JP2006194785A - Diagnostic kit for equine babesia infection - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ウマバベシア感染用診断キットに関し、特に、バベシア・エクイ（Ｂａｂｅｓｉａ ｅｑｕｉ）感染及びバベシア・カバリ（Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｂａｌｌｉ）感染を同時に判定できるイムノクロマクキットに関する。 The present invention relates to a diagnostic kit for equine Babesia infection, and more particularly, to an immunochromac kit capable of simultaneously determining Babesia equi infection and Babesia caballi infection.
ウマバベシア病はダニが媒介する原虫病であり、病原体であるウマバベシア原虫はバベシア属に属するバベシア・カバリ（Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｂａｌｌｉ；以下、「ＢＣ」ともいう）およびバベシア・エクイ（Ｂａｂｅｓｉａ ｅｑｕｉ；以下、「ＢＥ」ともいう）の２種類が知られている。 Umababesia disease is a protozoal disease mediated by mites, and the pathogen Umababesiaia parasite is Babesia cavalli (hereinafter also referred to as “BC”) and Babesia equi; Are also known).
ウマバベシア 病は、南ヨーロッパ、アジア、ロシア、中近東、アフリカおよび中南米など世界中に広く分布している。本病は臨床上、高熱を発し、貧血および黄疸を主徴とし、急性ないし慢性に経過する。急性症の場合、その死亡率は２種類ある病原体によって若干異なるが、約１０％、まれには５０％に達することもあるといわれている。一方、予後は病原体により症状が異なり、いずれも耐過後は末梢血液中から原虫が消失するが、ＢＥの場合は終生原虫保有ウマとなることが知られている。 Equine Babesia disease is widely distributed throughout the world, including Southern Europe, Asia, Russia, the Middle East, Africa and Latin America. The disease is clinically hyperthermia, with anemia and jaundice as the main features, and progresses from acute to chronic. In the case of acute disease, the mortality rate is slightly different depending on two types of pathogens, but it is said that it may reach about 10%, rarely 50%. On the other hand, the prognosis varies depending on the pathogen. In both cases, the protozoa disappear from the peripheral blood after tolerance, but in the case of BE, it is known to be a horse with a lifelong protozoa.
近年の国際的なウマの取り引きの増加は、清浄国である北アメリカ、オーストラリア、および日本を含む極東への本病の拡散の可能性を含んでいることから、早期診断による感染ウマの摘発が極めて重要となっている。このように感染が認められたウマについては拡散防止のために殺処分されることになるが、上記のようにＢＣ感染の場合は、感染後に原虫が消失することから、ＢＣ感染ウマは隔離、係留しておけば殺処分をしなくて済むケースがある。また、感染原虫種により治療法も異なってくる。従って、いずれの種のバベシア 原虫に感染しているかを正確に診断することは、特に高価な競争馬においては重要な問題となっている。 The recent increase in international equine trade includes the possibility of spreading the disease to the clean east, including North America, Australia, and the Far East, including Japan. It is extremely important. Horses that have been infected in this way will be killed to prevent spread, but in the case of BC infection as described above, since the protozoa disappear after infection, the BC infected horse is isolated, There are cases in which it is not necessary to kill if moored. In addition, the treatment method varies depending on the protozoan species. Therefore, accurately diagnosing which species of Babesia parasite is infected is an important issue, especially in expensive competitive horses.
ウマバベシア 原虫の生活史はマラリア原虫と類似している。すなわち、宿主の血液に入った種虫（スポロゾイト；ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）は直ちに赤血球に侵入しメロゾイト（ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ）となる。メロゾイトは赤血球中でさらに２分裂して数を増す。赤血球の破壊に伴いメロゾイトは放出され、他の赤血球に感染する。メロゾイトが寄生している赤血球を媒介者であるマダニが吸血によって摂取すると、マダニ腸管内でメロゾイトのうちある個体は配偶子母細胞となり、有性的な配偶子を形成する。こうして形成された雌雄の配偶子の合体によって生じたチゴート（ｚｙｇｏｔｅ）は、マダニ腸細胞内に侵入し、スポロキネート（ｓｐｏｒｏｋｉｎｅｔｅ）を経た後、マダニ体内の各臓器内でさらに分裂して、最終的にマダニ唾液腺に到って多数の種虫となり、新たな感染を引き起こす。 The life history of the protozoan is similar to that of the malaria parasite. That is, sporozoites that have entered the blood of the host immediately invade red blood cells to become merozoites. The merozoite divides further in red blood cells and increases in number. With the destruction of red blood cells, merozoites are released and infect other red blood cells. When a tick, who is a mediator, ingests red blood cells that are infested with merozoites by sucking blood, one individual of merozoites in the tick intestine becomes a gametocyte and forms a sexual gamete. The zygote produced by the union of the male and female gametes formed in this way enters the tick intestinal cells, passes through sporokinate, and further divides in each organ in the tick body, finally It reaches the tick salivary gland and becomes a large number of species and causes new infections.
ウマバベシア 病の感染の診断は、通常、上記ウマバベシア 原虫の生活史のうち、ウマ血中に存在するメロゾイトまたはそれに対する抗体を検出することにより行う。 Diagnosis of infection of equine Babesia disease is usually carried out by detecting merozoites present in equine blood or antibodies thereto in the life history of the equine beetle.
ウマバベシア 病の感染の診断には、現在のところ、主に補体結合反応（以下、「ＣＦ」ともいう）と間接蛍光抗体法（以下、「ＩＦＡ」ともいう）が用いられているが、検出感度が低いことから感染初期やキャリアー状態のウマを見逃すおそれが指摘されている。また、これらの血清学的診断法は特異性の点でも問題を伴うことが多い。 At present, the complement binding reaction (hereinafter also referred to as “CF”) and the indirect fluorescent antibody method (hereinafter also referred to as “IFA”) are mainly used for diagnosis of infection of equine Babesia disease. Because of its low sensitivity, it has been pointed out that it may miss horses in the early stages of infection or in a carrier state. Also, these serological diagnostic methods are often problematic in terms of specificity.
さらに、これらの診断法は、本病に感染したウマの血液より分離した原虫を抗原として利用したものであるため、抗原の作製コストおよびその品質のバラツキが問題となる。特にＢＣについては、感染したウマは原虫の増殖がまだ低い段階でも発熱・貧血を主徴とする激烈な症状を呈して死亡してしまうため、抗原の入手が極めて困難であり、安定した診断法の確立が妨げられている。 Furthermore, since these diagnostic methods utilize protozoa isolated from blood of horses infected with this disease as antigens, the production costs of antigens and variations in their quality are problematic. In particular, for BC, infected horses die with severe symptoms, mainly fever and anemia, even when the growth of protozoa is still low, making it difficult to obtain antigens and a stable diagnostic method. Establishment has been hindered.
