JP2006180828A - Method for evaluating cyclooxygenase inhibition selectivity of compound and screening method applying the evaluation method - Google Patents

Method for evaluating cyclooxygenase inhibition selectivity of compound and screening method applying the evaluation method Download PDF

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公子 數村
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for simply and quickly evaluating COX (cyclooxygenase) inhibition selectivity. <P>SOLUTION: This method for evaluating the cyclooxygenase inhibition selectivity of a compound comprises stimulating neutrophils in the presence or absence of the compound, measuring the intracellular Ca<SP>2+</SP>concentration and superoxide production quantity of the neutrophils, and evaluating the COX inhibition selectivity of the compound on the basis of the measurement result. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、化合物のシクロオキシゲナーゼ阻害の選択性を評価する方法及びその評価方法を応用したスクリーニング方法に関する。   The present invention relates to a method for evaluating the selectivity of a compound for inhibiting cyclooxygenase and a screening method using the evaluation method.

抗炎症薬としてよく使用されている非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）の主な作用機序は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害による、炎症性メディエーターであるプロスタグランジン（ＰＧｓ）合成阻害である。ＣＯＸには、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の２つのアイソザイムが存在することが知られている（例えば、非特許文献１）。ＣＯＸ−１は全ての細胞に存在する構成型の酵素であり、胃粘膜細胞の保護や正常な腎機能維持、止血作用など、生体保護に関与するＰＧｓを合成する。それに対して、ＣＯＸ−２は誘導型であり、炎症刺激によって様々な炎症関連細胞において発現が誘導され、特に、炎症に関与するＰＧｓがＣＯＸ−２を介して産生される。   The main mechanism of action of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), which are often used as anti-inflammatory drugs, is the inhibition of synthesis of prostaglandins (PGs), which are inflammatory mediators, by cyclooxygenase (COX) inhibition. It is known that COX has two isozymes, COX-1 and COX-2 (for example, Non-Patent Document 1). COX-1 is a constitutive enzyme present in all cells, and synthesizes PGs involved in biological protection such as protection of gastric mucosa cells, maintenance of normal renal function, and hemostasis. In contrast, COX-2 is inducible, and its expression is induced in various inflammation-related cells by inflammatory stimuli. In particular, PGs involved in inflammation are produced via COX-2.

ＮＳＡＩＤｓは、その種類によってＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２への選択性が異なり、ＣＯＸ−２を選択的に阻害するＮＳＡＩＤｓは胃腸障害などの副作用を引き起こす可能性が低いと考えられている。したがって、ＮＳＡＩＤｓのＣＯＸ選択性を評価することは臨床上及び薬の開発上、重要なことである。   NSAIDs have different selectivity for COX-1 and COX-2 depending on their types, and NSAIDs that selectively inhibit COX-2 are considered to be less likely to cause side effects such as gastrointestinal disorders. Therefore, evaluating the COX selectivity of NSAIDs is important for clinical and drug development.

ＣＯＸ阻害の選択性を評価する方法として、以下のものが知られている。
（１）ヒト絨毛刺激ホルモンで刺激したラット前排卵卵胞の顆粒膜細胞の抽出液から、ＣＯＸ−１酵素及びＣＯＸ−２酵素を単離し、過酸化水素を基質として各酵素のパーオキシダーゼ活性を測定する方法（非特許文献２）。
（２）マウスのＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２のいずれか一方のみをトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞由来）を用いる方法（非特許文献３）。
（３）ＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２のいずれか一方のみを専ら発現しているヒトの全血由来の成分を使用する方法（非特許文献４）。 The following methods are known as methods for evaluating the selectivity of COX inhibition.
(1) From the extract of granulosa cells of rat preovulatory follicles stimulated with human chorionic hormone, COX-1 and COX-2 enzymes are isolated, and peroxidase activity of each enzyme is measured using hydrogen peroxide as a substrate. Method (Non-patent Document 2).
(2) A method using COS-1 cells (derived from African green monkey kidney cells) transfected with only either mouse COX-1 or COX-2 (Non-patent Document 3).
(3) A method of using a component derived from human whole blood exclusively expressing only one of COX-1 or COX-2 (Non-patent Document 4).

Byron Cryer et al., Prostaglandins & other Lipid Mediators, vol. 56, pp. 341-361 (1998)Byron Cryer et al., Prostaglandins & other Lipid Mediators, vol. 56, pp. 341-361 (1998) Jean Sirois et al., The Journal of Biological Chemistry, vol. 267, pp. 6382-6388 (1992)Jean Sirois et al., The Journal of Biological Chemistry, vol. 267, pp. 6382-6388 (1992) Elizabeth A. Meade et al., Journal of Lipid mediators, vol. 6, pp. 119-129 (1993)Elizabeth A. Meade et al., Journal of Lipid mediators, vol. 6, pp. 119-129 (1993) C. Brideau et al., Inflammation Research, vol. 45, pp. 68-74 (1996)C. Brideau et al., Inflammation Research, vol. 45, pp. 68-74 (1996)

しかしながら、上記（１）及び（２）の方法では、種差があるためＣＯＸの構造及び活性に違いがあり、ヒトにおけるＮＳＡＩＤｓのＣＯＸ選択性を評価するには不適当である。また、酵素や細胞の調製といった手間がかかり、酵素活性やｍＲＮＡの発現量を測定するため、評価に時間がかかるという問題点もある。上記（３）のヒトの全血を使用する方法は、ヒトのＣＯＸを利用しているという利点もあるが、成分の分離の煩雑さや、個体差によるばらつきが大きい等の問題点も多い。また、放射性物質を使用するため、被爆や廃棄の制限も大きな問題となる。さらに、この方法は刺激によってＣＯＸ−２が発現し、それによって合成されるＰＧｓを測定するため、２４時間以上の培養が必要となり、迅速性にも欠ける。   However, the methods (1) and (2) above are different in the structure and activity of COX due to species differences, and are not suitable for evaluating the COX selectivity of NSAIDs in humans. In addition, it takes time and effort to prepare enzymes and cells, and the enzyme activity and the expression level of mRNA are measured. The method (3) using human whole blood has the advantage of using human COX, but there are also many problems such as complicated separation of components and large variations due to individual differences. In addition, since radioactive materials are used, restrictions on exposure and disposal are also a major problem. Furthermore, since this method measures COG-2 expressed by stimulation and measures PGs synthesized by the expression, it requires culture for 24 hours or more, and lacks rapidity.

したがって、本発明の目的は、簡便かつ迅速にＣＯＸ阻害の選択性を評価する方法を提供することにある。本発明の別の目的は、ＣＯＸ阻害の選択性の評価方法を応用したスクリーニング方法を提供することにある。   Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for evaluating the selectivity of COX inhibition simply and quickly. Another object of the present invention is to provide a screening method applying the method for evaluating the selectivity of COX inhibition.

本発明者は、ＮＳＡＩＤｓのＣＯＸ阻害の選択性と、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量に与えるＮＳＡＩＤｓの影響との間に、一定の関係があることを見出し、本発明を完成させた。 The present inventor has found that there is a certain relationship between the selectivity of NSAIDs for COX inhibition and the influence of NSAIDs on the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production of neutrophils. Completed.

