JP2006071631A - Detection method for virus in pestivirus of fravivirus, and use thereof in immuno-chromatography - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白に対する抗体を用いたサンドイッチ式免疫測定法、特に、イムノクロマトグラフィー測定法およびイムノクロマト法テストストリップに関するものであり、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスに起因する疾病を迅速かつ簡便に診断するために有用な方法に関する。 The present invention relates to a sandwich immunoassay method using an antibody against NS3 protein of Flaviviridae pestivirus, particularly immunochromatography assay and immunochromatography test strip, and is a disease caused by Flaviviridae pestivirus genus virus. The present invention relates to a method useful for quickly and conveniently diagnosing the disease.
フラビウイルス科ペスチウイルス属に属するウイルスとしては、牛ウイルス性下痢ウイルス（Bovine viral diarrhea virus : BVDV）、豚コレラウイルス（Classical Swine Fever virus : CSFV）、ボーダー病ウイルス（Border Disease virus : BDV）などが知られている。ＢＶＤＶは牛や水牛に感染して牛ウイルス性下痢・粘膜病（Bovine viral diarrhea/mucosal disease）を発症させる。この牛ウイルス性下痢・粘膜病は、家畜伝染病予防法における届出伝染病に指定されている。ＣＳＦＶおよびＢＤＶは、ＢＶＤＶと近縁のウイルスであり、それぞれ豚および羊に感染して豚コレラおよびボーダー病を発症させる。豚コレラは、家畜伝染病予防法における法定伝染病に指定されている。ボーダー病は、牛ウイルス性下痢・粘膜病と同様の症状を羊に発生させる。 Known viruses belonging to the genus Pestivirus in the Flaviviridae family include bovine viral diarrhea virus (Bovine viral diarrhea virus: BVDV), swine cholera virus (Classical Swine Fever virus: CSFV), border disease virus (Border disease virus: BDV), etc. It has been. BVDV infects cattle and water buffalo and causes bovine viral diarrhea / mucosal disease. This bovine viral diarrhea / mucosal disease is designated as a reported infectious disease in the Domestic Animal Infectious Disease Prevention Law. CSFV and BDV are closely related to BVDV and infect swine and sheep, respectively, to develop swine fever and border disease. Porcine cholera is designated as a legal infectious disease in the Livestock Infectious Disease Prevention Law. Border disease causes the same symptoms in sheep as bovine viral diarrhea / mucosal disease.
ＢＶＤＶには細胞病原性（CP）と非細胞病原性(NCP)のウイルスがあり、ＣＰウイルスに感染して牛ウイルス性下痢・粘膜病の急性症状を発した牛の発見は比較的容易である。しかしながら、ＮＣＰウイルスは、一部の株を除き、一般の牛に感染しても症状は穏やかであり、妊娠牛が感染した場合、胎児感染が起こり、異常産が発生し、酪農家にとっては大きな損失となる。また、ＮＣＰウイルスが妊娠５０〜１５０日の妊娠牛に感染した場合、免疫寛容により持続感染牛が生まれることがある。持続感染牛は、見かけ上は正常で生まれてくるが、終生体内でウイルスを産生し、酪農場における正常な牛に対する感染源となる。このようにしてＮＣＰウイルスに感染した牛は、ＣＰウイルスの重感染あるいはＮＣＰウイルスからＣＰウイルスへの変異によって消化管のびらんや潰瘍を特徴とする致死的な粘膜病を発生し、酪農家に大きな痛手を与える。 BVDV has both cytopathogenic (CP) and non-cytopathic (NCP) viruses, and it is relatively easy to find cattle that have been infected with CP virus and have acute symptoms of bovine viral diarrhea and mucosal disease. . However, except for some strains, NCP virus has mild symptoms even if it is transmitted to general cattle. When pregnant cattle are infected, fetal infection occurs and abnormal birth occurs, which is great for dairy farmers. Loss. Moreover, when NCP virus infects pregnant cows on the 50th to 150th day of pregnancy, persistently infected cows may be born due to immune tolerance. Persistently infected cattle appear to be normal, but produce virus in the living organism and become a source of infection for normal cattle on dairy farms. Cattle infected with NCP virus in this way develop fatal mucosal disease characterized by gastrointestinal erosion and ulcers due to CP virus superinfection or mutation from NCP virus to CP virus. Give pain.
したがって、ＢＶＤＶの清浄化には持続感染牛の摘発および淘汰が重要である。現在、ＢＶＤＶの検出法としては血液サンプルからのウイルス分離やPCR法が用いられており、また、持続感染牛を検出するためのＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosorbent assay）法検査キットも市販されているが、これらは結果が得られるまでに時間がかかる。また、従来のＥＬＩＳＡ法では、変異を受けやすい構造蛋白に対する抗体を用いているため、広範囲のＢＶＤＶまたはフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスの検出に必ずしも十分に対応するものではなかった。 Therefore, for the cleaning of BVDV, it is important to detect persistently infected cattle and culling. Currently, virus isolation from blood samples and PCR are used as detection methods for BVDV, and ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) test kits for detecting persistently infected cattle are also commercially available. These take time to obtain results. In addition, the conventional ELISA method uses an antibody against a structural protein that is susceptible to mutation, and therefore does not always sufficiently respond to detection of a wide range of BVDV or Flaviviridae pestiviruses.
本発明者らは、既に、フラビウイルス科ペスチウイルス属の共通抗原であるＮＳ３蛋白に対するモノクローナル抗体を数種類取得しているが、これらのモノクローナル抗体が第一の抗体と第二の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法において有用であるかどうかについては未だ何ら検討を行っていない（非特許文献１参照）。 The present inventors have already obtained several types of monoclonal antibodies against NS3 protein, which is a common antigen of the Flaviviridae pestivirus genus, and these monoclonal antibodies are sandwiches using a first antibody and a second antibody. Whether it is useful in the formula immunoassay has not been examined yet (see Non-Patent Document 1).
本発明の目的は、広範囲のフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスを迅速かつ簡便に検出できる方法および測定器具を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method and a measuring instrument that can quickly and easily detect a wide range of Flaviviridae pestiviruses.
本発明者等は、今般、フラビウイルス科ペスチウイルス属の共通抗原であるＮＳ３蛋白に対する抗体が、第一の抗体と第二の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法とりわけイムノクロマトグラフィー測定法で使用する抗体として使用でき、フラビウイルス科ペスチウイルス属に属するウイルスを広範囲に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors now use an antibody against NS3 protein, which is a common antigen of the Flaviviridae pestivirus genus, in a sandwich immunoassay method, particularly an immunochromatographic assay method, using a first antibody and a second antibody. It has been found that it can be used as an antibody and can detect a wide range of viruses belonging to the genus Flasviridae pestivirus, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明の一局面によれば、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白に対する第一の抗体と第二の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法からなることを特徴とするフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスの検出法が提供される。 That is, according to one aspect of the present invention, the Flaviviridae pestivirus is characterized by comprising a sandwich immunoassay method using a first antibody and a second antibody against NS3 protein of Flaviviridae pestivirus genus virus. Methods for detecting genus viruses are provided.
また、本発明の他の局面によれば、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白に対する第一の抗体を予め所定位置に固定せしめて形成された捕捉部位を備える膜担体を用意し、前記ＮＳ３蛋白に対する第二の抗体と所定量の被験試料との混合液を、前記捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記被験試料中に含まれるフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルス由来のＮＳ３蛋白と前記第二の抗体との複合体を前記捕捉部位に捕捉させることを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法が提供される。 According to another aspect of the present invention, there is provided a membrane carrier having a capture site formed by previously fixing a first antibody against NS3 protein of Flaviviridae pestivirus genus virus in a predetermined position, and said NS3 protein A mixture of a second antibody against the test sample and a predetermined amount of the test sample is chromatographed on the membrane carrier toward the capture site, and NS3 protein derived from the Flaviviridae pestivirus genus virus contained in the test sample; An immunochromatographic measurement method is provided, wherein the complex with the second antibody is captured at the capture site.
また、本発明の更に他の局面によれば、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白に対する第一の抗体と第二の抗体と膜担体とを少なくとも備え、前記第一の抗体は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なよう配置されてなるフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルス検出用イムノクロマト法テストストリップが提供される。 Further, according to still another aspect of the present invention, at least a first antibody against the NS3 protein of the Flaviviridae pestivirus genus virus, a second antibody, and a membrane carrier are provided, and the first antibody comprises the membrane carrier. Preliminarily fixed at a predetermined position to form a capture site, and the second antibody is labeled with an appropriate labeling substance, and disposed so as to be chromatographed on the membrane carrier at a position separated from the capture site. An immunochromatographic test strip for detecting a virus of the genus Flaviviridae pestivirus is provided.
本発明によれば、第一の抗体と第二の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法とりわけイムノクロマトグラフィー測定法において、抗体としてフラビウイルス科ペスチウイルス属の共通抗原であるＮＳ３蛋白に対する抗体、とりわけ、モノクローナル抗体を使用することとしたので、フラビウイルス科ペスチウイルス属に属する広範囲のウイルスを簡単な方法で迅速に検出できる。 According to the present invention, in a sandwich immunoassay method, particularly an immunochromatography assay method using a first antibody and a second antibody, an antibody against NS3 protein which is a common antigen of the Flaviviridae pestivirus genus as an antibody, Since a monoclonal antibody is used, a wide range of viruses belonging to the genus Flaviviridae pestivirus can be rapidly detected by a simple method.
本発明で用いられる上記第一の抗体および第二の抗体は、それぞれ、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、一般に、少なくとも一方の抗体をモノクローナル抗体とすることが好ましく、両方の抗体をモノクローナル抗体とすることが特に好ましい。 Each of the first antibody and the second antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. From the viewpoint of reaction specificity, at least one of the antibodies is generally monoclonal. It is preferable to use antibodies, and it is particularly preferable to use both antibodies as monoclonal antibodies.
本発明において好ましいモノクローナル抗体は、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白と免疫染色法およびウエスタンブロット法の何れにおいても反応するモノクローナル抗体である。ウエスタンブロット法は、下記実施例で詳述するように、ＢＶＤＶなどのフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスの感染細胞や、遺伝子工学的に発現させて精製されたＮＳ３蛋白をドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、メンブランに転写された蛋白にモノクローナル抗体を反応させることにより行われる。このようなウエスタンブロット法の過程でＮＳ３蛋白は変性を受けると考えられるが、上記好ましいモノクローナル抗体は、このような変性を受けない抗原決定基（エピトープ）を認識するものとして特徴付けられる。 A preferred monoclonal antibody in the present invention is a monoclonal antibody that reacts with the NS3 protein of Flaviviridae pestivirus in any of immunostaining and Western blotting methods. As described in detail in the Examples below, Western blotting is performed using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of infected cells of Flaviviridae pestiviruses such as BVDV and NS3 protein purified by genetic engineering. This is performed by reacting the monoclonal antibody with the protein fractionated by electrophoresis and transferred to the membrane. Although NS3 protein is thought to undergo denaturation in the course of such Western blotting, the preferred monoclonal antibody is characterized as recognizing an antigenic determinant (epitope) that does not undergo such denaturation.
