JP2006062986A - Estrogenic agent, method for producing the same, prophylactic agent for osteoporosis and food and beverage - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、優れたエストロゲン様作用を発揮することができるエストロゲン様作用剤及びその製造方法、並びに骨粗しょう症予防剤及び飲食品に関するものである。 The present invention relates to an estrogen-like agent capable of exhibiting an excellent estrogen-like action, a method for producing the same, an osteoporosis-preventing agent, and a food and drink.
従来、１０−ヒドロキシデカン酸や１０−ヒドロキシ−２−デセン酸等の炭素数が１０の直鎖脂肪酸はローヤルゼリー中に含有されており、生理活性機能としてアルドース還元酵素阻害作用、抗炎症作用、及びチロシナーゼ活性阻害作用が報告されている（例えば、特許文献１〜４参照。）。
この発明は、本発明者らの鋭意研究の結果、１０−ヒドロキシデカン酸や１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を含む特定の直鎖脂肪酸が優れたエストロゲン様作用を発揮することを見出したことによりなされたものである。その目的とするところは、優れたエストロゲン様作用を発揮することができるエストロゲン様作用剤並びに骨粗しょう症予防剤及び飲食品を提供することにある。別の目的とするところは、エストロゲン様作用剤を容易に製造することができるエストロゲン様作用剤の製造方法を提供することにある。 As a result of intensive studies by the present inventors, the present invention has found that specific linear fatty acids including 10-hydroxydecanoic acid and 10-hydroxy-2-decenoic acid exhibit an excellent estrogenic action. It was made. The purpose is to provide an estrogenic agent capable of exhibiting an excellent estrogenic effect, an osteoporosis preventive agent, and a food and drink. Another object is to provide a method for producing an estrogen-like agent that can easily produce an estrogen-like agent.
前記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明のエストロゲン様作用剤は、炭素数が１０の直鎖脂肪酸又はその塩からなるものである。
請求項２に記載の発明のエストロゲン様作用剤は、下記一般式（１）若しくは（２）で示される化合物又はその塩からなるものである。
In order to achieve the above object, the estrogen-like agent of the invention described in claim 1 is composed of a linear fatty acid having 10 carbon atoms or a salt thereof.
The estrogenic agent of the invention described in claim 2 is composed of a compound represented by the following general formula (1) or (2) or a salt thereof.
請求項３に記載の発明のエストロゲン様作用剤の製造方法は、請求項１又は請求項２に記載のエストロゲン様作用剤の製造方法であって、動物素材又は植物素材から有機溶媒によって抽出成分を抽出する抽出工程と、抽出成分を分離する分離工程とを備えるものである。
The method for producing an estrogen-like agent according to claim 3 is the method for producing an estrogen-like agent according to claim 1 or 2, wherein an extract component is extracted from an animal material or plant material with an organic solvent. An extraction step for extraction and a separation step for separating the extracted components are provided.
請求項４に記載の発明のエストロゲン様作用剤の製造方法は、請求項１又は請求項２に記載のエストロゲン様作用剤の製造方法であって、動物素材又は植物素材から有機溶媒及び油脂の混合液によって抽出成分を抽出する抽出工程と、抽出成分を分離する分離工程とを備えるものである。 A method for producing an estrogen-like agent according to claim 4 is a method for producing an estrogen-like agent according to claim 1 or 2, wherein an organic solvent and fats and oils are mixed from animal material or plant material. It comprises an extraction step for extracting an extraction component with a liquid and a separation step for separating the extraction component.
請求項５に記載の発明の骨粗しょう症予防剤は、請求項１又は請求項２に記載のエストロゲン様作用剤を有効成分として含有するものである。
請求項６に記載の発明の飲食品は、請求項１又は請求項２に記載のエストロゲン様作用剤を含有するものである。
The osteoporosis preventive agent of the invention described in claim 5 contains the estrogen-like agent described in claim 1 or claim 2 as an active ingredient.
The food / beverage product of the invention of Claim 6 contains the estrogen-like agent of Claim 1 or Claim 2.
本発明によれば、次のような効果を奏する。
請求項１及び請求項２に記載の発明のエストロゲン様作用剤によれば、優れたエストロゲン様作用を発揮することができる。
The present invention has the following effects.
According to the estrogen-like agent of the invention described in claims 1 and 2, an excellent estrogen-like action can be exhibited.
請求項３及び請求項４に記載の発明のエストロゲン様作用剤の製造方法によれば、エストロゲン様作用剤を容易に製造することができる。
請求項５に記載の発明の骨粗しょう症予防剤によれば、骨粗しょう症の発症を予防することができる。
According to the method for producing an estrogen-like agent of the invention described in claims 3 and 4, the estrogen-like agent can be easily produced.
According to the osteoporosis preventive agent of the invention described in claim 5, the onset of osteoporosis can be prevented.
請求項６に記載の発明の飲食品によれば、エストロゲン欠乏症や骨粗しょう症の発症を予防することができる。 According to the food and drink of the invention described in claim 6, it is possible to prevent the onset of estrogen deficiency and osteoporosis.
本実施形態の第１のエストロゲン様作用剤は、下記一般式（１）で示される化合物又はその塩からなる。 The first estrogenic agent of this embodiment is composed of a compound represented by the following general formula (1) or a salt thereof.
このエストロゲン様作用剤は炭素数が１０の直鎖飽和脂肪酸であり、デカン酸を基本骨格としている。前記一般式（１）で示される化合物としては、Ｘが水素を示すｎ−デカン酸、又はＸが水酸基を示す１０−ヒドロキシデカン酸が挙げられる。
This estrogenic agent is a straight-chain saturated fatty acid having 10 carbon atoms and has decanoic acid as a basic skeleton. Examples of the compound represented by the general formula (1) include n-decanoic acid in which X represents hydrogen, or 10-hydroxydecanoic acid in which X represents a hydroxyl group.
本実施形態の第２のエストロゲン様作用剤は、下記一般式（２）で示される化合物又はその塩からなる。 The second estrogenic agent of this embodiment is composed of a compound represented by the following general formula (2) or a salt thereof.
このエストロゲン様作用剤は炭素数が１０の直鎖不飽和脂肪酸であり、２−デセン酸を基本骨格としている。前記一般式（２）で示される化合物としては、Ｘが水素を示すトランス−２−デセン酸、又はＸが水酸基を示す１０−ヒドロキシ−２−デセン酸が挙げられる。これら第１及び第２のエストロゲン様作用剤において、前記各一般式で示される化合物の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の金属塩、モノメチルアミン、トリメチルアミン等の有機アミン塩が挙げられる。
This estrogenic agent is a linear unsaturated fatty acid having 10 carbon atoms and has 2-decenoic acid as a basic skeleton. Examples of the compound represented by the general formula (2) include trans-2-decenoic acid in which X represents hydrogen, or 10-hydroxy-2-decenoic acid in which X represents a hydroxyl group. In these first and second estrogenic agents, the salts of the compounds represented by the above general formulas include metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt and magnesium salt, and organic amines such as monomethylamine and trimethylamine. Salt.
これらエストロゲン様作用剤は、ローヤルゼリー等の動物素材や花粉等の植物素材から得られる。各エストロゲン様作用剤は、体内に吸収されたときには優れたエストロゲン様作用（エストロゲンの生理活性に類似した作用）を発揮する。 These estrogenic agents are obtained from animal materials such as royal jelly and plant materials such as pollen. Each estrogen-like agent exhibits an excellent estrogen-like action (action similar to the physiological activity of estrogen) when absorbed into the body.