すなわち、本発明は、化合物のシクロオキシゲナーゼ阻害の選択性を評価する方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が変化せず、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を、シクロオキシゲナーゼ−１を選択的に阻害する化合物であると評価し、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少しない化合物を、シクロオキシゲナーゼを非選択的に阻害する化合物であると評価し、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を、シクロオキシゲナーゼ−２を選択的に阻害する化合物であると評価する工程と、
を備える方法を提供する。 That is, the present invention is a method for evaluating the selectivity of a compound for cyclooxygenase inhibition,
Stimulating neutrophils or neutrophil-like cultured cells in the presence and absence of compounds in the presence and absence of Ca 2+ chelating agents;
Measuring the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production of neutrophils or neutrophil-like cultured cells;
In the absence of a Ca 2+ chelating agent, the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound does not change as compared to the absence of the compound, the amount of superoxide produced does not change, and the Ca 2+ does not change. In the presence of a chelating agent, a compound having a reduced intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound and a decrease in superoxide production as compared to the absence of the compound and cyclooxygenase-1 are selectively used. Evaluate the compound as an inhibitor,
In the absence of a Ca 2+ chelator, the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound is reduced compared to the absence of the compound, and the amount of superoxide produced is reduced, and the Ca 2+ chelator Inhibits cyclooxygenase non-selectively in a compound that does not decrease intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound and does not decrease the amount of superoxide produced in the presence of the compound as compared to the absence of the compound. Evaluate it as a compound,
In the absence of a Ca 2+ chelator, the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound is reduced compared to the absence of the compound, and the amount of superoxide produced is reduced, and the Ca 2+ chelator Selectively inhibits cyclooxygenase-2 in compounds with reduced intracellular Ca 2+ concentration and reduced superoxide production in the presence of compound in the presence of compound A step of evaluating it as a compound;
A method comprising:

上記方法によれば、ＣＯＸ酵素やＣＯＸをトランスフェクトした細胞を調製する必要がなく、かつ、ＣＯＸの酵素活性やＣＯＸのｍＲＮＡの発現量を測定する必要もないため、簡便かつ迅速に評価することが可能である。   According to the above method, it is not necessary to prepare cells transfected with COX enzyme or COX, and it is not necessary to measure the enzyme activity of COX or the expression level of COX mRNA. Is possible.

本発明は、また、上記評価方法を応用した以下のスクリーニング方法を提供する。
［１］ シクロオキシゲナーゼ−１を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が変化せず、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程と、
を備える方法。 The present invention also provides the following screening method applying the above evaluation method.
[1] A method for screening a compound that selectively inhibits cyclooxygenase-1,
Stimulating neutrophils or neutrophil-like cultured cells in the presence and absence of compounds in the presence and absence of Ca 2+ chelating agents;
Measuring the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production of neutrophils or neutrophil-like cultured cells;
In the absence of a Ca 2+ chelating agent, the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound does not change as compared to the absence of the compound, the amount of superoxide produced does not change, and the Ca 2+ does not change. In the presence of a chelating agent, selecting a compound that has a reduced intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound as compared to the absence of the compound and that reduces superoxide production;
A method comprising:

［２］ シクロオキシゲナーゼを非選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少しない化合物を選択する工程と、
を備える方法。 [2] A method for screening a compound that non-selectively inhibits cyclooxygenase,
Stimulating neutrophils or neutrophil-like cultured cells in the presence and absence of compounds in the presence and absence of Ca 2+ chelating agents;
Measuring the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production of neutrophils or neutrophil-like cultured cells;
In the absence of a Ca 2+ chelator, the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound is reduced compared to the absence of the compound, and the amount of superoxide produced is reduced, and the Ca 2+ chelator Selecting a compound that does not decrease intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound and does not decrease superoxide production in the presence of the compound compared to the absence of the compound;
A method comprising:

［３］ シクロオキシゲナーゼ−２を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程と、
を備える方法。 [3] A method for screening a compound that selectively inhibits cyclooxygenase-2,
Stimulating neutrophils or neutrophil-like cultured cells in the presence and absence of compounds in the presence and absence of Ca 2+ chelating agents;
Measuring the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production of neutrophils or neutrophil-like cultured cells;
In the absence of a Ca 2+ chelator, the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound is reduced compared to the absence of the compound, and the amount of superoxide produced is reduced, and the Ca 2+ chelator Selecting a compound having a reduced intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound and a decrease in superoxide production in the presence of the compound compared to the absence of the compound;
A method comprising:

［４］ 上記［１］又は［２］に記載のスクリーニング方法で選択された化合物を抗血栓薬として選択する、抗血栓薬のスクリーニング方法。 [4] A screening method for an antithrombotic drug, wherein the compound selected by the screening method according to [1] or [2] above is selected as an antithrombotic drug.

［５］ 上記［２］又は［３］に記載のスクリーニング方法で選択された化合物を抗腫瘍薬として選択する、抗腫瘍薬のスクリーニング方法。 [5] A screening method for an antitumor drug, wherein a compound selected by the screening method according to [2] or [3] above is selected as an antitumor drug.

［６］ 抗腫瘍薬をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程と、
を備える方法。 [6] A method for screening an antitumor drug,
Stimulating neutrophils or neutrophil-like cultured cells in the absence and presence of a compound in the absence of a Ca 2+ chelator;
Measuring the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production of neutrophils or neutrophil-like cultured cells;
Selecting a compound that reduces intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound and decreases superoxide production in the absence of the Ca 2+ chelator compared to the absence of the compound;
A method comprising:

本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性を評価する方法は、簡便かつ迅速に化合物を評価することが可能である。また、本発明のスクリーニング方法は、簡便かつ迅速に化合物をスクリーニングすることが可能であり、ハイスループットスクリーニングに適している。   The method for evaluating the selectivity of the COX inhibition of the compound of the present invention enables simple and rapid evaluation of the compound. In addition, the screening method of the present invention is capable of screening a compound simply and rapidly, and is suitable for high-throughput screening.

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。   Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail.

（化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法）
まず、化合物のＣＯＸ阻害の選択性を評価する方法について説明する。本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性を評価する方法は以下の工程（１）〜（３）を備える。
（１）Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程。
（２）好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程。
（３） Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が変化せず、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を、シクロオキシゲナーゼ−１を選択的に阻害する化合物であると評価し、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少しない化合物を、シクロオキシゲナーゼを非選択的に阻害する化合物であると評価し、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を、シクロオキシゲナーゼ−２を選択的に阻害する化合物であると評価する工程。 (Method for evaluating selectivity of COX inhibition of compound)
First, a method for evaluating the selectivity of the compound for COX inhibition will be described. The method for evaluating the selectivity of COX inhibition of the compound of the present invention comprises the following steps (1) to (3).
(1) A step of stimulating neutrophils or neutrophil-like cultured cells in the presence and absence of a Ca 2+ chelating agent in the presence and absence of a compound.
(2) A step of measuring intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production amount of neutrophils or neutrophil-like cultured cells.
(3) In the absence of a Ca 2+ chelating agent, the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound does not change as compared to the absence of the compound, and the superoxide production amount does not change, and In the presence of a Ca 2+ chelating agent, a compound having a reduced intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound and a decrease in superoxide production compared to the absence of the compound, and cyclooxygenase-1 Evaluated as a compound that selectively inhibits,
In the absence of a Ca 2+ chelator, the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound is reduced compared to the absence of the compound, and the amount of superoxide produced is reduced, and the Ca 2+ chelator Inhibits cyclooxygenase non-selectively in a compound that does not decrease intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound and does not decrease the amount of superoxide produced in the presence of the compound as compared to the absence of the compound. Evaluate it as a compound,
In the absence of a Ca 2+ chelator, the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound is reduced compared to the absence of the compound, and the amount of superoxide produced is reduced, and the Ca 2+ chelator Selectively inhibits cyclooxygenase-2 in compounds with reduced intracellular Ca 2+ concentration and reduced superoxide production in the presence of compound in the presence of compound A step of evaluating as a compound.

