JP2006145400A - Method of making bio-molecule interact with each other, and method of moving bio-molecule - Google Patents

Method of making bio-molecule interact with each other, and method of moving bio-molecule Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a means capable of promoting interaction in a bio-molecule micro array and increasing speed and sensitivity of the reaction. <P>SOLUTION: In this interaction method, solution containing a target bio-molecule is arranged between a bio-molecule micro array having one or more spots where bio-molecules are fixed to the surface of a substrate and a counter electrode, and the bio-molecules fixed to the surface of the substrate are interacted with the target bio-molecule. The micro array has a conductive material surface in at least a part of the bio-molecule fixed surface, voltage is applied at a frequency of 0.01-10 Hz between the conductive material surface and the counter electrode to promote the interaction. In this moving method, the bio-molecules contained in the solution arranged between the substrate at least partly having the conductive material surface and the counter electrode is moved. Voltage is applied at a frequency of 0.01-10 Hz between the conductive material surface and the counter electrode to move the bio-molecules toward the substrate or the counter electrode. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、基板上に固定化された生体分子と溶液に含まれる生体分子とを相互作用させる方法、および、溶液に含まれる生体分子を一方向に選択的に移動させる方法に関する。   The present invention relates to a method for causing a biomolecule immobilized on a substrate to interact with a biomolecule contained in a solution, and a method for selectively moving a biomolecule contained in a solution in one direction.

遺伝子診断や病原菌の特定、あるいは一塩基多型の検出等、ある種の核酸(ターゲット核酸)を検出する目的で、プローブ核酸とターゲット核酸とのハイブリダイゼーションが利用されている。近年、多数のプローブ核酸を基板に固定したＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイが実用化されるようになり、ターゲット核酸の検出に使用されている。   Hybridization between a probe nucleic acid and a target nucleic acid is used for the purpose of detecting a certain type of nucleic acid (target nucleic acid) such as genetic diagnosis, identification of pathogenic bacteria, or detection of single nucleotide polymorphisms. In recent years, DNA chips and DNA microarrays in which a large number of probe nucleic acids are immobilized on a substrate have come into practical use and are used for detection of target nucleic acids.

ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイの作製においては、基板にＤＮＡを多数スポットとして整列させて固定化する必要がある。ＤＮＡの固定化には、例えば、末端をチオール修飾した一本鎖ＤＮＡを、例えば、金基板に固定化する方法が取られている。そして、固定化されたＤＮＡに被検体であるターゲットＤＮＡを作用させ、ハイブリダイゼーションの有無を検出する。ハイブリダイゼーションの有無は、例えば、蛍光法を用いて、蛍光標識したターゲットＤＮＡとハイブリダイズした固定化ＤＮＡのスポットの蛍光を測定することによって検出することができる。   In the production of a DNA chip or a DNA microarray, it is necessary to align and fix DNA as many spots on a substrate. For immobilization of DNA, for example, a method of immobilizing a single-stranded DNA whose end is thiol-modified, for example, on a gold substrate is employed. Then, the target DNA, which is an analyte, is allowed to act on the immobilized DNA to detect the presence or absence of hybridization. The presence or absence of hybridization can be detected, for example, by measuring the fluorescence of the spot of the immobilized DNA hybridized with the fluorescently labeled target DNA using a fluorescence method.

基板上に固定化されたプローブＤＮＡと試料ターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーションさせるためには、例えば、プローブＤＮＡを固定化したＤＮＡマイクロアレイ上に、ターゲットＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液を滴下し、溶液が乾かないようにカバーガラスをかけて密閉した湿箱に入れ、ターゲットＤＮＡおよびプローブＤＮＡに合わせた適温でハイブリッド形成反応を行う方法が用いられている（特許文献１参照）。   In order to hybridize the probe DNA immobilized on the substrate and the sample target DNA, for example, a hybridization solution containing the target DNA is dropped on a DNA microarray on which the probe DNA is immobilized so that the solution does not dry. A method of performing a hybridization reaction at an appropriate temperature in accordance with the target DNA and probe DNA is used (see Patent Document 1).

しかし、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーションさせるためには、通常、十数時間を要し、しかも、多量の試料ターゲットＤＮＡが必要とされる。そのため、特許文献１に記載の方法では、ハイブリッド形成には長時間を要するため、迅速な観察を行うことは困難である。しかも、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーションさせるためには、多量の試料を調製しなければならない。
特開２００３−１５６４４２号公報 However, in order to hybridize the probe DNA and the target DNA, it usually takes ten hours or more, and a large amount of sample target DNA is required. Therefore, in the method described in Patent Document 1, it takes a long time to form a hybrid, so that it is difficult to make a quick observation. In addition, in order to hybridize the probe DNA and the target DNA, a large amount of sample must be prepared.
JP 2003-156442 A

本発明の目的は、生体分子マイクロアレイにおける相互作用を促進し、反応の高速化および高感度化が可能な手段を提供することである。   An object of the present invention is to provide means capable of accelerating the interaction in a biomolecule microarray and increasing the reaction speed and sensitivity.

本発明の上記目的を達成する手段は、以下の通りである。
[請求項１]基板表面に生体分子が固定化されたスポットを１つ以上有する生体分子マイクロアレイと、前記基板表面と対向する電極（以下、「対向電極」という）との間にターゲット生体分子を含む溶液を配置し、前記基板表面に固定化された生体分子とターゲット生体分子とを相互作用させる方法であって、
前記マイクロアレイは、生体分子が固定化された面の少なくとも一部に導電性物質表面を有し、
前記導電性物質表面と対向電極との間に、周波数０．０１〜１０Ｈｚで電圧を印加して、前記相互作用を促進することを特徴とする、前記方法。
[請求項２]少なくとも一部に導電性物質表面を有する基板と、前記導電性物質表面と対向する電極（以下、「対向電極」という）との間に配置された溶液に含まれる生体分子を移動させる方法であって、
前記導電性物質表面と対向電極との間に、周波数０．０１〜１０Ｈｚで電圧を印加して、前記基板または対向電極に向けて前記生体分子を移動させることを特徴とする方法。
[請求項３]前記電圧が０．１〜４Ｖである、請求項１または２に記載の方法。
[請求項４]前記溶液は、カチオンを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
[請求項５]前記カチオンは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、およびアルミニウムイオンからなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項４に記載の方法。
[請求項６]前記溶液中のカチオン濃度は、１〜１０００ｍＭの範囲である、請求項４または５に記載の方法。
[請求項７]前記電圧は、パルス直流電圧である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
[請求項８]少なくとも前記基板表面が負に帯電するように電圧を印加することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
[請求項９]前記基板は、基板全体が導電性物質からなるか、または、基板表面に導電性物質被覆層を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
[請求項１０]前記導電性物質は、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸化物、または導電性プラスチックである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
[請求項１１]前記対向電極は、電極全体が、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸化物、または導電性プラスチックからなるか、または、前記基板の導電性物質表面と対向する表面に、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸化物、または導電性プラスチックからなる導電性物質被覆層を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
[請求項１２]前記対向電極は、透明電極である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
[請求項１３]前記基板と対向電極との間に非導電性スペーサーを配置し、前記基板、対向電極、および非導電性スペーサーによって囲まれた空間に、前記溶液を充填する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
[請求項１４]前記導電性物質表面と対向電極との間に電圧が印加されない間、前記溶液を攪拌することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
[請求項１５]前記生体分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、蛋白、ポリペプチド、糖化合物、脂質、天然低分子、および合成低分子からなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の方法。 Means for achieving the object of the present invention is as follows.
[Claim 1] A target biomolecule is placed between a biomolecule microarray having one or more spots having biomolecules immobilized on a substrate surface and an electrode facing the substrate surface (hereinafter referred to as "counter electrode"). Placing a solution containing the biomolecules immobilized on the substrate surface and interacting with the target biomolecules,
The microarray has a conductive material surface on at least a part of a surface on which a biomolecule is immobilized,
The method described above, wherein a voltage is applied at a frequency of 0.01 to 10 Hz between the surface of the conductive material and the counter electrode to promote the interaction.
[Claim 2] A biomolecule contained in a solution disposed between a substrate having a conductive material surface at least in part and an electrode facing the conductive material surface (hereinafter referred to as "counter electrode"). A method of moving,
A method of applying a voltage at a frequency of 0.01 to 10 Hz between the surface of the conductive material and the counter electrode to move the biomolecule toward the substrate or the counter electrode.
[3] The method according to [1] or [2], wherein the voltage is 0.1 to 4V.
[Claim 4] The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the solution contains a cation.
[5] The method according to [4], wherein the cation is at least one selected from the group consisting of sodium ion, potassium ion, lithium ion, magnesium ion, calcium ion, and aluminum ion.
[Claim 6] The method according to claim 4 or 5, wherein the cation concentration in the solution is in the range of 1 to 1000 mM.
[7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the voltage is a pulsed DC voltage.
[8] The method according to any one of [1] to [7], comprising applying a voltage so that at least the surface of the substrate is negatively charged.
[9] The method according to any one of [1] to [8], wherein the entire substrate is made of a conductive material or has a conductive material coating layer on the substrate surface.
10. The conductive material according to claim 1, wherein the conductive material is gold, nickel, platinum, silver, titanium, aluminum, stainless steel, copper, chromium, a conductive oxide, or a conductive plastic. The method according to item.
[11] The counter electrode, as a whole, is made of gold, nickel, platinum, silver, titanium, aluminum, stainless steel, copper, chromium, conductive oxide, or conductive plastic, or of the substrate. The conductive material coating layer made of gold, nickel, platinum, silver, titanium, aluminum, stainless steel, copper, chromium, conductive oxide, or conductive plastic is provided on the surface facing the conductive material surface. The method of any one of 10-10.
[12] The method according to any one of [1] to [11], wherein the counter electrode is a transparent electrode.
[13] A non-conductive spacer is disposed between the substrate and the counter electrode, and the space enclosed by the substrate, the counter electrode, and the non-conductive spacer is filled with the solution. 13. The method according to any one of items 12.
[14] The method according to any one of [1] to [13], comprising stirring the solution while no voltage is applied between the surface of the conductive material and the counter electrode.
15. The biomolecule is at least one selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA, protein, polypeptide, sugar compound, lipid, natural low molecule, and synthetic low molecule. The method according to any one of the above.

本発明によれば、アレイ表面近傍にターゲット生体分子を濃縮し、生体分子の相互作用の高速化と高感度化を実現することができる。   According to the present invention, it is possible to concentrate target biomolecules in the vicinity of the array surface and realize high-speed and high-sensitivity interaction of biomolecules.

以下、本発明について更に詳細に説明する。

本発明の第一の態様は、
基板表面に生体分子が固定化されたスポットを１つ以上有する生体分子マイクロアレイと、前記基板表面と対向する電極（対向電極）との間にターゲット生体分子を含む溶液を配置し、前記基板表面に固定化された生体分子とターゲット生体分子とを相互作用させる方法であって、
前記マイクロアレイは、生体分子が固定化された面の少なくとも一部に導電性物質表面を有し、
前記導電性物質表面と対向電極との間に、周波数０．０１〜１０Ｈｚで電圧を印加して、前記相互作用を促進することを特徴とする、前記方法
である。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

The first aspect of the present invention is:
A solution containing a target biomolecule is disposed between a biomolecule microarray having one or more spots having biomolecules immobilized on the substrate surface and an electrode (counter electrode) facing the substrate surface, A method of interacting an immobilized biomolecule with a target biomolecule,
The microarray has a conductive material surface on at least a part of a surface on which a biomolecule is immobilized,
The method is characterized in that a voltage is applied at a frequency of 0.01 to 10 Hz between the surface of the conductive material and the counter electrode to promote the interaction.

