JP2006087435A - New polypeptide and dna encoding the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、カブトガニ・アメボサイト由来の(1→3)−β−D−グルカン感受性因子(以下「G因子」という)のアミノ酸配列で示されるポリペプチド及びそれをコードするDNA、特に、G因子のaサブユニットのアミノ酸配列で示されるポリペプチド及びそれをコードするDNAに関する。 The present invention relates to a polypeptide represented by the amino acid sequence of a (1 → 3) -β-D-glucan sensitive factor (hereinafter referred to as “Factor G”) derived from horseshoe crab / amebosite and DNA encoding the same, The present invention relates to a polypeptide represented by the amino acid sequence of a subunit and DNA encoding the same.
従来、カブトガニ・アメボサイト・ライセートを使用して、エンドトキシンを測定する方法が知られている。この方法は、微量、たとえば10−9gオーダーのエンドトキシンによりライセートが凝固することに基づいており、その後の生化学的解明により、この反応はいくつかの凝固因子の段階的な活性化機構より成ることが明らかにされている(カスケード反応ともいう)(非特許文献1) 。第1図に日本産カブトガニ(Tachypleus tridentatus)におけるこの凝固カスケード反応を示す。またこの第1図に示す三種のセリンプロテアーゼ前駆体(C因子、B因子、凝固酵素前駆体)とゲル化タンパク質(コアギュローゲン)に関しては、それらの構造がcDNAクローニング等によりすでに明らかにされている(非特許文献2〜4)。
一方、このライセートは、真菌や酵母菌の細胞壁に存在する(1→3)−β−D−グルカンにも10−8〜10−9gのオーダーで反応し、ゲル化を引き起こすことが知られている(第1図参照)。この(1→3)−β−D−グルカンと相互作用し、ゲル化反応を開始させる因子として、G因子が存在する。G因子は他の因子と同様にセリンプロテアーゼ前駆体であり、72kDaのa subunit (サブユニット) と37kDa のb subunit(サブユニット) が非共有結合で結ばれた糖タンパク質であることが明らかにされている(1991年第64回日本生化学会にて発表) 。
また、G因子のaサブユニットには(1→3)−β−D−グルカンに特異的な結合部位が、さらにbサブユニットにはセリンプロテアーゼ領域が存在し、(1→3)−β−D−グルカンがaサブユニットに結合するとG因子が活性化されセリンプロテアーゼの機能を発現するものと考えられている。しかし、G因子の全構造は、まだ明らかにされていない。
On the other hand, this lysate is known to react with (1 → 3) -β-D-glucan present in the cell walls of fungi and yeasts in the order of 10 −8 to 10 −9 g and cause gelation. (See FIG. 1). Factor G exists as a factor that interacts with this (1 → 3) -β-D-glucan and initiates the gelation reaction. Factor G, like other factors, is a serine protease precursor, and is revealed to be a glycoprotein in which a 72 kDa a subunit and a 37 kDa b subunit are linked non-covalently. (Presented at the 64th Annual Meeting of the Japanese Biochemical Society in 1991).
In addition, the a subunit of factor G has a binding site specific for (1 → 3) -β-D-glucan, and the b subunit has a serine protease region, and (1 → 3) -β- It is believed that when D-glucan binds to the a subunit, factor G is activated to express the function of serine protease. However, the entire structure of factor G has not yet been clarified.
本発明は、上記したような状況を考慮してなされたものであって、カブトガニ・アメボサイト由来のG因子、特に(1→3)−β−D−グルカン結合部位を有するaサブユニットを単離精製し、その全構造を明らかにしようとするものである。
本発明の課題は、G因子の(1→3)−β−D−グルカン結合部位を含むポリペプチド及びそれをコードするDNAを提供することにある。
また、本発明の課題は、G因子のaサブユニットのポリペプチド及びそれをコードするDNAを提供することにある。
さらに、本発明の課題は、aサブユニットを含むG因子のポリペプチド及びそれをコードするDNAを提供することである。
The present invention has been made in consideration of the situation as described above, and isolates a factor G having a binding site derived from horseshoe crab / amebosite, particularly (1 → 3) -β-D-glucan. It is intended to purify and reveal its entire structure.
An object of the present invention is to provide a polypeptide containing a (1 → 3) -β-D-glucan binding site of factor G and DNA encoding the same.
Another object of the present invention is to provide a polypeptide of the G subunit a subunit and a DNA encoding the same.
Furthermore, the subject of this invention is providing the polypeptide of G which contains a subunit, and DNA which codes it.
従って、本発明は、アミノ酸配列Gln-Gln-Trp-Serで示されるモチーフ構造を少なくとも一箇所含むポリペプチドをコードする一本鎖のDNA又は該DNAと相補的なDNAとからなる二本鎖のDNAおよび該アミノ酸配列で示されるポリペプチドに関する。
また、本発明は、次のアミノ酸配列またはそれと相同性を有する配列で示されるポリペプチドをコードする一本鎖のDNA又は該DNAと相補的なDNAとからなる二本鎖のDNAおよび該アミノ酸配列で示されるポリペプチドに関する。
SerHisGluProLysTrpGlnLeuValTrpSerAspGluPheThrAsnGly
IleSerSerAspTrpGluPheGluMetGlyAsnGlyLeuAsnGlyTrpGly
AsnAsnGluLeuGlnTyrTyrArgArgGluAsnAlaGlnValGluGlyGly
LysLeuValIleThrAlaLysArgGluAspTyrAspGlyPheLysTyrThr
SerAlaArgLeuLysThrGlnPheAspLysSerTrpLysTyrGlyLysIle
GluAlaLysMetAlaIleProSerPheArgGlyValTrpValMetPheTrp
MetSerGlyAspAsnThrAsnTyrValArgTrpProSerSerGlyGluIle
AspPheIleGluHisArgAsnThrAsnAsnGluLysValArgGlyThrIle
HisTrpSerThrProAspGlyAlaHisAlaHisHisAsnArgGluSerAsn
ThrAsnGlyIleAspTyrHisIleTyrSerValGluTrpAsnSerSerIle
ValLysTrpPheValAsnGlyAsnGlnTyrPheGluValLysIleGlnGly
GlyValAsnGlyLysSerAlaPheArgAsnLysValPheValIleLeuAsn
MetAlaIleGlyGlyAsnTrpProGlyPheAspValAlaAspGluAlaPhe
ProAlaLysMetTyrIleAspTyrValArgValTyrGlnAspAlaSerThr
SerSerProValGlyAspThrSerLeuAspGlyTyrTyrPheValGlnAsn
ArgHisSerGluLeuTyrLeuAspValThrAspAlaSerAsnGluAspGly
AlaPheLeuGlnGlnTrpSerTyrSerGlyAsnGluAsnGlnGlnPheAsp
PheGluHisLeuGluAsnAsnValTyrLysIleThrAsnLysLysSerGly
LysSerLeuAspValTyrAsnPheGlyThrGluAsnGlyValArgIleGln
GlnTrpSerTyrGlyGlyAlaArgAsnGlnGlnPheThrValGlnSerVal
GlyAspGlyTyrTyrLysIleIleProArgGlySerGlyLysIleValGlu
ValAlaAspPheSerLysAspAlaGlyGlyLysIleGlnGlnTrpSerAsp
AsnAsnGlnLeuSerGlyGlnTrpLysLeuIleLysSerLysSerTyrSer
LysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheAspSerSerLysValGlnLeuGlu
AspThrSerAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGluGly
AlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyrArg
IleGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeuAsp
LeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspValProSerThrGly
GlyTrpGlnLysTrpThrThrIleSerHisThrValAsnValAspSerGly
ThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnArgAlaSerTrpAsnIleAsnTrp
IleLysIleThrLysIleProGluGlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArgArg
AsnSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluValGln
LeuGluAspThrLeuAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspLys
GluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlySer
TyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSer
LeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspIleProSer
ThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrIleSerHisIleValAsnValAsp
LeuGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnLysAlaSerTrpAsnIle
AsnTrpIleArgIleThrLysVal
現在までに4種のカブトガニが知られているが、その4種において、アメボサイトの成分であるコアギュローゲンの機能発現に必要な構造部分は互いに非常に類似している(73〜99%)。このことより、本発明のポリペプチドも4種のカブトガニ間でアミノ酸配列がコアギュローゲンの場合と同程度に類似していることが予測される。
すなわち、ポリペプチド間に相同性がある場合、アミノ酸配列は同一ではないにもかかわらず、その類似のアミノ酸配列により、同一あるいは類似した機能を発現する。したがって、上記に示されたアミノ酸配列そのものだけでなく、それと相同性を有するアミノ酸配列も本発明に包含されることは当業者にも容易に理解されるところである。
Therefore, the present invention provides a double-stranded DNA comprising a single-stranded DNA encoding a polypeptide containing at least one motif structure represented by the amino acid sequence Gln-Gln-Trp-Ser or a DNA complementary to the DNA. The present invention relates to DNA and a polypeptide represented by the amino acid sequence.
The present invention also provides a double-stranded DNA comprising a single-stranded DNA encoding a polypeptide represented by the following amino acid sequence or a sequence having homology thereto, or a DNA complementary to the DNA, and the amino acid sequence: It is related with polypeptide shown by.
SerHisGluProLysTrpGlnLeuValTrpSerAspGluPheThrAsnGly
IleSerSerAspTrpGluPheGluMetGlyAsnGlyLeuAsnGlyTrpGly
AsnAsnGluLeuGlnTyrTyrArgArgGluAsnAlaGlnValGluGlyGly
LysLeuValIleThrAlaLysArgGluAspTyrAspGlyPheLysTyrThr
SerAlaArgLeuLysThrGlnPheAspLysSerTrpLysTyrGlyLysIle
GluAlaLysMetAlaIleProSerPheArgGlyValTrpValMetPheTrp
MetSerGlyAspAsnThrAsnTyrValArgTrpProSerSerGlyGluIle
AspPheIleGluHisArgAsnThrAsnAsnGluLysValArgGlyThrIle
HisTrpSerThrProAspGlyAlaHisAlaHisHisAsnArgGluSerAsn
ThrAsnGlyIleAspTyrHisIleTyrSerValGluTrpAsnSerSerIle
ValLysTrpPheValAsnGlyAsnGlnTyrPheGluValLysIleGlnGly
GlyValAsnGlyLysSerAlaPheArgAsnLysValPheValIleLeuAsn
MetAlaIleGlyGlyAsnTrpProGlyPheAspValAlaAspGluAlaPhe
ProAlaLysMetTyrIleAspTyrValArgValTyrGlnAspAlaSerThr
SerSerProValGlyAspThrSerLeuAspGlyTyrTyrPheValGlnAsn
ArgHisSerGluLeuTyrLeuAspValThrAspAlaSerAsnGluAspGly
AlaPheLeuGlnGlnTrpSerTyrSerGlyAsnGluAsnGlnGlnPheAsp
PheGluHisLeuGluAsnAsnValTyrLysIleThrAsnLysLysSerGly
LysSerLeuAspValTyrAsnPheGlyThrGluAsnGlyValArgIleGln
GlnTrpSerTyrGlyGlyAlaArgAsnGlnGlnPheThrValGlnSerVal
GlyAspGlyTyrTyrLysIleIleProArgGlySerGlyLysIleValGlu
ValAlaAspPheSerLysAspAlaGlyGlyLysIleGlnGlnTrpSerAsp
AsnAsnGlnLeuSerGlyGlnTrpLysLeuIleLysSerLysSerTyrSer
LysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheAspSerSerLysValGlnLeuGlu
AspThrSerAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGluGly
AlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyrArg
IleGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeuAsp
LeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspValProSerThrGly
GlyTrpGlnLysTrpThrThrIleSerHisThrValAsnValAspSerGly
ThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnArgAlaSerTrpAsnIleAsnTrp
IleLysIleThrLysIleProGluGlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArgArg
AsnSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluValGln
LeuGluAspThrLeuAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspLys
GluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlySer
TyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSer
LeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspIleProSer
ThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrIleSerHisIleValAsnValAsp
LeuGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnLysAlaSerTrpAsnIle
AsnTrpIleArgIleThrLysVal
To date, four kinds of horseshoe crabs are known. In the four kinds, the structural parts necessary for the functional expression of coagulogen which is a component of amebosite are very similar to each other (73 to 99%). Based on this, it is predicted that the polypeptide of the present invention is similar in amino acid sequence among the four species of horseshoe crabs to the same extent as in the case of coagulogen.
That is, when there is homology between polypeptides, the same or similar function is expressed by the similar amino acid sequence even though the amino acid sequences are not identical. Therefore, those skilled in the art can easily understand that the present invention encompasses not only the amino acid sequence shown above but also amino acid sequences having homology thereto.
