JP2006122025A - New gene associated with petal elongation and use thereof - Google Patents
New gene associated with petal elongation and use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006122025A JP2006122025A JP2004318518A JP2004318518A JP2006122025A JP 2006122025 A JP2006122025 A JP 2006122025A JP 2004318518 A JP2004318518 A JP 2004318518A JP 2004318518 A JP2004318518 A JP 2004318518A JP 2006122025 A JP2006122025 A JP 2006122025A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plant
- polypeptide
- gene
- petal
- polynucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 113
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 81
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 125
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 117
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 108
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 78
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 78
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 78
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 51
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 39
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 18
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 14
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 114
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 17
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 abstract description 13
- 238000005452 bending Methods 0.000 abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 74
- 230000006870 function Effects 0.000 description 41
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 15
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 15
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 13
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 13
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 9
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 9
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 8
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 8
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 241000234282 Allium Species 0.000 description 6
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 6
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 6
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 6
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 6
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 5
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 241000207875 Antirrhinum Species 0.000 description 4
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000012966 insertion method Methods 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700006388 Arabidopsis HY5 Proteins 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 101150005226 FRL1 gene Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 240000001549 Ipomoea eriocarpa Species 0.000 description 3
- 235000005146 Ipomoea eriocarpa Nutrition 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 3
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000011681 asexual reproduction Effects 0.000 description 3
- 238000013465 asexual reproduction Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 3
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 3
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 3
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 description 2
- LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoate Chemical compound C=1C=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 240000001436 Antirrhinum majus Species 0.000 description 2
- 101100156797 Arabidopsis thaliana WSD11 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- -1 His Proteins 0.000 description 2
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 101150002979 cin gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- MLFHJEHSLIIPHL-UHFFFAOYSA-N isoamyl acetate Chemical group CC(C)CCOC(C)=O MLFHJEHSLIIPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 101150060993 ACT8 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 244000058084 Aegle marmelos Species 0.000 description 1
- 241000243290 Aequorea Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101100434207 Arabidopsis thaliana ACT8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100227722 Arabidopsis thaliana FRL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- IXVMHGVQKLDRKH-VRESXRICSA-N Brassinolide Natural products O=C1OC[C@@H]2[C@@H]3[C@@](C)([C@H]([C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C(C)C)C)C)CC3)CC[C@@H]2[C@]2(C)[C@@H]1C[C@H](O)[C@H](O)C2 IXVMHGVQKLDRKH-VRESXRICSA-N 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150056054 HY5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000233855 Orchidaceae Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- IXVMHGVQKLDRKH-KNBKMWSGSA-N brassinolide Chemical compound C1OC(=O)[C@H]2C[C@H](O)[C@H](O)C[C@]2(C)[C@H]2CC[C@]3(C)[C@@H]([C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)C(C)C)CC[C@H]3[C@@H]21 IXVMHGVQKLDRKH-KNBKMWSGSA-N 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940117955 isoamyl acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229910052762 osmium Inorganic materials 0.000 description 1
- SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N osmium atom Chemical compound [Os] SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical group 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 1
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
本発明は、植物の花弁の伸長に関与する新規遺伝子および当該遺伝子がコードするタンパク質、並びに当該遺伝子を利用して植物の花弁の形状を改変する方法に関するものである。 The present invention relates to a novel gene involved in plant petal elongation, a protein encoded by the gene, and a method for modifying the petal shape of a plant using the gene.
植物の花弁は花器官の中で最も多様な形態をしており、花粉媒介者の誘引等の重要な役割をもつ。花弁形成機構については、これまでに花弁原基形成やアイデンティティの確立などのメカニズムが遺伝子レベルで明らかにされている。しかしながら、花弁原基形成後に花弁がどのような機構で伸長し、一定の形態をとるようになるのかはほとんど知られていない。 Plant petals have the most diverse forms of floral organs and play an important role in attracting pollinators. Regarding petal formation mechanisms, mechanisms such as petal primordia formation and identity establishment have been clarified so far at the gene level. However, little is known about the mechanism by which petals extend after taking petal primordia and come to take a certain form.
花弁の形態形成に関与する遺伝子としては、キンギョソウ（Antirrhinum majas）のCIN遺伝子（非特許文献１）およびDICHTOMA遺伝子（非特許文献２）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のFRL1遺伝子（非特許文献３）が知られている。 Examples of genes involved in petal morphogenesis include Antirrhinum majas CIN gene (Non-patent document 1) and DICHTOMA gene (Non-patent document 2), and Arabidopsis thaliana FRL1 gene (Non-patent document 3). Are known.
キンギョソウのCIN遺伝子は花弁のlobeと呼ばれる上部部分の表皮細胞の分化に関与しており、cin突然変異体ではこの上部部分が小さくなったり、少し曲がったりする。また、キンギョソウのDICHTOMA遺伝子は背側（dorsal）の花弁形態を非対称にする役割を持つ。これらの相同遺伝子はシロイヌナズナにも存在するが、その機能については明らかにされていない。 Snapdragon CIN gene is involved in the differentiation of the upper epidermis cells, called petal lobe, and in the cin mutant, this upper part becomes smaller or slightly bent. Snapdragon DICHTOMA gene also has a role to make dorsal petal form asymmetric. These homologous genes are also present in Arabidopsis, but their functions have not been clarified.
シロイヌナズナのFRL1遺伝子については、frl1突然変異体では花弁の先端がギザギザになり、フリルのような形状になる。これは花弁先端部のＤＮＡ複製が異常になっていることに起因しており、FRL1遺伝子が花弁の細胞分裂に関与することを示している。しかしながら、FRL1遺伝子は未だクローニングされていない。 For the FRL1 gene of Arabidopsis thaliana, the frl1 mutant has a jagged tip of the petal and a frill-like shape. This is due to abnormal DNA replication at the tip of the petal, indicating that the FRL1 gene is involved in petal cell division. However, the FRL1 gene has not yet been cloned.
一方、ほとんどの園芸植物は花弁の色や形状に特色があり、それによって価値を高めている。例えばキンギョソウや多くのランは、花弁の色や模様とともに花弁の形状が変化していることが鑑賞の対象となっている。また、台咲と呼ばれる変化アサガオは、花弁の屈曲に特徴があり、アサガオ市等で高値で取引されている。しかしながら人工的に花弁の形状を改変することは困難である。現状では、自然界で偶然に生じる突然変異を見出し、相当の時間と労力を費やして交雑による育種を行う方法が用いられている。
上述のように、花弁がどのような機構で伸長し、一定の形態をとるようになるのかについてはほとんど解明されていない。また、花弁の形態形成に関与することが知られている遺伝子も非常に数が少ない。 As described above, little is known about the mechanism by which the petals extend and take a certain form. There are also very few genes known to be involved in petal morphogenesis.
花弁形成機構の解明を進展させるためには、花弁の形態形成に関与する新規な遺伝子を数多く見出し、その機能を明らかにすることが重要である。特に花弁の伸長など、花弁の後期発生に関わる遺伝子は未だ見出されておらず、花弁の後期発生に関わる遺伝子を単離できれば、花弁形成機構の解明に大きく貢献できることが期待される。 In order to advance the elucidation of the petal formation mechanism, it is important to find many novel genes involved in petal morphogenesis and clarify their functions. In particular, genes related to the later development of petals, such as the expansion of petals, have not yet been found, and if genes involved in the later development of petals can be isolated, it is expected to contribute greatly to the elucidation of the mechanism of petal formation.
また、上述のように、花弁の形状を人工的に改変することは困難である。それゆえ、遺伝子操作により花弁の形状を改変することができれば、園芸価値の高い花弁の形状に特徴がある植物を容易に作製することが可能となる。 Further, as described above, it is difficult to artificially change the petal shape. Therefore, if the petal shape can be modified by genetic manipulation, it becomes possible to easily produce a plant characterized by a petal shape with high horticultural value.
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、花弁の伸長に関与する新規な遺伝子を提供すること、および当該遺伝子を利用した花弁の形状を改変する方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above problems, and its object is to provide a novel gene involved in petal elongation, and a method for modifying the petal shape using the gene There is to do.
本発明者らは、上記課題を解決するために、変異誘導したシロイヌナズナのスクリーニングを行い、花弁が折れ曲がる表現型を表す個体を分離し、この変異の原因となる単一の遺伝子をシロイヌナズナゲノムから単離・同定した。さらに、変異個体の詳細な観察、および野生型遺伝子による相補実験の結果、当該変異の原因遺伝子およびその産物は花弁をまっすぐ伸長させる機能を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors screened mutated Arabidopsis thaliana to isolate individuals exhibiting a phenotype in which petals are bent, and singly isolated a single gene responsible for this mutation from the Arabidopsis genome. Separated and identified. Furthermore, as a result of detailed observation of mutant individuals and complementary experiments with wild-type genes, it was found that the causative gene of the mutation and its product have a function of straightening the petals, and the present invention has been completed.
すなわち本発明は、花弁の伸長に関与する新規遺伝子およびその利用に関し、以下の発明を包含する。
（１）花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列、
からなるポリペプチド。
（２）（１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（３）配列番号２に示される塩基配列のコード領域を含む、（２）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（５）（２）ないし（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドのフラグメント。
（６）（２）ないし（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または（５）に記載のフラグメントを含むベクター。
（７）（６）に記載のベクターが導入されている形質転換体。
（８）（１）に記載のポリペプチドに結合する抗体。
（９）（２）ないし（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドに変異を導入する工程を含むことを特徴とする、花弁の形状が改変された植物の作製方法。
（１０）（２）ないし（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または（５）に記載のフラグメントを細胞に導入する工程を含むことを特徴とする、花弁の形状が改変された植物の作製方法。
（１１）（９）または（１０）に記載の方法で作製された植物。
That is, the present invention relates to a novel gene involved in petal elongation and use thereof, and includes the following inventions.
(1) A polypeptide having a function of extending a petal straightly,
(A) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
A polypeptide comprising:
(2) A polynucleotide encoding the polypeptide according to (1).
(3) The polynucleotide according to (2), comprising the coding region of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(4) A polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions, and that encodes a polypeptide having a function of extending a petal straightly.
(5) A fragment of the polynucleotide according to any one of (2) to (4).
(6) A vector comprising the polynucleotide according to any one of (2) to (4) or the fragment according to (5).
(7) A transformant into which the vector according to (6) has been introduced.
(8) An antibody that binds to the polypeptide according to (1).
(9) A method for producing a plant having a modified petal shape, comprising a step of introducing a mutation into the polynucleotide according to any one of (2) to (4).
(10) A plant having a modified petal shape, comprising the step of introducing the polynucleotide according to any one of (2) to (4) or the fragment according to (5) into a cell. Manufacturing method.
(11) A plant produced by the method according to (9) or (10).
本発明の遺伝子およびタンパク質は、花弁伸長という花弁の後期発生に関与する遺伝子およびタンパク質として初めて単離されたものである。それゆえ、花弁原基形成後の花弁伸長機構の解明に貢献できるという効果を奏する。 The genes and proteins of the present invention have been isolated for the first time as genes and proteins involved in the late development of petals called petal elongation. Therefore, there is an effect that it can contribute to the elucidation of the petal elongation mechanism after petal primordia formation.