前記生体分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、蛋白、ポリペプチド、糖化合物、脂質、天然低分子、および合成低分子からなる群から選ばれる少なくとも一種であることができ、目的に応じて選択することができる。
ここで、糖化合物としては、例えば、単糖、オリゴ糖、多糖、糖鎖複合体、糖蛋白質、糖脂質、およびそれら誘導体などを挙げることができる。
脂質としては、例えば、脂肪酸、リン脂質、糖脂質、グリセリドなどを挙げることができる。
天然低分子としては、例えば、ホルモン分子や抗生物質、毒物、ビタミン類、生理活性物質、二次代謝産物などを挙げることができる。
合成低分子としては、例えば、天然低分子の合成物、およびそれら誘導体などを挙げることができる。 The biomolecule may be at least one selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA, protein, polypeptide, sugar compound, lipid, natural low molecule, and synthetic low molecule, and should be selected according to the purpose. Can do.
Here, examples of the sugar compound include monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, sugar chain complexes, glycoproteins, glycolipids, and derivatives thereof.
Examples of lipids include fatty acids, phospholipids, glycolipids, and glycerides.
Examples of natural small molecules include hormone molecules, antibiotics, poisons, vitamins, physiologically active substances, secondary metabolites, and the like.
As a synthetic | combination small molecule | numerator, the synthetic | combination product of a natural low molecule | numerator, those derivatives, etc. can be mentioned, for example.

前記相互作用としては、例えば、プローブ核酸とターゲット核酸とのハイブリダイゼーション、抗原−抗体相互作用、レセプター−リガンド相互作用、タンパク−タンパク相互作用、ＤＮＡ−タンパク相互作用を挙げることができる。   Examples of the interaction include hybridization between probe nucleic acid and target nucleic acid, antigen-antibody interaction, receptor-ligand interaction, protein-protein interaction, and DNA-protein interaction.

本発明の第一の態様において使用される生体分子マイクロアレイは、基板上に生体分子を固定化することによって作製されるものであり、生体分子が固定化された面の少なくとも一部に導電性物質表面を有する。前記基板は、基板全体が導電性物質からなる基板であるか、または、基板表面に導電性物質被覆層を有する基板であることができる。   The biomolecule microarray used in the first aspect of the present invention is produced by immobilizing a biomolecule on a substrate, and has a conductive substance on at least a part of the surface on which the biomolecule is immobilized. Having a surface. The substrate may be a substrate made of a conductive material as a whole or a substrate having a conductive material coating layer on a substrate surface.

前記導電性物質は、例えば、金属（例えば、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム）、導電性酸化物（例えば、Ｉｎ2Ｏ5／ＳｎＯ2）、または導電性プラスチック（例えば、ポリアセチレン）であることができる。なお、前記導電性物質をチオールと結合性を有する金属から選択することにより、金属とチオールとの結合を利用して、プローブ核酸の固定化を行うことができる、また、後述するように、前記基板が突出スポット部を有するものであり、反射像によって自動グリッティングを行う場合には、前記導電性物質は、光を反射する物質から選択することができる。 The conductive material may be, for example, a metal (eg, gold, nickel, platinum, silver, titanium, aluminum, stainless steel, copper, chromium), a conductive oxide (eg, In 2 O 5 / SnO 2 ), or conductive It can be a plastic (eg, polyacetylene). In addition, by selecting the conductive substance from a metal having a binding property with thiol, the probe nucleic acid can be immobilized using the bond between the metal and the thiol. In the case where the substrate has a protruding spot portion and automatic gritting is performed using a reflected image, the conductive material can be selected from materials that reflect light.

前記基板が、導電性物質被覆層を有する基板である場合、そのような基板は、ガラス、石英、シリコン、プラスチック、具体的には、ポリプロピレン等の基板の表面に、前記導電性物質を被覆したものを挙げることができる。基板上の導電性物質被覆層の厚さは、特に限定されるものではなく、例えば、０．１〜１０μｍとすることができる。このような基板は、公知の方法で作製することができ、また、市販品として入手可能なものもある。   In the case where the substrate is a substrate having a conductive material coating layer, such a substrate is obtained by coating the surface of a substrate such as glass, quartz, silicon, plastic, specifically, polypropylene with the conductive material. Things can be mentioned. The thickness of the conductive material coating layer on the substrate is not particularly limited and can be, for example, 0.1 to 10 μm. Such a substrate can be produced by a known method, and some of the substrates are commercially available.

更に、第一の態様において使用される基板は、平らな表面を有する基板であることができる。また、第一の態様において使用される基板は、基板表面から突出し、かつ頂上にスポット用平面を有する生体分子固定化用スポット（突出スポット部）を有し、少なくとも前記突出スポット部は導電性物質表面を有し、前記スポット用平面の導電性物質表面に生体分子が固定化されており、かつ前記基板は、前記基板上の突出スポット部以外の表面に、前記突出スポット部の導電性物質表面と通電可能な端子を有するものであることもできる。前記基板上の突出スポット部以外の表面は、導電性物質被覆層を有することができ、前記端子は、前記導電性物質被覆層に含まれるか、または、前記導電性物質被覆層と通電可能であることができる。更に、この導電性物質被覆層と突出スポット部の導電性物質表面とは、一体の導電性物質被覆層として設けられていることが好ましい。そのような基板としては、少なくとも、前記突出スポット部周辺の基板表面、突出スポット部側面、およびスポット用平面が、導電性物質からなる基板（以下、基板Ｉという）、または、隣り合う突出スポット部は、突出スポット部側面によって隣接しており、かつ、少なくとも、前記突出スポット部側面およびスポット用平面が、導電性物質からなる基板（以下、基板ＩＩという）を挙げることができる。   Furthermore, the substrate used in the first embodiment can be a substrate having a flat surface. The substrate used in the first aspect has a biomolecule-immobilizing spot (protruding spot portion) that protrudes from the substrate surface and has a flat surface for spotting on the top, and at least the protruding spot portion is a conductive substance. A biomolecule is immobilized on the surface of the conductive material for the spot plane, and the substrate has a conductive material surface of the protruding spot portion on a surface other than the protruding spot portion on the substrate. It can also have a terminal which can be supplied with electricity. The surface other than the protruding spot portion on the substrate may have a conductive material coating layer, and the terminal may be included in the conductive material coating layer or may be energized with the conductive material coating layer. Can be. Furthermore, it is preferable that the conductive material coating layer and the conductive material surface of the protruding spot portion are provided as an integral conductive material coating layer. As such a substrate, at least a substrate surface around the protruding spot portion, a protruding spot portion side surface, and a spot plane are made of a conductive material (hereinafter referred to as substrate I), or adjacent protruding spot portions. May be a substrate (hereinafter referred to as a substrate II) that is adjacent to the side surface of the protruding spot portion, and at least the side surface of the protruding spot portion and the plane for spot are made of a conductive material.

基板ＩおよびＩＩでは、生体分子固定化用スポットが、突出スポット部の頂上の平面に設けられている。そのため、基板ＩおよびＩＩでは、前記突出スポット部頂上のスポット用平面（生体分子固定化用スポット）は、前記突出スポット部周辺の基板表面より一段高い位置にあり、両者間に高低差が生じる。   In the substrates I and II, the biomolecule immobilization spot is provided on the top surface of the protruding spot portion. Therefore, in the substrates I and II, the spot plane on the top of the protruding spot portion (spot for biomolecule immobilization) is located one step higher than the substrate surface around the protruding spot portion, and there is a difference in height between the two.

一方、後述するように生体分子の相互作用の検出に用いられ得る共焦点型検出器は、試料上の焦点面からの反射光や蛍光を、光学系の結像面に置かれたピンホールに通して検出する。図１に、共焦点型検出器４０の光学系の概略図を示す。図１の実線ａは、入射光を表す。実線ｂは、焦点面からの反射光または蛍光を表し、破線は、非焦点面からの反射光または蛍光を表す。共焦点型検出器４０では、マイクロアレイ４１上の焦点面から反射した反射光、および、試料上の焦点面から放出された蛍光は、対物レンズ４２を通ってビームスプリッター４３へ入射し、ビームスプリッター４３によって、検出レンズ４４へ垂直に入射するように光路が修正され、検出レンズ４４を経て、結像面４５へ入射する。共焦点型検出器４０は、試料上での焦点が、結像面でも焦点となるように設計されている。よって、試料上の焦点面からの光は、結像面４５で焦点を結び、ピンホール４６を通過して、検出部４７で検出される。一方、試料上の非焦点面からの光は、結像面４５で焦点を結ばないため、大部分がピンホール４６を通過せず、検出部７において検出されない。このように、共焦点型検出器によれば、焦点面からの光を、選択的に検出することができる。   On the other hand, as will be described later, a confocal detector that can be used to detect the interaction of biomolecules reflects reflected light or fluorescence from a focal plane on a sample into a pinhole placed on the imaging plane of the optical system. Detect through. FIG. 1 shows a schematic diagram of the optical system of the confocal detector 40. A solid line a in FIG. 1 represents incident light. A solid line b represents reflected light or fluorescence from the focal plane, and a broken line represents reflected light or fluorescence from the non-focal plane. In the confocal detector 40, the reflected light reflected from the focal plane on the microarray 41 and the fluorescence emitted from the focal plane on the sample enter the beam splitter 43 through the objective lens 42, and the beam splitter 43. As a result, the optical path is corrected so as to enter the detection lens 44 perpendicularly, and enters the imaging plane 45 through the detection lens 44. The confocal detector 40 is designed so that the focal point on the sample is also the focal point on the imaging plane. Therefore, the light from the focal plane on the sample is focused on the imaging plane 45, passes through the pinhole 46, and is detected by the detection unit 47. On the other hand, the light from the non-focal surface on the sample is not focused on the imaging surface 45, so that most of the light does not pass through the pinhole 46 and is not detected by the detection unit 7. Thus, according to the confocal detector, the light from the focal plane can be selectively detected.

前記基板Ｉでは、前記突出スポット部周辺の基板表面と、前記突出スポット部頂上のスポット用平面（生体分子固定化用スポット）との高低差が、生体分子とターゲット生体分子との相互作用の検出において使用する共焦点型検出器の焦点深度以上であれば、共焦点型検出器の焦点を、突出スポット部頂上のスポット用平面の高さに合わせることにより、検出器において、突出部周辺の基板表面からの蛍光や反射光よりも、突出スポット部頂上のスポット用平面からの蛍光や反射光を、より高い強度で検出することができる。従って、基板Ｉの突出スポット部頂上のスポット用平面に生体分子を固定化したマイクロアレイを使用することにより、スポット上の情報、例えば、ターゲット生体分子との相互作用の有無を、高感度で検出することができる。   In the substrate I, the difference in height between the substrate surface around the protruding spot portion and the spot plane (spot for immobilizing biomolecules) on the top of the protruding spot portion is the detection of the interaction between the biomolecule and the target biomolecule. If the depth of focus of the confocal detector is greater than that of the confocal detector used in the above, the focal point of the confocal detector is adjusted to the height of the spot plane on the top of the protruding spot portion. Fluorescence and reflected light from the spot plane on the top of the protruding spot portion can be detected with higher intensity than fluorescence and reflected light from the surface. Accordingly, by using a microarray in which biomolecules are immobilized on the spot plane on the top of the protruding spot portion of the substrate I, information on the spot, for example, presence or absence of interaction with the target biomolecule is detected with high sensitivity. be able to.

前記基板ＩＩは、隣り合う突出スポット部が、突出スポット部側面によって隣接しており、かつ、少なくとも、前記突出スポット部側面およびスポット用平面が、導電性物質からなることを特徴とする。基板ＩＩの一例を、図２に示す。   The substrate II is characterized in that adjacent protruding spot portions are adjacent to each other by a protruding spot portion side surface, and at least the protruding spot portion side surface and the spot plane are made of a conductive material. An example of the substrate II is shown in FIG.

前記基板ＩおよびＩＩにおいて、前記突出スポット部頂上のスポット用平面と前記突出スポット部側面とのなす角は、９０度以上であることが好ましい。好ましくは、９０〜１３５度である。図３（ａ）は、そのような基板の一部の断面図である。ここで、「突出スポット部頂上のスポット用平面と突出スポット部側面とのなす角」とは、図３（ａ）における角度θをいう。角度θは、例えば、突出スポット部を、突出スポット部周辺の基板表面に対して垂直に切断し、その断面から求めることができる。   In the substrates I and II, an angle formed by the spot plane on the top of the protruding spot part and the side surface of the protruding spot part is preferably 90 degrees or more. Preferably, it is 90 to 135 degrees. FIG. 3A is a cross-sectional view of a part of such a substrate. Here, “the angle formed by the spot plane on the top of the protruding spot portion and the side surface of the protruding spot portion” refers to the angle θ in FIG. The angle θ can be obtained from, for example, a cross section obtained by cutting the protruding spot portion perpendicularly to the substrate surface around the protruding spot portion.

