JP2006166703A - Cartilage differentiation regulating gene - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、II型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの取得方法、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含有する形質転換体ならびに該タンパク質と特異的に反応する抗体に関する。また、本発明は、軟骨の障害が関与する疾患の診断、治療または予防を行う際の本発明のタンパク質、ＤＮＡまたは抗体の使用に関する。
【０００２】
また本発明は、該タンパク質、ＤＮＡ、組換えベクターおよび形質転換体を用いて、軟骨細胞の増殖分化を阻害または促進する物質をスクリーニングする方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
軟骨は軟骨細胞（chondrocyte）とこれを取り囲む細胞外基質（matrix）からなる結合組織であり、関節、脊椎の椎間板、肋軟骨、耳介、外耳道、恥骨結合、咽喉蓋などに存在する。細胞外基質の主成分はコラーゲン及びアグリカン（軟骨型プロテオグリカン）であり、これらは軟骨細胞によって産生される。コラーゲン繊維は軟骨の張力および剪断力に対する剛性に関与し、アグリカンは軟骨組織特有の膨潤性に関与することが知られている。
【０００４】
軟骨組織は胎児期には骨格の大部分を占めており豊富に存在するが、出生後の発育、成長に伴い、軟骨組織の占める割合は減少し、その局在は限定されるようになる。成体では主に骨端表面を覆う関節軟骨として残るのみである。
【０００５】
骨端軟骨の軟骨細胞は、骨端部から骨幹部へ向かって、静止軟骨細胞、増殖軟骨細胞、前肥大軟骨細胞、肥大軟骨細胞に分かれ、同調した分化段階にある細胞群が極めて整然と層状に配列している。そして各軟骨層は、その分化の程度に応じて特有の分子を発現、産生する。増殖軟骨細胞は分化の指標としては、軟骨に特有のII型コラーゲンと、糖とタンパク質の複合体であるプロテオグリカン、特にアグリカンを強く発現する。肥大軟骨細胞になるとコラーゲンはII型からＸ型を発現するようになる。
【０００６】
軟骨細胞は間葉系の細胞（多能性未分化間葉系細胞）より分化する。さらに最近の研究から軟骨細胞の増殖や分化を調節する因子が明らかにされてきている（たとえば、Crombrugghe B. et al.:Current Opinion in Cell Biology.13 p721-727(2001)）。Ｓｏｘ（Sry-type HMG box）遺伝子群は、性決定遺伝子Ｓｒｙ（Sex determining region Y）のＨＭＧ（high mobility group）ボックスと高い相同性を持つドメインを有する転写制御遺伝子群であり、現在２０種類以上のＳｏｘ遺伝子が同定されている。この中で、Ｓｏｘ９はヒトにおける変異が彎曲肢異型性症の原因になること（Foster J.W.et al.:Nature,372 p525-530(1994)）、またマウスの発生過程において軟骨組織優位に発現されること（Wright E.M.et al.:Nature Genet.9 p15-20(1995)）、Ｓｏｘ９遺伝子変異のＥＳ細胞を用いた実験から、Ｓｏｘ９-/-細胞は軟骨組織に参加できず、II型コラーゲンのような軟骨細胞特異的な細胞外遺伝子を発現できないことが報告されており（Bi W.et al.:Nature Genet.22 p85-89(1999)）、軟骨形成に重要な働きを持つ転写因子とされている。しかし、Ｓｏｘ９の機能は軟骨細胞に限られているわけではなく、またII型コラーゲン遺伝子の活性化には、Ｓｏｘ９の他に未知のパートナー遺伝子が必要であるとの報告（Kamachi Y.et al.:Mol.Cell.Biol.19 p107-120(1999)）もあり不明な点は多い。また、Ｓｏｘ９の発現制御メカニズムも未解明である。
【０００７】
この他に、軟骨細胞の増殖や分化に関与する因子として、骨形成タンパク（bone morphogenetic protein：ＢＭＰ）、線維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor：ＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（insulin-like growth factor：ＩＧＦ）、副甲状腺ホルモン関連ペプチド（parathyroid hormone related peptide：ＰＴＨｒＰ）、ソニックへッジホッグ（Sonic hedgehog）、インディアンヘッジホッグ（Indian hedgehog）、などが報告されているが、いずれも軟骨以外にもさまざまな組織、期間形成で重要な役割を果たす共通の基本的制御因子であり、特異的な分化誘導因子は見つかっていない。
【０００８】
血管に富む骨は比較的旺盛な再生能力を持っているが、その表面を覆う関節軟骨は再生能力に極めて乏しい組織である。関節軟骨の表面が損傷を受けると容易に変形性軟骨症へと移行し、これを軟骨で再生させることは極めて困難である。軟骨細胞の増殖と分化の分子機構を解明することは、軟骨疾患の病因解明や、治療手段開発に寄与することが期待される。
【０００９】
しかしながら、軟骨細胞の増殖と分化のメカニズムに関しては、いまだ不明な点が多くその全容は明らかにされていない。軟骨細胞の増殖・分化に関わる新たな分子の同定と、より進んだメカニズムの解明が望まれている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記のように軟骨細胞の増殖と分化を制御する作用を有する有用な新規な遺伝子、タンパク質を見出し、これを医薬、診断薬、医療の分野で利用する方法を提供することにある。
【００１１】
即ち、本発明は、II型コラーゲンの発現を促進する作用を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含有する形質転換体、該タンパク質の製造方法、該タンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体、該抗体の製造方法、該タンパク質あるいは該遺伝子を含有している医薬を提供する。
【００１２】
また、本発明は、該タンパク質、ＤＮＡ、組換えベクターおよび形質転換体を用いて、II型コラーゲンの発現を阻害または促進する物質をスクリーニングする方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法もしくはスクリーニング用キットを用いて得られるII型コラーゲンの発現を阻害または促進する物質、該物質の製造方法、II型コラーゲンの発現を阻害または促進する物質を含有している医薬などを提供する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
マウスＥＣ（embryonal carcinoma）由来クローン化細胞株ＡＴＤＣ５は高率に軟骨分化が誘導されるのみならず、高い自己複製能を有する点で軟骨幹細胞に必須の要件を満たしている（Atsumi T.et al.:Cell Diff. Dev.,30 p109-116(1990) Shukunami C.et al.: J.Cell Biol.,133 p457-468(1996)）。最近この細胞を用いて軟骨分化の制御機構を解析することが可能となってきた。未分化ＡＴＤＣ５細胞をインスリン存在下で培養すると肢芽間充織細胞に見られるような細胞凝集領域が培養系内に出現する。凝集領域内にある特徴的な未分化細胞は前駆軟骨細胞と言えるもので、この領域内において増殖軟骨細胞へと分化が進行する。この時、発現するコラーゲンタイプはI型からII型へと劇的に変化する。II型コラーゲンを発現する軟骨細胞はゆっくり増殖して軟骨結節を形成する。さらにＸ型コラーゲンを発現する肥大軟骨細胞へと分化してついには細胞外基質が石灰化する。このようにＡＴＤＣ５細胞によって、軟骨のすべての分化段階をシミュレートできる。
【００１４】
一方、軟骨特異的な分子であるII型コラーゲンの発現制御に関しては、II型コラーゲンが軟骨で特異的に発現するのに必要な調節配列（エンハンサー）が、II型コラーゲン遺伝子の第１イントロン内に存在し、哺乳類のII型コラーゲン遺伝子間で保存されていることが報告されている（例えば、Lefebvre V.et al.:Mol.Cell.Biol.16 p4512-4523(1996), Lefebvre V.et al.:Mol.Cell.Biol.17 p2336-2346(1997), Bell,D.M.et al.:Nature Genet.16 p174-178(1997), Zhou G.et al.:J.Biol.Chem.272 p14989-14997(1998)）。
【００１５】
本発明者らは、かかる技術背景のもとに、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、オリゴキャッピング法を用いて完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製し、ＡＴＤＣ５細胞を用いた発現クローニング法による遺伝子機能アッセイ系を完成し、該アッセイ系によりII型コラーゲンの発現を制御する作用を有するタンパク質をコードする新規ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を単離することに成功した。この新規ＤＮＡは、ＡＴＤＣ５細胞内で発現させることによりII型コラーゲンの発現を促進させることができることを確認した。この結果は、該新規ＤＮＡがII型コラーゲンの発現に関与する分子であることを示しており、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１） 以下の（ａ）または（ｂ）の精製されたタンパク質。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８のいずれかにおいて１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつII型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質。
（２） 上記（１）記載のタンパク質とその全長にわたり少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質であり、かつII型コラーゲンの発現を促進する作用を有する、精製されたタンパク質。
（３） 上記（１）または（２）に記載のタンパク質であり、かつ軟骨細胞の分化を促進する作用を有するタンパク質。
（４） 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する、単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８のいずれかにおいて１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつII型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質。
（５） 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５または４７のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列。
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、II型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５または４７のいずれかにおいて、１若しくは複数個のヌクレオチド配列が欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド配列からなり、かつII型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
（６） 上記（４）記載のポリヌクレオチドと全長にわたり少なくとも９５％以上の同一性を有し、かつII型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
（７） 上記（５）記載のポリヌクレオチドと全長にわたり少なくとも９５％以上の同一性を有し、かつII型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオチド。
（８） 上記（４）〜（７）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド配列からなり、かつ軟骨細胞の分化を促進する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
（９） 上記（４）〜（７）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドによりコードされる精製されたタンパク質。
（１０） 上記（４）〜（７）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
（１１） 上記（１０）に記載の組換えベクターを含む形質転換された細胞。
（１２） 上記（１）または（２）に記載のタンパク質が膜タンパク質である場合における、上記（１１）記載の細胞の膜。
（１３） （ａ）上記（４）〜（７）のいずれか１つに記載の単離されたポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現する条件下で該ポリヌクレオチドを含有する形質転換された細胞を培養し、
（ｂ）培養物からタンパク質を回収する、
ことを含む、タンパク質の製造方法。
（１４） （ａ）個体のゲノムにおける上記（１）、（２）または（９）に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列中の変異の存在または不存在を決定し、および／または
（ｂ）該個体に由来するサンプル中での該タンパク質の発現量を分析する、
ことを含む該個体における該タンパク質の発現または活性に関連した、該個体における疾病または疾病への感受性の診断方法。好ましくは発現するタンパク質の量が正常の２倍以上の場合、あるいは２分の１以下の場合に病気であると診断する。
（１５） 以下の工程を含むII型コラーゲンの発現の阻害活性または促進活性について化合物をスクリーニングする方法。
（ａ）II型コラーゲンの発現を促進するタンパク質をコードする遺伝子およびII型コラーゲンの発現に対応した、検出可能シグナルを提供しうる成分を細胞に提供する工程、
（ｂ）該遺伝子が形質転換された細胞内で発現可能となる条件下で該形質転換された細胞を培養する工程、
（ｃ）該形質転換された細胞と１あるいは複数個の候補化合物とを接触させる工程、
（ｄ）検出可能なシグナルを測定する工程、および
（ｅ）該検出可能なシグナルの測定により活性化剤化合物および／または阻害剤化合物を単離もしくは同定する工程。
また、シグナルを正常より１．２倍以上増加させる化合物を活性化剤化合物として単離または同定し、０．８倍以下に減少させる化合物を阻害剤化合物として単離または同定することが好ましい。
（１６） 以下の工程を含む、医薬組成物を製造する方法。
（ａ）II型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子、および検出可能なシグナルを提供しうる成分を細胞に提供する工程、
（ｂ）該遺伝子が形質転換された細胞内で発現可能となる条件下で該形質転換された宿主細胞を培養する工程、
（ｃ）該形質転換された宿主細胞と１あるいは複数個の候補化合物とを接触させる工程、
（ｄ）検出可能なシグナルを測定する工程、
（ｅ）該検出可能なシグナルの測定により活性化剤化合物および／または阻害剤化合物を単離もしくは同定する工程、および
（ｆ）単離または同定された化合物を医薬組成物として最適化する工程。
また、本発明においては、シグナルを正常より１．２倍以上増加させる化合物を活性化剤化合物として単離または同定し、０．８倍以下に減少させる化合物を阻害剤化合物として単離または同定することが好ましい。
（１７） II型コラーゲンの発現の阻害活性または促進活性について化合物をスクリーニングするためのキットであって、
（ａ）II型コラーゲンの発現を促進するタンパク質をコードする遺伝子、およびII型コラーゲンの発現に対応した、検出可能なシグナルを提供しうる成分により形質転換された細胞、および
（ｂ）検出可能なシグナルを測定するための試薬
を含むキット。
（１８） 上記（１）、（２）または（９）に記載のタンパク質に特異的に結合するモノクローナルあるいはポリクローナル抗体。
（１９） 上記（１）、（２）または（９）に記載のタンパク質を抗原あるいはエピトープ含有フラグメントとして非ヒト動物に投与することからなる、上記（１）、（２）または（９）記載のタンパク質に特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造方法。
（２０） 上記（１）、（２）または（９）に記載のタンパク質を有効成分として含有する、軟骨細胞の分化促進剤。
（２１） 上記（１）、（２）、または（９）に記載のタンパク質をコードする遺伝子を有効成分として含有する、軟骨細胞の分化促進剤。
（２２） 上記（１）、（２）、または（９）に記載のタンパク質を有効成分として含有する、軟骨疾患予防治療剤。
（２３） 上記（１）、（２）、または（９）記載のタンパク質をコードする遺伝子を有効成分として含有する、軟骨疾患予防治療剤。
（２４） 軟骨疾患が、変形性関節症、軟骨欠損症、または慢性関節リウマチである上記（２２）または（２３）記載の軟骨疾患予防治療剤。
（２５） II型コラーゲンの発現を促進するタンパク質の発現を阻害する、上記（４）〜（７）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（２６） 上記（１）、（２）または（９）記載のタンパク質をコードするＲＮＡの開裂により、II型コラーゲンの発現を阻害するリボザイム。
（２７） 軟骨疾患の予防治療に有効な量の上記（１５）記載の方法でスクリーニングされた化合物および／または上記（１８）記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体および／または上記（２５）記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または上記（２６）記載のリボザイムを個体に投与することを含む疾患の治療法。
（２８） II型コラーゲンの発現を阻害または活性化するものとして上記（１６）に記載の方法により製造された医薬組成物。
（２９） 軟骨疾患の予防治療のための上記（２８）記載の医薬組成物。
（３０） 軟骨に関連する疾患を患っている患者に上記（１６）記載の方法により製造された医薬組成物を投与することからなる軟骨疾患を予防治療する方法。
（３１） 上記（１８）記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
（３２） 上記（２５）記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物。
（３３） 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５または４７で表されるヌクレオチド配列のうち少なくとも１以上を含むデータセットおよび／または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも１以上を含むデータセットを保存したコンピュータ読み込み可能媒体。
（３４） 上記（３３）に記載の媒体上のデータと他のヌクレオチド配列および／または他のアミノ酸配列のデータを比較して他のポリヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列との同一性の算出を行う方法。
（３５） 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５または４７から選択されるヌクレオチド配列の全てまたは一部を含むポリヌクレオチドが固定されている不溶性基質。
（３６） 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８で表されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリペプチドが固定されている不溶性基質。
【００１７】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の基本的特徴を更に明らかにするために、本発明の完成に至る経緯を追いながら、本発明について説明する。II型コラーゲンの発現を促進する作用を有する新規遺伝子を取得する目的で、実施例に示すように、以下の実験を実行した。
【００１８】
まずＡＴＤＣ５細胞（理研ジーンバンクより購入）あるいはヒト正常肺線維芽細胞（三光純薬株式会社より購入）より調製したｍＲＮＡより、オリゴキャッピング法によって完全長ｃＤＮＡを作製し、該ｃＤＮＡをベクターｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３（GenBank Accession AB009864）に組み込んだ完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製した。次に、該ｃＤＮＡライブラリーを大腸菌に導入し、１クローンずつプラスミドを調製した。次に、ＡＴＤＣ５細胞に、ルシフェラーゼをコードするＤＮＡの上流にII型コラーゲン遺伝子のプロモーター配列及びエンハンサー配列を含有するレポータープラスミド、すなわちII型コラーゲン遺伝子の発現を調べることができるレポータープラスミドと上記の完全長ｃＤＮＡプラスミドとを共導入した。そして、４８時間培養後、ルシフェラーゼ活性を測定し、ルシフェラーゼ活性が対照実験（完全長ｃＤＮＡの代わりに、ベクターｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３を入れた細胞）と比べて有意に上昇している（対照実験と比べてルシフェラーゼ活性が２倍以上の値を示した）プラスミドを選抜し、該プラスミドにクローニングされているｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列を決定した。このようにして得られたｃＤＮＡによりコードされるタンパク質は、該タンパク質がII型コラーゲンの発現に関与する分子であることを示している。
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質を提供し、これに関連して、さらに以下のタンパク質を提供する。
（ａ）上記アミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｂ）上記アミノ酸配列の１つを有するペプチド。
（ｃ）II型コラーゲンの発現を促進し、かつ上記アミノ酸配列において、１以上のアミノ酸の削除、置換または付加を有するタンパク質。
（ｄ）その全長にわたり配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８のアミノ酸配列に少なくとも９５％、好ましくは９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【００２０】
“同一性”とは、当該技術で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の適合によって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間の適合によって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味する。“同一性”は、既知の方法により容易に決定できる。同一性を決定する好ましい方法は、試験する配列間で最も長く適合するように設計される。同一性を決定するための方法は、公に利用可能なプログラムにコードされている。相同性決定には、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997)）を利用し決定することができる。BLASTのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。BLAST検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りであるが、これに限定されない。
【００２１】
アミノ酸置換行列とは２０種類のアミノ酸の各々のペアの類縁性を数値化した行列であり、通常BLOSUM62のデフォルトマトリックスが用いられる。このアミノ酸置換行列の理論についてはAltschul S.F., J.Mol.Biol.,219:555-565(1991)に、ＤＮＡ配列の比較への適用についてはStates D.J., Gish W., Altschul S.F., Methods, 3:66-70(1991)に示されている。その際の最適なギャップコストは経験的に決定されており、BLOSUM62の場合は好ましくは、Existence 11、Extension 1のパラメーターが用いられる。期待値（EXPECT）とは、データベース配列に対してマッチする際の統計的有意性に関する閾値であり、デフォルト値は１０である。
【００２２】
一例として、配列番号２のアミノ酸配列に対して例えば９５％以上の同一性を有するタンパク質は、そのアミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸１００個あたり５個までのアミノ酸の変化を含んでよいことを意味する。言い換えれば、対照アミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質は、対照配列中の全アミノ酸の５％までの数のアミノ酸が欠失または他のアミノ酸と置換していてもよく、あるいは、対照配列中の全アミノ酸配列のうち５％までの数のアミノ酸が対照配列中に挿入されたものであっても良い。対照配列におけるこれらの変化は、対照アミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端位置に存在していてもよく、あるいはそれらの末端間のいずれかの位置に存在していてもよく、あるいは対照配列内で１個またはそれ以上の一連の群をなしていてもよい。
【００２３】
上記した配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質がII型コラーゲンの発現を促進する作用を有することは、本明細書実施例に記載の通りである。
【００２４】
また、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５または４７のポリヌクレオチドを提供し、これに関連して、さらに以下の単離されたポリヌクレオチドを提供する。
（ａ）上記配列に少なくとも９５％、好ましくは９７〜９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
（ｂ）上記配列のポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８のアミノ酸配列に少なくとも９５％、好ましくは９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
【００２５】
上記ヌクレオチド配列に含まれるヌクレオチド配列に同一または実質的に同一なポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンまたは上記配列に対応する相同性の高い他の遺伝子のｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離するためのハイブリダイゼーションプローブとして、または核酸増幅反応のためのプライマーとして使用してもよい。代表的には、これらのヌクレオチド配列は、上記配列に７０％同一であり、好ましくは、８０％同一であり、より好ましくは９０％同一であり、最も好ましくは、９５％同一である。プローブまたはプライマーは、一般的には少なくとも１５ヌクレオチドを含有し、好ましくは３０ヌクレオチドを含有し、５０ヌクレオチドを含有してもよい。特に好ましいプローブは、３０〜５０ヌクレオチドを有する。特に好ましいプライマーは、２０〜２５ヌクレオチドを有する。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態（たとえば、ｃＤＮＡおよびクローニングによって得られるか、あるいは合成的に生成されるゲノムＤＮＡを含む）であってもよく、ＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ）の形態であってもよい。該ポリヌクレオチドは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドであってもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（コード鎖としても知られる）であっても、アンチセンス鎖（非コード鎖としても知られる）であってもよい。
【００２７】
当業者であれば、公知の方法を用いてこのタンパク質中のアミノ酸の置換などを適宜行ない、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と同様にII型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質を作製することが可能である。一つの方法としては、該タンパク質をコードするＤＮＡに対して、慣用の突然変異誘発法を使用する方法がある。別の方法としてはたとえば部位特異的変異法（たとえば宝酒造株式会社のＭｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ キット）が挙げられる。また、タンパク質のアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このようにアミノ酸の欠失、置換、付加により配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８のタンパク質に対してアミノ酸配列が変異した変異体であって、II型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質及び該タンパク質をコードするＤＮＡも本発明に含まれる。変異の数は、好ましくは１０以下、より好ましくは５以下、最も好ましくは３以下が好ましい。
【００２８】
アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のグループ内での置換が挙げられる。（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。
【００２９】
当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術などを用いて配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（たとえば配列番号２）またはその一部を基に、これと類似性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡから配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同様にII型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質を得ることも通常行い得ることである。このように上記した配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８で表されるアミノ酸配列のタンパク質と高い同一性を有するタンパク質であって、II型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。高い同一性とは、上記配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８で表されるアミノ酸配列の全長にわたり少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を示す。