また、本発明の遺伝子に変異を導入することにより、または、本発明の遺伝子の発現を阻害することにより花弁の形態を改変することができ、花弁形態が多様な園芸価値の高い植物を遺伝子操作により容易に作製することができるという効果を奏する。 In addition, by introducing mutations into the gene of the present invention, or by inhibiting the expression of the gene of the present invention, the petal morphology can be modified, and a plant with high horticultural value with various petal morphology can be genetically manipulated. Thus, it is possible to produce the device more easily.
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。 An embodiment of the present invention will be described as follows. Note that the present invention is not limited to this.
（１）ポリペプチド
本発明者らは、変異処理を施したシロイヌナズナをスクリーニングし、花弁がまっすぐ伸びずに曲がってしまう突然変異体folded petals（fop）を見出し、当該変異の原因遺伝子が新規遺伝子FOLDED PETALS（FOP）であることを明らかにした。
(1) Polypeptide The present inventors screened Arabidopsis thaliana that has been subjected to mutation treatment, found mutant folded petals (fop) in which petals bend without straightening, and the causative gene of the mutation is a novel gene FOLDED Clarified that it is PETALS (FOP).
ＦＯＰ遺伝子がコードするタンパク質については、ドメイン検索の結果、既知のドメインは見つからなかったが、高い疎水性アミノ酸が連続している領域を有し、１つの膜貫通ドメインを有することが予想された。また、ＦＯＰ−ＧＦＰ融合タンパク質をタマネギ表皮細胞で発現させたところ、当該融合タンパク質は細胞膜に局在することが明らかとなった。 As for the protein encoded by the FOP gene, no known domain was found as a result of the domain search, but it was expected to have a region where high hydrophobic amino acids are continuous and to have one transmembrane domain. In addition, when FOP-GFP fusion protein was expressed in onion epidermis cells, it was revealed that the fusion protein was localized in the cell membrane.
また、ＦＯＰ遺伝子をｆｏｐ突然変異体に導入したところ、得られた全ての個体で花弁の屈曲が回復した。 Moreover, when the FOP gene was introduced into the fop mutant, petal bending was restored in all the obtained individuals.
ｆｏｐ突然変異体の詳細な観察の結果、ｆｏｐ突然変異体は花弁原基の初期発生には異常が見られず、花弁が伸長を始める頃から屈曲した。また、花弁表皮細胞の形態を電子顕微鏡で観察した結果、野生型では基部に細長い細胞が形成され、先端に向かうにしたがって徐々に丸い細胞に変化していたが、ｆｏｐ突然変異体では基部の細長い細胞から屈曲箇所で細胞形態が急激に変化し、先端では尖った細胞が形成されていた。 As a result of detailed observation of the fop mutant, the fop mutant showed no abnormality in the initial development of the petal primordia and bent from the time when the petal started to grow. In addition, as a result of observing the morphology of petal epidermis cells with an electron microscope, in the wild type, elongated cells were formed at the base and gradually changed to round cells toward the tip. The cell shape suddenly changed from the cell at the bent portion, and a sharp cell was formed at the tip.
以上の観察結果より、ＦＯＰ遺伝子およびそれがコードするＦＯＰタンパク質は花弁の後期発生に関与し、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有すると考えられる。 From the above observation results, it is considered that the FOP gene and the FOP protein encoded by the FOP gene are involved in the late development of petals and have a function of extending the petals straight.
本明細書中において、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。 In this specification, the term “polypeptide” is used interchangeably with “peptide” or “protein”. The polypeptides according to the invention may also be isolated from natural sources or chemically synthesized.
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。 The term “isolated” polypeptide or protein is intended to be a polypeptide or protein that has been removed from its natural environment. For example, recombinantly produced polypeptides and proteins expressed in a host cell can be isolated in the same manner as natural or recombinant polypeptides and proteins that have been substantially purified by any suitable technique. It is thought that there is.
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。 Polypeptides according to the present invention include natural purified products, products of chemical synthesis procedures, and prokaryotic or eukaryotic hosts (eg, bacterial cells, yeast cells, higher plant cells, insect cells, and mammalian cells). ) From recombinantly produced products. Depending on the host used in the recombinant production procedure, the polypeptides according to the invention may be glycosylated or non-glycosylated. Furthermore, the polypeptides according to the invention may also contain an initiating modified methionine residue in some cases as a result of host-mediated processes.
本発明は、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドを提供する。一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体でありかつ花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドである。 The present invention provides a polypeptide having a function of straightening a petal. In one embodiment, the polypeptide according to the present invention is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a variant of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and extends the petals straightly. A polypeptide having a function.
変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。 Variants include deletions, insertions, inversions, repeats, and type substitutions (eg, replacement of a hydrophilic residue with another residue, but usually a strongly hydrophilic residue to a strongly hydrophobic residue Are not substituted). In particular, “neutral” amino acid substitutions in a polypeptide generally have little effect on the activity of the polypeptide.
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。 It is well known in the art that some amino acids in the amino acid sequence of a polypeptide can be easily modified without significantly affecting the structure or function of the polypeptide. Furthermore, it is also well known that there are variants that not only artificially modify, but also do not significantly alter the structure or function of the protein in the native protein.
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、作製した変異体が花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するか否かは、例えばシロイヌナズナのｆｏｐ突然変異体に当該変異体をコードするポリヌクレオチドを導入し、花弁の屈曲が回復するか否かを観察することにより、容易に決定し得る。 One skilled in the art can readily mutate one or several amino acids in the amino acid sequence of a polypeptide using well-known techniques. For example, according to a known point mutation introduction method, an arbitrary base of a polynucleotide encoding a polypeptide can be mutated. In addition, a deletion mutant or an addition mutant can be prepared by designing a primer corresponding to an arbitrary site of a polynucleotide encoding a polypeptide. Furthermore, whether or not the produced mutant has a function of extending the petal straightly is determined by introducing a polynucleotide encoding the mutant into an Arabidopsis fop mutant and restoring the bending of the petal or not. It can be easily determined by observing.
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチド活性を変化させない。 Preferred variants have conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions, or additions. Silent substitution, addition, and deletion are preferred, and conservative substitution is particularly preferred. These do not alter the polypeptide activity according to the invention.
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。 Typically seen as conservative substitutions are substitutions of one amino acid for another in the aliphatic amino acids Ala, Val, Leu, and Ile, exchange of hydroxyl residues Ser and Thr, acidic residues Asp and Glu exchange, substitution between amide residues Asn and Gln, exchange of basic residues Lys and Arg, and substitution between aromatic residues Phe, Tyr.
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。 As detailed above, further guidance on which amino acid changes are likely to be phenotypically silent (ie likely not to have a significantly detrimental effect on function) can be found in Bowie, J. . U. “Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substations”, Science 247: 1306-1310 (1990), which is incorporated herein by reference.
本実施形態に係るポリペプチドは、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドであって、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列、からなるポリペプチドであることが好ましい。 The polypeptide according to the present embodiment is a polypeptide having a function of extending a petal straightly, and (a) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; or (b) an amino acid represented by SEQ ID NO: 1. The polypeptide is preferably a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the sequence.
上記「１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。 The above “one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added” means substitution, deletion, insertion, or by a known mutant polypeptide production method such as site-directed mutagenesis. It means that as many amino acids as can be added (preferably 10 or less, more preferably 7 or less, most preferably 5 or less) are substituted, deleted, inserted or added. As described above, such a mutant polypeptide is not limited to a polypeptide having a mutation artificially introduced by a known mutant polypeptide production method, and a naturally occurring polypeptide is isolated and purified. It may be what you did.
なお、本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。 The polypeptide according to the present invention is not limited to this as long as it is a polypeptide in which amino acids are peptide-bonded, and may be a complex polypeptide containing a structure other than the polypeptide. As used herein, examples of the “structure other than the polypeptide” include sugar chains and isoprenoid groups, but are not particularly limited.
また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。 The polypeptide according to the present invention may include an additional polypeptide. Examples of the additional polypeptide include epitope-tagged polypeptides such as His, Myc, and Flag.
また、本発明に係るポリペプチドは、後述する本発明に係るポリヌクレオチド（本発明に係るポリペプチドをコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された場合であってもよい。また、本発明に係るポリペプチドは、化学合成されたものであってもよい。 In addition, the polypeptide according to the present invention is a state in which a polynucleotide according to the present invention (a gene encoding the polypeptide according to the present invention) described later is introduced into a host cell and the polypeptide is expressed in the cell. It may also be a case where it is isolated and purified from cells, tissues or the like. The polypeptide according to the present invention may be chemically synthesized.
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。 In other embodiments, the polypeptides of the invention can be recombinantly expressed in a modified form such as a fusion protein. For example, additional amino acids, particularly charged amino acid regions, of the polypeptides according to the invention may be used in host cells to improve stability and persistence during purification or subsequent manipulation and storage. It can be added to the N-terminus of the polypeptide.
本実施形態に係るポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）にＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）（本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合される本実施形態に係るポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。 The polypeptide according to this embodiment can be added to the N-terminus or C-terminus, for example, to a tag label (tag sequence or marker sequence) that is a sequence encoding a peptide that facilitates purification of the fused polypeptide. Such sequences can be removed prior to final preparation of the polypeptide. In certain preferred embodiments of this aspect of the invention, the tag amino acid sequence is a hexa-histidine peptide (eg, a tag provided in a pQE vector (Qiagen, Inc.), among many of them Are publicly and / or commercially available. For example, Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989) (incorporated herein by reference), hexahistidine provides convenient purification of the fusion protein. The “HA” tag is another peptide useful for purification corresponding to an epitope derived from influenza hemagglutinin (HA) protein, which is described in Wilson et al., Cell 37: 767 (1984) (herein). Which is incorporated by reference). Other such fusion proteins include a polypeptide according to this embodiment or a fragment thereof fused to Fc at the N or C terminus.
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成されても、化学合成されてもよい。 In another embodiment, the polypeptides according to the invention may be produced recombinantly or chemically synthesized as detailed below.
組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行うことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行うことができる。 Recombinant production can be performed using methods well known in the art, for example using vectors and cells as detailed below.
合成ペプチドは、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で調製されそして特徴付けられたＨＡ１ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、さらにＨｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出、５１３４）。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。 Synthetic peptides can be synthesized using known methods of chemical synthesis. For example, Houghten is prepared for the synthesis of multiple peptides such as 10-20 mg of 248 different 13 residue peptides that represent a single amino acid variant of the HA1 polypeptide segment prepared and characterized in less than 4 weeks. A simple method is described. Houghten, R.A. A. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135 (1985). This “Simultaneous Multiple Peptide Synthesis (SMPS)” process is further described in US Pat. No. 4,631,211 to Houghten et al. (1986). In this procedure, individual resins for solid phase synthesis of various peptides are contained in separate solvent permeable packets, allowing optimal use of many identical iteration steps associated with solid phase methods. Complete manual procedures allow 500-1000 or more syntheses to be performed simultaneously (Houghten et al., Supra, 5134). These documents are incorporated herein by reference.