このように、基板ＩおよびＩＩにおいて、突出スポット部頂上のスポット用平面と突出スポット部側面とのなす角が９０度以上であることにより、即ち、突出スポット部底面の大きさが、突出スポット部頂上のスポット用平面の大きさ以上であることにより、グリッティングを自動で行って、生体分子固定化用スポットの位置および大きさを特定することができるという利点がある。以下に、この点について、詳述する。   Thus, in the substrates I and II, when the angle formed by the spot plane on the top of the protruding spot portion and the side surface of the protruding spot portion is 90 degrees or more, that is, the size of the bottom surface of the protruding spot portion is the protruding spot portion. By being larger than the size of the top spot plane, there is an advantage that the position and size of the biomolecule immobilization spot can be specified by automatically performing griting. This point will be described in detail below.

図３（ａ）に示すように、突出スポット部頂上のスポット用平面と突出スポット部側面とのなす角が９０度以上である場合、共焦点型の検出器を使用して反射光を検出する際に、突出スポット部頂上のスポット用平面に対して垂直な方向から照射した光（図３（ａ）に矢印で表される光）に対する突出スポット部側面からの反射光は、入射光と同一方向には反射しない。一方、突出スポット部頂上のスポット用平面からの反射光は、入射光と同一方向に反射する。このため、共焦点型検出器では、突出スポット部頂上のスポット用平面からの反射光のみが検出され、側面からの反射光は検出されない。こうして得られた反射像には、突出スポット部頂上のスポット用平面に相当する像が、反射像として得られ、突出スポット部側面に相当する部分は、反射光がほとんど検出されないので黒色の縁取りとして表れる。この反射像では、黒い縁取りの内部が生体分子スポットに相当するため、この反射像により、スポットの大きさおよび位置を特定することができる。   As shown in FIG. 3A, when the angle formed by the spot plane on the top of the protruding spot portion and the side surface of the protruding spot portion is 90 degrees or more, the reflected light is detected using a confocal detector. At this time, the reflected light from the side surface of the protruding spot portion with respect to the light irradiated from the direction perpendicular to the spot plane on the top of the protruding spot portion (light represented by an arrow in FIG. 3A) is the same as the incident light. Does not reflect in the direction. On the other hand, the reflected light from the spot plane on the top of the protruding spot part is reflected in the same direction as the incident light. For this reason, in the confocal detector, only the reflected light from the spot plane on the top of the protruding spot portion is detected, and the reflected light from the side surface is not detected. In the reflection image thus obtained, an image corresponding to the spot plane on the top of the protruding spot portion is obtained as a reflected image, and the portion corresponding to the side surface of the protruding spot portion has almost no reflected light, and therefore has a black border. appear. In this reflection image, since the inside of the black border corresponds to a biomolecule spot, the size and position of the spot can be specified by this reflection image.

また、基板Ｉにおいて、突出スポット部の高さが相互作用の検出に使用する共焦点型検出器の焦点深度以上である場合は、共焦点型検出器の焦点を、突出スポット部頂上のスポット用平面の高さに合わせれば、突出スポット部周辺の基板表面からの反射光は、焦点が合わないため、突出スポット部頂上のスポット用平面からの反射光よりもはるかに弱い強度でしか、検出されない。但し、前記突出スポット部の高さが相互作用の検出に使用する共焦点型検出器の焦点深度より小さい場合であっても、前述のように、反射像において、突出スポット部側面に相当する部分が黒色の縁取りとして表れれば、スポットの大きさおよび位置を特定することが可能である。   On the substrate I, when the height of the protruding spot portion is equal to or greater than the depth of focus of the confocal detector used for detecting the interaction, the focal point of the confocal detector is used for the spot on the top of the protruding spot portion. If the height of the plane is adjusted, the reflected light from the substrate surface around the protruding spot is not focused, and is detected only with a much lower intensity than the reflected light from the spot plane on the top of the protruding spot. . However, even if the height of the protruding spot portion is smaller than the focal depth of the confocal detector used for detecting the interaction, as described above, the portion corresponding to the side surface of the protruding spot portion in the reflected image If it appears as a black border, the size and position of the spot can be specified.

また、基板Ｉでは、前記突出スポット部頂上のスポット用平面と突出スポット部側面とのなす角が９０度未満であっても、突出スポット部の高さが相互作用の検出に使用する共焦点型検出器の焦点深度以上である場合は、スポット用平面と、突出スポット部周辺の基板表面との高低差を利用して、反射像によって、スポット用平面の位置および大きさを特定し、自動でグリッティングを行うことができる。前記突出スポット部頂上のスポット用平面と突出スポット部側面とのなす角が９０度である場合、前記突出スポット部の形状は、例えば、円柱状または角柱状であることができる。   Further, in the substrate I, even if the angle formed by the spot plane on the top of the protruding spot portion and the side surface of the protruding spot portion is less than 90 degrees, the height of the protruding spot portion is used for detecting the interaction. If it is greater than the depth of focus of the detector, use the height difference between the spot plane and the substrate surface around the protruding spot to identify the position and size of the spot plane using the reflection image and automatically Gritting can be performed. When the angle formed by the spot plane on the top of the protruding spot portion and the side surface of the protruding spot portion is 90 degrees, the shape of the protruding spot portion can be, for example, a columnar shape or a prism shape.

さらに、基板Ｉは、前記突出スポット部頂上のスポット用平面と前記突出スポット部側面とのなす角が、９０度以上であり、かつ、前記突出スポット周辺の基板表面が、略Ｖ字型底面を形成する基板であることもできる。このような基板では、共焦点型検出器で検出されるスポット用平面からの反射光強度が、基板上のスポット用平面以外の部分からの反射光強度より強くなるため、この反射光強度の違いにより、スポット用平面の位置および大きさを特定することができる。図４は、「略Ｖ字型底面」を有する基板の一部の拡大図である。本発明において、「略Ｖ字型底面」とは、例えば、隣り合う突出スポット部間の突出スポット部周辺の基板表面が平面ではなく、図４に示すように、略Ｖ字を形成していることをいう。   Further, the substrate I has an angle formed by the spot plane on the top of the protruding spot portion and the side surface of the protruding spot portion of 90 degrees or more, and the substrate surface around the protruding spot has a substantially V-shaped bottom surface. It can also be a substrate to be formed. In such a substrate, the reflected light intensity from the spot plane detected by the confocal detector is stronger than the reflected light intensity from a portion other than the spot plane on the substrate. Thus, the position and size of the spot plane can be specified. FIG. 4 is an enlarged view of a part of a substrate having a “substantially V-shaped bottom surface”. In the present invention, the “substantially V-shaped bottom surface” means, for example, that the substrate surface around the protruding spot portion between adjacent protruding spot portions is not a flat surface, but has a substantially V shape as shown in FIG. That means.

更に、基板Ｉは、少なくとも、前記突出スポット部周辺の基板表面、突出スポット部側面、およびスポット用平面が、導電性物質からなる。製造の容易さや製造コストを考慮すれば、基板Ｉは、基板上の、前記突出スポット周辺以外の基板表面も、導電性物質からなるものであることが好ましい。また、基板ＩＩは、少なくとも突出スポット部側面および突出スポット部平面が、導電性物質からなる。   Further, in the substrate I, at least the substrate surface around the protruding spot portion, the side surface of the protruding spot portion, and the plane for spot are made of a conductive material. In view of ease of manufacturing and manufacturing cost, it is preferable that the substrate I on the substrate other than the periphery of the protruding spot is also made of a conductive material. Further, in the substrate II, at least the protruding spot portion side surface and the protruding spot portion plane are made of a conductive material.

本発明では、基板Ｉにおいては、少なくとも、突出スポット部周辺の基板表面、突出スポット部側面、およびスポット用平面が、基板ＩＩにおいては、少なくとも、突出スポット部側面およびスポット用平面が、導電性物質からなることにより、後述するように、基板上に生体分子を固定化することによって作製されたマイクロアレイに対向する電極を設け、電界を印加することによって、スポット用平面に固定化された生体分子とターゲット生体分子との相互作用を促進することができる。例えば、ターゲット生体分子の濃度が低い場合でも、良好な相互作用結果を得ることができ、また、濃度が同一の場合には、より短時間で所定の相互作用結果を得ることができる。   In the present invention, in the substrate I, at least the substrate surface around the protruding spot portion, the protruding spot portion side surface, and the spot plane are in the conductive material, and in the substrate II, at least the protruding spot portion side surface and the spot plane are in the conductive material. As will be described later, an electrode opposed to the microarray produced by immobilizing the biomolecule on the substrate is provided, and the biomolecule immobilized on the spot plane is applied by applying an electric field. Interaction with the target biomolecule can be promoted. For example, even when the concentration of the target biomolecule is low, a favorable interaction result can be obtained, and when the concentration is the same, a predetermined interaction result can be obtained in a shorter time.

本発明において、前記突出スポット部の高さは、共焦点型検出器の焦点深度等を考慮して適宜設定することができ、例えば、１０〜５００μｍとすることができる。
また、前記突出スポット部の高さを決定する際は、生体分子のスポット形成（スタンピング）に使用するニードルの直径や、プローブ核酸等の生体分子溶液のスポット量も考慮すべきである。例えば、直径１００μｍの円形の突出スポット部に対して直径１３０μｍ程度のニードルを用いて生体分子をスポットする場合、突出スポット部の高さが１５μｍ以上であれば、表面張力のため、突出スポット部頂上のスポット用平面から生体分子溶液が流れ出すことなく、固定化用スポットのみに、生体分子が固定化されるため、好ましい。 In the present invention, the height of the protruding spot portion can be appropriately set in consideration of the depth of focus of the confocal detector, for example, 10 to 500 μm.
Further, when determining the height of the protruding spot portion, the diameter of the needle used for biomolecule spot formation (stamping) and the spot amount of the biomolecule solution such as probe nucleic acid should be taken into consideration. For example, when a biomolecule is spotted using a needle having a diameter of about 130 μm with respect to a circular protruding spot portion having a diameter of 100 μm, if the height of the protruding spot portion is 15 μm or more, the top of the protruding spot portion is caused by surface tension. This is preferable because the biomolecule solution is immobilized only on the immobilization spot without flowing out of the biomolecule solution from the spot plane.

突出スポット部を有する基板において、突出スポット部頂上のスポット用平面の形状は、スポットされた生体分子を保持し得る形状であれば、いずれの形状であることもでき、例えば、円形や正方形であることができる。前記スポット用平面の大きさは、スポットに用いるニードルやスポットする生体分子溶液の量に応じて適宜設定することができ、例えば、１０〜５００μｍとすることができる。ここで、「スポット用平面の大きさ」とは、例えば、スポット用平面の形状が円形の場合は、その直径をいい、スポット用平面の形状が正方形の場合は、その一辺の長さをいう。
突出スポット部底面の形状は、特に限定されないが、製造の容易さ等を考慮すれば、スポット用平面と同様の形状であることが好ましい。図３（ｂ）は、突出スポット部を有する基板上の突出スポット部の概略図である。ここで、「突出スポット部底面の形状」とは、図３（ｂ）の斜線部をいう。 In the substrate having the protruding spot portion, the shape of the spot plane on the top of the protruding spot portion can be any shape as long as it can hold the spotted biomolecule, for example, circular or square. be able to. The size of the spot plane can be appropriately set according to the amount of needle used for the spot or the biomolecule solution to be spotted, and can be set to 10 to 500 μm, for example. Here, the “size of the spot plane” means, for example, the diameter when the shape of the spot plane is circular, and the length of one side when the shape of the spot plane is square. .
The shape of the bottom surface of the protruding spot portion is not particularly limited, but it is preferable that the shape is the same as that of the spot plane in consideration of ease of manufacture and the like. FIG. 3B is a schematic view of the protruding spot portion on the substrate having the protruding spot portion. Here, “the shape of the bottom surface of the protruding spot portion” refers to the shaded portion in FIG.