通常、第一の抗体と第二の抗体を用いるサンドイッチ式免疫測定法においては、第一の抗体と第二の抗体とは抗原決定基（エピトープ）が相互に異なるものが使用され、所謂「ヘテロ」の組み合わせで用いられる。本発明において、「ヘテロ」の組み合わせで第一の抗体および第二の抗体を構成することは何ら妨げられるものではない。しかしながら、下記実施例で詳述するように、上記好ましいモノクローナル抗体は、第一の抗体と第二の抗体を用いるサンドイッチ式免疫測定法、とりわけイムノクロマトグラフィー測定法において、第一の抗体と第二の抗体の両方に使用することができ、所謂「ホモ」の組み合わせ（すなわち、第一の抗体と第二の抗体が同じモノクローナル抗体）で用いることができる。このことは、上記好ましいモノクローナル抗体が認識する抗原決定基（エピトープ）は、ＮＳ３蛋白上に複数存在することを示唆する。したがって、上記好ましいモノクローナル抗体は、ＮＳ３蛋白上に複数存在するウエスタンブロット法によって変性を受けない同一の抗原決定基（エピトープ）を認識するモノクローナル抗体として特徴付けることもできる。 Usually, in the sandwich immunoassay using the first antibody and the second antibody, those having different antigenic determinants (epitope) are used for the first antibody and the second antibody. Is used in combination. In the present invention, it is not impeded that the first antibody and the second antibody are composed of a combination of “hetero”. However, as described in detail in the Examples below, the preferred monoclonal antibody is a sandwich type immunoassay method using a first antibody and a second antibody, particularly an immunochromatographic assay method. It can be used for both antibodies, and can be used in so-called “homo” combinations (ie, the first antibody and the second antibody are the same monoclonal antibody). This suggests that a plurality of antigenic determinants (epitope) recognized by the preferable monoclonal antibody exist on the NS3 protein. Therefore, the preferred monoclonal antibody can also be characterized as a monoclonal antibody that recognizes the same antigenic determinant (epitope) that is not subject to denaturation by Western blotting, which is present in plurality on the NS3 protein.
フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白に関しては、例えば、ＢＶＤＶ Ｎｏｓｅ株のＮＳ３蛋白の遺伝子配列およびアミノ酸配列は日本DNAデータバンクアクセス番号AB078951から入手可能であり、配列表の配列番号３に示されるものは下記実施例で取得されたＢＶＤＶ Ｎｏｓｅ株由来のＮＳ３蛋白断片のアミノ酸配列である。また、ＣＳＦＶおよびＢＤＶについても、幾つかの株について、ＮＳ３遺伝子の完全長または部分配列が公開されている。したがって、このような遺伝子配列またはアミノ酸配列の情報を参照して適当なプライマーＤＮＡを合成し、適当なフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスからＮＳ３遺伝子を取得し、これをクローニングして遺伝子工学的に発現させることにより、ＮＳ３蛋白を入手できる。
ＮＳ３遺伝子を取得するために用いるフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスとしては、寄託機関に保存されている各種の株の他、各種の野外株を取得して用いることもできる。寄託機関に保存されている株としては、例えば、ＢＶＤＶ ＮｅｗＹｏｒｋ １（ＡＴＣＣ番号：ＶＲ−１５６１）、ＢＶＤＶ ＮＡＤＬ（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｃｌｏｎｅｄ）（ＡＴＣＣ番号：ＶＲ−１４２２）、ＢＶＤＶ ＮＡＤＬ（ＡＴＣＣ番号：ＶＲ−５３４）、ＢＤＶ ３１（ＡＴＣＣ番号：ＶＲ−９９６）などが挙げられる。ＢＶＤＶの野外株としては、例えば、Ｎｏｓｅ、ＣＰ７、Ｎｏ．１２、ＴＫ８７−２ ｎｃｐ、ＮＭ８７−１ ｎｃｐ、ＩＳ２５ＣＰ／０１、Ｏｒｅｇｏｎ、Ｎｏｓｅ Ｅｎｄ−、Ｎｏｓｅ Ｅｎｄ＋、ＫＳ８６−１ ｎｃｐ、ＫＳ８６−１ ｃｐ、１９０ ｎｃｐ、Ｓｏ ＣＰ／７５、Ｔｏｃｈｉｇｉ−Ｎ１、Ｔｏｃｈｉｇｉ−Ｎ２、Ｔｏｃｈｉｇｉ−Ｎ３、Ｔｏｃｈｉｇｉ−Ｎ４、Ｔｏｃｈｉｇｉ−Ｎ５、Ｔｏｃｈｉｇｉ−Ｎ６、Ｔｏｃｈｉｇｉ−Ｎ７、ＢＶＤＶ／Ａｏｍｏｒｉ／１／０２、ＢＶＤＶ／Ｓａｐｐｏｒｏ／１／０２、ＫＺ−９１ ｃｐ、ＫＺ−９１ ｎｃｐなどが知られている。ＣＳＦＶの野外株としては、例えば、ＡＬＤ、Ａｍｅｓ、ＧＰＥ−、Ｋａｎａｇａｗａ／７４、Ｙａｍａｇａｔａ／８０、Ｓｈｉｍａｎｅ／８０、Ｍｉｙａｚａｋｉ／８１、Ｏｇａｔａｍｕｒａ／６８、ＰＡＶ−１、ＫＰＰ／９３、ＮＲＳＭ／９３、Ｃｈｉｂａ／８０、Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／８０、ＷＢ８２ ＥＮＤ＋、ＷＢ８２などが知られている。ＢＤＶの野外株としては、例えば、Ｍｏｒｅｄｕｎ株などが知られている。また、市販の生ワクチンなどからこれらのウイルスを単離して使用することもできる。
ＮＳ３遺伝子は、これらの広範囲のフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスにおいて共通に保存されているものであり、下記の実施例で示されるように、一般に取得される抗ＮＳ３蛋白モノクローナル抗体の多くは、ＢＶＤＶ Ｎｏｓｅ株、ＣＳＦＶ ＧＰＥ−株、ＢＤＶ Ｍｏｒｅｄｕｎ株などの広範囲のフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスと交差反応し、各種ウイルス間のＮＳ３蛋白のアミノ酸ホモロジーは９０％程度を示す。したがって、配列番号３に示されるようなＮＳ３遺伝子に関する情報および上記フラビウイルス科ペスチウイルス属の各種ウイルスの少なくとも１種を入手し、本明細書の記載を参照することにより、ＮＳ３蛋白またはその断片およびそれに対する抗体を作成できる。
Regarding the NS3 protein of the Flaviviridae pestivirus genus virus, for example, the gene sequence and amino acid sequence of NS3 protein of BVDV Nose strain are available from Japan DNA Databank Accession No. AB078951, and are shown in SEQ ID No. 3 of the Sequence Listing Is the amino acid sequence of the NS3 protein fragment derived from the BVDV Nose strain obtained in the following Example. As for CSFV and BDV, the full length or partial sequence of the NS3 gene is published for several strains. Therefore, appropriate primer DNA is synthesized with reference to such gene sequence or amino acid sequence information, NS3 gene is obtained from an appropriate Flaviviridae pestivirus, and cloned to be genetically expressed. Thus, NS3 protein can be obtained.
As the Flaviviridae pestivirus genus virus used for obtaining the NS3 gene, various field strains can be obtained and used in addition to the various strains stored in the depository organization. Examples of strains stored in the depository include BVDV New York 1 (ATCC number: VR-1561), BVDV NADL (biologically cloned) (ATCC number: VR-1422), and BVDV NADL (ATCC number: VR-534). , BDV 31 (ATCC number: VR-996) and the like. Examples of BVDV field strains include Nose, CP7, No. 1, and others. 12, TK87-2 ncp, NM87-1 ncp, IS25CP / 01, Oregon, Nose End -, Nose End +, KS86-1 ncp, KS86-1 cp, 190 ncp, So CP / 75, Tochigi-N1, Tochigi- N2, Tochigi-N3, Tochigi-N4, Tochigi-N5, Tochigi-N6, Tochigi-N7, BVDV / Amoori / 1/02, BVDV / Sapporo / 01/02, KZ-91 cp, KZ-91 n etc. It has been. The field strain of CSFV, for example, ALD, Ames, GPE -, Kanagawa / 74, Yamagata / 80, Shimane / 80, Miyazaki / 81, Ogatamura / 68, PAV-1, KPP / 93, NRSM / 93, Chiba / 80, Fukushima / 80, WB82 END + , WB82 and the like are known. As an outdoor strain of BDV, for example, Moredun strain is known. Moreover, these viruses can also be isolated and used from commercially available live vaccines.
The NS3 gene is conserved in a wide range of these Flaviviridae pestiviruses, and as shown in the examples below, many of the commonly obtained anti-NS3 protein monoclonal antibodies are BVDV Nose. strain CSFV GPE - strain, cross-react with a wide range of Flaviviridae pestivirus viruses, such as BDV Moredun strains, the amino acid homology of the NS3 protein among the various viral shows the about 90%. Therefore, by obtaining information regarding the NS3 gene as shown in SEQ ID NO: 3 and at least one of the various viruses belonging to the genus Flaviviridae pestivirus, referring to the description of the present specification, the NS3 protein or a fragment thereof and the Can produce antibodies against.
本発明において、抗体の製造および該抗体を使用する検出法および測定法における各ステップは、それぞれ、それ自体、公知の免疫学的手法に準拠して行なわれる。
本発明において、ポリクローナル抗体は、例えば、ＢＶＤＶのようなフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスの感染細胞の培養上清から抽出精製したＮＳ３蛋白またはクローニングされたＮＳ３蛋白の遺伝子を大腸菌などの宿主で遺伝子工学的に発現させて抽出精製したＮＳ３蛋白を抗原として常法に従って動物を免疫し、その抗血清から得られる。
In the present invention, each step in the production of an antibody and the detection method and measurement method using the antibody is performed according to a known immunological technique.
