JP2006087376A - 細胞トラップデバイス - Google Patents

Abstract

【課題】 細胞をマニピュレートするときに、細胞に与える影響を軽減することを目的とする。
【解決手段】 本発明は、細胞トラップデバイスであって、該デバイスの片面には、流体が流れる流路が設けられ、該流路には、少なくとも4つ以上の凸型電極が形成され、該凸型電極と相対する面には、対電極が形成されていることを特徴とする細胞トラップデバイスを提供する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、細胞をトラップするため、またはマニピュレートするためのデバイスに関する。

近年、マイクロ加工技術を化学分析、バイオ分析技術に応用しようとする試みが盛んになってきており、DNAチップ、電気泳動チップ、プロテインチップなどの様々な応用が試みられている。

一方、ゲノム、プロテオームなどの分子生物学から発する生命現象の解明は、より包括的な研究に広がりを見せ始めている。特に、最近では細胞内における生態物質の動的変化、更には一群の細胞の協調的な動きなど、より個体レベルに近づいた研究も行われている。

このような研究において、細胞内の変化を観察するための技術は、非常に重要な技術である。複数の細胞を同時に観察する際に、細胞を1つずつマニピュレートすることが必要である。従来の細胞をマニピュレートする技術としては、たとえば先端を10μm程度に絞ったニードルガラスを使用する方法がある。この方法では、顕微鏡下で観察しながら、機械的X、Y軸駆動機構に連結されたニードルガラスを介して細胞のマニピュレートが行われる。

また、同様に顕微鏡下でレーザトラップ技術を利用してビーズや細胞をトラップする方法もある。レーザトラップ技術とは、微妙な球にレーザ光をフォーカスさせて光を屈折させることにより、この屈折による光路変化を微小球の把持力としてマニピュレーションを行うものである。

また、上記技術とは異なり、誘電電気泳動(誘電泳動)を利用することも行われている。誘電電気泳動とは、電界強度を徐々に変化させた向流電場を形成すると、物質が電界強度の強い方向に引かれること(正の誘電泳動)、または電界強度の小さい方向に向かうこと(負の誘電泳動)を利用した技術である。同一電場においては、分子量、荷電状態、緩衝液成分、電解の強さ、または周波数によって引かれ易さが異なることを利用している。このような誘電電気泳動を利用した細胞マニピュレートの例として、たとえば特許文献1があげられ、複合体を形成させることにより電界強度500kV/M以上の不均一電解において分離する方法が記載されている。また、特許文献2には、基板上に電極を設けた誘電泳動装置において、対向する電極の一方の電極の下部に、物理的に低い部位を形成することにより、不均一電解領域の拡大を図った構造が例示されている。さらに、非特許文献1には、マトリックス上に配置された電極アレイを形成し、その電極上に細胞を配列することが記載されている。非特許文献2にも、8本の電極を立体的に配置し、負の誘電泳動により細胞をトラップすることが記載されている。
特開2001-165905号公報 特開2001-296274号公報 Jing Cheng, et al.、Isolation of cultured cervical carcinoma cells mixed with peripheral blood cells on a bioelectronic chip.、"Anal. Chem."、1998年、70巻、p.2321-2326 Dielectrophoretic sorting of particles and cells in a microsystem.、"Anal. Chem."、1998年、70巻、p.1909-1915

上記のように、細胞をマニピュレートする技術としては、いくつかの方法が考えられるが、微細ガラス電極を使用する方法では、物理的に細胞と電極が接触するため、細胞を傷つけるおそれがあり、また操作に熟練を要するという欠点もある。また、レーザを使用したとラップによる方法では、レーザの強力な収束光によって細胞が傷つくおそれがある。

一方、誘電泳動を利用した方法は、比較的細胞へのダメージが少なく、緩衝液、電界強度、周波数などのパラメータを変更しやすく、最適条件が求めやすい。さらには、マイクロ加工技術で構造体を形成することにより、細胞1個でのマニピュレーションが可能となるなどのメリットがある。しかし、正の誘電泳動を利用して細胞をマニピュレートする場合には、非常に大きな電場に細胞がトラップされることになり、細胞への悪影響が懸念される。負の誘電泳動を利用する場合には、細胞へのダメージを軽減されることが期待される。上記非特許文献2には、このようなことを考慮して、負の誘電泳動を利用することが記載されている。しかし、該方法を利用してトラップする場合には、電場の谷を3次元的に形成する必要があり、8本の電極を3次元的に配置した構造となっている。このような3次元的な配置を微小領域に形成するには、構造も複雑となり、製作にも非常に手間がかかってしまう。さらに、3次元的な手段で細胞をトラップすると、各種薬剤（診断用、治療用、研究用）との反応や測定用光ビームの照射および／または回収が非効率的となりうる。