前記突出スポット部頂上のスポット用平面は、粗面化されていてもよい。例えば、前記突出スポット部頂上のスポット用平面は、深さ方向と略水平方向に、相互作用の検出において使用する共焦点型検出器の焦点深度以内の深さの凹凸を有していてもよい。図５に、粗面化されたスポット用平面の一例（部分拡大図）を示す。粗面化されたスポット用平面の一例としては、図５に示すような、数μｍ角の格子状の形状を設けたスポット用平面を挙げることができる。このように、スポット用平面が粗面化されていることにより、凹凸の角（エッジ）部分に強電界が生じ、相互作用が更に促進されるという利点がある。   The flat surface for spot on the top of the protruding spot portion may be roughened. For example, the spot plane on the top of the protruding spot portion may have an unevenness with a depth within the depth of focus of the confocal detector used for detecting the interaction in the depth direction and substantially in the horizontal direction. . FIG. 5 shows an example (partially enlarged view) of the roughened spot plane. As an example of the roughened spot plane, a spot plane having a lattice shape of several μm square as shown in FIG. 5 can be cited. As described above, since the spot plane is roughened, there is an advantage that a strong electric field is generated at the corners (edges) of the unevenness and the interaction is further promoted.

スポット用平面の粗面化方法は特に限定されず、例えば、本発明で使用される基板がプラスチック成型基板の場合、フォトリソグラフィーによりエッチングした母材を、電鋳法により反転写した微細加工金型を用いることにより、スポット用平面が粗面化された基板を製作することができる。   The method of roughening the flat surface for spot is not particularly limited. For example, when the substrate used in the present invention is a plastic molded substrate, a microfabricated mold in which a base material etched by photolithography is anti-transferred by electroforming By using this, it is possible to manufacture a substrate having a rough spot plane.

次に、基板表面から突出し、かつ頂上にスポット用平面を有する生体分子固定化用スポット（突出スポット部）を有する基板の製造方法について説明する。
前記基板が金属からなるものである場合は、所望の形状の突出スポット部に対応した凹部を有する鋳型に、熔融した金属を注入して鋳造することにより、突出スポット部を有する基板を得ることができる。また、プレス成形によって、金属製基板を得ることもできる。本発明で使用される基板は、金属からなる基板の上に、導電性物質を被覆したものであることもできる。 Next, a method for producing a substrate having a biomolecule immobilization spot (protruding spot portion) protruding from the substrate surface and having a spot flat surface on the top will be described.
When the substrate is made of metal, a molten metal is poured into a mold having a recess corresponding to the projecting spot portion having a desired shape, and a substrate having the projecting spot portion is obtained. it can. A metal substrate can also be obtained by press molding. The board | substrate used by this invention can also coat | cover the electroconductive substance on the board | substrate which consists of metals.

本発明において使用される基板が、シリコンまたはプラスチック製の基板上に導電性物質の被覆を有するものである場合は、例えば、所望の形状の突出スポット部に対応した凹部を有する成形型を用いてシリコンまたはプラスチックを成形し、そのシリコンまたはプラスチック製の基板上に、導電性物質を、蒸着、メッキ等によって被覆することにより、突出スポット部を有する基板を得ることができる。
また、突出スポット部を有する基板は、平板状の基板上に導電性被覆層を被覆した後に、エッチング等により突出スポット部を形成することによって製造することもできる。 In the case where the substrate used in the present invention has a conductive material coating on a silicon or plastic substrate, for example, a mold having a recess corresponding to a protruding spot portion of a desired shape is used. A substrate having protruding spot portions can be obtained by molding silicon or plastic and coating a conductive material on the silicon or plastic substrate by vapor deposition, plating, or the like.
Moreover, the board | substrate which has a protrusion spot part can also be manufactured by forming a protrusion spot part by an etching etc., after coat | covering a conductive coating layer on a flat substrate.

次に、突出スポット部を有する基板が、ガラス基板上に金被覆層を有するものである場合の、基板の製造方法の一例を説明する。但し、本発明はこの態様に限定されるものではない。
まず、スライドガラスの表面に、真空蒸着装置により、クロムを蒸着し、次いで、その上に金を蒸着する。この金蒸着スライドガラス上に、ポジ型レジストをスピンコーターで塗布し、例えば６０℃でオーブンにより１時間ベーキングする。
次いで、紫外線露光装置により、フォトマスクを通してスライドガラスに紫外線を照射する。このとき、フォトマスクとしては、所望の形状の突出スポット部に対応したパターンを有するものを使用する。紫外線照射後、現像液によって現像を行えば、金蒸着スライドガラス表面に、レジストパターンを形成することができる。 Next, an example of the manufacturing method of a board | substrate in case the board | substrate which has a protrusion spot part has a gold coating layer on a glass substrate is demonstrated. However, the present invention is not limited to this embodiment.
First, chromium is vapor-deposited on the surface of the slide glass by a vacuum vapor deposition apparatus, and then gold is vapor-deposited thereon. A positive resist is applied onto the gold-deposited slide glass with a spin coater, and baked in an oven at 60 ° C. for 1 hour, for example.
Next, the glass slide is irradiated with ultraviolet rays through a photomask by an ultraviolet exposure device. At this time, a photomask having a pattern corresponding to a protruding spot portion having a desired shape is used. A resist pattern can be formed on the gold-deposited slide glass surface by developing with a developing solution after the ultraviolet irradiation.

次いで、レジストパターン周辺の金表面を、金エッチャントによってエッチングする。金エッチング後の基板を超純水によって洗浄した後、金の下に蒸着されたクロムを除去するために、エッチャントにより更にエッチングを行い、超純水によって洗浄する。
アセトン等によってレジストを溶解した後、超純水によって洗浄し、更に残っているレジストを完全に除去するために、ピラニア溶液（硫酸：過酸化水素＝１：１）に１０分間漬けて、超純水で洗浄する。これにより、フォトマスクに対応した金パターンを有するガラス基板を得ることができる。 Next, the gold surface around the resist pattern is etched with a gold etchant. After the gold etching substrate is washed with ultrapure water, in order to remove chromium deposited under the gold, etching is further performed with an etchant and washed with ultrapure water.
After dissolving the resist with acetone or the like, it is washed with ultrapure water, and in order to completely remove the remaining resist, it is immersed in a piranha solution (sulfuric acid: hydrogen peroxide = 1: 1) for 10 minutes. Wash with water. Thereby, a glass substrate having a gold pattern corresponding to the photomask can be obtained.

次に、上記基板を、フッ化水素酸に浸漬し、露出しているガラス表面をエッチングする。このときに使用するフッ化水素酸の濃度および浸漬時間は、所望の突出スポット部の高さに応じて適宜設定することができる。   Next, the substrate is immersed in hydrofluoric acid, and the exposed glass surface is etched. The concentration and immersion time of hydrofluoric acid used at this time can be appropriately set according to the desired height of the protruding spot portion.

次に、前述と同様に、金およびクロム等のエッチングを行った後、ピラニア溶液および超純水によって基板を洗浄し、所望の形状の突出スポット部を有するガラス基板を得ることができる。
このガラス基板に、前述と同様に、クロムを蒸着し、次いで、金を蒸着することによって、突出部を有し、かつ、金被覆を有する基板を得ることができる。 Next, in the same manner as described above, after etching with gold, chromium, or the like, the substrate is washed with a piranha solution and ultrapure water to obtain a glass substrate having a projecting spot portion having a desired shape.
In the same manner as described above, chromium is vapor-deposited on this glass substrate, and then gold is vapor-deposited, whereby a substrate having protrusions and having a gold coating can be obtained.

前述の基板全体の大きさ、基板上の突出スポット部の数および集積度は特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、本発明では、１０〜２０，０００ｍｍ2の大きさの基板上に、突出スポット部を、１０〜５０，０００個程度有する基板を用いることができる。 The size of the entire substrate, the number of protruding spot portions on the substrate, and the degree of integration are not particularly limited, and can be set as appropriate. For example, in the present invention, a substrate having about 10 to 50,000 protruding spot portions on a substrate having a size of 10 to 20,000 mm 2 can be used.

本発明では、基板上に固定化された生体高分子が核酸であり、かつ、前記導電性物質表面を構成する導電性物質が金属である場合、プローブ核酸を基板上に固定化するために、基板上の導電性物質表面を構成する金属と反応性を有する基を一端に有する核酸を含む溶液を、スポッティング溶液として用いることができる。そのような基としては、チオール基を挙げることができる。チオール基を有する核酸鎖の金属表面への固定化は、公知の方法によって行うことができ、例えば、J.Am.Chem.Soc.1998,120,9787-9792を参照することができる。   In the present invention, when the biopolymer immobilized on the substrate is a nucleic acid and the conductive substance constituting the surface of the conductive substance is a metal, in order to immobilize the probe nucleic acid on the substrate, A solution containing a nucleic acid having a group reactive at one end with a metal constituting the surface of the conductive substance on the substrate can be used as a spotting solution. Such groups can include thiol groups. Immobilization of a nucleic acid chain having a thiol group on a metal surface can be performed by a known method, and for example, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 9787-9792 can be referred to.

金属表面へのＤＮＡの固定化方法としては、金属（表面酸化被膜を活性化させ水酸基を提示させたもの）に対して以下の処理を行う方法を用いることもできる。
（１）アミノシラン処理した基板表面に、ＵＶ照射することにより、ＤＮＡを固定化する。
（２）アミノシラン、NHS（N-ヒドロキシスクシンイミド）-ビオチン、アビジンによって順次処理した基板表面に、ビオチン化ＤＮＡを固定化する。
（３）アミノシラン、マレイミド-ビオチン、アビジンによって順次処理した基板表面に、ビオチン化DNAを固定化する。
（４）アミノシラン、次いでグルタルアルデヒドによって処理した基板表面に、アミノ化DNAを固定化する。
（５）アミノシラン、次いでカルボジイミドによって処理した基板表面に、アミノ化DNAを固定化する。
（６）アミノシラン処理した基板表面に、カルボキシ化DNAを固定化する。
（７）アミノシラン処理した基板表面に、リン酸化DNAを固定化する。
（８）アミノシラン、次いでNHS−マレイミド化合物によって処理した基板表面に、チオール化DNAを固定化する。
（９）エポキシシラン処理した基板表面に、アミノ化DNAを固定化する。
（１０）チオールシラン処理した基板表面に、チオール化DNAを固定化する。 As a method for immobilizing DNA on a metal surface, a method in which the following treatment is performed on a metal (a surface oxide film activated to present a hydroxyl group) can also be used.
(1) DNA is immobilized by irradiating UV on the aminosilane-treated substrate surface.
(2) Immobilize biotinylated DNA on the surface of a substrate that has been sequentially treated with aminosilane, NHS (N-hydroxysuccinimide) -biotin, and avidin.
(3) Immobilize biotinylated DNA on a substrate surface that has been sequentially treated with aminosilane, maleimide-biotin, and avidin.
(4) Aminated DNA is immobilized on the surface of a substrate treated with aminosilane and then with glutaraldehyde.
(5) Immobilize aminated DNA on the surface of a substrate treated with aminosilane and then carbodiimide.
(6) Immobilize carboxylated DNA on the substrate surface treated with aminosilane.
(7) Immobilize phosphorylated DNA on the aminosilane-treated substrate surface.
(8) Thiolated DNA is immobilized on the surface of a substrate treated with aminosilane and then NHS-maleimide compound.
(9) Immobilize the aminated DNA on the surface of the epoxysilane-treated substrate.
(10) Immobilize thiolated DNA on the substrate surface treated with thiolsilane.

また、ＤＮＡ以外の生体分子についても、上記のような、ＵＶ照射による固定化や、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、リン酸基などの官能基を介しての固定化が可能である。   In addition, biomolecules other than DNA can be immobilized by UV irradiation as described above, or via functional groups such as thiol groups, amino groups, carboxyl groups, and phosphate groups.