本実施形態の医薬品又は医薬部外品は、第１又は第２のエストロゲン様作用剤を有効成分として含有している。医薬品又は医薬部外品は、エストロゲン様作用剤の優れたエストロゲン様作用により、エストロゲン欠乏症の発症の予防の他、骨粗しょう症予防剤として骨粗しょう症の発症の予防に用いられる。 The pharmaceutical or quasi drug of this embodiment contains the first or second estrogen-like agent as an active ingredient. Medicinal products or quasi-drugs are used to prevent the development of estrogen deficiency, as well as to prevent the development of osteoporosis as an osteoporosis preventive agent due to the excellent estrogenic action of the estrogenic agent.
医薬品は、経口剤又は非経口剤として構成される。経口剤の剤形としては、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤等が挙げられる。医薬品は、錠剤として構成されるときには結合剤、賦形剤、膨化剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤等が混合されるとともに表面にシェラックや砂糖がコーティングされ、カプセル剤として構成されるときには前記各成分の他に油脂等の液体担体等が混合され、シロップ剤又はドリンク剤として構成されるときには甘味剤、防腐剤、色素香味剤等が混合される。非経口剤の剤形としては、軟膏剤、クリーム剤、水剤等の外用剤の他に注射剤等が挙げられる。医薬品は、外用剤として構成されるときにはワセリン、パラフィン、油脂類、ラノリン、マクロゴールド等の基材が混合される。また、医薬品は、注射剤として構成されるときには剤形として液剤や凍結乾燥剤が挙げられ、凍結乾燥剤のときには注射用蒸留水、生理食塩水、輸液等に無菌的に溶解して用いられる。一方、医薬部外品においては、エストロゲン様作用剤は錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、石鹸、歯磨き粉等に含有される。 The pharmaceutical is configured as an oral or parenteral agent. Examples of oral dosage forms include tablets, capsules, powders, syrups, and drinks. When pharmaceutical products are configured as tablets, they are mixed with binders, excipients, swelling agents, lubricants, sweeteners, flavoring agents, etc. and coated with shellac or sugar on the surface, and when configured as capsules In addition to the above components, liquid carriers such as fats and oils are mixed, and when configured as a syrup or drink, sweeteners, preservatives, pigment flavoring agents and the like are mixed. Examples of parenteral dosage forms include injections in addition to external preparations such as ointments, creams, and liquids. When pharmaceuticals are configured as external preparations, base materials such as petrolatum, paraffin, fats and oils, lanolin and macro gold are mixed. In addition, pharmaceuticals include liquids and lyophilized agents as dosage forms when configured as injectables, and are used aseptically dissolved in distilled water for injection, physiological saline, infusion, and the like when lyophilized. On the other hand, in quasi drugs, estrogenic agents are contained in tablets, capsules, drinks, soaps, toothpastes and the like.
医薬品又は医薬部外品中のエストロゲン様作用剤の含有量は０．００１〜３０質量％が好ましく、０．０１〜１０質量％がより好ましく、０．０５〜１質量％がさらに好ましい。エストロゲン様作用剤の含有量が０．００１質量％未満では、医薬品又は医薬部外品に含有されるエストロゲン様作用剤の量が少ない。一方、３０質量％を超えると、医薬品又は医薬部外品が賦形剤等の剤形を維持するための成分を含有するときにその成分の含有量が低下し、医薬品又は医薬部外品は剤形を維持するのが困難になる。 0.001-30 mass% is preferable, as for content of the estrogen-like agent in a pharmaceutical or a quasi-drug, 0.01-10 mass% is more preferable, 0.05-1 mass% is further more preferable. When the content of the estrogen-like agent is less than 0.001% by mass, the amount of the estrogen-like agent contained in the pharmaceutical product or quasi drug is small. On the other hand, when the content exceeds 30% by mass, the content of the component decreases when the drug or quasi-drug contains a component for maintaining a dosage form such as an excipient. It becomes difficult to maintain the dosage form.
本実施形態の飲食品は、第１又は第２のエストロゲン様作用剤を含有している。ここで、飲食品とはドリンク等の飲料品やクッキー等の食品を含み、健康食品等の食品製剤も含む。この飲食品は、エストロゲン様作用剤の優れたエストロゲン様作用により、エストロゲン欠乏症及び骨粗しょう症の発症の予防に用いられる。 The food / beverage products of this embodiment contain the 1st or 2nd estrogen-like agent. Here, the food and drink includes beverages such as drinks and foods such as cookies, and also includes food preparations such as health foods. This food and drink is used for the prevention of the development of estrogen deficiency and osteoporosis due to the excellent estrogenic effect of the estrogenic agent.
飲食品中のエストロゲン様作用剤の含有量は０．００１〜１０質量％が好ましく、０．００１〜５質量％がより好ましく、０．０１〜０．１質量％がさらに好ましい。エストロゲン様作用剤の含有量が０．００１質量％未満では、飲食品に含有されるエストロゲン様作用剤の量が少ない。一方、１０質量％を超えると、飲食品がその他の成分として基材を含有するときに、基材の含有量が減少することによって飲食品はその形態を維持するのが困難になる。その他の成分としては、基材、賦形剤、添加剤、副素材、増量剤等が挙げられる。飲食品の形態は粉末状、錠剤状、ドリンク剤等の液状、カプセル状等が挙げられ、具体的には飴、せんべい、クッキー、各種飲料等の形態を採用することができる。 0.001-10 mass% is preferable, as for content of the estrogen-like agent in food-drinks, 0.001-5 mass% is more preferable, and 0.01-0.1 mass% is further more preferable. When the content of the estrogen-like agent is less than 0.001% by mass, the amount of the estrogen-like agent contained in the food or drink is small. On the other hand, when it exceeds 10 mass%, when food / beverage products contain a base material as another component, it will become difficult for food / beverage products to maintain the form by reducing the content of a base material. Examples of other components include base materials, excipients, additives, auxiliary materials, and bulking agents. Examples of the form of food and drink include powders, tablets, liquids such as drinks, and capsules. Specifically, forms such as rice cakes, rice crackers, cookies, and various beverages can be employed.
飲食品は、一日数回に分けて経口摂取される。一日の摂取量は０．００１〜１０ｇが好ましく、０．００１〜５ｇがより好ましく、０．０１〜０．１ｇがさらに好ましい。飲食品の摂取量が０．００１ｇ未満では、一日に摂取することができるエストロゲン様作用剤の量が少なくなる。一方、１０ｇを超えると、摂取量が多いために飲食品の取扱い性が悪化するおそれがある。 Food and drink is taken orally in several divided doses a day. The daily intake is preferably 0.001 to 10 g, more preferably 0.001 to 5 g, and still more preferably 0.01 to 0.1 g. If the intake of food and drink is less than 0.001 g, the amount of estrogen-like agent that can be ingested in a day decreases. On the other hand, if it exceeds 10 g, the amount of intake may be large, and the handleability of food and drink may be deteriorated.
次に、エストロゲン様作用剤の製造方法について説明する。この製造方法は、抽出工程と分離工程とを備えている。抽出工程においては、浸漬処理と、固液分離処理と、必要に応じて濃縮及び乾燥とが行われる。浸漬処理では、有機溶媒に動物素材又は植物素材を浸漬した後に撹拌又は放置することにより、有機溶媒中にエストロゲン様作用剤を含有する抽出成分が抽出される。有機溶媒としては、エタノール、メタノール等の低級アルコール類、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類等が挙げられる。これらは単独で用いられてもよいし、二種以上が組み合わされて用いられてもよい。これらの中でも、エタノールが、得られたエストロゲン様作用剤を経口剤等の原料として容易に用いることができるために好ましい。さらに、浸漬処理においては、エストロゲン様作用剤を損なうことなく抽出するために、有機溶媒及び油脂の混合液を用いるのが好ましい。油脂としてはグリセリン、スクワレン、ラード、なたね油、シソ油、オリーブ油、大豆油、ゴマ油等が挙げられ、これらはエストロゲン様作用剤の安定性を高めることができる。 Next, a method for producing an estrogen-like agent will be described. This manufacturing method includes an extraction step and a separation step. In the extraction step, immersion treatment, solid-liquid separation treatment, and concentration and drying are performed as necessary. In the dipping treatment, an extraction component containing an estrogen-like agent is extracted in an organic solvent by immersing an animal material or a plant material in an organic solvent and then stirring or leaving it. Examples of the organic solvent include lower alcohols such as ethanol and methanol, and halogenated hydrocarbons such as chloroform. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, ethanol is preferable because the obtained estrogen-like agent can be easily used as a raw material for oral preparations. Furthermore, in the immersion treatment, it is preferable to use a mixed solution of an organic solvent and fats and oils in order to extract without damaging the estrogen-like agent. Examples of fats and oils include glycerin, squalene, lard, rapeseed oil, perilla oil, olive oil, soybean oil, sesame oil, and the like, which can enhance the stability of estrogenic agents.