ＣＦやＩＦＡに代わる診断法として、近年、ウエスタンブロット法［Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ２２（５）：６２７−６３０（１９９２）、非特許文献１］、ＥＬＩＳＡ［Ｖｅｔ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２０：４３−４８（１９８６）、非特許文献２；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ２４（３）：３４１−３４６（１９９４）、非特許文献３；Ｖｅｔ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ６８：１１−２６（１９９７）、非特許文献４］、ＤＮＡプローブを用いた方法［Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ １０２：３５７−３６５（１９９１）、非特許文献５；Ｖｅｔ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ７３：５３−６３（１９９７）、非特許文献６］が報告されている。しかしながら、ウエスタンブロット法では検出感度の点、ＥＬＩＳＡではＢＥとの類症鑑別における特異性の点あるいは抗原入手の困難性の点、ＤＮＡプローブを用いた方法ではオートラジオグラフィーなどアイリトープを用いる特別な施設を必要とする等、特異性、感度、簡便さなど多くの解決すべき問題が残されている。 In recent years, western blotting [ Int. J. et al. Parasitol. 22 (5) : 627-630 (1992), Non-Patent Document 1], ELISA [ Vet. Parasitol. 20 : 43-48 (1986), Non-Patent Document 2; Int. J. et al. Parasitol. 24 (3) : 341-346 (1994), Non-Patent Document 3; Vet. Parasitol. 68: 11-26 (1997), Non-Patent Document 4], a method using a DNA probe [Parasitology 102: 357-365 (1991), Non-Patent Document 5; Vet. Parasitol. 73 : 53-63 (1997), Non-Patent Document 6] has been reported. However, in Western blotting, detection facilities are sensitive, in ELISA, specificity in differentiation from BE or difficulty in obtaining antigens, in DNA probes, autoradiography and other special facilities that use iritopes Many problems to be solved such as specificity, sensitivity, and simplicity remain.
以上のことから、特異性に優れるＢＣ原虫の有用な診断用抗原を安定して供給することを可能にし得る技術を開発することが、本病を予防、制圧する上で重要な課題と考えられる。
バベシア・エクイ（Ｂａｂｅｓｉａ ｅｑｕｉ）及びバベシア・カバリ（Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｂａｌｌｉ）の分布地域は、重複しており、両者の感染を同時にかつ確実に判定できることができれば、ウマの検疫には非常に有利である。 The distribution areas of Babesia equi and Babesia caballi overlap, and if both infections can be determined simultaneously and reliably, it is very advantageous for quarantine of horses.
そこで本発明の目的は、バベシア・エクイ（Ｂａｂｅｓｉａ ｅｑｕｉ）感染及びバベシア・カバリ（Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｂａｌｌｉ）感染を同時に、かつ確実に判定できるイムノクロマトグラフィーキットを提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide an immunochromatography kit that can simultaneously and reliably determine Babesia equi infection and Babesia caballi infection.
上記課題を解決する本発明は以下の通りである。
[請求項１]バベシア・エクイ（Ｂａｂｅｓｉａ ｅｑｕｉ）感染及びバベシア・カバリ（Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｂａｌｌｉ）感染を同時に判定できるイムノクロマトグラフィーキットであって、
長手方向にサンプルパッド、コンジュゲートパッド、検出領域、コントロール領域及び吸収領域を、この順に有する多孔性のクロマトグラフィー用部材で構成され、
前記サンプルパッドは、被検物質を含む試料を供給する領域であり、
前記コンジュゲートパッドは、被検物質に特異的に結合する物質であって, 粒子により標識された物質であるコンジュゲートを含む領域であり、
前記検出領域は、被検物質に特異的に結合する物質を含む領域であり、
前記コントロール領域は、コンジュゲートに特異的に結合する物質を含む領域であり、
前記吸収領域は、液体吸収用物質を含む領域であり、
前記被検物質に特異的に結合する物質が、バベシア・エクイのメロゾイト表面抗原由来の断片化ＥＭＡ−２ｔ抗原（ｒＥＭＡ−２ｔ）及びバベシア・カバリのメロゾイト表面抗原由来の断片化Ｂｃ４８抗原（ｒＢｃ４８）である、
前記キット。
[請求項２]被検物質が、バベシア・エクイのメロゾイト表面抗原に対する抗体及バベシア・カバリのメロゾイト表面抗原に対する抗体である請求項１に記載のキット。
[請求項３]粒子が金属コロイド粒子又はラテックス粒子である請求項１または２に記載のキット。
[請求項４]ｒＥＭＡ−２ｔが３．５〜６．５μg/cm2の濃度で前記検出領域に含まれ、かつｒＥＭＡ−２ｔのコンジュゲートがｒＥＭＡ−２ｔとして５〜１５μg/cm2の濃度で前記コンジュゲートパッドに含まれる請求項１〜３のいずれか１項に記載のキット。
[請求項５]ｒＢｃ４８が０．７５〜２μg/cm2の濃度で前記検出領域に含まれ、かつｒＢｃ４８のコンジュゲートがｒＢｃ４８として３．１２５〜１２．５μg/cm2の濃度で前記コンジュゲートパッドに含まれる請求項１〜４のいずれか１項に記載のキット。
The present invention for solving the above problems is as follows.
[Claim 1] An immunochromatography kit capable of simultaneously determining Babesia equi infection and Babesia caballi infection,
It is composed of a porous chromatography member having a sample pad, a conjugate pad, a detection region, a control region and an absorption region in this order in the longitudinal direction,
The sample pad is an area for supplying a sample containing a test substance,
The conjugate pad is a region containing a conjugate that is a substance that specifically binds to a test substance and is a substance labeled with particles,
The detection region is a region containing a substance that specifically binds to a test substance,
The control region is a region containing a substance that specifically binds to the conjugate,
The absorption region is a region containing a liquid absorbing substance,
The substance that specifically binds to the test substance is a fragmented EMA-2t antigen (rEMA-2t) derived from Babesia Equi merozoite surface antigen and a fragmented Bc48 antigen derived from Babesia cabari merozoite surface antigen (rBc48) Is,
Said kit.
[Claim 2] The kit according to claim 1, wherein the test substance is an antibody against a Babesia Equi merozoite surface antigen and an antibody against Babesia cabali merozoite surface antigen.
[Claim 3] The kit according to claim 1 or 2, wherein the particles are metal colloid particles or latex particles.
[4] rEMA-2t is contained in the detection region at a concentration of 3.5 to 6.5 μg / cm 2 , and rEMA-2t conjugate is rEMA-2t at a concentration of 5 to 15 μg / cm 2 The kit according to any one of claims 1 to 3, which is contained in the conjugate pad.
