン酸濃度依存性をヒアルロン酸濃度依存性との対比において示すグラフである。It is a graph which shows the anion modification hyaluronic acid density | concentration dependence of the proliferation degree of the human mesenchymal stem cell by the human cell culture | cultivation method which concerns on one Embodiment of this invention in contrast with hyaluronic acid density | concentration dependence. 骨芽細胞に分化しつつあるヒト間葉系幹細胞の増殖度の陰イオン修飾ヒアルロン酸濃度依存性をヒアルロン酸濃度依存性との対比において示す図１と同様のグラフである。FIG. 2 is a graph similar to FIG. 1 showing the anion-modified hyaluronic acid concentration dependency of the proliferation degree of human mesenchymal stem cells that are differentiating into osteoblasts in comparison with the hyaluronic acid concentration dependency. 図２の骨芽細胞の相対アルカリフォスファターゼ活性の陰イオン修飾ヒアルロン酸濃度依存性をヒアルロン酸濃度依存性との対比において示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the anion-modified hyaluronic acid concentration dependence of the relative alkaline phosphatase activity of the osteoblasts of FIG. 2 in comparison with the hyaluronic acid concentration dependence. 図２の骨芽細胞によるカルシウム沈着の陰イオン修飾ヒアルロン酸濃度依存性をヒアルロン酸濃度依存性との対比において示すグラフである。It is a graph which shows the anion modification hyaluronic acid concentration dependence of calcium deposition by the osteoblast of FIG. 2 in contrast with the hyaluronic acid concentration dependence. 本発明の一実施形態に係る培養容器を説明する模式的な縦断面図である。It is a typical longitudinal section explaining a culture container concerning one embodiment of the present invention. 図５の培養容器によるヒト表皮角化細胞の増殖度の陰イオン修飾ヒアルロン酸密度依存性を示すグラフである。It is a graph which shows the anion modification hyaluronic acid density dependence of the proliferation degree of the human epidermal keratinocyte by the culture container of FIG. 図６のヒト表皮角化細胞の細胞間連絡機能の亢進の陰イオン修飾ヒアルロン酸密度依存性を示すグラフである。It is a graph which shows the anion modification hyaluronic acid density dependence of the enhancement of the cell-cell communication function of the human epidermal keratinocyte of FIG. 図５の培養容器によるヒト表皮角化細胞の分化促進の陰イオン修飾ヒアルロン酸密度依存性を示すグラフである。It is a graph which shows the anion modification hyaluronic acid density dependence of the differentiation promotion of the human epidermal keratinocyte by the culture container of FIG. 図８の各密度における細胞の形態を顕微鏡写真で示す図である。It is a figure which shows the form of the cell in each density of FIG. 8 with a microscope picture. 本発明の一実施例に係るヒト間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化において陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加した場合の軟骨分化マーカの発現結果を示すグラフである。It is a graph which shows the expression result of the cartilage differentiation marker at the time of adding anion modification hyaluronic acid in the differentiation into the chondrocyte of the human mesenchymal stem cell which concerns on one Example of this invention.

符号の説明Explanation of symbols

１ 培養容器
１ａ 底面（内表面）
２ 培地
３ ヒト表皮角化細胞（ヒト細胞）
４ コーティング 1 Culture container 1a Bottom (inner surface)
2 Medium 3 Human epidermal keratinocytes (human cells)
4 Coating

Claims (7)

培地内に陰イオン修飾ヒアルロン酸を含有させてヒト細胞を培養するヒト細胞の培養方法。   A method for culturing human cells, which comprises culturing human cells containing anion-modified hyaluronic acid in the medium. 前記ヒト細胞が間葉系細胞からなる請求項１に記載のヒト細胞の培養方法。   The method for culturing human cells according to claim 1, wherein the human cells are mesenchymal cells. ヒト細胞を付着させて培養する内表面に、陰イオン修飾ヒアルロン酸をコーティングしてなる培養容器。   A culture vessel in which an anion-modified hyaluronic acid is coated on the inner surface where human cells are attached and cultured. ヒト細胞と陰イオン修飾ヒアルロン酸水溶液とを混合してなる生体組織補填体。   A biological tissue complement comprising a mixture of human cells and an anion-modified hyaluronic acid aqueous solution. 前記ヒト細胞が間葉系細胞からなる請求項４に記載の生体組織補填体。   The biological tissue complement according to claim 4, wherein the human cells are mesenchymal cells. さらに生体親和性材料からなる生体組織補填材を混合してなる請求項４または請求項５に記載の生体組織補填体。   The biological tissue filling material according to claim 4 or 5, further comprising a biological tissue filling material made of a biocompatible material. 生体組織補填材が粉状または顆粒状である請求項６に記載の生体組織補填体。   The body tissue filling material according to claim 6, wherein the body tissue filling material is powdery or granular.
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