有機溶媒の量は、動物素材又は植物素材の１重量部に対して１〜１０重量部が好ましく、２〜８重量部がより好ましく、３〜６重量部がさらに好ましい。一方、抽出温度は１０〜３０℃が好ましい。抽出時間は１〜２４時間が好ましく、２〜１２時間がより好ましく、３〜６時間がさらに好ましい。 The amount of the organic solvent is preferably 1 to 10 parts by weight, more preferably 2 to 8 parts by weight, and further preferably 3 to 6 parts by weight with respect to 1 part by weight of the animal material or plant material. On the other hand, the extraction temperature is preferably 10 to 30 ° C. The extraction time is preferably 1 to 24 hours, more preferably 2 to 12 hours, and further preferably 3 to 6 hours.
有機溶媒の量が１重量部未満、抽出温度が１０℃未満又は抽出時間が１時間未満では、抽出効率が低下してエストロゲン様作用剤の製造効率が低下するおそれがある。一方、有機溶媒の量が１０重量部を超えると抽出後の濃縮に時間を要し、抽出時間が２４時間を超えると抽出に時間を要する。よって、エストロゲン様作用剤の製造効率が低下するおそれがある。また、抽出温度が３０℃を超えると、抽出されたエストロゲン様作用剤が熱によって損なわれるおそれがある。さらに、有機溶媒の沸点が３０℃未満のときに有機溶媒が揮発するおそれがある。抽出に用いる容器は、密閉容器が有機溶媒の揮発を防止するために好ましく、防爆型容器が前記効果に加えて取扱いが容易なためにより好ましい。 If the amount of the organic solvent is less than 1 part by weight, the extraction temperature is less than 10 ° C., or the extraction time is less than 1 hour, the extraction efficiency may be reduced and the production efficiency of the estrogen-like agent may be reduced. On the other hand, if the amount of the organic solvent exceeds 10 parts by weight, it takes time to concentrate after extraction, and if the extraction time exceeds 24 hours, it takes time to extract. Therefore, the production efficiency of the estrogen-like agent may be reduced. Moreover, when extraction temperature exceeds 30 degreeC, there exists a possibility that the extracted estrogen-like agent may be impaired by heat. Furthermore, the organic solvent may volatilize when the boiling point of the organic solvent is less than 30 ° C. As the container used for extraction, a sealed container is preferable for preventing volatilization of the organic solvent, and an explosion-proof container is more preferable because it is easy to handle in addition to the above effects.
動物素材及び植物素材はエストロゲン様作用剤を含有し、動物素材としてはローヤルゼリー等が挙げられ、植物素材としては花粉、オリーブ又はその種子、海藻、大豆、大麦若葉等が挙げられる。ローヤルゼリーは、蜜蜂のうち日齢３〜１２日の働き蜂が下咽頭腺及び大腮腺から分泌する分泌物を混合して作る乳白色のゼリー状物質である。ローヤルゼリーは中国、日本等のアジア諸国、台湾、ヨーロッパ諸国、北アメリカ諸国、南アメリカ諸国等の国又は地域のいずれの産地であってもよい。花粉の種類としてはトウモロコシ、ライ麦、チモシイ（大粟反）等が挙げられる。花粉は、単一種のみにより構成されてもよいし、複数種の混合により構成されてもよい。これらの中でも、ローヤルゼリーが、エストロゲン様作用剤の含有量が高いために好ましい。 Animal materials and plant materials contain an estrogen-like agent. Examples of animal materials include royal jelly. Examples of plant materials include pollen, olives or seeds thereof, seaweed, soybeans, and barley leaves. Royal jelly is a milky white jelly-like substance made by mixing secretions secreted from the hypopharyngeal gland and the greater vagina by bees 3 to 12 days of age among the bees. The royal jelly may be produced in any country or region such as Asian countries such as China and Japan, Taiwan, European countries, North American countries and South American countries. Examples of the types of pollen include corn, rye and timosi (Daisenkan). Pollen may be composed of only a single species or a mixture of a plurality of species. Of these, royal jelly is preferred because of its high content of estrogenic agents.
動物素材又は植物素材の形態としては、採取された状態のままのもの、採取された後に乾燥されたもの、採取された後に乾燥及び粉砕されて粉末化されたもの等が挙げられる。ここで、例えば採取された状態のままのローヤルゼリー、即ち生ローヤルゼリーは通常６５〜６７質量％の水分を含有している。このため、例えば生ローヤルゼリーを１００容量％の有機溶媒に浸漬したときには、有機溶媒と生ローヤルゼリー中の水分とが混合することにより有機溶媒の濃度が低下し、抽出効率が低下するおそれがある。よって、動物素材又は植物素材は、乾燥されたものが抽出効率を向上させることができるために好ましく、粉末化されたものが前記効果に加えて取扱いが容易なために好ましい。動物素材又は植物素材の乾燥は真空凍結乾燥等が挙げられる。一方、動物素材又は植物素材の粉砕には粉砕器、裁断機等が好適である。 Examples of the form of the animal material or the plant material include a material that has been collected, a material that has been collected and dried, a material that has been collected and then dried and pulverized, and the like. Here, for example, the royal jelly as it is collected, that is, fresh royal jelly, usually contains 65 to 67% by mass of water. For this reason, for example, when raw royal jelly is immersed in 100% by volume of an organic solvent, the concentration of the organic solvent may decrease due to mixing of the organic solvent and moisture in the raw royal jelly, and the extraction efficiency may decrease. Therefore, the animal material or the plant material is preferably dried so that the extraction efficiency can be improved, and the powdered material is preferable because it is easy to handle in addition to the above effects. Examples of the drying of animal materials or plant materials include vacuum freeze drying. On the other hand, a crusher, a cutting machine, etc. are suitable for crushing animal materials or plant materials.
浸漬処理の後、動物素材又は植物素材と有機溶媒との混合液の固液分離処理により、有機溶媒と抽出成分とからなる抽出液を得る。固液分離処理には、常圧濾過、吸引濾過、遠心分離等が用いられる。常圧濾過及び吸引濾過に用いる濾材としては食品用の濾紙、珪藻土を重層した濾紙等が挙げられ、遠心分離には通常の遠心分離機等が用いられる。固液分離処理は、濾過と遠心分離とを組み合わせて行うのが、分離効率を向上させることができるために好ましい。さらに、濾過によって得られる残渣は、有機溶媒によって再抽出されるのが抽出効率を向上させることができるために好ましい。 After the immersion treatment, an extraction liquid composed of the organic solvent and the extraction component is obtained by solid-liquid separation treatment of a mixed liquid of the animal material or plant material and the organic solvent. For the solid-liquid separation treatment, atmospheric pressure filtration, suction filtration, centrifugation, or the like is used. Examples of the filter medium used for normal pressure filtration and suction filtration include food filter paper, filter paper layered with diatomaceous earth, and a normal centrifuge or the like is used for centrifugation. The solid-liquid separation treatment is preferably performed in combination with filtration and centrifugation because the separation efficiency can be improved. Furthermore, the residue obtained by filtration is preferably re-extracted with an organic solvent because the extraction efficiency can be improved.