上記課題を解決すべく、本発明は、細胞をトラップする方法として微小ガラス電極またはレーザトラップよりも細胞へのダメージが軽減されることが期待される誘電泳動を利用し、さらに負の誘電泳動によってトラップするためのデバイスに3次元的な電極配置を必要としない構造のトラップデバイスを提供する。

すなわち、本発明は、細胞トラップデバイスであって、該デバイスの片面には、流体が流れる流路が設けられ、該流路には、少なくとも4つ以上の凸型電極が形成され、該凸型電極と相対する面には、対電極が形成されていることを特徴とする細胞トラップデバイスを提供する。

また、本発明は、上記細胞トラップデバイスであって、前記凸型電極は、先細り形状であり、かつ該凸型電極の先端部に相対する面に対電極が形成されていることを特徴とする細胞トラップデバイスを提供する。

さらに、本発明は、上記細胞トラップデバイスであって、前記凸型電極の表面は、絶縁性被膜で覆われていることを特徴とする細胞トラップデバイスを提供する。

さらに、本発明は、上記細胞トラップデバイスであって、前記凸型電極は、相互に電気的接続がなされること、または絶縁されて単独に電気的制御がなされることを特徴とする細胞トラップデバイスを提供する。

さらに、本発明は、上記細胞トラップデバイスであって、前記電極と相対する面に形成された前記対電極は、透明電極であることを特徴とする細胞トラップデバイスを提供する。

さらに、本発明は、上記細胞トラップデバイスであって、前記透明電極は、酸化インジウムチタン(ITO)で形成されることを特徴とする細胞トラップデバイスを提供する。

さらに、本発明は、上記細胞トラップデバイスであって、前記流体が流れる流路は、キャピラリー形状である細胞トラップデバイスを提供する。

本発明のトラップデバイスによれば、細胞へのダメージが少ない電気的手段で細胞をトラップするので、光測定に影響がない。特に、各トラップの中心部を細胞ごとの光測定用光路の中心軸とすることでトラップ領域を効率よく測定できる。また、本発明のトラップデバイスは、2次元的な可能方法のみで3次元的な極小位置を形成できる凸型電極を形成することができる。したがって、従来のトラップデバイスよりもマイクロ加工の適用が簡単であり、トラップデバイスを比較的容易に製作することができる。

負の誘電泳動を利用するための手段は一概には決められないが、細胞の性質、緩衝溶液成分、電場強度、周波数によって正または負の誘電泳動に変化し、比較的高い周波数領域で負の誘電泳動となるといわれている。

正の誘電泳動を利用する場合には、2次元的な配置の電極構成で電位勾配の極大位置を形成することができるが、負の誘電泳動を利用する場合には、電位勾配の極小位置を3次元的に形成する必要がある。このために、通常、電極を3次元的に配置する必要があるが、電極自体を3次元的に鶏舎を有する構造とすることによっても達成できる。

図1に、本発明の第1の態様にかかる実施形態を示す。図1aは、電極形成部を斜めから見た図である。実際の構成では、この上部に対電極6および上部基板7が構成されている。図1bは、対電極6および上部基板7を含んだ構成のA断面を示す図である。図1cは、凸型電極1と対電極6によって形成される電界強度を模式的に示した図である。以下にその詳細を説明する。

凸型電極1は、シリコンの異方性エッチングによって加工された4つの凸型電極のうちの1つを示す。4つの凸型電極1は、細胞トラップデバイスの片面に形成された流路に、4端を占めるように配置される。凸型電極1は、図1bの断面図からも明らかなように、先細りの形状となっている。

4つの凸型電極4と対電極6との間に交流電圧を印加すると、図1cに示した電界強度分布が形成される。この電界強度分布図は、A断面から見た図であり、4つの凸型電極と対電極との間には、4つの凸型電極の中心部を極小とする3次元的な電界強度分布が形成される。

凸型電極1は、絶縁層2上に形成されており、電極から引き出されたリード線5を通じて電源に接続されている。上記凸型電極1は、電界を印加することが可能な材料であればいずれの材料を使用して作製してもよいが、たとえば、シリコン基板から作製することができる。また、絶縁層2は、いずれの絶縁体を使用して作製してもよいが、好ましくは低応力窒化シリコン膜等を使用する。また、図1aの絶縁層2の上面から凸型電極の先端部までの高さは、トラップする細胞等の大きさによって適宜変更されるべきであるが、たとえば2μm、好ましくは5μm〜0.2mmである（本デバイスの形状を特定するために具体的に記入してください）。同様に、凸型電極間の距離も、適宜変更されるべきであるが、たとえば4μm、好ましくは8μm〜0.6mmである。