5. rBc48 is contained in the detection region at a concentration of 0.75 to 2 μg / cm 2 , and the conjugate of rBc48 is rBc48 at a concentration of 3.125 to 12.5 μg / cm 2. The kit of any one of Claims 1-4 contained in.
本発明によれば、バベシア・エクイ（Ｂａｂｅｓｉａ ｅｑｕｉ）感染及びバベシア・カバリ（Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｂａｌｌｉ）感染を同時に、かつ確実に判定できるイムノクロマトグラフィーキットを提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the immunochromatography kit which can determine a Babesia equi infection (Babesia equi) infection and Babesia caballi infection simultaneously and reliably can be provided.
本発明は、バベシア・エクイ（Ｂａｂｅｓｉａ ｅｑｕｉ）感染及びバベシア・カバリ（Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｂａｌｌｉ）感染を同時に判定できるイムノクロマトグラフィーキットである。以下、単に本発明のキットということがある。 The present invention is an immunochromatography kit capable of simultaneously determining Babesia equi infection and Babesia caballi infection. Hereinafter, it may be simply referred to as a kit of the present invention.
図１に本発明のキットの長手方向の断面説明図を示す。図1に示すように、本発明のキットは、長手方向にサンプルパッド10、コンジュゲートパッド11、検出領域12及び13、コントロール領域14並びに吸収領域15を有する多孔性のクロマトグラフィー用部材で構成される。検出領域12及び13、並びにコントロール領域14は、分析用膜17にそれぞれ設けられている。
分析用膜17は、親水性、多孔性及びタンパク質親和性を有するという観点から、ニトロセルロースであることが適当である。
また、サンプルパッド10、コンジュゲートパッド11、分析用膜17及び吸収領域15は、基板16上に、隣り合う部材の末端が重なり合うように配置される。
FIG. 1 shows a cross-sectional explanatory view in the longitudinal direction of the kit of the present invention. As shown in FIG. 1, the kit of the present invention is composed of a porous chromatography member having a sample pad 10, a conjugate pad 11, detection regions 12 and 13, a control region 14 and an absorption region 15 in the longitudinal direction. The The detection regions 12 and 13 and the control region 14 are provided on the analysis film 17, respectively.
The analysis membrane 17 is suitably nitrocellulose from the viewpoint of hydrophilicity, porosity and protein affinity.
Further, the sample pad 10, the conjugate pad 11, the analysis membrane 17, and the absorption region 15 are arranged on the substrate 16 so that the ends of adjacent members overlap each other.
サンプルパッド10は、被検物質を含む試料を供給する領域であり、保水力があり、被検物質との化学反応が起こらない不活性素材から構成されることが適当である。サンプルパッド10は、例えば、コットン素材のペーパーから構成される。 The sample pad 10 is an area for supplying a sample containing a test substance, and is suitably composed of an inert material that has water retention and does not cause a chemical reaction with the test substance. The sample pad 10 is made of, for example, cotton paper.
コンジュゲートパッド11は、被検物質に特異的に結合する物質であって、粒子により標識された物質(コンジュゲート)20及び21を含む領域である。コンジュゲートパッド11を構成するパッドは、例えば、多孔質材質の繊維性フィルター（グラスファイバー）から構成することができる。 The conjugate pad 11 is a region that contains substances (conjugates) 20 and 21 that are specifically bound to a test substance and are labeled with particles. The pad constituting the conjugate pad 11 can be composed of, for example, a porous fibrous filter (glass fiber).
検出領域12及び13は、被検物質に特異的に結合する物質22及び23を含む領域であり、分析用膜17上に設けられる。分析用膜17は、例えば、多孔性のクロマトグラフィー用部材（ニトロセルロースメンブレン）から構成することができる。 The detection regions 12 and 13 are regions including substances 22 and 23 that specifically bind to the test substance, and are provided on the analysis film 17. The analysis membrane 17 can be composed of, for example, a porous chromatography member (nitrocellulose membrane).
コントロール領域14は、コンジュゲートに特異的に結合する物質24を含む領域であり、分析用膜17上に設けられる。 The control region 14 is a region containing a substance 24 that specifically binds to the conjugate, and is provided on the analysis membrane 17.
吸収領域15は、抗原と抗体の特異的な結合が行われるメンブレンから過剰のサンプルを吸収する領域であり、例えば、セルロースフィルターから構成することができる。 The absorption region 15 is a region that absorbs an excessive sample from a membrane in which specific binding between an antigen and an antibody is performed, and can be composed of, for example, a cellulose filter.
前記コンジュゲートを構成する被検物質に特異的に結合する物質は、バベシア・エクイのメロゾイト表面抗原由来の断片化ＥＭＡ−２ｔ抗原（ｒＥＭＡ−２ｔ）及びバベシア・カバリのメロゾイト表面抗原由来の断片化Ｂｃ４８抗原（ｒＢｃ４８）である。バベシア ・エクイのメロゾイト表面抗原由来の断片化ＥＭＡ−２ｔ抗原（ｒＥＭＡ−２ｔ）は、ＥＭＡ−２ｔ遺伝子を鋳型として用いて、組換えEMA-2tタンパク質として調製することができる。バベシア・カバリのメロゾイト表面抗原由来の断片化Ｂｃ４８抗原（ｒＢｃ４８）は、Ｂｃ４８遺伝子を鋳型として用いて、組換えEMA-2tタンパク質として調製することができる。いずれの組換えタンパク質も常法により調製することができ、必要により、例えば、カラムクロマトグラフィーにより精製することもできる。 Substances that specifically bind to the test substance constituting the conjugate include fragmented EMA-2t antigen derived from Babesia Equi merozoite surface antigen (rEMA-2t) and fragmented from Babesia cabari merozoite surface antigen. Bc48 antigen (rBc48). Fragmented EMA-2t antigen (rEMA-2t) derived from Babesia Equi merozoite surface antigen can be prepared as a recombinant EMA-2t protein using the EMA-2t gene as a template. Fragmented Bc48 antigen (rBc48) derived from Babesia cabali merozoite surface antigen can be prepared as a recombinant EMA-2t protein using the Bc48 gene as a template. Any recombinant protein can be prepared by a conventional method, and can be purified by, for example, column chromatography, if necessary.