In the present invention, a polyclonal antibody can be obtained by genetically engineering a NS3 protein extracted or purified from a culture supernatant of an infected cell of Flaviviridae pestivirus such as BVDV or a cloned NS3 protein gene in a host such as Escherichia coli. The animal is immunized according to a conventional method using NS3 protein expressed, extracted and purified as an antigen, and obtained from the antiserum.
また、モノクローナル抗体は、例えば、上記と同様に抽出精製したＮＳ３蛋白を抗原としてマウスのような動物を免疫したのち、この免疫された動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られた融合細胞をＨＡＴ含有培地でセレクトした後に増殖せしめる。増殖せしめた株を前記のようにして得られたＮＳ３蛋白を使用して、たとえば、酵素標識免疫法などにより抗ＮＳ３蛋白抗体産生株を選別する。 The monoclonal antibody was obtained, for example, by immunizing an animal such as a mouse using NS3 protein extracted and purified as described above as an antigen, and then cell-splitting spleen cells and myeloma cells of the immunized animal. The fused cells are allowed to grow after selection with HAT-containing medium. Using the NS3 protein obtained as described above for the grown strain, an anti-NS3 protein antibody-producing strain is selected by, for example, enzyme-labeled immunization.
本発明において、前記第一の抗体および第二の抗体の何れか一方を担体に固定しておくことも可能であり、これにより、例えば、ＥＬＩＳＡまたはイムノクロマトグラフィー測定法を容易に実施できる。
イムノクロマトグラフィー測定法は、公知のイムノクロマト法テストストリップの構成に準拠して容易に実施できる。
一般に、イムノクロマト法テストストリップは、抗原の第一の抗原決定基にて抗体抗原反応可能な第一の抗体と、前記抗原の第二の抗原決定基にて抗体抗原反応可能で且つ標識された第二の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の抗体は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の抗体は前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように配置されて構成される。第一の抗体および第二の抗体は、上述のように、それぞれポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても良いが、少なくとも何れか一方がモノクローナル抗体であることが好ましい。なお、第一の抗原決定基と第二の抗原決定基は抗原上の位置が異なっていれば構造的に同一であってもよく、その場合、第一の抗体および第二の抗体は上記「ホモ」の組み合わせのモノクローナル抗体であってよく、例えば、第一の抗体および第二の抗体の両方に上記の好ましいモノクローナル抗体を使用できる。
In the present invention, any one of the first antibody and the second antibody can be immobilized on a carrier, whereby, for example, ELISA or immunochromatographic measurement can be easily performed.
The immunochromatographic measurement method can be easily carried out in accordance with the configuration of a known immunochromatographic test strip.
In general, an immunochromatographic test strip comprises a first antibody capable of reacting with an antibody with a first antigenic determinant of an antigen, and a labeled antibody capable of reacting with an antibody with a second antigenic determinant of the antigen. At least two antibodies and a membrane carrier, wherein the first antibody is preliminarily fixed at a predetermined position of the membrane carrier to form a capture site, and the second antibody is separated from the capture site. It is arranged so that it can be chromatographed on a membrane carrier. As described above, each of the first antibody and the second antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but at least one of them is preferably a monoclonal antibody. The first antigenic determinant and the second antigenic determinant may be structurally the same as long as the positions on the antigen are different. For example, the above preferred monoclonal antibodies can be used for both the first antibody and the second antibody.
イムノクロマト法テストストリップの具体例としては、例えば、図３に示されるテストストリップが挙げられる。図３において、数字１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、３１は捕捉部位、４は吸収用部材、５は試料添加用部材を示している。
図示の例では、膜担体３は、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターで作成されている。
該膜担体３には、そのクロマト展開始点側の末端から７．５ｍｍの位置に、第一の抗体が固定され、検体の捕捉部位３１が形成される。
図示の例では、膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、被験試料に含まれる検体をクロマト展開可能で、かつ、上記捕捉部位３１を形成する抗体を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
A specific example of the immunochromatographic test strip is, for example, the test strip shown in FIG. In FIG. 3, numeral 1 is an adhesive sheet, 2 is an impregnating member, 3 is a membrane carrier, 31 is a capture site, 4 is an absorbing member, and 5 is a sample adding member.
In the example shown in the figure, the membrane carrier 3 is made of a strip-like nitrocellulose membrane filter having a width of 5 mm and a length of 36 mm.
The first antibody is fixed to the membrane carrier 3 at a position 7.5 mm from the end on the side of the chromatographic expansion start point, and a specimen capture site 31 is formed.
In the illustrated example, the membrane carrier 3 uses a nitrocellulose membrane filter. However, the membrane carrier 3 should be capable of chromatographic development of the specimen contained in the test sample and immobilize the antibody forming the capture site 31. Any cellulose membrane, nylon membrane, glass fiber membrane, etc. can be used.
含浸部材２は、前記第一の抗体が結合する第一の抗原決定基と異なる部位に位置する第二の抗原決定基にて前記抗原と抗体抗原反応する第二の抗体を含浸せしめた部材からなる。当該第二の抗体は、適当な標識物質で予め標識される。
図示の例では、含浸部材２として、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布を用いているが、これに限定されるものではなく、例えば、セルロース類布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類なども使用できる。
The impregnated member 2 is a member impregnated with a second antibody that reacts with the antigen with the second antigen determinant located at a different site from the first antigen determinant to which the first antibody binds. Become. The second antibody is previously labeled with an appropriate labeling substance.
In the illustrated example, a 5 mm × 15 mm strip-shaped glass fiber nonwoven fabric is used as the impregnating member 2, but is not limited thereto, and examples thereof include cellulose cloth (filter paper, nitrocellulose membrane, etc.), polyethylene, Porous plastic cloths such as polypropylene can also be used.
第二の抗体の標識物質としては、使用可能なものであればいかなる物質であってもよく、呈色標識物質、酵素標識物質、放射線標識物質などが挙げられる。
このうち、捕捉部位３１での色の変化を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便に判定できる点から、呈色標識物質を用いることが好ましい。
呈色標識物質としては、金コロイド、白金コロイド等の金属コロイドの他、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスや、天然ゴムラテックスなどのラテックスが挙げられ、このうち、金コロイドなどの金属コロイドが特に好ましい。
当該含浸部材２は、標識された第二の抗体の懸濁液を前記ガラス繊維不織布等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させることなどによって作製できる。
The labeling substance for the second antibody may be any substance as long as it can be used, and examples thereof include a coloring labeling substance, an enzyme labeling substance, and a radiation labeling substance.
Among these, it is preferable to use a color labeling substance from the viewpoint that the color change at the capturing site 31 can be determined quickly and easily by observing with the naked eye.
Examples of the color labeling substance include metal colloids such as gold colloid and platinum colloid, synthetic latex such as polystyrene latex colored with respective pigments such as red and blue, and latex such as natural rubber latex. Of these, metal colloids such as gold colloid are particularly preferred.
The impregnated member 2 can be produced by impregnating the labeled second antibody suspension into a member such as the glass fiber non-woven fabric and drying it.
図３に示されるように、膜担体３を粘着シート１の中程に貼着し、該膜担体３のクロマト展開の開始点側（すなわち図３の左側、以下「上流側」と記す、また、その逆の側、すなわち図３の右側を、以下「下流側」と記す）の末端の上に、含浸部材２の下流側末端を重ね合わせて連接するとともに、この含浸部材２の上流側部分を粘着シート１に貼着して本発明のイムノクロマト法テストストリップを作成できる。
さらに、必要に応じて、含浸部材２の上面に試料添加用部材５の下流側部分を載置するとともに、該試料添加用部材５の上流側部分を粘着シート１に貼着してもよく、また、膜担体３の下流側部分の上面に吸収用部材４の上流側部分を載置するとともに、該吸収用部材４の下流側部分を粘着シート１に貼着せしめることもできる。
As shown in FIG. 3, the membrane carrier 3 is stuck in the middle of the pressure-sensitive adhesive sheet 1 and the chromatographic development start side of the membrane carrier 3 (that is, the left side of FIG. 3, hereinafter referred to as “upstream side”, The opposite side, that is, the right side of FIG. 3 is hereinafter referred to as the “downstream side”, and the downstream end of the impregnation member 2 is overlapped and connected to the upstream end of the impregnation member 2. Can be attached to the pressure-sensitive adhesive sheet 1 to produce the immunochromatographic test strip of the present invention.
Further, if necessary, the downstream portion of the sample addition member 5 may be placed on the upper surface of the impregnation member 2, and the upstream portion of the sample addition member 5 may be attached to the adhesive sheet 1. Further, the upstream portion of the absorbing member 4 can be placed on the upper surface of the downstream portion of the membrane carrier 3, and the downstream portion of the absorbing member 4 can be attached to the adhesive sheet 1.
試料添加用部材５としては、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、ならびに、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または織布もしくは不織布を用いることができる。
吸収用部材４は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
As the sample addition member 5, for example, a porous synthetic resin sheet or film such as porous polyethylene or porous polypropylene, and a paper or woven or non-woven fabric made of cellulose such as filter paper and cotton cloth are used. be able to.
The absorbing member 4 may be of any material that can absorb and hold liquid quickly, and examples thereof include cotton cloth, filter paper, and porous plastic nonwoven fabric made of polyethylene, polypropylene, etc., and filter paper is particularly suitable. is there.
さらに、市販品の場合、図３のイムノクロマト法テストストリップは、試料添加用部材５と捕捉部位３１の上方にそれぞれ被験試料注入部と判定部が開口された適当なプラスチック製ケース内に収容されて提供される。 Further, in the case of a commercially available product, the immunochromatographic test strip of FIG. 3 is accommodated in a suitable plastic case in which a test sample injection part and a judgment part are opened above the sample addition member 5 and the capture part 31, respectively. Provided.
かくして、生体試料などからなる被験試料を必要に応じて適当な展開溶媒と混合してクロマト展開可能な混合液を得た後、当該混合液を図３に示されるイムノクロマト法テストストリップの試料添加用部材５上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材５を通過して含浸部材２において、標識された第二の抗体と混合する。
その際、該混合液中に検体が存在すれば、抗原抗体反応により検体と第二の抗体との複合体が形成される。
この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位３１に到達し、そこに固定された第一の抗体と抗原抗体反応して捕捉される。
このとき、標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が使用されていれば、当該呈色標識物質の集積により発色するので、直ちに、検体の有無を判定することができる。
Thus, after mixing a test sample made of a biological sample with an appropriate developing solvent as necessary to obtain a mixed solution that can be chromatographed, the mixed solution is used for sample addition of the immunochromatographic test strip shown in FIG. When injected onto the member 5, the mixed solution passes through the sample addition member 5 and is mixed with the labeled second antibody in the impregnating member 2.