リード線5は、4つの電極間を短絡してから配線してもよく、また独立で動作できるように配線してもよい。リード線5の外側は、保護用絶縁膜4で被覆されている。上記リード線5は、適切な金属を使用することができ、たとえば、アルミ、白金/チタン、金/チタンなどを使用することができる。また、対電極6は、交流電圧を印加することが可能であれば、いずれの材料を使用してもよい。特に、対電極は透明であることが好ましく、この場合は、酸化インジウムチタン（ITO）を使用することができる。また、上部基板7も透明であることが好ましく、たとえば、ポリカーボネート、アクリル、ポリプロピレンを上部基板として使用することができる。ここで、上部基盤は、少なくとも4つの電極で囲まれたとラップ領域の中心部と対向する部分を下部基盤として機能する平板上の絶縁膜4と平行な肉厚を有し、このましくはトラップ領域全域について光測定用の光路が通過する範囲について均一な厚みを有する。このことにより、各トラップ領域にトラップされた細胞を最適な光学条件で測定できる。4つの電極は、2次元的な電極配置においては、細胞のトラップ性能において必要十分な性能を示すが、細胞の種類によっては、4個の電極を増減してもトラップ領域の中心に安定化できる場合もある。また、各種の微小光学系（たとえばFCS（蛍光相関分光法）、FRET（蛍光共鳴エネルギー移動法）、CLSM（共焦点レーザ操作顕微鏡）等）の測定光軸を各トラップ領域の中心に設定するだけで、良好な位置決めができると共に、各細胞の測定点のアドレスを精度よく管理できる。なと、細胞をトラップする上で、上下の基盤は、上下反転してもよいし、水平面以外の向きであってもよい。さらに、上下基盤の向きを傾斜状態ないし鉛直方向にしてもよいので、任意の流路設計に対応できる。また、上下基盤の幅方向および流路方向の長さを、各2以上のトラップ領域が配置しうるように拡張すれば、多数のアドレス化された領域でのハイスループットな測定が可能となる。さらに、電気的トラップ手段であるため、各基盤に対しては、実質的に非接触で安定かつ可逆的なトラップができるので、連続的な細胞観察ないし各種治療ないし診断用薬剤に関する試験／研究を実施することができる。

また、絶縁膜4による被覆は、たとえば絶縁性のポリイミド樹脂をコーティングすればよい。

このような構成において、対電極6と4つの凸型電極1との間に交流電圧を印加すると凸型電極の中心部に電位勾配の極小位置を形成することができる。その結果、細胞をこの極小位置にトラップすることが可能となる。

本発明の形態においては、細胞のトラップを負の誘電泳動を利用して行うが、上述したように細胞の性質、緩衝溶液成分、電場強度、周波数を適宜選択して、細胞に対して負の誘電泳動を誘起する。これらの条件は、たとえば周波数を数MHx、電圧を数十kV〜数百MV/mとしてもよい。また、緩衝液として、炭酸緩衝液、PBS、HEPES緩衝液などを、pH7.4で使用してもよい。

上記のような、3次元的な傾斜を有する構造は、半導体シリコンを異方性エッチングすることにより、2次元的な加工プロセスで形成可能である。（100）面のシリコンウエハに対し、アンモニア水、テトラメチルアンモニウム溶液などのアルカリ溶液を用いてエッチングするとエッチング速度が結晶方向性に依存して変化することが知られている。特に、（111）面のエッチング速度は極端に低下するため、3次元的な傾斜を有する異方性エッチングが可能であることが知られている。この技術を有効に利用することにより3次元的に電位勾配の極小位置を有する構造体を比較的容易に作成することができる。

以下、本発明のトラップデバイスの作製方法の一例を示す。

[流路部分の形成]（図2を参照されたい）
（1）半導体シリコン基板（100）11の両面に低応力窒化シリコン膜14,15を形成する。基板の片面には、細胞トラップデバイスの細胞を流す流路に対応するパターン12のフォトリソグラフィを行う。

（2）露出部の窒化シリコン膜15をRIE（Reactive Ion Etching）によって除去し、次いで異方性または等方性エッチング液を使用してシリコンのエッチングを行う。

（3）エッチング面に低応力窒化シリコン膜13を形成する。

（4）工程（2）と同様に、フォトリソグラフィにより、凸型電部に対応する部分のパターニングを行う（レジスト16）。

（5）レジストを除去する。

[電極配線の形成]（図3を参照されたい）
（6）両面アライメント装置を使用して、凸型電極に相当する位置の反対面からフォトリソグラフィを行い、配線ラインに相当するレジスト21のパターニングを行う。

（7）RIE装置を使用して、窒化シリコン膜14をパターニングする。パターニングされた窒化シリコン膜22が形成されることにより、シリコン14の露出パターンが形成される。