上記ｒＥＭＡ−２ｔ及びｒＢｃ４８は、粒子により標識されてコンジュゲートを構成する。標識に用いられる粒子は、例えば、金属コロイド粒子又はラテックス粒子であることができる。ここで使用される粒子は、免疫診断法等で、抗原または抗体を標識するのに用いられる粒子をそのまま利用することができる。ｒＥＭＡ−２ｔ及びｒＢｃ４８に対する粒子の標識は、ｒＥＭＡ−２ｔまたはｒＢｃ４８と金属コロイド粒子またはラテックス粒子を混合し、コンジュゲートを形成しなかった金属コロイド粒子またはラテックス粒子を洗い流すことで行われる。金属コロイド粒子またはラテックス粒子による標識は、常法によって行うことができる。 The rEMA-2t and rBc48 are labeled with particles to form a conjugate. The particles used for labeling can be, for example, metal colloid particles or latex particles. As the particles used here, particles used for labeling an antigen or antibody in an immunodiagnostic method or the like can be used as they are. The labeling of the particles for rEMA-2t and rBc48 is performed by mixing rEMA-2t or rBc48 with metal colloid particles or latex particles and washing away the metal colloid particles or latex particles that have not formed a conjugate. Labeling with metal colloid particles or latex particles can be performed by a conventional method.
粒子により標識されたｒＥＭＡ−２ｔコンジュゲート、及び粒子により標識されたｒＢｃ４８コンジュゲートのコンジュゲートパッドへの含有量は、試料中に含まれる被検物質（抗体）量及びを考慮して、ｒＥＭＡ−２ｔ及びｒＢｃ４８の両方について適切な検出感度が得られ、かつコントロール領域において、コントロールラインが形成されるように決定される。具体的には、コントロール領域に固定されている「コンジュゲートに特異的に結合する物質」が、抗ｒＥＭＡ−２ｔ抗体である場合、ｒＥＭＡ−２ｔコンジュゲートのコンジュゲートパッドへの含有量は、試料中に含まれる被検物質（抗体）量を超え、コントロール領域に固定されている抗ｒＥＭＡ−２ｔ抗体とも、反応できる量であることが、コントロールラインが形成されるためには必要である。「コンジュゲートに特異的に結合する物質」が、抗ｒＢｃ４８抗体である場合のｒＢｃ４８コンジュゲートのコンジュゲートパッドへの含有量についても同様である。 The content of the rEMA-2t conjugate labeled with the particles and the rBc48 conjugate labeled with the particles in the conjugate pad is determined in consideration of the amount of the test substance (antibody) contained in the sample and the rEMA- It is determined that appropriate detection sensitivity is obtained for both 2t and rBc48, and that control lines are formed in the control region. Specifically, when the “substance specifically binding to the conjugate” fixed to the control region is an anti-rEMA-2t antibody, the content of the rEMA-2t conjugate in the conjugate pad is In order to form a control line, it is necessary that the amount of the test substance (antibody) contained therein exceeds the amount of the test substance (antibody) contained therein and can be reacted with the anti-rEMA-2t antibody immobilized on the control region. The same applies to the content of the rBc48 conjugate in the conjugate pad when the “substance specifically binding to the conjugate” is an anti-rBc48 antibody.
ｒＥＭＡ−２ｔコンジュゲート及びｒＢｃ４８コンジュゲートのサンプルパッドへの保持は、上記2つのコンジュゲートの混合物を作成し、この混合物を、サンプルパッドを構成するパッド上に、例えば、スプレーし、乾燥することで行うことができる。 The retention of rEMA-2t conjugate and rBc48 conjugate on the sample pad can be accomplished by creating a mixture of the two conjugates and spraying and drying the mixture onto the pad that constitutes the sample pad, for example. It can be carried out.
検出領域12及び13に含まれ、被検物質に特異的に結合する物質22及び23は、具体的には、それぞれｒＥＭＡ−２ｔ及びｒＢｃ４８である。ｒＥＭＡ−２ｔ及びｒＢｃ４８の調製方法は前述の通りである。ｒＥＭＡ−２ｔ及びｒＢｃ４８の検出領域12及び13への固定化量は、ｒＥＭＡ−２ｔ及びｒＢｃ４８の両方について適切な検出感度が得られること等を考慮して、決定される。 Specifically, the substances 22 and 23 included in the detection regions 12 and 13 and specifically binding to the test substance are rEMA-2t and rBc48, respectively. The preparation method of rEMA-2t and rBc48 is as described above. The amount of rEMA-2t and rBc48 immobilized on the detection regions 12 and 13 is determined in consideration of obtaining appropriate detection sensitivity for both rEMA-2t and rBc48.
より具体的には、検出領域12へのｒＥＭＡ−２ｔの固定化量は、例えば、３．５〜６．５μg/cm2の濃度であることが適当である。ｒＥＭＡ−２ｔの固定化量は、約５μg/ cm2の濃度であることが好ましい。検出領域12へのｒＥＭＡ−２ｔの固定化量は、３．５μg/cm2の濃度を下回ると、陽性血清に対しても、識別可能な程度に発色せず、また６．５μg/cm2の濃度を上回ると、陰性血清に対しても、発色してしまう。ｒＥＭＡ−２ｔの固定化量が、約５μg/cm2の濃度であることで、陽性血清に対して適度な発色（識別が容易な程度の発色）が得られる。 More specifically, the amount of rEMA-2t immobilized on the detection region 12 is suitably, for example, a concentration of 3.5 to 6.5 μg / cm 2 . The amount of rEMA-2t immobilized is preferably about 5 μg / cm 2 . When the amount of rEMA-2t immobilized on the detection region 12 is below a concentration of 3.5 μg / cm 2 , the positive serum does not develop a color that can be discerned, and is 6.5 μg / cm 2 . When the concentration is exceeded, color develops even for negative sera. When the immobilized amount of rEMA-2t is a concentration of about 5 μg / cm 2 , an appropriate color (a color that can be easily identified) can be obtained with respect to positive serum.
検出領域13へのｒＢｃ４８の固定化量は、例えば、０．７５〜２μg/cm2の濃度であることが適当である。ｒＢｃ４８の固定化量は、約１．２５μg/cm2の濃度であることが好ましい。検出領域13へのｒＢｃ４８の固定化量は、０．７５μg/cm2の濃度を下回ると、陽性血清に対しても、識別可能な程度に発色せず、また２μg/cm2の濃度を上回ると、陰性血清に対しても、発色してしまう。ｒＢｃ４８の固定化量が、約１．２５μg/cm2の濃度であることで、陽性血清に対して適度な発色（識別が容易な程度の発色）が得られる。 The amount of rBc48 immobilized on the detection region 13 is suitably, for example, a concentration of 0.75 to 2 μg / cm 2 . The amount of rBc48 immobilized is preferably about 1.25 μg / cm 2 . Immobilization of rBc48 to the detection region 13, when the lower concentration of 0.75 [mu] g / cm 2, even for positive serum, not colored enough to be identified, also exceeds the concentration of 2 [mu] g / cm 2 Color develops even for negative sera. When the amount of rBc48 immobilized is about 1.25 μg / cm 2 , an appropriate color (a color that can be easily identified) can be obtained with respect to positive serum.