At that time, if a sample is present in the mixed solution, a complex of the sample and the second antibody is formed by the antigen-antibody reaction.
This complex is chromatographed in the membrane carrier 3 to reach the capture site 31, where it is captured by an antigen-antibody reaction with the first antibody immobilized thereon.
At this time, if a colored labeling substance such as colloidal gold is used as the labeling substance, the color is generated by the accumulation of the colored labeling substance, so that the presence or absence of the specimen can be determined immediately.
被験試料としては、特に制限はなく、例えば、血液、（全血でも、血清でも、血漿でもよい）、唾液、尿等の体外に採取された体液が挙げられる。被験試料は、展開溶媒などの適当な希釈液で希釈して膜担体に注入してもよい。本発明で検出するＮＳ３蛋白は非構造蛋白であり、ウイルス粒子中にはほとんど存在せず、ウイルスが増殖する細胞内でのみ発現する。したがって、ウイルスが感染している細胞として白血球を抽出して被験試料とすることが好ましい。 There is no restriction | limiting in particular as a test sample, For example, the bodily fluid extract | collected outside bodies, such as blood, (it may be whole blood, serum, or plasma), saliva, urine, etc. are mentioned. The test sample may be diluted with an appropriate diluent such as a developing solvent and injected into the membrane carrier. The NS3 protein detected by the present invention is a nonstructural protein, hardly exists in the virus particle, and is expressed only in cells in which the virus grows. Therefore, it is preferable to extract leukocytes as cells infected with the virus to obtain a test sample.
なお、全血を被験試料として用いるときで、特に標識抗体の標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が用いられる場合、前記試料添加用部材に血球捕捉膜部材を配置しておくことが好ましい。血球捕捉膜部材は、前記含浸部材と前記試料添加用部材との間に積層することが好ましい。これにより、赤血球が膜担体に展開されるのが阻止されるので、膜担体の捕捉部位における呈色標識の集積の確認が容易になる。血球捕捉膜部材としては、カルボキシメチルセルロース膜が用いられ、具体的には、アドバンテック東洋株式会社から販売されているイオン交換濾紙ＣＭ（商品名）や、ワットマンジャパン株式会社から販売されているイオン交換セルロースペーパーなどを用いることができる。 When whole blood is used as a test sample, and particularly when a colored labeling substance such as gold colloid is used as the labeling substance of the labeled antibody, it is preferable to dispose a blood cell capturing membrane member on the sample addition member. . The blood cell trapping membrane member is preferably laminated between the impregnation member and the sample addition member. This prevents red blood cells from being developed on the membrane carrier, so that it is easy to confirm the accumulation of the colored label at the capture site of the membrane carrier. As the blood cell capturing membrane member, a carboxymethylcellulose membrane is used. Specifically, ion exchange filter paper CM (trade name) sold by Advantech Toyo Co., Ltd. or ion exchange cellulose sold by Whatman Japan Co., Ltd. Paper or the like can be used.
下記の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。 The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
使用したウイルスとその培養方法
以下の例では、野外株であるBVDV Nose株、CSFV GPE-株およびBDV Moredun株を使用した。
The virus with the following examples the culture methods used, BVDV Nose strain, CSFV GPE is field strains - Using strain and BDV Moredun strains.
BVDVの増殖には牛腎臓由来株化細胞（MDBK-HS細胞）、牛胎子筋肉初代培養細胞（BFM細胞）または牛精巣初代培養細胞（BT細胞）を用いた。MDBK-HS細胞は、本発明者らがMDBK細胞を馬血清添加培養液で増殖可能に馴化したものである。
CSFVの増殖には豚腎臓由来株化細胞であるCPK細胞またはPK-15細胞を用いた。
BDVの増殖には羊胎子腎臓初代培養細胞（LK-9細胞）を用いた。LK-9細胞は、本発明者らが新生子羊の腎臓より作成した。
Bovine kidney-derived cell lines (MDBK-HS cells), fetal bovine muscle primary cultured cells (BFM cells) or bovine testicular primary cultured cells (BT cells) were used for the growth of BVDV. MDBK-HS cells are those in which the present inventors have acclimated MDBK cells so that they can be grown in a culture solution supplemented with horse serum.
CPK cells or PK-15 cells, which are porcine kidney-derived cell lines, were used for the proliferation of CSFV.
Lamb fetal kidney primary culture cells (LK-9 cells) were used for the growth of BDV. LK-9 cells were prepared from the kidneys of newborn lambs by the present inventors.
MDBK-HS細胞およびBFM細胞の培養にはイーグル最小必須培地（日水製薬）に加熱非働化した馬血清 10%（Invitrogen）、Tryptose Phosphate Broth 3mg/ml（Becton Dickinson）、L-グルタミン 0.3mg/ml（和光純薬）、ペニシリンGカリウム 100単位/ml（萬有製薬）、硫酸ストレプトマイシン 100μg/ml（明治製菓）、Gentacin 40μg/ml（Schering-Plough）を加えた後、重炭酸ナトリウム（和光純薬）でpHを調整した培養液を用いた。
BT細胞の培養には上述の培養液の馬血清を5%とし、5%のBVDV-free牛準胎児血清（三菱ウェルファーマ）を加えた培養液を用いた。
CPK細胞およびPK-15細胞の培養には上述の培養液の馬血清を5%とした培養液を用いた。
LK-9細胞の培養には上述の培養液の血清を10%のBVDV-free牛準胎児血清とした培養液を用いた。
MDBK-HS cells and BFM cells were cultured in Eagle's minimum essential medium (Nissui Pharmaceutical) with 10% equine serum (Invitrogen), Tryptose Phosphate Broth 3 mg / ml (Becton Dickinson), L-glutamine 0.3 mg / After adding ml (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), penicillin G potassium 100 units / ml (Ari Pharmaceutical), streptomycin sulfate 100 μg / ml (Meiji Seika), Gentacin 40 μg / ml (Schering-Plough), sodium bicarbonate (Wako Pure) The culture solution whose pH was adjusted with (drug) was used.
For the culture of BT cells, a culture solution containing 5% horse serum in the above-mentioned culture solution and 5% BVDV-free bovine semi-fetal serum (Mitsubishi Pharma) was used.
For the culture of CPK cells and PK-15 cells, a culture solution containing 5% of the above-described culture solution of horse serum was used.
For the culture of LK-9 cells, a culture solution in which the serum of the above-mentioned culture solution was 10% BVDV-free bovine semi-fetal serum was used.
本発明で使用した実験プロトコールの詳細は下記のとおりである。
免疫染色法
免疫染色法はOffice International Des Epizooties（2000）の方法に従った。単層を形成した培養細胞にm.o.i.=1でウイルスを接種し、37℃で48時間培養後、培養上清を除去し、感染細胞をPBSで1回洗浄した。乾燥後、70〜80℃で1時間熱固定した。モノクローナル抗体を含むマウス腹水を抗体希釈液［1% Bovine Serum Albumin Fraction V（Roche）および0.05% Tween 20（Nacalai Tesque）を含むPBS］で1,000倍に希釈した。これを1次抗体液として添加し、室温で1時間反応させた。PBSで1回洗浄後、同様に1,000倍に希釈したGoat Anti-Mouse IgG-HRP Conjugate（Bio-Rad）を2次抗体液として添加し、室温で1時間反応させた。PBSで1回洗浄後、基質液［1.8mM 3-Amino-9-ethylcarbazole（AEC）（Sigma）および0.01% 過酸化水素水（三菱瓦斯化学）を含む50mM 酢酸緩衝液（pH5.0）］を添加し、37℃で30分反応させた。基質液を除き、細胞面を水道水で洗浄後、細胞を検鏡しウイルス抗原の有無を判定した。
Details of the experimental protocol used in the present invention are as follows.
Immunostaining method The immunostaining method followed the method of Office International Des Epizooties (2000). The cultured cells forming a monolayer were inoculated with the virus at moi = 1, cultured for 48 hours at 37 ° C., the culture supernatant was removed, and the infected cells were washed once with PBS. After drying, heat setting was performed at 70 to 80 ° C. for 1 hour. Mouse ascites containing the monoclonal antibody was diluted 1,000 times with an antibody diluent [PBS containing 1% Bovine Serum Albumin Fraction V (Roche) and 0.05% Tween 20 (Nacalai Tesque)]. This was added as a primary antibody solution and reacted at room temperature for 1 hour. After washing once with PBS, Goat Anti-Mouse IgG-HRP Conjugate (Bio-Rad) diluted 1000 times in the same manner was added as a secondary antibody solution and reacted at room temperature for 1 hour. After washing once with PBS, the substrate solution [1.8 mM 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) (Sigma) and 0.01% hydrogen peroxide (Mitsubishi Gas Chemical) 50 mM acetate buffer (pH 5.0)] The mixture was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After removing the substrate solution and washing the cell surface with tap water, the cells were examined to determine the presence or absence of a viral antigen.
ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）
SDS-PAGEはLaemmli（1970）の方法に従った。試料に試料用緩衝液［0.1M Tris-HCl（pH6.8）、4% SDS（Nacalai Tesque）、10% 2-Mercaptoethanol（Merck）、20% グリセリン（和光純薬）および0.005% ブロモ・フェノール・ブルー（キシダ化学）］を等量加え、5分間煮沸し可溶化した。試料としてウイルス感染細胞を用いる際は、感染細胞に可溶化バッファー［0.1M Tris-HCl（pH7.6）、0.1M NaCl、1% Nonidet P-40（Nacalai Tesque）、1% Triton X-100およびComplete, Mini, EDTA-free（Roche）］を加えた後、同様に処理した。可溶化した試料は7.5%あるいは10% ポリアクリルアミドゲルを用いて泳動した。ゲルはCoomassie Brilliant Blue R-250（Nacalai Tesque）で染色した。
Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
SDS-PAGE followed the method of Laemmli (1970). Sample buffer [0.1M Tris-HCl (pH6.8), 4% SDS (Nacalai Tesque), 10% 2-Mercaptoethanol (Merck), 20% glycerin (Wako Pure Chemicals) and 0.005% bromo-phenol ・Blue (Kishida Kagaku)] was added in an equal amount and boiled for 5 minutes to solubilize. When using virus-infected cells as samples, the solubilized buffer [0.1M Tris-HCl (pH 7.6), 0.1M NaCl, 1% Nonidet P-40 (Nacalai Tesque), 1% Triton X-100 and Complete, Mini, EDTA-free (Roche)] was added, and the same treatment was performed. Solubilized samples were run on 7.5% or 10% polyacrylamide gels. The gel was stained with Coomassie Brilliant Blue R-250 (Nacalai Tesque).