（8）配線用金属（アルミ、白金/チタン、金/チタン）23などを成膜する。

（9）リフトオフによって金属ラインパターン24を形成し、リード線を形成する。

（10）絶縁膜（ポリイミドなど）25をコーティングする。

[凸型電極の形成]（図4を参照されたい）
（11）図2と同じ面の加工に戻り、異方性エッチングを行い、凸型電極36を形成する。

（12）表面の窒化シリコン膜を除去する。場合によっては、電極表面に絶縁性のコーティングを行う。

（13）上部基板33に透明電極32を形成する。本図では、透明電極は、全面に形成されているが、凸型電極が形成されている部分に限定してもよい。

（14）上部基板と電極形成基板を接合する。接合方法としては、スクリーン印刷を使用することができる。上部基板がパイレックス（登録商標）の場合には、陽極接合を使用することもできる。

上記作製方法は、これに限定されるものではなく、種々の変更が可能である。上記方法では、製作プロセスを大きく3つに分けて流路部分の形成、電極配線の形成、凸型電極の形成を行ったが、たとえば、電極配線の形成と流路部分の形成を入れ換えて作製することもできる。また、（11）の凸型電極の形成は、窒化シリコン膜22が露出するまでエッチングしてもよく、シリコン膜が全面に残っていてもよい。ただし、シリコン膜が残っている場合には、電極間の導通が維持されるため、対電極との絶縁に注意する必要がある。すなわち、本実施の態様においては、凸型電極により電位勾配の3次元的な極小位置を形成するとこが肝要である。

また、電極配置は、以下のように種々の変更を行うことができる。

凸型電極配置41の配置をクロス位置に配置した変更例を図5に示す。また、複数の凸型電極51を配置して3次元的な極小位置を複数形成できるようにした例を図6に示す。この場合、電極を独立に制御することにより、任意の位置に極小位置を形成することができる。さらに、電極を独立に制御できるように配線してもよい。この場合、極小位置でトラップした後に、凸型電極間の周波数、印加電圧（数10V〜1000V/cm程度）を変更することにより、正の誘電泳動と切り替えながら制御することが可能となり、細胞の回転などを行うことができる。

また、上記細胞トラップデバイスにおいて、流体が流れる流路は、キャピラリー形状とすることも可能である。さらに、基板に、流体が流れる流路として、キャピラリーを複数形成し、それぞれのキャピラリー流路について凸型電極を形成することもできる。また、本発明の細胞トラップデバイスは、細胞と同様に個別にトラップし、各種観察ないし試験／研究を行うべき誘電トラップ可能な全ての生物材料に適用できる。たとえば、人工的微粒子により個々の細胞と同様の取り扱いを行うことができる。また、本発明のデバイスは、自動化された装置の一部として具備するようにしてもよいし、搬送可能なマイクロチップとして多数交換使用するようにしてもよい。

本発明の細胞トラップデバイスは、細胞をマニピュレートするための装置として、バイオ分野に利用することができる。また、各種微小光学測定と連携した検査技術にも応用することができる。

本発明の細胞トラップデバイスの一態様を示す図。 本発明の細胞トラップデバイスの作製方法の一態様を示す図。 本発明の細胞トラップデバイスの作製方法の一態様を示す図。 本発明の細胞トラップデバイスの作製方法の一態様を示す図。 本発明の細胞トラップデバイスのもう一つの態様を示す図。 本発明の細胞トラップデバイスのもう一つの態様を示す図。

符号の説明

1、36、41、51・・・凸型電極
2、・・・絶縁層
3、11・・・シリコン基板
4、25・・・絶縁膜
5、24・・・リード線
6、32・・・対電極
7、33・・・上部基板
12、16、21・・・レジスト
13、14、15、22・・・低応力窒化シリコン膜
23・・・配線用金属

Claims (4)

1. 複数の細胞トラップ位置を有し、対抗する2枚の平板の片面が誘電的とラップ手段を備えると共に、他の面が各細胞トラップ位置において細胞の任意の位置に対して光測定するための光透化性部を有し、トラップ領域の中心部を細胞ごとの光測定用光路の中心軸と合致させたことを特徴とする細胞トラップデバイス。
2. 請求項1に記載の細胞トラップデバイスであって、該デバイスの片面には、流体が流れる流路が設けられ、該流路には、少なくとも4つ以上の凸型電極が形成され、該凸型電極と相対する面には、対電極が形成されていることを特徴とする細胞トラップデバイス。
3. 請求項1に記載の細胞トラップデバイスであって、前記電極と相対する面に形成された前記対電極は、透明電極であることを特徴とする細胞トラップデバイス。
4. 請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞トラップデバイスであって、前記流体が流れる流路は、キャピラリー形状である細胞トラップデバイス。

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