以下、各工程を説明する。工程（１）では、好中球あるいは好中球様の培養細胞（以下、説明を簡略化するために、好中球様の培養細胞も含めて好中球と表現する場合がある。）を刺激することにより、好中球に活性酸素の産生を促す。好中球の由来は限定されないが、哺乳類、特にヒトの好中球であることが好ましい。好中球は、常法により血液から採取・精製することができる。例えば、モノ・ポリ分離溶液（大日本製薬）を用いた密度勾配遠心により血液から調製可能である。好中球様の培養細胞とは、好中球様に分化した細胞をいい、例えば、ＨＬ−６０細胞（ヒト前骨髄芽球系株化細胞）をＤＭＳＯなどの分化誘導剤で分化させた細胞やＴＨＰ−１細胞（ヒト単球系株化細胞）をＢｔ２ｃＡＭＰ（ジブチリルｃＡＭＰ）などの分化誘導剤で分化させた細胞などが挙げられる。 Hereinafter, each process will be described. In step (1), neutrophils or neutrophil-like cultured cells (hereinafter, in order to simplify the explanation, neutrophils including neutrophil-like cultured cells may be expressed). Stimulation stimulates neutrophils to produce active oxygen. The origin of neutrophils is not limited, but mammals, particularly human neutrophils are preferred. Neutrophils can be collected and purified from blood by conventional methods. For example, it can be prepared from blood by density gradient centrifugation using a mono-poly separation solution (Dainippon Pharmaceutical). A neutrophil-like cultured cell refers to a cell that has differentiated into a neutrophil-like, for example, a cell obtained by differentiating HL-60 cells (human promyeloblast cell line) with a differentiation inducer such as DMSO. And cells obtained by differentiating THP-1 cells (human monocytic cell line) with a differentiation inducer such as Bt 2 cAMP (dibutyryl cAMP).

好中球の刺激は、培養液中や緩衝液中で行うことが可能である。好中球の培養に用いられている培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地など）や一般的な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液など）が使用可能である。培地又は緩衝液の好適なｐＨ及び温度は、それぞれ６〜８及び３７℃である。Ｃａ２＋キレート剤の存在下で好中球を刺激する場合には培養液中にＣａ２＋が含まれていても含まれていなくてもよいが、Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で好中球を刺激する場合には培養液中にＣａ２＋が含まれていることが望ましく、典型的には０．５ｍＭ〜２ｍＭにＣａ２＋濃度は調整される。Ｃａ２＋キレート剤としては、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸）やＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）などの公知のＣａ２＋キレート剤を用いることが可能である。培養液や緩衝液にＣａ２＋キレート剤を添加することにより、好中球の細胞内へのＣａ２＋流入を阻害している。Ｃａ２＋キレート剤の濃度は好中球の細胞内へのＣａ２＋の流入を阻止できるのに充分な濃度であればよく、好適な濃度は当該技術分野でよく知られている。Ｃａ２＋キレート剤としてＥＧＴＡやＥＤＴＡを用いる場合、その濃度は典型的には１ｍＭ〜１０ｍＭである。 Neutrophil stimulation can be performed in a culture solution or a buffer solution. A medium used for neutrophil culture (for example, RPMI 1640 medium) or a general buffer (for example, phosphate buffer, Tris buffer, HEPES buffer, etc.) can be used. Suitable pH and temperature of the medium or buffer are 6-8 and 37 ° C., respectively. May not be included be included Ca 2+ in the culture broth when stimulating neutrophil in the presence of Ca 2+ chelator, but neutrophils in the absence of Ca 2+ chelator In the case of stimulating, Ca 2+ is desirably contained in the culture solution, and the Ca 2+ concentration is typically adjusted to 0.5 mM to 2 mM. The Ca 2+ chelator, it is possible to use a known Ca 2+ chelators such as EGTA (ethylene glycol bis (2-aminoethyl ether) tetraacetic acid) and EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid). By adding a Ca 2+ chelating agent to the culture solution or buffer, Ca 2+ influx into the cells of neutrophils is inhibited. The concentration of the Ca 2+ chelating agent need only be sufficient to prevent Ca 2+ influx into the cells of neutrophils, and suitable concentrations are well known in the art. When EGTA or EDTA is used as the Ca 2+ chelating agent, the concentration is typically 1 mM to 10 mM.

好中球の刺激は、ｆＭＬＰ（ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン）、Ｃ５ａ（活性化補体成分の一種）及びＳＯＺ（ｓｅｒｕｍ−ｏｐｓｏｎｉｚｅｄ−Ｚｙｍｏｓａｎ；血清オプソニン化ザイモサン）等の走化性因子を好中球に接触させることにより達成される。走化性因子の濃度は好中球を刺激できる濃度であればよく、その種類に応じて濃度は異なるが、各走化性因子の好適な濃度は当該技術分野でよく知られている。そして、好中球の刺激を、被検対象である化合物の存在下（複数の濃度であってもよい）及び非存在下の双方で行うことにより、好中球の挙動（具体的には、細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量）の変化が異なるため、その挙動の違いにより化合物のＣＯＸ阻害の選択性を評価することが可能である。 Stimulation of neutrophils favors chemotactic factors such as fMLP (formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine), C5a (a type of activated complement component) and SOZ (serum-opsonized-Zymosan). This is achieved by contacting the sphere. The concentration of the chemotactic factor is not particularly limited as long as it can stimulate neutrophils, and the concentration varies depending on the type, but suitable concentrations of each chemotactic factor are well known in the art. And, by performing stimulation of neutrophils both in the presence (may be a plurality of concentrations) and absence of the compound to be examined, the behavior of neutrophils (specifically, Since changes in intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production amount) are different, it is possible to evaluate the selectivity of the compound for COX inhibition by the difference in behavior.

工程（２）では、刺激を受けた好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する。ｆＭＬＰ等による刺激を受けた好中球は、通常、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇し、スーパーオキシド産生量が増加する。しかし、ＣＯＸ阻害化合物の存在下では、ＣＯＸ阻害の選択性に依存して、その挙動が変化する。また、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で好中球を刺激すると、好中球の細胞内へのＣａ２＋の流入が生じない。そのため、Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下では、細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の増減の変化は異なり、しかも、その違いはＣＯＸ阻害の選択性に依存する。 In step (2), the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production amount of the stimulated neutrophil are measured. Neutrophils stimulated by fMLP or the like usually have an increased intracellular Ca 2+ concentration and increased superoxide production. However, in the presence of a COX inhibitor compound, its behavior changes depending on the selectivity of COX inhibition. Also, stimulation of neutrophil in the presence of Ca 2+ chelator, influx of Ca 2+ into cells of neutrophils does not occur. Therefore, changes in increase and decrease in intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production amount differ in the presence and absence of a Ca 2+ chelating agent, and the difference depends on the selectivity of COX inhibition.

細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量は、常法に従って、また、市販の試薬や測定キットを用いて、測定することが可能である。細胞内Ｃａ２＋濃度の測定は、例えば、カルシウム蛍光指示薬（例えば、Ｆｕｒａ−２やＦｌｕｏ−３、膜透過性を高めたそれらのエステル誘導体など、数多くのカルシウム蛍光指示薬が市販されている）を好中球に導入し、励起光を照射して発生した蛍光を測定することにより可能である。スーパーオキシド産生量の測定は、例えば、ＣＬＡ（２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン）などのスーパーオキシドと反応して化学発光を生じる試薬を測定系に添加し、好中球がスーパーオキシドを産生するに伴い発生する化学発光を測定することにより可能である。 The intracellular Ca 2+ concentration and the amount of superoxide produced can be measured according to conventional methods and using commercially available reagents and measurement kits. For the measurement of intracellular Ca 2+ concentration, for example, calcium fluorescent indicators (for example, many calcium fluorescent indicators such as Fura-2 and Fluo-3 and their ester derivatives having increased membrane permeability are commercially available) are preferred. It is possible to measure the fluorescence generated by introducing it into a sphere and irradiating it with excitation light. Superoxide production is measured by reacting with superoxide such as CLA (2-methyl-6-phenyl-3,7-dihydroimidazo [1,2-a] pyrazin-3-one) to produce chemiluminescence. This is possible by adding the resulting reagent to the measurement system and measuring the chemiluminescence generated as neutrophils produce superoxide.