以下本発明について詳しく説明する。
まずG因子は、カブトガニ血球抽出液より種々のカラムクロマトグラフィーの操作、例えばデキストラン硫酸−セファロース CL-6B(Dextran sulfate-Sepharose CL-6B)およびコンカナバリンA−セファロース 4B(Con A-Sepharose 4B)によるアフィニティークロマトグラフィー、さらにセファクリル(Sephacryl) S-200HR によるゲル濾過クロマトグラフィーにより精製することができる(T.Morita etal(1981)FEBS Lett.,129(2),318-321、特公平3-399 号公報)。さらに、G因子を構成するaサブユニットおよびbサブユニットは、G因子を変性剤(界面活性剤等)により変性し、分子篩を用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分画することにより得ることができる。各々のサブユニットの部分アミノ酸配列は、それぞれのサブユニットを還元・アルキル化後、酵素消化することにより得られるペプチド断片のアミノ酸配列をペプチドシークエンサー等を用いて決定することにより得ることができる。また、カブトガニ血球より単離した poly(A)+ RNAより作製したcDNAライブラリーから前述した各々のサブユニットの部分アミノ酸配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドまたは各々のサブユニットに対する抗体等を用いることによりそれぞれのサブユニットをコードするcDNAを単離し、それらの塩基配列をダイデオキシチェインターミネーション法 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74,5463-5467 (1977) Sanger, F. et al.) 等により決定することができる。また、このように決定された塩基配列と上記部分アミノ酸配列を基に各サブユニットのアミノ酸配列を決定することができる。
以上の方法によって、配列番号1で示されるG因子のaサブユニットであるポリペプチドをコードするDNA(AGC ・・・・・・GTG;塩基番号114〜2075)およびそれに対応するアミノ酸配列(Ser ・・・・Val;アミノ酸番号1〜654)を明らかにした。
また、G因子のaサブユニットは、そのアミノ酸配列よりドメイン構造を有していることを明らかにした。
すなわち、aサブユニットのアミノ末端側(Pro ・・・・Ala;アミノ酸番号4〜236)にはβ−1,3−グルカナーゼのカルボキシル末端側の配列と類似した配列をもつグルカナーゼドメインが存在した(第2図)。一方、カルボキシル末端側には 126個のアミノ酸から構成される繰り返し構造(Ser ・・・・Ile;アミノ酸番号391〜516及び Ser・・・・Val ;アミノ酸番号529〜654)が存在し、またこの配列はキシラナーゼZのアミノ末端側の配列と類似していた(第3図)。さらに、これらのグルカナーゼドメインとキシラナーゼドメインとの間には”QQWS(Gln-Gln-Trp-Ser)”モチーフを含み、さらにキシラナーゼAの配列と類似した配列が三回繰り返して存在した(Leu ・・・・ Leu;アミノ酸番号247〜293、Glu ・・・・Val;アミノ酸番号294〜340及びGly ・・・・Ser;アミノ酸番号341〜387)(第4図)。
なお、第2図〜第4図においては各アミノ酸を1文字表記で表わした。
本発明では、これらのペプチドをコードするDNAを含む組換えDNAベクターを調製し、これを宿主に組み込み、培養あるいは飼育する、いわゆる遺伝子工学的手法によって、これらのペプチドを産生採取することができる。
以下、本発明の具体的実施例を説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
The present invention will be described in detail below.
First, factor G is subjected to various column chromatography operations from a horseshoe crab blood cell extract, for example, affinity by dextran sulfate-Sepharose CL-6B and concanavalin A-Sepharose 4B (Con A-Sepharose 4B). It can be purified by chromatography and gel filtration chromatography using Sephacryl S-200HR (T. Morita etal (1981) FEBS Lett., 129 (2), 318-321, Japanese Patent Publication No. 3-399). ). Furthermore, the a subunit and b subunit constituting the factor G are obtained by denaturing factor G with a denaturing agent (surfactant, etc.) and fractionating it by high performance liquid chromatography (HPLC) using a molecular sieve. Can do. The partial amino acid sequence of each subunit can be obtained by determining the amino acid sequence of a peptide fragment obtained by enzymatic digestion after reduction / alkylation of each subunit using a peptide sequencer or the like. In addition, by using an oligonucleotide synthesized based on the partial amino acid sequence of each subunit described above from a cDNA library prepared from poly (A) + RNA isolated from horseshoe crab blood cells, or an antibody to each subunit, etc. CDNAs encoding each subunit were isolated and their nucleotide sequences were determined by the dideoxy chain termination method (Proc. Natl.
By the above method, DNA encoding a polypeptide that is a subunit of factor G represented by SEQ ID NO: 1 (AGC... GTG; base numbers 114 to 2075) and the corresponding amino acid sequence (Ser. ... Val;
Moreover, it was clarified that the a subunit of factor G has a domain structure from its amino acid sequence.
That is, a glucanase domain having a sequence similar to the sequence at the carboxyl terminal side of β-1,3-glucanase was present on the amino terminal side of the a subunit (Pro... Ala;
In FIGS. 2 to 4, each amino acid is represented by one letter.
In the present invention, these peptides can be produced and collected by a so-called genetic engineering technique in which a recombinant DNA vector containing DNAs encoding these peptides is prepared, incorporated into a host, cultured or bred.
Hereinafter, specific examples of the present invention will be described, but the present invention is not limited thereto.
1.G因子の精製
(1)血球抽出液の調製
カブトガニ(Tachypleus tridentatus) の血球 113gに0.02Mトリス−塩酸緩衝液, pH8.0 (50mM 塩化ナトリウム含有)400mlを加え、高速ホモジナイザー (商品名、ヒスコトロン、日本精密工業(株))で3分間ホモジナイズした後、8000rpm 、30分間遠心し、上清を得た。さらに、遠心の際に生じた沈澱物に同一緩衝液300 mlを加え、前記操作と同様、ホモジナイズと遠心を行い再び上清を得た。この沈澱物に同一緩衝液を加えて遠心し、上清を回収する操作を、さらに2回繰り返し、遠心操作で得られた全ての上清を集め、1250mlの血球抽出液を得た。
(2)血球抽出液からのG因子の精製方法
a. デキストラン硫酸−セファロース CL-6Bカラムクロマトグラフィー
前記抽出液1250mlを、あらかじめ抽出用緩衝液で平衡化したデキストラン硫酸−セファロース CL-6Bカラム(5X17.8cm)(調製法は特公平3-399 号公報の調製例2参照)に添加し、充分に同緩衝液で洗浄した後、0.02Mトリス−塩酸緩衝液,pH8.0 (0.15M塩化ナトリウム含有) でカラムに吸着した余分なタンパク質を洗い流した。次いで、0.02Mトリス−塩酸緩衝液,pH8.0(0.25M塩化ナトリウム含有) でカラムに吸着したタンパク質を溶出し、G因子画分を得た。
b. コンカナバリンA−セファロース 4Bカラムクロマトグラフィー
前記のG因子画分を、あらかじめ0.02M トリス−塩酸緩衝液,pH8.0(0.25M塩化ナトリウム含有)で平衡化したCon A-Sepharose4Bカラム(ファルマシアバイオテク(株))(2X16cm)に添加し、平衡化緩衝液で充分に洗浄した後、0.02M トリス−塩酸緩衝液,pH8.0(0.5M塩化ナトリウム含有) で再度カラムを充分に洗浄した。洗浄後、0.02M トリス−塩酸緩衝液,pH8.0(0.5M塩化ナトリウム、0.5Mメチル−α−D−グルコシド含有)でカラムに吸着したタンパク質を溶出し、G因子画分を得た。
c.セファクリル S-200 HRカラムクロマトグラフィー
前記のG因子画分を限外濾過により濃縮した後、あらかじめ0.05M リン酸ナトリウム緩衝液,pH6.5 で平衡化したSephacrylS-200HR カラム(ファルマシアバイオテク(株)) (2.7X98cm)に添加し、同緩衝液でタンパク質を溶出した。このクロマトグラフィーで最後に溶出され、280 nmの波長でわずかな吸収しか示さないタンパク質の画分を集めた。このようにして得られたタンパク質をG因子の最終精製標品とした。最終的に 113gの血球より、牛血清アルブミン換算で約 300μgのG因子を得た。
1. Purification of Factor G (1) Preparation of blood cell extract 400 ml of 0.02M Tris-HCl buffer solution, pH8.0 (containing 50 mM sodium chloride) is added to 113 g of blood cells of horseshoe crab (Tachypleus tridentatus), and a high-speed homogenizer (trade name, Hiscotron, (Nippon Seimitsu Kogyo Co., Ltd.) for 3 minutes and then centrifuged at 8000 rpm for 30 minutes to obtain a supernatant. Furthermore, 300 ml of the same buffer was added to the precipitate generated during centrifugation, and the supernatant was obtained again by homogenization and centrifugation as in the above operation. The operation of adding the same buffer to the precipitate and centrifuging and collecting the supernatant was further repeated twice, and all the supernatants obtained by the centrifugation were collected to obtain 1250 ml of blood cell extract.