本発明に係るポリペプチドを花弁が折れ曲がる変異植物において発現させることにより、花弁をまっすぐ伸長させ正常な形状の花弁を形成させることができる。また、本発明のポリペプチドは、花弁原基形成後の花弁の後期発生機構を解明するために有用である。 By expressing the polypeptide according to the present invention in a mutant plant in which the petals bend, the petals can be elongated straight to form petals of a normal shape. In addition, the polypeptide of the present invention is useful for elucidating the late development mechanism of petals after petal primordia formation.
このように、本発明に係るポリペプチドは、少なくとも、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでいればよいといえる。すなわち、配列番号１に示されるアミノ酸配列と特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とからなるポリペプチドも本発明に含まれることに留意すべきである。また、配列番号１に示されるアミノ酸配列および当該任意のアミノ酸配列は、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。 Thus, it can be said that the polypeptide according to the present invention only needs to contain at least the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. That is, it should be noted that the polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and any amino acid sequence having a specific function (for example, tag) is also included in the present invention. In addition, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the arbitrary amino acid sequence may be linked with an appropriate linker peptide so as not to inhibit the respective functions.
（２）ポリヌクレオチド
本発明は、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有する本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書中において、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中において、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
(2) Polynucleotide The present invention provides a polynucleotide encoding a polypeptide according to the present invention having a function of straightening a petal. As used herein, the term “polynucleotide” is used interchangeably with “nucleic acid” or “nucleic acid molecule” and is intended to be a polymer of nucleotides. In this specification, the term “base sequence” is used interchangeably with “nucleic acid sequence” or “nucleotide sequence”, and is indicated as a sequence of deoxyribonucleotides (abbreviated as A, G, C, and T).
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。 The polynucleotide according to the present invention may exist in the form of RNA (eg, mRNA) or in the form of DNA (eg, cDNA or genomic DNA). DNA can be double-stranded or single-stranded. Single-stranded DNA or RNA can be the coding strand (also known as the sense strand) or it can be the non-coding strand (also known as the antisense strand).
本発明に係るポリヌクレオチドのフラグメントの長さは特に限定されないが、少なくとも１２、１５、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００ｎｔ（ヌクレオチド）であることが好ましい。少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントによって、例えば、配列番号２に示される塩基配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号２に示される塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号２に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。 The length of the fragment of the polynucleotide according to the present invention is not particularly limited, but may be at least 12, 15, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000 nt (nucleotide). preferable. By a fragment of at least 20 nt in length is intended, for example, a fragment comprising 20 or more consecutive bases from the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. By referring to the present specification, the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is provided, so that those skilled in the art can easily prepare a DNA fragment based on SEQ ID NO: 2. For example, restriction endonuclease cleavage or ultrasonic shearing can be readily used to create fragments of various sizes. Alternatively, such fragments can be made synthetically. Appropriate fragments (oligonucleotides) are synthesized by Applied Biosystems Incorporated (ABI, 850 Lincoln Center Dr., Foster City, CA 94404) type 392 synthesizer and the like.
また本発明に係るポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。 Further, the polynucleotide according to the present invention can be fused to the polynucleotide encoding the tag tag (tag sequence or marker sequence) described above on the 5 'side or 3' side.
本発明はさらに、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。 The present invention further relates to a variant of the polynucleotide encoding a polypeptide having a function of extending the petals straight. Variants can occur naturally, such as a natural allelic variant. By “allelic variant” is intended one of several interchangeable forms of a gene occupying a given locus on the chromosome of an organism. Non-naturally occurring variants can be generated, for example, using mutagenesis techniques well known in the art.
このような変異体としては、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１個または数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、または付加を生成し得る。 Examples of such a mutant include a mutant in which one or several bases are deleted, substituted, or added in the base sequence of a polynucleotide encoding a polypeptide having a function of extending petals straight. Variants can be mutated in coding or non-coding regions, or both. Mutations in the coding region can generate conservative or non-conservative amino acid deletions, substitutions, or additions.
本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドを提供する。 The present invention further provides an isolated polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a polypeptide having a function of straightening a petal under stringent hybridization conditions or a polynucleotide that hybridizes to the polynucleotide. .
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号２に示される塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチドであることが好ましい。また、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。 In one embodiment, the polynucleotide according to the present invention is preferably a polynucleotide comprising the coding region of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. Further, it is preferably a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and that encodes a polypeptide having a function of straightening the petals. .
ここで、配列番号２に示される塩基配列は、本発明者がシロイヌナズナから単離したＦＯＰ遺伝子の全長ｃＤＮＡの塩基配列である。コード領域（オープンリーディングフレーム）は５０位〜１５１０位であり、１５０８位〜１５１０位のＴＡＡは終止コドンである。また、当該ＦＯＰ遺伝子を含有するゲノムＤＮＡの塩基配列が配列番号３に示されている。ＦＯＰ遺伝子は７個のエクソンを有する遺伝子である。 Here, the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the base sequence of the full-length cDNA of the FOP gene isolated by the present inventors from Arabidopsis thaliana. The coding region (open reading frame) is positions 50 to 1510, and TAA at positions 1508 to 1510 is a stop codon. Further, the base sequence of genomic DNA containing the FOP gene is shown in SEQ ID NO: 3. The FOP gene is a gene having 7 exons.
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、５０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味する。上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。なお、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり、より相同性の高いポリヌクレオチドを単離できる。 The term “stringent conditions” means that hybridization occurs only when at least 90% identity, preferably at least 95% identity, exists between sequences. For example, at 50 ° C. Means binding under 2 × SSC wash conditions. The hybridization is described in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory (2001). Note that the higher the temperature and the lower the salt concentration, the higher the stringency and the more homologous polynucleotide can be isolated.
別の実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドのフラグメントであることが好ましい。 In another embodiment, the polynucleotide according to the present invention is preferably a fragment of the polynucleotide.
本発明に係るポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。ＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。 The polynucleotide or fragment thereof according to the present invention includes not only double-stranded DNA but also single-stranded DNA and RNA such as sense strand and antisense strand constituting the same. DNA includes, for example, cDNA and genomic DNA obtained by cloning, chemical synthesis techniques, or a combination thereof. Furthermore, the polynucleotide or oligonucleotide according to the present invention may contain sequences such as untranslated region (UTR) sequences and vector sequences (including expression vector sequences).
本発明に係るポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡ干渉に用いるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、リボザイムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。これらを用いた結果として、遺伝子産物の発現が抑制または阻害される。本発明に係るポリヌクレオチドのフラグメントを導入することによって、ＦＯＰ遺伝子産物（本発明に係るポリペプチド）の発現を阻害することにより、花弁の形状を改変することができる。 The polynucleotide or fragment thereof according to the present invention can be used as a tool for gene expression manipulation using antisense RNA, siRNA (small interfering RNA) used for RNA interference, or ribozyme. As a result of using them, the expression of the gene product is suppressed or inhibited. By introducing the fragment of the polynucleotide according to the present invention, the shape of the petal can be modified by inhibiting the expression of the FOP gene product (polypeptide according to the present invention).
本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法として、公知の技術により、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。 Examples of a method for obtaining the polynucleotide according to the present invention include a method for isolating and cloning a DNA fragment containing the polynucleotide according to the present invention by a known technique. For example, a probe that specifically hybridizes with a part of the base sequence of the polynucleotide in the present invention may be prepared and a genomic DNA library or cDNA library may be screened. Such a probe may be of any sequence and / or length as long as it specifically hybridizes to at least part of the base sequence of the polynucleotide of the present invention or its complementary sequence. Good.
あるいは、本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。 Alternatively, examples of the method for obtaining the polynucleotide according to the present invention include a method using amplification means such as PCR. For example, in the polynucleotide cDNA of the present invention, primers are prepared from the 5 ′ side and 3 ′ side sequences (or their complementary sequences), and genomic DNA (or cDNA) or the like is used as a template using these primers. By performing PCR or the like and amplifying the DNA region sandwiched between both primers, a large amount of DNA fragments containing the polynucleotide according to the present invention can be obtained.
本発明に係るポリヌクレオチドは、適当な植物の組織や細胞を供給源として取得することができる。植物としては特に限定されず、例えば、シロイヌナズナに近縁な他のアブラナ科の植物、アサガオ、ペチュニア、キンギョソウ、タバコ、イネなどが挙げられる。なお、ＦＯＰ遺伝子についてホモロジー検索を行ったところ、シロイヌナズナに１１個、イネに３個の相同遺伝子が見つかったが、いずれも機能は未知である。当業者は、他の植物においてもＦＯＰ遺伝子の相同遺伝子が存在することを容易に予想し得る。 The polynucleotide according to the present invention can be obtained using a suitable plant tissue or cell as a source. The plant is not particularly limited, and examples thereof include other cruciferous plants closely related to Arabidopsis thaliana, morning glory, petunia, snapdragon, tobacco, and rice. In addition, when homology search was performed for the FOP gene, 11 homologous genes were found in Arabidopsis thaliana and 3 homologous genes were found in rice, but their functions are unknown. Those skilled in the art can easily expect that homologous genes of the FOP gene exist in other plants.
（３）ベクター
本発明は、上述した本発明に係るポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを含むベクターを提供する。
(3) Vector The present invention provides a vector comprising the polynucleotide according to the present invention described above or a fragment thereof.
一実施形態において、本発明に係るベクターは花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドを生成するために使用されるベクターである。このようなベクターは、インビトロ翻訳（無細胞タンパク質合成）に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。 In one embodiment, the vector according to the present invention is a vector used for producing a polypeptide having a function of extending a petal straightly. Such a vector may be a vector used for in vitro translation (cell-free protein synthesis) or a vector used for recombinant expression.
別の実施形態において、本発明に係るベクターは相同組換えに用いるターゲティングベクターである。さらに他の実施形態において、本発明に係るベクターは、アンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現させるために用いられるベクターである。 In another embodiment, the vector according to the present invention is a targeting vector used for homologous recombination. In yet another embodiment, the vector according to the present invention is a vector used to express antisense RNA or siRNA.
本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを含むものであれば、特に限定されない。組換え発現ベクターの場合、例えば、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。 The vector according to the present invention is not particularly limited as long as it contains the above-described polynucleotide according to the present invention or a fragment thereof. In the case of a recombinant expression vector, for example, a recombinant expression vector into which a cDNA of a polynucleotide encoding a polypeptide having a function of extending a petal straight is inserted. A method for producing a recombinant expression vector includes, but is not limited to, a method using a plasmid, phage, cosmid or the like.
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。 The specific type of the vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in the host cell may be appropriately selected. That is, according to the type of the host cell, a promoter sequence is appropriately selected in order to reliably express the polynucleotide according to the present invention, and a vector in which this and the polynucleotide according to the present invention are incorporated into various plasmids is used as an expression vector. Use it.
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。 The expression vector preferably includes at least one selectable marker. Such markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture, and E. coli. Examples of culture in E. coli and other bacteria include a tetracycline resistance gene or an ampicillin resistance gene.
