JP2006149270A - Method and apparatus for detecting microorganism - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、微生物検出方法及び微生物検出装置に関し、より詳しくは、電極を用いて微生物の検出を行う微生物検出方法及び微生物検出装置に関する。 The present invention relates to a microorganism detection method and a microorganism detection apparatus, and more particularly to a microorganism detection method and a microorganism detection apparatus that detect microorganisms using an electrode.
食中毒を防止するため、食品の原材料や加工工程毎の安全面や衛生面の管理の高度化が望まれている。食中毒の原因となる微生物の検出や、微生物数の測定については、微生物の代謝による培地中の溶存酸素濃度の減少を酸素電極で検知する方法（酸素電極法）が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。この方法では、液体培地中で微生物（好気性菌及び通性嫌気性菌）を培養するとともに、酸素電極を用いて電流値を測定する。そして、微生物が一定以上の濃度になると、その呼吸により溶存酸素が消費し尽くされて酸素電極で検出される電流値がほぼゼロになることから、検量線を用いて、電流値が任意の値になるまでの培養時間に基づいて増殖開始前の微生物数を推定することができる。
しかし、上記の従来の酸素電極法では、増殖開始前の微生物数を推定できても、その微生物の種類を判定することはできない。一方、特定の微生物のみ生育可能な液体培地を用いることも考えられるが、微生物によっては、そのような好ましい液体培地がない場合もある。また、公定法により微生物を検出する場合には、増菌、寒天培地による分離、栄養要求性により生化学的に同定という複雑なステップを経て検出を行うが、液体培地のみで同様に微生物の検出を行うことは不可能である。また、このような公定法による場合は、複雑なステップを経なくてはならないため、作業が煩雑であり、迅速に測定を行うことができない。 However, with the conventional oxygen electrode method described above, even if the number of microorganisms before the start of growth can be estimated, the type of the microorganism cannot be determined. On the other hand, it is conceivable to use a liquid medium capable of growing only a specific microorganism, but there are cases where such a preferable liquid medium is not available depending on the microorganism. In addition, when detecting microorganisms by the official method, detection is performed through complicated steps of enrichment, separation on an agar medium, and biochemical identification due to auxotrophy, but detection of microorganisms is similarly performed using only a liquid medium. It is impossible to do. In addition, in the case of such an official method, since complicated steps must be performed, the work is complicated and measurement cannot be performed quickly.
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的は、より簡易かつ迅速に特定の微生物を検出するための微生物検出方法及び微生物検出装置を提供することにある。 The present invention has been made to solve the above-described problems, and an object thereof is to provide a microorganism detection method and a microorganism detection apparatus for detecting a specific microorganism more simply and quickly.
本発明の微生物検出方法は、特定の微生物を培養可能な液体培地で微生物群濃度が所定値に達するまで培養を行う第１工程と、触媒で標識した免疫測定試薬を用いて、前記液体培地に含まれる特定の微生物に対して特定の免疫反応を生じせしめる第２工程と、前記特定の微生物を前記免疫反応に基づいて分離して前記触媒と反応する基質を含む溶液中に加え、前記触媒と前記基質による反応に基づいて変化する特定物質の溶存量を電極により測定することにより、前記特定の微生物を検出する第３工程とを含む。これによれば、微生物群濃度が所定値に達した場合に、電極を用いて、免疫測定試薬に標識された触媒と基質との反応に基づいて特定の微生物を検出することにより、特定の微生物の検出を、より簡易かつ迅速に行うことができる。 The microorganism detection method of the present invention comprises a first step of culturing in a liquid medium capable of culturing a specific microorganism until the microorganism group concentration reaches a predetermined value, and an immunoassay reagent labeled with a catalyst. A second step of causing a specific immune reaction against a specific microorganism contained therein, and adding the catalyst to a solution containing a substrate that separates the specific microorganism based on the immune reaction and reacts with the catalyst; And a third step of detecting the specific microorganism by measuring the dissolved amount of the specific substance that changes based on the reaction by the substrate with an electrode. According to this, when the microorganism group concentration reaches a predetermined value, the specific microorganism is detected by detecting the specific microorganism based on the reaction between the catalyst labeled with the immunoassay reagent and the substrate using the electrode. Can be detected more easily and quickly.
この微生物検出方法において、前記第１工程において、前記液体培地での微生物群濃度は、微生物の代謝に基づいて変化する前記特定物質の溶存量を電極により測定することにより求め、前記第１工程の電極による測定方法と同じ方法で前記第３工程の測定を実行するものとすることができる。これによれば、第１工程における微生物群濃度の測定と、第
３工程における特定の微生物の検出とを同じ方法を用いて行うことができる。
In this microorganism detection method, in the first step, the microorganism group concentration in the liquid medium is obtained by measuring the dissolved amount of the specific substance that changes based on the metabolism of the microorganism with an electrode. The measurement in the third step can be performed by the same method as the measurement method using electrodes. According to this, the measurement of the microorganism group density | concentration in a 1st process and the detection of the specific microorganisms in a 3rd process can be performed using the same method.
この微生物検出方法において、前記特定物質の溶存量を溶存酸素量とし、前記触媒を酸化還元触媒とすることができる。
この微生物検出方法において、前記免疫測定試薬を、特定の微生物と反応する抗体であって前記触媒で標識したものと前記特定の微生物を捕捉可能な捕捉体とを含むものとすることができる。これによれば、触媒で標識された抗体と捕捉体とを特定の微生物に結合させることができる。このため、捕捉体を用いて、触媒で標識された抗体が結合した特定の微生物を分離できる。そして、分離された微生物に結合した抗体に標識された触媒と基質による反応に基づいて、特定の微生物を検出できる。
この微生物検出方法において、前記免疫測定試薬を、特定の微生物を構成する抗原であって触媒により標識されたものと前記抗原と結合可能な捕捉体とを含むものとすることができる。これによれば、特定の微生物の抗原と免疫測定試薬中の抗原とが、競合的に捕捉体に結合する。つまり、特定の微生物と触媒により標識された抗原とが、競合的に捕捉体に結合する。従って、これらが結合した捕捉体を、基質を含む溶液に投入することにより、特定の微生物の検出を行うことができる。
In this microorganism detection method, the dissolved amount of the specific substance can be the dissolved oxygen amount, and the catalyst can be a redox catalyst.
In this microorganism detection method, the immunoassay reagent may include an antibody that reacts with a specific microorganism and labeled with the catalyst, and a capturing body capable of capturing the specific microorganism. According to this, the antibody labeled with the catalyst and the capturing body can be bound to a specific microorganism. For this reason, a specific microorganism to which an antibody labeled with a catalyst is bound can be separated using a capturing body. And a specific microorganism can be detected based on the reaction by the catalyst and substrate which were labeled with the antibody couple | bonded with the isolate | separated microorganism.