固液分離処理の後、必要に応じて抽出液を濃縮及び乾燥することにより抽出成分を得る。このとき、抽出液を減圧下で加熱することにより濃縮及び乾燥してもよいし、真空凍結乾燥機を用いることにより抽出液を加熱することなく濃縮及び乾燥してもよい。減圧下で加熱するときには、加熱温度は２０〜６０℃が好ましく、２５〜５５℃がより好ましく、３０〜５０℃がさらに好ましい。加熱温度が２０℃未満では、濃縮等に時間を要しエストロゲン様作用剤の製造効率が低下するおそれがある。一方、６０℃を超えると、エストロゲン様作用剤が熱により損なわれるおそれがある。 After the solid-liquid separation process, the extract is concentrated and dried as necessary to obtain an extract component. At this time, the extract may be concentrated and dried by heating under reduced pressure, or the extract may be concentrated and dried without heating by using a vacuum freeze dryer. When heating under reduced pressure, the heating temperature is preferably 20 to 60 ° C, more preferably 25 to 55 ° C, and even more preferably 30 to 50 ° C. If the heating temperature is less than 20 ° C., it takes time to concentrate and the like, and the production efficiency of the estrogen-like agent may be reduced. On the other hand, when it exceeds 60 ° C., the estrogen-like agent may be damaged by heat.
分離工程においては、分離処理と、濃縮及び乾燥とが行われる。分離処理では、分離用担体をカラムに充填した後に抽出成分が溶解された分離用溶液をカラムに供することにより、分離用溶液中の抽出成分においてエストロゲン様作用剤と他の成分とを分離する。このとき、エストロゲン様作用剤は分離用溶液に溶解した状態で得られる。この分離処理により、抽出成分からエストロゲン様作用剤のみを取出すことができる。 In the separation step, separation treatment, concentration and drying are performed. In the separation treatment, an estrogen-like agent and other components are separated from each other in the extraction component in the separation solution by supplying the separation solution in which the extraction component is dissolved after filling the separation carrier into the column. At this time, the estrogen-like agent is obtained in a state dissolved in the separation solution. By this separation treatment, only the estrogen-like agent can be extracted from the extracted components.
分離用担体の材質としては、セルロース、アガロース等の多孔性の多糖類、酸化ケイ素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン等が挙げられる。分離用担体の種類としては、逆相担体、イオン交換担体、アフィニティ担体、分配性担体、分子篩用担体、吸着性担体等が挙げられる。逆相担体はその表面が疎水性化合物によりコーティングされ、ＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア社製）等が挙げられる。イオン交換担体はその表面がイオン性の物質によりコーティングされ、具体例としてはＩＲＡ−４１０、ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（ロームアンドハース社製）等が挙げられる。ここで、エストロゲン様作用剤は疎水性を示す。このため、イオン交換担体は、抽出成分がエストロゲン様作用剤の他に親水性を示す成分を多く含有するときに用いることができる。アフィニティ担体はその表面が抗体等によりコーティングされ、抗原となる物質のみを分離する。分配性担体は分離する物質と分離用溶媒との間の分配係数の差異を利用して分離を行い、シリカゲル（メルク社製）等が挙げられる。分子篩用担体は分子の大きさの差異を利用して分子量数十〜数千の分子の分離を行い、セファデックス（登録商標）ＬＨ−２０（アマシャムファルマシア製）等が挙げられる。吸着性担体は分離する物質の吸着性を利用して分離を行い、ダイヤイオン（登録商標）（三菱化学（株）製）等が挙げられる。 Examples of the material for the separation carrier include porous polysaccharides such as cellulose and agarose, silicon oxide compounds, polyacrylamide, polystyrene, and polypropylene. Examples of the separation carrier include a reverse phase carrier, an ion exchange carrier, an affinity carrier, a dispersible carrier, a molecular sieve carrier, and an adsorptive carrier. The surface of the reverse phase carrier is coated with a hydrophobic compound, and examples thereof include DM1020T (manufactured by Fuji Silysia). The surface of the ion exchange carrier is coated with an ionic substance, and specific examples include IRA-410, XAD-2, XAD-4 (Rohm and Haas). Here, the estrogen-like agent exhibits hydrophobicity. For this reason, the ion exchange carrier can be used when the extraction component contains a large amount of hydrophilic components in addition to the estrogen-like agent. The surface of the affinity carrier is coated with an antibody or the like, and only the substance that becomes an antigen is separated. The dispersible carrier is separated using a difference in distribution coefficient between the substance to be separated and the solvent for separation, and examples thereof include silica gel (manufactured by Merck). The molecular sieve carrier separates molecules having molecular weights of several tens to several thousand using the difference in molecular size, and examples thereof include Sephadex (registered trademark) LH-20 (manufactured by Amersham Pharmacia). The adsorptive carrier is separated by utilizing the adsorptivity of the substance to be separated, and Diaion (registered trademark) (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) can be used.
各分離用担体の中でも、抽出成分の分離効率が高いために逆相担体又は分配性担体が好ましく、エストロゲン様作用剤が結合するエストロゲン受容体により表面がコーティングされているアフィニティ担体が、エストロゲン様作用剤を特異的に分離することができるためにより好ましい。 Among the separation carriers, a reverse phase carrier or a dispersible carrier is preferable because of high separation efficiency of the extracted components, and an affinity carrier whose surface is coated with an estrogen receptor to which an estrogen-like agent binds has an estrogenic effect. It is more preferable because the agent can be specifically separated.
分離用担体の粒径は０．１〜３００μｍが好ましい。粒径が０．１μｍ未満では、分離用担体が細かすぎるために分離用溶液の展開に時間を要し、エストロゲン様作用剤の製造効率が低下するおそれがある。一方、３００μｍを超えると、抽出物の分離精度が低下するおそれがある。分離温度（分離用担体が充填されたカラムの温度）は４〜３０℃が好ましく、１０〜２５℃がより好ましい。分離温度が４℃未満では、カラムの操作性が悪化するおそれがある。一方、３０℃を超えると、分離によって得られるエストロゲン様作用剤が熱によって損なわれるおそれがある。分離用担体は有機溶媒に対する耐性を有するものが好ましく、医薬品や食品を製造するために用いられるものが、得られるエストロゲン様作用剤に分離用担体由来の不純物が混合されるのを防止することができるためにより好ましい。具体的には、前記各分離用担体の中でも、ＤＭ１０２０Ｔ、セファデックスＬＨ−２０又はダイヤイオンが、前記効果が高いために好ましい。 The particle size of the separation carrier is preferably 0.1 to 300 μm. If the particle size is less than 0.1 μm, the separation carrier is too fine, and it takes time to develop the separation solution, which may reduce the production efficiency of the estrogen-like agent. On the other hand, when it exceeds 300 μm, the separation accuracy of the extract may be lowered. The separation temperature (the temperature of the column packed with the separation carrier) is preferably 4 to 30 ° C, more preferably 10 to 25 ° C. If the separation temperature is less than 4 ° C., the operability of the column may be deteriorated. On the other hand, when it exceeds 30 ° C., the estrogenic agent obtained by separation may be damaged by heat. The separation carrier is preferably resistant to organic solvents, and the one used for producing pharmaceuticals and foods can prevent impurities derived from the separation carrier from being mixed with the obtained estrogen-like agent. It is more preferable because it is possible. Specifically, among the above-mentioned separation carriers, DM1020T, Sephadex LH-20 or diamond ion is preferable because of the high effect.