上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明に係るポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）をマーカーとして用い、本発明に係るポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。 By using the above selection marker, it can be confirmed whether or not the polynucleotide according to the present invention has been introduced into the host cell, and whether or not it is reliably expressed in the host cell. Alternatively, the polypeptide according to the present invention may be expressed as a fusion polypeptide. For example, a green fluorescent protein (GFP) derived from Aequorea jellyfish is used as a marker, and the polypeptide according to the present invention is used as a GFP fusion polypeptide. It may be expressed as
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。 The host cell is not particularly limited, and various conventionally known cells can be suitably used. Specifically, for example, bacteria such as Escherichia coli, yeasts (budding yeast Saccharomyces cerevisiae, fission yeast Schizosaccharomyces pombe), nematodes (Caenorhabditis elegans), and Xenopus laevis mothers such as Xenopus laevis However, it is not particularly limited. Appropriate culture media and conditions for the above-described host cells are well known in the art.
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。 A method for introducing the expression vector into a host cell, that is, a transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, or a DEAE dextran method can be suitably used. . In addition, for example, when the polypeptide according to the present invention is transferred and expressed in insects, an expression system using baculovirus may be used.
本発明のベクターを用いて本発明に係るポリペプチドを生産することができる。本発明に係るポリペプチドを生産する方法としては、無細胞タンパク質合成系を用いる方法、組換え発現系を用いる方法を挙げることができる。 The polypeptide of the present invention can be produced using the vector of the present invention. Examples of the method for producing the polypeptide according to the present invention include a method using a cell-free protein synthesis system and a method using a recombinant expression system.
無細胞タンパク質合成系を用いる場合、本発明のベクターを無細胞タンパク質合成系に適用すればよい。無細胞タンパク質合成には、種々の市販のキットを用いることができる。組換え発現系を用いる場合、本発明に係るポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。 When using a cell-free protein synthesis system, the vector of the present invention may be applied to the cell-free protein synthesis system. Various commercially available kits can be used for cell-free protein synthesis. When a recombinant expression system is used, the polynucleotide according to the present invention is incorporated into a recombinant expression vector, and then introduced into a host so that it can be expressed by a known method, and the polypeptide obtained by translation in the host is purified. Such a method can be adopted.
ポリペプチドを精製する方法としては、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、または培地や無細胞タンパク質合成液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製することができる。 As a method for purifying a polypeptide, a cell extract is prepared from cells or tissues by a well-known method (for example, a method in which cells or tissues are disrupted and then centrifuged to collect a soluble fraction), or a medium or Well-known methods from cell-free protein synthesis solutions (eg ammonium sulfate precipitation or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography) , And lectin chromatography).
相同組換えに用いるターゲティングベクターの場合は、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのゲノムＤＮＡと相同組換えが可能なフラグメントを含み、その一部を薬剤耐性遺伝子などのマーカーと結合させたものを挙げることができる。このようなターゲティングベクターにより、標的の遺伝子を破壊することができる。マーカーとして用いる遺伝子は特に限定されないが、例えばカナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが挙げられる。上記フラグメントは花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのゲノムＤＮＡと相同組換えを起こすことができる程度の相同性を有していればよい。このような相同性としては、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性が挙げられる。また、フラグメントは少なくとも５０ｎｔ以上の長さを有することが好ましく、より好ましくは１００ｎｔ以上である。 In the case of a targeting vector used for homologous recombination, it contains a fragment capable of homologous recombination with the genomic DNA of a polynucleotide encoding a polypeptide having a function of extending the petal straightly, and a part thereof is a marker such as a drug resistance gene Can be mentioned. Such a targeting vector can destroy the target gene. The gene used as a marker is not particularly limited, and examples thereof include a kanamycin resistance gene and a chloramphenicol resistance gene. The above-mentioned fragment only needs to have a degree of homology capable of causing homologous recombination with the genomic DNA of a polynucleotide encoding a polypeptide having a function of extending a petal straightly. Such homology is preferably 90% or more, more preferably 95% or more. The fragment preferably has a length of at least 50 nt, more preferably 100 nt or more.
アンチセンスＲＮＡを発現させるために用いられるベクターの場合は、例えば、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡまたはその一部をプロモーターの下流にアンチセンス方向に連結させたものを挙げることができる。このようなベクターを植物に導入することにより、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドの発現を抑制または阻害することができる。内在の花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドの発現を抑制または阻害することができる限り、当該ポリペプチドをコードする遺伝子の転写産物に完全に相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするものでなくてもよい。 In the case of a vector used to express antisense RNA, for example, a cDNA of a polynucleotide encoding a polypeptide having a function of extending a petal straight or a part thereof is linked downstream of the promoter in the antisense direction. Things can be mentioned. By introducing such a vector into a plant, it is possible to suppress or inhibit the expression of a polypeptide having a function of extending the petals straight. As long as it is possible to suppress or inhibit the expression of a polypeptide having a function of straightly extending an endogenous petal, it does not encode an antisense RNA that is completely complementary to the transcript of the gene encoding the polypeptide. Also good.
ｓｉＲＮＡを発現させるために用いられるベクターの場合は、例えば、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡの一部がプロモーターの下流にセンス方向に連結された部位と、プロモーターの下流に上記ｃＤＮＡの一部がアンチセンス方向に連結された部位とを有するものを挙げることができる。あるいは、プロモーターの下流にセンス配列とアンチセンス配列とがループ配列を解して連結される構造を有するベクターでもよい。このようなベクターを植物に導入することにより、細胞内で二本鎖のｓｉＲＮＡが生成し、ＲＮＡ干渉により花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドの発現を抑制または阻害することができる。 In the case of a vector used for expressing siRNA, for example, a site where a part of cDNA of a polynucleotide encoding a polypeptide having a function of extending a petal straightly is linked in the sense direction downstream of the promoter; And a portion having a part of the cDNA linked in the antisense direction downstream thereof. Alternatively, it may be a vector having a structure in which a sense sequence and an antisense sequence are linked downstream of a promoter via a loop sequence. By introducing such a vector into a plant, double-stranded siRNA is generated in the cell, and the expression of a polypeptide having a function of extending the petal straightly by RNA interference can be suppressed or inhibited.
上記ベクターの植物細胞への導入方法等についての詳細は後述する。 Details of the method for introducing the vector into plant cells will be described later.
（４）形質転換体
本発明は、上述した花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを含むベクターが導入されている形質転換体を提供する。ここで「形質転換体」には、細胞、組織、器官、生物個体が含まれる。
(4) Transformant The present invention provides a transformant into which a vector containing a polynucleotide encoding a polypeptide having a function of straightening the above-described petals or a fragment thereof is introduced. Here, “transformants” include cells, tissues, organs, and individual organisms.
形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法を挙げることができる。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物を挙げることができる。 A method for producing a transformant (production method) is not particularly limited, and examples thereof include a method for transformation by introducing the above-described recombinant vector into a host. In addition, the organism to be transformed is not particularly limited, and examples thereof include various microorganisms, plants and animals exemplified in the host cell.
本発明に係る形質転換体は、植物の形質転換体(形質転換植物）であることが好ましい。形質転換植物は、上述の本発明に係るベクターを、当該ベクターに挿入された遺伝子またはその一部が発現し得るように植物中に導入することにより得ることができる。 The transformant according to the present invention is preferably a plant transformant (transformed plant). A transformed plant can be obtained by introducing the above-described vector according to the present invention into a plant so that the gene inserted into the vector or a part thereof can be expressed.
組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明に係るポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクター、または外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。 When a recombinant expression vector is used, the recombinant expression vector used for transformation of the plant body is not particularly limited as long as it is a vector capable of expressing the polynucleotide according to the present invention in the plant. Examples of such a vector include a vector having a promoter that constitutively expresses a polynucleotide in a plant cell (eg, cauliflower mosaic virus 35S promoter), or a promoter that is inducibly activated by an external stimulus. The vector which has is mentioned.
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。 Plants to be transformed in the present invention include whole plants, plant organs (eg leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.), plant tissues (eg epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, It means any of a palisade tissue, a spongy tissue, etc.) or a plant cultured cell, or various forms of plant cells (eg, suspension cultured cells), protoplasts, leaf sections, callus, etc. The plant used for transformation is not particularly limited, and may be any plant belonging to the monocotyledonous plant class or the dicotyledonous plant class.
植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知である。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著，植物遺伝子操作マニュアル，１９９０，２７−３１ｐｐ，講談社サイエンティフィック，東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、６７、３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎら、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞または植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター（ｐＢＩ１２１またはｐＰＺＰ２０２など）を使用することができる。 For the introduction of genes into plants, transformation methods known to those skilled in the art (for example, Agrobacterium method, gene gun, PEG method, electroporation method, etc.) are used. For example, a method using Agrobacterium and a method for directly introducing it into plant cells are well known. When the Agrobacterium method is used, the constructed plant expression vector is introduced into an appropriate Agrobacterium (for example, Agrobacterium tumefaciens), and this strain is used as a leaf disk method (by Hirofumi Uchimiya, Plant According to the gene manipulation manual, 1990, 27-31pp, Kodansha Scientific, Tokyo), etc., a sterile cultured leaf piece can be infected to obtain a transformed plant. Also, the method of Nagel et al. (Micibiol. Lett., 67, 325 (1990)) can be used. In this method, for example, an expression vector is first introduced into Agrobacterium, and then transformed Agrobacterium is transformed into a plant cell by the method described in Plant Molecular Biology Manual (SB Gelvin et al., Academic Press Publishers). It is a method of introducing into plant tissue. Here, “plant tissue” includes callus obtained by culturing plant cells. When transformation is performed using the Agrobacterium method, a binary vector (such as pBI121 or pPZP202) can be used.
また、遺伝子を直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。遺伝子銃を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物または試料によって異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。 Electroporation and gene gun methods are known as methods for directly introducing genes into plant cells or plant tissues. When using a gene gun, a plant body, a plant organ, and a plant tissue itself may be used as they are, or may be used after preparing a section, or a protoplast may be prepared and used. The sample prepared in this manner can be processed using a gene transfer apparatus (for example, PDS-1000 (BIO-RAD)). The treatment conditions vary depending on the plant or sample, but are usually performed at a pressure of about 450 to 2000 psi and a distance of about 4 to 12 cm.
遺伝子が導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性マーカーで選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。 A cell or plant tissue into which a gene has been introduced is first selected with a drug resistance marker such as hygromycin resistance, and then regenerated into a plant body by a conventional method. Regeneration of a plant body from a transformed cell can be performed by a method known to those skilled in the art depending on the type of plant cell.
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターを遺伝子銃、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。 When plant cultured cells are used as a host, transformation is carried out by introducing a recombinant vector into the cultured cells using a gene gun, electroporation method or the like. Callus, shoots, hairy roots, etc. obtained as a result of transformation can be used as they are for cell culture, tissue culture or organ culture, and can be used at a suitable concentration using conventionally known plant tissue culture methods. It can be regenerated into plants by administration of plant hormones (auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.).
遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。 Whether or not a gene has been introduced into a plant can be confirmed by PCR, Southern hybridization, Northern hybridization, or the like. For example, DNA is prepared from a transformed plant, PCR is performed by designing a DNA-specific primer. PCR can be performed under the same conditions as those used for preparing the plasmid. Thereafter, the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis or capillary electrophoresis, stained with ethidium bromide, SYBR Green solution, etc., and the amplified product is detected as a single band, It can be confirmed that it has been transformed. Moreover, PCR can be performed using a primer previously labeled with a fluorescent dye or the like to detect an amplification product. Furthermore, it is possible to employ a method in which the amplification product is bound to a solid phase such as a microplate and the amplification product is confirmed by fluorescence or enzymatic reaction.
本発明に係るポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体がいったん得られれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、本発明に係るポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。 Once a transformed plant in which the polynucleotide of the present invention is integrated into the genome is obtained, progeny can be obtained by sexual or asexual reproduction of the plant. Further, for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, and the like can be obtained from the plant or its progeny, or clones thereof, and the plant can be mass-produced based on them. it can. Therefore, the present invention also includes a plant body into which the polynucleotide according to the present invention is introduced so that it can be expressed, or a progeny of the plant body having the same properties as the plant body, or a tissue derived therefrom.
（５）抗体
本発明は、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明に係る抗体は、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドを発現する生物材料の選択に有用であり得る。
(5) Antibody The present invention provides an antibody that specifically binds to a polypeptide having a function of straightening a petal. As used herein, the term “antibody” refers to immunoglobulins (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM and their Fab fragments, F (ab ′) 2 fragments, Fc fragments), eg Examples include, but are not limited to, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, single chain antibodies, anti-idiotype antibodies, and humanized antibodies. The antibody according to the present invention may be useful for selection of a biological material that expresses a polypeptide having a function of straightening a petal.
「抗体」は、種々の公知の方法（例えば、ＨａｒＬｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）」、岩崎ら、「単クローン抗体 ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」）に従えば作製することができる。 “Antibodies” can be prepared by various known methods (eg, HarLow et al., “Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)”, Iwasaki et al., “Monoclonal antibody hybridoma and ELISA, Kodansha (19). ") Can be produced.
ペプチド抗体は、当該分野に周知の方法によって作製される。例えば、Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化され得る。しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアにカップリングされ得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングされ得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキャリア−カップリングペプチドのいずれかで、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびＦｒｅｕｎｄのアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。 Peptide antibodies are produced by methods well known in the art. For example, Chow, M .; Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914; and Bittle, F .; J. et al. Et al. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (1985) (incorporated herein by reference). In general, animals can be immunized with free peptides. However, anti-peptide antibody titers can be boosted by coupling the peptide to a macromolecular carrier such as keyhole limpet hemocyanin (KLH) or tetanus toxoid. For example, peptides containing cysteine can be coupled to a carrier using a linker such as m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), while other peptides can be coupled more like glutaraldehyde. Common linking agents can be used to couple to the carrier. Animals such as rabbits, rats, and mice can be injected either intraperitoneally and / or intradermally with either free or carrier-coupled peptides, eg, emulsions containing about 100 μg of peptide or carrier protein and Freund's adjuvant. Immunized. To provide useful titers of anti-peptide antibodies that can be detected by an ELISA assay using, for example, free peptide adsorbed on a solid surface, for example, at intervals of about 2 weeks May be needed. The titer of anti-peptide antibodies in serum from immunized animals is increased by selection of anti-peptide antibodies, for example, adsorption to peptides on solid supports and elution of selected antibodies by methods well known in the art. obtain.
本明細書中において、用語「花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体」は、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチド抗原に特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３）（本明細書中に参考として援用される））。従って、これらのフラグメントが好ましい。 In the present specification, the term “an antibody that specifically binds to a polypeptide having a function of extending a petal straight” refers to a complete antibody molecule that can specifically bind to a polypeptide antigen having a function of extending a petal straight. And antibody fragments (eg, Fab and F (ab ′) 2 fragments). Fab and F (ab ′) 2 fragments lack the Fc portion of the complete antibody, are removed more rapidly by circulation, and have little to no nonspecific tissue binding of the complete antibody (Wahl et al., J Nucl.Med.24: 316-325 (1983) (incorporated herein by reference). These fragments are therefore preferred.
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明に係る抗体の他のフラグメントは、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが、明らかである。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。あるいは、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチド結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学によって産生され得る。 It is clear that Fab and F (ab ′) 2 and other fragments of the antibodies according to the invention can be used according to the methods disclosed herein. Such fragments are typically produced by proteolytic cleavage using enzymes such as papain (resulting in Fab fragments) or pepsin (resulting in F (ab ′) 2 fragments). Alternatively, polypeptide-binding fragments that have the function of extending the petals straight can be produced by the application of recombinant DNA technology or synthetic chemistry.
このように、本発明に係る抗体は、少なくとも、本発明に係る花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドを認識する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を備えていればよいといえる。すなわち、本発明に係る花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドを認識する抗体フラグメントと、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。 As described above, the antibody according to the present invention includes at least an antibody fragment (for example, Fab and F (ab ′) 2 fragment) that recognizes a polypeptide having a function of extending the petal according to the present invention straight. It's good. That is, it should be noted that the present invention includes an immunoglobulin comprising an antibody fragment that recognizes a polypeptide having a function of straightening the petals according to the present invention and an Fc fragment of a different antibody molecule.
（６）花弁の形状が改変された植物の作製方法
本発明は、花弁の形状が改変された植物の作製方法を提供する。
(6) Method for Producing Plant with Modified Petal Shape The present invention provides a method for producing a plant with modified petal shape.
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドに変異を導入する工程を含むことを特徴とする。 In one embodiment, the method includes introducing a mutation into the polynucleotide according to the present invention.
本発明者らは、変異処理を施したシロイヌナズナのスクリーニングにより見出した花弁が屈曲するｆｏｐ突然変異体は、野生型ＦＯＰ遺伝子のオープンリーディングフレーム（配列番号２に示される塩基配列の５０位〜１５１０位）の８２０番目（配列番号２に示される塩基配列の８６９位）のグアニンがアデニンに置換されており、その結果配列番号１に示されるアミノ酸配列の２７４位のグリシンがアルギニンに変異していることを確認した（実施例１）。 The present inventors found that the fo mutant with a bent petal found by screening Arabidopsis thaliana was subjected to the open reading frame of the wild-type FOP gene (positions 50 to 1510 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2). ) Guanine at position 820 (position 869 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2) is substituted with adenine, and as a result, the glycine at position 274 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is mutated to arginine (Example 1).
また、本発明者らはソーク研究所（ＳＡＬＫ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＳａｎＤｉｅｇｏ）から入手した２ラインのＴ−ＤＮＡ挿入ラインについて、Ｔ−ＤＮＡがＦＯＰ遺伝子内に挿入されていること、およびｆｏｐ突然変異体と同様に花弁が屈曲する表現型を表すことを確認した。具体的には、一方のライン（ＳＡＬＫ＿０９３１３３）には第２イントロンに８塩基の欠失を伴うＴ−ＤＮＡの挿入が生じており、他方のライン（ＳＡＬＫ＿１３７４８１）には第２イントロンと第３エクソンに２３塩基の欠損を伴うＴ−ＤＮＡの挿入が生じていた。 In addition, the present inventors have also found that T-DNA is inserted into the FOP gene with respect to two lines of T-DNA insertion lines obtained from Salk Institute (California, San Diego), and fo mutants. It was confirmed that the phenotype in which the petal bends was expressed as well. Specifically, one line (SALK — 093133) has T-DNA insertion with an 8 base deletion in the second intron, and the other line (SALK — 137481) contains the second intron and the third exon. Insertion of T-DNA with a 23 base deletion occurred.
変異を導入する工程において利用できる手法としては、例えばＴ−ＤＮＡ挿入法、トランスポゾン挿入法、ジーンターゲティング法などを挙げることができるが、これらに限定されない。 Examples of techniques that can be used in the step of introducing mutations include, but are not limited to, a T-DNA insertion method, a transposon insertion method, and a gene targeting method.
Ｔ−ＤＮＡ挿入法による変異導入は、Ｔ−ＤＮＡをゲノム中にランダムに挿入させ、ＰＣＲを用いて標的遺伝子破壊株を見出す方法である。Ｔ−ＤＮＡの挿入はアグロバクテリウムを介した減圧湿潤法（島本功、岡田清孝監修「新版モデル植物の実験プロトコール」（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ１５）秀潤社、２００１年４月２日発行、「４−７減圧浸潤法による形質転換」１０９−１１３ｐｐ）などの公知の方法により行うことができる。すなわち、アグロバクテリウムの懸濁液に花蕾を含む植物体の全体を浸漬し、減圧下でアグロバクテリウムを浸潤させることによりＴ−ＤＮＡを植物体に導入する。Ｔ−ＤＮＡを導入した植物から得られた種子を、選択マーカーとして用いた薬剤（例えばカナマイシン等）を含む培地で生育させ、形質転換された個体を選抜し、ＰＣＲ等によりＴ−ＤＮＡが標的遺伝子（ＦＯＰ遺伝子）内部に挿入されているか否かを確認することにより、花弁の形状が改変された植物を作製することができる。 Mutagenesis by the T-DNA insertion method is a method in which T-DNA is randomly inserted into a genome and a target gene disruption strain is found using PCR. Insertion of T-DNA by Agrobacterium-mediated decompression-humidification method (supervised by Isao Shimamoto and Kiyotaka Okada “New Version Model Plant Experiment Protocol” (Cell Engineering Separate Volume, Plant Cell Engineering Series 15) Shujunsha, April 2, 2001 Published in Japan, “4-7 Transformation by vacuum infiltration method” 109-113 pp). That is, T-DNA is introduced into a plant body by immersing the whole plant body containing the flower buds in an Agrobacterium suspension and infiltrating Agrobacterium under reduced pressure. Seeds obtained from a plant into which T-DNA has been introduced are grown in a medium containing a drug (eg, kanamycin) used as a selection marker, transformed individuals are selected, and T-DNA is converted into a target gene by PCR or the like. By confirming whether or not the (FOP gene) has been inserted, a plant having a modified petal shape can be produced.
トランスポゾン挿入法は、トランスポゾンをゲノム中にランダムに挿入させ、ＰＣＲを用いて標的遺伝子破壊株を見出す方法である。使用するトランスポゾンについては、特に限定されず、例えばＡｃ／ＤＳ等のＤＮＡ型トランスポゾンやレトロトランスポゾンを使用することができる。トランスポゾンの挿入はエレクトロポレーション法などの公知の方法（佐々木卓治、田畑哲之、島本功監修「植物のゲノム研究プロトコール」（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ１４）秀潤社、２００１年２月５日発行、「２−４遺伝子破壊法」）により行うことができる。 The transposon insertion method is a method in which a transposon is randomly inserted into a genome and a target gene-disrupted strain is found using PCR. The transposon to be used is not particularly limited, and for example, a DNA transposon such as Ac / DS or a retrotransposon can be used. Transposon insertion is a well-known method such as electroporation (Takuharu Sasaki, Tetsuyuki Tabata, Isao Shimamoto "Plant Genome Research Protocol" (Cell Engineering Separate Volume, Plant Cell Engineering Series 14) Shujunsha, February 5, 2001) Published in Japan, “2-4 gene disruption method”).