In this microorganism detection method, the immunoassay reagent may include an antigen constituting a specific microorganism and labeled with a catalyst, and a capturing body capable of binding to the antigen. According to this, the antigen of a specific microorganism and the antigen in the immunoassay reagent are competitively bound to the capturing body. That is, a specific microorganism and an antigen labeled with a catalyst bind to the capturing body competitively. Therefore, specific microorganisms can be detected by putting the capture bodies to which these are bound into a solution containing a substrate.
本発明の微生物検出装置は、電極を用いて特定物質の溶存量を測定する測定手段を備えた微生物検出装置であって、前記測定手段が、特定の微生物を培養可能な液体培地で、微生物の代謝に基づいて変化する前記特定物質の溶存量を電極により測定することにより、微生物群濃度を測定する微生物群濃度測定手段と、触媒で標識した免疫測定試薬を用いて、前記液体培地に含まれる特定の微生物に対して生じせしめた特定の免疫反応に基づいて前記特定の微生物を分離して、前記触媒と反応する基質を含む溶液中に加え、前記触媒と前記基質による反応に基づいて変化する前記特定物質の溶存量を電極により測定することにより、前記特定の微生物を検出する特定微生物検出手段として機能する。これによれば、電極を用いて特定物質の溶存量を測定する測定手段を用いて、微生物の代謝に基づく微生物の濃度の測定と、特定の微生物の検出のための免疫測定試薬に標識された触媒による反応に基づく特定の微生物の検出とを行うことができる。 The microorganism detecting apparatus of the present invention is a microorganism detecting apparatus provided with a measuring means for measuring the dissolved amount of a specific substance using an electrode, wherein the measuring means is a liquid medium capable of culturing a specific microorganism, Included in the liquid medium using a microorganism group concentration measuring means for measuring the microorganism group concentration by measuring the dissolved amount of the specific substance that changes based on metabolism with an electrode and an immunoassay reagent labeled with a catalyst. The specific microorganism is separated based on a specific immune reaction generated against the specific microorganism, added to a solution containing a substrate that reacts with the catalyst, and changes based on the reaction between the catalyst and the substrate. By measuring the dissolved amount of the specific substance with an electrode, it functions as a specific microorganism detection means for detecting the specific microorganism. According to this, using a measuring means that measures the dissolved amount of a specific substance using an electrode, it is labeled with an immunoassay reagent for measuring the concentration of the microorganism based on the metabolism of the microorganism and detecting the specific microorganism. Detection of a specific microorganism based on a reaction by a catalyst can be performed.
この微生物検出装置において、前記特定物質の溶存量を溶存酸素量とし、前記触媒を酸化還元触媒とすることができる。 In this microorganism detection apparatus, the dissolved amount of the specific substance can be the dissolved oxygen amount, and the catalyst can be a redox catalyst.
本発明によれば、より簡易かつ迅速に特定の微生物を検出することができる。 According to the present invention, a specific microorganism can be detected more easily and quickly.
以下、本発明を具体化した実施形態について説明する。
本発明における微生物検出方法では、まず、特定の微生物を培養可能な液体培地で微生物群濃度が所定値に達するまで培養する（第１工程）。そして、この液体培地に含まれる特定の微生物に対して、触媒で標識した免疫測定試薬を用いて、特定の免疫反応を生じせしめる（第２工程）。そして、この免疫反応に基づいて検出対象の特定の微生物を分離して、これを免疫測定試薬に標識された触媒と反応する基質を含む溶液と反応させ、この触媒と基質による反応に基づく特定物質の溶存量を電極により測定することにより、特定の微生物を検出する（第３工程）。
Hereinafter, embodiments embodying the present invention will be described.
In the microorganism detection method of the present invention, first, a specific microorganism is cultured in a liquid medium capable of being cultured until the microorganism group concentration reaches a predetermined value (first step). Then, a specific immune reaction is caused to occur on a specific microorganism contained in the liquid medium using an immunoassay reagent labeled with a catalyst (second step). Then, a specific microorganism to be detected is separated based on this immune reaction, and this is reacted with a solution containing a substrate that reacts with a catalyst labeled with an immunoassay reagent, and a specific substance based on the reaction between this catalyst and the substrate. A specific microorganism is detected by measuring the dissolved amount of the solution with an electrode (third step).
第１工程における微生物群濃度の測定は特に限定されないが、例えば、後述する第３工程における特定物質の溶存量の測定と同じ方法により、微生物の代謝による液体培地中の特定物質の溶存量を電極により測定することにより行うことができる。この場合、第１工程における測定と第３工程における測定とを、同様の電極を用いる測定手段により行うことができる。つまり、同様の電極を用いる測定手段が、第１工程における測定を行う場合
は特許請求の範囲に記載の微生物群濃度測定手段として機能し、第３工程における測定を行う場合は特許請求の範囲に記載の特定微生物検出手段として機能する。
The measurement of the concentration of the microorganism group in the first step is not particularly limited. For example, the dissolved amount of the specific substance in the liquid medium due to the metabolism of the microorganism can be determined by the same method as the measurement of the dissolved amount of the specific substance in the third step described later. It can be performed by measuring. In this case, the measurement in the first step and the measurement in the third step can be performed by a measuring means using the same electrode. That is, when the measurement means using the same electrode performs the measurement in the first step, it functions as the microorganism group concentration measurement means described in the claims, and in the case of performing the measurement in the third step, the claims. It functions as the specific microorganism detection means described.
本発明の微生物検出装置は、電極を用いて特定物質の溶存量を測定する測定手段を備え、この測定手段が、上記のように、微生物群濃度測定手段及び特定微生物検出手段として機能する。 The microorganism detection apparatus of the present invention includes measurement means for measuring the dissolved amount of a specific substance using an electrode, and the measurement means functions as a microorganism group concentration measurement means and a specific microorganism detection means as described above.
電極を用いて溶存量を測定する特定物質としては、酸素、二酸化炭素、水素イオン等が挙げられる。なお、水素イオンの溶存量については、ｐＨとして測定してもよい。いずれの場合も、第１工程においては、微生物の代謝によって変化する溶存量を測定し、第３工程においては、免疫測定試薬に標識された触媒と基質との反応に基づいて変化する溶存量を測定する。以下、測定する特定物質の溶存量を溶存酸素量とする場合について説明するが、本発明はこれに限られるものではない。 Specific substances for measuring the dissolved amount using an electrode include oxygen, carbon dioxide, hydrogen ions, and the like. The dissolved amount of hydrogen ions may be measured as pH. In either case, in the first step, the dissolved amount that changes due to the metabolism of microorganisms is measured, and in the third step, the dissolved amount that changes based on the reaction between the catalyst labeled on the immunoassay reagent and the substrate is determined. taking measurement. Hereinafter, although the case where the dissolved amount of the specific substance to be measured is the dissolved oxygen amount will be described, the present invention is not limited to this.