(2) Purification method of factor G from blood cell extract
Dextran Sulfate-Sepharose CL-6B Column Chromatography 1250 ml of the above extract was equilibrated in advance with a buffer for extraction. Dextran Sulfate-Sepharose CL-6B Column (5X17.8cm) (See Preparation Example 2 in the publication), and after washing thoroughly with the same buffer, the excess protein adsorbed on the column was washed away with 0.02 M Tris-HCl buffer, pH 8.0 (containing 0.15 M sodium chloride). . Subsequently, the protein adsorbed on the column was eluted with 0.02 M Tris-HCl buffer, pH 8.0 (containing 0.25 M sodium chloride) to obtain a factor G fraction.
b. Concanavalin A-Sepharose 4B Column Chromatography The above-mentioned Factor G fraction was equilibrated with 0.02M Tris-HCl buffer, pH 8.0 (containing 0.25M sodium chloride) in advance, a Con A-Sepharose 4B column (Pharmacia Biotech ( The column was thoroughly washed again with 0.02M Tris-HCl buffer, pH 8.0 (containing 0.5M sodium chloride). After washing, the protein adsorbed on the column was eluted with 0.02 M Tris-HCl buffer, pH 8.0 (containing 0.5 M sodium chloride and 0.5 M methyl-α-D-glucoside) to obtain a factor G fraction.
c. Sephacryl S-200 HR column chromatography The above-mentioned factor G fraction was concentrated by ultrafiltration, and then a Sephacryl S-200HR column (Pharmacia Biotech Co., Ltd.) equilibrated in advance with 0.05 M sodium phosphate buffer, pH 6.5. )) (2.7 × 98 cm) and the protein was eluted with the same buffer. The fraction of the protein that eluted last in this chromatography and showed little absorption at a wavelength of 280 nm was collected. The protein thus obtained was used as the final purified preparation of factor G. Finally, about 300 μg of factor G in terms of bovine serum albumin was obtained from 113 g of blood cells.
2.G因子のa サブユニットの部分配列の決定
(1)G因子のaサブユニットとbサブユニットの分離
G因子のaサブユニットとbサブユニットのcDNAクローニングを行うために必要なG因子のa、bサブユニットの部分アミノ酸配列を明らかにするため、まずG因子のaサブユニットとbサブユニットを分離した。前記1で得られたG因子を脱塩と濃縮とを兼ねて、メタノールとクロロホルムを用いて沈澱させた後(Methods in Enzymology vol.182, p78-79, (1990)) 、2%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)溶液に溶解し、100 ℃で5分間加熱した。この加熱した試料を、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液,pH7.0 (0.1%SDSを含む)を移動相として用いた、二本を連結したTSKgel G3000SWによるゲル濾過に付すことにより、G因子のa、bサブユニットを分離した。
(2)G因子のaサブユニットの酵素消化
前記2(1)で得られたG因子のaサブユニットの画分に終濃度で17.4%(W/V)になるようにトリクロロ酢酸(TCA)を加えてG因子のaサブユニットを沈澱させた。Paul Matsudaira の方法 (A Practical Guide to Protein and Peptide Purifica-tion for Microsequencing, p42-43 ,1989, Academic Press,Inc.発行)に従い、沈澱させたG因子のaサブユニットを0.4M重炭酸アンモニウム(8M尿素を含む)に溶解し、ヨードアセトアミドを用いて還元アルキル化を行い、次いで水を加えて尿素濃度を4Mに希釈した後、酵素−基質重量比1:60のリシルエンドペプチダーゼ(lysyl endopeptidase,和光純薬工業(株)) を加え37℃で20時間酵素消化した。この消化物をあらかじめ0.06%(V/V) トリフルオロ酢酸で平衡化したμBondasphere 5μC8-300Å(2.1X150mm) (ウォーターズ社) に添加し、充分にカラムを洗浄した後、5分後に0%(V/V)、65分後に24%(V/V) 、125分後に56%(V/V) 、135分後に80%(V/V) までアセトニトリル濃度を連続的に上昇させた直線的濃度勾配法を用いて、 0.2ml/min の流速で吸着したタンパク質を溶出した。この際溶出される各ペプチドは210nm の紫外部吸収でモニターし、全て分取した。
(3)部分アミノ酸配列の決定
得られた各ペプチドのアミノ酸配列を気相シークエンサー477A(アプライド バイオシステムズ ジャパン(株))を用いて決定した。この結果を第1表に示す。
2. Determination of partial sequence of a subunit of factor G (1) Separation of a subunit and b subunit of factor G a, a factor G necessary for cDNA cloning of a subunit and b subunit of factor G, In order to clarify the partial amino acid sequence of the b subunit, the a subunit and the b subunit of factor G were first separated. The factor G obtained in 1 above is precipitated with methanol and chloroform for both desalting and concentration (Methods in Enzymology vol.182, p78-79, (1990)), and then 2% SDS (dodecyl). Sodium sulfate) solution and heated at 100 ° C. for 5 minutes. The heated sample was subjected to gel filtration with TSKgel G3000SW, which was linked to two using 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.0 (containing 0.1% SDS) as the mobile phase, thereby allowing a factor G a , B subunits were separated.