本発明者らが開発した化学発光及び蛍光の同時測定装置（特開２００４−６１４３８号公報、特開２０００−３３８０４５号公報及び特開２０００−１３１２３４号公報等に記載）は、化学発光及び蛍光を同時に測定できるため、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の測定に特に適している。 An apparatus for simultaneous measurement of chemiluminescence and fluorescence developed by the present inventors (described in JP-A-2004-61438, JP-A-2000-338045, JP-A-2000-131234, etc.) Since it can be measured simultaneously, it is particularly suitable for measurement of intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production amount of neutrophils.

工程（３）では、工程（２）で得られた測定結果に基づいて被検対象の化合物のＣＯＸ阻害の選択性を評価する。ここで、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度（スーパーオキシド産生量）が「変化しない」とは、化合物の存在下での測定値を化合物の非存在下での測定値で除した数値が０．７以上１．３以下であることが好ましい。また、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度（スーパーオキシド産生量）が「増加する」とは、化合物の存在下での測定値を化合物の非存在下での測定値で除した数値が１．３よりも大きいことが好ましい。また、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度（スーパーオキシド産生量）が「減少する」とは、０．７未満であることが好ましい。さらに、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度（スーパーオキシド産生量）が「増加しない」とは、「変化しない」又は「減少する」のいずれかの状態を表し、「減少しない」とは「変化しない」又は「増加する」のいずれかの状態を表す。特に、細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の増減の評価に当っては、複数用量（濃度）の被検化合物で測定を行い、用量依存曲線を作成し、その最大変化量について評価を行うことが好ましい。 In step (3), the selectivity for COX inhibition of the compound to be tested is evaluated based on the measurement result obtained in step (2). Here, the intracellular Ca 2+ concentration (superoxide production amount) in the presence of the compound is “not changed” as compared to the absence of the compound, which means that the measured value in the presence of the compound is absent. It is preferable that the numerical value divided by the measured value below is 0.7 or more and 1.3 or less. Further, “increase in intracellular Ca 2+ concentration (superoxide production amount) in the presence of a compound as compared to the absence of the compound means that the measured value in the presence of the compound is in the absence of the compound. The numerical value divided by the measured value at is preferably greater than 1.3. Moreover, it is preferable that it is less than 0.7 that intracellular Ca < 2+ > density | concentration (superoxide production amount) in the presence of a compound "decreases" compared with the absence of a compound. Furthermore, “there is no increase” in the intracellular Ca 2+ concentration (superoxide production amount) in the presence of the compound as compared with the absence of the compound is a state of “no change” or “decrease”. “Do not decrease” indicates a state of “no change” or “increase”. In particular, in evaluating the increase and decrease in intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production, measurement is performed with multiple doses (concentrations) of the test compound, a dose-dependent curve is created, and the maximum change is evaluated. It is preferable.

（ＣＯＸ阻害化合物のスクリーニング方法）
次に、本発明のＣＯＸ阻害化合物のスクリーニング方法について説明する。本発明のＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法は、以下の工程（１）〜（３）を備える。
（１）Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球を刺激する工程。
（２）好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程。
（３）Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が変化せず、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程。 (Screening method for COX inhibitory compound)
Next, the screening method for the COX inhibitory compound of the present invention will be described. The method for screening for a compound that selectively inhibits COX-1 of the present invention comprises the following steps (1) to (3).
(1) Stimulating neutrophils in the presence and absence of a compound in the presence and absence of a Ca 2+ chelator.
(2) A step of measuring the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production amount of neutrophils.
(3) In the absence of a Ca 2+ chelating agent, the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound does not change as compared to the absence of the compound, and the superoxide production amount does not change, and In the presence of a Ca 2+ chelating agent, a step of selecting a compound in which the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound is decreased and the superoxide production amount is decreased as compared to the absence of the compound.

工程（１）では、好中球を刺激することにより、好中球に活性酸素の産生を促す。好中球の種類、好中球の刺激等については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。工程（２）では、刺激を受けた好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する。本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した測定方法と同様の測定方法で、測定を行うことが可能である。工程（３）では、工程（２）で得られた測定結果に基づいて被検対象の化合物がＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物であるか否かを評価し選択する。評価方法については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。 In step (1), neutrophils are stimulated to produce active oxygen by stimulating neutrophils. The types of neutrophils, neutrophil stimulation, etc. are as described in the method for evaluating the selectivity of COX inhibition of the compounds of the present invention. In step (2), the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production amount of the stimulated neutrophil are measured. The measurement can be performed by the same measurement method as described in the method for evaluating the selectivity of COX inhibition of the compound of the present invention. In step (3), based on the measurement result obtained in step (2), it is evaluated and selected whether or not the compound to be tested is a compound that selectively inhibits COX-1. About the evaluation method, it is as having described in the evaluation method of the selectivity of COX inhibition of the compound of this invention.

このようにして選択されたＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物は、抗炎症薬として利用できるだけでなく、抗血栓薬としても利用することが可能である。血小板には核がなくタンパク質合成はおきない。したがって、血小板に存在するＣＯＸはＣＯＸ−１のみであり、誘導型であるＣＯＸ−２は存在しない。ＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物は血小板においてＣＯＸ−１を阻害し、アラキドン酸からＰＧＩ２の合成抑制することにより、血小板の凝集を抑制し、血栓形成を防止することが可能である。   The compound that selectively inhibits COX-1 thus selected can be used not only as an anti-inflammatory drug but also as an antithrombotic drug. Platelets have no nucleus and do not synthesize proteins. Therefore, the COX present in platelets is only COX-1, and there is no inducible COX-2. A compound that selectively inhibits COX-1 inhibits COX-1 in platelets and suppresses the synthesis of PGI2 from arachidonic acid, thereby suppressing platelet aggregation and preventing thrombus formation.

本発明のＣＯＸを非選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法は、以下の工程（１）〜（３）を備える。
（１）Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球を刺激する工程。
（２）好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程。
（３）Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少しない化合物を選択する工程。 The method for screening for a compound that non-selectively inhibits COX of the present invention comprises the following steps (1) to (3).
(1) Stimulating neutrophils in the presence and absence of a compound in the presence and absence of a Ca 2+ chelator.
(2) A step of measuring the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production amount of neutrophils.
(3) In the absence of a Ca 2+ chelating agent, the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound is decreased as compared to the absence of the compound, and the amount of superoxide produced is reduced. 2+ In the presence of a chelating agent, a step of selecting a compound that does not decrease the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound and does not decrease the amount of superoxide produced compared to the absence of the compound.

工程（１）では、好中球を刺激することにより、好中球に活性酸素の産生を促す。好中球の種類、好中球の刺激等については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。工程（２）では、刺激を受けた好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する。本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した測定方法と同様の測定方法で、測定を行うことが可能である。工程（３）では、工程（２）で得られた測定結果に基づいて被検対象の化合物が非選択的にＣＯＸを阻害する化合物であるか否かを評価し選択する。評価方法については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。 In step (1), neutrophils are stimulated to produce active oxygen by stimulating neutrophils. The types of neutrophils, neutrophil stimulation, etc. are as described in the method for evaluating the selectivity of COX inhibition of the compounds of the present invention. In step (2), the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production amount of the stimulated neutrophil are measured. The measurement can be performed by the same measurement method as described in the method for evaluating the selectivity of COX inhibition of the compound of the present invention. In step (3), based on the measurement result obtained in step (2), it is evaluated and selected whether or not the compound to be tested is a compound that non-selectively inhibits COX. About the evaluation method, it is as having described in the evaluation method of the selectivity of COX inhibition of the compound of this invention.