分離用溶液の溶媒である分離用溶媒は分離用担体の種類により適宜選択され、例えば分離用担体として逆相担体、イオン交換性担体又は吸着性担体を用いるときにはメタノール、エタノール等の低級アルコール又は低級アルコールと水との混合液が好ましい。また、アフィニティ担体又は分配性担体を用いるときにはクロロホルム、メタノール、酢酸又はそれらの混合液が好ましく、分子篩用担体を用いるときには低級アルコールが好ましい。これら分離溶媒の中でも、エタノールが、得られたエストロゲン様作用剤を経口剤等の原料として容易に用いることができるために好ましい。 The separation solvent, which is a solvent for the separation solution, is appropriately selected depending on the type of separation carrier. For example, when a reverse phase carrier, an ion exchange carrier or an adsorbent carrier is used as the separation carrier, a lower alcohol such as methanol, ethanol or the like A mixture of alcohol and water is preferred. Further, chloroform, methanol, acetic acid or a mixture thereof is preferable when an affinity carrier or a dispersible carrier is used, and a lower alcohol is preferable when a molecular sieve carrier is used. Among these separation solvents, ethanol is preferable because the obtained estrogenic agent can be easily used as a raw material for oral preparations.
分離用溶媒の量は、抽出成分の１質量に対して１〜５０倍量が好ましく、３〜２０倍量がより好ましい。分離用溶媒の量が１倍量未満では、分離用溶媒中の抽出成分の濃度が高すぎるために抽出成分の分離が困難になる。一方、５０倍量を超えると、分離用溶媒の体積が大きくなるために抽出成分の分離に時間を要し、エストロゲン様作用剤の製造効率が低下するおそれがある。 The amount of the separation solvent is preferably 1 to 50 times, more preferably 3 to 20 times the mass of the extraction component. If the amount of the separation solvent is less than 1 time, separation of the extraction components becomes difficult because the concentration of the extraction components in the separation solvent is too high. On the other hand, if the amount exceeds 50 times, the volume of the separation solvent increases, so that it takes time to separate the extraction components, and the production efficiency of the estrogen-like agent may be reduced.
抽出成分を分離するときには、カラムによる分離を複数回繰返すことが、分離用溶液中の不純物を確実に取除いてエストロゲン様作用剤の精製を行うことができるために好ましい。このとき、同一又は異なる分離用担体や分離用溶媒を用いてもよい。さらに、抽出成分の分離工程は、低速クロマトグラムシステム、精製用クロマトグラムシステム、膜分離クロマトグラムシステム等のシステム化された装置を用いることが、エストロゲン様作用剤の分離を容易に行うことができるために好ましい。さらに、抽出成分の分離工程を行うときには、分離用溶液中のエストロゲン様作用剤の存在を確認することが好ましい。エストロゲン様作用剤の存在を確認する方法としては、エストロゲンレセプター（ＥＲ）結合アッセイによる試験、エストロゲンに感受性を示すヒト乳癌細胞株を用いた増殖試験等が挙げられる。 When separating the extraction component, it is preferable to repeat the separation by the column a plurality of times because the estrogen-like agent can be purified by reliably removing impurities in the separation solution. At this time, the same or different separation carriers or separation solvents may be used. Furthermore, in the separation process of the extraction component, using a systemized apparatus such as a low-speed chromatogram system, a purification chromatogram system, or a membrane separation chromatogram system can easily separate an estrogen-like agent. Therefore, it is preferable. Furthermore, when performing the extraction component separation step, it is preferable to confirm the presence of an estrogen-like agent in the separation solution. Examples of the method for confirming the presence of an estrogen-like agent include a test by an estrogen receptor (ER) binding assay, a proliferation test using a human breast cancer cell line sensitive to estrogen, and the like.
分離処理の後、カラムに供された分離用溶液を濃縮及び乾燥して粉末化することにより、エストロゲン様作用剤を得る。濃縮及び乾燥には、減圧蒸留装置、真空乾燥機等が好適である。減圧蒸留装置を用いて乾燥するときには、乾燥温度は２０〜５０℃が好ましく、３０〜４０℃がより好ましい。一方、真空乾燥機を用いて乾燥するときには、乾燥温度は２０〜６０℃が好ましく、２５〜４０℃がより好ましい。乾燥温度が２０℃未満では、乾燥に時間を要しエストロゲン様作用剤の製造効率が低下するおそれがある。一方、５０℃又は６０℃を超えると、エストロゲン様作用剤が熱によって損なわれるおそれがある。 After the separation treatment, the estrogen-like agent is obtained by concentrating and drying the separation solution supplied to the column to form a powder. For concentration and drying, a vacuum distillation apparatus, a vacuum dryer or the like is suitable. When drying using a vacuum distillation apparatus, the drying temperature is preferably 20 to 50 ° C, more preferably 30 to 40 ° C. On the other hand, when drying using a vacuum dryer, the drying temperature is preferably 20 to 60 ° C, more preferably 25 to 40 ° C. If the drying temperature is less than 20 ° C., it takes time to dry and the production efficiency of the estrogen-like agent may be reduced. On the other hand, when it exceeds 50 ° C. or 60 ° C., the estrogenic agent may be damaged by heat.
前記の実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ 第１及び第２のエストロゲン様作用剤は前記一般式（１）若しくは（２）で示される化合物又はその塩からなるために、優れたエストロゲン様作用をそれぞれ発揮することができる。さらに、エストロゲン様作用剤は、その優れたエストロゲン様作用により、子宮内膜の増殖、子宮筋の発育、乳腺管の増殖分泌等の促進や月経周期の成立の媒介として作用することができる。このため、エストロゲン様作用剤は、無月経や月経異常の治療、月経の人為的移動、乳癌等に対するホルモン療法、無排卵性子宮出血等の消退出血の治療等に用いることができる。
The effects exhibited by the above embodiment will be described below.
-Since the 1st and 2nd estrogen-like agent consists of the compound or its salt shown by the said General formula (1) or (2), it can exhibit the outstanding estrogen-like action, respectively. Furthermore, an estrogen-like agent can act as a mediator of promotion of endometrial proliferation, myometrial growth, mammary duct growth and secretion, and establishment of the menstrual cycle by its excellent estrogen-like action. For this reason, an estrogen-like agent can be used for treatment of amenorrhea and menstrual abnormalities, artificial movement of menstruation, hormone therapy for breast cancer and the like, treatment of withdrawal bleeding such as anovulatory uterine bleeding, and the like.
・ エストロゲン様作用剤の製造方法は、前記抽出工程により抽出成分を得た後、分離工程による抽出成分の抽出、濃縮及び乾燥によりエストロゲン様作用剤を得る。よって、このエストロゲン様作用剤の製造方法は、抽出工程の後に分離工程を行うという簡単な操作により、エストロゲン様作用剤を容易に得ることができる。 In the method for producing an estrogen-like agent, an estrogen-like agent is obtained by obtaining an extract component by the extraction step and then extracting, concentrating and drying the extract component by a separation step. Therefore, this estrogen-like agent production method can easily obtain an estrogen-like agent by a simple operation of performing a separation step after the extraction step.