(2) Enzymatic digestion of factor G a subunit Trichloroacetic acid (TCA) to a final concentration of 17.4% (W / V) in the fraction of factor G a subunit obtained in 2 (1) above Was added to precipitate the G subunit a subunit. According to the method of Paul Matsudaira (A Practical Guide to Protein and Peptide Purifica-tion for Microsequencing, p42-43, 1989, Academic Press, Inc.), the a subunit of the factor G was converted to 0.4M ammonium bicarbonate (8M And then reductive alkylation with iodoacetamide, and after adding water to dilute the urea concentration to 4M, lysyl endopeptidase, 1:60 enzyme-substrate weight ratio Koji Junyaku Kogyo Co., Ltd. was added and the enzyme was digested at 37 ° C for 20 hours. This digest was added to μBondasphere 5μC8-300Å (2.1X150mm) (Waters) equilibrated with 0.06% (V / V) trifluoroacetic acid in advance, and the column was thoroughly washed. After 5 minutes, 0% (V / V), 24% (V / V) after 65 minutes, 56% (V / V) after 125 minutes, and 80% (V / V) after 135 minutes. Using this method, the adsorbed protein was eluted at a flow rate of 0.2 ml / min. Each peptide eluted at this time was monitored by ultraviolet absorption at 210 nm, and all were collected.
(3) Determination of partial amino acid sequence The amino acid sequence of each obtained peptide was determined using a gas phase sequencer 477A (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.). The results are shown in Table 1.
3.オリゴヌクレオチドの合成
第1表の決定したアミノ酸配列の中から、2種のアミノ酸配列A:-Glu-Asp-Tyr-Asp-Gly-Phe- 、B:-Trp-Val-Met-Phe-Trp-Met- を利用して、A をセンスに、B をアンチセンスに逆翻訳し、さらに 5′末端側に制限酵素認識配列とDNA の保護のための2塩基を付けた以下に示す様なそれぞれ25個と26個のオリゴヌクレオチドの混合物をDNAシンセサイザー380A(アプライド バイオシステムズ ジャパン(株))を用いて合成した。
4.G因子をコードするmRNAを含む poly(A)+ RNA の調製
G因子はカブトガニ血球より精製されることから、 poly(A)+ RNA はカブトガニ血球より単離した。
(1)全RNAの調製
カブトガニ血球11.8gよりAGPC法 (実験医学Vol.9, p1937〜1940を参照) を用いて、全RNA 約11mgを分離した。
(2) poly(A)+ RNA の調製
分離した全RNA のうち約2mg の全RNA よりOligotex-dT 30 Superキット(日本ロシュ(株))を用いて poly(A)+ RNA を単離した。さらに、一度単離した poly(A)+ RNA は、より純度を高めるために、同様の操作をもう一度繰り返した。このように2度のOligotex-dT 30 Superキットの操作により、2 mgの全RNA から34.5μgの高純度の poly(A)+ RNA を得た。
4). Preparation of poly (A) + RNA containing mRNA encoding factor G Since factor G is purified from horseshoe crab blood cells, poly (A) + RNA was isolated from horseshoe crab blood cells.
(1) Preparation of total RNA About 11 mg of total RNA was isolated from 11.8 g of horseshoe crab blood cells using the AGPC method (see Experimental Medicine Vol. 9, p1937 to 1940).
(2) poly (A) + RNA Oligotex-dT 30 Super kit from total RNA of approximately 2mg of the total RNA prepared separate poly using (Nippon Roche (Ltd.)) (A) + RNA was isolated. Further, once isolated poly (A) + RNA, the same operation was repeated once again in order to further increase the purity. Thus, 34.5 μg of high-purity poly (A) + RNA was obtained from 2 mg of total RNA by operating the Oligotex-dT 30 Super kit twice.
5.カブトガニ血球cDNAのライブラリーの作製
(1)cDNAの合成
前記4で得た poly(A)+ RNA 34.5μgのうち 5μgの poly(A) + RNA からアマシャム社のcDNA synthesisキットを利用し、cDNAを合成した。
(2)cDNAライブラリーの作製
(1)で合成したcDNAからアマシャム社のcDNAクローニングシステムλgt10アダプター法を利用し、カブトガニ血球cDNAライブラリーを作製した。
5. Using Amersham cDNA synthesis kit from 5μg of poly (A) + RNA of the horseshoe crab Preparation of blood cells cDNA library (1) poly obtained in Synthesis said fourth cDNA (A) + RNA 34.5μg, the cDNA Synthesized.
(2) Preparation of cDNA Library A horseshoe crab blood cell cDNA library was prepared from the cDNA synthesized in (1) using the Amersham cDNA cloning system λgt10 adapter method.
6.G因子のaサブユニットのcDNAクローニング
前記4(2)で得られた poly(A)+ RNA を鋳型とし、さらに前記3で合成したオリゴヌクレオチドを用いて、PCR 法(Saiki,R.K. et al, Science, 239,487-491,1988)を行いG因子のaサブユニットの一部をコードするcDNAフラグメントを増幅した。このcDNAフラグメントをマルチプライム-DNAラベリングキット (日本ジーン(株))を利用して[ α−32P]dCTP でラベルしたものをプローブとして、前記5.(2)で作製したcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、長さが最も長い約2,400bp のインサートcDNAを含む二つのポジティブクローンを得た。これらのクローンのインサートcDNAは、5'末端側と3'末端側の長さが数塩基異なることを除けば、全く同一であった。また両者の塩基配列を決定し、それらを複合した塩基配列は、開始コドンと poly(A)+ tailを含み、2,408bpの大きさを示した。
6). CDNA cloning of the a subunit of factor G Using the poly (A) + RNA obtained in 4 (2) above as a template and further using the oligonucleotide synthesized in 3 above, the PCR method (Saiki, RK et al, Science 239, 487-491, 1988), and a cDNA fragment encoding a part of the a subunit of factor G was amplified. Using this multi-prime-DNA labeling kit (Nippon Gene Co., Ltd.) labeled with [α- 32 P] dCTP as a probe, the cDNA library prepared in 5. (2) above was screened. As a result, two positive clones containing about 2,400 bp of insert cDNA having the longest length were obtained. The insert cDNAs of these clones were exactly the same except that the lengths of the 5 ′ end side and the 3 ′ end side differed by several bases. In addition, the base sequences of both were determined, and the composite base sequence including the start codon and poly (A) + tail showed a size of 2,408 bp.