前記導電性物質表面への生体分子溶液のスポッティングは、常法により行うことができ、例えば、先端に生体分子溶液を保持したニードルを、基板表面の生体分子を固定化させたい位置に接触させることにより行うことができる。ここで、前記基板が突出スポット部を有する場合は、突出スポット部頂上のスポット用平面に接触させることにより、生体分子のスポッティングを行うことができる。ここで使用されるスポッティング用装置としては、例えば、特開２００１−４６０６２号公報および特開２００３−５７２３６号公報に記載の装置を挙げることができる。スポット量は、適宜調整することができ、前記基板が突出スポット部を有する場合は、スポット用平面から生体分子溶液が流れ出さないように、スポット用平面の大きさや、突出スポット部の高さに応じて、適宜設定することができる。   The spotting of the biomolecule solution on the surface of the conductive substance can be performed by a conventional method. For example, a needle holding the biomolecule solution at the tip is brought into contact with a position where the biomolecule on the substrate surface is to be immobilized. Can be performed. Here, when the substrate has a protruding spot portion, spotting of biomolecules can be performed by bringing the substrate into contact with a spot plane on the top of the protruding spot portion. Examples of the spotting device used here include the devices described in JP 2001-46062 A and JP 2003-57236 A. The spot amount can be adjusted as appropriate. When the substrate has a protruding spot portion, the size of the spot plane or the height of the protruding spot portion is set so that the biomolecule solution does not flow out of the spot plane. Accordingly, it can be set as appropriate.

本発明の第一の態様では、前記生体分子が固定化された基板表面に対向するように、電極（対向電極）を配置する。第一の態様の方法では、基板の導電性物質表面と対向電極との間に電圧を印加して電界を生じさせることにより、基板と対向電極との間に配置された溶液に含まれるターゲット生体分子が、基板側に選択的に移動して基板表面近傍に濃縮される。このようにターゲット生体分子を基板表面近傍に濃縮することにより、基板上に固定化された生体分子と、ターゲット生体分子との相互作用を促進することができる。   In the first aspect of the present invention, an electrode (counter electrode) is disposed so as to face the substrate surface on which the biomolecule is immobilized. In the method of the first aspect, a target living body contained in a solution disposed between the substrate and the counter electrode is generated by applying a voltage between the conductive material surface of the substrate and the counter electrode to generate an electric field. Molecules selectively move to the substrate side and are concentrated near the substrate surface. By concentrating the target biomolecule in the vicinity of the substrate surface in this way, the interaction between the biomolecule immobilized on the substrate and the target biomolecule can be promoted.

前記対向電極は、前記生体分子マイクロアレイと対向電極との間に電界を生じさせることができるものであれば、特に制限はない。前記対向電極は、電極全体が、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸化物、または導電性プラスチックからなるものであることができる。または、前記対向電極は、前記基板の導電性物質表面と対向する表面に、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸化物、または導電性プラスチックからなる導電性物質被覆層を有するものであることができる。本発明では、特に、前記対向電極が、例えば、ＩＴＯ（酸化インジウムスズ）、酸化スズなどの透明電極であれば、生体分子の相互作用中に、同時に、透明電極の上から、蛍光検出器等を用いて、生体分子の相互作用をリアルタイムで検出することができる。また、前記生体分子マイクロアレイを構成する基板が、光透過性のガラスやプラスチック上に、透明の導電性被覆層を設けたものである場合や、基板全体が透明の導電性物質からなる場合も、同様に、相互作用をリアルタイムで検出することができる。   The counter electrode is not particularly limited as long as it can generate an electric field between the biomolecule microarray and the counter electrode. In the counter electrode, the entire electrode may be made of gold, nickel, platinum, silver, titanium, aluminum, stainless steel, copper, chromium, conductive oxide, or conductive plastic. Alternatively, the counter electrode has a conductive surface made of gold, nickel, platinum, silver, titanium, aluminum, stainless steel, copper, chromium, conductive oxide, or conductive plastic on the surface of the substrate facing the conductive material surface. It can have an active material coating layer. In the present invention, in particular, if the counter electrode is a transparent electrode such as ITO (indium tin oxide) or tin oxide, during the interaction of biomolecules, simultaneously from above the transparent electrode, a fluorescence detector or the like Can be used to detect the interaction of biomolecules in real time. In addition, when the substrate constituting the biomolecule microarray is a transparent conductive coating layer on a light transmissive glass or plastic, or when the entire substrate is made of a transparent conductive material, Similarly, interactions can be detected in real time.

第一の態様の方法では、前記導電性物質表面と対向電極との間に、周波数０．０１〜１０Ｈｚで電圧を印加する。このように電圧を印加して導電性物質表面と対向電極との間に電界を発生させることによって、溶液中のターゲット生体分子が基板側に選択的に移動して濃縮され、生体分子間の反応効率が高まり、生体分子の相互作用を促進することができる。   In the method of the first aspect, a voltage is applied at a frequency of 0.01 to 10 Hz between the surface of the conductive material and the counter electrode. In this way, by applying a voltage to generate an electric field between the surface of the conductive material and the counter electrode, the target biomolecules in the solution selectively move to the substrate side and are concentrated, and the reaction between the biomolecules. Efficiency is increased and biomolecular interactions can be promoted.

第一の態様の方法において、基板の導電性物質表面と対向電極との間に印加する電圧の周波数は、０．０１〜１０Ｈｚである。周波数が０．０１Ｈｚ未満であると、一定時間内のターゲット生体分子を基板表面近傍に濃縮する回数が少なくなり、相互作用を促進させる効果が低下する。また、周波数が１０Ｈｚを超えると、ターゲット生体分子を含む溶液が電気分解して気泡が発生するおそれがある。前記周波数は、好ましくは０．０１〜１Ｈｚである。   In the method of the first aspect, the frequency of the voltage applied between the conductive material surface of the substrate and the counter electrode is 0.01 to 10 Hz. If the frequency is less than 0.01 Hz, the number of times the target biomolecules are concentrated in the vicinity of the substrate surface within a certain time is reduced, and the effect of promoting the interaction is reduced. If the frequency exceeds 10 Hz, the solution containing the target biomolecule may be electrolyzed to generate bubbles. The frequency is preferably 0.01 to 1 Hz.

基板の導電性物質表面と対向電極との間で印加する電圧は、０．１〜４Ｖであることが好ましい。電圧が上記範囲内であれば、電気分解や発熱の問題なく、生体分子の相互作用を促進することができる。前記電圧は、好ましくは１〜３Ｖである。   The voltage applied between the conductive material surface of the substrate and the counter electrode is preferably 0.1 to 4V. If the voltage is within the above range, the interaction of biomolecules can be promoted without electrolysis or heat generation. The voltage is preferably 1 to 3V.

前記ターゲット生体分子を含む溶液は、カチオンを含むことが好ましい。これは、以下の理由による。
高周波交流電圧の印加による誘電泳動によって、溶液中の生体分子を一方向に選択的に移動させようとする場合、溶液にカチオンが含まれていると、電圧印加によりカチオンが優先的に移動して生体分子が移動しない。
それに対して、本発明者らは、基板の導電性物質表面と対向電極との間に周波数０．０１〜１０Ｈｚで電圧を印加して電界を生じさせることにより、溶液がカチオンを含む場合でも、ターゲット生体分子を基板側に選択的に移動させて濃縮し、相互作用の反応効率を高めることができることを見出した。このように、溶液がカチオンを含む場合には、いわゆる電気浸透流(Electroosmotic Flow: EOF)により、溶液中でターゲット生体分子が移動すると考えられる。即ち、溶液がカチオンを含む場合には、電圧印加により溶液中のカチオンが移動し、そのカチオンの移動により生じた溶液の流れに伴いターゲット生体分子が移動することにより、ターゲット生体分子を基板側に選択的に移動させることができると考えられる。 The solution containing the target biomolecule preferably contains a cation. This is due to the following reason.
When a biomolecule in a solution is selectively moved in one direction by dielectrophoresis by applying a high-frequency alternating voltage, if the solution contains a cation, the cation moves preferentially by the voltage application. Biomolecules do not move.
In contrast, even when the solution contains cations by applying a voltage at a frequency of 0.01 to 10 Hz between the conductive material surface of the substrate and the counter electrode to generate an electric field, It was found that the target biomolecule can be selectively moved to the substrate side and concentrated to increase the reaction efficiency of the interaction. Thus, when a solution contains a cation, it is considered that a target biomolecule moves in the solution by so-called electroosmotic flow (EOF). That is, when the solution contains a cation, the cation in the solution is moved by applying a voltage, and the target biomolecule moves along with the flow of the solution generated by the movement of the cation, so that the target biomolecule is moved to the substrate side. It is thought that it can be moved selectively.

更に、例えば、生体分子として核酸を用いる場合、生体分子間の相互作用、即ち、ターゲット核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションの効率を高めるためには、ハイブリダイゼーション溶液にカチオンが含まれていることが好ましい。これは、カチオンの正の電荷により、核酸のリン酸基の負の電荷が打ち消され、プローブ核酸とターゲット核酸との反応性が高まるためである。よって、本発明において、ターゲット核酸溶液にカチオンを添加すれば、電圧印加によるハイブリダイゼーション促進効果に加えて、カチオンの効果によりハイブリダイゼーション効率を更に高めることができる。   Furthermore, for example, when using a nucleic acid as a biomolecule, a cation may be included in the hybridization solution in order to increase the interaction between the biomolecules, that is, the efficiency of hybridization between the target nucleic acid and the probe nucleic acid. preferable. This is because the negative charge of the phosphate group of the nucleic acid is canceled by the positive charge of the cation, and the reactivity between the probe nucleic acid and the target nucleic acid is increased. Therefore, in the present invention, if a cation is added to the target nucleic acid solution, the hybridization efficiency can be further enhanced by the effect of the cation in addition to the effect of promoting the hybridization by applying a voltage.

本発明において使用される電圧は、特に限定されず、サイン波交流電圧、矩形波交流電圧、定常波直流電圧、パルス波直流電圧などを用いることができる。直流電圧としては、パルス波直流電圧を用いることが好ましい。パルス波直流電圧を用いることにより、電圧の周期に合わせて周期的にターゲット生体分子を移動させ、生体分子の相互作用を効率的に促進することができる。電圧印加は、少なくとも基板表面が負に帯電するように電圧を印加する期間を含むように行うことが好ましく、直流電圧を使用する場合には、基板側が負に帯電するように電界を印加することが好ましい。これにより、溶液に含まれるカチオンが基板側に引き寄せられるため、カチオンの移動により生じた溶液流によって、ターゲット生体分子を基板側に選択的に移動させることができる。   The voltage used in the present invention is not particularly limited, and a sine wave AC voltage, a rectangular wave AC voltage, a standing wave DC voltage, a pulse wave DC voltage, or the like can be used. As the DC voltage, a pulse wave DC voltage is preferably used. By using the pulsed direct current voltage, the target biomolecule can be moved periodically according to the period of the voltage, and the interaction of the biomolecule can be efficiently promoted. The voltage application is preferably performed so as to include at least a period in which the voltage is applied so that the substrate surface is negatively charged. When a DC voltage is used, an electric field is applied so that the substrate side is negatively charged. Is preferred. As a result, the cations contained in the solution are attracted to the substrate side, so that the target biomolecule can be selectively moved to the substrate side by the solution flow generated by the movement of the cations.