【００３０】
本発明におけるII型コラーゲンの発現を促進する作用を有するとは、適切な細胞内に遺伝子を導入し該遺伝子にコードさせるタンパク質を過剰発現させた時、II型コラーゲンの発現が直接的あるいは間接的に促進される（II型コラーゲンの発現を誘発する）ことをいう。II型コラーゲンの発現は、例えば、II型コラーゲン遺伝子のプロモーター配列及び調節（エンハンサー）配列を用いて作製したII型コラーゲン遺伝子の発現を調べることができるレポータープラスミドを用いたレポーターアッセイにより測定できる。II型コラーゲンの発現を促進する作用を有するとは、II型コラーゲンの発現が対照実験（該タンパク質を過剰発現させてない細胞）に比し上昇させる作用を有することをいう。II型コラーゲンの発現上昇は、好ましくは、１．５倍以上、さらに好ましくは、２倍以上である。
【００３１】
II型コラーゲンの発現は、発現させたいタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えばｃＤＮＡ）を適切な発現ベクター内にクローニングし、該発現ベクターとII型コラーゲンの発現を調べることができるレポータープラスミドを適切な細胞に共導入（コ・トランスフェクション）し、一定時間培養後、レポーターの活性を測定することにより測定することができる。適切な発現ベクターは当業者にはよく知られており、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが挙げられる。レポーター遺伝子は、当業者がその発現を容易に検出できるものであれば良く、例えば、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子である。ルシフェラーゼをコードする遺伝子を使用することが最も好ましい。II型コラーゲンの発現を調べることができるレポータープラスミドとしては、例えば本明細書に記載のＣＰＥ４３が例示される。適切な細胞とは、例えばＡＴＤＣ５細胞が挙げられる。細胞培養および細胞への遺伝子導入（トランスフェクション）は、当業者であれば当技術分野で公知の慣用方法により実施でき最適化できる。
【００３２】
好ましい方法としては、細胞を細胞培養用９６穴プレートに７５００cells/wellの細胞数となるように、５％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）存在下の培地（１０μg/mlヒトトランスフェリン、０．３nmol/l亜セレン酸ナトリウムを含む、ＨＡＭ Ｆ−１２培地とＤ−ＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）を１：１で混合したもの）にまき、５％ＣＯ2存在下、３７℃で２４時間培養した後、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、ＣＰＥ４３レポータープラスミドと、発現ベクターを１ウエルに共導入する。３７℃で４８時間培養後、ロングタームルシフェラーゼアッセイシステムピッカジーンＬＴ２．０（東洋インキ社）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定することによりII型コラーゲンの発現を測定する。ルシフェラーゼ活性の測定は、例えばＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＷａｌｌａｃ ＡＲＶＯＴＭＳＴ １４２０ ＭＵＬＴＩＬＡＢＥＬ ＣＯＵＮＴＥＲを用いて測定できる。ＦｕＧＥＮＥ６による遺伝子導入の方法及びピッカジーンＬＴ２．０によるルシフェラーゼ活性測定は、それぞれに添付されているプロトコールに従い実施できる。ＦｕＧＥＮＥ６を用いた９６穴プレートでの遺伝子導入の方法は、１ウエルあたり、ＦｕＧＥＮＥ６の量は０．３〜０．５μｌが良く好ましくは０．４μｌであり、ＣＰＥ４３レポータープラスミドの量は５０〜１００ｎｇが良く好ましくは１００ｎｇであり、発現ベクターの量は５０〜１００ｎｇが良く好ましくは１００ｎｇである。II型コラーゲンの発現を促進する作用を有するとは、該レポーター活性（ルシフェラーゼ活性）を対照実験（空のベクターのみを導入した細胞）に比し上昇させる作用を有することをいう。レポーター活性の上昇は、好ましくは、１．５倍以上、さらに好ましくは、２倍以上である。
【００３３】
本発明のタンパク質としては、ヒトや哺乳動物のあらゆる細胞や組織に由来する天然のタンパク質でもよく、化学合成タンパク質であってもよく、また遺伝子組換え技術によって得られたタンパク質でもよい。タンパク質は糖鎖やリン酸化などの翻訳後修飾は受けていても受けていなくても良い。
【００３４】
本発明の遺伝子がコードするタンパク質としては、例えば、分泌タンパク質（増殖因子、サイトカイン、ホルモン等）、タンパク質修飾酵素（タンパク質リン酸化酵素、タンパク質脱リン酸化酵素、プロテアーゼ等）、シグナル伝達分子（タンパク間相互作用分子等）、核内タンパク質（核内受容体、転写因子等）、膜タンパク質が挙げられる。膜タンパク質は、受容体、細胞接着分子、イオンチャンネル、トランスポーター等が挙げられる。タンパク質が膜タンパク質である場合、後述するスクリーニングにより選択された化合物は、細胞内へ容易に移行することが予想されるため、医薬化合物のリサーチツールとしては、より有用である。
【００３５】
本発明は、上記で示される本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。上記の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列としてより具体的には、たとえば配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５または４７で表されるヌクレオチド配列が挙げられる。ＤＮＡはｃＤＮＡのほか、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡも含まれる。遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産されるタンパク質のアミノ酸配列を変えることなく配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドを他の種類のヌクレオチドに置換することができる。従って、本発明のＤＮＡはまた、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって変換されたヌクレオチド配列も含有する。このようなＤＮＡは、公知の方法により合成することができる。
【００３６】
本発明のＤＮＡは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５または４７で表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつII型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。ストリンジェントな条件とは、当業者には十分理解できることであり、たとえば、T.Maniatisらの実験操作書（Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory 1982、1989）などに従えば容易に実施できる。
【００３７】
すなわち、ストリンジェントな条件とは、３０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中（５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性せん断サケ精子ＤＮＡ）で３７℃のインキュベーションを一晩行い、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分の洗浄を３回行い、次いで１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で１０分の洗浄を２回行う条件である（低ストリンジエンシー）。より好ましい条件は、４０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃のインキュベーションを一晩行い、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分の洗浄を３回行い、次いで０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中、４２℃で１０分の洗浄を２回行う条件である（中ストリンジエンシー）。最も好ましい条件は、５０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃のインキュベーションを一晩行い、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分の洗浄を３回行い、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で１０分の洗浄を２回行う条件である（高ストリンジエンシー）。この際、得られたＤＮＡは、II型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質をコードすることが必須である。
【００３８】
本発明は、上記（４）あるいは（５）のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と高い類似性を有し、かつII型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質をコードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む。代表的には、これらのヌクレオチド配列は、上記（４）または（５）のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の全長にわたり９５％同一であり、より好ましくは９７％同一であり、最も好ましくは少なくとも９９％同一である。
【００３９】
本発明のタンパク質は、ＡＴＤＣ５細胞においてII型コラーゲンの発現を促進する作用を有している。軟骨細胞は、凝集した間葉系幹細胞から分化する。間葉系幹細胞は、軟骨細胞以外にも分化するが、軟骨細胞への分化したか否かは、軟骨細胞に特異的に発現するII型コラーゲンの産生有無で判断できる。II型コラーゲンが、軟骨細胞に特異的に発現する分子であることは、よく知られている（例えば、Horton W. et al.:Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 p8864-8868(1987)）。よって、II型コラーゲンの発現を促進する作用というのは、未分化軟骨細胞を成熟軟骨細胞へと分化促進する作用と同義である。また一方ＡＴＤＣ５細胞は、軟骨分化の全ての段階をシミュレートできる細胞株として世の中で認知されている（例えば、Atsumi T.et al.:Cell Diff. Dev.,30 p109-116(1990) 、Shukunami C.et al.: J.Cell Biol.,133 p457-468(1996)）。ＡＴＤＣ５細胞は軟骨前駆細胞の性質を有し、かつ増殖因子の刺激により軟骨細胞に分化する。未分化ＡＴＤＣ５細胞はII型コラーゲンを発現していないが、インスリン存在下で培養すると、コンフルエントに達した後に特有の細胞凝集領域が出現し、この領域から軟骨細胞が出現して、軟骨結節が形成される。軟骨結節の形成と並行してII型コラーゲンの発現が認められるようになることが報告されている（Shukunami C.et al.: J.Cell Biol.,133 p457-468(1996)）。すなわち本発明は、上記（１）または（２）に記載のタンパク質であり、かつ軟骨細胞の分化を促進する作用を有するタンパク質である。また本発明は、上記（４）〜（７）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド配列からなり、かつ軟骨細胞の分化を促進する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列である。
【００４０】
上記の本発明のＤＮＡは、前述のタンパク質を、組換えＤＮＡ技術を用いて製造するのに用いることができる。本発明のＤＮＡ及びペプチドは、概略以下のようにして得ることができる。
（Ａ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングする。
（Ｂ）タンパク質の全コード領域あるいはその一部をコードするＤＮＡを発現用ベクターに組み込んで、組換えベクターを構築する。
（Ｃ）構築した組換えベクターにより、宿主細胞を形質転換する。
（Ｄ）得られた細胞を培養し、該タンパク質、またはその類縁体を発現させ、カラムクロマトグラフィーなどにより精製する。
【００４１】
上記の工程中でＤＮＡ、組換え体宿主としての大腸菌等の取り扱いに必要な一般的な操作は、当業者間で通常行われているものであり、たとえば、上記Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの実験操作書に従えば容易に実施できる。使用する酵素、試薬類も全て市販の製品を用いることができ、特に断らない限り、製品で指定されている使用条件に従えば、完全にそれらの目的を達成することができる。以下に上記（Ａ）〜（Ｄ）の工程について更に詳しく説明する。
【００４２】
上記工程（Ａ）における本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本願明細書実施例に記載した方法の他に、本発明のヌクレオチド配列（たとえば配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５または４７）の一部を有する合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって増幅する方法、あるいは、適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別すること、などが挙げられる。細胞、組織より全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ-ＰＣＲ法）によって増幅することもできる。
【００４３】
適当なベクターに組み込んだＤＮＡとしては、たとえば市販されている（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）ライブラリーを使用することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、当業者間で通常行われているものであり、たとえば、上記Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの実験操作書に従えば容易に実施できる。クローン化された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。上記のようにして得られるＤＮＡは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５または４７に記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子であるか、あるいは前述の（４）〜（７）のポリヌクレオチドであればよい。上記工程（Ｂ）において発現ベクターに組み込むＤＮＡは、上述のタンパク質の全長をコードする全長ｃＤＮＡでも、ＤＮＡ断片でも良いし、その一部分を発現する様に構築されたＤＮＡ断片でも良い。
【００４４】
すなわち、本発明は、上記のＤＮＡを含有する組換えベクターを提供する。本発明のタンパク質の発現ベクターは、たとえば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００４５】
用いる発現ベクターとしては、複製可能であれば、大腸菌をはじめとする原核生物由来、酵母由来、真菌由来、昆虫ウイルス由来、脊椎動物ウイルス由来いずれのベクターでも良いが、宿主として使用する微生物または細胞に適したものを選択する必要がある。また、発現物に応じて、宿主細胞―発現ベクター系としては、適切な組み合わせが選択される。
【００４６】
微生物を宿主として使用する場合、これら微生物に適したプラスミドベクターが組換え体ＤＮＡの複製可能な発現ベクターとして一般に用いられる。
【００４７】
たとえば、大腸菌を形質転換するためのプラスミドベクターとしては、プラスミドｐＢＲ３２２やｐＢＲ３２７などを用いることができる。プラスミドベクターは通常複製起源、プロモーター、及び組換え体ＤＮＡで形質転換した細胞を選別するのに有用な表現型を組換え体ＤＮＡに与えるマーカー遺伝子等を含んでいる。プロモーターの例としては、β−ラクタマーゼプロモータ、ラクトースプロモーター、トリプトファンプロモーター等が挙げられる。マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子やテトラサイクリン遺伝子などが挙げられる。適した発現ベクターの例としては、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２７の他に、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等が挙げられる。
【００４８】
酵母で本発明のＤＮＡを発現するためには、複製可能なベクターとして、たとえばＹＥｐ２４を用いることができる。プラスミドＹＥｐ２４はＵＲＡ３遺伝子を含有しており、このＵＲＡ３遺伝子をマーカー遺伝子として利用することができる。酵母細胞用の発現ベクターのプロモーターの例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼなどの遺伝子のプロモーター等が挙げられる。
【００４９】
真菌で本発明のＤＮＡを発現するための発現ベクターに用いられるプロモーター及びターミネーターの例としては、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、アクチン等の遺伝子プロモーター及びターミネーターが挙げられる。適した発現ベクターの例としては、プラスミドｐＰＧＡＣＹ２、ｐＢＳＦＡＨＹ８３等が挙げられる。
【００５０】
昆虫細胞で本発明のＤＮＡを発現させるための発現ベクターに用いられるプロモーターの例としては、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが挙げられる。昆虫細胞に適した発現ベクターの例としては、バキュロウイルスなどが挙げられる。
【００５１】
動物細胞で本発明のＤＮＡを発現させるための組換えベクターは、一般に遺伝子を制御するための機能配列、たとえば、複製起源、本発明のＤＮＡの上流に位置すべきプロモーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位や転写終止配列を含有している。本発明のＤＮＡを真核細胞内で発現させるのに用いることができるそのような機能配列はウイルスやウイルス性物質から得ることができる。
【００５２】
例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の上流位置に本来存在するプロモーターも、上述の宿主−ベクター系で使用するのに適しているならば使用することができる。複製起源については、外来性の起源、たとえばアデノウイルス、ポリオーマ、ＳＶ４０等のウイルス由来の複製起点を用いることができる。また、発現ベクターとして宿主染色体に組み込まれるような性質を有するベクターを用いる場合、宿主染色体の複製起源を利用することができる。適した発現ベクターの例としては、プラスミドｐＳＶ−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣＣ ３７１１１）、ｐｃＤＮＡ３．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）、ｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３等が挙げられる。
【００５３】
本発明は、上記の組換えベクターを含む形質転換された細胞である。本発明の複製可能な組換えベクターで形質転換された微生物または細胞は、前述の通り、組換えベクターに与えられた少なくとも１種の表現型によって形質転換されずに残った親細胞から選別される。表現型は少なくとも１種のマーカー遺伝子を組換えベクターに挿入することによって与えることができる。また複製可能なベクターが本来有しているマーカー遺伝子を利用することもできる。マーカー遺伝子の例としては、たとえば、ネオマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子やジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子などが挙げられる。
【００５４】
上記工程（Ｃ）において用いる宿主としては、大腸菌をはじめとする原核生物、酵母、真菌等の微生物、及び昆虫や動物等の細胞のいずれでも良いが、用いる発現ベクターに適したものを選択する必要がある。微生物の例としては、エシュリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株、たとえばＥ．ｃｏｌｉＫ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３７）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６００、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ株、あるいはバチラス サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の如きＢａｃｉｌｌｕｓ属の菌株、あるいはサルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチア マーゼサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ）等の大腸菌以外の腸内菌、あるいはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の種々の菌株が挙げられる。
【００５５】
酵母としては、たとえば、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。真菌としては、たとえば、アスペルギルス ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アクレモニウム クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）（ＡＴＣＣ １１５５０）等が挙げられる。
【００５６】
昆虫細胞としては、たとえば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ：Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、などが用いられる。動物細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＤＣ５細胞等が挙げられる。これらの中でも、ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ２９３細胞が好ましい。細胞を宿主とする場合、用いられる発現ベクターと宿主細胞の組合せは実験の目的により異なるが、その組合せにより、一過的発現、構成的発現の２種類の発現方式が考えられる。
【００５７】
上記工程（Ｃ）における微生物及び細胞の形質転換とは、ＤＮＡを強制的方法や、細胞の貪食能により微生物や細胞に取り込ませ、プラスミド状態あるいは染色体に組み込まれた状態でＤＮＡの形質を一過的あるいは構成的に発現させることである。当業者であれば公知の方法によって形質転換できる（たとえば実験医学別冊遺伝子工学ハンドブック）。たとえば動物細胞の場合、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、リポフェクション法などの方法でＤＮＡを細胞に導入することができる。動物細胞を用いて、本発明のタンパク質を安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のタンパク質の高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＤＨＦＲ）遺伝子を選択マーカーとして用いた場合Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（ＭＴＸ）濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ＤＨＦＲ遺伝子とともに、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。
【００５８】
上記の形質転換された細胞を本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明のタンパク質を生成、蓄積せしめることによって、本発明のタンパク質を製造することができる。すなわち、本発明は、上記（４）〜（７）に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む形質転換された細胞を、該ポリヌクレオチドによりコードされているタンパク質を発現させる条件下培養し、次いで培養物から該タンパク質を回収することを含む該タンパク質の製造方法である。
【００５９】
上記の形質転換された細胞の培養は、当業者に公知の方法で行なうことができる（たとえばバイオマニュアルシリーズ４、羊土社）。たとえば動物細胞の場合、各種の動物細胞培養法、たとえば、シャーレ培養、マルチトレー式培養、モジュール培養などの付着培養、または細胞培養用担体（マイクロキャリアー）に付着させるか生産細胞自体を浮遊化させ浮遊培養等の公知の方法により培養を行なえば良い。培地は通常良く用いられる動物細胞用の培地、たとえばＤ−ＭＥＭやＲＰＭＩ１６４０等を用いれば良い。
【００６０】
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。たとえば、本発明のタンパク質は、硫安またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスフォセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む既知の方法により組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィーが精製に使用される。ポリペプチドが細胞内合成、単離または精製の間に変性するときには、活性なコンフォメーションを再生するためにタンパク質をリフォールディングするためのよく知られた技術を使用できる。
【００６１】
本発明のタンパク質を他のタンパク質との融合タンパク質として製造することができる。これらも、本発明に含まれる。この融合タンパク質を発現する際に用いられるベクターとしては、該タンパク質をコードするＤＮＡを組み込むことができ、かつ該融合タンパク質を発現することができるベクターであれば、いかなるベクターでも用いることができる。本発明のペプチドに融合できるタンパク質としては、たとえばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジン残基の６個の連続配列（６×Ｈｉｓ）等が挙げられる。本発明のタンパク質を他のタンパク質と融合したタンパク質として発現させた場合には、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、有利である。例えば、ＧＳＴとの融合タンパク質として生産した場合は、グルタチオンをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００６２】
本発明は、上記（９）のタンパク質の活性を阻害するタンパク質を含む。たとえば、抗体や、上記（９）のタンパク質の活性中心等に結合し活性の発現を妨げる他のタンパク質が挙げられる。
【００６３】
本発明は、前記の本発明のタンパク質あるいはその部分ペプチドに特異的に結合する抗体ならびにそのような抗体の製造方法に関する。抗体は、本発明のタンパク質を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびにこれらの抗体のフラグメント、一本鎖抗体、ヒト化抗体の何れであってもよい。抗体フラグメントは、公知の技術によって作製することができる。たとえば、該抗体フラグメントには、限定されるものではないが、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂフラグメント及びＦｖフラグメントが含まれる。たとえば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、上記（１）または（２）に記載のタンパク質を抗原またはエピトープ含有フラグメントとして非ヒト動物に投与することにより得られる。本発明のタンパク質に対する抗体は、本発明のタンパク質あるいはそのペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。たとえば実験医学別冊 新遺伝子工学ハンドブック 改訂第３版に記載の方法が挙げられる。
【００６４】
ポリクローナル抗体の場合であれば、たとえば、本発明のタンパク質をウサギなどの動物に本発明のタンパク質あるいはペプチドを注射することにより該タンパク質あるいはペプチドに対する抗体を産生させ、次いで血液を採取し、これを、たとえば硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、あるいは該タンパク質を固定化したアフィニティーカラム等によって精製することで調製することができる。
【００６５】
モノクローナル抗体の場合は、たとえば、本発明のタンパク質をマウスなどの動物に免疫し、同マウスから脾臓を抽出し、これをすりつぶして細胞にし、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、本発明のタンパク質に対する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウス内より腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、たとえば硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、あるいは該タンパク質を固定化したアフィニティーカラム等によって精製することで調製することができる。
【００６６】
得られた抗体をヒトに投与する目的で使用する場合は、免疫原性を低下させるために、ヒト型化抗体あるいはヒト抗体を用いることが好ましい。ヒト型化抗体は、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を用いて作製することができる。これらのヒト型化抗体やヒト抗体の一般的概説は、たとえば、Morrison,S.L.et al.〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)〕、Jones,P.T.et al〔Nature 321:522-525(1986)〕、野口浩〔医学のあゆみ 167:457-462(1993)〕、松本隆志〔化学と生物 36:448-456(1998)〕によって供されている。ヒト化キメラ抗体は、マウス抗体のＶ領域とヒト抗体のＣ領域を遺伝子組換えにより結合し、作製することができる。ヒト化抗体は、マウスのモノクローナル抗体から相補性決定部位（ＣＤＲ）以外の領域をヒト抗体由来の配列に置換することによって作製できる。また、免疫系をヒトのものと入れ換えたマウスを用いて、該マウスを免疫して、通常のモノクローナル抗体と同様に直接ヒト抗体を作製することもできる。
【００６７】