ジーンターゲティング法による変異導入は、相同組換えにより本発明に係るポリヌクレオチドの内部に薬剤耐性遺伝子等の他のポリヌクレオチドを挿入することにより行うことができる。その結果相、標的遺伝子は破壊（ノックアウト）され、標的遺伝子が変異した植物細胞を得ることができる。あるいは、相同組換えにより、例えばＦＯＰ遺伝子のオープンリーディングフレームの８２０番目のグアニンに相当する塩基をアルギニンに置換してもよい。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドのゲノムＤＮＡのエクソン内に薬剤耐性遺伝子などを挿入したターゲティングベクターを構築し、これを植物細胞内に導入することによって、相同組換えを起こさせることができる。相同組換えが起こったか否かについては、ＰＣＲやサザンハイブリダイゼーションにより確認することができる。なお、本方法に用いるターゲティングベクターは、上述の本発明に係るベクターに含まれる。 Mutation can be introduced by the gene targeting method by inserting another polynucleotide such as a drug resistance gene into the polynucleotide according to the present invention by homologous recombination. As a result, the target gene is destroyed (knocked out), and a plant cell in which the target gene is mutated can be obtained. Alternatively, for example, a base corresponding to 820th guanine in the open reading frame of the FOP gene may be substituted with arginine by homologous recombination. For example, homologous recombination can be caused by constructing a targeting vector in which a drug resistance gene or the like is inserted into an exon of the genomic DNA of the polynucleotide of the present invention and introducing it into a plant cell. Whether or not homologous recombination has occurred can be confirmed by PCR or Southern hybridization. In addition, the targeting vector used for this method is contained in the vector which concerns on the above-mentioned this invention.
一旦、本発明に係るポリヌクレオチドであるゲノムＤＮＡに変異が導入され植物が得られれば、当該植物から有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、上述の本発明に係る花弁の形状が改変された植物の作製方法により作製された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。 Once a mutation is introduced into genomic DNA, which is a polynucleotide according to the present invention, and a plant is obtained, offspring can be obtained from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. Further, for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, and the like can be obtained from the plant or its progeny, or clones thereof, and the plant can be mass-produced based on them. it can. Therefore, the present invention includes a plant produced by the above-described method for producing a plant having a modified petal shape according to the present invention, or a progeny of the plant having the same properties as the plant, or these Also includes tissue from origin.
他の実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを細胞に導入する工程を含むことを特徴としている。本発明に係るポリヌクレオチドまたはそのフラグメントとしては、アンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとして機能するポリヌクレオチドまたはそのフラグメントが好ましい。これらを細胞に導入することにより、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有するポリペプチドの発現を阻害し、花弁の形状が改変された植物を作製することができる。 In another embodiment, the method includes a step of introducing a polynucleotide according to the present invention or a fragment thereof into a cell. The polynucleotide or fragment thereof according to the present invention is preferably a polynucleotide that functions as antisense RNA or siRNA or a fragment thereof. By introducing these into cells, it is possible to inhibit the expression of a polypeptide having a function of extending the petals straight and to produce a plant in which the shape of the petals is modified.
アンチセンスＲＮＡは、正常な転写産物（ｍＲＮＡ）に相補的なＲＮＡを用いて遺伝子発現を特異的に阻害する方法である。例えば、プラスミドベクターのプロモーターに逆向きにｃＤＮＡを挿入して宿主細胞に導入し、細胞内でアンチセンスＲＮＡを発現させれば遺伝子の発現（タンパク質の翻訳）を阻害できる。 Antisense RNA is a method of specifically inhibiting gene expression using RNA complementary to a normal transcript (mRNA). For example, gene expression (protein translation) can be inhibited by inserting cDNA reversely into the promoter of a plasmid vector, introducing the cDNA into a host cell, and expressing antisense RNA in the cell.
ＲＮＡ干渉は、２本鎖のＲＮＡを細胞の中に入れると、その配列に相同なｍＲＮＡが分解され、遺伝子発現を阻害する現象である。ＲＮＡ干渉を起こすことができる短い２本鎖ＲＮＡはｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）と称される。ｓｉＲＮＡが、遺伝子特異的にその発現を抑制することは、既に多くの研究で確立されており、当業者において技術常識である。ｓｉＲＮＡの設計の指針については既に多数の文献や成書において公表されており、これらの指針にしたがって遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを設計することができる。細胞内でｓｉＲＮＡが発現するように構築したベクター（ｓｉＲＮＡ発現ベクター）を宿主細胞に導入し、細胞内でｓｉＲＮＡを発現させればポリペプチドの発現を阻害できる。 RNA interference is a phenomenon in which when a double-stranded RNA is introduced into a cell, mRNA homologous to the sequence is degraded and gene expression is inhibited. A short double-stranded RNA capable of causing RNA interference is called siRNA (small interfering RNA). It has already been established in many studies that siRNA suppresses its expression in a gene-specific manner, and it is common knowledge in the art. SiRNA design guidelines have already been published in many literatures and books, and gene-specific siRNAs can be designed according to these guidelines. Polypeptide expression can be inhibited by introducing a vector (siRNA expression vector) constructed so that siRNA is expressed in the cell into the host cell and expressing the siRNA in the cell.
恒常的にアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを過剰発現できるベクターを構築し、植物細胞に導入して染色体に組み込まれた形質転換細胞を得れば、当該植物細胞を再生すれば本発明に係るポリペプチドの発現が恒常的に阻害される植物を作製することができる。 If a vector capable of constitutively overexpressing antisense RNA or siRNA is constructed, and transformed cells are introduced into plant cells and integrated into the chromosome, the plant cells can be regenerated to regenerate the polypeptide of the present invention. Plants whose expression is constitutively inhibited can be produced.
一旦このような本発明に係るポリペプチドの発現が恒常的に阻害される植物を得ることができれば、当該植物から有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、上述の本発明に係る花弁の形状が改変された植物の作製方法により作製された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。 Once a plant in which the expression of the polypeptide according to the present invention is constantly inhibited can be obtained, offspring can be obtained from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. Further, for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, and the like can be obtained from the plant or its progeny, or clones thereof, and the plant can be mass-produced based on them. it can. Therefore, the present invention includes a plant produced by the above-described method for producing a plant having a modified petal shape according to the present invention, or a progeny of the plant having the same properties as the plant, or these Also includes tissue from origin.
なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 The present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made within the scope of the claims, and the embodiments can be obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments. The form is also included in the technical scope of the present invention.
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail using an Example, this invention is not limited to these Examples.
〔実施例１：突然変異体のスクリーニングおよびポジショナルクローニング〕
材料植物として、シロイヌナズナ hy5 突然変異体を用いた。このシロイヌナズナ hy5 突然変異体は、明条件下（２４時間光照射下）において胚軸が長く伸び、暗条件下で生育したような表現型を示す突然変異体として単離された（エコタイプはWassilewskija[WS]）。HY5 遺伝子はbZIPタイプの転写因子をコードしており、光刺激に応答した植物の成長に関与することが示されている（Oyama et al., Genes & Development 11, 2983-2995, 1997）。使用したアリルはＡＢＲＣ（Arabidopsis Biological Resource Center）より取り寄せたhy5-1である。
Example 1: Mutant screening and positional cloning
As a plant material, Arabidopsis hy5 mutant was used. This Arabidopsis hy5 mutant was isolated as a mutant exhibiting a phenotype as if the hypocotyl grew long under light conditions (under 24 hours of light irradiation) and grew under dark conditions (the ecotype was Wassilewskija). [WS]). The HY5 gene encodes a bZIP-type transcription factor and has been shown to be involved in plant growth in response to light stimulation (Oyama et al., Genes & Development 11, 2983-2995, 1997). The allyl used was hy5-1 obtained from ABCR (Arabidopsis Biological Resource Center).
花弁形成に関わる遺伝子を単離・同定するため、まず花弁形態に異常を示す突然変異体のスクリーニングを行った。すなわち、上記シロイヌナズナ hy5 突然変異体の種子を0.3％ ethylmethanesulphonate（エチルメタンサルフォネート、EMS）溶液中で13〜15時間振とう培養した後にバーミキュライト上にまき、成育した植物から種子を回収した（M2種子）。 To isolate and identify genes involved in petal formation, we first screened for mutants that show abnormal petal morphology. That is, seeds of the above Arabidopsis hy5 mutant were cultured in a 0.3% ethylmethanesulphonate (EMS) solution for 13 to 15 hours, then seeded on vermiculite, and seeds were collected from the grown plants (M2 seed).
上記M2種子をバーミキュライト上にまいて生育させ、花の形態を肉眼で詳細に観察し、異常を示す個体を選抜した。異常を示す個体の中で、花弁が曲がるという新規の表現型を示すものを見出し、folded petals (fop)と名づけた。図１に野生型（WS）およびfop突然変異体（fop）の花の形状を示した。図１から明らかなように、fop突然変異体では花弁が一度または二度曲がる表現型が見られた。 The M2 seeds were spread on vermiculite and grown, and the flower morphology was observed in detail with the naked eye, and individuals showing abnormalities were selected. Among the individuals exhibiting abnormalities, we found a novel phenotype that petals bend and named it folded petals (fop). FIG. 1 shows the flower shape of wild type (WS) and fop mutant (fop). As is clear from FIG. 1, the fop mutant showed a phenotype in which the petals bent once or twice.
見出されたfop突然変異体については、２回の戻し交配（backcross）により、hy5突然変異を失ったもの（エコタイプはWS）を得て以後の解析に用いた。 About the found fop mutant, what lost hy5 mutation (ecotype is WS) was obtained by backcrossing twice and used for further analysis.
fop突然変異体（WS)と野生型Col（Columbia）株を掛け合わせ、F2世代の植物の中からfopの表現型を示すものを組換体の候補として選抜した。これらの個体のロゼット葉からDNAを抽出し、SSLP (simple sequence length polymorphism)およびCAPS(cleaved amplified polymorphism sequence)マーカーを利用したラフマッピングにより、FOP遺伝子が5番染色体のnga129とJV61/62マーカーの間に位置することを明らかにした。各染色体に座乗するSSLP, CAPS各マーカーの塩基配列情報は、ＴＡＩＲ（The Arabidopsis Information Resource、www.arabidopsis.org）より入手した。 Fop mutant (WS) and wild-type Col (Columbia) strains were crossed to select F2 genus plants showing fop phenotype as recombinant candidates. DNA was extracted from rosette leaves of these individuals, and rough mapping using SSLP (simple sequence length polymorphism) and CAPS (cleaved amplified polymorphism sequence) markers revealed that the FOP gene was located between nga129 and JV61 / 62 markers on chromosome 5. Revealed to be located in. The nucleotide sequence information of SSLP and CAPS markers located on each chromosome was obtained from TAIR (The Arabidopsis Information Resource, www.arabidopsis.org).