第一の態様の方法は、前記導電性物質表面と対向電極との間に電圧が印加されていない間、ターゲット生体分子を含む溶液を攪拌する操作を行うことが好ましい。例えば、パルス直流電圧を印加する場合、電圧印加の周期の間（電圧印加が行われていない間）に溶液を攪拌することができる。このように、電圧を印加しない間に溶液を攪拌することにより、電圧印加により基板側に移動したカチオンを溶液内に拡散させることができる。その後、次の電圧印加が行われれば、溶液内に拡散したカチオンの移動に伴い、ターゲット生体分子を基板側に選択的に移動させることができる。このように、電圧の印加と溶液の攪拌を繰り返すことによって、ターゲット生体分子を基板側へ順次移動させて基板表面近傍に効率的に濃縮することができる。
溶液の攪拌方法としては、例えば、反応槽全体をロータリーオーブンで回転させる方法、チャンバー内につながる送液口を設け、送液口とペリスタポンプ、ロータリーポンプ等のポンプをチューブでつなぎ、チャンバー内の溶液を往復攪拌する方法を用いることができる。 In the method of the first aspect, it is preferable to perform an operation of stirring the solution containing the target biomolecule while no voltage is applied between the surface of the conductive material and the counter electrode. For example, when a pulsed DC voltage is applied, the solution can be stirred during the period of voltage application (while no voltage is applied). Thus, by stirring the solution while no voltage is applied, the cations that have moved to the substrate side due to the voltage application can be diffused into the solution. Then, if the next voltage application is performed, a target biomolecule can be selectively moved to the substrate side with the movement of the cation diffused in the solution. In this way, by repeating the application of voltage and stirring of the solution, the target biomolecules can be sequentially moved to the substrate side and efficiently concentrated near the substrate surface.
Examples of the stirring method of the solution include, for example, a method in which the entire reaction vessel is rotated by a rotary oven, a liquid supply port connected to the chamber is provided, and a pump such as a liquid supply port and a peristaltic pump or a rotary pump is connected by a tube, and the solution in the chamber Can be used.

前記カチオンは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、およびアルミニウムイオンからなる群から選ばれる少なくとも一種であることができる。上記カチオンの中で好ましいものは、ナトリウムイオンおよびマグネシウムイオンである。   The cation may be at least one selected from the group consisting of sodium ion, potassium ion, lithium ion, magnesium ion, calcium ion, and aluminum ion. Among the above cations, sodium ions and magnesium ions are preferable.

溶液中のカチオン濃度は、印加する電圧の種類や周波数等を考慮して、相互作用に最適な濃度に設定することが好ましく、例えば、１〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜５００ｍＭとすることができる。   The cation concentration in the solution is preferably set to an optimum concentration for the interaction in consideration of the type of voltage to be applied, the frequency, and the like, and can be set to 1 to 1000 mM, preferably 10 to 500 mM, for example.

ターゲット生体分子を含む溶液は、バッファーを含むことができる。バッファーとしては、中性域のｐＨの緩衝能を有するものを用いることが好ましいが、これに限定されるものではない。具体的には、バッファーとしては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーを用いることができる。   The solution containing the target biomolecule can contain a buffer. As the buffer, it is preferable to use a buffer having a neutral pH buffering ability, but is not limited thereto. Specifically, for example, a Tris-HCl buffer can be used as the buffer.

ターゲット生体分子を含む溶液の温度は、相互作用に適した温度にすることが好ましく、例えば、常温（例えば２０℃程度）〜７０℃とすることができる。ターゲット生体分子を含む溶液の温度を制御するために、ヒーター等の温度制御手段を用いることもできる。なお、過度に高い電圧を使用すると、発熱により溶液温度が高温になるため、温度制御を厳密に行う必要が生じる場合がある。それに対し、第一の態様の方法は、比較的低電圧により相互作用促進効果が得られるため、厳密な温度制御手段を使用しなくても実施できるという利点がある。   The temperature of the solution containing the target biomolecule is preferably a temperature suitable for interaction, and can be, for example, normal temperature (for example, about 20 ° C.) to 70 ° C. In order to control the temperature of the solution containing the target biomolecule, temperature control means such as a heater can also be used. If an excessively high voltage is used, the solution temperature becomes high due to heat generation, and thus it may be necessary to strictly control the temperature. On the other hand, the method of the first aspect has an advantage that it can be carried out without using a strict temperature control means, because an interaction promoting effect can be obtained by a relatively low voltage.

前記基板と対向電極との間には、生体分子が固定化された領域が覆われないように、非導電性材料からなるスペーサーを挟むことができる。このように、基板と対向電極との間に非導電性スペーサーを配置し、基板、対向電極、および非導電性スペーサーによって囲まれた空間に、ターゲット生体分子を含む溶液を充填することができる。前記非導電性材料としては、例えば、シリコン、ゴム、ガラス、プラスチックを挙げることができる。本発明では、このスペーサーの厚さにより、基板と対向電極との距離を設定することができる。前記基板と対向電極との距離は、電界印加による生体分子の相互作用促進効果が得られる範囲で適宜設定することができ、例えば、３０〜５００μｍとすることができる。   A spacer made of a non-conductive material can be sandwiched between the substrate and the counter electrode so that the region where the biomolecule is immobilized is not covered. In this way, a non-conductive spacer is disposed between the substrate and the counter electrode, and a space surrounded by the substrate, the counter electrode, and the non-conductive spacer can be filled with the solution containing the target biomolecule. Examples of the non-conductive material include silicon, rubber, glass, and plastic. In the present invention, the distance between the substrate and the counter electrode can be set by the thickness of the spacer. The distance between the substrate and the counter electrode can be appropriately set within a range in which the effect of promoting the interaction of biomolecules by applying an electric field can be obtained, and can be set to, for example, 30 to 500 μm.

前記非導電性スペーサーは、その両面に接着剤層を有することができ、接着剤層によって、基板と対向電極とを張り合わせることができる。前記接着剤層の接着剤は、光硬化性樹脂を含むことが好ましい。光硬化性樹脂は、光を照射することによって硬化して接着力を失うため、前記接着剤が光硬化性樹脂を含むことにより、光照射すれば、非導電性スペーサーから基板と対向電極をはずすことができる。光硬化性樹脂としては、例えば紫外線硬化型樹脂などの公知の光硬化性樹脂を用いることができる。   The non-conductive spacer can have an adhesive layer on both surfaces thereof, and the substrate and the counter electrode can be bonded together by the adhesive layer. It is preferable that the adhesive of the adhesive layer contains a photocurable resin. Since the photo-curing resin is cured by irradiating light and loses its adhesive force, the adhesive contains the photo-curing resin, so that the substrate and the counter electrode are removed from the non-conductive spacer when irradiated with light. be able to. As the photocurable resin, for example, a known photocurable resin such as an ultraviolet curable resin can be used.

前記相互作用は、対向電極が透明電極である場合には、対向電極を通してリアルタイムで検出することができる。また、前述のように、マイクロアレイを構成する基板が、光透過性のガラスやプラスチック上に、透明の導電性被覆層を設けた基板である場合や、基板全体が透明の導電性物質からなる場合には、基板側からのリアルタイム検出も可能である。相互作用の検出方法としては、蛍光検出器、共焦点検出器、共焦点レーザ蛍光顕微鏡、蛍光顕微鏡を用いる方法を挙げることができる。蛍光検出器により生体分子間の相互作用を検出するために、ターゲット生体分子は、蛍光標識されていることが好ましい。ターゲット生体分子の蛍光標識は、公知の方法で行うことができる。また、本発明では、基板表面に固定化されている生体分子が、蛍光標識されていてもよい。基板に固定される生体分子の蛍光標識も、公知の方法で行うことができる。   The interaction can be detected in real time through the counter electrode when the counter electrode is a transparent electrode. In addition, as described above, the substrate constituting the microarray is a substrate in which a transparent conductive coating layer is provided on light transmissive glass or plastic, or the entire substrate is made of a transparent conductive material. In addition, real-time detection from the substrate side is also possible. Examples of the detection method of the interaction include a method using a fluorescence detector, a confocal detector, a confocal laser fluorescence microscope, and a fluorescence microscope. In order to detect an interaction between biomolecules with a fluorescence detector, the target biomolecule is preferably fluorescently labeled. Fluorescent labeling of the target biomolecule can be performed by a known method. In the present invention, the biomolecule immobilized on the substrate surface may be fluorescently labeled. Fluorescent labeling of biomolecules immobilized on the substrate can also be performed by a known method.

更に、前述のように、突出スポット部を有する基板を用いる場合には、生体分子間の相互作用を、共焦点型検出器によって検出することができる。共焦点型検出器による反射光および蛍光の検出原理については、前述の通りである。突出スポット部を有する基板を用いる場合、共焦点型検出器を用いて、前述の原理で反射像によってスポットの大きさおよび位置を特定することで、自動グリッティングを行うことができる。即ち、マイクロアレイ表面の突出スポット部とそれ以外の部分の高さおよび／または形状の差による反射光強度の相違から、マイクロアレイ上の突出スポット部を、反射像として検出することができる。更に、共焦点型検出器によって、マイクロアレイからの蛍光を検出するときに、マイクロアレイ上の突出スポット部頂上のスポット平面の高さに、共焦点型検出器の焦点を合わせれば、突出スポット部からの蛍光、即ち、スポット平面上の蛍光標識された生体分子（スポットに固定化された生体分子および／またはターゲット生体分子）からの蛍光を選択的に検出して、スポットに対応する蛍光像を得ることができる。こうして得られた反射像と蛍光像を重ね合わせることによって、マイクロアレイ上の相互作用が起こっているスポットを特定することができ、その蛍光強度により、相互作用の程度を測定することができる。なお、本発明では、二本鎖核酸を特異的に染色する蛍光インターカレーターを用いて、インターカレーターからの蛍光を測定することによって相互作用を検出することもできる。   Further, as described above, when a substrate having a protruding spot portion is used, an interaction between biomolecules can be detected by a confocal detector. The principle of detection of reflected light and fluorescence by the confocal detector is as described above. When a substrate having a protruding spot portion is used, automatic fitting can be performed by using a confocal detector and specifying the size and position of the spot from the reflected image according to the principle described above. That is, the protruding spot portion on the microarray can be detected as a reflected image from the difference in reflected light intensity due to the height and / or shape difference between the protruding spot portion on the surface of the microarray and the other portion. Furthermore, when detecting the fluorescence from the microarray by the confocal detector, if the confocal detector is focused on the height of the spot plane on the top of the protruding spot on the microarray, Fluorescence, that is, fluorescence from a fluorescently labeled biomolecule (a biomolecule immobilized on the spot and / or a target biomolecule) on the spot plane is selectively detected to obtain a fluorescent image corresponding to the spot Can do. By superimposing the reflection image and the fluorescence image obtained in this way, the spot where the interaction occurs on the microarray can be specified, and the degree of the interaction can be measured by the fluorescence intensity. In the present invention, the interaction can also be detected by measuring the fluorescence from the intercalator using a fluorescent intercalator that specifically stains the double-stranded nucleic acid.

特に、本発明では、反射光と蛍光とを同時に検出することができる共焦点型蛍光スキャナーを用いることが好ましい。そのような装置の一例を、図６に示す。図６に示す装置では、励起光源（レーザー）２１から発生した励起光はミラー２２、ダイクロックミラーミラー２３、ミラー２６、対物レンズ２４、を介して試料（マイクロアレイ）２５に照射される。反射光は対物レンズ２４、ミラー２６、ダイクロックミラー２３（反射光の一部を透過（数パーセント以下））、ダイクロックミラー２７、減光フィルター２８、検出レンズ２９、ピンホール３０を介して反射光検出部３１に導かれる。蛍光は２つのダイクロックミラー２３、２７を透過し、ミラー３２にて反射しカットフィルター３３、検出レンズ３４、ピンホール３５を介して蛍光検出部３６に導かれる。このような装置によれば、マイクロアレイ表面の突出スポット部とそれ以外の部分の高さおよび／または形状の差による反射光強度の相違から、マイクロアレイ上の突出スポット部を反射像として検出し、同時に、そのスポットからの蛍光を検出することによって、生体分子の相互作用を検出することができる。   In particular, in the present invention, it is preferable to use a confocal fluorescent scanner that can simultaneously detect reflected light and fluorescence. An example of such a device is shown in FIG. In the apparatus shown in FIG. 6, excitation light generated from an excitation light source (laser) 21 is applied to a sample (microarray) 25 through a mirror 22, a dichroic mirror 23, a mirror 26, and an objective lens 24. The reflected light is reflected through the objective lens 24, mirror 26, dichroic mirror 23 (transmits part of the reflected light (a few percent or less)), dichroic mirror 27, neutral density filter 28, detection lens 29, and pinhole 30. Guided to the light detection unit 31. The fluorescence passes through the two dichroic mirrors 23 and 27, is reflected by the mirror 32, and is guided to the fluorescence detection unit 36 through the cut filter 33, the detection lens 34, and the pinhole 35. According to such an apparatus, the projected spot on the microarray is detected as a reflected image from the difference in reflected light intensity due to the difference in height and / or shape between the projected spot on the surface of the microarray and the other part, and at the same time, The interaction of biomolecules can be detected by detecting the fluorescence from the spot.