ウエスタンブロット法
ウエスタンブロット法はTowbinら（1979）の方法に従った。まず、SDS-PAGEで分画された蛋白をImmobilon-P Transfer Membrane（Millipore）に転写した。メンブランを5%のスキムミルクを含むPBSでブロッキングした。次に、6xHis Monoclonal Antibody（Clontech）またはモノクローナル抗体を含むマウス腹水を0.5%のスキムミルクを含むPBSで5,000倍に希釈し、メンブランと反応させた。洗浄後、同様に5,000倍に希釈したGoat Anti-Mouse IgG-HRP Conjugateと反応させた。洗浄後、発光基質溶液（Lumi-Light Western Blotting Substrate、Roche）に浸して、暗室でフィルム（Hyperfilm ECL、Amersham）に感光させ、現像した。
Western blotting Western blotting followed the method of Towbin et al. (1979). First, the protein fractionated by SDS-PAGE was transferred to Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore). The membrane was blocked with PBS containing 5% skim milk. Next, mouse ascites containing 6xHis Monoclonal Antibody (Clontech) or monoclonal antibody was diluted 5,000 times with PBS containing 0.5% skim milk and allowed to react with the membrane. After washing, the reaction was similarly performed with Goat Anti-Mouse IgG-HRP Conjugate diluted 5,000 times. After washing, the film was immersed in a luminescent substrate solution (Lumi-Light Western Blotting Substrate, Roche), exposed to a film (Hyperfilm ECL, Amersham) in a dark room, and developed.
モノクローナル抗体のビオチン標識
モノクローナル抗体を含むマウス腹水約5mlを孔径0.45μmのフィルター（Millex HV Filter Unit、Millipore）で濾過後、MAbTrap Kit（Amersham）を用いて精製した。ELISAおよび蛋白量の測定をおこない、抗体を含むフラクションを選別し、これを10mM HEPES緩衝液（pH8.5）に対して透析した。
精製したモノクローナル抗体2.5〜4.0mgに2.0〜3.0μlのビオチン溶液［100mM Biotin-AC5-OSu（同仁化学）を含むDimethyl Sulfoxide（Nacalai Tesque）］を添加し、25℃で4時間反応させた。このとき、精製したモノクローナル抗体に対して約10倍モル量のビオチンを反応させた。反応液をPBSに対して透析した後、同容量のグリセリンを加え、ビオチン標識モノクローナル抗体とした。
About 5 ml of mouse ascites containing the monoclonal antibody biotin-labeled monoclonal antibody was filtered through a 0.45 μm filter (Millex HV Filter Unit, Millipore) and purified using MAbTrap Kit (Amersham). ELISA and protein measurement were performed, and the fraction containing the antibody was selected and dialyzed against 10 mM HEPES buffer (pH 8.5).
To 2.5 to 4.0 mg of the purified monoclonal antibody, 2.0 to 3.0 μl of a biotin solution [Dimethyl Sulfoxide (Nacalai Tesque) containing 100 mM Biotin-AC 5 -OSu (Dojindo Chemical)] was added and reacted at 25 ° C. for 4 hours. At this time, about 10-fold molar amount of biotin was reacted with the purified monoclonal antibody. After the reaction solution was dialyzed against PBS, the same volume of glycerin was added to obtain a biotin-labeled monoclonal antibody.
酵素結合抗体法（ELISA）による結合競合試験
ELISAによる結合競合試験（競合ELISA試験）はKimura-Kurodaら（1983）の方法に従った。組換えＮＳ３蛋白を蛋白量1.2μg/mlにPBSで希釈し抗原液とした。モノクローナル抗体を含むマウス腹水をBSA5T［0.5% Bovine Serum Albumin Fraction Vおよび0.05% Tween 20を含むPBS］で1:100から4倍階段希釈したものを競合抗体として反応させた。ビオチン標識モノクローナル抗体はあらかじめ設定した希釈倍数にBSA5Tで調整して用いた。Avidin-HRP Conjugate（Bio-Rad）を1% Tween 20および5% スキムミルクを含むPBSで3,000倍に希釈し反応させた後、ELISAと同様にして405nmにおける吸光度を測定した。
競合率は次式により算出した。
競合率 (%) = 100 x ( ODfree − ODsample ) / ( ODfree − ODhomo )
ここでODfreeは競合抗体が存在しない（ビオチン標識モノクローナル抗体のみを反応させた）ときの吸光度、ODhomoはビオチン標識モノクローナル抗体とホモの競合抗体が存在するときの吸光度およびODsampleは各々の競合抗体が存在するときの吸光度を示す。
Binding competition test by enzyme-linked antibody method (ELISA)
The binding competition test by ELISA (competitive ELISA test) followed the method of Kimura-Kuroda et al. (1983). Recombinant NS3 protein was diluted with PBS to a protein amount of 1.2 μg / ml to obtain an antigen solution. Mouse ascites containing the monoclonal antibody was serially diluted 1: 100 to 4-fold with BSA 5 T [PBS containing 0.5% Bovine Serum Albumin Fraction V and 0.05% Tween 20] and reacted as a competitive antibody. The biotin-labeled monoclonal antibody was used by adjusting the dilution factor set in advance with BSA 5 T. Avidin-HRP Conjugate (Bio-Rad) was diluted 3,000 times with PBS containing 1% Tween 20 and 5% skim milk and reacted, and the absorbance at 405 nm was measured in the same manner as ELISA.
The competition rate was calculated by the following formula.
Competition rate (%) = 100 x (OD free − OD sample ) / (OD free − OD homo )
Here, OD free is the absorbance when no competing antibody is present (only biotin-labeled monoclonal antibody is reacted), OD homo is the absorbance when biotin-labeled monoclonal antibody and homo competing antibody are present, and OD sample is the respective competition Absorbance when antibody is present.
参考例１（ＮＳ３遺伝子のクローニング）
単層を形成したBFM細胞に感染多重度（multiplicity of infection、m.o.i.）1でBVDV Nose株を接種した。37℃で48時間培養後、この感染細胞にRNA抽出試薬（TRIzol Reagent、Invitrogen）を加え、ウイルスRNAを抽出した。抽出したRNAからRNA LA PCR Kit（AMV）Ver.1.1（宝酒造）を用いて逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）法によりＮＳ３遺伝子を増幅した。プライマーとして NS3Hel-1F（sense）：5’-CGAATTCGAAGGGTGGTTGGTAGAGTCAAAG-3’ （配列番号１）および NS3Hel-2R（antisense）：5’-CAAGCTTTTACAACCCGGCCACTTGCTTCAGT-3’ （配列番号２）を用いた。なおプライマーの塩基配列のうち、下線は制限酵素の部位（EcoRI；GAATTC、HindIII；AAGCTT）を、NS3Hel-2Rの5’末端から８〜１０番目のTAAは終止コドン（TAA）を示す。
Reference Example 1 (Cloning of NS3 gene)
BFM cells that formed monolayers were inoculated with the BVDV Nose strain at a multiplicity of infection (moi) of 1. After culturing at 37 ° C. for 48 hours, an RNA extraction reagent (TRIzol Reagent, Invitrogen) was added to the infected cells to extract viral RNA. From the extracted RNA, the NS3 gene was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using RNA LA PCR Kit (AMV) Ver.1.1 (Takara Shuzo). NS3Hel-1F (sense): 5′-C GAATTC GAAGGGTGGTTGGTAGAGTCAAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 1) and NS3Hel-2R (antisense): 5′-C AAGCTT TTACAACCCGGCCACTTGCTTCAGT-3 ′ (SEQ ID NO: 2) were used as primers. Note of primer nucleotide sequence, underlined sites for restriction enzymes (Eco RI; GAATTC, Hin dIII ; AAGCTT) , and the 8-10 th TAA from the 5 'end of NS3Hel-2R showing a termination codon (TAA).
得られたPCR産物の一部を0.8% アガロースゲル（アガロース S、和光純薬）で電気泳動し、ＮＳ３遺伝子の増幅を確認した後、全量を泳動し、目的のバンドを含むゲルを切り出した。このゲルからMinElute Gel Extraction Kit（Qiagen）を用いてＮＳ３遺伝子断片を精製し、pGEM-T Vector System I（Promega）を用いてベクターにクローニングした。QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen）を用いて抽出、精製されたプラスミドは、制限酵素EcoRI（東洋紡）およびHindIII（Boehringer Mannheim）で切断した後、0.8% アガロースゲルで電気泳動し、目的遺伝子が挿入されていることを確認した。 A part of the obtained PCR product was electrophoresed on a 0.8% agarose gel (Agarose S, Wako Pure Chemical Industries), and after confirming the amplification of NS3 gene, the entire amount was electrophoresed to cut out a gel containing the target band. NS3 gene fragment was purified from this gel using MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen) and cloned into a vector using pGEM-T Vector System I (Promega). QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) using the extracted, purified plasmid was digested with restriction enzyme Eco RI (Toyobo) and Hin dIII (Boehringer Mannheim), electrophoresed on a 0.8% agarose gel, inserted target gene Confirmed that it has been.
参考例２（組換えＮＳ３蛋白の発現と精製）
目的遺伝子が挿入された参考例１のプラスミドをQIAGEN Plasmid Midi Kit（Qiagen）を用いて大量精製した。このプラスミドを制限酵素EcoRIおよびHindIIIで切断した後、MinElute Gel Extraction Kit（Qiagen）を用いてゲルから目的のＮＳ３遺伝子断片を抽出、精製した。
Esherichia coli（E. coli）発現用ベクターpET-32c（Novagen）を制限酵素EcoRIおよびHindIIIで切断した後、脱リン酸化処理（アルカリフォスファターゼ処理）した。このpET-32cベクターとＮＳ３遺伝子断片を混和後、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造）を用いてライゲーション反応をおこなった。ライゲーション後の反応液をE. coli JM109株（東洋紡）に導入した後、LB寒天平板培地で培養した。得られたコロニーの菌液からQIAprep Spin Miniprep Kitを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素EcoRIおよびHindIIIで処理した後、目的遺伝子が挿入されているクローンを選択した。作製された発現ベクターの遺伝子マップを図1に示す。
Reference Example 2 (Expression and purification of recombinant NS3 protein)
The plasmid of Reference Example 1 into which the target gene was inserted was purified in large quantities using the QIAGEN Plasmid Midi Kit (Qiagen). After cutting the plasmid with restriction enzymes Eco RI and Hin dIII, extracted NS3 gene fragment of interest from the gel using MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen), and purified.