まず、上記の測定手段において用いられる電極について図１を用いて説明する。
図１は、本発明の微生物検出装置の原理を示す概略図である。図１に示すように、微生物検出装置は、溶液を収容するセル中に、作用極（作用電極）１１と参照極（参照電極）１２と対極（対電極）１３から構成される酸素電極を備えている。溶液中で作用極１１において、Ｏ2＋４Ｈ+→２Ｈ2Ｏの反応が生じて４ｅ-の電子の授受が行われ、これに対応する電流が流れる。この反応は、溶存酸素濃度に依存するため、流れる電流量も溶存酸素濃度に依存する。従って、電流値の測定により、後述するように、第１工程では液体培地中の溶存酸素量に基づいて微生物群濃度を測定でき、第３工程では基質を含む溶液中の溶存酸素量に基づいて特定の微生物を検出できる。
First, the electrodes used in the measurement means will be described with reference to FIG.
FIG. 1 is a schematic view showing the principle of the microorganism detection apparatus of the present invention. As shown in FIG. 1, the microorganism detection apparatus includes an oxygen electrode including a working electrode (working electrode) 11, a reference electrode (reference electrode) 12, and a counter electrode (counter electrode) 13 in a cell that stores the solution. ing. In the working
溶存酸素量の測定により特定の微生物を検出する場合、免疫測定試薬を標識する触媒として酸化還元触媒を用いる。酸化還元触媒としては、酸化還元酵素及び金属触媒が挙げられる。酸化還元酵素が特に好ましく、例えば、グルコースオキシダーゼ＜グルコース＞、アミノ酸オキシダーゼ＜アミノ酸＞、アスコルビン酸オキシダーゼ＜アスコルビン酸＞、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ＜アシルＣｏＡ＞、ガラクトースオキシダーゼ＜ガラクトース＞、キサンチンオキシダーゼ＜キサチン＞、コレステロールオキシダーゼ＜コレステロール＞、シュウ酸オキシダーゼ＜シュウ酸＞、ザルコシンオキシダーゼ＜ザルコシン＞等が挙げられる。なお、ここでは、各酸化還元酵素とその基質とを「酸化還元酵素＜基質＞」のように示している。また、金属触媒としては、白金、金、酸化チタン等が挙げられる。 When a specific microorganism is detected by measuring the amount of dissolved oxygen, a redox catalyst is used as a catalyst for labeling the immunoassay reagent. Examples of the redox catalyst include redox enzymes and metal catalysts. An oxidoreductase is particularly preferable, for example, glucose oxidase <glucose>, amino acid oxidase <amino acid>, ascorbate oxidase <ascorbic acid>, acyl-CoA oxidase <acyl CoA>, galactose oxidase <galactose>, xanthine oxidase <xatin>, Examples include cholesterol oxidase <cholesterol>, oxalate oxidase <oxalate>, sarcosine oxidase <sarcosine>, and the like. Here, each oxidoreductase and its substrate are shown as “oxidoreductase <substrate>”. Moreover, platinum, gold | metal | money, titanium oxide etc. are mentioned as a metal catalyst.
免疫測定試薬は、特定の微生物の検出をサンドイッチ法により行う場合と競合法により行う場合とで異なる。サンドイッチ法による場合、免疫測定試薬として、検出対象の微生物の表面の抗原と結合しうる標識抗体を構成成分に含む試薬を用い、検出対象の微生物に、この標識抗体と、この検出対象の微生物を捕捉する捕捉体とを結合させる。一方、競合法による場合、免疫測定試薬として、検出対象の微生物を構成する抗原であって触媒により標識されたもの（標識抗原）を構成成分に含む試薬を用い、検出対象の微生物を捕捉可能な捕捉体に、検出対象の微生物と標識抗原とを競合的に結合させる。 The immunoassay reagent differs depending on whether a specific microorganism is detected by the sandwich method or the competitive method. In the case of the sandwich method, a reagent containing a labeled antibody that can bind to an antigen on the surface of the microorganism to be detected as an immunoassay reagent is used as a component, and the labeled antibody and the microorganism to be detected are used as the microorganism to be detected. The capturing body to be captured is combined. On the other hand, in the case of the competitive method, the detection target microorganism can be captured by using a reagent that contains an antigen constituting the detection target microorganism labeled with a catalyst (labeled antigen) as a component as an immunoassay reagent. The microorganism to be detected and the labeled antigen are competitively bound to the capturing body.
サンドイッチ法による場合と競合法による場合とでは、第２工程における反応や第３工程における反応及び電流値の測定結果が異なる。ここでは、サンドイッチ法による場合について説明し、競合法による場合については、他の実施形態として後述する。 In the case of the sandwich method and the case of the competitive method, the reaction in the second step, the reaction in the third step, and the measurement result of the current value are different. Here, the case of the sandwich method will be described, and the case of the competition method will be described later as another embodiment.
次に、各工程について、処理手順、反応、測定結果等について説明する。なお、ここでは、酸素電極の作用極１１、参照極１２及び対極１３の各端子を備えたセル（容量：２．０ｍｌ）を備えた、温度制御可能な微生物検出装置を用いる。
Next, processing steps, reactions, measurement results, etc. will be described for each step. Here, a temperature-controllable microorganism detecting device including a cell (capacity: 2.0 ml) having terminals of the working
＜第１工程＞
まず、第１工程として、特定の微生物を培養可能な液体培地で微生物群濃度が所定値に達するまで、３５℃で培養する。この特定の微生物を培養可能な液体培地とは、一般生菌用液体培地、もしくは特定の微生物を含む広い範囲の菌種類を培養可能な液体培地、もしくは特定の微生物を培養可能な液体培地である。このような液体培地としては、公知のものを用いることができる。そして、この液体培地に、測定対象物の抽出液を懸濁して調整する。測定対象物としては、肉、野菜、海産物、総菜、乳製品等の食材、医薬品、化学製品等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
<First step>
First, as a 1st process, it culture | cultivates at 35 degreeC until the microorganism group density | concentration reaches a predetermined value with the liquid culture medium which can culture a specific microorganism. The liquid medium capable of culturing this specific microorganism is a liquid medium for general living bacteria, a liquid medium capable of culturing a wide range of bacterial species including a specific microorganism, or a liquid medium capable of culturing a specific microorganism. . As such a liquid medium, a known medium can be used. And the extract of a measuring object is suspended and adjusted in this liquid culture medium. Examples of the measurement object include, but are not limited to, foods such as meat, vegetables, marine products, prepared dishes, and dairy products, pharmaceuticals, and chemical products.