より具体的には、ｒＥＭＡ−２ｔが３．５〜６．５μg/cm2の濃度で検出領域に含まれ、かつｒＥＭＡ−２ｔのコンジュゲートがｒＥＭＡ−２ｔとして５〜１５μg/cm2の濃度でコンジュゲートパッドに含まれること、さらには、ｒＢｃ４８が０．７５〜２μg/cm2の濃度で検出領域に含まれ、かつｒＢｃ４８のコンジュゲートがｒＢｃ４８として３．１２５〜１２．５μg/cm2の濃度でコンジュゲートパッドに含まれることが、バベシア・エクイ（Ｂａｂｅｓｉａ ｅｑｕｉ）感染及びバベシア・カバリ（Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｂａｌｌｉ）感染を同時に、かつ確実に判定する、という観点から好ましい。 More specifically, rEMA-2t is included in the detection region at a concentration of 3.5 to 6.5 μg / cm 2 , and rEMA-2t conjugate is rEMA-2t at a concentration of 5 to 15 μg / cm 2 . In addition to being included in the conjugate pad, rBc48 is included in the detection region at a concentration of 0.75 to 2 μg / cm 2 , and the rBc48 conjugate is a concentration of 3.125 to 12.5 μg / cm 2 as rBc48. It is preferable to be included in the conjugate pad from the viewpoint of simultaneously and reliably determining a Babesia equi infection and a Babesia caballi infection.
ｒＥＭＡ−２ｔを含む検出領域12とｒＢｃ４８を含む検出領域13とは、この順に設けても、逆に、ｒＢｃ４８を含む検出領域13が上流、ｒＥＭＡ−２ｔを含む検出領域12が下流になってもよい。 Even if the detection region 12 including rEMA-2t and the detection region 13 including rBc48 are provided in this order, the detection region 13 including rBc48 is upstream and the detection region 12 including rEMA-2t is downstream. Good.
コントロール領域14は、コンジュゲートに特異的に結合する物質24を含む。コンジュゲートに特異的に結合する物質24は、例えば、抗ｒＥＭＡ−２ｔ抗体、抗ｒＢｃ４８抗体等であることができる。抗ｒＥＭＡ−２ｔ抗体は、具体的には、抗ｒＥＭＡ−２ｔＩｇＧ等であることができる。抗ｒＢｃ４８抗体は、具体的には、抗ｒＢｃ４８ＩｇＧ等であることができる。 The control region 14 includes a substance 24 that specifically binds to the conjugate. The substance 24 that specifically binds to the conjugate can be, for example, an anti-rEMA-2t antibody, an anti-rBc48 antibody, or the like. Specifically, the anti-rEMA-2t antibody can be anti-rEMA-2tIgG or the like. Specifically, the anti-rBc48 antibody can be anti-rBc48IgG or the like.
コントロール領域14へコンジュゲートに特異的に結合する物質24の含有量は、コントロール領域に到達したコンジュゲート（21または22）とコンジュゲートに特異的に結合する物質24とが結合して、識別可能な程度のコントロールラインが形成されること等を考慮して適宜決定できる。 The content of the substance 24 that specifically binds to the conjugate to the control region 14 can be identified by the combination of the conjugate (21 or 22) that has reached the control region and the substance 24 that specifically binds to the conjugate. It can be appropriately determined in consideration of the formation of a certain degree of control line.
本発明のキットを用いて検出される被検物質は、バベシア・エクイのメロゾイト表面抗原に対する抗体及バベシア・カバリのメロゾイト表面抗原に対する抗体である。被験体であるウマから採取した血液を、そのまま、あるいは血清を分離して、検査試料(溶液)として用いる。 The test substance detected using the kit of the present invention is an antibody against the Babesia Equi merozoite surface antigen and an antibody against the Babesia cabali merozoite surface antigen. Blood collected from a subject's horse is used as a test sample (solution) as it is or after serum is separated.
本発明のキットでは、検査試料(溶液)をサンプルパッド10に供給する。サンプルパッド10に供給された検査試料は、毛細管現象により、サンプルパッド10からコンジュゲートパッド11に移動する。コンジュゲートパッド11からは、コンジュゲートパッド11に含有されていた、ｒＥＭＡ−２ｔコンジュゲート及びｒＢｃ４８コンジュゲートも、検査試料とともに、分析用膜17に移動する。分析用膜17上では、検出領域12、検出領域13、及びコントロール領域14の順に、コンジュゲートを含む検査試料が移動する。 In the kit of the present invention, a test sample (solution) is supplied to the sample pad 10. The test sample supplied to the sample pad 10 moves from the sample pad 10 to the conjugate pad 11 by capillary action. From the conjugate pad 11, the rEMA-2t conjugate and the rBc48 conjugate contained in the conjugate pad 11 also move to the analysis membrane 17 together with the test sample. On the analysis membrane 17, the test sample containing the conjugate moves in the order of the detection region 12, the detection region 13, and the control region 14.
検出領域12には、ｒＥＭＡ−２ｔが固定化されており、検査試料にバベシア・エクイのメロゾイト表面抗原に対する抗体が含まれていると、この抗体とｒＥＭＡ−２ｔコンジュゲートとが結合し、さらに、この結合体の抗体部分が、検出領域12のｒＥＭＡ−２ｔと結合して、コンジュゲートの凝集体を形成して、発色する。 When rEMA-2t is immobilized in the detection region 12, and the test sample contains an antibody against the Babesia Equi merozoite surface antigen, this antibody and the rEMA-2t conjugate bind, The antibody portion of this conjugate binds to rEMA-2t in the detection region 12 to form an aggregate of the conjugate and develop color.
検出領域13にはｒＢｃ４８が固定化されており、検査試料にバベシア・カバリのメロゾイト表面抗原に対する抗体が含まれていると、この抗体とｒＢｃ４８コンジュゲートが結合し、さらに、この結合体の抗体部分が、検出領域13のｒＢｃ４８と結合して、コンジュゲートの凝集体を形成して、発色する。 When rBc48 is immobilized in the detection region 13 and the test sample contains an antibody against the Babesia cabari merozoite surface antigen, this antibody and rBc48 conjugate bind, and the antibody portion of this conjugate Binds to rBc48 in the detection region 13 to form an aggregate of the conjugate and develop color.
本発明のキットは、バベシア・エクイ（Ｂａｂｅｓｉａ ｅｑｕｉ）感染及びバベシア・カバリ（Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｂａｌｌｉ）感染を同時に、かつ確実に判定できることを目的とするキットである。そのため、本発明においては、粒子により標識されたｒＥＭＡ−２ｔ(コンジュゲート20)及び粒子により標識されたｒＢｃ４８(コンジュゲート21)は、コンジュゲートパッド11から、ほぼ並行して分析用膜17上を移動して検出領域12及び13、さらには、コントロール領域14に達するように、コンジュゲート20及びコンジュゲート21の混合物をコンジュゲートパッド11に含有させている。 The kit of the present invention is a kit intended to be able to simultaneously and reliably determine Babesia equi infection and Babesia caballi infection. Therefore, in the present invention, rEMA-2t (conjugate 20) labeled with particles and rBc48 (conjugate 21) labeled with particles travel on the analysis membrane 17 almost in parallel from the conjugate pad 11. A mixture of the conjugate 20 and the conjugate 21 is contained in the conjugate pad 11 so as to move to reach the detection regions 12 and 13 and further to the control region 14.