Esherichia coli ( E. coli ) expression vector pET-32c (Novagen) was cleaved with restriction enzymes Eco RI and Hin dIII, and then dephosphorylated (alkaline phosphatase treatment). The pET-32c vector and the NS3 gene fragment were mixed, and then a ligation reaction was performed using DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo). The reaction solution after ligation was introduced into E. coli JM109 strain (Toyobo) and then cultured on LB agar plate medium. From bacterial solution of the resultant colonies using QIAprep Spin Miniprep Kit was extracted plasmid was treated with restriction enzymes Eco RI and Hin dIII, clones were selected target gene has been inserted. A gene map of the prepared expression vector is shown in FIG.
目的遺伝子がクローニングされた組換えＮＳ３プラスミド（pET-32c/BVDV Nose NS3）を、組換え蛋白発現用宿主E. coli BL21(DE3)pLysS（Novagen）に導入した。導入菌をLB寒天平板培地で培養し、得られたコロニーをLB液体培地で培養した。1mM IPTG（宝酒造）を添加して組換えＮＳ３蛋白の発現を誘導した後、E. coliを回収した。回収した菌を可溶化バッファー［0.5% Triton X-100（Sigma）、10mM Imidazole、20mM Phosphateおよび0.5M NaCl（pH7.4）（Amersham）］に再浮遊し、超音波処理により可溶化した後、組換えＮＳ３蛋白をHisTrap Kit（Amersham）を用いて精製した。この精製蛋白をPBSに対して透析し、目的の組換えＮＳ３蛋白とした。 A recombinant NS3 plasmid (pET-32c / BVDV Nose NS3) in which the target gene was cloned was introduced into a recombinant protein expression host E. coli BL21 (DE3) pLysS (Novagen). The introduced bacteria were cultured on LB agar plate medium, and the resulting colonies were cultured on LB liquid medium. After adding 1 mM IPTG (Takara Shuzo) to induce expression of recombinant NS3 protein, E. coli was recovered. The collected bacteria were resuspended in a solubilization buffer [0.5% Triton X-100 (Sigma), 10 mM Imidazole, 20 mM Phosphate and 0.5 M NaCl (pH 7.4) (Amersham)] and solubilized by sonication. Recombinant NS3 protein was purified using HisTrap Kit (Amersham). This purified protein was dialyzed against PBS to obtain the desired recombinant NS3 protein.
なお、上記可溶化サンプルと上記精製蛋白をSDS-PAGEで解析したところ、約75kDaの位置に発現蛋白が単一のバンドとして確認された（図2）。BVDV Nose株のＮＳ３蛋白のアミノ酸配列（Nagaiら、2003、日本DNAデータバンクアクセス番号 AB078951）より、ＮＳ３蛋白の分子量は約75〜80kDaと推定される。うち本参考例においてE. coliで発現させた領域の分子量は約57kDaと予想される。さらにpET-32cベクターを用いることにより約18kDaのTrx蛋白を融合発現しているので、予想される組換えＮＳ３蛋白の分子量は約75kDaと計算される。これは図2の発現後の可溶化サンプルおよび精製蛋白で検出されたバンドの分子量と合致している。さらに、このバンドは、6xHis Monoclonal Antibodyを用いたウエスタンブロットにより約75kDaの位置に検出され、ELISAによりＮＳ３蛋白に対するモノクローナル抗体JCU/BVD/CF10（TropBio）と反応した（データ示さず）。なお、ここで得られたＮＳ蛋白断片のアミノ酸配列を配列表の配列番号３に示した。 When the solubilized sample and the purified protein were analyzed by SDS-PAGE, the expressed protein was confirmed as a single band at a position of about 75 kDa (FIG. 2). From the amino acid sequence of NS3 protein of BVDV Nose strain (Nagai et al., 2003, Japan DNA Data Bank Access No. AB078951), the molecular weight of NS3 protein is estimated to be about 75-80 kDa. Of these, the molecular weight of the region expressed in E. coli in this reference example is expected to be about 57 kDa. Furthermore, since the Trx protein of about 18 kDa is fused and expressed by using the pET-32c vector, the expected molecular weight of the recombinant NS3 protein is calculated to be about 75 kDa. This is consistent with the molecular weight of the band detected in the solubilized sample after expression and the purified protein in FIG. Furthermore, this band was detected at a position of about 75 kDa by Western blot using 6xHis Monoclonal Antibody, and reacted with the monoclonal antibody JCU / BVD / CF10 (TropBio) against NS3 protein by ELISA (data not shown). The amino acid sequence of the NS protein fragment obtained here is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
参考例３（ＮＳ３蛋白に対するモノクローナル抗体の作出）
参考例２で得られた組換えＮＳ３蛋白を抗原として、ＮＳ３蛋白に対するモノクローナル抗体（以下、単に「抗ＮＳ３抗体」ということもある）を作出した。モノクローナル抗体の作出はKidaら（1982）の方法に従っておこなった。100μgの組換えＮＳ３蛋白と等量のAdjuvant Complete Freund（Difco）を混合して、マウス（BALB/c、5週齢、日本SLC）に3回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。
Reference Example 3 (Production of monoclonal antibody against NS3 protein)
Using the recombinant NS3 protein obtained in Reference Example 2 as an antigen, a monoclonal antibody against the NS3 protein (hereinafter sometimes simply referred to as “anti-NS3 antibody”) was produced. Monoclonal antibodies were produced according to the method of Kida et al. (1982). 100 μg of recombinant NS3 protein and an equal amount of Adjuvant Complete Freund (Difco) were mixed, and mice (BALB / c, 5 weeks old, Japan SLC) were immunized 3 times, and the spleen cells were used for cell fusion.
細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞であるSp2/0-Ag14細胞（Shulmanら、1978）を用いた。細胞の培養には、Dulbecco’s Modified Eagle Medium（Gibco）にL-グルタミン 0.3mg/ml、ペニシリンGカリウム 100単位/ml、硫酸ストレプトマイシン 100μg/ml、Gentacin 40μg/mlを添加し（DMEM）、これに牛胎児血清（JRH）を10%となるように加えた培養液を用いた。 Sp2 / 0-Ag14 cells (Shulman et al., 1978), which are mouse myeloma cells, were used for cell fusion. For cell culture, Dulbecco's Modified Eagle Medium (Gibco) was supplemented with 0.3 mg / ml L-glutamine, 100 units / ml penicillin G potassium, 100 μg / ml streptomycin sulfate, and 40 μg / ml Gentacin (DMEM). A culture solution to which fetal serum (JRH) was added to 10% was used.
細胞融合は、免疫マウスの脾臓細胞とSp2/0-Ag14細胞を混合し、そこにPolyethylene glycol solution（Sigma）を添加することによりおこなった。融合細胞はHAT-DMEM［0.1mM Sodium Hypoxanthine、0.4μM Aminopterinおよび0.016mM Thymidine（Gibco）を含む血清加DMEM］で培養し、酵素結合抗体法（ELISA）により培養上清中の抗体産生を確認した。ELISAはKidaら（1982）の方法に従った。 Cell fusion was performed by mixing spleen cells of immunized mice and Sp2 / 0-Ag14 cells and adding polyethylene glycol solution (Sigma) thereto. The fused cells were cultured in HAT-DMEM [serum-added DMEM containing 0.1 mM Sodium Hypoxanthine, 0.4 μM Aminopterin and 0.016 mM Thymidine (Gibco)], and antibody production in the culture supernatant was confirmed by enzyme-linked antibody method (ELISA). . ELISA followed the method of Kida et al. (1982).
抗体産生陽性の細胞をHT-DMEM［0.1mM Sodium Hypoxanthineおよび0.016mM Thymidine（Gibco）を含む血清加DMEM］で培養し、さらに血清加DMEMで培養を続けた。抗体産生陽性の細胞は軟寒天上コロニー形成法（Kidaら、1982）によりクローニングした。クローニングした細胞は、2, 6, 10, 14-Tetramethylpentadecane（Sigma）を接種しておいたマウス（BALB/c、リタイア、日本SLC）に腹腔内接種し、腹水を採取した。この腹水をモノクローナル抗体として用いた。作出したモノクローナル抗体のアイソタイプは、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents（Sigma）を用いてELISAで同定した。 Antibody-positive cells were cultured in HT-DMEM [serum-added DMEM containing 0.1 mM sodium hypoxanthine and 0.016 mM thymidine (Gibco)], and further cultured in serum-added DMEM. Antibody-positive cells were cloned by colonization on soft agar (Kida et al., 1982). The cloned cells were intraperitoneally inoculated into mice (BALB / c, Retire, Japan SLC) inoculated with 2, 6, 10, 14-Tetramethylpentadecane (Sigma), and ascites was collected. This ascites was used as a monoclonal antibody. The isotype of the produced monoclonal antibody was identified by ELISA using Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents (Sigma).
なお、精製した組換え蛋白にはE. coli由来成分が極微量混入していると考えられる。そこでpET-32cベクターに遺伝子を挿入せずに発現させた蛋白（ET-32c Trx）を組換えＮＳ３蛋白と同様に精製し、対照抗原としてELISAに供した。これにより、Trx蛋白あるいはE. coli由来成分に対する抗体産生細胞を除外し、ＮＳ３蛋白に対する抗体産生細胞のみをスクリーニングした。
最終的にＮＳ３蛋白に対するモノクローナル抗体産生細胞が10クローン得られた。これらのモノクローナル抗体のイムノグロブリンアイソタイプはすべてIgG1であった。
The purified recombinant protein is thought to contain a very small amount of E. coli- derived components. Therefore, the protein (ET-32c Trx) expressed without inserting the gene into the pET-32c vector was purified in the same manner as the recombinant NS3 protein and subjected to ELISA as a control antigen. Thereby, antibody-producing cells against Trx protein or E. coli- derived components were excluded, and only antibody-producing cells against NS3 protein were screened.
Finally, 10 clones producing monoclonal antibody against NS3 protein were obtained. The immunoglobulin isotypes of these monoclonal antibodies were all IgG1.