これらの抗体は、タンパク質を発現するクローンを単離したり同定するのに使用できる。また、これらの抗体は、本発明のタンパク質を細胞抽出液、または本発明のタンパク質を産生する形質転換細胞から精製するのに使用できる。更にこれらの抗体は、細胞や組織中の本発明のタンパク質を検出するＥＬＩＳＡやＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、またはウエスタンブロット系の構築に使用できる。このような検出系は、動物、好ましくは、ヒトの組織または血管内流体などの身体サンプル中に存在する本発明のタンパク質の存在量を検出する診断目的に使用することができる。たとえば、これらの抗体は、変形性関節症、慢性関節リウマチなどの本発明のタンパク質の（発現）異常に起因する軟骨の異常によって特徴付けられる疾患の診断に使用できる。
【００６８】
疾患の診断の基礎を提供するために、本発明のタンパク質の発現についての通常の値、すなわち標準値が確立されなければならないが、これは当業者においては周知の技術である。すなわち、複合体形成のための適切な条件下で、ヒトあるいは動物のどちらでもよいが、正常の被験者から得られた体液あるいは細胞抽出物と、本発明のタンパク質に対する抗体とを結合させ、この抗体−タンパク複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原（本発明のタンパク質）を含む標準液を用いて作成した標準曲線を用いて、正常サンプルから得られた標準値を算出する。標準値と本発明のタンパク質が関係する疾患を潜在的に患う被験者からのサンプルから得られた値と比較し、標準値との偏差によって疾病の存在を確認することができる。また、これらの抗体は、本発明のタンパク質の機能を研究する試薬としても用いることができる。
【００６９】
本発明の抗体は精製され、次いで、たとえば、本発明のタンパク質の発現異常に起因するII型コラーゲンの発現異常および／または軟骨細胞分化異常によって特徴付けられる疾患の患者に投与され得る。すなわち本発明は、上記に記載の抗体を有効成分として含有する医薬、および抗体を用いた治療方法である。これらの医薬は治療的使用のためにさらなる有効成分または不活性成分（たとえば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（たとえば、免疫原性アジュバント））と、生理学的に無毒の安定化剤および賦形剤とともに組み合わされ得る。これらの組み合わせは、濾過滅菌され、そして凍結乾燥により投薬バイアル中に、または安定化水性調製物中の貯蔵物として投薬形態にされ得る。患者への投与は、たとえば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などの当業者に公知の方法により行い得る。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。これらの抗体は、本発明のタンパク質で仲介されるII型コラーゲンの発現異常および／または軟骨細胞の異常分化を阻害し、治療効果を示す。
【００７０】
本発明のＤＮＡは、軟骨細胞の分化制御に関わるタンパク質を単離、同定、クローン化することにも使用できる。たとえば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、コードされたタンパク質を「バイト（ｂａｉｔ）」として用いて、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーから、本発明のタンパク質に結合できるタンパク質をコードする他の配列「プレイ（ｐｒｅｙ）」を単離し、クローン化する酵母ツーハイブリッドシステム（たとえばNature、340:245-246(1989)）に用いることができる。同様の方式で、本発明のタンパク質が、他のタンパク質に結合できるかどうかも決定することができる。あるいは別の方法として、本発明のタンパク質の抗体を用いた免疫沈降法（たとえば、実験医学別冊新遺伝子工学ハンドブック）によって、本発明のタンパク質に結合し得るタンパク質を細胞抽出物から単離する方法が挙げられる。さらに別の方法として、上記に記載のように、本発明のタンパク質を他のタンパク質との融合タンパク質として発現させ、融合タンパク質に対する抗体を用いて免疫沈降法を行ない、本発明のタンパク質に結合し得るタンパク質を単離する方法が挙げられる。
【００７１】
本発明は、前述の方法により、II型コラーゲンの発現を促進する機能を持つ（１）、（２）または（９）のタンパク質をコードする遺伝子中の変異を検出するアッセイを行い、疾患の診断や該疾患への感受性を診断するための方法を提供する。さらに、このような疾患は、個体に由来するサンプル中のタンパク質またはｍＲＮＡレベルの異常な減少または増加を測定することを含む方法によって診断してもよい。発現の減少または増加は、当該技術でＲＮＡレベルでのポリヌクレオチドの定量によく知られた方法、たとえば、ＲＴ−ＰＣＲなどの核酸増幅法、およびＲＮａｓｅ保護法、ノーザンブロット法その他のハイブリダイゼーション法などの方法で測定できる。宿主に由来するサンプル中のタンパク質レベルの測定に使用され得るアッセイ技術は、当業者によく知られている。そのような方法には、ラジオイムノアッセイ、競合的結合測定法、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。本発明のＤＮＡは、本発明のタンパク質またはそのペプチドフラグメントをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡにおける異常を検出するのに使用できる。本発明は、個体における上記（１）、（２）または（９）に記載のタンパク質の発現に関連した疾患または疾患への感受性を診断する方法に関する。該方法は、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列における変異を、測定することを含む。
【００７２】
本発明のＤＮＡは、本発明のＤＮＡを用いることによって、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常を検出することができるので、たとえば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、増加あるいは発現過多などの遺伝子診断に有用である。すなわち本発明は、生物個体における該タンパク質の発現または活性に関連した、該個体における疾病または疾病への感受性の診断方法であって、
（ａ）個体のゲノムにおける上記（１）、（２）または（９）に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列中の変異の存在または不存在を決定し、および／または
（ｂ）該個体に由来するサンプル中での該タンパク質の発現量を分析する、ことを含む方法を提供する。例えば、タンパク質の発現量の程度に基づき疾患であるか否かの判断は行うことができ、発現量に基づく判断基準の好ましい一例としては、発現するタンパク質の量が正常の２倍以上あるいは１／２以下の場合に病気であると診断する。
【００７３】
上記診断方法の工程（ａ）により、II型コラーゲンの発現を促進する作用および／または軟骨細胞の分化を促進する作用を持つ（１）、（２）または（９）のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に変異があることが検出された場合は、該変異がII型コラーゲンの発現異常および／または軟骨細胞の分化に関連した疾病を引き起こす可能性がある。あるいは、上記診断方法の工程（ｂ）により、被験者における前記（１）、（２）または（９）のタンパク発現量を測定し正常値と異なる値を示す場合は、II型コラーゲンの発現を促進する作用および／または軟骨分化を促進する作用を持つ本発明の新規タンパク質の発現量異常が、II型コラーゲンの発現異常及び／または軟骨細胞の異常に関連した疾病の原因である可能性がある。ここで、工程（ａ）のII型コラーゲンの発現作用を促進する作用および／または軟骨細胞の分化を促進するを持つ（１）、（２）または（９）のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の変異の有無を測定する方法としては、例えば、それらのタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の一部をプライマーとして、ＲＴ−ＰＣＲを行い、その後通常のヌクレオチド配列決定方法によって配列を決定し、変異の有無を検出できる。あるいは、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Genomics、5:874-879、1989年、実験医学別冊新遺伝子工学ハンドブック）によっても変異の有無を調べることができる。また、工程（ｂ）のタンパク発現量を調べる方法としては、たとえば、前記（１９）に記載の抗体を利用する方法などが挙げられる。
【００７４】
また、本発明は、本発明のタンパク質によるII型コラーゲンの発現および／または軟骨細胞の分化を阻害または促進する化合物のスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法は、
（ａ）II型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子および検出可能なシグナルを提供し得る成分を細胞に提供する工程、
（ｂ）該遺伝子が形質転換された細胞内で発現可能となる条件下で形質転換された宿主細胞を培養する工程、
（ｃ）該形質転換された細胞と１あるいは複数個の被検化合物とを接触させる工程、
（ｄ）検出可能なシグナルを検出する工程、および
（ｅ）該検出可能なシグナルの測定により活性化剤化合物および／または阻害剤化合物を単離または同定する工程、を含む。
【００７５】
また、シグナルを正常より１．２倍以上増加させる化合物を活性化剤化合物として単離または同定し、０．８倍以下に減少させる化合物を阻害剤化合物として単離または同定することが好ましい。
【００７６】
検出可能なシグナルを提供し得る成分としては、たとえばレポーター遺伝子が挙げられる。レポーター遺伝子は、テストを行なう転写因子の活性化を直接検出するかわりに用いられるもので、調べたい遺伝子のプロモーターをレポーター遺伝子につなぎ、レポーター遺伝子の産物の活性を測定することによってプロモーターの転写活性の解析を行なうものである（バイオマニュアルシリーズ４、羊土社（１９９４））。
【００７７】
レポーター遺伝子としては、その発現産物の活性または生産量（ｍＲＮＡの生産量も含まれる）を当業者が測定可能なものであれば、いかなるペプチド、タンパク質をコードする遺伝子も用いることができる。たとえば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダ−ゼ、ルシフェラーゼ等の酵素活性を測定することで利用できる。II型コラーゲンの発現を評価するのに用いるレポータープラスミドとしては、II型コラーゲン遺伝子のプロモーター配列およびII型コラーゲンが軟骨で特異的に発現するのに必要な調節配列をレポーター遺伝子の上流に組み込んだものであればよく、たとえば本明細書実施例に記載のＣＰＥ４３が利用できる。あるいは、Murakami S.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96 p1113-1118（2000）に記載のレポータープラスミド（48-bp chondrocyte-specific Col2a1 enhancer construction）が例示される。
【００７８】
宿主細胞としては、II型コラーゲンの発現を検出し得る細胞であればよく、好ましくは、哺乳動物細胞であり、たとえばＡＴＤＣ５細胞が好適に用いられる。形質転換及び培養に関しては、上記に記載の通りである。
【００７９】
II型コラーゲンの発現を阻害または促進する化合物のスクリーニングは、具体的には、たとえば、一定時間培養した形質転換細胞に、被験物質を任意の量添加し、一定時間後の該細胞が発現するレポーター活性を測定し、被験物質を添加しない細胞のレポーター活性と比較することにより、II型コラーゲンの発現を阻害または促進する化合物をスクリーニングすることができる。レポーター活性の測定は、当業者に公知の方法（たとえばバイオマニュアルシリーズ４、羊土社（１９９４））で行なうことができる。スクリーニングの被検物質には特に制限はなく、低分子化合物、ペプチドなどが挙げられる。被検化合物は、人工的に合成したものであっても、天然に存在するものであっても良い。また単一物質でも、混合物でもい。検出可能なシグナルとしては、上記レポーター遺伝子の他に、II型コラーゲンのｍＲＮＡ量あるいはタンパク量を測定しても良い。ｍＲＮＡ量の測定は、たとえばノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ法などが挙げられる。タンパク量の測定はたとえば抗体を用いる方法が挙げられる。抗体は公知の方法によって作製しても良いし、市販のもの（たとえばSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY社）を使用することもできる。
【００８０】
また、本発明は、上記本発明のタンパク質を有効成分として含有する、軟骨細胞の分化促進剤および軟骨疾患予防治療剤を提供する。また本発明は、上記本発明のタンパク質をコードする遺伝子を有効成分として含有する、軟骨細胞の分化促進剤および軟骨疾患予防治療剤を提供する。本発明のタンパク質あるいは該タンパク質をコードする遺伝子は、II型コラーゲンの発現を促進することおよび／または未分化軟骨細胞を成熟軟骨細胞へと分化促進することにより、軟骨の障害が関与する各種疾患の予防・治療に有効に用いられる。該疾患とは、例えば、変形性関節症、軟骨形成異常症、骨折における軟骨の欠損、外傷による関節軟骨または関節円板の損傷、結核性関節炎、慢性関節リウマチ、椎間板ヘルニアまたは変形性脊椎症などが挙げられる。
【００８１】
本発明の軟骨細胞分化剤および軟骨障害治療剤のうち、タンパク質を有効成分とする際には、以下のような投与形態、投与方法および投与量が使用されうる。すなわち治療的使用のためにさらなる有効成分または不活性成分（たとえば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（たとえば、免疫原性アジュバント））と、生理学的に無毒の安定化剤および賦形剤とともに組み合わされ得る。これらの組み合わせは、濾過滅菌され、そして凍結乾燥により投薬バイアル中に、または安定化水性調製物中の貯蔵物として投薬形態にされ得る。患者への投与は、静脈注射による投与が好ましいが、経口投与、坐薬としての投与、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与などが行える。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。たとえば一日量０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ程度を投与することが可能である。
【００８２】
本発明の軟骨細胞分化促進剤および軟骨障害治療剤のうち、遺伝子を有効成分とし、遺伝子治療剤として使用する際には、以下のような遺伝子導入方法、導入形態および導入量が使用され得る。
【００８３】
すなわち、本発明の遺伝子治療剤の患者への導入方法としては、遺伝子を直接体内の細胞に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法、およびヒトからある種の細胞を取り出し体外で遺伝子を該細胞に導入し、その細胞を生体に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法がある。
【００８４】
ｉｎ ｖｉｖｏ法としては、ウイルスベクターを用いる方法及び非ウイルスベクターを用いる方法いずれの方法も適用することができる（たとえば実験医学別冊バイオマニュアルＵＰシリーズ遺伝子治療の基礎技術、細胞工学Vol.20 No.9(2001)）。
【００８５】
組換えウイルスを用いる方法としては、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス等のウイルスに、本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法等が挙げられる。ｅｘ ｖｉｖｏ法としては、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が用いられる。
【００８６】
患者への投与方法は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮肉、筋肉内等に投与することができる。製剤中の遺伝子の含量は、当業者であれば、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができる。
【００８７】
また、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程により医薬組成物を製造することも可能である。
（ａ）II型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子および検出可能なシグナルを与えることができる成分を細胞に提供する工程、
（ｂ）該遺伝子が形質転換された細胞内で発現可能となる条件下で形質転換された宿主細胞を培養する工程、
（ｃ）該形質転換された宿主細胞と１あるいは複数個の化合物とを接触させる工程、
（ｄ）検出可能なシグナルを測定する工程、
（ｅ）該検出可能なシグナルの測定により活性化剤化合物および／または阻害剤化合物を単離または同定する工程、および
（ｆ）単離または同定された化合物を医薬組成物として最適化する工程。
【００８８】
また、上記医薬組成物製造方法の工程（ｅ）においては、シグナルを正常より１．２倍以上増加させる化合物を活性化剤化合物、０．８倍以下に減少させる化合物を阻害化合物として単離または同定することが好ましい。
【００８９】
本発明のタンパク質は、以下の工程により、該タンパク質のアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤を、構造を基礎にして設計する方法に使用してもよい。
（ａ）まず、タンパク質の三次元構造を決定する工程、
（ｂ）アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の反応性部位または結合部位と思われる部位の三次元構造を推論する工程、
（ｃ）推論した結合部位または反応性部位に結合するかあるいは結合すると予測される候補化合物を合成する工程、および
（ｄ）該候補化合物が本当にアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤であるか否かを試験する工程。
【００９０】
また本発明は、上記スクリーニングによって得られた化合物を含む。しかしながら、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物の製造方法は、上記の方法に限定されるものではない。さらに、上記（１６）に記載の方法により医薬組成物を製造する方法も含む。
【００９１】
該候補化合物には特に制限はなく、低分子化合物、ペプチドなどが挙げられ、また、人工的に合成したものであっても、天然に存在するものであっても良い。上記スクリーニングによって得られた化合物は、II型コラーゲンの発現を阻害または促進する作用を有しているので、II型コラーゲンの発現異常および／または軟骨細胞の分化異常に起因する疾患を治療または予防するための医薬として有用である。混合物から目的化合物を単離、精製するには、自体公知の方法、例えば濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、結晶化、各種クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて行なうことができる。化合物の塩を取得したい時は、化合物が塩の形で得られる場合にはそのまま精製すれば良く、また遊離の形で得られる場合には、通常の方法により適当な溶媒に溶解または懸濁し、所望の酸または塩基を添加し、塩を形成させて単離精製すれば良い。
【００９２】
本発明の方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として最適化する工程としては、例えば以下のような常法により製剤化する方法が例示される。すなわち活性成分として有効な量の上記化合物またはその薬理的に許容される塩と、薬理的に許容される担体とを混合すれば良い。製剤化は、選択された投与様式に適した形態が選ばれる。経口投与に適した組成物としては、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、および散剤などの固体形態、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁液剤などの液体形態が挙げられる。非経口投与に有用な形態としては、無菌溶液剤、乳剤、および懸濁液剤が挙げられる。上記の担体としては、例えばゼラチン、乳糖、グルコース等の糖類、コーン・小麦・米・とうもろこし澱粉等の澱粉類、ステアリン酸等の脂肪酸、ステアリン酸カルシウム・ステアリン酸マグネシウム等の脂肪酸塩、タルク、植物油、ステアリンアルコール・ベンジルアルコール等のアルコール、ガム、ポリアルキレングリコール等が挙げられる。これらのうち液状担体の例としては、一般に水、生理食塩水、デキストロースまたは類似の糖溶液、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のグリコール類が挙げられる。
【００９３】
本発明は、II型コラーゲンの発現の阻害活性または促進活性について化合物をスクリーニングするためのキットを提供する。該キットは、
（ａ）II型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子およびII型コラーゲンの発現を促進後、検出可能なシグナルを提供しうる成分により形質転換された細胞、
（ｂ）検出可能なシグナルを測定するための試薬、から成り、II型コラーゲンの発現を阻害または促進する化合物をスクリーニングするために必要な試薬類、
を含む。
【００９４】
別の側面において、本発明は、
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５または４７で表されるヌクレオチド配列を有する本発明のポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８で表されるアミノ酸配列を有する本発明のタンパク質またはそれらの断片；または
（ｄ）（ｃ）の本発明のタンパク質に対する抗体；
を含む診断キットを提供する。
【００９５】
少なくとも上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかを含む診断キットは、変形性関節症、慢性関節リウマチおよび軟骨欠損症などの疾患または該疾患への感受性を診断するのに有用である。
【００９６】
本明細書中に報告するII型コラーゲンの発現を促進する作用を有する新規タンパク質の発見により、軟骨の障害が関与する疾患の治療または予防する新しい医薬および治療方法が提供された。さらなる具体例において、本発明は、軟骨細胞の増殖・分化を制御するための前記のII型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質の機能を活性化または阻害する化合物を用いる方法に関する。上記スクリーニング方法によって得られた、II型コラーゲンの発現を活性化または阻害する化合物は、軟骨の障害が関与する疾患の治療または予防する医薬として有用である。該疾患とは、例えば、変形性関節症、軟骨形成異常症、骨折における軟骨の欠損、外傷による関節軟骨または関節円板の損傷、結核性関節炎、慢性関節リウマチ、椎間板ヘルニア、変形性脊椎症、異所性骨化および異所性石灰化などが挙げられる。
【００９７】
更に、本発明のタンパク質や該タンパク質をコードするＤＮＡは、診断目的にも使用できる。
【００９８】
上記本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を上述の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。たとえば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、たとえば、ヒトや哺乳動物（たとえば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。患者への投与は、たとえば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行いうる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢などにより変動するが、当業者であれば適宜投与方法を選択すると共に、投与方法に応じて適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。すなわち本発明は、II型コラーゲンの発現を阻害または活性化する化合物を有効成分として含有する医薬を提供する。
【００９９】
さらに、上記化合物は、軟骨の障害が関与する疾患の治療または予防する医薬として有用である。すなわち本発明は、II型コラーゲンの発現を阻害または活性化する化合物を含む、軟骨疾患予防または治療のための医薬を提供する。具体的には、例えば、変形性関節症、軟骨形成異常症、骨折における軟骨の欠損、外傷による関節軟骨または関節円板の損傷、結核性関節炎、慢性関節リウマチ、椎間板ヘルニア、変形性脊椎症、異所性骨化、異所性石灰化などに対する治療及び予防薬として有用である。
【０１００】
さらにまた、本発明は、変形性関節症、軟骨形成異常症、骨折における軟骨の欠損、外傷による関節軟骨または関節円板の損傷、結核性関節炎、慢性関節リウマチ、椎間板ヘルニア、変形性脊椎症、異所性骨化、異所性石灰化などの医薬の製造における上記（１６）記載の方法により製造された医薬組成物の使用も含む。
【０１０１】
また本発明は、上記（４）〜（７）に記載のポリヌクレオチドに対するアンチセンスオリヌクレオチドを提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的とした遺伝子配列に対して相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドを用いて、タンパク質への翻訳、細胞質への輸送、あるいは全体的な生物活性機能に必要な他の活性等のＲＮＡの機能を阻害することによって、標的遺伝子の発現を抑制することができる。この際、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ＲＮＡを用いても良いし、ＤＮＡを用いても良い。本発明のＤＮＡ配列は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製するために使用できる。一般にアンチセンスオリゴヌクレオチドが、その遺伝子の発現に対して抑制的に作用することは公知での事実である（たとえば、細胞工学 Vol.13 No.4(1994)）。本発明のタンパク質をコードする遺伝子に対するアンチセンスコード配列を有するオリゴヌクレオチドは、標準の方法で細胞内に導入することができ、該オリゴヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を効果的に遮断して、その発現を遮断して、望ましくない作用を抑制することができる。
【０１０２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然に見出されるオリゴヌクレオチドの他に、修飾されたものであっても良い〔たとえば、村上＆牧野：細胞工学 Vol.13 No.4 p259-266(1994)、村上章：蛋白質核酸酵素 Vol.40 No.10 p1364-1370(1995)、竹内恒成ら：実験医学 Vol.14 No.4 p85-95(1996)〕。従って、オリゴヌクレオチドは変化した糖部分あるいは糖間部分を有していても良い。これらの例は、当該技術分野において使用が知られているホスホチオエート及び他のイオウ含有種である。幾つかの好ましい態様に従えば、オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのホスホジエステル結合が、その活性が調節されるべきＲＮＡが位置する細胞の領域に浸透する組成物の能力を高める機能を有する構造により置換される。
【０１０３】
このような置換は、ホスホロチオエート結合、ホスホロアミデート結合、メチルホスホネート結合または短鎖アルキルもしくはシクロアルキル構造を含むことが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、幾つかの修飾されたヌクレオチド型を含んでいても良い。従って、天然に通常見いだされるもの以外のプリン及びピリミジンを使用していても良い。同様に本発明の本質的な意図が実行される限り、ヌクレオチドサブユニットのフラノシル部分を修飾することもできる。このような修飾の例は、２’−Ｏ−アルキル−、及び２’−ハロゲン置換ヌクレオチドである。本発明において有用な幾つかの糖部分の２’位の修飾の例は、ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ3、ＯＣＨ3、ＯＣＮ、またはＯ（ＣＨ2）ｎＣＨ3（ここでｎは１から約１０である）、及び同様の特性を有する他の置換基である。全てのこのような類似体は、本発明の遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズしてそのＲＮＡの機能を阻害する機能を果たす限り、本発明に包含される。
【０１０４】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約３から約５０ヌクレオチドを含み、約１５から約３０ヌクレオチドを含むことが好ましく、約２０から約２５ヌクレオチドを含むことがさらに好ましい。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、周知の方法である固相合成法により作製することができる。このような合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含む幾つかの業者により販売されている。ホスホチオエート等の他のオリゴヌクレオチドの製造も当業者に公知の方法で作製できる。
【０１０５】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の遺伝子から転写されるｍＲＮＡとハイブリダイズできるように設計される。与えられた遺伝子の配列に基づいてアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する方法は、当業者であれば容易である〔たとえば、村上および牧野：細胞工学 Vol.13 No.4 p259-266(1994)、村上章：蛋白質核酸酵素 Vol.40 No.10 p1364-1370(1995)、竹内恒成ら：実験医学 Vol.14 No.4 p85-95(1996)〕。最近の研究は、ｍＲＮＡの５’領域、好ましくは翻訳開始部位を含む領域に設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが、遺伝子の発現の阻害に最も効果的であることを示唆している。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、１５から３０ヌクレオチドが好ましく、２０から２５ヌクレオチドがより好ましい。ホモロジー検索で他のｍＲＮＡとの相互作用がないこと、オリゴヌクレオチド配列内で二次構造を取らないことを確認しておくことが望ましい。設計したアンチセンス分子が機能したかどうかの評価は、適当な細胞を用いて、該細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入し、当業者には公知の方法で、対象ｍＲＮＡの量（たとえば、ノーザンブロット法またはＲＴ−ＰＣＲ法）、あるいは対象タンパク質の量（たとえば、ウエスタンブロットまたは蛍光抗体法）を測定することにより、発現抑制の効果を確認できる。
【０１０６】