微生物のうち好気性菌や通性嫌気性菌は呼吸により酸素を消費するが、液体培地中で培養した微生物の濃度が一定以上になると、液体培地中の溶存酸素の消費が加速し、溶存酸素が消費し尽くされる。このため、酸素電極で検出される電流値がほぼゼロになる。つまり、セルに収容された液体培地の溶存酸素が消費し尽くされると、図１に示した作用極１１上の反応が起こらなくなるため、電流が流れなくなる。これを、図２を用いて説明する。
Among the microorganisms, aerobic bacteria and facultative anaerobes consume oxygen by respiration, but when the concentration of microorganisms cultured in the liquid medium exceeds a certain level, the consumption of dissolved oxygen in the liquid medium accelerates and dissolved oxygen Is consumed. For this reason, the current value detected by the oxygen electrode becomes almost zero. That is, when the dissolved oxygen in the liquid medium contained in the cell is exhausted, the reaction on the working
図２は、異なる初期菌数でそれぞれ培養を行った場合について、酸素電極で測定された電流値の変化を示す。ここでは、初期菌数がそれぞれ１０5、１０4、１０3、１０2、１０1である場合と、微生物が存在しない場合とについて、酸素電極で測定された電流値の変
化をそれぞれ示す。液体培地中に微生物が存在しない場合、電流値は緩やかに減少する。一方、培養開始時に微生物が存在していた場合、電流値は培養開始からある時点までは緩やかに減少するが、ある時点を過ぎると急激に減少し、電流値がほぼゼロになる。これは、液体培地中の微生物がある程度まで増殖した場合に、呼吸により液体培地中の溶存酸素を使い切り、作用極における上記の反応が起こらなくなるため、急激に電流値が低下するものである。初期菌数が多いほど、より短い培養時間で液体培地中の微生物の濃度が一定以上になるため、ここでは、初期菌数が１０5の場合に、最も短い培養時間で電流値が急
激に減少している。そして、初期菌数が少なくなるに従って、電流値の急激な減少が起こるまでの培養時間が長くなっている。
FIG. 2 shows changes in the current value measured with the oxygen electrode when the culture was performed with different initial numbers of bacteria. Here, the change of the current value measured with the oxygen electrode is shown for each of the cases where the initial number of bacteria is 10 5 , 10 4 , 10 3 , 10 2 , 10 1 and the case where no microorganism is present. When microorganisms are not present in the liquid medium, the current value gradually decreases. On the other hand, when microorganisms are present at the start of culture, the current value gradually decreases from the start of culture until a certain point, but after a certain point, the current value decreases rapidly and the current value becomes almost zero. This is because when the microorganisms in the liquid medium grow to a certain extent, the dissolved oxygen in the liquid medium is used up by respiration, and the above reaction does not occur at the working electrode, so the current value decreases rapidly. As the initial number of bacteria increases, the concentration of microorganisms in the liquid medium becomes more than a certain level in a shorter culture time. Here, when the initial number of bacteria is 10 5 , the current value rapidly decreases in the shortest culture time. is doing. And the culture | cultivation time until the rapid reduction | decrease in an electric current value becomes long as the initial number of bacteria decreases.
ここで、微生物が溶存酸素を使い切って電流値がゼロに近づいた状態の所定の電流値をしきい値とした場合、このしきい値に達するまでの培養時間は初期菌数によって異なるが、このしきい値に達した状態における液体培地中の微生物群濃度はほぼ一定となる。従って、しきい値に達した状態での液体培地を用いれば、ほぼ一定の微生物群濃度の液体培地を用いることができる。このため、電流値がしきい値に達した場合、電流値の測定を終了し、次の第２工程に移る。 Here, when the predetermined current value in which the microorganism has used up dissolved oxygen and the current value has approached zero is used as a threshold, the incubation time until this threshold is reached differs depending on the initial number of bacteria. The microbial group concentration in the liquid medium in a state where the threshold is reached is substantially constant. Therefore, if a liquid medium in a state where the threshold value has been reached is used, a liquid medium having a substantially constant microbial group concentration can be used. For this reason, when the current value reaches the threshold value, the measurement of the current value is terminated, and the process proceeds to the next second step.
＜第２工程＞
電流値がしきい値に達した場合、電流値の測定を終了し、触媒で標識した免疫測定試薬を用いて、液体培地に含まれる特定の微生物に対して特定の免疫反応を生じせしめる。なお、この第２工程においては、後述するように、液体培地に含まれる特定の微生物を、この微生物の選択培地を用いて増菌培養する。以下、免疫測定試薬を標識する触媒として酸化還元酵素であるグルコースオキシダーゼを用いる場合について説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
<Second step>
When the current value reaches the threshold value, the measurement of the current value is terminated, and a specific immune reaction is caused to a specific microorganism contained in the liquid medium using an immunoassay reagent labeled with a catalyst. In the second step, as described later, a specific microorganism contained in the liquid medium is enriched and cultured using the selective medium for the microorganism. Hereinafter, although the case where glucose oxidase which is an oxidoreductase is used as a catalyst for labeling an immunoassay reagent will be described, the present invention is not limited to this.
サンドイッチ法による場合、免疫測定試薬として、検出対象の微生物の表面の抗原と結合しうる標識抗体とこの検出対象の微生物を捕捉可能な捕捉体とを構成成分に含む試薬を用いる。標識抗体は、触媒により標識されている。ここでは、グルコースオキシダーゼにより標識された標識抗体（グルコースオキシダーゼ標識抗体）を用いる。そして、検出対象の微生物に、この標識抗体と、この検出対象の微生物を捕捉する捕捉体とを結合させる
。捕捉体としては、例えば、検出対象の微生物の細胞表層の構成成分に結合可能なリガンドを固定化した磁気ビーズを用いる。具体的には、例えば、検出対象の微生物がサルモネラ等のグラム陰性菌である場合、ポリミキシンＢを固定化した磁気ビーズを用いる。なお、ポリミキシンＢは、グラム陰性菌の外膜の構成成分であるリポポリサッカライドと特異的に結合することが知られている。なお、ここでは、捕捉体としてリガンドを固定化した磁気ビーズを用いたが、捕捉体はこれに限られるものではなく、検出対象の微生物を捕捉可能であればよい。例えば、ウェルにリガンドを固定化したものを捕捉体として用いてもよい。
In the case of the sandwich method, as an immunoassay reagent, a reagent containing a labeled antibody capable of binding to an antigen on the surface of a microorganism to be detected and a capturing body capable of capturing the microorganism to be detected as constituent components is used. The labeled antibody is labeled with a catalyst. Here, a labeled antibody labeled with glucose oxidase (glucose oxidase labeled antibody) is used. Then, the labeled antibody and a capturing body that captures the detection target microorganism are bound to the detection target microorganism. As the capturing body, for example, a magnetic bead on which a ligand capable of binding to a constituent component of a cell surface layer of a microorganism to be detected is immobilized is used. Specifically, for example, when the microorganism to be detected is a Gram-negative bacterium such as Salmonella, magnetic beads on which polymyxin B is immobilized are used. Polymyxin B is known to specifically bind to lipopolysaccharide, which is a constituent of the outer membrane of Gram-negative bacteria. Here, the magnetic beads on which the ligand is immobilized are used as the capturing body. However, the capturing body is not limited to this, and it is sufficient that the microorganism to be detected can be captured. For example, a ligand in which a ligand is immobilized may be used as a capturing body.