ラフマッピングの後、ColとWSの塩基配列をシークエンスし、違いのあるところをマーカーとしてファインマッピングを行い、5番染色体の南端の約136 kbの領域内にFOP遺伝子があることを突き止めた。領域内のORFの塩基配列をWSとfop突然変異体とで比較することによって、At5g53390遺伝子に１塩基の変異があることを明らかにした。fop突然変異体では、820番目のグアニンがアデニンに変わっており、その結果グリシンがアルギニンに変わっていた。 After rough mapping, the base sequences of Col and WS were sequenced, and fine mapping was performed using the difference as a marker, and it was found that the FOP gene was in the approximately 136 kb region at the southern end of chromosome 5. By comparing the base sequence of ORF in the region between WS and fop mutants, it was clarified that there was a single base mutation in the At5g53390 gene. In the fop mutant, 820th guanine was changed to adenine, and as a result, glycine was changed to arginine.
At5g53390遺伝子がFOP遺伝子であることを確かめるため、2.2 kbのプロモーター領域、2.2 kbのORFおよび1.6 kbの3’領域を含む野生型のゲノム断片を、Agrobacterium tumefaciensを介したvacuum infiltration 法によってfop突然変異体に導入した。得られた種子をカナマイシン30 μg/mlを含むMS培地上で選抜し、バーミキュライトに植え替えて成育させた。得られた約80個体について花弁の表現型を観察したところ、全ての個体で花弁の屈曲が回復することが確認された。 To confirm that the At5g53390 gene is a FOP gene, a wild-type genomic fragment containing a 2.2 kb promoter region, a 2.2 kb ORF and a 1.6 kb 3 'region was fop mutated by vacuum infiltration via Agrobacterium tumefaciens. Introduced to the body. The obtained seeds were selected on an MS medium containing kanamycin 30 μg / ml, replanted in vermiculite and grown. When the petal phenotype was observed for about 80 individuals obtained, it was confirmed that the flexion of the petals recovered in all individuals.
野生型の茎頂（つぼみを含む）からRNAを抽出し、逆転写反応を行ってcDNAを調製した。mRNAの全長(untranslational region, UTRを含む)を決定するため、上記cDNAをテンプレートとしてそれぞれ5’-RACE、3’-RACEを行った結果、FOP転写産物は49 bpの5’-UTRと217 bpの3’-UTRを持つことが分かった。ドメイン検索を行ったが、既知のドメインはFOP遺伝子産物内に見つからず、１つのtransmembrane domainをもつことが予想された。この領域は配列番号１に示されるアミノ酸配列の191位から213位の間に相当する。この領域は高い疎水性を示すアミノ酸が連続している。 RNA was extracted from wild type shoot apex (including buds), and reverse transcription was performed to prepare cDNA. In order to determine the total length of mRNA (including untranslational region, UTR), 5'-RACE and 3'-RACE were performed using the above cDNA as a template. As a result, FOP transcripts were 49 bp of 5'-UTR and 217 bp. It turns out to have 3'-UTR. A domain search was performed, but no known domain was found in the FOP gene product and it was expected to have one transmembrane domain. This region corresponds to positions between positions 191 and 213 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. This region is continuous with highly hydrophobic amino acids.
ホモロジー検索を行ったところ、シロイヌナズナに11個、イネに３個の相同遺伝子が見つかったが、いずれも機能未知である。これらの遺伝子のアライメントを行ったが、全体によく似ており、目立ったドメインは見出せなかった。 As a result of homology search, 11 homologous genes were found in Arabidopsis thaliana and 3 homologous genes in rice. Although these genes were aligned, they were very similar to the whole, and no prominent domains were found.
〔実施例２：fop突然変異体の解析〕
fop突然変異体の若い花芽を含む茎頂全体をFAA固定液（50%エタノール, 5%酢酸, 3.7%ホルムアルデヒド）中に浸し、30分脱気して固定した。固定後、エタノールシリーズ（50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100%, 各30分ずつ４度で振とう）で処理し、Technovit 7100(Heraeus Kulzer GmbH&Co.KG)を用いて樹脂に包埋し、5μmの切片をミクロトームで作製した後にスライドグラス上で風乾させ、0.1%のトルイジンブルーで染色して観察を行った。
[Example 2: Analysis of fop mutant]
The whole shoot apex including the young flower bud of the fop mutant was immersed in FAA fixative (50% ethanol, 5% acetic acid, 3.7% formaldehyde) and fixed by deaeration for 30 minutes. After fixation, treat with ethanol series (50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100%, shake at 4 degrees for 30 minutes each), Technonov 7100 (Heraeus Kulzer GmbH & Co.KG) After embedding in a resin, a 5 μm section was prepared with a microtome, air-dried on a slide glass, and stained with 0.1% toluidine blue for observation.
図２に野生型（WS)およびfop突然変異体（fop）の花弁原基の成長を光学顕微鏡を用いて観察した組織切片画像を示した。図２から明らかなように、fop突然変異体においてstage8 の花までには花弁原基の形成や成長に異常は見られないが、stage10 頃から花弁の屈曲が始まり、花弁とがく片、花弁と雄しべの間にそれぞれすき間が生じる（stage10 の矢尻参照）。屈曲箇所の細胞形態には大きな変化は見られなかった（stage12 の矢尻参照）。すなわち、花弁原基の初期発生には異常が見られず、伸長を始める頃から屈曲することが明らかとなった。
FIG. 2 shows tissue section images obtained by observing the growth of petal primordia of wild type (WS) and fop mutant (fop) using an optical microscope. As is clear from FIG. 2, in the fop mutant, there is no abnormality in the formation and growth of the petal primordium by the
次に、走査型電子顕微鏡を用いて詳細な観察を行った。fop突然変異体の若い花芽を含む茎頂全体を、上記と同様にFAA液で脱気して固定し、エタノールでリンスした後に酢酸イソアミルに置換した。臨界点乾燥機で処理後オスミウムを蒸着し、電子顕微鏡観察に供した。 Next, detailed observation was performed using a scanning electron microscope. The whole shoot apex including the young flower bud of the fop mutant was fixed by degassing with FAA solution in the same manner as above, rinsed with ethanol, and then replaced with isoamyl acetate. After treatment with a critical point dryer, osmium was deposited and subjected to electron microscope observation.
図３に花弁表皮細胞を走査型電子顕微鏡で観察した画像を示した。図３に示したように、野生型（WS）では基部に近い領域（basal region）に細長い細胞が形成され、先端に近い領域（upper region）には小さな丸い細胞が形成されている。その間の領域（transition region）では細胞の形が徐々に変わっている。これに対してfop突然変異体では、屈曲箇所の細胞の形が急速に変わっている。また、先端部では尖った細胞が形成されている。以上の観察結果から、fop突然変異体は、花弁表皮細胞の形態変化が急速に起こることによって花弁屈曲が引き起こされることが明らかとなった。 FIG. 3 shows an image of petal epidermis cells observed with a scanning electron microscope. As shown in FIG. 3, in the wild type (WS), elongated cells are formed in a basal region close to the base, and small round cells are formed in a region close to the tip (upper region). In the transition region, the cell shape gradually changes. In contrast, in the fop mutant, the shape of the cell at the bend is changing rapidly. In addition, a sharp cell is formed at the tip. From the above observation results, it has been clarified that the fop mutant causes the petal bending by the rapid change in the morphology of the petal epidermis cells.
〔実施例３：RT-PCRによる組織別発現解析〕
野生型の茎（stem）、茎生葉（cauline leaf）、若い花芽を含む茎頂（inflorescence）、花（open flower）、さや（silique）および芽生え（seedling）からIsogen reagent（Nippon gene）またはRNeasy（QIAGEN）を用いてtotal RNAを抽出し、SUPERSCRIPTII reverse transcription kit（Invitrogen）によりcDNAを合成した。FOP遺伝子中の特異的な領域を認識するプライマー（5’-ACGGAGAACGGTAGGAGAATG-3’（配列番号４）と5’-TTTGTCTTGAGGGATACGGAG-3’（配列番号５））を用いたPCR（30 cycle）で増幅した。なお、コントロールとしてゲノムDNAを鋳型として上記プライマーによりPCRを行った。
[Example 3: Expression analysis by tissue by RT-PCR]
From wild-type stem, stem leaf, inflorescence with young flower buds, open flower, silique and seedling, Isogen reagent (Nippon gene) or RNeasy ( Total RNA was extracted using QIAGEN), and cDNA was synthesized using SUPERSCRIPTII reverse transcription kit (Invitrogen). Amplified by PCR (30 cycle) using primers (5'-ACGGAGAACGGTAGGAGAATG-3 '(SEQ ID NO: 4) and 5'-TTTGTCTTGAGGGATACGGAG-3' (SEQ ID NO: 5)) that recognize specific regions in the FOP gene . As a control, PCR was performed with the above primers using genomic DNA as a template.
ACT8を認識するプライマーはAida et al., Plant Cell 9, 841-857, 1997 に掲載されているものを使用した。ACT8遺伝子はアクチンタンパク質をコードする遺伝子であり、植物体のいずれの組織でも強く発現していることが知られている。このことより、RT-PCRのポジティブコントロールとしてよく用いられる。 The primer which recognizes ACT8 used what was published in Aida et al., Plant Cell 9, 841-857, 1997. The ACT8 gene is a gene encoding an actin protein and is known to be strongly expressed in any tissue of the plant body. Therefore, it is often used as a positive control for RT-PCR.
図４にRT-PCRの結果を示した。図４から明らかなように、FOP遺伝子は若い花芽を含む茎頂および花で特異的に発現していることがわかった。 FIG. 4 shows the results of RT-PCR. As is clear from FIG. 4, it was found that the FOP gene was specifically expressed in the shoot apex and flowers including young flower buds.
〔実施例４：FOPプロモーターでβ−グルクロニダーゼ（GUS）を発現させる形質転換体の解析〕
FOP遺伝子の上流約2.2kbのFOPプロモーター領域をPCRによって増幅し、pBI101に導入してFOPp::GUS遺伝子を作製した。アグロバクテリウムC58C1に遺伝子を導入後、vacuum infiltration法により野生型Col株に導入した。カナマイシンを含むアガロースプレートでT1植物を選抜し、土に植え替えた後に花を咲かせた。
[Example 4: Analysis of transformant expressing β-glucuronidase (GUS) with FOP promoter]
The FOP promoter region of about 2.2 kb upstream from the FOP gene was amplified by PCR and introduced into pBI101 to prepare the FOPp :: GUS gene. After introducing the gene into Agrobacterium C58C1, it was introduced into the wild-type Col strain by vacuum infiltration method. T1 plants were selected on an agarose plate containing kanamycin, replanted in soil, and then blossomed.
茎頂を90%アセトンで固定後、GUS染色液中において37℃、16時間処理した後に透明化液で処理して観察した。GUS活性の試薬等はDonnelly et al., Developmental Biology 215, 407-419, 1999 に掲載されている方法に従った。 The shoot apex was fixed with 90% acetone, then treated in a GUS staining solution at 37 ° C. for 16 hours and then treated with a clearing solution and observed. The reagent etc. of GUS activity followed the method published in Donnelly et al., Developmental Biology 215, 407-419, 1999.