一方、三重らせん形成（トリプル・ヘリックス技術）は、核内のＤＮＡを標的とした、主に転写の段階での遺伝子発現制御方法である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、主に転写に関与する遺伝子領域に設計され、それにより、転写及び本発明のタンパク質の産生を抑える。これらのＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドは、公知の合成装置などを用いて製造することができる。
【０１０７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列を含む細胞に、たとえばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法などのＤＮＡトランスフェクション法、またはウイルスなどの遺伝子導入ベクターの使用を含む遺伝子導入法のいずれを用いて導入してもよい。適切なレトロウイルスベクターを用いてアンチセンスオリゴヌクレオチド発現ベクターを作製し、その後、該発現ベクターを細胞とｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで接触させることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入できる。
【０１０８】
本発明のＤＮＡは、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術またはトリプル・へリックス技術を用いて、本発明のタンパクを介するII型コラーゲンの発現促進および／または軟骨細胞の分化促進を阻害するのに使用できる。
【０１０９】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、たとえば異所性骨化、異所性石灰化などの軟骨細胞の望ましくない分化促進によって特徴づけられる疾患を治療または予防する医薬として有用である。すなわち、本発明は、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する医薬である。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法を用いてそれらの疾病の検出に利用することもできる。
【０１１０】
本発明は、II型コラーゲンの発現促進および／または軟骨細胞の分化促進を阻害するリボザイムも含む。リボザイムは、核酸のヌクレオチド配列を認識して、核酸を切断する活性を持つＲＮＡである（たとえば、柳川弘志 実験医学バイオサイエンス１２、ＲＮＡのニューエイジ）。リボザイムは、選択された標的ＲＮＡ、たとえば本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡを開裂するように製造することができる。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を基に、本発明のタンパク質のｍＲＮＡを特異的に切断するリボザイムを設計することができ、かようなリボザイムは本発明のタンパク質のｍＲＮＡに対して相補的な配列を有し、該ｍＲＮＡと相補的結合し、ついで該ｍＲＮＡが開裂され本発明のタンパク質の発現が減少し（または完全に発現せず）、発現減少のレベルは標的細胞内でのリボザイム発現のレベルに依存している。
【０１１１】
よく用いられるリボザイムには、ハンマーヘッド型とヘアピン型の２種類があり、特にハンマーヘッド型リボザイムは切断活性に必要な一次構造や二次構造がよく調べられており、当業者であれば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列情報のみで容易にリボザイムの設計が可能である〔たとえば、飯田ら：細胞工学Vol.16 No.3,p438-445 (1997)、大川＆平比良：実験医学Vol.12 No.12 p83-88(1994)〕。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ＲＮＡと相補鎖を形成する２ヶ所の認識部位（認識部位Ｉと認識部位ＩＩ）と活性部位からなる構造をなし、標的ＲＮＡと認識部位で相補対を形成した後、標的ＲＮＡのＮＵＸの配列（Ｎ：ＡまたはＧまたはＣまたはＵ、Ｘ：ＡまたはＣまたはＵ）の３’末端側で切断することが知られており、特にＧＵＣ（あるいはＧＵＡ）が一番高い活性を持つことが知られている〔たとえばKoizumi,Mら:Nucl. Acids Res.17,7059-7071(1989)、飯田ら：細胞工学Vol.16 No.3,p438-445(1997)、大川＆平比良：実験医学Vol.12 No.12 p83-88(1994)、川崎＆多比良：実験医学 Vol.18 No.3p381-386 (2000)〕。
【０１１２】
そこでまず、本発明のＤＮＡ配列の中からＧＴＣ（またはＧＴＡ）の配列を探し出し、その前後で数ヌクレオチドから十数ヌクレオチドの相補対をつくることができるようにリボザイムを設計する。設計したリボザイムの適切性の評価は、たとえば、大川＆平比良の文献〔実験医学Vol.12 No.12 p83-88(1994)〕に記載の方法によって、作製したリボザイムが、イン ビトロ（in vitro）で標的ｍＲＮＡを切断できるかどうかを調べることで評価できる。リボザイムの調製は、ＲＮＡ分子を合成するための当分野で周知の方法により調製する。
【０１１３】
別法としては、リボザイムの配列をＤＮＡ合成機で合成し、たとえばＴ７或いはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを有する多種のベクターに組み込み、イン ビトロで酵素的にＲＮＡを合成させる方法が挙げられる。これらのリボザイムは、たとえばマイクロインジェクション法などの遺伝子導入方法によって細胞内に導入できる。あるいは別の方法として、リボザイムをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んで、株細胞、細胞或いは組織内に導入する。選択された細胞中にリボザイムを導入するのに、適切なベクターを使用することができ、たとえばプラスミドベクター、動物ウイルス（たとえばレトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスあるいはワクシニアウイルス）ベクターがこれらの目的に通常用いられるこれらのリボザイムは、本発明のタンパク質で仲介されるII型コラーゲンの発現促進および／または軟骨細胞の分化促進を阻害する作用を有する。
【０１１４】
本発明はまた、機能を有する新規遺伝子の取得方法を提供する。より具体的には、オリゴキャッピング法を用いて完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製する工程およびシグナル因子を用いて該機能を有するタンパク質の存在を検出する工程を含む、新規遺伝子の取得方法を提供する。シグナル因子には、たとえばレポーター遺伝子が挙げられる。
【０１１５】
機能を有する遺伝子（ｃＤＮＡ）を多数取得するためには、不完全長のものが多いｃＤＮＡライブラリーを用いると効率が悪い。したがって、全体のクローンの中で、完全長のものの割合が高いライブラリーが必要となる。完全長ｃＤＮＡは遺伝子から出来るｍＲＮＡの完全なコピーのことである。オリゴキャッピング法で作製したｃＤＮＡライブラリーは、完全長ｃＤＮＡの割合が５０〜８０％であり、従来の方法で作製されたｃＤＮＡライブラリーと比べて、５〜１０倍の完全長ｃＤＮＡクローンの濃縮になっている（菅野純夫：月刊 BIO INDUSTRY Vol.16 No.11 p19-26）。一般に、完全長ｃＤＮＡは、遺伝子の機能解析においては、タンパク質発現のために必須なクローンであり、完全長ｃＤＮＡのクローンそのものが活性測定のための材料として極めて重要なものであるため、遺伝子の機能解析を試みるに際して、完全長ｃＤＮＡのクローニングは必須の要件である。さらにその配列を決定することで、それがコードするタンパク質の一次配列を確定するための重要な情報となると同時に、遺伝子の全エクソンの配列も分かる。すなわち、完全長ｃＤＮＡは、遺伝子を同定する上で貴重な情報、たとえばタンパク質の一次配列、エクソン−イントロン構造、ｍＲＮＡの転写開始点、プロモーターの位置などを決めるための情報をも与える。
【０１１６】
オリゴキャッピング法による完全長ｃＤＮＡライブラリー作製は、たとえば実験医学別冊新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版（１９９９年）に記載の方法に従い行うことができる。すなわち、本発明において、オリゴキャッピング法とは、鈴木・菅野 実験医学別冊 遺伝子工学ハンドブック改訂第３版に記載のように、ＢＡＰ，ＴＡＰ，ＲＮＡリガーゼにより、キャップ構造を合成オリゴに置換する方法である。
【０１１７】
機能を有するタンパク質の存在を示すシグナル因子として用いることができるレポーター遺伝子は、転写因子等のタンパク質因子が結合できる適切な発現制御配列部分（１つまたは複数）と、その転写因子等による活性化を測定できる構造遺伝子部分からなる。構造遺伝子部分は、その発現産物の活性または生産量（ｍＲＮＡの生産量も含まれる）を当業者が測定可能なものであれば、いかなるペプチド、タンパク質をコードする遺伝子も用いることができる。たとえば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダ−ゼ、ルシフェラーゼ等をコードするポリヌクレオチドなどを用いることができ、その酵素活性を測定することで利用できる。機能を有するタンパク質の存在を示すレポーター遺伝子としては、本明細書実施例に示すようにＣＰＥ４３レポータープラスミドの他、たとえば軟骨細胞で特異的に発現しているマーカー遺伝子であるアグリカン、ＸI型コラーゲン等の遺伝子発現制御配列を用いたレポーター遺伝子などが挙げられる。
【０１１８】
たとえば、II型コラーゲン遺伝子の発現を促進する機能を有する遺伝子を取得したい場合は、II型コラーゲンの発現をモニターできるＣＰＥ４３レポータープラスミドとオリゴキャッピング法で作製した完全長ｃＤＮＡクローンを細胞に共導入し、その中からレポーター活性が上昇したプラスミドを選ぶことによって、該目的を達成することができる。この場合、細胞に何らかの刺激を加えた状態で行なっても良い。ｃＤＮＡクローンの細胞への導入は、１クローンでも良いし、複数のクローンを同時に導入しても良い。本発明の該方法の一例は、本明細書実施例に詳細に記述してある。あるいは、未分化細胞から軟骨細胞への分化を抑制する機能を有する遺伝子をスクリーニングするための系を構築することもできる。ＩＧＦ、ＢＭＰ、ＦＧＦなどの液性因子は軟骨細胞の増殖や分化の調節に関わっていることが知られている（たとえば、Geduspan J.S. et al.:Dev.Biol.156 p500-508(1993)）。完全長ｃＤＮＡとレポーター遺伝子（例えばＣＰＥ４３レポータープラスミド）を細胞（例えばＡＴＤＣ５細胞）に導入した後、細胞をＩＧＦ、ＢＭＰ、ＦＧＦなどの液性因子で刺激し、レポーター活性の上昇の弱いクローンを選ぶことによって、未分化細胞から軟骨細胞への分化を抑制する機能を有する遺伝子を取得することができる。しかし、レポーター遺伝子を適宜作製することにより、II型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子以外にも、各種生理活性因子（例えばNF-κB、MAPカイネース、血管新新生因子、各種転写因子）を活性化する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子の取得が可能である。
【０１１９】
本発明の新規遺伝子の取得方法は、イン ビトロ（in vitro）の系、あるいは細胞を用いて（cell-based）の系のどちらの方法でも良く、好ましくは細胞を用いた系である。細胞は、原核大腸菌をはじめとする原核生物、酵母、真菌等の微生物、及び昆虫や動物等の細胞のいずれでも良く、好ましくは動物細胞であり、ＡＴＤＣ５細胞、が例示できる。
【０１２０】
また、本発明のｃＤＮＡは、完全長ｃＤＮＡであるため、その５’末端の配列がｍＲＮＡの転写開始点であり、該ｃＤＮＡ配列をゲノムのヌクレオチド配列と比較することにより、該遺伝子のプロモーター領域を同定することに利用できる。ゲノムのヌクレオチド配列は、データベースに公知の配列として登録されている場合はその配列を利用できる。あるいは、該ｃＤＮＡを用いてたとえばハイブリダイゼーションによってゲノムライブラリーからクローニングし、ヌクレオチド配列を決めることもできる。このようにして、本発明のｃＤＮＡのヌクレオチド配列をゲノムの配列と比較することによって、その上流に存在する該遺伝子のプロモーター領域を同定することが可能である。さらに、このようにして同定した該遺伝子のプロモーター断片を用いて該遺伝子の発現を調べるレポータープラスミドを作製することができる。レポータープラスミドは、大方の場合、転写開始点からその上流２ｋｂ、好ましくは転写開始点からその上流１ｋｂのＤＮＡ断片をレポーター遺伝子の上流に組み込むことによって作製できる。さらに該レポータープラスミドは、該遺伝子の発現を増強あるいは減弱させる化合物のスクリーニングに利用できる。具体的には例えば、該レポータープラスミドで適当な細胞を形質転換し、一定時間培養した形質転換細胞に、被験物質を任意の量添加し、一定時間後の該細胞が発現するレポーター活性を測定し、被験物質を添加しない細胞のレポーター活性と比較することによりスクリーニングすることができる。これらも本発明に含まれる。
【０１２１】
また本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５または４７で表されるヌクレオチド配列のうち少なくとも１以上を含むデータセットおよび／または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも１以上を含むデータセットを保存したコンピュータ読み込み可能媒体に関する。
【０１２２】
さらに本発明は、上記に記載の媒体上のデータと他のヌクレオチド配列のデータを比較して相同性の算出を行う方法に関する。すなわち、本発明のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、その２次元および３次元構造を決定し、たとえば同様の機能を有する相同性の高いさらなる配列を同定するための貴重な情報源となる。これらの配列をコンピュータ読み込み可能媒体に保存し、ついで既知の高分子構造プログラムにおいて保存したデータを用いて、ＧＣＧのような既知検索ツールを用いてデータべースを検索すれば、データベース中の、ある相同性を有する配列を見出すことは容易である。
【０１２３】
コンピュータ読み取り可能媒体は情報またはデータを保存するのに用いる物体のいずれの組成物であってもよく、たとえば、市販フレキシブルディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスク、およびビデオディスク等がある。また、本媒体上のデータは、他のヌクレオチド配列のデータと比較して相同性の算出を行なう方法を可能にする。この方法には、本発明ポリヌクレオチド配列を含む第一のポリヌクレオチド配列をコンピュータ読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該第一のポリヌクレオチド配列を少なくとも一つの第二のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を同定する工程を含む。
【０１２４】
本発明はまた、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５または４７から選択されるヌクレオチド配列の全てまたは一部を含むポリヌクレオチドが固定されている不溶性基質に関する。ＤＮＡプローブである複数の各種ポリヌクレオチドがスライドガラス等の特別に加工された基質上に固定され、次いで標識された標的ポリヌクレオチドを、固定化されたポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、それぞれのプローブからのシグナルを検出する。得られるデータは、解析され、遺伝子発現が測定される。
【０１２５】
本発明はさらにまた、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８で表されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリペプチドが固定されている不溶性基質に関する。このタンパク質を固定した不溶性基質と、生物由来の細胞抽出液とを混合し、不溶性基質上に捕獲された、診断あるいは新薬開発のために有効であることが期待されるタンパク質などの細胞由来の成分を、単離あるいは同定することができる。
【０１２６】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明は、これらの例に何ら限定されるものではない。当業者には種々の変更、修飾が可能であり、これも本発明に含まれる。
【０１２７】
（実施例１）オリゴキャッピング法を用いた完全長ｃＤＮＡライブラリーの作製
（１）マウスＡＴＤＣ５細胞からのＲＮＡ調製
マウスＥＣ（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）由来クローン化細胞株ＡＴＤＣ５（Atsumi,T.et al.:Cell Diff.Dev.,30:p109-116(1990)）を１０ｃｍシャーレ５０枚まで継代培養した後、セルスクレーパーで細胞を回収した。次いで、回収した細胞からＲＮＡ抽出用試薬ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーンより購入）を用いて全ＲＮＡを取得した。取得の具体的方法は、試薬のプロトコールに従った。次いで、オリゴ−ｄＴ セルロース カラムを用いて、全ＲＮＡからポリＡ＋ＲＮＡを取得した。ポリＡ＋ＲＮＡ取得の具体的方法は、上記Ｍａｎｉａｔｉｓの実験書に従った。
【０１２８】
なお、ＡＴＤＣ５細胞の培養は、５％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１０μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン（ＳＩＧＭＡ社）、０．３ｎｍｏｌ／ｌ亜セレン酸ナトリウム（和光純薬）を含む、ＨＡＭ Ｆ−１２培地（ＳＩＧＭＡ社）とＤ−ＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium：ＳＩＧＭＡ社）を１：１で混合した培地にて、５％ＣＯ2存在下、３７℃で培養した。
【０１２９】
（２）ヒト肺線維芽細胞（Ｃｒｙｏ ＮＨＬＦ）からのＲＮＡ調製
ヒト肺線維芽細胞（Ｃｒｙｏ ＮＨＬＦ：三光純薬株式会社より購入）を、添付のプロトコールに従って培養した。１０ｃｍシャーレ５０枚まで継代培養した後、セルスクレーパーで細胞を回収した。次いで、上記（１）と同様の方法でポリＡ＋ＲＮＡを取得した。
【０１３０】
（３）オリゴキャッピング法による完全長ｃＤＮＡライブラリー作製
上記ＡＴＤＣ５細胞とヒト肺線維芽細胞のポリＡ＋ＲＮＡから、オリゴキャッピング法により完全長ｃＤＮＡライブラリーをそれぞれ作製した。オリゴキャッピング法による完全長ｃＤＮＡライブラリー作製の具体的方法は、菅野らの方法〔例えば、Maruyama,K.& Sugano,S.Gene,138:171-174(1994)、Suzuki、Y.et al.Gene、200:149-156(1997)、鈴木・菅野 実験医学別冊 遺伝子工学ハンドブック改訂第３版〕に従って作製した。
【０１３１】
（４）プラスミドＤＮＡの調製
上記実施例で作製した完全長ｃＤＮＡライブラリーを、エレクトロポレーション法によって大腸菌ＴＯＰ１０株に形質転換した後、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。続いて、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で生育した大腸菌のコロニーから、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡｗｅｌｌ ９６ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔを用いてプラスミドを回収した。具体的方法は、ＱＩＡｗｅｌｌ ９６ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔに添付のプロトコールに従った。
【０１３２】
（実施例２）II型コラーゲンの発現を誘導する作用を有するＤＮＡのクローニング
（１）II型コラーゲンの発現を誘導する作用を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡのスクリーニング
ＡＴＤＣ５細胞を、７５００Ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／１００μｌとなるように細胞培養用９６穴プレートに播種し、５％ＣＯ2存在下、３７℃で１日培養した。なお培地は、５％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１０μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン（ＳＩＧＭＡ社）、０．３ｎｍｏｌ／ｌ亜セレン酸ナトリウム（和光純薬）を含む、ＨＡＭ Ｆ−１２培地（ＳＩＧＭＡ社）とＤ−ＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium：ＳＩＧＭＡ社）を１：１で混合した培地を用いた。次いで、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社より購入）を用いて、ＣＰＥ４３レポータープラスミド１００ｎｇと、上記実施例１（４）で調製した完全長ｃＤＮＡプラスミド２μｌを１ウエルに共導入した。導入の方法は添付のプロトコールに従った。５％ＣＯ2存在下、３７℃で２日培養後、ロングタームルシフェラーゼアッセイシステム、ピッカジーンＬＴ２．０（東洋インキ社）を用いて添付されている説明書に従い、ＣＰＥ４３レポータープラスミドのレポーター活性（ルシフェラーゼ活性）を測定した。なおルシフェラーゼ活性の測定は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＷａｌｌａｃ ＡＲＶＯＴＭＳＴ １４２０ ＭＵＬＴＩＬＡＢＥＬ ＣＯＵＮＴＥＲを用いて行った。
【０１３３】
なお、II型コラーゲン遺伝子のプロモーター配列およびエンハンサー配列を有すると共に構造遺伝子部分としてルシフェラーゼをコードするＤＮＡを搭載したレポータープラスミドＣＰＥ４３は、以下の通りに構築した。ＣＰＥ４３は、Lefebvreら（Mol.Cell.Biol.,16 p4512-4523(1996)）が構築したレポータープラスミドを参考にして構築した。まず、ヒトII型コラーゲン遺伝子のプロモーター領域の配列をクローニングするために、ヒトII型コラーゲン遺伝子の塩基配列（Genbank Accession M60299）に基づいて、合成オリゴヌクレオチド、５’―ＡＧＡＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＧＣＣＣＡＧＣＴＧＧＧ―３’（配列番号４９）と、５’―ＡＡＧＣＴＴＡＧＣＡＧＣＧＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＴＣ―３’（配列番号５０）のプライマーを設計し、このプライマー対を用いてヒトゲノムを鋳型としてＰＣＲを行ない、増幅された約０．１２ｋｂの断片を分離し、制限酵素ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ホタルルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ株式会社）のＢｇｌＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いて挿入した。得られたクローンは、定法により塩基配列を確認した。ＰＣＲは、１０倍濃度の反応緩衝液（TaKaRa Ex Taqに添付のバッファー：宝酒造）５μｌ、２．５ｍMｄＮＴＰ混合液５μｌ、上記プライマー各々２μｌ（各々１０μＭの濃度）、TaKaRa Ex Taqポリメラーゼ（宝酒造）０．５μｌ、ヒトGenomic DNA （CLONTECH社）２００ｎｇを含む５０μｌの反応液を調製し、９６℃で２分間のインキュベーションの後、９４℃で１分間、５６℃で１分２０秒間、７２℃で１分４０秒間のインキュベーションを、TaKaRa PCR Thermal Cycler MP（宝酒造）を用いて３０サイクル行なった。
【０１３４】
次に、II型コラーゲン遺伝子のエンハンサー配列を合成オリゴヌクレオチドにより作製した。２本の合成オリゴヌクレオチド、５’―ＧＡＴＣＣＴＧＴＧＡＡＴＣＧＧＧＣＴＣＴＧＴＡＴＧＣＧＣＴＴＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＡＴＴＣＡＴＧＡＧＡ―３’（配列番号５１）と、５’―ＧＡＴＣＴＣＴＣＡＴＧＡＡＴＧＧＧＧＣＴＴＴＴＣＴＣＡＡＧＣＧＣＡＴＡＣＡＧＡＧＣＣＣＧＡＴＴＣＡＣＡＧ―３’（配列番号５２）を合成した。この合成オリゴヌクレオチドを各々１μｇ／μｌとなるように滅菌水で溶解し、各々１μｌずつ混ぜ、さらに滅菌水で２０μｌに容量を合わせた。その溶液を９５℃で５分間加熱後、徐々に室温まで冷却し二本鎖オリゴヌクレオチド溶液を調製した。その溶液をＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションを行ない、制限酵素ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで消化後、アガロースゲル電気泳動に供した。二本鎖オリゴヌクレオチドが４回同方向（タンデム）に連結された、約０．２ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎ ｋｉｔ（BIO 101社）を用いて精製した。該ＤＮＡ断片を上記作製のプラスミド（ヒトII型コラーゲン遺伝子のプロモーター領域の配列がｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ Ｖｅｃｔｏｒに組み込まれたもの）のＢｇｌＩＩ部位に挿入した。II型コラーゲンプロモーターと合成オリゴヌクレオチドの間に制限酵素ＢｇｌＩＩ部位が生じるように合成オリゴヌクレオチドが挿入されたクローンを選び、ＣＰＥ４３レポータープラスミドとした。
【０１３５】
（２）ヌクレオチド配列の決定
上記スクリーニングを１２万クローン行ない、ルシフェラーゼ活性が対照実験（完全長ｃＤＮＡプラスミドの代わりに、空ベクターｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３を導入した細胞のルシフェラーゼ活性）と比べて２倍以上上昇しているプラスミドを選抜し、まず、クローニングされているｃＤＮＡの５’側（シークエンスプライマ−：５’−ＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＡＡＡＡＧＣＴＧＣＧ−３’（配列番号５３））と３’側（シークエンスプライマ−：５’−ＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＡＣＡ−３’（配列番号５４））からそれぞれｏｎｅ−ｐａｓｓシークエンスを行ない、できる限り長くヌクレオチド配列を決定した。なお、ヌクレオチド配列決定のための試薬や方法は、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）を用い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７シークエンサー、あるいは、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００シークエンサーを用い、各々キットに添付されている説明書に従って行なった。
【０１３６】
（３）全長シークエンス
２４種類の新規のクローンについて全長ヌクレオチド配列（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５または４７）を決定し、タンパク質をコードする部分（オープンリーディングフレーム）のアミノ酸配列（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８）を予想した。
【０１３７】
【発明の効果】
本発明により、産業上有用性の高いII型コラーゲン遺伝子の発現を促進する作用を有するタンパク質やそれらの遺伝子が提供される。本発明のタンパク質や遺伝子はII型コラーゲンの発現を促進する。その結果、軟骨細胞分化誘導促進作用、軟骨形成促進作用を有し、本発明のタンパク質や遺伝子を含有する組成物は、軟骨の障害が関与する各種疾患の予防・治療に有用である。また本発明のタンパク質やそれらの遺伝子により、軟骨の阻害が関与する疾患の治療や予防に有用な化合物のスクリーニング、さらにそのような疾患の診断薬を作製することが可能である。
【０１３８】
【配列表】
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a protein having an action of promoting expression of type II collagen, a DNA encoding the protein, a method for obtaining the DNA, a recombinant vector containing the DNA, a transformant containing the recombinant vector, and The present invention relates to an antibody that specifically reacts with the protein. The present invention also relates to the use of the protein, DNA or antibody of the present invention in the diagnosis, treatment or prevention of diseases involving cartilage disorders.
[0002]
The present invention also relates to a method for screening a substance that inhibits or promotes chondrocyte proliferation and differentiation using the protein, DNA, recombinant vector and transformant.
[0003]
[Prior art]
Cartilage is a connective tissue consisting of chondrocytes and the extracellular matrix that surrounds them, and is present in joints, spinal discs, costal cartilage, ear pinna, ear canal, pubic bone, and pharynx. The main components of the extracellular matrix are collagen and aggrecan (cartilage-type proteoglycan), which are produced by chondrocytes. Collagen fibers are known to be involved in cartilage tension and rigidity against shearing force, and aggrecan is known to be involved in the swelling characteristic of cartilage tissue.