ポリミキシンＢが固定化された磁気ビーズを用いて微生物の捕捉を行う場合は、ポリミキシンＢが固定化された磁気ビーズの添加に先立って増菌培養を行う。これは、ポリミキシンＢを用いて捕捉を行う場合、捕捉を行う際に熱処理が必要であるため、その時点で微生物が死んでしまい、その後増殖しないためである。この場合、ポリミキシンＢの添加より前に微生物を増殖させておく必要がある。捕捉の際に熱処理が必要かどうかはリガンドの種類による。捕捉の際に熱処理が不要なリガンドを用いる場合は、増菌培養と捕捉の順番を入れ替えてもよい。 When microorganisms are captured using magnetic beads on which polymyxin B is immobilized, enrichment culture is performed prior to the addition of magnetic beads on which polymyxin B is immobilized. This is because when capturing using polymyxin B, heat treatment is required when capturing, so that the microorganisms die at that point and do not grow thereafter. In this case, it is necessary to grow microorganisms prior to the addition of polymyxin B. Whether heat treatment is required for capture depends on the type of ligand. When using a ligand that does not require heat treatment during capture, the order of enrichment culture and capture may be switched.
捕捉体の添加前に増菌培養を行う場合、まず、液体培地が収容されたセルから、適量の液体培地を採取する。そして、検出対象である特定の微生物の選択培地を用いてこの特定の微生物の増菌培養を行い、この増菌培養を行った液体培地中に、標識抗体とリガンドを固定化した磁気ビーズとを含む免疫測定試薬を検出対象の微生物の増菌培養を行った液体培地に添加する。これにより、検出対象の微生物に、標識抗体とリガンドを固定化した磁気ビーズとが、それぞれ結合する。ここで、磁石を用いて磁気ビーズを分離すると、磁気ビーズに結合した、標識抗体と結合した検出対象の微生物が分離される。 When enrichment culture is performed before addition of the capturing body, first, an appropriate amount of the liquid medium is collected from the cell containing the liquid medium. Then, enrichment culture of the specific microorganism is performed using a selective culture medium of the specific microorganism to be detected, and the labeled antibody and the magnetic beads on which the ligand is immobilized are added to the liquid medium subjected to the enrichment culture. The immunoassay reagent is added to the liquid medium in which the microorganisms to be detected are enriched. As a result, the labeled antibody and the magnetic beads on which the ligand is immobilized bind to the detection target microorganism. Here, when magnetic beads are separated using a magnet, microorganisms to be detected that are bound to the magnetic beads and bound to the labeled antibody are separated.
なお、上記の場合は捕捉体の添加前に増菌培養を行ったが、捕捉の際に熱処理が必要でない場合は、上述のように、捕捉体の添加の前後のいずれで増菌培養を行ってもよい。捕捉体の添加後に増菌培養を行う場合、第２工程において、第１工程の液体培地を採取して、これに捕捉体（例えば、抗体を固定化した磁気ビーズ）を添加する。そして、この磁気ビーズにより捕捉された微生物を、検出対象の微生物の選択培地に添加する。そして、この選択培地において増菌培養を行うと、検出対象の微生物が増殖し、増殖した微生物が磁気ビーズに捕捉される。 In the above case, the enrichment culture was performed before the addition of the capturing body. However, if the heat treatment is not required at the time of capturing, the enrichment culture was performed before or after the addition of the capturing body as described above. May be. When enrichment culture is performed after the addition of the capturing body, in the second step, the liquid medium of the first step is collected, and the capturing body (for example, magnetic beads with immobilized antibodies) is added thereto. Then, the microorganism captured by the magnetic beads is added to the selective medium of the microorganism to be detected. When enrichment culture is performed in this selective medium, the microorganisms to be detected grow and the grown microorganisms are captured by the magnetic beads.
この微生物を捕捉した磁気ビーズを洗浄し、洗浄後の微生物を捕捉した磁気ビーズの溶液に標識抗体（例えば、グルコースオキシダーゼ標識抗体）を添加する。これにより、磁気ビーズに捕捉された微生物に標識抗体が結合する。そして、この磁気ビーズを分離すると、この標識抗体が結合した微生物が分離される。 The magnetic beads that have captured the microorganisms are washed, and a labeled antibody (for example, glucose oxidase-labeled antibody) is added to the magnetic bead solution that has captured the washed microorganisms. Thereby, the labeled antibody binds to the microorganism captured by the magnetic beads. When the magnetic beads are separated, the microorganisms to which the labeled antibody is bound are separated.
＜第３工程＞
次に、分離された捕捉体を、基質を含む溶液に投入する。そして、捕捉体に捕捉された微生物に結合した抗体に標識された触媒と、この触媒と基質による反応に基づく特定物質の溶存量を電極により測定することにより、特定の微生物を検出する。
<Third step>
Next, the separated capturing body is put into a solution containing a substrate. Then, a specific microorganism is detected by measuring, using an electrode, a catalyst labeled with an antibody bound to the microorganism captured by the capturing body, and a dissolved amount of the specific substance based on the reaction between the catalyst and the substrate.
例えば、上記の例の場合、グルコースオキシダーゼにより標識された抗体が結合した検出対象の微生物を磁気ビーズにより捕捉し、この磁気ビーズを液体培地から分離して、セルに収容されたグルコースを含む溶液に投入する。そして、この場合の電流値を、酸素電極を用いて測定する。この場合の測定結果について図３を用いて説明する。なお、図３では、セルに投入した磁気ビーズのうち、グルコースオキシダーゼ標識抗体と結合した微生物を捕捉した磁気ビーズの量が異なる２つの場合について示している。 For example, in the case of the above example, a microorganism to be detected to which an antibody labeled with glucose oxidase is bound is captured by a magnetic bead, and the magnetic bead is separated from a liquid medium to form a solution containing glucose contained in a cell. throw into. And the electric current value in this case is measured using an oxygen electrode. The measurement result in this case will be described with reference to FIG. FIG. 3 shows two cases in which the amount of magnetic beads that have captured microorganisms bound to the glucose oxidase-labeled antibody are different among the magnetic beads put into the cell.
図３に示すように、この磁気ビーズを投入するまでは電流値は緩やかに減少しているが、磁気ビーズを投入すると、急激に電流値が減少する。これは、グルコースオキシダーゼが触媒して化１に示す反応が生じ、グルコースが酸化され、酸素が消費されるためである。 As shown in FIG. 3, the current value gradually decreases until the magnetic beads are introduced, but when the magnetic beads are introduced, the current value rapidly decreases. This is because glucose oxidase catalyzes the reaction shown in Chemical Formula 1 to oxidize glucose and consume oxygen.