検出領域12及び検出領域13を通過したコンジュゲートを含む検査試料(溶液)は、コントロール領域14に達する。コントロール領域14には、例えば、前述のように抗ｒＥＭＡ−２ｔ抗体または抗ｒＢｃ４８抗体が固定化されており、試料含まれるコンジュゲーとこれらの抗体が反応してコンジュゲートの凝集体を形成して、発色する。これにより、コンジュゲートを含む検査試料(溶液)が、検出領域12及び検出領域13を通過したことを判定できる。 The test sample (solution) containing the conjugate that has passed through the detection region 12 and the detection region 13 reaches the control region 14. For example, as described above, the anti-rEMA-2t antibody or the anti-rBc48 antibody is immobilized on the control region 14, and the conjugate contained in the sample reacts with these antibodies to form an aggregate of the conjugate. Color develops. Thereby, it can be determined that the test sample (solution) containing the conjugate has passed through the detection region 12 and the detection region 13.
検出領域12及び検出領域13のいずれもが発色すれば、バベシア・エクイ（Ｂａｂｅｓｉａ ｅｑｕｉ）及びバベシア・カバリ（Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｂａｌｌｉ）の両方の感染に対して陽性である。検出領域12及び検出領域13のいずれか一方が発色せず、コントロール領域14が発色すれば、検出領域が発色した方の感染のみ陽性である。または両方の検出領域ともに発色せず、コントロール領域14が発色すれば、いずれの感染に対しても陰性である。 If both detection region 12 and detection region 13 develop color, then it is positive for both Babesia equi and Babesia caballi infections. If one of the detection region 12 and the detection region 13 does not develop color and the control region 14 develops color, only the infection in which the detection region develops is positive. Alternatively, if both detection areas do not develop color and the control area 14 develops color, it is negative for any infection.
本発明のキットについて、以下に実施例によりさらに詳細に説明する。 The kit of the present invention will be described in more detail with reference to the following examples.
組換え抗原rEMA-2tの調製
EMA-2t遺伝子をオリゴヌクレオチド5'-ACGAATTCCGATGAGGCACCAAAG-3' (配列番号1), 及び 5'-ACGAATTCTTATTGGGTCTTGTAG-3' (配列番号2)のセットをプライマーとし、B. equiのUSDA株(USDA: U.S. Department of Agriculture) から抽出したゲノムDNAを鋳型として用いて増幅した。増幅DNAは、pGEX-4TのEcoRI部位に挿入しE. coli のDH5α 株を形質転換した。得られた組換えプラスミドをクローニングし、pGEX-4T/EMA-2tとした。pGEX-4T/EMA-2tで形質転換したE. coliクローンを50 μg/ml のアンピシリンナトリウムを含むLB 培地 (1% bacto treptone, 0.5% 酵母抽出物, 1% NaCl, 及び 0.1% 5 N NaOH)で37(Cで培養した。OD 600 nm が0.30に達したとき、0.5 mM IPTGを添加し、さらに4時間インキュベートすることにより組換えEMA-2tタンパク質を発現するようにE. coliを誘導した。GSTと融合した組換えEMA-2tタンパク質は、100 μg/ml のリゾチーム及び 1% Triton X-100を含むTNE (50 mM Tris-HCl at pH 7.5, 100 mM NaCl, 及び2 mM EDTA)で超音波を加えながら抽出し、Glutathione Sepharose 4B (Amersham Pharmarcia Biotech, USA)を用いて可溶性フラクションから精製した。スロンビンプロテアーゼを用いて融合タンパク質からGSTを除去した後に、組換えEMA-2tをメーカー推奨の方法に従い、Glutathion Sepharose 4B（グルタチオンセファロース4B）カラムにて精製した。
Preparation of recombinant antigen rEMA-2t
The EMA-2t gene was used as a primer for oligonucleotides 5'-ACGAATTCCGATGAGGCACCAAAG-3 '(SEQ ID NO: 1) and 5'-ACGAATTCTTATTGGGTCTTGTAG-3' (SEQ ID NO: 2), and B. equi's USDA strain (USDA: US Department) of agriculture) was used as a template for amplification. The amplified DNA was inserted into the EcoRI site of pGEX-4T and transformed into E. coli DH5α strain. The obtained recombinant plasmid was cloned to obtain pGEX-4T / EMA-2t. LB medium containing 50 μg / ml ampicillin sodium (1% bacto treptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, and 0.1% 5 N NaOH) for E. coli clones transformed with pGEX-4T / EMA-2t Incubated at 37 (C. When OD 600 nm reached 0.30, 0.5 mM IPTG was added and further incubated for 4 hours to induce E. coli to express recombinant EMA-2t protein. Recombinant EMA-2t protein fused with GST was sonicated with TNE (50 mM Tris-HCl at pH 7.5, 100 mM NaCl, and 2 mM EDTA) containing 100 μg / ml lysozyme and 1% Triton X-100. Extracted from the soluble fraction using Glutathione Sepharose 4B (Amersham Pharmarcia Biotech, USA) After removing GST from the fusion protein using thrombin protease, recombinant EMA-2t was prepared according to the manufacturer's recommended method. Purify on Glutathion Sepharose 4B column It was.
組換え抗原rBc48の調製
pGEX-4T/Bc48で形質転換した E. coli (BL21 strain) コロニーを37℃で一晩、50 μg/ml のアンピシリンナトリウムとともにLB培地(1% bacto treptone, 0.5% 酵母抽出物, 1% NaCl, 及び 0.1% 5 N NaOH) で小スケールで培養した。得られた培養物をLB mediumに1:100で希釈し、25Cでの大規模培養に供した。OD 600 nm が0.50に達したとき、0.5 mM IPTGを添加し、さらに25℃で4時間インキュベーションして組換えBc48タンパク質を発現するように誘導した。抽出及び精製の操作方法は、上記rEMA-2tと同様とした。
Preparation of recombinant antigen rBc48
E. coli (BL21 strain) colonies transformed with pGEX-4T / Bc48 were grown overnight at 37 ° C with 50 μg / ml ampicillin sodium in LB medium (1% bacto treptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, And 0.1% 5 N NaOH). The resulting culture was diluted 1: 100 in LB medium and subjected to large scale culture at 25C. When OD 600 nm reached 0.50, 0.5 mM IPTG was added and further incubated at 25 ° C. for 4 hours to induce expression of recombinant Bc48 protein. The operation method of extraction and purification was the same as that of the above rEMA-2t.