次に、試験例を挙げて前記実施形態をさらに具体的に説明する。
（試験例１）
抽出工程として、動物素材としての生ローヤルゼリー（中国産）２ｋｇに有機溶媒としての１００容量％エタノール４リットルを加え２０℃で２時間撹拌した後、濾紙（アドバンテック東洋（株）製、Ｎｏ．２）を用いて吸引濾過を行い濾液を得た。次いで、残渣に１００容量％エタノール８リットルを加え２０℃で２時間撹拌した後、前記濾紙を用いて吸引濾過を行い濾液を得た。続いて、各濾液を混合してエタノール抽出液を得た後、該エタノール抽出液を濃縮乾固して抽出成分を得た。次に、抽出成分３８５ｇを水及びクロロホルムを用いて分配し、クロロホルム層を取出した後に濃縮乾固してクロロホルム抽出物を得た。次いで、クロロホルム抽出物７２ｇにヘキサンを加え２０℃で２時間撹拌した後、前記濾紙を用いて濾液（ヘキサン抽出液）を得た。続いて、ヘキサン抽出液を濃縮乾固し、ヘキサン抽出物５．３２ｇを得た。
Next, the embodiment will be described more specifically with reference to test examples.
(Test Example 1)
As an extraction process, 4 kg of 100% ethanol by volume as an organic solvent was added to 2 kg of raw royal jelly as an animal material and stirred at 20 ° C. for 2 hours, followed by filter paper (No. 2 manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd.). Filtration with suction was performed to obtain a filtrate. Next, 8 liters of 100% by volume ethanol was added to the residue, and the mixture was stirred at 20 ° C. for 2 hours, followed by suction filtration using the filter paper to obtain a filtrate. Subsequently, each filtrate was mixed to obtain an ethanol extract, and then the ethanol extract was concentrated to dryness to obtain an extract component. Next, 385 g of the extracted component was distributed using water and chloroform, and the chloroform layer was taken out and then concentrated to dryness to obtain a chloroform extract. Next, hexane was added to 72 g of chloroform extract and stirred at 20 ° C. for 2 hours, and then a filtrate (hexane extract) was obtained using the filter paper. Subsequently, the hexane extract was concentrated to dryness to obtain 5.32 g of hexane extract.
次に、分離工程として、ヘキサン抽出物５．３２ｇを２容量％メタノール含有クロロホルム５０ｍｌに溶解させた後、シリカゲルカラム（富士シリシア化学（株）製、カラム直径：４．１ｃｍ、カラム長さ：３０ｃｍ、分離用担体：粒径７５μｍのシリカゲル、４００ｍｌ、溶出溶媒：クロロホルム、２０００ｍｌ）を用いた分画を行い、分離用担体に担持されている成分が溶出した溶出液（画分）を得た。 Next, as a separation step, 5.32 g of hexane extract was dissolved in 50 ml of chloroform containing 2% by volume of methanol, and then a silica gel column (manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd., column diameter: 4.1 cm, column length: 30 cm). Fractionation using a separation carrier: silica gel having a particle size of 75 μm, 400 ml, elution solvent: chloroform, 2000 ml) was performed to obtain an eluate (fraction) in which components supported on the separation carrier were eluted.
続いて、得られた各画分について、エストロゲン受容体と親和性を示す物質の受容体結合実験によるエストロゲン様作用の確認及び薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ、展開溶媒：クロロホルム）による含有成分の分析を行い、エストロゲン様作用を有するとともに２４−メチレンコレステロールを含有しない画分Ａを得た。２４−メチレンコレステロールはエストロゲン様作用を有している。 Subsequently, for each of the obtained fractions, confirmation of estrogen-like action by a receptor binding experiment of a substance having affinity with the estrogen receptor and analysis of contained components by thin layer chromatography (TLC, developing solvent: chloroform) were performed. Fraction A, which has an estrogenic action and does not contain 24-methylenecholesterol, was obtained. 24-Methylenecholesterol has an estrogenic effect.
画分Ａについて、セファデックス（登録商標）ＬＨ−２０を分離用担体としたカラム（カラム直径：３．４ｃｍ、カラム長さ：２４ｃｍ、分離用担体の量：２２０ｍｌ、溶出溶媒：クロロホルム、２５０ｍｌ）を用いた分画、及び得られた各画分についての前記受容体結合実験を行い、エストロゲン様作用を有する画分Ｂを得た。続いて、画分Ｂについて、高速液体クロマトグラフィ（カラム直径：２０ｍｍ、カラム長さ：２５０ｍｍ、分離用担体：シリカゲル（（株）資生堂製のＡＣＲタイプ）、溶出溶媒：０．１容量％酢酸添加７０容量％メタノール水溶液、検出波長：２３０ｎｍ）を用いた分画、及び得られた各画分についての前記受容体結合実験を行い、エストロゲン様作用を有する画分Ｃを得た。
（試験例２）
抽出工程として、前記試験例１と同様にしてクロロホルム抽出物を得た。次いで、クロロホルム抽出物７２ｇにヘキサンを加え２０℃で２時間撹拌した後、前記濾紙を用いて残渣（ヘキサン不溶物）を得た。
For fraction A, a column using Sephadex (registered trademark) LH-20 as a separation carrier (column diameter: 3.4 cm, column length: 24 cm, amount of separation carrier: 220 ml, elution solvent: chloroform, 250 ml) And the receptor binding experiment on each of the obtained fractions was carried out to obtain fraction B having an estrogen-like action. Subsequently, for fraction B, high performance liquid chromatography (column diameter: 20 mm, column length: 250 mm, separation carrier: silica gel (ACR type manufactured by Shiseido Co., Ltd.), elution solvent: 0.1 vol% acetic acid added 70 Fractionation using a volume% aqueous methanol solution (detection wavelength: 230 nm) and the receptor binding experiment for each of the obtained fractions were performed to obtain fraction C having an estrogen-like action.
(Test Example 2)
As an extraction step, a chloroform extract was obtained in the same manner as in Test Example 1. Next, hexane was added to 72 g of chloroform extract and stirred at 20 ° C. for 2 hours, and then a residue (hexane insoluble matter) was obtained using the filter paper.
次に、分離工程として、ヘキサン不溶物５ｇを２容量％メタノール含有クロロホルム５０ｍｌに溶解させた後、オクタデシル（ＯＤＳ）カラム(富士シリシア社製、カラム直径：５．０ｃｍ、カラム長さ：２８ｃｍ、分離用担体：粒径１００μｍ、５５０ｍｌ、溶出溶媒：０．１容積％トリフルオロ酢酸添加４０容積％メタノール水溶液、３０００ｍｌ)を用いた分画、及び得られた各画分についての前記受容体結合実験を行い、エストロゲン様作用を有する画分Ｄを得た。
＜成分の同定＞
試験例１の画分Ｃ、及び試験例２の画分Ｄ中の成分を核磁気共鳴測定装置（ＮＭＲ、バリアン社製、３００ＭＨｚ）によって解析した。この結果、データは示さないが、画分Ｃはトランス−２−デセン酸のみを含有し、画分Ｄは１０−ヒドロキシ−２−デセン酸のみを含有していることを確認した。
＜ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７細胞を用いたエストロゲン様作用に関する試験＞
試験例１の画分Ｃ及び試験例２の画分Ｄをそれぞれ溶媒留去したもの並びに１０−ヒドロキシデカン酸標品について、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７細胞を用いたエストロゲン様作用に関する試験を行った。ＭＣＦ−７細胞はエストロゲンに対して感受性を示し、エストロゲン濃度に依存して増殖する。本試験においては、ＭＣＦ−７細胞は東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターより供給を受けたＴＫＧ０４７９を用い、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ社製、＃Ｒ８７５８）で３７℃、５容量％二酸化炭素存在下においてＭＣＦ−７細胞の継代培養を行った。
Next, as a separation step, 5 g of hexane-insoluble matter was dissolved in 50 ml of chloroform containing 2% by volume of methanol, and then an octadecyl (ODS) column (manufactured by Fuji Silysia Co., Ltd., column diameter: 5.0 cm, column length: 28 cm, separation) Fraction using carrier for particle size: 100 μm, 550 ml, elution solvent: 40 volume% methanol aqueous solution with 0.1 volume% trifluoroacetic acid, 3000 ml), and the receptor binding experiment for each of the obtained fractions And fraction D having an estrogen-like action was obtained.