セルに投入した磁気ビーズのうち、グルコースオキシダーゼ標識抗体と結合した微生物を捕捉した磁気ビーズがより多くなるのは、上記の第１工程で所定の濃度まで微生物を培養した際に、液体培地中に測定対象の微生物が多く含まれていた場合である。従って、上記の処理を行った磁気ビーズをグルコースが含まれる溶液中に投入した場合に電流値が急激に下がることにより、測定対象の微生物を検出できる。また、この場合の電流値の変化の度合いにより、セル中の測定対象の微生物の数を推定することが可能となり、さらに、この微生物数と培養時間とに基づいて、第１工程における培養開始時点での測定対象の微生物の数を推定することが可能となる。 Among the magnetic beads put into the cell, the number of magnetic beads that capture microorganisms bound to glucose oxidase-labeled antibody is increased when the microorganisms are cultured to a predetermined concentration in the first step. This is a case where many microorganisms to be measured are contained. Therefore, when the magnetic beads subjected to the above treatment are put into a solution containing glucose, the current value rapidly decreases, so that the microorganism to be measured can be detected. In addition, the number of microorganisms to be measured in the cell can be estimated from the degree of change in the current value in this case, and further, based on the number of microorganisms and the culture time, the culture start time in the first step Thus, it is possible to estimate the number of microorganisms to be measured.
なお、Ｈ2Ｏ2の発生による反応性の低下は、例えば、ｏ-フェニレンジアミン（ＯＰＤ
）とペルオキシダーゼを共存させることにより、ペルオキシダーゼにより触媒されるＨ2
Ｏ2とＯＰＤとの反応によりＨ2Ｏ2を除去することで防止できる。この場合、ＯＰＤが発
色するため、吸光度の測定によっても、グルコースオキシダーゼにより触媒される反応によりＨ2Ｏ2が発生したことを確認できる。
Note that the decrease in reactivity due to the generation of H 2 O 2 is, for example, o-phenylenediamine (OPD).
) And peroxidase in the presence of H 2 catalyzed by peroxidase
This can be prevented by removing H 2 O 2 by the reaction of O 2 and OPD. In this case, since OPD develops color, it can be confirmed that H 2 O 2 is generated by the reaction catalyzed by glucose oxidase even by measuring the absorbance.
（他の実施形態）
上記の実施形態では、特定の微生物の検出をサンドイッチ法により行う場合について説明したが、特定の微生物の検出は競合法により行ってもよい。ここでは、他の実施形態として、特定の微生物の検出を競合法により行う場合について説明する。この場合、第２工程における反応や第３工程における反応及び電流値の測定結果が上記の実施形態の場合と異なるため、ここでは、第２工程及び第３工程について説明する。
(Other embodiments)
In the above embodiment, the case where the specific microorganism is detected by the sandwich method has been described. However, the specific microorganism may be detected by the competitive method. Here, as another embodiment, a case where a specific microorganism is detected by a competition method will be described. In this case, since the reaction in the second step, the reaction in the third step, and the measurement result of the current value are different from those in the above embodiment, the second step and the third step will be described here.
＜第２工程＞
競合法による場合、免疫測定試薬として、検出対象の微生物を構成する抗原であって触媒により標識されたもの（標識抗原）とこの抗原と結合可能であって検出対象の微生物を捕捉可能な捕捉体とを構成成分に含む試薬を用いる。ここで、標識抗原は、この微生物に含まれる抗原が触媒により標識されている。ここでは、グルコースオキシダーゼにより標識された標識抗原（グルコースオキシダーゼ標識抗原）を用いる。また、検出対象の微生物を捕捉可能な捕捉体として、この抗原と結合可能なリガンドを固定化した磁気ビーズを用いる。
<Second step>
In the case of the competitive method, as immunoassay reagents, antigens constituting microorganisms to be detected that are labeled with a catalyst (labeled antigens) and capture bodies that can bind to the antigens and capture the microorganisms to be detected Are used as constituents. Here, in the labeled antigen, the antigen contained in the microorganism is labeled with a catalyst. Here, a labeled antigen labeled with glucose oxidase (glucose oxidase-labeled antigen) is used. Further, magnetic beads on which a ligand capable of binding to the antigen is immobilized are used as a capturing body capable of capturing the microorganism to be detected.
この第２工程では、まず、採取された液体培地に対し、検出対象である特定の微生物の選択培地を用いて、検出対象である特定の微生物の増菌培養を行う。そして、増菌培養を行った選択培地に標識抗原及び捕捉体を含む免疫測定試薬を添加する。 In the second step, first, enrichment culture of a specific microorganism to be detected is performed on the collected liquid medium using a selective medium for the specific microorganism to be detected. Then, an immunoassay reagent containing a labeled antigen and a capturing body is added to the selective medium subjected to enrichment culture.
この場合、培養された検出対象の微生物と、免疫測定試薬に含まれる標識抗原とは、競
合的に捕捉体に結合する。そして、捕捉体を分離すると、捕捉体とともに、捕捉された微生物等（検出対象の微生物又は標識抗原）が分離される。ここでは、培養された検出対象の微生物とグルコースオキシダーゼ標識抗原とが競合的にリガンドを固定化した磁気ビーズに結合し、捕捉された微生物等（液体培地で培養された検出対象の微生物又はグルコースオキシダーゼ標識抗原）が分離される。
In this case, the cultured microorganism to be detected and the labeled antigen contained in the immunoassay reagent competitively bind to the capturing body. When the capturing body is separated, the captured microorganisms (the detection target microorganism or the labeled antigen) are separated together with the capturing body. Here, the cultured microorganism to be detected and the glucose oxidase-labeled antigen are competitively bound to the magnetic beads having the ligand immobilized thereon, and the captured microorganism or the like (the detected microorganism or glucose oxidase cultured in the liquid medium) Labeled antigen) is separated.
＜第３工程＞
次に、分離された捕捉体を、基質を含む溶液に投入し、電極を用いて電流値を測定する。上記の例では、培養された検出対象の微生物又はグルコースオキシダーゼ標識抗原を捕捉した磁気ビーズを、グルコースを含む溶液に投入し、酸素電極を用いて電流値を測定する。
<Third step>
Next, the separated capturing body is put into a solution containing a substrate, and a current value is measured using an electrode. In the above example, the magnetic beads capturing the cultured microorganism to be detected or the glucose oxidase-labeled antigen are put into a solution containing glucose, and the current value is measured using an oxygen electrode.