図５にFOPプロモーターでGUSを発現させる形質転換体の発現パターンを観察した画像を示した。図５に示したように、茎頂分裂組織（IM）では発現せず、若い花芽の全体で強く発現し、その後花弁（P）、雄しべ（st）、胚珠、柱頭での発現が認められた。 FIG. 5 shows an image obtained by observing the expression pattern of a transformant expressing GUS with the FOP promoter. As shown in FIG. 5, it was not expressed in the shoot apical meristem (IM), but was strongly expressed in the whole young buds, and then expressed in petals (P), stamens (st), ovules, and stigmas. .
〔実施例５：FOP-GFP融合タンパク質発現タマネギ細胞の解析〕
終止コドンを含まないFOP cDNAをPCRにより増幅し、GFPとともに35Sプロモーターを含むベクターに導入し、35S::FOP-GFP遺伝子を持つコンストラクトを作製した。金粒子にこの遺伝子をコーティングし、Model PDS-1000/He Biolistic particle Delivery System（BIO-RAD）を用いたパーティクルボンバードメント法によってタマネギ表皮細胞に導入した。対照として、GFP遺伝子のみを持つベクターを導入したタマネギ表皮細胞を作製した。16時間培養した後に蛍光顕微鏡を用いて観察を行った。
[Example 5: Analysis of onion cells expressing FOP-GFP fusion protein]
FOP cDNA not containing a stop codon was amplified by PCR and introduced into a vector containing a 35S promoter together with GFP to prepare a construct having a 35S :: FOP-GFP gene. This gene was coated on gold particles and introduced into onion epidermal cells by a particle bombardment method using Model PDS-1000 / He Biolistic Particle Delivery System (BIO-RAD). As a control, onion epidermal cells into which a vector having only the GFP gene was introduced were prepared. After culturing for 16 hours, observation was performed using a fluorescence microscope.
図６に上記タマネギ表皮細胞を観察した画像を示した。GFPのみを発現させた場合は、細胞全体と核とに蛍光が観察された（上段）が、FOP-GFP融合タンパク質を発現させた場合は細胞膜に局在することが明らかとなった（下段）。なお、図６中の矢尻は核の位置を示している。 FIG. 6 shows an image obtained by observing the onion epidermal cells. When only GFP was expressed, fluorescence was observed in the whole cell and nucleus (upper), but when FOP-GFP fusion protein was expressed, it became clear that it was localized in the cell membrane (lower). . In addition, the arrowhead in FIG. 6 has shown the position of the nucleus.
〔実施例６：FOPタンパク質過剰発現シロイヌナズナの作製〕
実施例１で得られたcDNAのオープンリーディングフレームをカリフラワーモザイクウイルス由来のS35プロモーターおよびNopaline synthase遺伝子のターミネーター（NOSt）を持つpGEMベクターに導入し、35S::FOP cDNA:: NOStコンストラクトを作製した。当該コンストラクトをバイナリ−ベクターpBl121に導入し、アグロバクテリウムに形質転換した後、野生型Col株に減圧湿潤法を用いて導入した（T0世代）。T0世代の植物より得られた種子（T1世代）をカナマイシンを含む培地で生育させ、薬剤に耐性を持つ個体を選抜した。
[Example 6: Production of FOP protein overexpressing Arabidopsis]
The cDNA open reading frame obtained in Example 1 was introduced into a pGEM vector having an S35 promoter derived from cauliflower mosaic virus and a terminator (NOSt) of Nopaline synthase gene to prepare a 35S :: FOP cDNA :: NOSt construct. The construct was introduced into the binary vector pBl121, transformed into Agrobacterium, and then introduced into the wild-type Col strain using the reduced pressure wet method (T0 generation). Seeds (T1 generation) obtained from T0 generation plants were grown in a medium containing kanamycin, and individuals resistant to the drug were selected.
T1世代の植物体を観察したところ、花弁の形状を含めて外部から観察可能な表現型については、野生型と比較して顕著に表現型の異なる器官は認められなかった。 When T1 generation plants were observed, no organs with significantly different phenotypes were observed in the phenotypes that can be observed from the outside, including the petal shape, compared to the wild type.
〔実施例７：シロイヌナズナのT-DNA挿入ラインの検討〕
ソーク研究所（SALK institute, California, San Diego）は、シロイヌナズナのT-DNAラインを大規模に作製しており、T-DNA上のプライマーから隣接部位の塩基配列（flanking sequence）をデータベース化している。そこで、FOP遺伝子の塩基配列に基づいて、ソーク研究所のデータベースを検索したところ、FOP遺伝子にT-DNAが挿入されている２ラインを見出し、その種子をソーク研究所から入手した。
[Example 7: Examination of T-DNA insertion line of Arabidopsis thaliana]
SALK Institute (California, San Diego) has created a large-scale Arabidopsis T-DNA line and has created a database of flanking sequences from primers on the T-DNA. . Then, when searching the database of the Soak Institute based on the base sequence of the FOP gene, two lines in which T-DNA was inserted into the FOP gene were found, and the seeds were obtained from the Soak Institute.
ソーク研究所のデータベースでは、T-DNAの挿入位置についてはT-DNAに隣接する左側の塩基配列のみが示されているため、T-DNAに隣接する右側の塩基配列を確認した。すなわち、ソーク研究所から送付された種子から植物を生育し、当該植物からDNAを調製してT-DNAに隣接する右側の塩基配列を決定した。その結果、一方のライン（SALK_093133）には第２イントロンに８塩基の欠失を伴うＴ−ＤＮＡの挿入が生じており（配列番号３に示される塩基配列の第3767位〜第3774位が欠失し、その部分にT-DNAが挿入されていた）、他方のライン（SALK_137481）には第２イントロンと第３エクソンに23塩基の欠損を伴うＴ−ＤＮＡの挿入が生じていた（配列番号３に示される塩基配列の第3823位〜第3845位が欠失し、その部分にT-DNAが挿入されていた）。 In the Soak Institute database, only the left base sequence adjacent to T-DNA is shown for the T-DNA insertion position, so the right base sequence adjacent to T-DNA was confirmed. That is, a plant was grown from seeds sent from Sok Laboratories, DNA was prepared from the plant, and the right base sequence adjacent to T-DNA was determined. As a result, in one line (SALK_093133), T-DNA was inserted with a deletion of 8 bases in the second intron (positions 3767 to 3774 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 were missing). The T-DNA was inserted in the second intron and the third exon in the other line (SALK_137481) (SEQ ID NO :). 3) from position 3823 to position 3845 of the nucleotide sequence shown in Fig. 3 was deleted, and T-DNA was inserted into that portion).
なお、図７に当該T-DNA挿入ライン（SALK_093133およびSALK_137481）の花の形状を示した。図７から明らかなように、いずれのT-DNA挿入ラインも、発明者らが見出したfop突然変異体と同様に花弁が屈曲する表現型が確認された。 FIG. 7 shows the flower shape of the T-DNA insertion line (SALK_093133 and SALK_137481). As is clear from FIG. 7, the phenotypes in which the petals bend were confirmed in all T-DNA insertion lines, similar to the fop mutant found by the inventors.
以上の結果より、花弁が屈曲する変異体は特定のアミノ酸置換に基づく変異に限定されるものではなく、ランダムなT-DNAの挿入によっても得られることが明らかとなった。また、T-DNAの挿入位置はコード領域に限定されず、イントロンへの挿入でも変異体が得られることが判明した。 From the above results, it has been clarified that mutants with bent petals are not limited to mutations based on specific amino acid substitutions, but can also be obtained by random T-DNA insertion. In addition, the insertion position of T-DNA was not limited to the coding region, and it was found that mutants can be obtained by insertion into introns.
以上のように、本発明に係るポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、花弁をまっすぐ伸長させる機能を有している。それゆえ、本発明に係るポリペプチドおよびポリヌクレオチドを利用した花弁の形状が改変された植物の作製方法により園芸価値の高い植物を作製することが可能となる。したがって、本発明は農業分野、中でも園芸植物の分野において非常に利用価値が高いものである。 As described above, the polypeptides and polynucleotides according to the present invention have a function of straightening the petals. Therefore, it is possible to produce a plant with high horticultural value by a method for producing a plant in which the petal shape is modified using the polypeptide and polynucleotide according to the present invention. Therefore, the present invention has very high utility value in the field of agriculture, especially in the field of horticultural plants.
Claims (11)
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列、
からなるポリペプチド。 A polypeptide having a function of straightening the petals,
(A) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
A polypeptide comprising:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004318518A JP2006122025A (en) | 2004-11-01 | 2004-11-01 | New gene associated with petal elongation and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004318518A JP2006122025A (en) | 2004-11-01 | 2004-11-01 | New gene associated with petal elongation and use thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006122025A true JP2006122025A (en) | 2006-05-18 |
Family
ID=36717324
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004318518A Withdrawn JP2006122025A (en) | 2004-11-01 | 2004-11-01 | New gene associated with petal elongation and use thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2006122025A (en) |
-
2004
- 2004-11-01 JP JP2004318518A patent/JP2006122025A/en not_active Withdrawn
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fukaki et al. | Lateral root formation is blocked by a gain‐of‐function mutation in the SOLITARY‐ROOT/IAA14 gene of Arabidopsis | |
| US6455672B1 (en) | Scarecrow gene, promoter and uses thereof | |
| US7208652B2 (en) | Constitutive photomorphogenesis 1 (COP1) nucleic acid sequence from Zea mays and its use thereof | |
| US6441273B1 (en) | Constitutive and inducible promoters from coffee plants | |
| JP3914993B2 (en) | Conferring viral resistance using plant proteins that bind to plant virus migration proteins | |
| WO2004081204A1 (en) | Plant and plant cell having been modified in cell multiplication and development/differentiation | |
| US8461414B2 (en) | Gene having endoreduplication promoting activity | |
| JP5142247B2 (en) | Method for producing plant virus resistant plant and use thereof | |
| JP5303713B2 (en) | Submerged response-related genes and their use | |
| KR101028113B1 (en) | CaHB1 gene involved in growth enhancement, salt tolerance and senescence regulation of Capsicum annuum and uses thereof | |
| ES2434742T3 (en) | Genes and procedures to increase disease resistance in plants | |
| US20030163837A1 (en) | Constitutive and inducible promoters from coffee plants | |
| JP2006122025A (en) | New gene associated with petal elongation and use thereof | |
| US20030088073A1 (en) | Scarecrow gene, promoter and uses thereof | |
| AU724857C (en) | SCARECROW gene, promoter and uses thereof | |
| JP4849670B2 (en) | Tobamovirus resistance gene Tm-1 | |
| JPWO2005026345A1 (en) | Plant dwarfing gene | |
| JP4550889B2 (en) | Boron absorption promoting gene | |
| JP2010035510A (en) | Field resistance gene to bacterial leaf blight of rice and use thereof | |
| WO2013095125A1 (en) | Method for producing a plant having enhanced disease resistance to nematodes | |
| WO2000053723A2 (en) | Scarecrow gene, promoter and uses thereof | |
| CZ339899A3 (en) | Plants with adjusted growth | |
| JP2006187203A (en) | New vinyl group reductase associated with biosynthesis of chlorophyll and utilization of the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20080108 |