7.G因子のaサブユニットをコードするcDNA塩基配列の決定
上記6.で得られたインサートcDNAをpUC118ベクター及びpBluescript II SK ベクターに組み込んだ。pUC118ベクター及びpBluescript II SK ベクターにクローニングしたcDNAの全塩基配列を決定するために、cDNA断片上の制限酵素認識部位ならびにキロ−シークエンスデレーションキット(宝酒造(株))を用いたデレーションによるサブクローニングを行った。上記方法により作製したクローン中のcDNAの塩基配列を螢光ラベルしたヌクレオチドプライマーを使用したDNA シークエンサー370A(アプライド バイオシステムズ ジャパン(株))(Smith, L. M. et al(1986) Nature 321, 674-679)を用いて決定した。
このように決定したG因子のaサブユニットのcDNAの塩基配列、ならびにそれより明らかにされたアミノ酸配列を配列番号1の配列表に示した。このアミノ酸配列中に、2(3)で決定した部分アミノ酸配列(第1表)が全て含まれており、今回塩基配列を決定したインサートcDNAはG因子のaサブユニットを確かにコードしていた。
7). Determination of cDNA base sequence encoding a subunit of factor G 6. The insert cDNA obtained in (1) was incorporated into the pUC118 vector and the pBluescript II SK vector. In order to determine the entire nucleotide sequence of cDNA cloned into pUC118 vector and pBluescript II SK vector, subcloning by restriction using restriction enzyme recognition site on cDNA fragment and kilo-sequence deletion kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) went. DNA Sequencer 370A (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.) (Smith, LM et al (1986) Nature 321, 674-679) using a nucleotide primer fluorescently labeled with the base sequence of cDNA in the clone produced by the above method Was used to determine.
The nucleotide sequence of the a subunit cDNA of factor G determined as described above and the amino acid sequence clarified therefrom are shown in the sequence listing of SEQ ID NO: 1. This amino acid sequence contained all the partial amino acid sequences determined in 2 (3) (Table 1), and the insert cDNA whose base sequence was determined this time surely encoded the a subunit of factor G. .
8.G因子またはそのサブユニットの発現および精製
上記で得られたクローンからG因子のaサブユニットをコードする遺伝子の全部あるいは一部を超音波処理、制限酵素処理またはこの技術分野において知られた他の方法により切り出し、適当なベクターに組み込む。ベクターとしては宿主微生物体内あるいは細胞内で自律的に増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組み替え用として構築されたもの、つまり適当なプロモーター、SD配列、翻訳開始コドンATG、あるいはさらに適当な構造遺伝子を含むようなものが適している。この構築したベクターを適当な宿主生物または細胞に移入することに、より形質転換体を得ることができる。宿主としては、種々の大腸菌株、種々の酵母菌株、ハツカネズミ、ラット、チャイニーズハムスター等の動物の卵母細胞(CHO)のような動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動植物昆虫宿主等である。このようにして得られた形質転換体を栄養培地で培養することにより、あるいは栄養食で飼育することにより多量のG因子またはそのサブユニット(以下、G因子等という)を安定して生産することができる。形質転換体の培養あるいは飼育条件は、G因子等を生産する範囲で適宜変更可能であるが、用いた宿主が生育し、この技術分野において一般に知られている条件を用いるとよい。培養物中のあるいは飼育物中のG因子等は、菌体あるいは細胞を含む培養液あるいは個体を適当な機械的な方法で破砕した抽出液をそのまま採取し、利用することもできる。しかし、一般には常法に従って、G因子等が培養液中あるいは抽出液中に存在する場合には、濾過、遠心分離などによりG因子等含有溶液と菌体、細胞あるいは個体の破砕破片とを分離した後に利用される。G因子等が菌体内、細胞内あるいは個体の臓器膜内に存在する場合には、得られた培養物あるいは破片を濾過または遠心分離などの手段により、菌体、細胞あるいは破片を採取し、次いでこの物を機械的方法または超音波処理またはリゾチーム等の酵素的方法またはEDTA等のキレート剤および/または界面活性剤を添加してG因子等を可溶化して分離採取する。このようにして得られたG因子等含有溶液からのG因子等の単離は、通常知られているタンパク質の精製方法に従うことにより可能である。
この際、G因子等をキメラポリペプチドとして発現していれば、他方のタンパク質の性質を利用して容易に単離することが可能である。例えば他方のタンパク質のある物との親和性を利用して、アフィニティークロマトグラフィーにより容易に単離することが可能である。
実際にG因子aサブユニットは、次のような方法で発現できる。
5’−AGCCACGAACCAAAGTGGCA−3’の配列をもつオリゴヌクレオチドを合成し、さらに5’末端をリン酸化する。次いでこのオリゴヌクレオチドをG因子のaサブユニットをコードする遺伝子が組み込まれたプラスミドより調製した一本鎖DNAとハイブリダイズし、Klenow fragment などのDNAポリメラーゼによる伸長反応を行い、この際生じる一本鎖部分を Mung bean nucleaseなどのDNAヌクレアーゼで切断し、二本鎖DNAとする。この二本鎖DNAをSph I制限酵素で切断し、この際生じる接着末端はT4 DNAポリメラーゼあるいはKlenow fragmentあるいはBluntingキットにより平滑化する。この二本鎖DNAをあらかじめNco I制限酵素で切断し、この際生じる接着末端はT4 DNAポリメラーゼあるいはKlenow fragmentあるいはBluntingキットにより平滑化したpTV118N(アンピシリン耐性遺伝子を含む)に組み込んだ。このプラスミドをE.coli JM109あるいはE.coli MV1184に導入し、形質転換体を得る。この際、必要な形質転換体はプラスミドの性質を利用した一般的な方法で選択することができる。すなわち、アンピシリンを含むLBプレート(5−ブロモ−4−クロロ−3−3インドリル−β−D−ガラクトシド(X−gal)/イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)をあらかじめ塗布したもの)上で培養し、目的のプラスミドの導入された白色コロニーを拾い上げて選択する。さらに正しい配列をもつプラスミドは、5’−AAACAGACCATGAGCCACGAACCA−3’の合成オリゴヌクレオチドをプローブとしてスクリーニングして得ることができる。さらにRV−Nプライマー(宝酒造(株))をシークエンシングプライマーとして用いたDNAシークエンシングにより正しくプラスミドが構築されたことをさらに確認することができる。正しい配列をもつプラスミドが導入されたE.coli JM109あるいはMV1184を100μg/ml アンピシリンと1mM IPTGを含む3%Nutrient broth(日水製薬(株))にて30℃、24時間培養する。この培養上清あるいは菌体抽出液より、一般的に用いられている方法によりG因子のaサブユニットを精製する。このとき抗体あるいはG因子のaサブユニットに親和性をもつリガンドなどを用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、より簡単に精製することが可能である。
8). Expression and purification of factor G or its subunits All or part of the gene encoding factor G a subunit from the clones obtained above is sonicated, restriction enzyme treated or other known in the art Cut out by the method and incorporate into an appropriate vector. Vectors constructed for gene recombination from phages or plasmids that can grow autonomously in host microorganisms or cells, including appropriate promoters, SD sequences, translation initiation codons ATG, or more appropriate structural genes Such a thing is suitable. More transformants can be obtained by transferring the constructed vector into an appropriate host organism or cell. Examples of the host include various E. coli strains, various yeast strains, animal cells such as oocytes (CHO) of animals such as mice, rats, and Chinese hamsters, plant cells, insect cells, and animal and plant insect hosts. Stable production of a large amount of G factor or a subunit thereof (hereinafter referred to as G factor, etc.) by culturing the transformant thus obtained in a nutrient medium or by breeding with a nutrient diet Can do. The culture or breeding conditions of the transformant can be appropriately changed within a range in which factor G or the like is produced, but the conditions generally known in this technical field may be used as the host used grows. As for G-factor and the like in culture or breeding, a culture solution containing cells or cells or an extract obtained by crushing an individual by an appropriate mechanical method can be collected and used as it is. However, in general, when a factor G or the like is present in a culture solution or an extract according to a conventional method, the solution containing the factor G or the like is separated from cells, cells or individual fragments by filtration or centrifugation. After use. When factor G or the like is present in the microbial cells, cells or in the organ membrane of the individual, the cultivated cells, cells or debris are collected by means such as filtration or centrifugation of the obtained culture or debris, This product is separated and collected by solubilizing factor G or the like by adding a mechanical method, an ultrasonic method such as sonication or lysozyme, or a chelating agent such as EDTA and / or a surfactant. Isolation of factor G and the like from the solution containing factor G and the like thus obtained is possible by following a generally known protein purification method.