この場合、この磁気ビーズを投入するまでは緩やかに減少しているが、磁気ビーズを投入すると、この磁気ビーズにグルコースオキシダーゼ標識抗原が捕捉されている場合、グルコースオキシダーゼが触媒して、上記の化１に示す反応が生じる。このため、グルコースが酸化され、酸素が消費されることにより、電流値が急激に減少する。また、セルに投入した磁気ビーズのうち、グルコースオキシダーゼ標識抗原を捕捉した磁気ビーズがより多い場合、電流値の減少がより大きくなる。つまり、競合法による場合は、培養された液体培地中に検出対象の微生物が多く存在していた場合は、電流値の減少が小さく、反対に液体培地中に検出対象の微生物が存在していなかった場合は、電流値の減少が大きくなる。 In this case, it gradually decreases until the magnetic beads are added, but when the magnetic beads are added, when the glucose oxidase-labeled antigen is captured by the magnetic beads, glucose oxidase catalyzes the above-mentioned chemical reaction. The reaction shown in 1 occurs. For this reason, glucose is oxidized and oxygen is consumed, whereby the current value decreases rapidly. In addition, when there are more magnetic beads that have captured the glucose oxidase-labeled antigen among the magnetic beads put into the cell, the current value decreases more greatly. In other words, in the case of the competitive method, if there are many microorganisms to be detected in the cultured liquid medium, the decrease in the current value is small, and conversely, there are no microorganisms to be detected in the liquid medium. In such a case, the current value decreases greatly.
従って、ビーズをセルに投入した場合の電流値の減少の度合いにより、測定対象の微生物を検出できる。また、この場合の電流値の変化の度合いにより、セル中の測定対象の微生物の数を推定することが可能となり、さらに、この微生物数と培養時間とに基づいて、第１工程における培養開始時点での測定対象の微生物の数を推定することが可能となる。なお、Ｈ2Ｏ2による反応性の低下は、上記の場合と同様の方法で防止できる。 Therefore, the microorganism to be measured can be detected based on the degree of decrease in the current value when beads are introduced into the cell. In addition, the number of microorganisms to be measured in the cell can be estimated from the degree of change in the current value in this case, and further, based on the number of microorganisms and the culture time, the culture start time in the first step Thus, it is possible to estimate the number of microorganisms to be measured. Incidentally, lowering of reactivity due to H 2 O 2 can be prevented in the same manner as the above case.
上記実施形態によれば、以下に示す効果を得ることができる。
・ 上記実施形態では、特定の微生物を培養可能な液体培地で微生物群濃度が所定値に達するまで培養を行う。そして、触媒で標識した免疫測定試薬を用いて、この液体培地に含まれる特定の微生物に対して特定の免疫反応を生じせしめる。そして、この免疫反応に基づいて分離した特定の微生物を、標識された触媒と反応する基質を含む溶液中に加え、この触媒と基質による反応に基づいて変化する特定物質の溶存量を電極により測定することにより、特定の微生物を検出する。これにより、微生物群濃度が所定値に達した場合に、免疫測定試薬に標識された触媒と基質との反応に基づいて、特定の微生物を、電極を用いて検出することができる。従って、公定法のような煩雑なステップを経ずに、より簡易かつ迅速に特定の微生物を検出できる。また、微生物群濃度が所定値に達した場合は、検出対象の微生物が存在する可能性が高いため、微生物群濃度が高いものだけを調べることは有効であり、これにより、効率よく特定の微生物の検出を行うことができる。
According to the above embodiment, the following effects can be obtained.
In the above embodiment, culturing is performed in a liquid medium in which a specific microorganism can be cultured until the microorganism group concentration reaches a predetermined value. Then, a specific immune reaction is caused to a specific microorganism contained in the liquid medium using an immunoassay reagent labeled with a catalyst. Then, a specific microorganism separated based on this immune reaction is added to a solution containing a substrate that reacts with the labeled catalyst, and the dissolved amount of the specific substance that changes based on the reaction between the catalyst and the substrate is measured with an electrode. By doing so, a specific microorganism is detected. Thereby, when the microorganism group concentration reaches a predetermined value, a specific microorganism can be detected using the electrode based on the reaction between the catalyst labeled with the immunoassay reagent and the substrate. Therefore, it is possible to detect a specific microorganism more easily and quickly without going through complicated steps as in the official method. When the microorganism group concentration reaches a predetermined value, there is a high possibility that microorganisms to be detected are present. Therefore, it is effective to examine only those having a high microorganism group concentration. Can be detected.
・ 上記実施形態では、第１工程において培養された微生物の濃度は、微生物の代謝に基づいて変化する前記特定物質の溶存量を電極により測定することにより求め、この方法と同じ方法で、第３工程において測定を実行することができる。これにより、第１工程における微生物群濃度の測定と、第３工程における特定の微生物の検出とを同じ方法を用いて行うことができる。このため、同様の電極を用いて、第１工程の測定と、第３工程の測定とを行うことができ、同じ装置を用いて、微生物の代謝に基づく微生物の濃度の測定と、特定の微生物の検出のための免疫測定試薬に標識された触媒による反応に基づく特定の微生物の検出とを行うことができる。従って、微生物の代謝により変化する特定物質の溶存量を測定するための電極を有する一般生菌測定用の装置を用いて微生物の種類を特定で
きる。このため、より簡易かつ迅速に特定の微生物を検出できる。
In the above embodiment, the concentration of the microorganism cultured in the first step is obtained by measuring the dissolved amount of the specific substance that changes based on the metabolism of the microorganism with an electrode. Measurements can be performed in the process. Thereby, the measurement of the microorganism group density | concentration in a 1st process and the detection of the specific microorganisms in a 3rd process can be performed using the same method. For this reason, the measurement of a 1st process and the measurement of a 3rd process can be performed using the same electrode, the measurement of the density | concentration of microorganisms based on the metabolism of microorganisms, and a specific microorganism using the same apparatus. It is possible to detect a specific microorganism based on a reaction with a catalyst labeled with an immunoassay reagent for detection. Therefore, the type of microorganism can be specified using an apparatus for measuring general living bacteria having an electrode for measuring the dissolved amount of a specific substance that changes due to metabolism of the microorganism. For this reason, a specific microorganism can be detected more easily and quickly.