<Identification of component>
Components in fraction C of Test Example 1 and fraction D of Test Example 2 were analyzed by a nuclear magnetic resonance measuring apparatus (NMR, manufactured by Varian, 300 MHz). As a result, although data is not shown, it was confirmed that fraction C contained only trans-2-decenoic acid and fraction D contained only 10-hydroxy-2-decenoic acid.
<Test for estrogenic action using human breast cancer cells MCF-7 cells>
Tests on estrogen-like action using human breast cancer cells MCF-7 cells were performed on the fraction C of Test Example 1 and the fraction D of Test Example 2 and the 10-hydroxydecanoic acid sample. . MCF-7 cells are sensitive to estrogen and proliferate depending on estrogen concentration. In this test, MCF-7 cells were prepared by using TKG0479 supplied by Tohoku University Institute of Aging Medicine, RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) (manufactured by Sigma). , # R8758), and MCF-7 cells were subcultured in the presence of 5% carbon dioxide at 37 ° C.
次いで、ＭＣＦ−７細胞を培地から剥離した後に洗浄し、活性炭処理を施したＦＢＳを１０質量％添加した改変型ＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ社製、＃Ｒ７５０９、フェノールレッドなし）によりＭＣＦ−７細胞を希釈した。そして、９６ウェルプレート（ヌンク社製、＃１６７００８）に、１ウェル当たり希釈後の培地０．１ｍｌ（ＭＣＦ−７細胞：８０００細胞）を添加し３７℃、５容量％二酸化炭素存在下で２４時間培養した。 Next, the MCF-7 cells were removed from the culture medium by detaching them from the medium and washed, and modified RPMI-1640 medium (Sigma, # R7509, no phenol red) supplemented with 10% by mass of activated carbon-treated FBS was added. Was diluted. Then, 0.1 ml of diluted medium (MCF-7 cells: 8000 cells) is added to a 96-well plate (Nunk, # 167008) and added at 37 ° C. in the presence of 5% by volume of carbon dioxide for 24 hours. Cultured.
続いて、試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に混合した後、混合液１μｌを前記２４時間培養後の培地に添加しさらに４８時間培養した。ここで、混合液中の固形分濃度を表１に示す。そして、培地を取除いた後、ＭＣＦ−７細胞に０．１ｍｌのＰＢＳ（１３７ｍＭＮａＣｌ、２．７ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＫＨ2ＰＯ4、８ｍＭＮａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．３）を加えた。続いて、ＭＴＴアッセイキット（Chemicon International, Inc.製、#28835、Colorimetric assay for cell survival and proliferation kit）を用い該キットの取扱説明書に従い反応を行った。次いで、マイクロプレートリーダー（Bio-Tek Instruments, Inc.製、μQuant）を用い６３０ｎｍを対照にとるとともに５７０ｎｍの吸光度を測定してＭＣＦ−７細胞数を求め、ＭＣＦ−７細胞の増殖割合を算出した。 Subsequently, after the sample was mixed with dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 μl of the mixed solution was added to the medium after culturing for 24 hours and further cultured for 48 hours. Here, the solid content concentration in the mixed solution is shown in Table 1. Then, after removing the medium, 0.1 ml of PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH 2 PO 4 , 8 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.3) was added to the MCF-7 cells. Subsequently, the reaction was performed using an MTT assay kit (Chemicon International, Inc., # 28835, Colorimetric assay for cell survival and proliferation kit) according to the instruction manual of the kit. Subsequently, using a microplate reader (Bio-Tek Instruments, Inc., μQuant), 630 nm was taken as a control and the absorbance at 570 nm was measured to determine the number of MCF-7 cells, and the proliferation rate of MCF-7 cells was calculated. .
一方、混合液をＤＭＳＯに変更した以外は前記と同様にして培養及び測定したものを陰性対照群とし、試料を１７βエストラジオール（シグマ社製、＃Ｅ８８７５、終濃度１００ｐｇ／ｍｌ）に変更した以外は前記と同様にして培養及び測定したものを陽性対照群とした。これらの結果を表１に示す。尚、表１において、各試料のＭＣＦ−７細胞の増殖割合を、ＭＣＦ−７細胞の増殖率（陰性対照群の増殖割合を１００としたときにおける各試料の増殖割合の相対値）として示した。さらに、陰性対照群に対するｔ−検定を行い危険率５％未満を有意差ありとし、＊は危険率５％未満、＊＊は危険率１％未満をそれぞれ示す。試験は各固形分濃度について６回行い、それらの平均値を表１に示す。また、生細胞数を顕微鏡により数えた値及び前記マイクロプレートリーダーで測定した値は比例関係にあることを予備的試験において確認した。 On the other hand, except that the mixed solution was changed to DMSO and cultured and measured in the same manner as described above as a negative control group, the sample was changed to 17β estradiol (Sigma, # E8875, final concentration 100 pg / ml). Those cultured and measured as described above were used as a positive control group. These results are shown in Table 1. In Table 1, the growth rate of MCF-7 cells of each sample is shown as the growth rate of MCF-7 cells (relative value of the growth rate of each sample when the growth rate of the negative control group is 100). . Further, a t-test with respect to the negative control group was conducted, and a risk rate of less than 5% was considered significant, * represents a risk rate of less than 5%, and ** represents a risk rate of less than 1%. The test was performed 6 times for each solid content concentration, and the average value is shown in Table 1. Further, it was confirmed in a preliminary test that the value obtained by counting the number of living cells with a microscope and the value measured with the microplate reader were in a proportional relationship.
＜未性成熟動物を用いたエストロゲン様作用に関する試験＞
試験例１の画分Ｃ及び試験例２の画分Ｄをそれぞれ溶媒留去したもの並びに１０−ヒドロキシデカン酸標品について、Sprague Dawleyラット（日本エスエルシー株式会社より購入、雌、１３日齢、ＳＰＦ動物）を用いたエストロゲン様作用に関する試験を行った。これは、エストロゲン様作用剤が、性成熟していない動物の子宮重量を増加させることに基づくものである。
<Test on estrogen-like effects in immature animals>
About the fraction C of Test Example 1 and the fraction D of Test Example 2 and the 10-hydroxydecanoic acid sample, the Sprague Dawley rat (purchased from Japan SLC Co., Ltd., female, 13 days old, A test for estrogenic action using SPF animals) was conducted. This is based on estrogen-like agents increasing uterine weight in non-sexually mature animals.
具体的には、カゼイン、卵白タンパク質、異性化糖を主体としエストロゲン様作用剤を含有しない餌（オリエンタル酵母（株）製）を食餌としてラットを１週間予備飼育した。また、試料を生理食塩水で調製した０．５質量％カルボキシメチルセルロースに懸濁して試料分散液を調製した。そして、予備飼育後のラットに、試料分散液を２０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で５日間皮下投与した。一方、前記試料分散液を生理食塩水で調製した０．５質量％カルボキシメチルセルロースに変更した以外は前記と同様にしてラットに皮下投与したものを陰性対照群とし、１７α−エチニルエストラジオール（シグマ社製、投与量：５μｇ／ｋｇ／日）に変更した以外は前記と同様にしてラットに投与したものを陽性対照群とした。 Specifically, rats were preliminarily raised for 1 week using diet (produced by Oriental Yeast Co., Ltd.) containing mainly casein, egg white protein, and isomerized sugar and not containing an estrogen-like agent. In addition, a sample dispersion was prepared by suspending the sample in 0.5% by mass carboxymethylcellulose prepared with physiological saline. Then, the sample dispersion was subcutaneously administered to the rats after preliminary breeding at a dose of 20 mg / kg / day for 5 days. On the other hand, 17α-ethynylestradiol (manufactured by Sigma) was used as a negative control group when subcutaneously administered to rats in the same manner as described above except that the sample dispersion was changed to 0.5% by mass carboxymethylcellulose prepared with physiological saline. , Except that the dose was changed to 5 μg / kg / day), those administered to rats in the same manner as described above were used as a positive control group.