本発明の第二の態様は、
少なくとも一部に導電性物質表面を有する基板と、前記導電性物質表面と対向する電極（対向電極）との間に配置された溶液に含まれる生体分子を移動させる方法であって、
前記導電性物質表面と対向電極との間に、周波数０．０１〜１０Ｈｚで電圧を印加して、前記基板または対向電極に向けて前記生体分子を移動させることを特徴とする方法
である。
第二の態様において使用される基板、対向電極、生体分子、印加電界等の詳細は、先に第一の態様について述べた通りである。 The second aspect of the present invention is:
A method of moving biomolecules contained in a solution disposed between a substrate having a conductive material surface at least in part and an electrode (counter electrode) facing the conductive material surface,
A method is characterized in that a voltage is applied at a frequency of 0.01 to 10 Hz between the surface of the conductive substance and the counter electrode to move the biomolecule toward the substrate or the counter electrode.
The details of the substrate, counter electrode, biomolecule, applied electric field, etc. used in the second embodiment are as described for the first embodiment.

第二の態様の方法は、基板側に生体分子を選択的に移動させて基板表面近傍に濃縮するために用いることができ、または、対向電極側に生体分子を選択的に移動させて対向電極表面近傍に濃縮するために用いることができる。   The method of the second aspect can be used to selectively move the biomolecule to the substrate side and concentrate it near the surface of the substrate, or to selectively move the biomolecule to the counter electrode side and counter electrode It can be used to concentrate near the surface.

更に、第二の態様の方法は、核酸の配列を検知するために用いることができる。例えば、前述の第一の態様の方法を用いて生体分子を相互作用させると、プローブ核酸と完全相補のターゲット核酸は、プローブ核酸と強固に相互作用する。それに対し、例えば、プローブ核酸と一部の配列がミスマッチなターゲット核酸は、プローブ核酸との相互作用が弱いため、逆向きに電界を印加すると、プローブ核酸から離れて対向電極側に移動する。このようにして、第二の態様の方法によれば、完全相補配列からの塩基配列の違い、例えば、一塩基多型（SNP）を検出することができる。   Furthermore, the method of the second aspect can be used to detect the sequence of a nucleic acid. For example, when a biomolecule is allowed to interact using the method of the first aspect described above, the target nucleic acid that is completely complementary to the probe nucleic acid strongly interacts with the probe nucleic acid. On the other hand, for example, a target nucleic acid whose probe nucleic acid and a part of the sequence are mismatched has a weak interaction with the probe nucleic acid. Therefore, when an electric field is applied in the opposite direction, it moves away from the probe nucleic acid and moves to the counter electrode side. Thus, according to the method of the second aspect, a difference in base sequence from a completely complementary sequence, for example, a single nucleotide polymorphism (SNP) can be detected.

以下、本発明を実施例によって更に説明する。

実施例１ 印加電圧の周波数と核酸濃縮との関係
表面に金をコートしたＤＮＡマイクロアレイ基板に、核酸溶液が入るように、両面接着性フィルムの中央をカットしたものを基板表面に貼付し、その上にＩＴＯ電極を電極面が基板と対向するように、貼り付けた。溶液が入る部分は、チャンバーとなるように作製してあり、接着性フィルムの一部から溶液が注入できるようになっている。装置の概略図を図７に示す。図７に示す装置のチャンバーに充填する核酸溶液として、０．１μＭ Ｃｙ３標識オリゴＤＮＡ （４５ｍｅｒ）、４０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．３）、４ ｍＭ ＥＤＴＡ、４００ ｍＭ ＮａＣｌを用いた。この核酸溶液を上記のチャンバー内に充填し、基板表面とＩＴＯ電極を交流電圧発生装置のそれぞれの極の端子と接続し、３Ｖｐ−ｐの電圧で、サイン波の交流電圧を１０Ｈｚから、０．０１Ｈｚまで周波数を変えながら、印加した。図８のグラフで、矢印の位置が、それぞれの周波数を印加、または周波数を変えたポイントである。グラフのカーブは、共焦点レーザ蛍光顕微鏡により、アレイ表面近傍の核酸分子の量を蛍光標識の蛍光強度として測定したものである。蛍光強度が強いほど、アレイ表面近傍に核酸分子が濃縮されたことを意味する。本条件下では、特に、周波数０．１ Ｈｚ、０．０１ Ｈｚの場合に、印加電圧の周期に合わせた蛍光強度の増加、即ち、核酸の濃縮が観察された。 Hereinafter, the present invention will be further described by way of examples.

Example 1 Relationship between Frequency of Applied Voltage and Nucleic Acid Concentration A DNA microarray substrate coated with gold on the surface was affixed to the substrate surface with a double-sided adhesive film cut at the center so that the nucleic acid solution could enter. The ITO electrode was attached to the substrate so that the electrode surface was opposed to the substrate. The part into which the solution enters is made to be a chamber, and the solution can be injected from a part of the adhesive film. A schematic diagram of the apparatus is shown in FIG. As a nucleic acid solution filled in the chamber of the apparatus shown in FIG. 7, 0.1 μM Cy3-labeled oligo DNA (45mer), 40 mM Tris-HCl (pH 8.3), 4 mM EDTA, 400 mM NaCl was used. The nucleic acid solution is filled in the above chamber, the substrate surface and the ITO electrode are connected to the terminals of the respective electrodes of the AC voltage generator, and the AC voltage of the sine wave is changed from 10 Hz to 0. 3 Vp-p. Application was performed while changing the frequency to 01 Hz. In the graph of FIG. 8, the position of the arrow is a point where each frequency is applied or the frequency is changed. The curve in the graph is obtained by measuring the amount of nucleic acid molecules near the surface of the array as the fluorescence intensity of the fluorescent label with a confocal laser fluorescence microscope. Higher fluorescence intensity means that nucleic acid molecules are concentrated near the surface of the array. Under these conditions, particularly when the frequencies were 0.1 Hz and 0.01 Hz, an increase in fluorescence intensity in accordance with the period of the applied voltage, that is, concentration of nucleic acid was observed.

実施例２ 印加電圧の波形と核酸濃縮との関係
次に実施例１と同様の装置を用いて、印加電圧の波形パターンをサイン波および矩形波にして、電圧のカーブと核酸濃縮との関係を調べた。実施例１と同様に、核酸溶液として、０．１μＭ Ｃｙ３標識オリゴＤＮＡ （４５ｍｅｒ）、４０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．３）、４ ｍＭ ＥＤＴＡ、４００ ｍＭ ＮａＣｌを用いた。印加電圧は、３Ｖｐ−ｐとし、サイン波および矩形波で交流電圧を印加した。図９に結果を示す。図９に示すように、どちらの波形でも、電圧波形に応じた蛍光強度の増加が観察された。これにより、電圧印加により基板表面近傍に核酸が効率的に濃縮でき、また、波形の種類によらず、基板表面が負電荷を帯びたときに、核酸が基板表面近傍に集まり、濃縮されることが判明した。 Example 2 Relationship between Applied Voltage Waveform and Nucleic Acid Concentration Next, using the same apparatus as in Example 1, the applied voltage waveform pattern was changed to a sine wave and a rectangular wave, and the relationship between the voltage curve and nucleic acid concentration was determined. Examined. As in Example 1, 0.1 μM Cy3-labeled oligo DNA (45mer), 40 mM Tris-HCl (pH 8.3), 4 mM EDTA, 400 mM NaCl was used as the nucleic acid solution. The applied voltage was 3 Vp-p, and an alternating voltage was applied as a sine wave and a rectangular wave. FIG. 9 shows the result. As shown in FIG. 9, an increase in fluorescence intensity corresponding to the voltage waveform was observed in both waveforms. This makes it possible to efficiently concentrate nucleic acids near the substrate surface by applying a voltage, and to collect and concentrate nucleic acids near the substrate surface when the substrate surface is negatively charged regardless of the type of waveform. There was found.

実施例３ パルス直流電圧による核酸の濃縮
次に実施例１と同様の装置を用いて、アレイ表面が負電荷を帯びるように、パルス直流電圧を印加した。核酸溶液は、実施例１と同様のものを用いた。−２Ｖの電圧を０．１Ｈｚの周期で、１秒間ずつ印加した。図１０に結果を示す。図１０に示すように、電圧の周期に合わせて蛍光強度の増加が見られた。これにより、パルス直流電圧の印加により、電圧の周期に合わせて核酸が濃縮されることが確認された。また、この結果によっても、負電荷をアレイ表面に印加することにより、ターゲット核酸が濃縮されることが示された。さらに、−２Ｖの電圧を０．１Ｈｚ（１ｓ印加）、１Ｈｚ（０．１ｓ 印加）、１０Ｈｚ（０．０１ｓ 印加）の周期で印加して、核酸濃縮の様子を観察した。その結果、図１１に示すように、いずれの場合にも、電圧の周期に合わせて蛍光強度が増加した。これにより、電圧印加によって負に帯電した基板側へ核酸が移動して基板表面近傍に核酸が濃縮されることが確認された。また、周波数０．１ Ｈｚの場合に最も蛍光強度が強く、周波数が高くなるにつれ、蛍光強度は低くなった。これにより、本条件下では、周波数０．１Ｈｚの場合に、核酸濃縮効果が最も顕著に得られることがわかる。 Example 3 Nucleic Acid Concentration by Pulsed DC Voltage Next, using the same apparatus as in Example 1, a pulsed DC voltage was applied so that the array surface was negatively charged. The same nucleic acid solution as in Example 1 was used. A voltage of −2 V was applied for 1 second with a period of 0.1 Hz. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 10, an increase in fluorescence intensity was observed in accordance with the voltage cycle. Thereby, it was confirmed that the application of the pulsed DC voltage enriches the nucleic acid in accordance with the voltage cycle. This result also showed that the target nucleic acid was concentrated by applying a negative charge to the array surface. Furthermore, a voltage of −2 V was applied at a period of 0.1 Hz (1 s applied), 1 Hz (0.1 s applied), and 10 Hz (0.01 s applied) to observe the state of nucleic acid concentration. As a result, as shown in FIG. 11, in any case, the fluorescence intensity increased in accordance with the voltage cycle. As a result, it was confirmed that the nucleic acid moved to the negatively charged substrate side by voltage application and concentrated in the vicinity of the substrate surface. In addition, the fluorescence intensity was strongest when the frequency was 0.1 Hz, and the fluorescence intensity decreased as the frequency increased. This shows that the nucleic acid concentration effect is most prominently obtained at a frequency of 0.1 Hz under this condition.