At this time, if factor G or the like is expressed as a chimeric polypeptide, it can be easily isolated using the properties of the other protein. For example, it can be easily isolated by affinity chromatography utilizing the affinity with the other protein.
Actually, the factor G a subunit can be expressed by the following method.
An oligonucleotide having the
1.G因子のbサブユニットの部分アミノ酸配列の決定
(1)G因子bサブユニットの単離
実施例1の2.(1)でG因子をaサブユニットとbサブユニットに分離することにより、bサブユニットも同様に得た。
(2)G因子のbサブユニットの酵素消化
前記(1)で得られたG因子のbサブユニットから実施例1の2.(2)と同じ方法でペプチド断片を得た。
(3)部分アミノ酸配列の決定
得られた各ペプチドのアミノ酸配列を実施例1の2.(3)と同様に決定した。この結果を第2表に示す。
1. Determination of partial amino acid sequence of factor G b subunit (1) Isolation of factor G b subunit By separating factor G into a subunit and b subunit in (1), b subunit was obtained in the same manner.
(2) Enzymatic digestion of b subunit of
(3) Determination of partial amino acid sequence The amino acid sequence of each obtained peptide was determined as 2. It determined similarly to (3). The results are shown in Table 2.
2.オリゴヌクレオチドの合成
決定したアミノ酸配列の中から、2種のアミノ酸配列C:-Asn-Glu-Gln-Cys-(Asn)-Lys、D:-Met-Tyr-Gln-Asn-Pro-Thr-の配列を利用して、CをセンスにDをアンチセンスに逆翻訳し、実施例1の3.と同様の方法で以下に示す様なそれぞれ25個のオリゴヌクレオチドC’およびD’の混合物を合成した。前記C中-(Asn)- は、Asnと推定したことを示す。
4.G因子のbサブユニットのcDNAクローニング
実施例1の4.(2)で得られた poly(A)+ RNA を鋳型とし、
さらに前記2で合成したオリゴヌクレオチドを用いて、以下実施例1の6.と同様の方法で実験を行い、1,979bpのcDNAを含むポジティブクローンを得た。このクローンのインサートcDNAの塩基配列を解析したところ、前記1.(2)で得られたG因子のbサブユニット由来のペプチドのアミノ酸配列に相当する塩基配列を含んでおり、さらに poly A付加シグナルが存在し、またその大きさからこのクローンは全長のcDNAであると思われる。
4). CDNA cloning of the G subunit b subunit Using poly (A) + RNA obtained in (2) as a template,
Further, using the oligonucleotide synthesized in the above 2, the following 6. Experiments were performed in the same manner as described above to obtain positive clones containing 1,979 bp cDNA. Analysis of the base sequence of the insert cDNA of this clone revealed that it contained the base sequence corresponding to the amino acid sequence of the peptide derived from the G subunit b subunit obtained in 1. (2) above, and further added a poly A addition signal. And the size of this clone seems to be a full-length cDNA.
5.G因子のbサブユニットをコードするcDNA塩基配列の決定
G因子のbサブユニットのcDNAの塩基配列は、実施例1の7.と同様の方法で決定した。このように検討した結果、明らかになったG因子のbサブユニットのcDNAの塩基配列ならびにそれより明らかにされたG因子のbサブユニットのアミノ酸配列を配列番号2の配列表に示した。
このアミノ酸配列中に実施例2の1(3)で決定した部分アミノ酸配列(表2)が全て含まれていることから、今回塩基配列を決定したインサートcDNAはG因子のbサブユニットを確かにコードしていた。
実施例2で採取したポリペプチドをコードするcDNAを含む組み換えDNAベクターを複製可能な宿主微生物、適当な動物細胞、昆虫あるいは昆虫細胞に移入した後、ベクターのマーカーと(1→3)−β−D−グルカン結合能とを指標としてスクリーニングして取得した、該組み換えDNAベクターを保持する微生物、動物細胞、昆虫あるいは昆虫細胞を培養あるいは飼育し、本発明のポリペプチドを採取することができる。
5. Determination of cDNA base sequence encoding factor G b subunit The base sequence of the factor G b subunit cDNA is the same as that of Example 1. It was determined by the same method. As a result of the examination as described above, the nucleotide sequence of the cDNA of the G subunit of the G factor that has been clarified and the amino acid sequence of the G subunit of the G subunit revealed therefrom are shown in the sequence listing of SEQ ID NO: 2.
Since this partial amino acid sequence (Table 2) determined in 1 (3) of Example 2 was included in this amino acid sequence, the insert cDNA whose base sequence was determined this time surely identifies the b subunit of factor G. I was coding.
After transferring the recombinant DNA vector containing the cDNA encoding the polypeptide collected in Example 2 to a replicable host microorganism, an appropriate animal cell, insect or insect cell, the vector marker and (1 → 3) -β- The polypeptide of the present invention can be collected by culturing or breeding microorganisms, animal cells, insects or insect cells carrying the recombinant DNA vector obtained by screening using D-glucan binding ability as an index.