[0004]
Cartilage tissue occupies most of the skeleton in the fetal period and is abundant, but with growth and growth after birth, the proportion of cartilage tissue decreases and its localization becomes limited. In adults, it remains only as articular cartilage covering mainly the epiphyseal surface.
[0005]
Chondrocytes of epiphyseal cartilage are divided into quiescent chondrocytes, proliferating chondrocytes, prehypertrophic chondrocytes, and hypertrophic chondrocytes from the epiphysis to the diaphysis. Arranged. Each cartilage layer expresses and produces unique molecules according to the degree of differentiation. Proliferating chondrocytes strongly express type II collagen unique to cartilage and proteoglycan, particularly aggrecan, which is a complex of sugar and protein, as differentiation indicators. When hypertrophic chondrocytes become collagen, collagen is expressed from type II to type X.
[0006]
Chondrocytes differentiate from mesenchymal cells (pluripotent undifferentiated mesenchymal cells). Further, recent studies have revealed factors that regulate chondrocyte proliferation and differentiation (for example, Crombrugghe B. et al .: Current Opinion in Cell Biology. 13 p721-727 (2001)). The Sox (Sry-type HMG box) gene group is a transcriptional control gene group having a domain having high homology with the HMG (high mobility group) box of the sex-determining gene Sry (Sex determining region Y). Sox genes have been identified. Among them, Sox9 is expressed predominantly in cartilage tissue during the development of mice because mutations in humans cause bending dysplasia (Foster JW et al .: Nature, 372 p525-530 (1994)). (Wright EM et al .: Nature Genet. 9 p15-20 (1995)), from experiments using Sox9 gene mutation ES cells, -/- It has been reported that cells cannot participate in cartilage tissue and cannot express chondrocyte-specific extracellular genes such as type II collagen (Bi W. et al .: Nature Genet. 22 p85-89 (1999) ), A transcription factor that plays an important role in cartilage formation. However, the function of Sox9 is not limited to chondrocytes, and it is reported that an unknown partner gene is required in addition to Sox9 for activation of type II collagen gene (Kamachi Y. et al. : Mol.Cell.Biol.19 p107-120 (1999)), there are many unclear points. Moreover, the expression control mechanism of Sox9 is still unclear.
[0007]
Other factors involved in chondrocyte proliferation and differentiation include bone morphogenetic protein (BMP), fibroblast growth factor (FGF), and insulin-like growth factor. : IGF), parathyroid hormone related peptide (PTHrP), Sonic hedgehog, Indian hedgehog, etc., all of which are various in addition to cartilage It is a common basic regulator that plays an important role in tissue and period formation, and no specific differentiation-inducing factor has been found.
[0008]
Bone rich in blood vessels has a relatively strong regenerative ability, but the articular cartilage covering the surface is a tissue with very poor regenerative ability. When the surface of the articular cartilage is damaged, it easily shifts to osteochondrosis, and it is extremely difficult to regenerate it with cartilage. Elucidation of the molecular mechanism of chondrocyte proliferation and differentiation is expected to contribute to elucidation of the pathogenesis of cartilage diseases and development of therapeutic means.
[0009]
However, regarding the mechanism of chondrocyte proliferation and differentiation, there are still many unclear points, and the whole picture has not been clarified. The identification of new molecules involved in chondrocyte proliferation and differentiation and the elucidation of more advanced mechanisms are desired.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to find a useful novel gene and protein having the action of controlling the proliferation and differentiation of chondrocytes as described above, and to provide a method for using this in the medical, diagnostic, and medical fields. It is in.
[0011]
That is, the present invention relates to a novel protein having an action of promoting the expression of type II collagen, a DNA encoding the protein, a recombinant vector containing the DNA, a transformant containing the recombinant vector, Provided are a production method, an antibody against the protein or a partial peptide thereof, a production method of the antibody, and a medicament containing the protein or the gene.
[0012]
In addition, the present invention provides a method for screening a substance that inhibits or promotes the expression of type II collagen using the protein, DNA, recombinant vector and transformant, the screening kit, the screening method or the screening kit. A substance that inhibits or promotes the expression of type II collagen obtained by using the method, a method for producing the substance, a pharmaceutical containing a substance that inhibits or promotes the expression of type II collagen, and the like are provided.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
The cloned cell line ATDC5 derived from mouse EC (embryonal carcinoma) not only induces cartilage differentiation at a high rate, but also satisfies the essential requirements for cartilage stem cells in that it has a high self-renewal ability (Atsumi T. et al .: Cell Diff. Dev., 30 p109-116 (1990) Shukunami C. et al .: J. Cell Biol., 133 p457-468 (1996)). Recently, it has become possible to analyze the control mechanism of cartilage differentiation using these cells. When undifferentiated ATDC5 cells are cultured in the presence of insulin, a cell aggregation region as seen in limb bud mesenchymal cells appears in the culture system. The characteristic undifferentiated cells in the aggregated region can be said to be progenitor chondrocytes, and differentiation proceeds into proliferating chondrocytes in this region. At this time, the expressed collagen type changes dramatically from type I to type II. Chondrocytes expressing type II collagen grow slowly and form cartilage nodules. Furthermore, differentiation into hypertrophic chondrocytes expressing type X collagen eventually causes the extracellular matrix to calcify. Thus, ATDC5 cells can simulate all differentiation stages of cartilage.
[0014]
On the other hand, regarding the control of expression of type II collagen, which is a cartilage-specific molecule, a regulatory sequence (enhancer) necessary for specific expression of type II collagen in cartilage is contained in the first intron of the type II collagen gene. It has been reported to be present and conserved among mammalian type II collagen genes (eg Lefebvre V. et al .: Mol. Cell. Biol. 16 p4512-4523 (1996), Lefebvre V. et al .: Mol. Cell. Biol. 17 p2336-2346 (1997), Bell, DM et al .: Nature Genet. 16 p174-178 (1997), Zhou G. et al .: J. Biol. Chem. 272 p14989-14997 (1998)).
[0015]
Based on this technical background, the present inventors have intensively studied to solve the above-mentioned problems. As a result, a full-length cDNA library was prepared using an oligocapping method, and expression cloning using ATDC5 cells was performed. And succeeded in isolating a novel DNA (cDNA) encoding a protein having an action of controlling the expression of type II collagen. It was confirmed that the expression of type II collagen can be promoted by expressing the novel DNA in ATDC5 cells. This result indicates that the novel DNA is a molecule involved in the expression of type II collagen, and the present invention has been completed.
[0016]
That is, the present invention is as follows.
(1) The following purified protein (a) or (b).
(A) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 Or a protein comprising an amino acid sequence represented by any one of 48.
(B) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 Or a protein comprising an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are deleted, substituted or added in any one of 48 and having an action of promoting expression of type II collagen.
(2) A purified protein having an amino acid sequence identity of at least 95% over the entire length of the protein according to (1) and having an action of promoting expression of type II collagen.
(3) A protein according to (1) or (2) above and having an action of promoting the differentiation of chondrocytes.
(4) An isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding the following protein (a) or (b):
(A) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 Or a protein comprising an amino acid sequence represented by any one of 48.
(B) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 Or a protein comprising an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are deleted, substituted or added in any one of 48 and having an action of promoting expression of type II collagen.
(5) An isolated polynucleotide comprising the polynucleotide sequence of any of the following (a) to (c):
(A) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 Or a polynucleotide sequence represented by any of 47.
(B) a polynucleotide sequence that encodes a protein that hybridizes with a polynucleotide having a polynucleotide sequence complementary to the polynucleotide sequence of (a) under stringent conditions and has an action of promoting expression of type II collagen .
(C) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 48. A polynucleotide sequence encoding a protein consisting of a polynucleotide sequence in which one or more nucleotide sequences are deleted, substituted or added, and having an action of promoting expression of type II collagen.
(6) An isolated product comprising a polynucleotide sequence encoding a protein having at least 95% identity over the entire length with the polynucleotide described in (4) above and having an action of promoting the expression of type II collagen. Polynucleotide.
(7) An isolated product comprising a polynucleotide sequence encoding a protein having at least 95% identity over the entire length with the polynucleotide described in (5) above and having an action of promoting the expression of type II collagen Polynucleotide.
(8) A polynucleotide sequence encoding a protein comprising the polynucleotide sequence according to any one of (4) to (7) above and having an action of promoting chondrocyte differentiation.
(9) A purified protein encoded by the polynucleotide according to any one of (4) to (7) above.
(10) A recombinant vector containing the polynucleotide according to any one of (4) to (7) above.
(11) A transformed cell comprising the recombinant vector according to (10) above.
(12) The membrane of the cell according to (11) above, wherein the protein according to (1) or (2) is a membrane protein.
(13) (a) A transformed cell containing the polynucleotide under a condition that expresses a protein encoded by the isolated polynucleotide according to any one of (4) to (7) above. Cultivate,
(B) recovering the protein from the culture;
A method for producing a protein.
(14) (a) determining the presence or absence of a mutation in the nucleotide sequence encoding the protein according to (1), (2) or (9) in the genome of the individual, and / or
(B) analyzing the expression level of the protein in a sample derived from the individual;
A method of diagnosing a disease or susceptibility to a disease in said individual related to the expression or activity of said protein in said individual. Preferably, the disease is diagnosed when the amount of expressed protein is more than twice the normal amount, or less than half.
(15) A method for screening a compound for inhibitory activity or promoting activity of type II collagen expression, comprising the following steps.
(A) providing a cell with a gene encoding a protein that promotes expression of type II collagen and a component capable of providing a detectable signal corresponding to the expression of type II collagen;
(B) culturing the transformed cell under conditions that allow the gene to be expressed in the transformed cell;
(C) contacting the transformed cell with one or more candidate compounds;
(D) measuring a detectable signal; and
(E) isolating or identifying activator compounds and / or inhibitor compounds by measuring the detectable signal.
Further, it is preferable to isolate or identify a compound that increases the signal by 1.2 times or more than normal as an activator compound and to isolate or identify a compound that decreases the signal by 0.8 times or less as an inhibitor compound.
(16) A method for producing a pharmaceutical composition comprising the following steps.
(A) providing a cell with a gene encoding a protein having an action of promoting the expression of type II collagen, and a component capable of providing a detectable signal;
(B) culturing the transformed host cell under conditions that allow the gene to be expressed in the transformed cell;
(C) contacting the transformed host cell with one or more candidate compounds;
(D) measuring a detectable signal;
(E) isolating or identifying activator compounds and / or inhibitor compounds by measuring the detectable signal; and
(F) optimizing the isolated or identified compound as a pharmaceutical composition.
In the present invention, a compound that increases the signal by 1.2 times or more than normal is isolated or identified as an activator compound, and a compound that decreases the signal by 0.8 times or less is isolated or identified as an inhibitor compound. It is preferable.
(17) A kit for screening a compound for inhibitory activity or promoting activity of type II collagen expression,
(A) a gene encoding a protein that promotes expression of type II collagen, and a cell transformed with a component capable of providing a detectable signal corresponding to the expression of type II collagen; and
(B) Reagent for measuring a detectable signal
Including kit.
(18) A monoclonal or polyclonal antibody that specifically binds to the protein according to (1), (2) or (9) above.
(19) The method according to (1), (2) or (9) above, comprising administering the protein described in (1), (2) or (9) to a non-human animal as an antigen or epitope-containing fragment. A method for producing a monoclonal or polyclonal antibody that specifically binds to a protein.
(20) A chondrocyte differentiation promoter containing the protein according to (1), (2) or (9) as an active ingredient.
(21) A chondrocyte differentiation promoter comprising as an active ingredient the gene encoding the protein according to (1), (2), or (9).
(22) A preventive or therapeutic agent for cartilage disease comprising the protein according to (1), (2) or (9) as an active ingredient.
(23) A prophylactic and therapeutic agent for cartilage disease comprising a gene encoding the protein according to (1), (2), or (9) as an active ingredient.
(24) The agent for preventing or treating cartilage disease according to the above (22) or (23), wherein the cartilage disease is osteoarthritis, cartilage deficiency, or rheumatoid arthritis.
(25) An antisense oligonucleotide complementary to the polynucleotide according to any one of (4) to (7), which inhibits expression of a protein that promotes expression of type II collagen.
(26) A ribozyme that inhibits expression of type II collagen by cleavage of RNA encoding the protein according to (1), (2), or (9).
(27) A compound screened by the method described in (15) above and / or a monoclonal or polyclonal antibody described in (18) above and / or an antisense oligo described in (25) above in an effective amount for preventing or treating cartilage disease A method for treating a disease comprising administering a nucleotide and / or a ribozyme according to (26) above to an individual.
(28) A pharmaceutical composition produced by the method according to (16) above as inhibiting or activating expression of type II collagen.
(29) The pharmaceutical composition according to the above (28), which is used for preventing or treating cartilage diseases.
(30) A method for preventing and treating cartilage disease, comprising administering a pharmaceutical composition produced by the method according to (16) above to a patient suffering from a disease related to cartilage.
(31) A pharmaceutical composition comprising the monoclonal or polyclonal antibody according to (18) as an active ingredient.
(32) A pharmaceutical composition comprising the antisense oligonucleotide according to (25) above as an active ingredient.
(33) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 Or a data set comprising at least one of the nucleotide sequences represented by 47 and / or SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, A computer-readable medium storing a data set including at least one of amino acid sequences represented by 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, or 48.
(34) The data on the medium described in (33) above is compared with data on other nucleotide sequences and / or other amino acid sequences, and the identity with other polynucleotide sequences and / or amino acid sequences is calculated. Method.
(35) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 Or an insoluble substrate to which a polynucleotide comprising all or part of a nucleotide sequence selected from 47 is immobilized.
(36) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 Or an insoluble substrate to which a polypeptide comprising all or part of an amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by 48 is immobilized.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
First, in order to further clarify the basic features of the present invention, the present invention will be described while following the process leading to the completion of the present invention. In order to obtain a novel gene having an action of promoting the expression of type II collagen, the following experiment was performed as shown in the Examples.
[0018]
First, a full-length cDNA was prepared from mRNA prepared from ATDC5 cells (purchased from Riken Genebank) or human normal lung fibroblasts (purchased from Sanko Junyaku Co., Ltd.) by the oligo capping method, and the cDNA was vector pME18S-FL3. A full-length cDNA library incorporated into (GenBank Accession AB009864) was prepared. Next, the cDNA library was introduced into E. coli, and plasmids were prepared for each clone. Next, in ATDC5 cells, a reporter plasmid containing a promoter sequence and an enhancer sequence of type II collagen gene upstream of the DNA encoding luciferase, that is, a reporter plasmid capable of examining the expression of type II collagen gene and the above full length Co-introduced with the cDNA plasmid. After culturing for 48 hours, the luciferase activity was measured, and the luciferase activity was significantly increased compared to the control experiment (cells containing the vector pME18S-FL3 instead of the full-length cDNA) (compared to the control experiment). A plasmid (in which the luciferase activity showed a value of 2 times or more) was selected, and the entire nucleotide sequence of the cDNA cloned in the plasmid was determined. The protein encoded by the cDNA thus obtained indicates that the protein is a molecule involved in the expression of type II collagen.
[0019]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention relates to SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, A protein consisting of either 46 or 48 amino acid sequences is provided, and in this connection, the following proteins are further provided.
(A) A protein comprising the amino acid sequence.
(B) A peptide having one of the above amino acid sequences.
(C) A protein that promotes the expression of type II collagen and has one or more amino acid deletions, substitutions or additions in the amino acid sequence.
(D) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, over its entire length A protein comprising an amino acid sequence having at least 95%, preferably 97-99% identity to the amino acid sequence of 44, 46 or 48.
[0020]
“Identity” is a relationship between two or more proteins or two or more polynucleotides determined by comparing sequences, as is known in the art. In the art, “identity” means between protein or polynucleotide sequences, as determined by a match between protein or polynucleotide sequences, or in some cases by a match between a series of such sequences. Means the degree of sequence correlation. “Identity” can be readily determined by known methods. Preferred methods for determining identity are designed to match the longest between the sequences tested. The method for determining identity is coded in a publicly available program. For homology determination, Altschul et al. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) program (eg, Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 ( 1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997)). When using software such as BLAST, it is preferred to use the default values. The main initial conditions generally used for the BLAST search are as follows, but are not limited thereto.
[0021]
The amino acid substitution matrix is a matrix obtained by digitizing the affinity of each pair of 20 types of amino acids, and the default matrix of BLOSUM62 is usually used. See Altschul SF, J. Mol. Biol., 219: 555-565 (1991) for the theory of this amino acid substitution matrix, and States DJ, Gish W., Altschul SF, Methods, 3 for application to DNA sequence comparison. : 66-70 (1991). In this case, the optimum gap cost is determined empirically. In the case of BLOSUM62, preferably, the parameters of Existence 11 and Extension 1 are used. The expected value (EXPECT) is a threshold value regarding statistical significance when matching against a database sequence, and the default value is 10.
[0022]
As an example, a protein having, for example, 95% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may contain up to 5 amino acid changes per 100 amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Means that. In other words, a protein having 95% or more amino acid sequence identity to the control amino acid sequence may have a deletion or substitution of up to 5% of all amino acids in the control sequence. Alternatively, the amino acid sequence up to 5% of the total amino acid sequence in the control sequence may be inserted into the control sequence. These changes in the control sequence may be present at the amino-terminal or carboxy-terminal position of the control amino acid sequence, or may be at any position between their ends, or 1 within the control sequence. It may form a series of one or more groups.
[0023]
SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 or As described in the Examples of the present specification, the protein having the amino acid sequence described in 48 has an action of promoting the expression of type II collagen.
[0024]
The present invention also includes SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 or 47 polynucleotides are provided and in this connection further the following isolated polynucleotides are provided.
(A) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 95%, preferably 97-99% identity to said sequence.
(B) A polynucleotide having the above sequence.
(C) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 Or a polynucleotide having a nucleotide sequence encoding a protein having an amino acid sequence having at least 95%, preferably 97-99% identity to the 48 amino acid sequence.
[0025]
A polynucleotide that is identical or substantially identical to the nucleotide sequence contained in the nucleotide sequence is a full-length cDNA and genomic clone encoding the protein of the present invention, or a cDNA or genomic clone of another gene having high homology corresponding to the sequence May be used as a hybridization probe for isolating or as a primer for nucleic acid amplification reactions. Typically, these nucleotide sequences are 70% identical to the above sequences, preferably 80% identical, more preferably 90% identical, and most preferably 95% identical. The probe or primer generally contains at least 15 nucleotides, preferably contains 30 nucleotides and may contain 50 nucleotides. Particularly preferred probes have 30-50 nucleotides. Particularly preferred primers have 20 to 25 nucleotides.
[0026]
The polynucleotides of the present invention may be in the form of DNA (eg, including cDNA and genomic DNA obtained by cloning or synthetically produced), or in the form of RNA (eg, mRNA). Good. The polynucleotide may be double-stranded or single-stranded. In the case of a double strand, it may be a double-stranded DNA, a double-stranded RNA, or a DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (also known as a coding strand) or an antisense strand (also known as a non-coding strand).
[0027]
A person skilled in the art appropriately substitutes amino acids in this protein using a known method, and SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, Producing a protein having the action of promoting the expression of type II collagen in the same manner as the protein having the amino acid sequence described in 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 or 48 Is possible. One method is to use a conventional mutagenesis method for the DNA encoding the protein. Another method is, for example, site-specific mutagenesis (for example, Mutan-Super Express Km kit from Takara Shuzo Co., Ltd.). Also, amino acid mutations in proteins can occur in nature. Thus, by amino acid deletion, substitution, addition, SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, A protein having an action of promoting the expression of type II collagen, and a DNA encoding the protein, which are mutants having an amino acid sequence mutated with respect to the protein of 38, 40, 42, 44, 46 or 48 included. The number of mutations is preferably 10 or less, more preferably 5 or less, and most preferably 3 or less.
[0028]
As an example of amino acid substitution, conservative substitution is preferable, and specific examples include substitution within the following groups. (Glycine, alanine) (valine, isoleucine, leucine) (aspartic acid, glutamic acid) (asparagine, glutamine) (serine, threonine) (lysine, arginine) (phenylalanine, tyrosine).
[0029]
A person skilled in the art can use SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 using a hybridization technique or the like. , 38, 40, 42, 44, 46 or 48, a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by the amino acid sequence (for example, SEQ ID NO: 2) or a part thereof, From the DNA, SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, It is usually possible to obtain a protein having the action of promoting the expression of type II collagen as well as the protein consisting of the amino acid sequence represented by 46 or 48. As described above, SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 , 46 or 48, a protein having a high identity with a protein having an amino acid sequence represented by 46 or 48, and having a function of promoting expression of type II collagen is also included in the protein of the present invention. High identity refers to the above SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 , 44, 46 or 48, amino acid sequences having at least 95%, preferably at least 97-99% identity over the entire length of the amino acid sequence represented.
[0030]
In the present invention, having an action of promoting the expression of type II collagen means that when a gene is introduced into an appropriate cell and a protein encoded by the gene is overexpressed, the expression of type II collagen is directly or indirectly (Inducing the expression of type II collagen). The expression of type II collagen can be measured, for example, by a reporter assay using a reporter plasmid capable of examining the expression of type II collagen gene prepared using the promoter sequence and regulatory (enhancer) sequence of type II collagen gene. “Having an action of promoting the expression of type II collagen” means that the expression of type II collagen has an action of increasing compared to a control experiment (a cell in which the protein is not overexpressed). The increase in expression of type II collagen is preferably 1.5 times or more, more preferably 2 times or more.
[0031]
For expression of type II collagen, a polynucleotide (for example, cDNA) encoding a protein to be expressed is cloned into an appropriate expression vector, and a reporter plasmid capable of examining expression of the expression vector and type II collagen is used in an appropriate cell. Can be measured by measuring the reporter activity after co-introduction (co-transfection) into the cells and culturing for a certain period of time. Suitable expression vectors are well known to those skilled in the art and include, for example, pME18S-FL3, pcDNA3.1 (Invitrogen) and the like. The reporter gene is not particularly limited as long as it can be easily detected by those skilled in the art. For example, the reporter gene is a gene encoding luciferase, chloramphenicol acetyltransferase, or β-galactosidase. Most preferably, a gene encoding luciferase is used. As a reporter plasmid capable of examining the expression of type II collagen, for example, CPE43 described in the present specification is exemplified. Suitable cells include, for example, ATDC5 cells. Cell culture and gene transfer (transfection) into cells can be performed and optimized by those skilled in the art by conventional methods known in the art.