このようにして選択された非選択的にＣＯＸ阻害する化合物は、心臓疾患（特に、心筋梗塞）の患者に投与する抗炎症薬として利用することが可能である。ＣＯＸ−２選択的なＮＳＡＩＤｓは心筋梗塞のリスクを増加させるという報告があり、非選択的にＣＯＸを阻害する化合物は、前述のように血小板のＣＯＸ−１を阻害することにより血栓形成を防止するため、心筋梗塞のリスクを低減できるからである。   The non-selectively COX-inhibiting compound thus selected can be used as an anti-inflammatory agent to be administered to patients with heart diseases (particularly myocardial infarction). COX-2 selective NSAIDs have been reported to increase the risk of myocardial infarction, and compounds that non-selectively inhibit COX prevent thrombus formation by inhibiting platelet COX-1 as described above This is because the risk of myocardial infarction can be reduced.

本発明のＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法は、以下の工程（１）〜（３）を備える。
（１）Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球を刺激する工程。
（２）好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及び好中球のスーパーオキシド産生量を測定する工程。
（３）Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程。 The method for screening for a compound that selectively inhibits COX-2 of the present invention comprises the following steps (1) to (3).
(1) Stimulating neutrophils in the presence and absence of a compound in the presence and absence of a Ca 2+ chelator.
(2) A step of measuring the intracellular Ca 2+ concentration of neutrophils and the production amount of neutrophil superoxide.
(3) In the absence of a Ca 2+ chelating agent, the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound is decreased as compared to the absence of the compound, and the amount of superoxide produced is reduced. 2+ In the presence of a chelating agent, the step of selecting a compound that reduces the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound as compared to the absence of the compound and decreases the amount of superoxide produced.

工程（１）では、好中球を刺激することにより、好中球に活性酸素の産生を促す。好中球の種類、好中球の刺激等については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。工程（２）では、刺激を受けた好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する。本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した測定方法と同様の測定方法で、測定を行うことが可能である。工程（３）では、工程（２）で得られた測定結果に基づいて被検対象の化合物がＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物であるか否かを評価し選択する。評価方法については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。 In step (1), neutrophils are stimulated to produce active oxygen by stimulating neutrophils. The types of neutrophils, neutrophil stimulation, etc. are as described in the method for evaluating the selectivity of COX inhibition of the compounds of the present invention. In step (2), the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production amount of the stimulated neutrophil are measured. The measurement can be performed by the same measurement method as described in the method for evaluating the selectivity of COX inhibition of the compound of the present invention. In step (3), based on the measurement result obtained in step (2), it is evaluated and selected whether or not the compound to be tested is a compound that selectively inhibits COX-2. About the evaluation method, it is as having described in the evaluation method of the selectivity of COX inhibition of the compound of this invention.

このようにして選択されたＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物は、胃腸障害などの副作用の少ない抗炎症薬として利用することが可能である。また、ＣＯＸ−２により産生されるＰＧは、腫瘍血管の新生を誘導することによって、癌の成長に関与していることが指摘されている（例えば、非特許文献１）。このことから、ＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物は、抗炎症薬としてだけでなく、抗腫瘍薬としても利用することが可能と考えられる。   The compound that selectively inhibits COX-2 selected in this way can be used as an anti-inflammatory drug with few side effects such as gastrointestinal disorders. Further, it has been pointed out that PG produced by COX-2 is involved in cancer growth by inducing neovascularization of tumor blood vessels (for example, Non-Patent Document 1). From this, it is considered that a compound that selectively inhibits COX-2 can be used not only as an anti-inflammatory drug but also as an anti-tumor drug.

（抗血栓薬のスクリーニング方法）
次に、本発明の抗血栓薬のスクリーニング方法について説明する。本発明の抗血栓薬のスクリーニング方法は、上記のＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法又は上記の非選択的にＣＯＸを阻害する化合物をスクリーニングする方法で選択された化合物を抗血栓薬として選択することを特徴とする。 (Screening method for antithrombotic drugs)
Next, the screening method for the antithrombotic drug of the present invention will be described. The antithrombotic drug screening method of the present invention is a method of screening a compound that selectively inhibits COX-1 or a method selected from the above-mentioned method of screening a compound that non-selectively inhibits COX. It is selected as a thrombotic drug.

既に説明したように、血小板に存在するＣＯＸはＣＯＸ−１のみであって、誘導型であるＣＯＸ−２は存在しない。ＣＯＸ−１を阻害する化合物は血小板においてＣＯＸ−１を阻害し、アラキドン酸からＰＧＩ２の合成抑制することにより、血小板の凝集を抑制し、血栓形成を防止することが可能である。したがって、ＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物及び非選択的にＣＯＸを阻害する化合物は、抗血栓薬の候補となり得る。   As already explained, the COX present in platelets is only COX-1, and there is no inductive COX-2. A compound that inhibits COX-1 inhibits COX-1 in platelets and suppresses the synthesis of PGI2 from arachidonic acid, thereby suppressing platelet aggregation and preventing thrombus formation. Therefore, compounds that selectively inhibit COX-1 and compounds that non-selectively inhibit COX can be candidates for antithrombotic agents.

（抗腫瘍薬のスクリーニング方法）
最後に、本発明の抗腫瘍薬のスクリーニング方法について説明する。本発明の抗腫瘍薬のスクリーニング方法は、上記の非選択的にＣＯＸを阻害する化合物をスクリーニングする方法又は上記のＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法で選択された化合物を抗腫瘍薬として選択することを特徴とする。 (Screening method for antitumor drugs)
Finally, the screening method for the antitumor drug of the present invention will be described. The method for screening an antitumor agent of the present invention is a method for screening a compound that inhibits COX non-selectively or a method for screening a compound that selectively inhibits COX-2. It is selected as a tumor drug.

既に説明したように、ＣＯＸ−２により産生されるＰＧは、腫瘍血管の新生を誘導することによって、腫瘍の成長に関与していることが指摘されている。また、大腸癌、乳癌、胃癌、食道癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、頭頚部の扁平上皮癌などのヒト癌細胞において、ＣＯＸ−２の発現が増強していることが報告されている。さらに、ＮＳＡＩＤｓ服用者は、大腸癌や乳癌などの癌の発症率が有意に低いことも報告されている。   As already explained, it has been pointed out that PG produced by COX-2 is involved in tumor growth by inducing neovascularization of tumor blood vessels. It has also been reported that COX-2 expression is enhanced in human cancer cells such as colon cancer, breast cancer, stomach cancer, esophageal cancer, lung cancer, liver cancer, pancreatic cancer, and squamous cell carcinoma of the head and neck. Furthermore, NSAIDs users have also been reported to have a significantly lower incidence of cancers such as colon cancer and breast cancer.