皮下投与終了後にラットから子宮を摘出し、子宮重量を測定した。試験は１群５匹で行い、これら子宮重量の平均値及び標準偏差を求めた。この結果を表２に示す。尚、表２において、陰性対照群に対するｔ−検定を行い危険率５％未満を有意差ありとし、＊は危険率５％未満、＊＊は危険率１％未満をそれぞれ示す。 After completion of subcutaneous administration, the uterus was removed from the rat and the uterine weight was measured. The test was conducted with 5 animals per group, and the average value and standard deviation of these uterine weights were determined. The results are shown in Table 2. In Table 2, the negative control group was subjected to a t-test, and a risk rate of less than 5% was considered significant, * indicates a risk rate of less than 5%, and ** indicates a risk rate of less than 1%.
（試験例３）
試験例１の画分Ｃを溶媒留去したもの０．０５ｇ、乳糖５．０ｇ及びステアリン酸マグネシウム４．９９５ｇの混合物をハードカプセルに充填することにより、エストロゲン様作用剤を含有するカプセル状の骨粗しょう症予防剤（１錠中の混合物の含有量：５００ｍｇ）を得た。
＜骨密度改善に関する試験＞
試験例３の骨粗しょう症予防剤について、骨粗しょう症改善に関する試験を行った。具体的には、６０〜７０才の閉経女性３例に、試験例３の骨粗しょう症予防剤を毎日３食後に１錠ずつ４週間それぞれ服用させた。そして、各例の服用前及び服用後の腰椎の骨密度をＸ線骨密度測定装置（ＱＤＲ４５００Ａ、東洋メティック（株）製）を用いて測定した。この結果、３例ともに骨粗しょう症予防剤の服用によって腰椎の骨密度が増加し、骨密度の増加率の平均は１１％であった。さらに、自覚症状、臨床症状、尿検査値、血液検査値、血液生化学検査値、体温、呼吸、心拍及び血圧等に異常は認められず、血液凝固系の亢進及び性器出血等の異常も認められなかった。このため、試験例３の骨粗しょう症予防剤は、骨密度の低下を防止して骨粗しょう症の発症を予防することができた。
（試験例４）
試験例１の画分Ｃを溶媒留去したもの０．０１ｇ、異性化糖３ｇ、食用セルロース１．９９８ｇ、アスコルビン酸０．０１ｇ及び食用香料０．１ｇの比率で混合した後に打錠し、質量が０．３ｇの三角形錠剤状の食品製剤を得た。
＜更年期障害改善に関する試験＞
試験例４の食品製剤について、更年期障害改善に関する試験を行った。具体的には、５０〜６０才の女性（更年期障害の自覚症状あり）３例に、試験例４の食品製剤を１日６錠、７日間摂食させた。そして、各例の摂食前及び摂食後の精神状態を聴取した。この結果、３例ともに、摂食後は摂食前に比べてイライラ感、のぼせ感、脱力感等の不定愁訴が減少した。さらに、摂食による苦情はなく、尿検査値、血液検査値及び血液生化学的検査値に異常は認められなかった。このため、試験例４の食品製剤は、更年期障害の自覚症状を低減して更年期障害を改善することができた。
(Test Example 3)
Capsule-shaped bone coarse powder containing an estrogen-like agent by filling a hard capsule with a mixture of 0.05 g obtained by evaporating the fraction C of Test Example 1, 5.0 g lactose and 4.995 g magnesium stearate Disease prevention agent (content of mixture in one tablet: 500 mg) was obtained.
<Test for bone density improvement>
For the osteoporosis preventive agent of Test Example 3, a test for osteoporosis improvement was performed. Specifically, three menopausal women aged 60 to 70 were given the osteoporosis preventive agent of Test Example 3 after taking three meals daily, one tablet for 4 weeks. And the bone density of the lumbar vertebra before and after taking each case was measured using an X-ray bone density measuring device (QDR4500A, manufactured by Toyo Metic Co., Ltd.). As a result, the bone density of the lumbar vertebrae increased by taking the osteoporosis preventive agent in all three cases, and the average increase rate of the bone density was 11%. In addition, no abnormalities were observed in subjective symptoms, clinical symptoms, urinalysis values, blood test values, blood biochemical test values, body temperature, breathing, heart rate, blood pressure, etc., and abnormalities such as increased blood coagulation system and genital bleeding were also observed I couldn't. For this reason, the osteoporosis preventive agent of Test Example 3 was able to prevent the onset of osteoporosis by preventing a decrease in bone density.
(Test Example 4)
Fraction C of test example 1 was distilled off at a ratio of 0.01 g, isomerized sugar 3 g, edible cellulose 1.998 g, ascorbic acid 0.01 g, and edible flavoring 0.1 g. 0.3 g of a triangular tablet-shaped food preparation was obtained.
<Examination on improvement of menopause>
The food preparation of Test Example 4 was tested for improving menopause. Specifically, 3 females aged 50 to 60 years (with subjective symptoms of menopause) were fed the food preparation of Test Example 4 6 tablets a day for 7 days. And the mental state before and after eating of each case was heard. As a result, in all three cases, indefinite complaints such as irritability, hotness and weakness were reduced after eating compared to before eating. Furthermore, there were no complaints due to eating, and no abnormalities were observed in urine test values, blood test values, and blood biochemical test values. For this reason, the food preparation of Test Example 4 was able to reduce the subjective symptoms of menopause and improve menopause.
なお、本実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
・ エストロゲン様作用剤を、炭素数が１０の直鎖飽和脂肪酸若しくは直鎖不飽和脂肪酸又はその塩から構成してもよい。直鎖飽和脂肪酸若しくは直鎖不飽和脂肪酸の塩としては、前記金属塩や有機アミン塩が挙げられる。
In addition, this embodiment can also be changed and embodied as follows.
-An estrogen-like agent may be comprised from a C10 linear saturated fatty acid or a linear unsaturated fatty acid, or its salt. Examples of the salt of the linear saturated fatty acid or the linear unsaturated fatty acid include the metal salts and organic amine salts.
・ エストロゲン様作用剤を乳癌等のエストロゲン欠乏に起因する疾患の治療や予防に用いてもよい。このように構成した場合は、エストロゲン様作用剤は優れたエストロゲン様作用を発揮することにより、乳癌等を治療したり発症を予防したりすることができる。 -Estrogen-like agents may be used for the treatment or prevention of diseases caused by estrogen deficiency such as breast cancer. When constituted in this way, the estrogen-like agent can treat breast cancer or prevent its onset by exhibiting an excellent estrogen-like action.
・ エストロゲン様作用剤と、自律神経調節剤等の更年期障害治療剤やビタミンＤ製剤等とを組み合わせて医薬品又は医薬部外品を製造してもよい。また、エストロゲン様作用剤と、ゲニステイン、ダイズイン等のイソフラボン類、花粉、オリーブオイル、胎盤エキス等とを組み合わせて用いてもよい。 -A drug or quasi-drug may be produced by combining an estrogen-like agent with an agent for treating climacteric disorders such as an autonomic nervous regulator or a vitamin D preparation. Further, an estrogen-like agent may be used in combination with isoflavones such as genistein and soybean in, pollen, olive oil, placenta extract and the like.
・ エストロゲン様作用剤を、動物素材又は植物素材からの抽出ではなく化学合成によって得てもよい。 • Estrogenic agents may be obtained by chemical synthesis rather than extraction from animal or plant materials.
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