[0032]
As a preferred method, a medium (10 μg / ml human transferrin, 0.3 nmol / l sublimation) in the presence of 5% FBS (Fetal Bovine Serum) is used so that the number of cells becomes 7500 cells / well in a 96-well plate for cell culture. HAM F-12 medium containing sodium selenate and D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) mixed at 1: 1) and 5% CO 2 After culturing at 37 ° C. for 24 hours in the presence, CPE43 reporter plasmid and an expression vector are co-introduced into one well using FuGENE6 (Roche). After culturing at 37 ° C. for 48 hours, the expression of type II collagen is measured by measuring the luciferase activity using Long Term Luciferase Assay System Picker Gene LT2.0 (Toyo Ink). The luciferase activity can be measured using, for example, Wallac ARVOTMST 1420 MULTILABEL COUNTER manufactured by Perkin Elmer. The gene introduction method using FuGENE6 and the luciferase activity measurement using Picker Gene LT2.0 can be carried out according to the protocol attached to each. In the method of gene transfer using 96-well plate using FuGENE6, the amount of FuGENE6 per well is preferably 0.3 to 0.5 μl, and preferably 0.4 μl, and the amount of CPE43 reporter plasmid is 50 to 100 ng. It is preferably 100 ng, and the amount of the expression vector is preferably 50 to 100 ng, and preferably 100 ng. Having an action of promoting the expression of type II collagen means having an action of increasing the reporter activity (luciferase activity) compared to a control experiment (a cell into which only an empty vector has been introduced). The increase in reporter activity is preferably 1.5 times or more, more preferably 2 times or more.
[0033]
The protein of the present invention may be a natural protein derived from any cell or tissue of humans or mammals, a chemically synthesized protein, or a protein obtained by a gene recombination technique. Proteins may or may not have undergone post-translational modifications such as sugar chains or phosphorylation.
[0034]
Examples of the protein encoded by the gene of the present invention include secreted proteins (growth factors, cytokines, hormones, etc.), protein-modifying enzymes (protein phosphorylase, protein dephosphorylase, protease, etc.), signal transduction molecules (interprotein) Interacting molecules, etc.), nuclear proteins (nuclear receptors, transcription factors, etc.) and membrane proteins. Examples of membrane proteins include receptors, cell adhesion molecules, ion channels, transporters and the like. When the protein is a membrane protein, the compound selected by the screening described below is expected to easily migrate into the cell, and thus is more useful as a research tool for pharmaceutical compounds.
[0035]
The present invention is a polynucleotide encoding the protein of the present invention shown above. SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 or More specifically, as a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by 48, for example, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 or 47. In addition to cDNA, DNA includes genomic DNA and chemically synthesized DNA. According to the degeneracy of the genetic code, without changing the amino acid sequence of the protein produced from the gene, SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, At least one nucleotide of the nucleotide sequence encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, or 48 can be substituted with another type of nucleotide. . Thus, the DNA of the present invention also contains nucleotide sequences that have been converted by substitution based on the degeneracy of the genetic code. Such DNA can be synthesized by a known method.
[0036]
The DNA of the present invention comprises SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, Also included is DNA that hybridizes with DNA comprising the nucleotide sequence represented by 43, 45 or 47 under stringent conditions and encodes a protein having an action of promoting the expression of type II collagen. Stringent conditions are well understood by those skilled in the art, and can be easily performed according to, for example, the experimental operation manual (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982, 1989) of T. Maniatis et al. .
[0037]
That is, stringent conditions include a hybridization solution containing 30% formamide (5 × SSC (0.75 M NaCl, 75 mM trisodium citrate), 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 100 μg / ml of denatured sheared salmon sperm DNA) overnight at 37 ° C., followed by 3 washes in 2 × SSC, 0.1% SDS for 10 minutes at room temperature, followed by 1 × SSC, 0.1% This is a condition in which washing for 10 minutes at 37 ° C. is performed twice in SDS (low stringency). More preferred conditions include incubation overnight at 42 ° C. in a hybridization solution containing 40% formamide, followed by three 10 minute washes in 2 × SSC, 0.1% SDS at room temperature, followed by 0. This is a condition in which washing for 10 minutes at 42 ° C. in 2 × SSC and 1% SDS is performed twice (medium stringency). Most preferred conditions are overnight incubation at 42 ° C. in a hybridization solution containing 50% formamide, followed by 3 × 10 min washes in 2 × SSC, 0.1% SDS at room temperature. This is a condition in which washing for 10 minutes at 50 ° C. is performed twice in 2 × SSC and 0.1% SDS (high stringency). At this time, it is essential that the obtained DNA encodes a protein having an action of promoting the expression of type II collagen.
[0038]
The present invention includes a polynucleotide comprising a nucleotide encoding a protein having a high similarity to the nucleotide sequence of the polynucleotide of (4) or (5) and having an action of promoting the expression of type II collagen. Typically, these nucleotide sequences are 95% identical, more preferably 97% identical, and most preferably at least 99% identical over the entire length of the nucleotide sequence of the polynucleotide of (4) or (5) above. It is.
[0039]
The protein of the present invention has an action of promoting type II collagen expression in ATDC5 cells. Chondrocytes differentiate from aggregated mesenchymal stem cells. Although mesenchymal stem cells differentiate other than chondrocytes, whether or not they differentiate into chondrocytes can be determined by the presence or absence of type II collagen specifically expressed in chondrocytes. It is well known that type II collagen is a molecule that is specifically expressed in chondrocytes (eg Horton W. et al .: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 p8864-8868 (1987)). ). Therefore, the action of promoting the expression of type II collagen is synonymous with the action of promoting the differentiation of undifferentiated chondrocytes into mature chondrocytes. On the other hand, ATDC5 cells are recognized in the world as a cell line that can simulate all stages of cartilage differentiation (eg, Atsumi T. et al .: Cell Diff. Dev., 30 p109-116 (1990), Shukunami). C. et al .: J. Cell Biol., 133 p457-468 (1996)). ATDC5 cells have the properties of cartilage progenitor cells and differentiate into chondrocytes upon growth factor stimulation. Undifferentiated ATDC5 cells do not express type II collagen, but when cultured in the presence of insulin, a unique cell aggregation region appears after reaching confluence, and chondrocytes appear from this region to form cartilage nodules Is done. It has been reported that expression of type II collagen is observed in parallel with the formation of cartilage nodules (Shukunami C. et al .: J. Cell Biol., 133 p457-468 (1996)). That is, the present invention is a protein according to the above (1) or (2) and having an action of promoting differentiation of chondrocytes. The present invention also relates to a polynucleotide sequence encoding a protein comprising the polynucleotide sequence described in any one of (4) to (7) above and having an action of promoting chondrocyte differentiation.
[0040]
The above-described DNA of the present invention can be used for producing the aforementioned protein using recombinant DNA technology. The DNA and peptide of the present invention can be roughly obtained as follows.
(A) Cloning the DNA encoding the protein of the present invention.
(B) A DNA encoding the entire coding region of the protein or a part thereof is incorporated into an expression vector to construct a recombinant vector.
(C) A host cell is transformed with the constructed recombinant vector.
(D) The obtained cells are cultured, the protein or its analog is expressed, and purified by column chromatography or the like.
[0041]
General operations necessary for handling DNA, Escherichia coli as a recombinant host and the like in the above steps are those commonly performed by those skilled in the art. According to Maniatis et al. Commercially available products can also be used for the enzymes and reagents used, and unless otherwise specified, the purpose can be completely achieved if the use conditions specified for the products are followed. The steps (A) to (D) will be described in more detail below.
[0042]
As a means for cloning the DNA encoding the protein of the present invention in the above step (A), in addition to the method described in the Examples of the present specification, the nucleotide sequence of the present invention (for example, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7) , 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 or 47) A method of amplification by the PCR method described above, or selection of DNA incorporated in an appropriate vector by hybridization with a DNA fragment encoding a part or the entire region of the protein of the present invention or a labeled synthetic DNA, Etc. Amplification can also be performed directly by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) using a total RNA or mRNA fraction prepared from cells and tissues.
[0043]
As the DNA incorporated into an appropriate vector, for example, a commercially available library (CLONTECH, STRATAGENE) can be used. Hybridization methods are those commonly performed by those skilled in the art. According to Maniatis et al. The cloned DNA encoding the protein of the present invention can be used as it is or after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker, if desired. DNAs obtained as described above are SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, It may be a gene having the nucleotide sequence described in 39, 41, 43, 45 or 47, or the polynucleotide described in (4) to (7) above. The DNA to be incorporated into the expression vector in the step (B) may be a full-length cDNA encoding the full length of the above protein, a DNA fragment, or a DNA fragment constructed so as to express a part thereof.
[0044]
That is, the present invention provides a recombinant vector containing the above DNA. The expression vector of the protein of the present invention can be produced, for example, by excising the target DNA fragment from the DNA encoding the protein of the present invention and ligating the DNA fragment downstream of the promoter in an appropriate expression vector. it can.
[0045]
The expression vector to be used may be any vector derived from prokaryotes such as E. coli, yeast, fungi, insect virus, and vertebrate virus as long as it can replicate, but it can be used for microorganisms or cells used as a host. It is necessary to select a suitable one. Depending on the expression, an appropriate combination is selected as the host cell-expression vector system.
[0046]
When microorganisms are used as hosts, plasmid vectors suitable for these microorganisms are generally used as expression vectors capable of replicating recombinant DNA.
[0047]
For example, plasmid pBR322, pBR327, etc. can be used as a plasmid vector for transforming E. coli. Plasmid vectors usually contain a replication origin, a promoter, and a marker gene that gives the recombinant DNA a phenotype useful for selecting cells transformed with the recombinant DNA. Examples of the promoter include β-lactamase promoter, lactose promoter, tryptophan promoter, and the like. Examples of marker genes include ampicillin resistance genes and tetracycline genes. Examples of suitable expression vectors include pUC18, pUC19 and the like in addition to plasmids pBR322 and pBR327.
[0048]
In order to express the DNA of the present invention in yeast, for example, YEp24 can be used as a replicable vector. The plasmid YEp24 contains the URA3 gene, and this URA3 gene can be used as a marker gene. Examples of expression vector promoters for yeast cells include promoters for genes such as 3-phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and alcohol dehydrogenase.
[0049]
Examples of promoters and terminators used in expression vectors for expressing the DNA of the present invention in fungi include phosphoglycerate kinase (PGK), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPD), gene promoters such as actin and the like Examples include terminators. Examples of suitable expression vectors include plasmids pPGACY2, pBSFAHY83, and the like.
[0050]
Examples of the promoter used in the expression vector for expressing the DNA of the present invention in insect cells include polyhedrin promoter and P10 promoter. Examples of expression vectors suitable for insect cells include baculovirus.
[0051]
Recombinant vectors for expressing the DNA of the present invention in animal cells generally have functional sequences for controlling genes such as origin of replication, promoter to be located upstream of the DNA of the present invention, ribosome binding site, polyadenylation Contains the site and transcription termination sequence. Such functional sequences that can be used to express the DNA of the present invention in eukaryotic cells can be obtained from viruses and viral substances.
[0052]
For example, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned. Of these, the CMV promoter, SRα promoter and the like are preferably used. In addition, a promoter originally present at the upstream position of the gene encoding the protein of the present invention can be used if it is suitable for use in the host-vector system described above. For the origin of replication, a replication origin derived from an exogenous source such as adenovirus, polyoma, SV40 or the like can be used. In addition, when using a vector having the property of being integrated into a host chromosome as an expression vector, the origin of replication of the host chromosome can be used. Examples of suitable expression vectors include plasmids pSV-dhfr (ATCC 37146), pBPV-1 (9-1) (ATCC 37111), pcDNA3.1 (INVITROGEN), pME18S-FL3, and the like.
[0053]
The present invention is a transformed cell containing the above recombinant vector. Microorganisms or cells transformed with a replicable recombinant vector of the invention are selected from the parent cells remaining untransformed by at least one phenotype given to the recombinant vector as described above. . A phenotype can be provided by inserting at least one marker gene into the recombinant vector. In addition, a marker gene originally possessed by a replicable vector can be used. Examples of marker genes include drug resistance genes such as neomycin resistance and genes encoding dihydrofolate reductase.
[0054]
The host used in the above step (C) may be any of prokaryotes such as E. coli, microorganisms such as yeast and fungi, and cells such as insects and animals, but it is necessary to select an appropriate one for the expression vector used. There is. Examples of microorganisms include strains of Escherichia coli, such as E. coli. E. coli K12 strain 294 (ATCC 31446), E. coli. E. coli X1776 (ATCC 31537), E. coli. coli C600, E. coli. coli JM109, E. coli. E. coli strain B, or a strain of the genus Bacillus, such as Bacillus subtilis, or a variety of intestinal fungi other than Escherichia coli, such as Salmonella typhimurium or Serratia marcesans, or other intestinal bacterium, such as Serratia marcesans. Strains.
[0055]
Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, and the like. Examples of the fungus include Aspergillus nidulans and Acremonium chrysogenum (ATCC 11550).
[0056]
As the insect cell, for example, when the virus is AcNPV, a larvae-derived cell line derived from night steal (Spodoptera frugiperda: Sf cell), a High FiveTM cell derived from an egg of Trichoplusia ni, and the like are used. Examples of animal cells include HEK293 cells, COS-1 cells, COS-7 cells, Hela cells, Chinese hamster (CHO) cells, ATDC5 cells and the like. Among these, CHO cells and HEK293 cells are preferable. When a cell is used as a host, the combination of an expression vector and a host cell to be used varies depending on the purpose of the experiment. Depending on the combination, two types of expression methods, transient expression and constitutive expression, can be considered.
[0057]
The transformation of microorganisms and cells in the above step (C) means that DNA is introduced into microorganisms or cells by forced methods or cell phagocytosis, and DNA traits are transiently incorporated in a plasmid state or in a state of being incorporated into a chromosome. It is expressed intentionally or constitutively. A person skilled in the art can perform transformation by a known method (for example, a separate handbook of genetic engineering in experimental medicine). For example, in the case of animal cells, DNA can be introduced into the cells by methods such as DEAE-dextran method, calcium phosphate method, electroporation method (electroporation method), lipofection method and the like. As a method for stably expressing the protein of the present invention using an animal cell, there is a method of selecting a cell in which the expression vector introduced into the animal cell is incorporated into a chromosome by clonal selection. Specifically, a transformant is selected using the above selection marker as an index. Furthermore, a stable animal cell line having a high expression ability of the protein of the present invention can be obtained by repeatedly selecting clones for the animal cells obtained using the selection marker. In addition, when the dihydroformate reductase (DHFR) gene is used as a selectable marker, the methinexate (MTX) concentration is gradually increased and cultured, and a resistant strain is selected. The animal cell line can be obtained by further amplification.
[0058]
The protein of the present invention can be produced by culturing the above transformed cells under conditions capable of expressing the DNA encoding the protein of the present invention, and generating and accumulating the protein of the present invention. That is, the present invention comprises culturing transformed cells containing the isolated polynucleotide according to the above (4) to (7) under conditions for expressing a protein encoded by the polynucleotide, A method for producing the protein comprising recovering the protein from a culture.
[0059]
The culture of the transformed cells can be performed by a method known to those skilled in the art (for example, Biomanual Series 4, Yodosha). For example, in the case of animal cells, various animal cell culture methods such as petri dish culture, multi-tray culture, module culture, etc. are attached to cell culture carriers (microcarriers) or the production cells themselves are suspended. The culture may be performed by a known method such as suspension culture. The medium may be a commonly used medium for animal cells, such as D-MEM or RPMI 1640.
[0060]
Separation and purification of the protein of the present invention from the culture can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods. These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, methods utilizing difference in charge such as ion exchange chromatography, dialysis, ultrafiltration, and gel filtration. , And methods that mainly use molecular weight differences such as SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, methods that use specific affinity such as affinity chromatography, and hydrophobic differences such as reversed-phase high-performance liquid chromatography A method using a difference in isoelectric point, such as a method, isoelectric focusing method, or the like is used. For example, the proteins of the present invention include ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography and lectin chromatography. It can be recovered from the recombinant cell culture and purified by known methods. Most preferably, high performance liquid chromatography is used for purification. When the polypeptide is denatured during intracellular synthesis, isolation or purification, well-known techniques for refolding the protein to regenerate active conformation can be used.
[0061]
The protein of the present invention can be produced as a fusion protein with other proteins. These are also included in the present invention. As the vector used for expressing the fusion protein, any vector can be used as long as it can incorporate DNA encoding the protein and can express the fusion protein. Examples of the protein that can be fused to the peptide of the present invention include glutathione-S-transferase (GST), six consecutive sequences of histidine residues (6 × His), and the like. When the protein of the present invention is expressed as a protein fused with another protein, it can be advantageously purified by affinity chromatography using a substance having affinity for the fused protein. For example, when it is produced as a fusion protein with GST, it can be purified by affinity chromatography using glutathione as a ligand.
[0062]
The present invention includes a protein that inhibits the activity of the protein of (9) above. Examples thereof include antibodies and other proteins that bind to the active center of the protein of (9) above and prevent the expression of activity.
[0063]
The present invention relates to an antibody that specifically binds to the protein of the present invention or a partial peptide thereof, and a method for producing such an antibody. The antibody may be any of a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a fragment of these antibodies, a single-chain antibody, and a humanized antibody as long as it can recognize the protein of the present invention. Antibody fragments can be produced by known techniques. For example, the antibody fragments include, but are not limited to, F (ab ′) 2 fragments, Fab ′ fragments, Fab fragments and Fv fragments. For example, a monoclonal antibody or a polyclonal antibody can be obtained by administering the protein described in (1) or (2) above to a non-human animal as an antigen or epitope-containing fragment. An antibody against the protein of the present invention can be produced according to a method for producing an antibody or antiserum known per se, using the protein of the present invention or a peptide thereof as an antigen. For example, the method described in the experimental medicine separate volume New Genetic Engineering Handbook Revised 3rd Edition can be mentioned.
[0064]
In the case of a polyclonal antibody, for example, an antibody against the protein or peptide is produced by injecting the protein or peptide of the present invention into an animal such as a rabbit, and then blood is collected. For example, it can be prepared by purification using ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, or an affinity column to which the protein is immobilized.
[0065]
In the case of a monoclonal antibody, for example, an animal such as a mouse is immunized with the protein of the present invention, and the spleen is extracted from the mouse, ground into cells, fused with mouse myeloma cells using a reagent such as polyethylene glycol, and the like. A clone producing an antibody against the protein of the present invention is selected from the fused cells (hybridoma) produced by the above. Next, the obtained hybridoma is transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites is collected from the mouse, and the resulting monoclonal antibody is obtained by, for example, ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, or an affinity column to which the protein is immobilized. It can be prepared by purification.
[0066]
When the obtained antibody is used for the purpose of administration to humans, it is preferable to use a humanized antibody or a human antibody in order to reduce immunogenicity. Humanized antibodies can be generated using transgenic mice or other mammals. General reviews of these humanized antibodies and human antibodies can be found in, for example, Morrison, SL et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)], Jones, PT et al [Nature 321 : 522-525 (1986)], Hiroshi Noguchi [Ayumi of Medicine 167: 457-462 (1993)], Takashi Matsumoto [Chemistry and Biology 36: 448-456 (1998)]. A humanized chimeric antibody can be prepared by joining the V region of a mouse antibody and the C region of a human antibody by genetic recombination. Humanized antibodies can be produced by substituting regions other than complementarity determining sites (CDRs) from mouse monoclonal antibodies with sequences derived from human antibodies. Alternatively, a mouse in which the immune system is replaced with a human one is used to immunize the mouse, and a human antibody can be directly produced in the same manner as a normal monoclonal antibody.
[0067]
These antibodies can be used to isolate and identify clones that express the protein. These antibodies can also be used to purify the protein of the present invention from cell extracts or transformed cells that produce the protein of the present invention. Furthermore, these antibodies can be used for the construction of ELISA or RIA (radioimmunoassay) or Western blot system for detecting the protein of the present invention in cells and tissues. Such a detection system can be used for diagnostic purposes to detect the abundance of the protein of the invention present in an animal, preferably a body sample such as human tissue or intravascular fluid. For example, these antibodies can be used to diagnose diseases characterized by cartilage abnormalities due to (expression) abnormalities of the protein of the present invention, such as osteoarthritis, rheumatoid arthritis and the like.
[0068]
In order to provide a basis for the diagnosis of the disease, normal values, ie standard values, for the expression of the proteins of the invention must be established, which is a technique well known to those skilled in the art. That is, it may be either human or animal under appropriate conditions for complex formation, but a body fluid or cell extract obtained from a normal subject is bound to an antibody against the protein of the present invention. -The amount of protein complex was detected by chemical or physical means, and this was obtained from a normal sample using a standard curve prepared with a standard solution containing a known amount of antigen (protein of the present invention) Calculate the standard value. The presence of the disease can be confirmed by comparing the standard value with a value obtained from a sample from a subject potentially suffering from a disease related to the protein of the present invention, and the deviation from the standard value. These antibodies can also be used as reagents for studying the function of the protein of the present invention.
[0069]
The antibodies of the invention can be purified and then administered to a patient with a disease characterized by, for example, abnormal expression of type II collagen and / or abnormal chondrocyte differentiation resulting from abnormal expression of the protein of the invention. That is, the present invention is a medicine containing the above-described antibody as an active ingredient, and a therapeutic method using the antibody. These medicaments have additional active or inactive ingredients for therapeutic use (eg, conventional pharmaceutically acceptable carriers or diluents (eg, immunogenic adjuvants)) and physiologically non-toxic stabilization. Can be combined with agents and excipients. These combinations can be filter sterilized and put into dosage forms by lyophilization in dosage vials or as a reservoir in a stabilized aqueous preparation. Administration to a patient can be performed by methods known to those skilled in the art, such as intraarterial injection, intravenous injection, and subcutaneous injection. The dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose. These antibodies inhibit the abnormal expression of type II collagen and / or abnormal differentiation of chondrocytes mediated by the protein of the present invention, and show a therapeutic effect.
[0070]
The DNA of the present invention can also be used to isolate, identify and clone proteins involved in chondrocyte differentiation control. For example, a DNA sequence encoding a protein of the present invention may include other sequences encoding proteins that can bind to the protein of the present invention from a cDNA or genomic DNA library using the encoded protein as a “bait”. A “play” can be used in a yeast two-hybrid system that isolates and clones (eg Nature, 340: 245-246 (1989)). In a similar manner, it can also be determined whether a protein of the invention can bind to other proteins. Alternatively, as another method, there is a method of isolating a protein capable of binding to the protein of the present invention from a cell extract by an immunoprecipitation method using the antibody of the protein of the present invention (for example, a new genetic engineering handbook for experimental medicine). Can be mentioned. As another method, as described above, the protein of the present invention can be expressed as a fusion protein with another protein, and an immunoprecipitation method can be performed using an antibody against the fusion protein to bind to the protein of the present invention. A method for isolating the protein can be mentioned.