より具体的には、大腸癌におけるＣＯＸ−２の発現及び選択的ＣＯＸ−２阻害剤によって大腸癌の増殖が抑制されることが、Hongmiao Sheng et al., The Journal of Clinical Investigation, vol. 99, pp. 2254-2259 (1997) において報告されている。また、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌におけるＣＯＸ−２の発現及びＣＯＸ−２が癌転移へ関与（原発巣からの離脱、基底膜の破壊、血管内皮細胞への接着、転移巣での増殖、血管新生など）することは、垣内佳美ら、肝胆膵、４５巻、５２７−５３３頁（２００２年）において報告されている。また、ヒトの大腸癌、乳癌、前立腺癌及び肺癌の生検組織やその新生腫瘍血管の細胞においてＣＯＸ−２の発現が認められ、ＣＯＸ−２阻害剤が血管新生を阻害して腫瘍細胞の増殖を抑制することが、Jaime L. Masferrer et al., Cancer Research, vol. 60, pp. 1306-1311 (2000) において報告されている。また、癌化に伴い子宮内膜におけるＣＯＸ−２の発現が増加し、ＣＯＸ−２阻害剤によって癌の増殖、進展が抑制されることが、長谷川清志ら、産婦人科治療、８３巻、６１０頁（２００１年）において報告されている。さらに、ＣＯＸ−２阻害剤は腫瘍起因性の血管新生を阻害し、癌の転移を抑制する効果があり、ヒトの癌治療に対する新たな治療薬となりうることが、Jaime L. Masferrer et al., Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 889, pp. 84-86 (1999) やStephen Gately et al., Seminars in Oncology, vol. 31, pp. 2-11 (2004) で報告されている。   More specifically, Hongmiao Sheng et al., The Journal of Clinical Investigation, vol. 99, that COX-2 expression and selective COX-2 inhibitors in colorectal cancer suppress colon cancer growth. pp. 2254-2259 (1997). In addition, expression of COX-2 in liver cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer and COX-2 are involved in cancer metastasis (detachment from the primary lesion, destruction of the basement membrane, adhesion to vascular endothelial cells, proliferation in the metastatic lesion, It has been reported in Yoshimi Kakiuchi et al., Hepatobiliary pancreas, 45, 527-533 (2002). In addition, COX-2 expression is observed in human colon cancer, breast cancer, prostate cancer and lung cancer biopsy tissues and cells of the newly formed tumor blood vessels, and COX-2 inhibitors inhibit angiogenesis and proliferate tumor cells. Has been reported in Jaime L. Masferrer et al., Cancer Research, vol. 60, pp. 1306-1311 (2000). In addition, the expression of COX-2 in the endometrium increases with canceration, and the growth and progression of cancer are suppressed by a COX-2 inhibitor. Kiyoshi Hasegawa et al., Obstetrics and Gynecology, 83, 610 Page (2001). Furthermore, Jaime L. Masferrer et al., That a COX-2 inhibitor has an effect of inhibiting tumor-induced angiogenesis and suppressing cancer metastasis, and can be a new therapeutic agent for human cancer treatment. Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 889, pp. 84-86 (1999) and Stephen Gately et al., Seminars in Oncology, vol. 31, pp. 2-11 (2004).

したがって、ＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物及び非選択的にＣＯＸを阻害する化合物は、抗腫瘍薬（抗癌薬）の候補となり得る。抗腫瘍薬の中でも、大腸癌、乳癌、胃癌、食道癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌及び頭頚部の扁平上皮癌に対する抗腫瘍薬であることが好ましく、特に大腸癌に対する抗腫瘍薬であることが好ましい。   Therefore, a compound that selectively inhibits COX-2 and a compound that non-selectively inhibits COX can be candidates for antitumor drugs (anticancer drugs). Among antitumor drugs, antitumor drugs for colon cancer, breast cancer, gastric cancer, esophageal cancer, lung cancer, liver cancer, pancreatic cancer and squamous cell carcinoma of the head and neck are preferable, particularly antitumor drugs for colon cancer Is preferred.

さらに、ＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物及び非選択的にＣＯＸを阻害する化合物と、ＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物と、を区別する方法は、抗腫瘍薬のスクリーニング方法に応用することが可能である。すなわち、本発明の抗腫瘍薬のスクリーニング方法は、以下の工程（１）〜（３）を備える。
（１）Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球を刺激する工程。
（２）好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程。
（３）Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程。 Furthermore, a method for distinguishing between a compound that selectively inhibits COX-2 and a compound that selectively inhibits COX, and a compound that selectively inhibits COX-1, is applied to a screening method for antitumor drugs. Is possible. That is, the screening method for an antitumor drug of the present invention comprises the following steps (1) to (3).
(1) Stimulating neutrophils in the absence and presence of a compound in the absence of a Ca 2+ chelator.
(2) A step of measuring the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production amount of neutrophils.
(3) In the absence of a Ca 2+ chelating agent, a compound is selected that has a reduced intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound and a reduced superoxide production amount compared to the absence of the compound. Process.

工程（１）では、好中球を刺激することにより、好中球に活性酸素の産生を促す。好中球の種類、好中球の刺激等については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。工程（２）では、刺激を受けた好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する。本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した測定方法と同様の測定方法で、測定を行うことが可能である。工程（３）では、工程（２）で得られた測定結果に基づいて被検対象の化合物が非選択的にＣＯＸを阻害する化合物又はＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物であるか否かを評価し選択する。評価方法については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。 In step (1), neutrophils are stimulated to produce active oxygen by stimulating neutrophils. The types of neutrophils, neutrophil stimulation, etc. are as described in the method for evaluating the selectivity of COX inhibition of the compounds of the present invention. In step (2), the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production amount of the stimulated neutrophil are measured. The measurement can be performed by the same measurement method as described in the method for evaluating the selectivity of COX inhibition of the compound of the present invention. In step (3), whether or not the compound to be tested is a compound that non-selectively inhibits COX or a compound that selectively inhibits COX-2 based on the measurement result obtained in step (2) Evaluate and select About the evaluation method, it is as having described in the evaluation method of the selectivity of COX inhibition of the compound of this invention.

以下、実施例を挙げて本発明について詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these Examples.

（実施例１）
ＣＯＸ阻害薬の存在下における、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化を以下の方法により確認した。 Example 1
Changes in neutrophil intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production in the presence of a COX inhibitor were confirmed by the following method.

好中球として、ＨＬ−６０細胞をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド；分化誘導剤）で分化させたものを用いた。すなわち、終濃度１．２８％のＤＭＳＯを含む１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）入りＲＰＭＩ１６４０培地にて、ＨＬ−６０細胞を３．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの密度で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４日間培養した。培地から細胞を回収し、ＲＨバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、５．６ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、１０％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させた。 As neutrophils, HL-60 cells differentiated with DMSO (dimethyl sulfoxide; differentiation inducer) were used. That is, in RPMI1640 medium containing 10% fetal calf serum (FCS) containing DMSO having a final concentration of 1.28%, HL-60 cells were cultured at 37 ° C., 5% CO 2 at a density of 3.0 × 10 5 cells / mL. Culture was performed for 4 days under the conditions of 2 . Cells were collected from the medium, washed twice with RH buffer (10 mM HEPES, 154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, pH 7.4), and suspended in RPMI 1640 medium containing 10% FCS.

この細胞懸濁液に３μＭのＦｌｕｏ３−ＡＭ（１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキシ−９−ザンテニル）フェノキシ］−２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸；カルシウム検出試薬；蛍光性指示薬）を加えて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３０分間インキュベーションし、細胞内にＦｌｕｏ３−ＡＭを取り込ませた。この細胞をＲＨバッファーで２回洗浄し、同バッファーに懸濁させた。得られた細胞懸濁液（８．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬ）に５μＬのＣＯＸ阻害薬の溶液又は５μＬのＤＭＳＯ（ブランクとして）を加え、さらにＣａＣｌ２及びＣＬＡ（スーパーオキシド検出試薬；化学発光性指示薬）をそれぞれ終濃度が１ｍＭ、１μＭとなるように加えた。 To this cell suspension was added 3 μM Fluo3-AM (1- [2-amino-5- (2,7-dichloro-6-hydroxy-3-oxy-9-xanthenyl) phenoxy] -2- (2-amino- 5-methylphenoxy) ethane-N, N, N ′, N′-tetraacetic acid; calcium detection reagent; fluorescent indicator) and incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 30 minutes, Was incorporated with Fluo3-AM. The cells were washed twice with RH buffer and suspended in the same buffer. To the obtained cell suspension (8.0 × 10 5 cells / mL), 5 μL of a solution of COX inhibitor or 5 μL of DMSO (as a blank) is added, and further CaCl 2 and CLA (superoxide detection reagent; chemiluminescence) Sex indicators) were added to a final concentration of 1 mM and 1 μM, respectively.