・ 上記実施形態では、例えば、酸素電極を用いて溶存酸素量を測定する。この場合、第３工程において、免疫反応に基づいて分離した特定の微生物を、標識された酸化還元触媒と反応する基質を含む溶液中に加え、この酸化還元触媒と基質による反応に基づいて変化する溶存酸素量を酸素電極により測定することにより、特定の微生物を検出する。これにより、第１工程では、酸素電極を用いて、微生物の呼吸による溶存酸素量の減少に基づいて微生物群濃度が所定値に達したことを検知し、第３工程では、同様の酸素電極を用いて、酸化還元触媒と基質による反応に基づいて変化する溶存酸素量に基づいて測定対象の特定の微生物を検出する。従って、第１工程における微生物群濃度の測定と、第３工程における特定の微生物の検出とを、同様の酸素電極を用いて、同じ方法により行うことができる。このため、微生物の代謝により変化する溶存酸素量を測定するための酸素電極を有する一般生菌測定用の装置を用いて微生物の種類を特定できる。このため、より簡易かつ迅速に特定の微生物を検出できる。 In the above embodiment, for example, the amount of dissolved oxygen is measured using an oxygen electrode. In this case, in the third step, a specific microorganism separated based on the immune reaction is added to a solution containing a substrate that reacts with the labeled redox catalyst, and changes based on the reaction by the redox catalyst and the substrate. A specific microorganism is detected by measuring the amount of dissolved oxygen with an oxygen electrode. Thus, in the first step, an oxygen electrode is used to detect that the microbial group concentration has reached a predetermined value based on a decrease in the amount of dissolved oxygen due to respiration of microorganisms, and in the third step, a similar oxygen electrode is used. Used to detect a specific microorganism to be measured based on the amount of dissolved oxygen that changes based on the reaction between the redox catalyst and the substrate. Therefore, the measurement of the microbial group concentration in the first step and the detection of a specific microorganism in the third step can be performed by the same method using the same oxygen electrode. For this reason, the kind of microorganisms can be specified using the apparatus for general living microbe measurement which has an oxygen electrode for measuring the amount of dissolved oxygen which changes with metabolism of microorganisms. For this reason, a specific microorganism can be detected more easily and quickly.
・ 上記実施形態では、検出対象の微生物の表面の抗原と結合しうる抗体であって触媒により標識されたもの（標識抗体）とこの検出対象の微生物を捕捉可能な捕捉体とを構成成分に含む免疫測定試薬を用いる。このため、液体培地中に検出対象の微生物が存在する場合、この微生物を捕捉する捕捉体を用いて標識抗体が結合した検出対象の微生物を分離して基質を含む溶液に投入し、電流値が急激に低下することにより、対象の微生物を検出できる。 In the above embodiment, an antibody that can bind to an antigen on the surface of a microorganism to be detected and labeled with a catalyst (labeled antibody) and a capturing body that can capture the microorganism to be detected are included as constituent components. Use immunoassay reagents. For this reason, when a microorganism to be detected is present in the liquid medium, the microorganism to be detected to which the labeled antibody is bound is separated using a capturing body that captures the microorganism, and the microorganism is added to a solution containing a substrate. The target microorganism can be detected by rapidly decreasing.
・ 上記の他の実施形態では、検出対象の微生物を構成する抗原であって触媒により標識されたもの（標識抗原）とこの抗原と結合可能な捕捉体とを構成成分に含む免疫測定試薬を用いる。これによれば、特定の微生物の抗原と標識抗原とが、競合的に捕捉体に結合する。つまり、培養された測定対象の微生物と、添加された標識抗原とが競合的に捕捉体に結合する。従って、これらが結合した捕捉体を、基質を含む溶液に投入すると、液体培地中に存在していた検出対象の微生物が少ないほど電流値が急激に低下するため、電流値の低下の度合いに基づいて、特定の微生物の検出を行うことができる。 In the other embodiment described above, an immunoassay reagent containing, as constituent components, an antigen constituting a detection target microorganism that is labeled with a catalyst (labeled antigen) and a capturing body capable of binding to the antigen is used. . According to this, the antigen of a specific microorganism and the labeled antigen are competitively bound to the capturing body. That is, the cultured microorganism to be measured and the added labeled antigen are competitively bound to the capturing body. Therefore, when the capture bodies to which these are bound are put into a solution containing a substrate, the current value decreases more rapidly as the number of microorganisms to be detected present in the liquid medium decreases. Thus, a specific microorganism can be detected.
・ 上記実施形態では、検出対象の微生物の選択培地を用いて増菌培養を行う。このため、特定の微生物の検出における感度を上げることができる。 -In the said embodiment, enrichment culture is performed using the selective culture medium of the microorganisms to be detected. For this reason, the sensitivity in the detection of a specific microorganism can be raised.
１１…作用極（作用電極）、１２…参照極（参照電極）、１３…対極（対電極）。
DESCRIPTION OF
Claims (7)
触媒で標識した免疫測定試薬を用いて、前記液体培地に含まれる特定の微生物に対して特定の免疫反応を生じせしめる第２工程と、
前記特定の微生物を前記免疫反応に基づいて分離して前記触媒と反応する基質を含む溶液中に加え、前記触媒と前記基質による反応に基づいて変化する特定物質の溶存量を電極により測定することにより、前記特定の微生物を検出する第３工程と
を含むことを特徴とする微生物検出方法。 A first step of culturing in a liquid medium capable of culturing a specific microorganism until the microbial group concentration reaches a predetermined value;
A second step of causing a specific immune reaction against a specific microorganism contained in the liquid medium using an immunoassay reagent labeled with a catalyst;
The specific microorganism is separated based on the immune reaction and added to a solution containing a substrate that reacts with the catalyst, and the dissolved amount of the specific substance that changes based on the reaction between the catalyst and the substrate is measured with an electrode. And a third step of detecting the specific microorganism.
前記第１工程の電極による測定方法と同じ方法で前記第３工程の測定を実行することを特徴とする請求項１に記載の微生物検出方法。 In the first step, the microbial group concentration in the liquid medium is determined by measuring the dissolved amount of the specific substance that changes based on the metabolism of the microorganism with an electrode,
The microorganism detection method according to claim 1, wherein the measurement in the third step is performed by the same method as the measurement method using the electrode in the first step.
前記測定手段が、
特定の微生物を培養可能な液体培地で、微生物の代謝に基づいて変化する前記特定物質の溶存量を電極により測定することにより、微生物群濃度を測定する微生物群濃度測定手段と、
触媒で標識した免疫測定試薬を用いて、前記液体培地に含まれる特定の微生物に対して生じせしめた特定の免疫反応に基づいて前記特定の微生物を分離して、前記触媒と反応する基質を含む溶液中に加え、前記触媒と前記基質による反応に基づいて変化する前記特定物質の溶存量を電極により測定することにより、前記特定の微生物を検出する特定微生物検出手段
として機能することを特徴とする微生物検出装置。 A microorganism detecting apparatus provided with a measuring means for measuring the dissolved amount of a specific substance using an electrode,
The measuring means is
A microorganism group concentration measuring means for measuring a microorganism group concentration by measuring the dissolved amount of the specific substance, which changes based on the metabolism of the microorganism, with an electrode in a liquid medium capable of culturing a specific microorganism;
A substrate that reacts with the catalyst by separating the specific microorganism based on a specific immune reaction generated against the specific microorganism contained in the liquid medium using an immunoassay reagent labeled with a catalyst; It functions as a specific microorganism detecting means for detecting the specific microorganism by measuring the dissolved amount of the specific substance that changes based on the reaction between the catalyst and the substrate in the solution with an electrode. Microbe detection device.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011504236A (en) * | 2007-11-20 | 2011-02-03 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | Method for analyzing bacterial samples using a polymer sensor containing diacetylene |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4691968B2 (en) | 2011-06-01 |
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