[0071]
The present invention carries out an assay for detecting a mutation in the gene encoding the protein (1), (2) or (9) having a function of promoting the expression of type II collagen by the above-described method, thereby diagnosing the disease. And a method for diagnosing susceptibility to the disease. Furthermore, such diseases may be diagnosed by methods that involve measuring an abnormal decrease or increase in protein or mRNA levels in a sample derived from an individual. Decrease or increase in expression is well known in the art for quantifying polynucleotides at the RNA level, for example, nucleic acid amplification methods such as RT-PCR, and RNase protection methods, Northern blotting methods, and other hybridization methods, etc. It can be measured by this method. Assay techniques that can be used to measure protein levels in a sample derived from a host are well-known to those of skill in the art. Such methods include radioimmunoassays, competitive binding assays, Western blot analysis and ELISA assays. The DNA of the present invention can be used to detect abnormalities in DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or a peptide fragment thereof. The present invention relates to a method for diagnosing a disease or susceptibility to a disease associated with the expression of the protein according to (1), (2) or (9) in an individual. The method includes measuring a mutation in a polynucleotide sequence encoding the protein.
[0072]
Since the DNA of the present invention can detect abnormalities in DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or its partial peptide by using the DNA of the present invention, for example, damage or mutation of the DNA or mRNA. Alternatively, it is useful for genetic diagnosis such as decreased expression, increased expression, or excessive expression. That is, the present invention is a method for diagnosing a disease or susceptibility to a disease in an individual related to the expression or activity of the protein in an individual organism,
(A) determining the presence or absence of a mutation in the nucleotide sequence encoding the protein according to (1), (2) or (9) above in the individual's genome, and / or
(B) providing a method comprising analyzing the expression level of the protein in a sample derived from the individual. For example, it can be determined whether or not the disease is a disease based on the degree of expression level of the protein. As a preferable example of the criterion based on the expression level, the amount of expressed protein is more than twice the normal level or 1 / Diagnose a illness if 2 or less.
[0073]
The nucleotide sequence encoding the protein of (1), (2) or (9) having the action of promoting the expression of type II collagen and / or the action of promoting the differentiation of chondrocytes by the step (a) of the diagnostic method If a mutation is detected, the mutation may cause abnormal expression of type II collagen and / or a disease associated with chondrocyte differentiation. Alternatively, when the protein expression level of (1), (2) or (9) in the subject is measured by the step (b) of the diagnostic method and shows a value different from the normal value, the expression of type II collagen is promoted. The abnormal expression level of the novel protein of the present invention having the action of promoting the action and / or the action of promoting the differentiation of cartilage may cause a disease related to the abnormal expression of type II collagen and / or the abnormality of chondrocytes. Here, the mutation of the nucleotide sequence encoding the protein of (1), (2) or (9) having the action of promoting the expression action of type II collagen in step (a) and / or the promotion of chondrocyte differentiation As a method for measuring the presence or absence of, for example, RT-PCR is performed using a part of the nucleotide sequence of a gene encoding the protein as a primer, and then the sequence is determined by a normal nucleotide sequencing method. Can be detected. Alternatively, the presence or absence of mutation can also be examined by PCR-SSCP method (Genomics, 5: 874-879, 1989, New Genetic Engineering Handbook, published by Experimental Medicine). Examples of the method for examining the protein expression level in step (b) include a method using the antibody described in (19).
[0074]
The present invention also relates to a method for screening a compound that inhibits or promotes type II collagen expression and / or chondrocyte differentiation by the protein of the present invention. This screening method is
(A) providing a cell with a gene encoding a protein having an action of promoting expression of type II collagen and a component capable of providing a detectable signal;
(B) culturing a transformed host cell under conditions that allow the gene to be expressed in the transformed cell;
(C) contacting the transformed cell with one or more test compounds;
(D) detecting a detectable signal; and
(E) isolating or identifying the activator compound and / or inhibitor compound by measuring the detectable signal.
[0075]
Further, it is preferable to isolate or identify a compound that increases the signal by 1.2 times or more than normal as an activator compound and to isolate or identify a compound that decreases the signal by 0.8 times or less as an inhibitor compound.
[0076]
A component that can provide a detectable signal includes, for example, a reporter gene. The reporter gene is used instead of directly detecting the activation of the transcription factor under test. The promoter of the gene to be examined is connected to the reporter gene, and the activity of the promoter gene is measured by measuring the activity of the reporter gene product. The analysis is performed (Biomanual Series 4, Yodosha (1994)).
[0077]
As the reporter gene, any gene encoding a peptide or protein can be used as long as the activity or production amount (including mRNA production amount) of the expression product can be measured by those skilled in the art. For example, it can be used by measuring enzyme activities such as chloramphenicol acetyltransferase, β-galactosidase, luciferase and the like. The reporter plasmid used to evaluate the expression of type II collagen is a type II collagen gene promoter sequence and a regulatory sequence necessary for the specific expression of type II collagen in cartilage upstream of the reporter gene. For example, the CPE 43 described in the embodiment of the present specification can be used. Alternatively, a reporter plasmid (48-bp chondrocyte-specific Col2a1 enhancer construction) described in Murakami S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 p1113-1118 (2000) is exemplified.
[0078]
The host cell may be any cell that can detect the expression of type II collagen, and is preferably a mammalian cell. For example, ATDC5 cells are suitably used. The transformation and culture are as described above.
[0079]
Specifically, for screening for a compound that inhibits or promotes the expression of type II collagen, for example, an arbitrary amount of a test substance is added to transformed cells cultured for a certain period of time, and a reporter expressed by the cells after a certain period of time is used. A compound that inhibits or promotes the expression of type II collagen can be screened by measuring the activity and comparing it with the reporter activity of a cell to which no test substance is added. The reporter activity can be measured by a method known to those skilled in the art (for example, BioManual Series 4, Yodosha (1994)). The test substance for screening is not particularly limited, and examples thereof include low molecular weight compounds and peptides. The test compound may be either artificially synthesized or naturally occurring. It can be a single substance or a mixture. As a detectable signal, in addition to the reporter gene, the amount of mRNA or protein of type II collagen may be measured. Examples of the measurement of mRNA amount include Northern hybridization and RT-PCR method. For example, a method using an antibody may be used to measure the amount of protein. The antibody may be prepared by a known method, or a commercially available antibody (for example, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY) may be used.
[0080]
The present invention also provides a chondrocyte differentiation promoting agent and a cartilage disease preventing / treating agent comprising the protein of the present invention as an active ingredient. The present invention also provides a chondrocyte differentiation promoter and a cartilage disease preventive / therapeutic agent containing the gene encoding the protein of the present invention as an active ingredient. The protein of the present invention or a gene encoding the protein can be used for various diseases associated with cartilage damage by promoting the expression of type II collagen and / or promoting the differentiation of undifferentiated chondrocytes into mature chondrocytes. Effectively used for prevention and treatment. Examples of the disease include osteoarthritis, cartilage dysplasia, cartilage defect in fractures, damage of articular cartilage or disc due to trauma, tuberculosis arthritis, rheumatoid arthritis, intervertebral disc herniation, or osteoarthritis Is mentioned.
[0081]
Among the chondrocyte differentiation agent and cartilage disorder therapeutic agent of the present invention, when a protein is used as an active ingredient, the following administration forms, administration methods and dosages can be used. That is, for therapeutic use, additional active or inactive ingredients (eg, conventional pharmaceutically acceptable carriers or diluents (eg, immunogenic adjuvants)) and physiologically non-toxic stabilizers and supplements. Can be combined with a form. These combinations can be sterile filtered and made into dosage forms by lyophilization in dosage vials or as a reservoir in a stabilized aqueous preparation. Administration to patients is preferably intravenous administration, but oral administration, administration as a suppository, subcutaneous injection, intramuscular injection, local injection, intraperitoneal administration, and the like can be performed. The dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose. For example, a daily dose of 0.0001 to 100 mg, preferably about 0.001 to 10 mg can be administered.
[0082]
Among the chondrocyte differentiation promoting agent and cartilage disorder therapeutic agent of the present invention, when a gene is used as an active ingredient and used as a gene therapy agent, the following gene introduction method, introduction form and introduction amount can be used.
[0083]
That is, as a method for introducing the gene therapy agent of the present invention into a patient, an in vivo method in which a gene is directly introduced into a cell in the body, and a certain cell is taken out from a human and introduced into the cell outside the body, There is an ex vivo method for returning cells to a living body.
[0084]
As an in vivo method, any of a method using a viral vector and a method using a non-viral vector can be applied (for example, experimental medicine separate biomanual UP series basic technology of gene therapy, cell engineering Vol. 20 No. 9 (2001)).
[0085]
Examples of the method using a recombinant virus include a method of introducing the DNA of the present invention into a virus such as adenovirus, herpes virus, retrovirus and the like. Examples of other methods include a method in which an expression plasmid is directly administered into muscle (DNA vaccine method), a liposome method, a lipofectin method, and the like. As the ex vivo method, a microinjection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, or the like is used.
[0086]
The administration method to a patient can be administered by an appropriate administration route according to the disease, symptom or the like for the purpose of treatment. For example, it can be administered intravenously, artery, subcutaneously, sarcoma, intramuscularly. A person skilled in the art can appropriately adjust the gene content in the preparation depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient.
[0087]
It is also possible to produce a pharmaceutical composition by the following steps (a) to (f).
(A) providing a cell with a gene encoding a protein having an action of promoting expression of type II collagen and a component capable of providing a detectable signal;
(B) culturing a transformed host cell under conditions that allow the gene to be expressed in the transformed cell;
(C) contacting the transformed host cell with one or more compounds;
(D) measuring a detectable signal;
(E) isolating or identifying activator compounds and / or inhibitor compounds by measuring the detectable signal; and
(F) optimizing the isolated or identified compound as a pharmaceutical composition.
[0088]
In the step (e) of the method for producing a pharmaceutical composition, a compound that increases the signal by 1.2 times or more than normal is isolated as an activator compound, and a compound that reduces the signal by 0.8 times or less is isolated or inhibited as an inhibitor compound. It is preferable to identify.
[0089]
The protein of the present invention may be used in a method for designing an agonist, antagonist or inhibitor of the protein based on the structure by the following steps.
(A) First, the step of determining the three-dimensional structure of the protein,
(B) inferring a three-dimensional structure of a site that appears to be a reactive or binding site of an agonist, antagonist or inhibitor;
(C) synthesizing candidate compounds that bind to or are predicted to bind to the inferred binding site or reactive site; and
(D) testing whether the candidate compound is indeed an agonist, antagonist or inhibitor.
[0090]
The present invention also includes a compound obtained by the above screening. However, the production method of the compound obtained by the screening method of the present invention is not limited to the above method. Furthermore, the method of manufacturing a pharmaceutical composition by the method as described in said (16) is also included.
[0091]
The candidate compound is not particularly limited, and examples thereof include a low molecular weight compound and a peptide. The candidate compound may be artificially synthesized or naturally occurring. Since the compound obtained by the above screening has an action of inhibiting or promoting the expression of type II collagen, it treats or prevents diseases caused by abnormal expression of type II collagen and / or abnormal differentiation of chondrocytes. It is useful as a pharmaceutical. In order to isolate and purify the target compound from the mixture, a method known per se, for example, filtration, extraction, washing, drying, concentration, crystallization, various chromatographies and the like can be appropriately combined. When it is desired to obtain a salt of the compound, it may be purified as it is when the compound is obtained in the form of a salt, and when it is obtained in a free form, it is dissolved or suspended in a suitable solvent by a usual method, A desired acid or base may be added to form a salt, followed by isolation and purification.
[0092]
Examples of the step of optimizing a compound obtained by using the method of the present invention or a salt thereof as a pharmaceutical composition include a method of formulating it by the following conventional method. That is, an effective amount of the above compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier may be mixed as an active ingredient. For formulation, a form suitable for the selected mode of administration is selected. Compositions suitable for oral administration include solid forms such as tablets, granules, capsules, pills, and powders, and liquid forms such as solutions, syrups, elixirs, and suspensions. Forms useful for parenteral administration include sterile solutions, emulsions, and suspensions. Examples of the carrier include saccharides such as gelatin, lactose and glucose, starches such as corn, wheat, rice and corn starch, fatty acids such as stearic acid, fatty acid salts such as calcium stearate and magnesium stearate, talc, vegetable oil, Examples include alcohols such as stearic alcohol and benzyl alcohol, gums, polyalkylene glycols, and the like. Among these, examples of the liquid carrier generally include water, physiological saline, dextrose or a similar sugar solution, and glycols such as ethylene glycol, propylene glycol and polyethylene glycol.
[0093]
The present invention provides a kit for screening a compound for the activity of inhibiting or promoting the expression of type II collagen. The kit
(A) a gene encoding a protein having an action of promoting the expression of type II collagen and a cell transformed with a component capable of providing a detectable signal after promoting the expression of type II collagen,
(B) a reagent for measuring a detectable signal, and reagents necessary for screening a compound that inhibits or promotes the expression of type II collagen;
including.
[0094]
In another aspect, the present invention provides:
(A) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 Or a polynucleotide of the invention having a nucleotide sequence represented by 47; (b) a polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of (a);
(C) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 Or a protein of the invention having an amino acid sequence represented by 48 or a fragment thereof; or
(D) an antibody against the protein of the present invention of (c);
A diagnostic kit is provided.
[0095]
A diagnostic kit including at least any of the above (a) to (d) is useful for diagnosing diseases such as osteoarthritis, rheumatoid arthritis, and cartilage deficiency, or susceptibility to the diseases.
[0096]
The discovery of a novel protein having the effect of promoting the expression of type II collagen reported herein has provided a new medicine and treatment method for treating or preventing diseases involving cartilage disorders. In a further embodiment, the present invention relates to a method of using a compound that activates or inhibits the function of a protein having an action of promoting the expression of type II collagen for controlling the proliferation / differentiation of chondrocytes. The compound that activates or inhibits the expression of type II collagen obtained by the above screening method is useful as a medicament for treating or preventing a disease involving a cartilage disorder. Examples of the disease include osteoarthritis, cartilage dysplasia, cartilage defect in fracture, damage of articular cartilage or disc due to trauma, tuberculosis arthritis, rheumatoid arthritis, intervertebral disc herniation, osteoarthritis, Examples include ectopic ossification and ectopic calcification.
[0097]
Furthermore, the protein of the present invention and the DNA encoding the protein can also be used for diagnostic purposes.
[0098]
When the compound obtained by using the screening method of the present invention or a salt thereof is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it can be carried out according to conventional means. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be used. Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be administered to, for example, humans and mammals (eg, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). . Administration to a patient can be performed by methods known to those skilled in the art, such as intraarterial injection, intravenous injection, and subcutaneous injection. The dose and administration method vary depending on the weight and age of the patient, but those skilled in the art can appropriately select an administration method and appropriately select an appropriate dose according to the administration method. In addition, if the compound can be encoded by DNA, it may be possible to incorporate the DNA into a gene therapy vector and perform gene therapy. That is, the present invention provides a medicament containing, as an active ingredient, a compound that inhibits or activates the expression of type II collagen.
[0099]
Furthermore, the above compound is useful as a medicament for treating or preventing diseases associated with cartilage disorders. That is, the present invention provides a medicament for preventing or treating cartilage disease, which comprises a compound that inhibits or activates the expression of type II collagen. Specifically, for example, osteoarthritis, cartilage dysplasia, cartilage defect in fractures, damage of articular cartilage or disc due to trauma, tuberculosis arthritis, rheumatoid arthritis, intervertebral disc herniation, osteoarthritis, It is useful as a therapeutic and prophylactic agent for ectopic ossification and ectopic calcification.
[0100]
Furthermore, the present invention includes osteoarthritis, cartilage dysplasia, cartilage defect in fractures, damage of articular cartilage or disc due to trauma, tuberculosis arthritis, rheumatoid arthritis, intervertebral disc herniation, osteoarthritis, The use of a pharmaceutical composition produced by the method described in (16) above in the production of a medicament such as ectopic ossification and ectopic calcification is also included.
[0101]
The present invention also provides antisense oligonucleotides to the polynucleotides described in (4) to (7) above. Antisense oligonucleotides use oligonucleotides that have a sequence complementary to the targeted gene sequence, and are translated into proteins, transported into the cytoplasm, or other activities required for overall biological activity functions, etc. By inhibiting the function of RNA, expression of the target gene can be suppressed. At this time, as the antisense oligonucleotide, RNA or DNA may be used. The DNA sequences of the present invention can be used to make antisense oligonucleotides that can hybridize to mRNA transcribed from the gene encoding the protein of the present invention. In general, it is a known fact that antisense oligonucleotides act suppressively on the expression of their genes (for example, Cell Engineering Vol. 13 No. 4 (1994)). An oligonucleotide having an antisense coding sequence for the gene encoding the protein of the present invention can be introduced into cells by a standard method, and the oligonucleotide can translate mRNA of the gene encoding the protein of the present invention. It can be effectively blocked to block its expression and suppress unwanted effects.
[0102]
The antisense oligonucleotide of the present invention may be modified in addition to the oligonucleotide found in nature [for example, Murakami & Makino: Cell Engineering Vol.13 No.4 p259-266 (1994), Akira Murakami: Protein Nucleic Acid Enzyme Vol.40 No.10 p1364-1370 (1995), Tsuneari Takeuchi et al .: Experimental Medicine Vol.14 No.4 p85-95 (1996)]. Thus, the oligonucleotide may have altered sugar moieties or intersugar moieties. Examples of these are phosphothioates and other sulfur-containing species known in the art. According to some preferred embodiments, at least one phosphodiester bond of the oligonucleotide is replaced by a structure having the function of enhancing the ability of the composition to penetrate the region of the cell in which the RNA whose activity is to be modulated is located. The
[0103]
Such substitutions preferably include phosphorothioate linkages, phosphoramidate linkages, methylphosphonate linkages or short chain alkyl or cycloalkyl structures. Antisense oligonucleotides may also include several modified nucleotide types. Accordingly, purines and pyrimidines other than those normally found in nature may be used. Similarly, the furanosyl portion of the nucleotide subunit can be modified as long as the essential intention of the invention is carried out. Examples of such modifications are 2'-O-alkyl- and 2'-halogen substituted nucleotides. Examples of 2'-position modifications of some sugar moieties useful in the present invention are OH, SH, SCH Three , OCH Three , OCN, or O (CH 2 NCH Three (Where n is from 1 to about 10), and other substituents having similar properties. All such analogs are encompassed by the present invention so long as they function to hybridize with the mRNA of the gene of the present invention and inhibit the function of that RNA.
[0104]
The antisense oligonucleotides of the present invention comprise about 3 to about 50 nucleotides, preferably about 15 to about 30 nucleotides, more preferably about 20 to about 25 nucleotides. The antisense oligonucleotide of the present invention can be prepared by a solid phase synthesis method which is a well-known method. Equipment for such synthesis is sold by several vendors, including Applied Biosystems. Production of other oligonucleotides such as phosphothioates can also be made by methods known to those skilled in the art.
[0105]
The antisense oligonucleotide of the present invention is designed so that it can hybridize with mRNA transcribed from the gene of the present invention. Methods for designing antisense oligonucleotides based on the sequence of a given gene are easy for those skilled in the art [for example, Murakami and Makino: Cell Engineering Vol.13 No.4 p259-266 (1994), Murakami Chapter: Protein Nucleic Acid Enzyme Vol.40 No.10 p1364-1370 (1995), Tsuneuchi Takeuchi et al .: Experimental Medicine Vol.14 No.4 p85-95 (1996)]. Recent studies suggest that antisense oligonucleotides designed in the 5 ′ region of mRNA, preferably in the region containing the translation initiation site, are most effective in inhibiting gene expression. The length of the antisense oligonucleotide is preferably 15 to 30 nucleotides, more preferably 20 to 25 nucleotides. It is desirable to confirm that there is no interaction with other mRNAs by homology search and that no secondary structure is taken in the oligonucleotide sequence. Evaluation of whether the designed antisense molecule functioned was carried out by introducing an antisense oligonucleotide into the cell using an appropriate cell, and measuring the amount of the target mRNA (for example, Northern blotting) by a method known to those skilled in the art. Or RT-PCR method), or by measuring the amount of the target protein (for example, Western blot or fluorescent antibody method), the effect of suppressing expression can be confirmed.
[0106]
On the other hand, triple helix formation (triple helix technology) is a method for controlling gene expression mainly at the transcriptional stage, targeting DNA in the nucleus. Antisense oligonucleotides are designed primarily in gene regions involved in transcription, thereby suppressing transcription and production of the proteins of the invention. These RNA, DNA, and oligonucleotide can be produced using a known synthesizer.
[0107]
The antisense oligonucleotide of the present invention includes the use of a DNA transfection method such as a calcium phosphate method, a lipofection method, an electroporation method, a microinjection method, or a gene transfer vector such as a virus in a cell containing a target nucleic acid sequence. It may be introduced using any gene transfer method. An antisense oligonucleotide expression vector can be made using a suitable retroviral vector and then introduced into a cell containing the target nucleic acid sequence by contacting the expression vector with the cell in vivo or ex vivo.
[0108]
The DNA of the present invention can be used to inhibit the promotion of type II collagen expression and / or the promotion of chondrocyte differentiation via the protein of the present invention using antisense RNA / DNA technology or triple helix technology.
[0109]
The antisense oligonucleotide of the gene encoding the protein of the present invention is useful as a medicament for treating or preventing diseases characterized by undesirable differentiation promotion of chondrocytes such as ectopic ossification and ectopic calcification. is there. That is, the present invention is a medicament containing the antisense oligonucleotide as an active ingredient. In addition, the antisense oligonucleotide of the present invention can also be used for detection of these diseases using the Northern hybridization method or the PCR method.
[0110]
The present invention also includes ribozymes that inhibit the promotion of type II collagen expression and / or the promotion of chondrocyte differentiation. A ribozyme is an RNA that recognizes the nucleotide sequence of a nucleic acid and has an activity of cleaving the nucleic acid (for example, Hiroshi Yanagawa Experimental Medicine Bioscience 12, New Age of RNA). Ribozymes can be produced to cleave selected target RNAs, such as mRNA encoding the protein of the invention. A ribozyme that specifically cleaves the mRNA of the protein of the present invention can be designed based on the nucleotide sequence of the DNA encoding the protein of the present invention, and such ribozyme is complementary to the mRNA of the protein of the present invention. The mRNA is cleaved and then the mRNA is cleaved to reduce (or not fully) express the protein of the present invention, and the level of decreased expression is the ribozyme in the target cell. Depends on the level of expression.
[0111]
There are two types of ribozymes that are often used, hammerhead type and hairpin type. In particular, hammerhead type ribozymes have been well examined for their primary and secondary structures required for cleavage activity. Ribozymes can be easily designed using only the nucleotide sequence information of the DNA encoding the protein of the invention [for example, Iida et al .: Cell Engineering Vol.16 No.3, p438-445 (1997), Okawa & Heihira: Experiments Medicine Vol.12 No.12 p83-88 (1994)]. The hammerhead ribozyme has a structure consisting of two recognition sites (recognition site I and recognition site II) that form complementary strands with the target RNA and an active site. After forming a complementary pair between the target RNA and the recognition site, It is known to cleave at the 3 ′ end of the NUX sequence (N: A or G or C or U, X: A or C or U) of the target RNA, and in particular, GUC (or GUA) is the highest. [For example, Koizumi, M et al .: Nucl. Acids Res. 17, 7059-7071 (1989), Iida et al .: Cell engineering Vol.16 No. 3, p438-445 (1997), Okawa & Heira: Experimental Medicine Vol.12 No.12 p83-88 (1994), Kawasaki & Tahira: Experimental Medicine Vol.18 No.3p381-386 (2000)].