作出した10クローンのモノクローナル抗体とBVDV Nose株、CSFV GPE-株およびBDV Moredun株との反応性を免疫染色法により検討した。また、ウエスタンブロット法によりBVDV Nose株との反応性を解析した。10クローンは、反応性の違いにより4群に分けられた（表１）。A群は、免疫染色法でBVDV Nose株、CSFV GPE-株、BDV Moredun株のすべてと反応し、またウエスタンブロット法でもBVDV Nose株と反応するモノクローナル抗体であり、37/4および46/1の2クローンがこれに分類された。B群は、免疫染色法でBVDV Nose株、CSFV GPE-株、BDV Moredun株のすべてと反応するが、ウエスタンブロット法ではBVDV Nose株と反応性を示さない抗体であり、2/8、7/5、23/4および49/2の4クローンがこれに分類された。C群は、免疫染色法でBVDV Nose株と反応するが、CSFV GPE-株とは反応せず、またウエスタンブロット法でBVDV Nose株と反応性を示さない抗体であり、9/1、34/6および50/1の3クローンがこれに分類された。D群は、免疫染色法でBVDV Nose株、CSFV GPE-株、BDV Moredun株のすべてと反応性を示さず、ウエスタンブロット法でのみBVDV Nose株と反応する抗体であり、33/1の1クローンがこれに分類された。 Monoclonal and BVDV Nose strains produced the 10 clones, CSFV GPE - reactivity with strains and BDV Moredun strains was examined by immunostaining. In addition, the reactivity with the BVDV Nose strain was analyzed by Western blotting. Ten clones were divided into 4 groups according to the difference in reactivity (Table 1). A group, BVDV Nose strain CSFV GPE in immunostaining - strain reacted with all BDV Moredun strains, also a monoclonal antibody that reacts with BVDV Nose strains by Western blotting, the 37/4 and 46/1 Two clones were classified into this. Group B is an antibody that reacts with all of BVDV Nose strain, CSFV GPE - strain, and BDV Moredun strain by immunostaining, but does not show reactivity with BVDV Nose strain by Western blotting. Four clones of 5, 23/4 and 49/2 were classified into this. Group C is an antibody that reacts with the BVDV Nose strain by immunostaining, but does not react with the CSFV GPE − strain, and does not react with the BVDV Nose strain by Western blotting. Three clones, 6 and 50/1, were classified into this. Group D, BVDV Nose strain CSFV GPE in immunostaining - strains did not show all the reactive BDV Moredun strains, an antibody that reacts with BVDV Nose strain only by Western blotting, 33/1 of 1 clone Was classified into this.
さらに、これらのモノクローナル抗体の抗原認識部位を同定するため、作出した10クローンのうち、5クローン（7/5、23/4、37/4、46/1および49/2）の抗体をビオチンで標識した。続いて、これら5クローンのビオチン標識抗体と未標識のモノクローナル抗体（競合抗体）との間で競合ELISA試験をおこなった。競合パターンにより5クローンのモノクローナル抗体は3群に分けられた（表１）。I群にはクローン37/4および46/1が属し、この2クローンはそれぞれ互いに競合した。II群にはクローン23/4および49/2が分類され、I群同様互いに競合した。III群にはクローン7/5が属した。クローン7/5は、競合抗体として用いたときはホモの標識抗体としか競合しないが、標識抗体として用いたときは他の4クローンともある程度の競合を示した。以上の成績より、これらの5クローンはＮＳ３蛋白上に存在する少なくとも3つの異なる抗原部位を認識していることが推察された。 Furthermore, in order to identify the antigen recognition site of these monoclonal antibodies, 5 of the 10 clones created (7/5, 23/4, 37/4, 46/1 and 49/2) were biotinized with biotin. Labeled. Subsequently, a competitive ELISA test was performed between these five clones of biotin-labeled antibodies and unlabeled monoclonal antibodies (competitive antibodies). The monoclonal antibodies of 5 clones were divided into 3 groups according to the competition pattern (Table 1). Group I included clones 37/4 and 46/1, which competed with each other. In group II, clones 23/4 and 49/2 were classified and competed with each other like group I. Clone 7/5 belonged to group III. Clone 7/5 competed only with homo-labeled antibodies when used as competing antibodies, but showed some competition with the other 4 clones when used as labeled antibodies. From the above results, it was speculated that these 5 clones recognize at least three different antigenic sites present on the NS3 protein.
実施例１（抗ＮＳ３抗体を用いたイムノクロマトキット）
参考例３で得られたモノクローナル抗体のうちクローン46/1（マウス腹水、未精製、ELISA価 ≧ 1,638,400）およびクローン49/2（マウス腹水、未精製、ELISA価 ≧ 1,638,400）を用い、イムノクロマト法テストストリップを下記の手順で作成し、試験を行った。
Example 1 (Immunochromatography kit using anti-NS3 antibody)
Of the monoclonal antibodies obtained in Reference Example 3, clone 46/1 (mouse ascites, unpurified, ELISA value ≧ 1,638,400) and clone 49/2 (mouse ascites, unpurified, ELISA value ≧ 1,638,400) were used for immunochromatographic test. Strips were made and tested according to the following procedure.
（１）抗ＮＳ３抗体の調製
参考例３で得られたクローン46/1および49/2のそれぞれを、さらに、常法によりプロテインG吸着体を用いたIgG精製を行い、抗ＮＳ３抗体とした。
(1) Preparation of anti-NS3 antibody Each of clones 46/1 and 49/2 obtained in Reference Example 3 was further subjected to IgG purification using a protein G adsorbent by a conventional method to obtain anti-NS3 antibody.
（２）金コロイド溶液の調製
加熱によって沸騰させた超純水99mlに、1%（v/w）塩化金酸水溶液1mlを加え、さらに、その１分後に1%（v/w）クエン酸ナトリウム水溶液1.5mlを加えて加熱し5分間沸騰させた後、室温に放置して冷却した。次いで、この溶液に200mM炭酸カリウム水溶液を加えてpH9.0に調製し、これに超純水を加えて全量を100mlとして金コロイド溶液を得た。
(2) Preparation of colloidal gold solution Add 1 ml of 1% (v / w) chloroauric acid aqueous solution to 99 ml of ultrapure water boiled by heating, and 1 minute later 1% (v / w) sodium citrate After 1.5 ml of an aqueous solution was added and heated to boil for 5 minutes, it was allowed to cool to room temperature. Subsequently, 200 mM potassium carbonate aqueous solution was added to this solution to adjust to pH 9.0, and ultrapure water was added thereto to make a total volume of 100 ml to obtain a gold colloid solution.
（３）金コロイド標識抗ＮＳ３抗体溶液の調製
上記（１）で得られた抗ＮＳ３抗体の蛋白換算重量1μg（以下、抗体の蛋白換算重量を示すとき、単に、その精製蛋白質の重量分析による重量数値で示す）と上記（２）の金コロイド溶液1mlとを混合し、室温で2分間静置してこの抗体のことごとくを金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%となるように10%ウシ血清アルブミン（以下、「BSA」と記す）水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をことごとくこのBSAでブロックして、金コロイド標識抗ＮＳ３抗体（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（5600×G、30分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を10%サッカロース・1%BSA・0.5%トリトン（Triton）-X100を含有する50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.4）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。
(3) Preparation of colloidal gold-labeled anti-NS3 antibody solution 1 μg of protein equivalent weight of the anti-NS3 antibody obtained in (1) above (hereinafter, when the weight of antibody protein equivalent weight is indicated, simply by weight analysis of the purified protein) (Shown in numerical values) and 1 ml of the colloidal gold solution of (2) above, and let stand for 2 minutes at room temperature to bind all of the antibodies to the surface of the colloidal gold particles. 10% bovine serum albumin (hereinafter referred to as “BSA”) aqueous solution was added so that the remaining surface of the gold colloidal particles was blocked with this BSA, and a colloidal gold-labeled anti-NS3 antibody (hereinafter referred to as “ A solution (denoted “colloidal gold labeled antibody”) was prepared. This solution was centrifuged (5600 × G, 30 minutes) to precipitate colloidal gold labeled antibody, and the supernatant was removed to obtain colloidal gold labeled antibody. The colloidal gold labeled antibody was suspended in a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 10% sucrose, 1% BSA, 0.5% Triton-X100 to obtain a colloidal gold labeled antibody solution.
（４）ＮＳ３蛋白測定用イムノクロマト法テストストリップの作成
図３に示されるイムノクロマト法テストストリップを下記の手順で作成した。
（４−１）ＮＳ３蛋白と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
幅5mm、長さ36mmの細長い帯状のニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体３として用意した。
抗ＮＳ３抗体1.0mg/mlが含有されてなる溶液0.5μlを、このクロマト展開用膜担体におけるクロマト展開開始点側の末端から7.5mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、ＮＳ３蛋白と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位３１とした。
(4) Preparation of immunochromatographic test strip for NS3 protein measurement The immunochromatographic test strip shown in FIG. 3 was prepared by the following procedure.
(4-1) An elongated belt-like nitrocellulose membrane having a capture site width of 5 mm and a length of 36 mm for the complex of NS3 protein and colloidal gold labeled antibody was prepared as a membrane carrier 3 for chromatographic development of a chromatographic medium.
0.5 μl of a solution containing 1.0 mg / ml of anti-NS3 antibody was applied in a line at a position 7.5 mm from the end of the chromatographic development start side of this membrane carrier for chromatographic development, and this was dried at room temperature. , And a capture site 31 of the complex of NS3 protein and colloidal gold labeled antibody.
（４−２）金コロイド標識抗体含浸部材
5mm×15mmの帯状のガラス繊維不織布に、金コロイド標識抗体溶液37.5μlを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材２とした。
（４−３）イムノクロマト法テストストリップの作成
上記クロマト展開用膜担体３、上記標識抗体含浸部材２の他に、試料添加用部材５として綿布と、吸収用部材４として濾紙を用意した。そして、これらの部材を用いて、図３と同様のイムノクロマト法テストストリップを作成した。
(4-2) Colloidal gold labeled antibody impregnated member
A 5 mm × 15 mm strip-shaped glass fiber nonwoven fabric was impregnated with 37.5 μl of a colloidal gold labeled antibody solution, which was dried at room temperature to obtain a colloidal gold labeled antibody impregnated member 2.
(4-3) Preparation of immunochromatographic test strip In addition to the membrane carrier 3 for chromatographic development and the labeled antibody impregnated member 2, a cotton cloth and a filter paper as an absorbing member 4 were prepared as the sample adding member 5. Then, using these members, an immunochromatographic test strip similar to that shown in FIG. 3 was prepared.
（５）試験
上記（１）のクローン46/1および49/2を表２に示すように組み合わせて使用し、サンドイッチ式免疫測定法とりわけイムノクロマトグラフィーにおいて最適のモノクローナル抗体の組み合わせを検討した。
抗原として参考例２で得られた組換えＮＳ３蛋白を用い、イムノクロマト法テストストリップの試料添加用部材に、当該抗原液を１００μｌ（濃度０．３２μg/l）を表２に示す濃度に希釈して滴下し、室温で１５分放置後、捕捉部位における呈色の度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（極めて弱い着色）、＋（弱い着色）、＋＋（明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。その結果を表２に示す。
(5) Test The clones 46/1 and 49/2 from the above (1) were used in combination as shown in Table 2, and the optimum combination of monoclonal antibodies in the sandwich immunoassay, particularly immunochromatography, was examined.