このように調製した試料溶液１ｍＬをセルに入れ、化学発光及び蛍光の同時測定装置（特開２００４−６１４３８号公報に記載の装置）のセルホルダーにセルをセットした。セル内の試料溶液は、撹拌しながら３７℃でインキュベートした。試料溶液に１００μＭのｆＭＬＰを１０μＬ加えて好中球を刺激し、Ｆｌｕｏ−３の蛍光強度及びＣＬＡの化学発光強度の変化をモニターした。   1 mL of the sample solution thus prepared was placed in a cell, and the cell was set in a cell holder of a simultaneous chemiluminescence and fluorescence measurement apparatus (apparatus described in JP-A-2004-61438). The sample solution in the cell was incubated at 37 ° C. with agitation. Neutrophils were stimulated by adding 10 μL of 100 μM fMLP to the sample solution, and changes in fluorescence intensity of Fluo-3 and chemiluminescence intensity of CLA were monitored.

用いたＣＯＸ阻害薬は以下の通りである：ＣＯＸ−１選択的阻害薬としてフルルビプロフェン及びケトプロフェン、非選択的ＣＯＸ阻害薬としてアスピリン及びイブプロフェン、ＣＯＸ−２選択的阻害薬としてエトドラク及びニメスリド。また、ＣＯＸ阻害薬の添加量（測定セルの試料溶液の含量）は、成人１回分の投与量の１／５００、１／５０００及び１／５００００倍量となるように添加した。   The COX inhibitors used were as follows: flurbiprofen and ketoprofen as COX-1 selective inhibitors, aspirin and ibuprofen as non-selective COX inhibitors, etodolac and nimesulide as COX-2 selective inhibitors. In addition, the COX inhibitor was added so that the amount of the sample solution (content of the sample solution in the measurement cell) was 1/500, 1/5000, and 1/50000 times the dose for one adult.

図１〜３は、ＣＯＸ阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化を表すグラフである。縦軸はＣＯＸ阻害薬添加時の蛍光（細胞内Ｃａ２＋濃度）及び化学発光（スーパーオキシド産生量）のピーク面積をブランクのピーク面積（ＤＭＳＯ添加時のピーク面積）で除した比を表し、横軸はＣＯＸ阻害薬の添加量（対数）を表す。図１はＣＯＸ−１選択的阻害薬の結果を表し、図２は非選択的ＣＯＸ阻害薬の結果を表し、図３はＣＯＸ−２選択的阻害薬の結果を表す。 1 to 3 are graphs showing changes in intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production of neutrophils in the presence of a COX inhibitor. The vertical axis represents the ratio of the peak area of fluorescence (intracellular Ca 2+ concentration) and chemiluminescence (superoxide production) at the time of COX inhibitor addition divided by the blank peak area (peak area at the time of DMSO addition). The axis represents the added amount (logarithm) of the COX inhibitor. FIG. 1 represents the results of the COX-1 selective inhibitor, FIG. 2 represents the results of the non-selective COX inhibitor, and FIG. 3 represents the results of the COX-2 selective inhibitor.

図１から明らかなように、ＣＯＸ−１選択的阻害薬の存在下では、非存在下と比べて、好中球を刺激したときの細胞内Ｃａ２＋濃度は変化せず、また、スーパーオキシド産生量も変化しなかった。一方、図２及び３から明らかなように、非選択的ＣＯＸ阻害薬及びＣＯＸ−２選択的阻害薬の存在下では、非存在下と比べて、好中球を刺激したときの細胞内Ｃａ２＋濃度は減少し、スーパーオキシド産生量も減少した。 As is clear from FIG. 1, in the presence of a COX-1 selective inhibitor, the intracellular Ca 2+ concentration when neutrophils were stimulated did not change compared to the absence, and superoxide production The amount did not change. On the other hand, as is apparent from FIGS. 2 and 3, intracellular Ca 2+ when neutrophils were stimulated in the presence of a non-selective COX inhibitor and a COX-2 selective inhibitor compared to the absence thereof. Concentration decreased and superoxide production decreased.

（実施例２）
ＥＧＴＡの存在下かつＣＯＸ阻害薬の存在下における、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化を以下の方法により確認した。 (Example 2)
Changes in neutrophil intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production in the presence of EGTA and COX inhibitor were confirmed by the following method.

実施例１と同様にして、Ｆｌｕｏ３−ＡＭを取り込ませた好中球の細胞懸濁液（８．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬ）を調製した。細胞懸濁液に、ＣａＣｌ２及びＣＬＡをそれぞれ終濃度が１ｍＭ、１μＭとなるように加え、室温にて５分間インキュベートし、ＥＧＴＡを終濃度が５ｍＭとなるように加え、室温にて２．５分間インキュベートした。さらに、５μＬのＣＯＸ阻害薬の溶液又は５μＬのＤＭＳＯ（ブランクとして）を加え、室温にて２．５分間インキュベートした。その後は、実施例１と同様に好中球を刺激し、Ｆｌｕｏ−３の蛍光強度及びＣＬＡの化学発光強度の変化をモニターした。 In the same manner as in Example 1, a neutrophil cell suspension (8.0 × 10 5 cells / mL) incorporating Fluo3-AM was prepared. To the cell suspension, CaCl 2 and CLA were added to a final concentration of 1 mM and 1 μM, respectively, incubated at room temperature for 5 minutes, EGTA was added to a final concentration of 5 mM, and 2.5 mL at room temperature. Incubated for minutes. In addition, 5 μL of COX inhibitor solution or 5 μL of DMSO (as a blank) was added and incubated at room temperature for 2.5 minutes. Thereafter, neutrophils were stimulated in the same manner as in Example 1, and changes in the fluorescence intensity of Fluo-3 and the chemiluminescence intensity of CLA were monitored.

用いたＣＯＸ阻害薬及びＣＯＸ阻害薬の添加量は、実施例１と同様である。   The added amounts of the COX inhibitor and the COX inhibitor used are the same as in Example 1.

図４〜６は、ＥＧＴＡ存在下かつＣＯＸ阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化を表すグラフである。図４はＣＯＸ−１選択的阻害薬の結果を表し、図５は非選択的ＣＯＸ阻害薬の結果を表し、図６はＣＯＸ−２選択的阻害薬の結果を表す。 4 to 6 are graphs showing changes in neutrophil intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production in the presence of EGTA and COX inhibitors. FIG. 4 represents the results of the COX-1 selective inhibitor, FIG. 5 represents the results of the non-selective COX inhibitor, and FIG. 6 represents the results of the COX-2 selective inhibitor.

図４から明らかなように、ＣＯＸ−１選択的阻害薬の存在下では、非存在下と比べて、好中球を刺激したときの細胞内Ｃａ２＋濃度は減少し、スーパーオキシド産生量も減少した。また、図５から明らかなように、非選択的ＣＯＸ阻害薬の存在下では、非存在下と比べて、好中球を刺激したときの細胞内Ｃａ２＋濃度は減少せず、スーパーオキシド産生量も減少しなかった。さらに、図６から明らかなように、ＣＯＸ−２選択的阻害薬の存在下では、非存在下と比べて、好中球を刺激したときの細胞内Ｃａ２＋濃度は減少し、スーパーオキシド産生量も減少した。 As is clear from FIG. 4, in the presence of a COX-1 selective inhibitor, the intracellular Ca 2+ concentration when neutrophils were stimulated decreased and the amount of superoxide produced also decreased compared to the absence of COX-1. did. Further, as apparent from FIG. 5, in the presence of the non-selective COX inhibitor, the intracellular Ca 2+ concentration when neutrophils were stimulated did not decrease as compared to the absence, and the amount of superoxide produced Also did not decrease. Furthermore, as is clear from FIG. 6, in the presence of a COX-2 selective inhibitor, the intracellular Ca 2+ concentration when neutrophils were stimulated decreased compared to the absence, and the amount of superoxide produced Also decreased.