コンジュゲートの調製
rEMA-2t 及びrBc48の濃度をそれぞれ200 μg/ml及び125 μg/mlとした。rEMA-2tを5 mMリン酸緩衝液(pH6.5)で透析し、rBc48 を5 mM phosphate buffer (pH 8.0)で透析した。rEMA-2t 及び rBc48は、それぞれ、抗原及び金コロイド粒子 (1:10 v/v)と混合し、室温で10分間インキュベートすることで、金コロイド (British BioCell International, SDX, UK)と 、pH 6.5 及び pH 8.0でそれぞれコンジュゲートした。次いで、0.05%ポリエチレングリコール20,000 (PEG) 及び 1%牛血清アルブミン(BSA)を添加して安定化し、コンジュゲート粒子をブロックした。18,000 × g で 20 min遠心分離した後、上澄み液を捨て、ペレットを超音波により再懸濁してPBS-0.5% BSA 及び0.05% PEGを含んだ液で洗浄した。2回目の遠心分離の後、ペレットをPBS-0.5% BSA 及び 0.05% PEGを含んだ液で再懸濁した。コンジュゲートの濃度は、520 nm 吸光度が5に達するまで調整した。2つのコンジュゲートは、混合し、10 mM Tris-HCl (pH 8.2) -5%サッカロースを含んだ液で希釈した。次いで、混合物はグラスファイバー(Schleicher & Schuell, NH, USA)上にスプレーし、真空中で一晩乾燥した。
Conjugate preparation
The concentrations of rEMA-2t and rBc48 were 200 μg / ml and 125 μg / ml, respectively. rEMA-2t was dialyzed against 5 mM phosphate buffer (pH 6.5), and rBc48 was dialyzed against 5 mM phosphate buffer (pH 8.0). rEMA-2t and rBc48 were mixed with antigen and colloidal gold particles (1:10 v / v) and incubated at room temperature for 10 minutes to allow colloidal gold (British BioCell International, SDX, UK) and pH 6.5. And pH 8.0, respectively. 0.05% polyethylene glycol 20,000 (PEG) and 1% bovine serum albumin (BSA) were then added to stabilize and block the conjugate particles. After centrifugation at 18,000 × g for 20 min, the supernatant was discarded, and the pellet was resuspended by sonication and washed with a solution containing PBS-0.5% BSA and 0.05% PEG. After the second centrifugation, the pellet was resuspended in a solution containing PBS-0.5% BSA and 0.05% PEG. The concentration of the conjugate was adjusted until the 520 nm absorbance reached 5. The two conjugates were mixed and diluted with a solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 8.2) -5% saccharose. The mixture was then sprayed onto glass fiber (Schleicher & Schuell, NH, USA) and dried overnight in vacuo.
Rabbit Anti-rEMA-2t IgG
1ml の完全フロイントアジュバント(DIFCO Laboratories, MI, USA)と混合した1 ml のrEMA-2t (2mg/ml)で、背中に複数回皮内注射することでラビットを免疫した。完全フロイントアジュバント(DIFCO Laboratories, MI, USA)と混合した抗原を同投与量で2週間の間隔で2回の追加免疫を行った。最後の免疫から10日後に全採血した。IgGフラグメントは、メーカーの推奨方法に従い、Econo-Pac（登録商標）Protein A Kit (Bio-Rad Laboratories, CA, USA)を用いてその血清から精製し、ICTのコントロールとして用いた。
Rabbit Anti-rEMA-2t IgG
Rabbits were immunized by multiple intradermal injections on the back with 1 ml of rEMA-2t (2 mg / ml) mixed with 1 ml of complete Freund's adjuvant (DIFCO Laboratories, MI, USA). The antigen mixed with complete Freund's adjuvant (DIFCO Laboratories, MI, USA) was boosted twice at the same dose at intervals of 2 weeks. Whole blood was collected 10 days after the last immunization. The IgG fragment was purified from the serum using the Econo-Pac (registered trademark) Protein A Kit (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) according to the manufacturer's recommended method, and used as an ICT control.
ニトロセルロース(NC)膜への rEMA-2t, rBc48 及びラビット抗-rEMA-2t IgG の固定化
rEMA-2t (500 μg/ml), rBc48 (125 μg/ml) 及びラビット抗-rEMA-2t IgG (1,500 μg/ml) をプラスチック材(Schleicher & Schuell, NH, USA)で裏張りしたNC上に、BioDot's Biojet 3050 quanti-dispenser (BioDot Inc., CA, USA)を用いてB. equiのテスト領域、B. caballiのテスト領域及びコントロール領域にそれぞれ線状に噴射した。次いで、この膜を50度で30分乾燥し、0.5% caseinを含む50 mMホウ酸緩衝液(pH 8.5)中で30分間ブロックした。0.5%サッカロース及び0.05%コール酸ナトリウムを含む50mM Tris-HCl(pH 7.4)で洗浄した後、膜を空気中で一晩乾燥した。rEMA-2t (500 μg/ml)は、 5μg/cm2の濃度となるように塗布した。また、rBc48 (125 μg/ml)は、1.25μg/cm2の濃度となるように塗布した。
Immobilization of rEMA-2t, rBc48 and rabbit anti-rEMA-2t IgG on nitrocellulose (NC) membrane
rEMA-2t (500 μg / ml), rBc48 (125 μg / ml) and rabbit anti-rEMA-2t IgG (1,500 μg / ml) on NC lined with plastic material (Schleicher & Schuell, NH, USA) Using a BioDot's Biojet 3050 quanti-dispenser (BioDot Inc., CA, USA), the B. equi test area, the B. caballi test area, and the control area were each injected linearly. The membrane was then dried at 50 degrees for 30 minutes and blocked in 50 mM borate buffer (pH 8.5) containing 0.5% casein for 30 minutes. After washing with 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 0.5% sucrose and 0.05% sodium cholate, the membrane was dried in air overnight. rEMA-2t (500 μg / ml) was applied to a concentration of 5 μg / cm 2 . RBc48 (125 μg / ml) was applied to a concentration of 1.25 μg / cm 2 .