本発明ではカブトガニのアメボサイト・ライセートのG因子のaサブユニットを単離精製し、そのアミノ酸配列およびそれをコードするcDNA塩基配列を決定した。
その結果、この配列中に(1→3)−β−D−グルカン結合部位の配列が含まれており、これらのcDNAを用いて遺伝子工学的手法によりその結合部位に相当するポリペプチドを得ることができる。得られるポリペプチドは、次の種々の効果を示す。
(1)近年、免疫不全患者の増加、高齢化に伴って、カンジダ、
アスペルギルス等のように通常病原性の弱い二次病原体による日和見真菌感染が目立って増加している。しかし特に真菌による内臓等の深在性真菌症は一部の特殊な病型を除いては侵襲的な手段によらない限り臨床診断が困難であり、そのため剖検後初めて診断されることが多い(微生物学辞典、1989年、技報堂)。
上記深在性真菌症の診断は、該(1→3)−β−D−グルカン結合部位を含むポリペプチドまたは(1→3)−β−D−グルカンを放射性同位元素、酵素、螢光物質、発光物質などの標識物質を用いてラベル化したものを用いてリガンドーレセプター・アッセイ法によって(1→3)−β−D−グルカンを測定することによって行うことができる。また、該ポリペプチドをマイクロプレート、試験管、ビーズなどの固相に結合して(1→3)−β−D−グルカンを特異的に捕捉して検出する方法等の測定法によることもできる。このような測定法より体液中の真菌由来の(1→3)−β−D−グルカンを特異的に測定し、深在性真菌症の診断を簡便かつ迅速に行うことができる。
(2)また、(1→3)−β−D−グルカン結合部位を含むポリペプチドに抗真菌剤を結合させた医薬は病巣に強い親和性を有し、(1→3)−β−D−グルカンが細胞壁に存在する病巣の真菌を特異的に殺菌する新たな選択的抗真菌剤となりうる。
(3)さらに、近年の遺伝子操作技術の発達に伴い、目的タンパク質を発現する際に目的とするタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの宿主として、酵母菌が繁用されている。これは、糖タンパク質の生産が可能で、細菌と同じく大量培養が可能であるためである。しかし、問題点として、生産物中に極微量の(1→3)−β−D−グルカンを構成成分として持つ酵母菌の残渣が含まれることが多く、その定量及び除去が必要となる。この場合に、(1→3)−β−D−グルカン結合部位を含むポリペプチドを支持体に結合したアフィニティー担体を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、特異的に酵母菌の残渣の除去、あるいは定量を行うことができ、また除去後の生産物に酵母菌菌体成分が存在しないことの確認も、(1)に述べたような(1→3)−β−D−グルカン結合部位を含むポリペプチドを用いた定量法を行うことによって、カブトガニ・アメボサイト・ライセートを用いた場合に比べてより簡便で特異性の高い確認が可能となる。
In the present invention, the a subunit of factor G of horseshoe crab amebocyte lysate was isolated and purified, and its amino acid sequence and the cDNA base sequence encoding it were determined.
As a result, this sequence contains the sequence of (1 → 3) -β-D-glucan binding site, and using these cDNAs, a polypeptide corresponding to the binding site is obtained by genetic engineering techniques. Can do. The resulting polypeptide exhibits the following various effects.
(1) In recent years, with increasing number of immunocompromised patients and aging, Candida,
Opportunistic fungal infections by secondary pathogens that are usually weakly pathogenic, such as Aspergillus, have increased markedly. However, in particular, deep mycoses such as visceral organs due to fungi are difficult to diagnose clinically unless they are invasive except for some special disease types, and are therefore often diagnosed for the first time after autopsy ( Microbiology Dictionary, 1989, Gihodo).
The above-mentioned deep mycosis is diagnosed by using the polypeptide containing the (1 → 3) -β-D-glucan binding site or (1 → 3) -β-D-glucan as a radioisotope, enzyme, fluorescent substance. This can be carried out by measuring (1 → 3) -β-D-glucan by a ligand-receptor assay using a substance labeled with a labeling substance such as a luminescent substance. Alternatively, the polypeptide can be bound to a solid phase such as a microplate, a test tube, or a bead, and (1 → 3) -β-D-glucan can be specifically captured and detected. . From such a measurement method, fungal-derived (1 → 3) -β-D-glucan in a body fluid can be specifically measured, and diagnosis of deep mycosis can be performed easily and rapidly.
(2) In addition, a drug in which an antifungal agent is bound to a polypeptide containing a (1 → 3) -β-D-glucan binding site has a strong affinity for a lesion, and (1 → 3) -β-D -Glucan can be a new selective antifungal agent that specifically kills focal fungi present in the cell wall.
(3) Furthermore, with the recent development of gene manipulation techniques, yeast is frequently used as a host for a vector containing a gene encoding a target protein when the target protein is expressed. This is because glycoproteins can be produced and can be cultured in large quantities like bacteria. However, as a problem, the product often contains a residue of yeast having a very small amount of (1 → 3) -β-D-glucan as a constituent component, and its quantification and removal are required. In this case, by performing affinity chromatography using an affinity carrier obtained by binding a polypeptide containing a (1 → 3) -β-D-glucan binding site to a support, removal of yeast residues specifically, Alternatively, quantification can be performed, and confirmation of the absence of yeast cell components in the product after removal can also be achieved by using the (1 → 3) -β-D-glucan binding site as described in (1). By carrying out the quantification method using the contained polypeptide, it is possible to confirm more simply and with higher specificity than when using horseshoe crab, amebocyte, lysate.
[配列表]
[Sequence Listing]
Claims (1)
SerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheAspSerSerLysValGlnLeu
GluAspThrSerAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGlu
GlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyr
ArgIleGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeu
AspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspValProSerThr
GlyGlyTrpGlnLysTrpThrThrIleSerHisThrValAsnValAspSer
GlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnArgAlaSerTrpAsnIleAsn
TrpIleLysIleThrLysIleProGluGlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArg
ArgAsnSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluVal
GlnLeuGluAspThrLeuAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAsp
LysGluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGly
SerTyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeu
SerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspIlePro
SerThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrIleSerHisIleValAsnVal
AspLeuGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnLysAlaSerTrpAsn
IleAsnTrpIleArgIleThrLysVal
A method for measuring (1 → 3) -β-D-glucan using a polypeptide (amino acid number 391-654 in Sequence Listing 1) which is a xylanase domain represented by the following amino acid sequence:
SerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheAspSerSerLysValGlnLeu
GluAspThrSerAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGlu
GlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyr
ArgIleGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeu
AspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspValProSerThr
GlyGlyTrpGlnLysTrpThrThrIleSerHisThrValAsnValAspSer
GlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnArgAlaSerTrpAsnIleAsn
TrpIleLysIleThrLysIleProGluGlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArg
ArgAsnSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluVal
GlnLeuGluAspThrLeuAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAsp
LysGluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGly
SerTyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeu
SerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspIlePro
SerThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrIleSerHisIleValAsnVal
AspLeuGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnLysAlaSerTrpAsn
IleAsnTrpIleArgIleThrLysVal
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