ＣＯＸ−１選択的阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化量を表すグラフである。（ａ）フルルビプロフェン、（ｂ）ケトプロフェン。It is a graph showing the amount of change of intracellular Ca <2+ > density | concentration and the amount of superoxide production of a neutrophil in presence of a COX-1 selective inhibitor. (A) Flurbiprofen, (b) Ketoprofen. 非選択的ＣＯＸ阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化量を表すグラフである。（ａ）アスピリン、（ｂ）イブプロフェン。It is a graph showing the amount of change of intracellular Ca <2+ > density | concentration of a neutrophil and superoxide production amount in presence of a non-selective COX inhibitor. (A) aspirin, (b) ibuprofen. ＣＯＸ−２選択的阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化量を表すグラフである。（ａ）エトドラク、（ｂ）ニメスリド。It is a graph showing the amount of change of intracellular Ca <2+ > density | concentration of a neutrophil and superoxide production amount in presence of a COX-2 selective inhibitor. (A) Etodolac, (b) Nimesulide. ＥＧＴＡの存在下かつＣＯＸ−１選択的阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化量を表すグラフである。（ａ）フルルビプロフェン、（ｂ）ケトプロフェン。It is a graph showing the amount of change of the intracellular Ca <2+ > density | concentration and superoxide production amount of a neutrophil in presence of EGTA and presence of a COX-1 selective inhibitor. (A) Flurbiprofen, (b) Ketoprofen. ＥＧＴＡの存在下かつ非選択的ＣＯＸ阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化量を表すグラフである。（ａ）アスピリン、（ｂ）イブプロフェン。It is a graph showing the amount of change of the intracellular Ca2 + density | concentration of a neutrophil and the amount of superoxide production in presence of EGTA and a non-selective COX inhibitor. (A) aspirin, (b) ibuprofen. ＥＧＴＡの存在下かつＣＯＸ−２選択的阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化量を表すグラフである。（ａ）エトドラク、（ｂ）ニメスリド。It is a graph showing the amount of change of the intracellular Ca <2+ > density | concentration and superoxide production amount of a neutrophil in presence of EGTA and presence of a COX-2 selective inhibitor. (A) Etodolac, (b) Nimesulide.

Claims (7)

化合物のシクロオキシゲナーゼ阻害の選択性を評価する方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が変化せず、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を、シクロオキシゲナーゼ−１を選択的に阻害する化合物であると評価し、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少しない化合物を、シクロオキシゲナーゼを非選択的に阻害する化合物であると評価し、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を、シクロオキシゲナーゼ−２を選択的に阻害する化合物であると評価する工程と、
を備える方法。 A method for evaluating the selectivity of a compound for cyclooxygenase inhibition comprising:
Stimulating neutrophils or neutrophil-like cultured cells in the presence and absence of compounds in the presence and absence of Ca 2+ chelating agents;
Measuring the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production of neutrophils or neutrophil-like cultured cells;
In the absence of a Ca 2+ chelating agent, the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound does not change as compared to the absence of the compound, the amount of superoxide produced does not change, and the Ca 2+ does not change. In the presence of a chelating agent, a compound having a reduced intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound and a decrease in superoxide production as compared to the absence of the compound and cyclooxygenase-1 are selectively used. Evaluate the compound as an inhibitor,
In the absence of a Ca 2+ chelator, the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound is reduced compared to the absence of the compound, and the amount of superoxide produced is reduced, and the Ca 2+ chelator Inhibits cyclooxygenase non-selectively in a compound that does not decrease intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound and does not decrease the amount of superoxide produced in the presence of the compound as compared to the absence of the compound. Evaluate it as a compound,
In the absence of a Ca 2+ chelator, the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound is reduced compared to the absence of the compound, and the amount of superoxide produced is reduced, and the Ca 2+ chelator Selectively inhibits cyclooxygenase-2 in compounds with reduced intracellular Ca 2+ concentration and reduced superoxide production in the presence of compound in the presence of compound A step of evaluating it as a compound;
A method comprising: シクロオキシゲナーゼ−１を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が変化せず、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程と、
を備える方法。 A method of screening for a compound that selectively inhibits cyclooxygenase-1,
Stimulating neutrophils or neutrophil-like cultured cells in the presence and absence of compounds in the presence and absence of Ca 2+ chelating agents;
Measuring the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production of neutrophils or neutrophil-like cultured cells;
In the absence of a Ca 2+ chelating agent, the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound does not change as compared to the absence of the compound, the amount of superoxide produced does not change, and the Ca 2+ does not change. In the presence of a chelating agent, selecting a compound that has a reduced intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound as compared to the absence of the compound and that reduces superoxide production;
A method comprising: シクロオキシゲナーゼを非選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少しない化合物を選択する工程と、
を備える方法。 A method for screening for a compound that non-selectively inhibits cyclooxygenase, comprising:
Stimulating neutrophils or neutrophil-like cultured cells in the presence and absence of compounds in the presence and absence of Ca 2+ chelating agents;
Measuring the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production of neutrophils or neutrophil-like cultured cells;
In the absence of a Ca 2+ chelator, the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound is reduced compared to the absence of the compound, and the amount of superoxide produced is reduced, and the Ca 2+ chelator Selecting a compound that does not decrease intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound and does not decrease superoxide production in the presence of the compound compared to the absence of the compound;
A method comprising: シクロオキシゲナーゼ−２を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程と、
を備える方法。 A method of screening for compounds that selectively inhibit cyclooxygenase-2, comprising:
Stimulating neutrophils or neutrophil-like cultured cells in the presence and absence of compounds in the presence and absence of Ca 2+ chelating agents;
Measuring the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production of neutrophils or neutrophil-like cultured cells;
In the absence of a Ca 2+ chelator, the intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound is reduced compared to the absence of the compound, and the amount of superoxide produced is reduced, and the Ca 2+ chelator Selecting a compound having a reduced intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound and a decrease in superoxide production in the presence of the compound compared to the absence of the compound;
A method comprising: 請求項２又は３に記載のスクリーニング方法で選択された化合物を抗血栓薬として選択する、抗血栓薬のスクリーニング方法。   A method for screening an antithrombotic drug, wherein the compound selected by the screening method according to claim 2 or 3 is selected as an antithrombotic drug. 請求項３又は４に記載のスクリーニング方法で選択された化合物を抗腫瘍薬として選択する、抗腫瘍薬のスクリーニング方法。   A method for screening an antitumor drug, wherein the compound selected by the screening method according to claim 3 or 4 is selected as an antitumor drug. 抗腫瘍薬をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程と、
を備える方法。 A method of screening for an anti-tumor drug, comprising:
Stimulating neutrophils or neutrophil-like cultured cells in the absence and presence of a compound in the absence of a Ca 2+ chelator;
Measuring the intracellular Ca 2+ concentration and superoxide production of neutrophils or neutrophil-like cultured cells;
Selecting a compound that reduces intracellular Ca 2+ concentration in the presence of the compound and decreases superoxide production in the absence of the Ca 2+ chelator compared to the absence of the compound;
A method comprising:
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