テストストリップの組み立て及び検出
セルロースメンブレン(NC)、吸収パッド、コンジュゲートパッド、サンプルパッド、粘着カード(Schleicher & Schuell, NH, USA)上に組み立て、BioDot's cutter (BioDot Inc., CA, USA)を用いて、6mm幅のストリップに切断した。作製したキットを用い、検出は、サンプルパッドに血清100 μlを滴下することで行った。結果は、15分以内に判定し、以下の通りに記録できた。結果を図４に示す。
レーン1： 使用前のキット
レーン２： 両バベシア症ともに陽性の血清
レーン３： バベシア・カバリ（B. caballi） 症は陽性で バベシア・エクイ（B. equi）症は陰性の血清
レーン４： バベシア ・エクイ（B. equi）症は陽性でバベシア ・カバリ（B. caballi）症は陰性の血清
レーン５： 両バベシア症ともに陰性の血清
Test strip assembly and detection Cellulose membrane (NC), absorbent pad, conjugate pad, sample pad, assembled on adhesive card (Schleicher & Schuell, NH, USA), using BioDot's cutter (BioDot Inc., CA, USA) And cut into 6 mm wide strips. Using the prepared kit, detection was performed by dropping 100 μl of serum onto the sample pad. The result was judged within 15 minutes and could be recorded as follows. The results are shown in FIG.
Lane 1: Kit before use Lane 2: Positive sera for both babesiosis Lane 3: B. caballi seropositive and Babesia Equi seronegative Lane 4: Babesia Sera positive for B. equi and negative for B. caballi Lane 5: Sera negative for both babesiosis
２種類のウマバベシア感染を同時に診断する簡易キットの条件検討
１）抗原と金コロイドの結合条件の検討
１．rEMA-2tの場合
抗原量の検討：5μg/cm2、10μg/cm2、15μg/cm2及び20μg/cm2の濃度で検討したところ、10μg/cm2で、もっとも良好な結合が認められた。
ｐＨの検討：6.0、6.5、7.0の３点で検討したところ、6.5で一番強い結合が認められた。
Examination of conditions of simple kit for simultaneous diagnosis of two types of equine Babesia infections 1) Examination of antigen and gold colloid binding conditions Examination of cases amounts antigen rEMA-2t: 5μg / cm 2 , 10μg / cm 2, was examined at a concentration of 15 [mu] g / cm 2 and 20 [mu] g / cm 2, at 10 [mu] g / cm 2, most good binding was observed .
Examination of pH: Examining at three points of 6.0, 6.5 and 7.0, the strongest binding was observed at 6.5.
２．rBC48の場合
抗原量の検討： 3.125μg/cm2、6.25μg/cm2、及び12.5μg/cm2の濃度で検討したところ、6.25μg/cm2で、もっとも良好な結合が認められた。
ｐＨの検討：7.0、8.0、9.0の３点で検討したところ、8.0で一番強い結合が認められた。
2. Examination of cases amounts antigen rBC48: 3.125μg / cm 2, was examined at a concentration of 6.25 [mu] g / cm 2, and 12.5 [mu] g / cm 2, at 6.25 [mu] g / cm 2, most good binding was observed.
Examination of pH: When examined at three points of 7.0, 8.0 and 9.0, the strongest bond was recognized at 8.0.
２）抗原のセルロースメンブレンへの塗布条件の検討
１．rEMA-2tの場合
抗原量の検討：2.5、5、7.5μg/cm2の濃度で検討したところ、5μg/ cm2で、バックグランドも認められず強いバンドが認められた。結果を図２に示す。
2) Examination of application conditions of antigen to cellulose membrane study of the case where the amount of antigen of rEMA-2t: was examined at a concentration of 2.5,5,7.5μg / cm 2, at 5μg / cm 2, strong band also not observed background was observed. The results are shown in FIG.
２．rBC48の場合
抗原量の検討：0.625、1.25、2.5μg/cm2 の濃度で検討したところ、1.25μg/cm2で、バックグランドも認められず強いバンドが認められた。結果を図３に示す。
2. study of the case where the amount of antigen of rBC48: was examined at a concentration of 0.625,1.25,2.5μg / cm 2, at 1.25μg / cm 2, strong band also not observed background was observed. The results are shown in FIG.
３）ニトロセルロースメンブレンのフローレートの検討
３種類のニトロセルロースメンブレンのフローレート(FF60/100(40〜80sec/4cm)、FF85/100(75〜100sec/4cm)及びFF125/100(100〜150sec/4cm)) を検討したところ、FF60/100のフローレートのニトロセルロースメンブレンで非特異的が一番少なく、高い感度が得られた。
3) Examination of flow rate of nitrocellulose membrane Three types of nitrocellulose membrane flow rate (FF60 / 100 (40-80sec / 4cm), FF85 / 100 (75-100sec / 4cm) and FF125 / 100 (100-150sec /) 4cm)), the non-specificity of the FF60 / 100 flow rate nitrocellulose membrane was the least and high sensitivity was obtained.
本診断キットは、２種類のウマバベシア病を短時間に簡便に診断可能である。
現在検疫所で用いられている方法（CF，IFA）にとって変われば、本疫のクリーニング法として極めて有利であり、馬の貿易促進に大いに役立つと期待される。
This diagnostic kit can easily diagnose two types of equine Babesia diseases in a short time.
If it changes to the method currently used at the quarantine station (CF, IFA), it is very advantageous as a cleaning method for the plague, and is expected to greatly help promote the trade of horses.
Claims (5)
長手方向にサンプルパッド、コンジュゲートパッド、検出領域、コントロール領域及び吸収領域を、この順に有する多孔性のクロマトグラフィー用部材で構成され、
前記サンプルパッドは、被検物質を含む試料を供給する領域であり、
前記コンジュゲートパッドは、被検物質に特異的に結合する物質であって, 粒子により標識された物質であるコンジュゲートを含む領域であり、
前記検出領域は、被検物質に特異的に結合する物質を含む領域であり、
前記コントロール領域は、コンジュゲートに特異的に結合する物質を含む領域であり、
前記吸収領域は、液体吸収用物質を含む領域であり、
前記被検物質に特異的に結合する物質が、バベシア・エクイのメロゾイト表面抗原由来の断片化ＥＭＡ−２ｔ抗原（ｒＥＭＡ−２ｔ）及びバベシア・カバリのメロゾイト表面抗原由来の断片化Ｂｃ４８抗原（ｒＢｃ４８）である、
前記キット。 An immunochromatography kit capable of simultaneously determining Babesia equi infection and Babesia caballi infection,
It is composed of a porous chromatography member having a sample pad, a conjugate pad, a detection region, a control region and an absorption region in this order in the longitudinal direction,
The sample pad is an area for supplying a sample containing a test substance,
The conjugate pad is a region containing a conjugate that is a substance that specifically binds to a test substance and is a substance labeled with particles,
The detection region is a region containing a substance that specifically binds to a test substance,
The control region is a region containing a substance that specifically binds to the conjugate,
The absorption region is a region containing a liquid absorbing substance,
The substance that specifically binds to the test substance is a fragmented EMA-2t antigen (rEMA-2t) derived from Babesia Equi merozoite surface antigen and a fragmented Bc48 antigen derived from Babesia cabari merozoite surface antigen (rBc48) Is,
Said kit.
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