[0112]
Therefore, first, a GTC (or GTA) sequence is searched from the DNA sequence of the present invention, and a ribozyme is designed so that complementary pairs of several nucleotides to several tens of nucleotides can be made before and after that. The evaluation of the appropriateness of the designed ribozyme can be performed, for example, by the method described in the literature of Okawa & Heihira [Experimental Medicine Vol.12 No.12 p83-88 (1994)]. ) Can be evaluated by examining whether the target mRNA can be cleaved. Ribozymes are prepared by methods well known in the art for synthesizing RNA molecules.
[0113]
An alternative method is to synthesize the ribozyme sequence with a DNA synthesizer, incorporate it into various vectors having an appropriate RNA polymerase promoter such as T7 or SP6, and synthesize RNA enzymatically in vitro. . These ribozymes can be introduced into cells by a gene introduction method such as a microinjection method. Alternatively, as another method, a ribozyme-encoding DNA is incorporated into an appropriate expression vector and introduced into a cell line, cell or tissue. Any suitable vector can be used to introduce the ribozyme into the selected cells, eg, plasmid vectors, animal virus (eg, retrovirus, adenovirus, herpes or vaccinia virus) vectors commonly used for these purposes. These ribozymes produced have the action of inhibiting the promotion of type II collagen expression and / or the promotion of chondrocyte differentiation mediated by the protein of the present invention.
[0114]
The present invention also provides a method for obtaining a novel gene having a function. More specifically, the present invention provides a method for obtaining a novel gene comprising a step of preparing a full-length cDNA library using an oligo capping method and a step of detecting the presence of a protein having the function using a signal factor. An example of the signal factor is a reporter gene.
[0115]
In order to obtain a large number of functional genes (cDNA), it is inefficient to use a cDNA library with many incomplete lengths. Therefore, a library having a high proportion of full-length clones among all clones is required. A full-length cDNA is a complete copy of mRNA made from a gene. The cDNA library prepared by the oligo-capping method has a full-length cDNA ratio of 50 to 80%, which is 5 to 10 times the concentration of full-length cDNA clones compared to the cDNA library prepared by the conventional method. (Junio Kanno: Monthly BIO INDUSTRY Vol.16 No.11 p19-26). In general, full-length cDNA is an essential clone for protein expression in gene function analysis, and the full-length cDNA clone itself is extremely important as a material for activity measurement. In attempting analysis, cloning of full-length cDNA is an essential requirement. Furthermore, determining the sequence provides important information for determining the primary sequence of the protein it encodes, as well as the sequence of all exons of the gene. That is, the full-length cDNA also provides valuable information for identifying a gene, such as information for determining the primary sequence of a protein, exon-intron structure, mRNA transcription start point, promoter position, and the like.
[0116]
Preparation of a full-length cDNA library by the oligo capping method can be performed, for example, according to the method described in the experimental medicine separate volume, new genetic engineering handbook revised third edition (1999). That is, in the present invention, the oligo capping method is a method of replacing the cap structure with a synthetic oligo by BAP, TAP, or RNA ligase, as described in Suzuki, Sugano Experimental Medicine separate volume, Genetic Engineering Handbook 3rd edition. .
[0117]
A reporter gene that can be used as a signal factor indicating the presence of a functional protein includes an appropriate expression control sequence part (or parts) to which a protein factor such as a transcription factor can bind and activation by the transcription factor. Consists of structural gene parts that can be measured. As the structural gene portion, any gene encoding a peptide or protein can be used as long as the activity or production amount (including mRNA production amount) of the expression product can be measured by those skilled in the art. For example, a polynucleotide encoding chloramphenicol acetyltransferase, β-galactosidase, luciferase and the like can be used, and can be used by measuring the enzyme activity. Examples of reporter genes indicating the presence of functional proteins include CPE43 reporter plasmid as shown in the examples of the present specification, as well as, for example, aggrecan which is a marker gene specifically expressed in chondrocytes, XI type collagen, etc. Examples include a reporter gene using a gene expression control sequence.
[0118]
For example, in order to obtain a gene having a function of promoting the expression of type II collagen gene, a CPE43 reporter plasmid capable of monitoring the expression of type II collagen and a full-length cDNA clone prepared by the oligo capping method are co-introduced into cells, The objective can be achieved by selecting a plasmid having an increased reporter activity from among them. In this case, it may be performed with some stimulation applied to the cells. The introduction of a cDNA clone into a cell may be one clone or a plurality of clones may be introduced simultaneously. An example of the method of the present invention is described in detail in the Examples herein. Alternatively, a system for screening a gene having a function of suppressing differentiation from undifferentiated cells to chondrocytes can be constructed. Humoral factors such as IGF, BMP, and FGF are known to be involved in the regulation of chondrocyte proliferation and differentiation (for example, Geduspan JS et al .: Dev. Biol. 156 p500-508 (1993)). . After introducing a full-length cDNA and a reporter gene (eg, CPE43 reporter plasmid) into a cell (eg, ATDC5 cell), the cell is stimulated with a humoral factor such as IGF, BMP, or FGF, and a clone with weak increase in reporter activity is selected. Thus, a gene having a function of suppressing differentiation from undifferentiated cells to chondrocytes can be obtained. However, by preparing a reporter gene as appropriate, in addition to a gene encoding a protein having an action of promoting type II collagen expression, various physiologically active factors (for example, NF-κB, MAP kinase, angiogenesis factor, various It is possible to obtain a gene encoding a protein having an action of activating a transcription factor.
[0119]
The method for obtaining the novel gene of the present invention may be either an in vitro system or a cell-based system, preferably a cell system. The cell may be any of prokaryotes such as prokaryotic Escherichia coli, microorganisms such as yeast and fungi, and cells such as insects and animals, preferably animal cells, such as ATDC5 cells.
[0120]
Further, since the cDNA of the present invention is a full-length cDNA, the sequence at the 5 ′ end is the transcription start point of mRNA, and by comparing the cDNA sequence with the nucleotide sequence of the genome, the promoter region of the gene is determined. It can be used for identification. When the nucleotide sequence of the genome is registered as a known sequence in the database, the sequence can be used. Alternatively, the cDNA can be used to clone from a genomic library, for example by hybridization, and determine the nucleotide sequence. In this way, by comparing the nucleotide sequence of the cDNA of the present invention with the genomic sequence, it is possible to identify the promoter region of the gene existing upstream thereof. Furthermore, a reporter plasmid for examining the expression of the gene can be prepared using the promoter fragment of the gene thus identified. In most cases, a reporter plasmid can be prepared by incorporating a DNA fragment 2 kb upstream from the transcription start site, preferably 1 kb upstream from the transcription start site, upstream of the reporter gene. Furthermore, the reporter plasmid can be used for screening for compounds that enhance or attenuate the expression of the gene. Specifically, for example, an appropriate cell is transformed with the reporter plasmid, an arbitrary amount of a test substance is added to the transformed cell cultured for a certain period of time, and the reporter activity expressed by the cell after a certain period of time is measured. It can screen by comparing with the reporter activity of the cell which does not add a test substance. These are also included in the present invention.
[0121]
The present invention also includes SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43. A data set comprising at least one or more of the nucleotide sequences represented by 45 or 47 and / or SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, The present invention relates to a computer readable medium storing a data set including at least one of amino acid sequences represented by 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, or 48.
[0122]
Furthermore, the present invention relates to a method for calculating homology by comparing data on the medium described above with data on other nucleotide sequences. That is, the polynucleotide and amino acid sequences of the present invention provide a valuable source of information for determining their two- and three-dimensional structures and for example identifying additional highly homologous sequences that have similar functions. If these sequences are stored in a computer-readable medium, and then the database is searched using a known search tool such as GCG using data stored in a known polymer structure program, It is easy to find sequences with some homology.
[0123]
The computer readable medium can be any composition of matter used to store information or data, such as a commercially available flexible disk, tape, chip, hard drive, compact disk, and video disk. In addition, the data on this medium allows a method of calculating homology compared to other nucleotide sequence data. In this method, a first polynucleotide sequence comprising a polynucleotide sequence of the present invention is provided in a computer readable medium, and then the first polynucleotide sequence is provided with at least one second polynucleotide or polypeptide sequence. And identifying the homology as compared to.
[0124]
The present invention also includes SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43. , 45 or 47, to an insoluble substrate on which a polynucleotide comprising all or part of the nucleotide sequence selected from is fixed. A plurality of various polynucleotides, which are DNA probes, are immobilized on a specially processed substrate such as a glass slide, and then the labeled target polynucleotide is hybridized with the immobilized polynucleotide. Detect the signal. The resulting data is analyzed and gene expression is measured.
[0125]
The present invention still further includes SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, The present invention relates to an insoluble substrate to which a polypeptide comprising all or part of an amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by 44, 46 or 48 is immobilized. Cell-derived components such as proteins that are expected to be effective for diagnosis or new drug development, which are mixed with an insoluble substrate immobilizing this protein and a biological cell extract and captured on the insoluble substrate Can be isolated or identified.
[0126]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. Various changes and modifications can be made by those skilled in the art and are also included in the present invention.
[0127]
(Example 1) Preparation of full-length cDNA library using oligo capping method
(1) Preparation of RNA from mouse ATDC5 cells
After subcultured mouse EC (embryonal carcinoma) -derived cloned cell line ATDC5 (Atsumi, T. et al .: Cell Diff. Dev., 30: p109-116 (1990)) to 50 10 cm dishes, a cell scraper Cells were harvested at Next, total RNA was obtained from the collected cells using an RNA extraction reagent ISOGEN (purchased from Nippon Gene). The specific method of acquisition followed the reagent protocol. Poly A + RNA was then obtained from total RNA using an oligo-dT cellulose column. The specific method for obtaining poly A + RNA was in accordance with the above-mentioned Maniatis experiment.
[0128]
ATDC5 cells were cultured in HAM F-12 medium containing 5% fetal bovine serum (Invitrogen), 10 μg / ml human transferrin (SIGMA), and 0.3 nmol / l sodium selenite (Wako Pure Chemical Industries). (SIGMA) and D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium: SIGMA) mixed at 1: 1 in a 5% CO 2 In the presence, the cells were cultured at 37 ° C.
[0129]
(2) RNA preparation from human lung fibroblasts (Cryo NHLF)
Human lung fibroblasts (Cryo NHLF: purchased from Sanko Junyaku Co., Ltd.) were cultured according to the attached protocol. After subcultured up to 50 10 cm dishes, cells were collected with a cell scraper. Subsequently, poly A + RNA was acquired by the method similar to said (1).
[0130]
(3) Preparation of full-length cDNA library by oligo capping method
A full-length cDNA library was prepared from the ATDC5 cells and human lung fibroblast poly A + RNA by the oligo capping method. A specific method for preparing a full-length cDNA library by the oligo capping method is the method of Sugano et al. (For example, Maruyama, K. & Sugano, S. Gene, 138: 171-174 (1994), Suzuki, Y. et al. Gene, 200: 149-156 (1997), Suzuki / Hino, Experimental Medicine Separate Volume, Genetic Engineering Handbook Revised 3rd Edition].
[0131]
(4) Preparation of plasmid DNA
The full-length cDNA library prepared in the above Example was transformed into E. coli TOP10 by electroporation, and then applied to an LB agar medium containing 100 μg / ml ampicillin and incubated at 37 ° C. overnight. Then, the plasmid was collect | recovered from the colony of colon_bacillus | E._coli grown on the ampicillin containing LB agar medium using QIAwell 96 Ultra Plasmid Kit of QIAGEN. The specific method followed the protocol attached to the QIAwell 96 Ultra Plasmid Kit.
[0132]
(Example 2) Cloning of DNA having an action of inducing expression of type II collagen
(1) Screening of cDNA encoding a protein having an action of inducing expression of type II collagen
ATDC5 cells were seeded in a 96-well plate for cell culture so as to be 7500 Cells / well / 100 μl, and 5% CO 2 In the presence, the cells were cultured at 37 ° C. for 1 day. The medium is a HAM F-12 medium (SIGMA) containing 5% fetal bovine serum (Invitrogen), 10 μg / ml human transferrin (SIGMA), and 0.3 nmol / l sodium selenite (Wako Pure Chemical Industries). And D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium: SIGMA) mixed at a ratio of 1: 1 was used. Next, using FuGENE6 (purchased from Roche), 100 ng of CPE43 reporter plasmid and 2 μl of the full-length cDNA plasmid prepared in Example 1 (4) above were co-introduced into one well. The method of introduction followed the attached protocol. 5% CO 2 After culturing at 37 ° C. for 2 days in the presence, the reporter activity (luciferase activity) of the CPE43 reporter plasmid was measured using the long term luciferase assay system, Picker Gene LT2.0 (Toyo Ink) according to the attached instructions. . The luciferase activity was measured using Wallac ARVOTMST 1420 MULTILABEL COUNTER manufactured by Perkin Elmer.
[0133]
A reporter plasmid CPE43 having a promoter sequence and an enhancer sequence of a type II collagen gene and carrying DNA encoding luciferase as a structural gene portion was constructed as follows. CPE43 was constructed with reference to a reporter plasmid constructed by Lefebvre et al. (Mol. Cell. Biol., 16 p4512-4523 (1996)). First, in order to clone the sequence of the promoter region of the human type II collagen gene, based on the base sequence of the human type II collagen gene (Genbank Accession M60299), a synthetic oligonucleotide, 5′-AGATCTGGTTACAGCCCCAGCTGGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 49 ) And 5′-AAGCTTAGCAGCCGCTCTCGGTCTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 50), and using this primer pair, PCR was carried out using the human genome as a template, and an amplified fragment of about 0.12 kb was isolated, After digestion with BglII and HindIII, T4 DNA ligase (GIBCO / BRL) is used between BglII and HindIII sites of firefly luciferase reporter vector pGL3-Basic Vector (Promega Corporation) Inserted. The obtained clone was confirmed for the nucleotide sequence by a conventional method. PCR was carried out using a 10-fold concentration of reaction buffer (buffer attached to TaKaRa Ex Taq: Takara Shuzo) 5 μl, 2.5 mM dNTP mixed solution 5 μl, each of the above primers 2 μl (each 10 μM concentration), TaKaRa Ex Taq polymerase (Takara Shuzo) 50 μl of a reaction solution containing 5 μl and human genomic DNA (CLONTECH) 200 ng was prepared. After incubation at 96 ° C. for 2 minutes, 94 ° C. for 1 minute, 56 ° C. for 1 minute 20 seconds, 72 ° C. for 1 minute 40 Incubation for 2 seconds was performed for 30 cycles using TaKaRa PCR Thermal Cycler MP (Takara Shuzo).
[0134]
Next, an enhancer sequence of a type II collagen gene was prepared using a synthetic oligonucleotide. Two synthetic oligonucleotides, 5′-GATCCTGTGAATCGGGCTCTTATGGCGCTTGAGAAAAGCCCCATTCATGAGA-3 ′ (SEQ ID NO: 51) and 5′-GATCTCTCCATGAATGGGGCTTTTCCAAGCGCATACAGAGCCCCATTCACAG-3 ′ (SEQ ID NO: 52) The synthetic oligonucleotides were dissolved in sterilized water to 1 μg / μl each, mixed in 1 μl each, and further adjusted to a volume of 20 μl with sterilized water. The solution was heated at 95 ° C. for 5 minutes and then gradually cooled to room temperature to prepare a double-stranded oligonucleotide solution. The solution was ligated using T4 DNA ligase, digested with restriction enzymes BamHI and BglII, and subjected to agarose gel electrophoresis. A DNA fragment of about 0.2 kb, in which double-stranded oligonucleotides were ligated four times in the same direction (tandem), was excised and purified using Geneclean Spin kit (BIO 101). The DNA fragment was inserted into the BglII site of the plasmid prepared above (in which the promoter region sequence of human type II collagen gene was incorporated into pGL3-Basic Vector). A clone in which the synthetic oligonucleotide was inserted so that a restriction enzyme BglII site was generated between the type II collagen promoter and the synthetic oligonucleotide was selected as a CPE43 reporter plasmid.
[0135]
(2) Determination of nucleotide sequence
120,000 clones were subjected to the above screening, and a plasmid whose luciferase activity was increased by 2 times or more compared with a control experiment (luciferase activity of a cell into which an empty vector pME18S-FL3 was introduced instead of the full-length cDNA plasmid) was selected, First, 5 ′ side (sequence primer: 5′-CTCTCTCTCTAAAAGCTCGCG-3 ′ (SEQ ID NO: 53)) and 3 ′ side (sequence primer: 5′-CGACCCTGCAGCTCGAGCACA-3 ′ (SEQ ID NO: 54) of the cloned cDNA ) From each, and the nucleotide sequence was determined as long as possible. The reagents and methods for determining the nucleotide sequence are BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), ABI PRISM 377 sequencer, or ABI PRISM 3100 sequencer attached to each kit. This was done according to the instructions.
[0136]
(3) Full length sequence
Full length nucleotide sequences (SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 for 24 novel clones) , 39, 41, 43, 45 or 47), and the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20) of the protein coding portion (open reading frame) , 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 or 48).
[0137]
【The invention's effect】
INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, proteins having an action of promoting the expression of type II collagen gene having high industrial utility and their genes are provided. The protein or gene of the present invention promotes the expression of type II collagen. As a result, the composition comprising the chondrocyte differentiation induction promoting action and the cartilage formation promoting action and containing the protein and gene of the present invention is useful for the prevention and treatment of various diseases involving cartilage disorders. Moreover, it is possible to screen for compounds useful for the treatment and prevention of diseases associated with cartilage inhibition and to produce diagnostic agents for such diseases by using the proteins of the present invention and their genes.
[0138]
[Sequence Listing]
Claims (30)
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８のいずれかにおいて１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつII型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質。The following purified protein (a) or (b):
(A) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 Or a protein comprising an amino acid sequence represented by any one of 48.
(B) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 Or a protein comprising an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are deleted, substituted or added in any one of 48 and having an action of promoting expression of type II collagen.
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８のいずれかにおいて１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつII型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質。An isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding the following protein (a) or (b):
(A) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 Or a protein comprising an amino acid sequence represented by any one of 48.
(B) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 Or a protein comprising an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are deleted, substituted or added in any one of 48 and having an action of promoting expression of type II collagen.
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５または４７のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列。
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつII型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５または４７のいずれかにおいて、１若しくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド配列からなり、かつII型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。An isolated polynucleotide comprising a polynucleotide sequence of any of the following (a) to (c):
(A) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 Or a polynucleotide sequence represented by any of 47.
(B) a polynucleotide encoding a protein that hybridizes with a polynucleotide having a polynucleotide sequence complementary to the polynucleotide sequence of (a) under stringent conditions and has an action of promoting expression of type II collagen An array.
(C) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 48. A polynucleotide sequence encoding a protein consisting of a polynucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added, and having an action of promoting expression of type II collagen.
（ｂ）培養物からタンパク質を回収する、
ことを含むタンパク質の製造方法。(A) culturing transformed cells containing the polynucleotide under conditions that express the protein encoded by the isolated polynucleotide according to any one of claims 3 to 6;
(B) recovering the protein from the culture;
A method for producing a protein comprising the above.
（ｂ）該個体に由来するサンプル中での該タンパク質の発現量を分析する、
ことを含む、該個体における該タンパク質の発現または活性に関連した、該個体における疾病または疾病への感受性の診断方法。(A) determining the presence or absence of a mutation in the nucleotide sequence encoding the protein of claim 1, 2, or 7 in the genome of the individual, and / or (b) in a sample derived from the individual Analyzing the expression level of the protein;
A method of diagnosing a disease or susceptibility to a disease in said individual related to the expression or activity of said protein in said individual.
（ａ）II型コラーゲンの発現を促進するタンパク質をコードする遺伝子、およびII型コラーゲンの発現に対応した、検出可能なシグナルを提供しうる成分を細胞に提供する工程、
（ｂ）該遺伝子が形質転換された細胞内で発現可能となる条件下で該形質転換された細胞を培養する工程、
（ｃ）該形質転換された細胞と１あるいは複数個の候補化合物とを接触させる工程、
（ｄ）検出可能なシグナルを測定する工程、および
（ｅ）該検出可能なシグナルの測定により活性化剤化合物および／または阻害剤化合物を単離もしくは同定する工程。A method of screening a compound for an activity of inhibiting or promoting expression of type II collagen comprising the following steps.
(A) providing a cell with a gene encoding a protein that promotes expression of type II collagen and a component capable of providing a detectable signal corresponding to the expression of type II collagen;
(B) culturing the transformed cell under conditions that allow the gene to be expressed in the transformed cell;
(C) contacting the transformed cell with one or more candidate compounds;
(D) measuring a detectable signal, and (e) isolating or identifying an activator compound and / or inhibitor compound by measuring the detectable signal.
（ａ）II型コラーゲンの発現を促進する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子、および検出可能なシグナルを提供しうる成分を細胞に提供する工程、
（ｂ）該遺伝子が形質転換された細胞内で発現可能となる条件下で該形質転換された宿主細胞を培養する工程、
（ｃ）該形質転換された宿主細胞と１あるいは複数個の候補化合物とを接触させる工程、
（ｄ）検出可能なシグナルを測定する工程、
（ｅ）該検出可能なシグナルの測定により活性化剤化合物および／または阻害剤化合物を単離もしくは同定する工程、および
（ｆ）単離または同定された化合物を医薬組成物として最適化する工程。A method for producing a pharmaceutical composition comprising the following steps.
(A) providing a cell with a gene encoding a protein having an action of promoting the expression of type II collagen, and a component capable of providing a detectable signal;
(B) culturing the transformed host cell under conditions that allow the gene to be expressed in the transformed cell;
(C) contacting the transformed host cell with one or more candidate compounds;
(D) measuring a detectable signal;
(E) isolating or identifying an activator compound and / or inhibitor compound by measuring the detectable signal, and (f) optimizing the isolated or identified compound as a pharmaceutical composition.
（ａ）II型コラーゲンの発現を促進するタンパク質をコードする遺伝子、およびII型コラーゲンの発現に対応した、検出可能なシグナルを提供しうる成分により形質転換された細胞、および
（ｂ）検出可能なシグナルを測定するための試薬、
を含むキット。A kit for screening a compound for inhibitory activity or promoting activity of type II collagen expression,
(A) a gene encoding a protein that promotes expression of type II collagen, and a cell transformed with a component capable of providing a detectable signal corresponding to the expression of type II collagen, and (b) detectable A reagent for measuring the signal,
Including kit.
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| JP2002113908A JP2006166703A (en) | 2002-04-16 | 2002-04-16 | Cartilage differentiation regulating gene |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023175583A1 (en) * | 2022-03-17 | 2023-09-21 | Innoskel | Methods of treating bone fragility syndromes |
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- 2002-04-16 JP JP2002113908A patent/JP2006166703A/en not_active Withdrawn
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|---|---|---|---|---|
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