Using the recombinant NS3 protein obtained in Reference Example 2 as an antigen, dilute 100 μl (concentration 0.32 μg / l) of the antigen solution to the concentration shown in Table 2 on the sample addition member of the immunochromatographic test strip. After dripping and allowing to stand at room temperature for 15 minutes, the degree of coloration at the capturing site is visually observed with-(no coloring), ± (very weak coloring), + (weak coloring), ++ (clear coloring), ++++ (noticeable) Categorized into five levels. The results are shown in Table 2.
表２に示されるように、金コロイド標識抗体にクローン49/2を用いた場合、捕捉部位の抗体としてクローン46/1および49/2の何れを使用しても感度を得ることはできなかった。これに対し、金コロイド標識抗体および捕捉部位の抗体として共にクローン46/1を用いた場合、最適であることが示された。金コロイド標識抗体としてクローン46/1を用い、捕捉部位の抗体としてクローン49/2を用いた場合も実施可能であると考えられるが、Blankにおける非特異的呈色が生じ、いわゆる非特異的反応を示した。
このことから、クローン46/1が属する表１のＡ群のモノクローナル抗体が最適であることが示された。また、金コロイド標識抗体および捕捉部位の抗体として共にクローン46/1を用いることができることから、クローン46/1が認識するＮＳ３蛋白の抗原部位は複数存在することが示唆された。
As shown in Table 2, when clone 49/2 was used as the colloidal gold labeled antibody, no sensitivity could be obtained using either clone 46/1 or 49/2 as the capture site antibody. . On the other hand, when clone 46/1 was used as both the colloidal gold labeled antibody and the capture site antibody, it was shown to be optimal. The clone 46/1 is used as the colloidal gold-labeled antibody, and the clone 49/2 is used as the capture site antibody. showed that.
This indicated that the monoclonal antibodies of Group A in Table 1 to which clone 46/1 belongs are optimal. In addition, clone 46/1 can be used as both the colloidal gold labeled antibody and the capture site antibody, suggesting that there are multiple antigenic sites of NS3 protein recognized by clone 46/1.
実施例２（イムノクロマト法テストストリップの感度の検討）
金コロイド標識抗体および捕捉部位の抗体として共にクローン46/1を用い、実施例１と同じ方法でイムノクロマト法テストストリップを作成した。
参考例２で得られた組換えＮＳ３蛋白を精製後、バッファーをPBSに置換したもの（濃度0.32μg/μl）を検体希釈液で希釈して、各濃度に調整し、被験試料とした。この被験試料100μlを上記テストストリップの試料添加用部材にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、捕捉部位で捕捉された組換えＮＳ３蛋白と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、＋（微弱な着色）、＋＋（明確な着色）、＋＋＋（強い着色）、＋＋＋＋（非常に強い着色）の５段階に区分して判定した。その結果を表３に示した。表３から、約３pg/ml以上の濃度のＮＳ３蛋白を検出可能であることがわかる。
Example 2 (Study of sensitivity of immunochromatographic test strip)
An immunochromatographic test strip was prepared in the same manner as in Example 1, using clone 46/1 as the colloidal gold labeled antibody and the capture site antibody.
After purifying the recombinant NS3 protein obtained in Reference Example 2, the buffer was replaced with PBS (concentration 0.32 μg / μl) was diluted with a specimen diluent, adjusted to each concentration, and used as a test sample. 100 μl of this test sample was dropped with a micropipette onto the sample strip sample addition member and chromatographed. After leaving at room temperature for 15 minutes, a complex of recombinant NS3 protein captured at the capture site and colloidal gold labeled antibody Was observed with the naked eye. The amount of reddish purple that increases or decreases in proportion to the amount of the captured amount is visually observed with-(no coloring), + (weak coloring), ++ (clear coloring), ++++ (strong coloring), ++++ ( Judgment was made by classifying into 5 levels (very intense coloring). The results are shown in Table 3. From Table 3, it can be seen that NS3 protein at a concentration of about 3 pg / ml or more can be detected.
実施例３（ウイルスを感染させた培養細胞中のＮＳ３蛋白の検出）
培養細胞にBVDV及び同じフラビウイルス科ペスチウイルス属の２種の豚コレラウイルス（CSFV）を接種した。この培養細胞を可溶化し、その溶液を被験試料とした。そして、被験試料100μlを実施例２で得られたテストストリップの試料添加用部材にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、捕捉部位で捕捉されたＮＳ３蛋白と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、＋（微弱な着色）、＋＋（明確な着色）、＋＋＋（強い着色）、＋＋＋＋（非常に強い着色）の５段階に区分して判定した。その結果を表４に示した。表４から、本発明によれば、BVDVだけでなく、CSFVなどのフラビウイルス科ペスチウイルス属に属するウイルスを検出できることがわかる。
Example 3 (Detection of NS3 protein in cultured cells infected with virus)
Cultured cells were inoculated with BVDV and two porcine cholera viruses (CSFV) of the same Flaviviridae pestivirus genus. The cultured cells were solubilized and the solution was used as a test sample. Then, 100 μl of the test sample is dropped onto the sample addition member of the test strip obtained in Example 2 with a micropipette and chromatographed. After standing at room temperature for 15 minutes, NS3 protein trapped at the capture site and colloidal gold label The captured amount of the complex with the antibody was observed with the naked eye. The amount of reddish purple that increases or decreases in proportion to the amount of the captured amount is visually observed with-(no coloring), + (weak coloring), ++ (clear coloring), ++++ (strong coloring), ++++ ( Judgment was made by classifying into 5 levels (very intense coloring). The results are shown in Table 4. From Table 4, it can be seen that according to the present invention, not only BVDV but also viruses belonging to the genus Flaviviridae pestivirus such as CSFV can be detected.
実施例４（野外持続感染牛および健康牛の白血球抽出液中のBVDV-ＮＳ３蛋白の検出）
各種野外持続感染牛および健康牛よりそれぞれの血液を採取し、赤血球のみを破裂させ、白血球のみを回収した。これに1%NP40を含むPBSを加え、白血球を可溶化させた。これを遠心分離し、上清を回収した。この遠心上清を被験試料とした。そして、被験試料100μlを実施例２で得られたテストストリップの試料添加用部材にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、上記捕捉部位で捕捉されたＮＳ３蛋白と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、＋（微弱な着色）、＋＋（明確な着色）、＋＋＋（強い着色）、＋＋＋＋（非常に強い着色）の５段階に区分して判定した。その結果を表５に示した。表５から、本発明によれば、感染牛と健康牛を明確に識別することができ、本発明が、感染牛の摘発に有用であることがわかる。
Example 4 (Detection of BVDV-NS3 protein in leukocyte extract of field persistently infected cattle and healthy cattle)
Each blood was collected from various field persistently infected cattle and healthy cattle, and only red blood cells were ruptured and only white blood cells were collected. PBS containing 1% NP40 was added thereto to solubilize leukocytes. This was centrifuged and the supernatant was collected. This centrifugal supernatant was used as a test sample. Then, 100 μl of the test sample is dropped on the sample addition member of the test strip obtained in Example 2 with a micropipette and chromatographed. After standing at room temperature for 15 minutes, NS3 protein and gold colloid captured at the capture site are collected. The captured amount of the complex with the labeled antibody was observed with the naked eye. The amount of reddish purple that increases or decreases in proportion to the amount of the captured amount is visually observed with-(no coloring), + (weak coloring), ++ (clear coloring), ++++ (strong coloring), ++++ ( Judgment was made by classifying into 5 levels (very intense coloring). The results are shown in Table 5. From Table 5, it can be seen that according to the present invention, infected cattle and healthy cattle can be clearly distinguished, and the present invention is useful for detecting infected cattle.
実施例５（豚コレラウイルスの検出）
ミニブタ3頭に対し、1頭当たり107 TCID50の豚コレラウイルス野外強毒株を接種した。経時的に採血を行い、白血球画分を回収した。回収した白血球より白血球抽出液を調製し、実施例２で得られたテストストリップの試料添加用部材にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、上記捕捉部位の呈色を肉眼で観察した。またすべての検体よりウイルス分離を実施した。その結果を表６に示した。
表６から、採取した血液より調製した白血球抽出液からはウイルス接種6日後より死亡までの間、検体中のNS3抗原を検出することが可能であり、イムノクロマトグラフィー測定法で簡便かつ迅速に豚コレラウイルス感染を判定できることがわかる。
Example 5 (Detection of swine cholera virus)
Three minipigs were inoculated with 10 7 TCID 50 of a swine cholera virus field virulent strain. Blood was collected over time, and the leukocyte fraction was collected. A leukocyte extract is prepared from the collected white blood cells, dropped onto the sample addition member of the test strip obtained in Example 2 with a micropipette and chromatographed, and left at room temperature for 15 minutes. Observed with the naked eye. Virus isolation was performed from all specimens. The results are shown in Table 6.
From Table 6, it is possible to detect NS3 antigen in the specimen from the leukocyte extract prepared from the collected blood from the 6th day after virus inoculation until the death. It can be seen that virus infection can be determined.
本発明は、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスに共通に存在するＮＳ３蛋白に対する抗体を用いたサンドイッチ式免疫測定法、特に、イムノクロマトグラフィー測定法およびイムノクロマト法テストストリップを提供するものであり、フラビウイルス科ペスチウイルス属に属する広範囲のウイルスを簡単な方法で迅速に検出できるので、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスに起因する疾病を迅速かつ簡便に診断するために有用である。 The present invention provides a sandwich immunoassay method using an antibody against NS3 protein that is commonly present in Flaviviridae pestiviruses, in particular, an immunochromatographic assay method and an immunochromatographic test strip. Since a wide range of viruses belonging to the genus can be rapidly detected by a simple method, it is useful for quickly and easily diagnosing diseases caused by Flaviviridae pestiviruses.
１ 粘着シート
２ 含浸部材
３ 膜担体
３１ 捕捉部位
４ 吸収用部材
５ 試料添加用部材
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Adhesive sheet 2 Impregnation member 3 Membrane carrier 31 Capture part 4 Absorption member 5 Sample addition member
Claims (20)
The immunochromatographic test strip according to any one of claims 14 to 19, wherein the membrane carrier is a nitrocellulose membrane.
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