実施例４ パルス直流電圧印加によるハイブリダイゼーションの促進
実施例１で用いたＤＮＡマイクロアレイ基板に、２種のプローブＤＮＡ（ＧＡＰＤＨ、ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ）溶液を等濃度でそれぞれ１０点ずつスタンプし、スタンプ後処理として基板を６００ｍＪ／ｃｍ2でＵＶ照射し、ＭＱＷで５分間２回洗浄した後乾燥させた。プローブＤＮＡは、５’側にアレイ用リンカー（日清紡績（株））修飾を施したものを使用した。以下、ＧＡＰＤＨ由来のプローブＤＮＡをスタンプしたスポットを、ＧＡＰＤＨスポット、ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ由来のプローブＤＮＡをスタンプしたスポットを、ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎスポットと呼ぶ。
ターゲットＤＮＡ溶液として、０．０１μＭの濃度の ５’末端Ｃｙ３蛍光標識−オリゴＤＮＡ（ＧＡＰＤＨと相補的な配列；溶液は、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、４ ｍＭ ＥＤＴＡ、４００ ｍＭ ＮａＣｌ）を用いた。実施例３と同様の装置、同様の電圧印加条件にて、ハイブリダイゼーションを行った。比較として、電圧を印加しない条件でもハイブリダイゼーションを行った。共焦点レーザ蛍光顕微鏡により、ハイブリダイゼーション反応の過程でのスポット上の蛍光強度の変化をリアルタイムに計測した結果を、図１２に示す。ターゲットＤＮＡと相補的な配列を有するプローブＤＮＡを含むＧＡＰＤＨスポットは、電圧を印加した場合、非印加の場合に比べ、蛍光強度が急激に増加し、ハイブリダイゼーション反応の速度が、２０倍以上に促進された。それに対して、ターゲットＤＮＡと相補的な配列を有するプローブＤＮＡを含まないｂｅｔａ−ａｃｔｉｎスポットでは、経時的な蛍光強度の増加は観察されなかった。これは、ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎスポットでは、電圧を印加しても非特異的な吸着が起こらなかったことを示している。１０分間ハイブリダイゼーション反応を行った後、２ｘＳＳＣ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、１ｘＳＳＣ、０．２ｘＳＳＣで順次洗浄を行い、その後、マイクロアレイスキャナーで画像を取得した（図１３）。比較のために、１６時間電圧を印加せずにハイブリダイゼーションを行い、同様にスキャナーで画像を取得した。その結果、１０分間反応させた場合、電圧を印加した場合には、電圧を印加しなかった場合と比べて、約１３倍蛍光強度が増加した。これは、電圧印加によりハイブリダイゼーション反応が高感度化されたことを示す。さらに、電圧印加による１０分間の反応後、電圧を印加せずに１６時間反応させた場合と比べても、約６倍蛍光強度が増加した。このように、本発明の方法により、ハイブリダイゼーション反応の高速化および高感度化が達成された。
実施例４において使用した２種のプローブＤＮＡの配列を以下に示す。 Example 4 Promotion of Hybridization by Applying Pulsed DC Voltage Two types of probe DNA (GAPDH, beta-actin) solutions were stamped at 10 concentrations each at the same concentration on the DNA microarray substrate used in Example 1, and stamp post-treatment The substrate was irradiated with UV at 600 mJ / cm 2 , washed twice with MQW for 5 minutes and then dried. The probe DNA used was modified with an array linker (Nisshinbo Industries, Ltd.) on the 5 ′ side. Hereinafter, a spot stamped with a GAPDH-derived probe DNA is called a GAPDH spot, and a spot stamped with a beta-actin-derived probe DNA is called a beta-actin spot.
As a target DNA solution, 5′-end Cy3 fluorescently labeled oligo DNA (sequence complementary to GAPDH; solution is 40 mM Tris HCl (pH 8.3), 4 mM EDTA, 400 mM NaCl) at a concentration of 0.01 μM. Using. Hybridization was performed using the same apparatus and the same voltage application conditions as in Example 3. For comparison, hybridization was performed even under the condition where no voltage was applied. FIG. 12 shows the result of measuring in real time the change in fluorescence intensity on the spot during the hybridization reaction using a confocal laser fluorescence microscope. The GAPDH spot containing the probe DNA having a sequence complementary to the target DNA increases the fluorescence intensity more rapidly when the voltage is applied than when no voltage is applied, and the speed of the hybridization reaction is increased by 20 times or more. It was done. On the other hand, in the beta-actin spot not containing the probe DNA having a sequence complementary to the target DNA, increase in fluorescence intensity over time was not observed. This indicates that non-specific adsorption did not occur in the beta-actin spot even when a voltage was applied. After performing a hybridization reaction for 10 minutes, washing was performed sequentially with 2 × SSC + 0.1% Tween 20, 1 × SSC, and 0.2 × SSC, and then an image was obtained with a microarray scanner (FIG. 13). For comparison, hybridization was performed without applying a voltage for 16 hours, and an image was similarly acquired with a scanner. As a result, when the reaction was carried out for 10 minutes, when the voltage was applied, the fluorescence intensity increased about 13 times as compared with the case where the voltage was not applied. This indicates that the sensitivity of the hybridization reaction has been increased by applying a voltage. Furthermore, after a reaction for 10 minutes by applying a voltage, the fluorescence intensity increased about 6 times compared to the case of reacting for 16 hours without applying a voltage. As described above, the speed of the hybridization reaction and high sensitivity were achieved by the method of the present invention.
The sequences of the two types of probe DNA used in Example 4 are shown below.

実施例５ 低周波交流電圧印加によるタンパク分子の濃縮
実施例１と同様の装置を用いて、低周波交流電圧印加によるタンパク分子の濃縮について調べた。タンパク分子溶液として、１μＭ Ｃｙ３標識ストレプトアビジン、４０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．３）、４ｍＭ ＥＤＴＡ、４００ｍＭ ＮａＣｌを用いた。印加電圧は、３Ｖｐ−ｐとして０．１Ｈｚの交流電圧を印加した。結果を図１４に示す。図１４に示すように、生体分子としてタンパク分子を用いた場合にも、電圧波形に応じた蛍光強度の増加を示し、電圧印加によりタンパク分子が基板表面近傍に濃縮されることが確認された。また、本実施例でも、基板側が負に帯電したときに、タンパク分子の移動、濃縮が観察された。 Example 5 Concentration of protein molecules by application of low-frequency AC voltage Using the same apparatus as in Example 1, the concentration of protein molecules by application of low-frequency AC voltage was examined. As a protein molecule solution, 1 μM Cy3-labeled streptavidin, 40 mM Tris-HCl (pH 8.3), 4 mM EDTA, 400 mM NaCl was used. As the applied voltage, an AC voltage of 0.1 Hz was applied as 3 Vp-p. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 14, even when protein molecules were used as biomolecules, the fluorescence intensity increased according to the voltage waveform, and it was confirmed that protein molecules were concentrated in the vicinity of the substrate surface by voltage application. Also in this example, movement and concentration of protein molecules were observed when the substrate side was negatively charged.

本発明によれば、生体分子の相互作用の高速化、高感度化を達成することができる。   According to the present invention, high-speed and high-sensitivity interaction of biomolecules can be achieved.

共焦点型検出器の光学系の概略図を示す。The schematic of the optical system of a confocal type | mold detector is shown. 本発明において使用される基板の一例を示す。An example of the board | substrate used in this invention is shown. 基板上の突出スポット部の概略図を示す。The schematic of the protrusion spot part on a board | substrate is shown. 略Ｖ字型底面を有する基板の一部の拡大図を示す。FIG. 2 shows an enlarged view of a part of a substrate having a substantially V-shaped bottom surface. 粗面化されたスポット用平面の一例（部分拡大図）を示す。An example (partial enlarged view) of a roughened spot plane is shown. 反射光と蛍光とを同時に検出することができる共焦点型蛍光スキャナーの光学系の概略図を示す。1 shows a schematic diagram of an optical system of a confocal fluorescent scanner that can simultaneously detect reflected light and fluorescence. FIG. 実施例１で使用した装置の概略図を示す。The schematic of the apparatus used in Example 1 is shown. 実施例１で得られた結果（印加電圧の周波数と核酸濃縮との関係）を示す。The result (relationship between the frequency of an applied voltage and nucleic acid concentration) obtained in Example 1 is shown. 実施例２で得られた結果（印加電圧の波形と核酸濃縮との関係）を示す。The result (relationship between the waveform of an applied voltage and nucleic acid concentration) obtained in Example 2 is shown. 実施例３で得られた結果を示す。The result obtained in Example 3 is shown. 実施例３で得られた結果を示す。The result obtained in Example 3 is shown. 実施例４で得られた結果を示す。The result obtained in Example 4 is shown. 実施例４で得られたマイクロアレイアレイスキャナーによる画像を示す。The image by the microarray array scanner obtained in Example 4 is shown. 実施例５で得られた結果を示す。The result obtained in Example 5 is shown.

Claims (15)

基板表面に生体分子が固定化されたスポットを１つ以上有する生体分子マイクロアレイと、前記基板表面と対向する電極（以下、「対向電極」という）との間にターゲット生体分子を含む溶液を配置し、前記基板表面に固定化された生体分子とターゲット生体分子とを相互作用させる方法であって、
前記マイクロアレイは、生体分子が固定化された面の少なくとも一部に導電性物質表面を有し、
前記導電性物質表面と対向電極との間に、周波数０．０１〜１０Ｈｚで電圧を印加して、前記相互作用を促進することを特徴とする、前記方法。 A solution containing the target biomolecule is disposed between a biomolecule microarray having one or more spots having biomolecules immobilized on the substrate surface and an electrode facing the substrate surface (hereinafter referred to as “counter electrode”). , A method of interacting a biomolecule immobilized on the substrate surface and a target biomolecule,
The microarray has a conductive material surface on at least a part of a surface on which a biomolecule is immobilized,
The method described above, wherein a voltage is applied at a frequency of 0.01 to 10 Hz between the surface of the conductive material and the counter electrode to promote the interaction. 少なくとも一部に導電性物質表面を有する基板と、前記導電性物質表面と対向する電極（以下、「対向電極」という）との間に配置された溶液に含まれる生体分子を移動させる方法であって、
前記導電性物質表面と対向電極との間に、周波数０．０１〜１０Ｈｚで電圧を印加して、前記基板または対向電極に向けて前記生体分子を移動させることを特徴とする方法。 This is a method for moving biomolecules contained in a solution disposed between a substrate having a conductive material surface at least partially and an electrode facing the conductive material surface (hereinafter referred to as “counter electrode”). And
A method of applying a voltage at a frequency of 0.01 to 10 Hz between the surface of the conductive material and the counter electrode to move the biomolecule toward the substrate or the counter electrode. 前記電圧が０．１〜４Ｖである、請求項１または２に記載の方法。 The method according to claim 1 or 2, wherein the voltage is 0.1 to 4V. 前記溶液は、カチオンを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the solution contains a cation. 前記カチオンは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、およびアルミニウムイオンからなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項４に記載の方法。 The method according to claim 4, wherein the cation is at least one selected from the group consisting of sodium ion, potassium ion, lithium ion, magnesium ion, calcium ion, and aluminum ion. 前記溶液中のカチオン濃度は、１〜１０００ｍＭの範囲である、請求項４または５に記載の方法。 The method according to claim 4 or 5, wherein the cation concentration in the solution is in the range of 1-1000 mM. 前記電圧は、パルス直流電圧である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the voltage is a pulsed DC voltage. 少なくとも前記基板表面が負に帯電するように電圧を印加することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 The method according to claim 1, comprising applying a voltage so that at least the substrate surface is negatively charged. 前記基板は、基板全体が導電性物質からなるか、または、基板表面に導電性物質被覆層を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the entire substrate is made of a conductive material, or has a conductive material coating layer on a surface of the substrate. 前記導電性物質は、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸化物、または導電性プラスチックである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the conductive substance is gold, nickel, platinum, silver, titanium, aluminum, stainless steel, copper, chromium, a conductive oxide, or a conductive plastic. . 前記対向電極は、電極全体が、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸化物、または導電性プラスチックからなるか、または、前記基板の導電性物質表面と対向する表面に、金、ニッケル、白金、銀、チタン、アルミニウム、ステンレス、銅、クロム、導電性酸化物、または導電性プラスチックからなる導電性物質被覆層を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。 The counter electrode is made of gold, nickel, platinum, silver, titanium, aluminum, stainless steel, copper, chromium, conductive oxide, or conductive plastic as a whole, or the surface of the conductive material of the substrate The conductive material coating layer made of gold, nickel, platinum, silver, titanium, aluminum, stainless steel, copper, chromium, conductive oxide, or conductive plastic is provided on the opposing surface. 2. The method according to item 1. 前記対向電極は、透明電極である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the counter electrode is a transparent electrode. 前記基板と対向電極との間に非導電性スペーサーを配置し、前記基板、対向電極、および非導電性スペーサーによって囲まれた空間に、前記溶液を充填する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。 The non-conductive spacer is arranged between the substrate and the counter electrode, and the solution is filled in the space surrounded by the substrate, the counter electrode, and the non-conductive spacer. The method according to item. 前記導電性物質表面と対向電極との間に電圧が印加されない間、前記溶液を攪拌することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。 The method according to claim 1, comprising stirring the solution while no voltage is applied between the surface of the conductive material and the counter electrode. 前記生体分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、蛋白、ポリペプチド、糖化合物、脂質、天然低分子、および合成低分子からなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の方法。 The biomolecule is at least one selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA, protein, polypeptide, sugar compound, lipid, natural low molecule, and synthetic low molecule. The method described in 1.
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