JP2006025635A - Method, instrument or apparatus for disposing cells in porous support - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は細胞を３次元的に培養するために多孔質体、例えば多孔質の支持体に効率よく細胞を内在化させる方法、器具または装置に関する。 The present invention relates to a method, device or apparatus for efficiently internalizing cells in a porous body, for example, a porous support, in order to culture cells three-dimensionally.
細胞を３次元的に培養するためには細胞の足場となる３次元の構造物、所謂多孔質体に細胞を内在化させて保持する必要がある。従来この多孔質体に細胞を内在化させるための方法として、注射針等を用いて多孔質体内に注入する、あるいは細胞懸濁液中に多孔質体を浸す等の方法が一般的に用いられている。 In order to culture cells three-dimensionally, it is necessary to internalize and hold the cells in a three-dimensional structure serving as a scaffold for the cells, a so-called porous body. Conventionally, as a method for internalizing cells in this porous body, methods such as injection into the porous body using an injection needle or the like, or immersion of the porous body in a cell suspension are generally used. ing.
ＷＯ２００４／０３５１０１は、細胞を保持させるための支持体を開示する。しかし、多孔質体内に細胞を播種、すなわち内在化させることは開示されていない。特開２００４−１６７２３６は、気管片を、非イオン性界面活性剤で処理した物に、細胞を播種する方法を開示する。しかし、液体の一部を除去する工程は、開示されていない。特開平１１−０５６３４３は、リアクター内の培養基材に細胞を播種する方法を開示する。しかし、液体を多孔質体内に部分的に含ませることは開示されていない。
しかし、前述の方法では、細胞を多孔質体内に均等に内在化させることは難しい。特に多孔質体の材料が疎水性であったり、空隙が小さい場合は細胞懸濁液を多孔質体内部に浸透させることすら困難である。 However, with the method described above, it is difficult to uniformly internalize cells in the porous body. In particular, when the material of the porous body is hydrophobic or the voids are small, it is difficult to even penetrate the cell suspension into the porous body.
本発明者らは上記課題を解決すべく種々検討した結果、予測できないことに、液体を予め、多孔質体内に浸透させることによって、多孔質体への細胞の内在化が促進できることを見出した。 As a result of various studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that the internalization of cells into the porous body can be promoted by impregnating the liquid into the porous body in advance.
以下、本発明を詳細に説明する。本発明が提供するのは以下の通りである：
[１]
（ａ）液体を多孔質体内に浸透させることを含む、多孔質体内への細胞の内在化を促進する方法。
[２]
さらに、（ｂ）該多孔質体内部に浸透した液体の一部を除去することを含む、[１]記載の方法。
[３]
（ａ）が、多孔質体と液体を含む系を提供すること、及び該系の圧力を、１又は２以上の回数変化させることを含む、[１]または[２]記載の方法。
[４]
該液体の一部の除去が、毛細管現象により達成される[２]記載の方法。
[５]
該液体の一部の除去が、遠心力により達成される、[２]記載の方法。
[６]
容器およびピストンを含む、液体を多孔質体内に浸透させる器具であって、該ピストンが、該容器の内部表面についてしゅう動可能であり、当該内部表面とのしゅう動可能性シールを定義し、かつ当該容器の内部に位置するピストンを含む、器具。
[７]
液体が該容器と流通可能に、該容器に接続された第二の容器をさらに含む、[６]記載の器具。
[８]
多孔質体内部に液体を含む、細胞を多孔質体内に内在化させるための、多孔質体。
Hereinafter, the present invention will be described in detail. The present invention provides the following:
[1]
(A) A method for promoting the internalization of cells into a porous body, which comprises allowing a liquid to penetrate into the porous body.
[2]
The method according to [1], further comprising (b) removing a part of the liquid that has permeated into the porous body.
[3]
The method according to [1] or [2], wherein (a) comprises providing a system comprising a porous body and a liquid, and changing the pressure of the system one or more times.
[4]
The method according to [2], wherein the removal of a part of the liquid is achieved by capillary action.
[5]
The method according to [2], wherein the removal of a part of the liquid is achieved by centrifugal force.
[6]
An instrument for infiltrating a liquid into a porous body, including a container and a piston, wherein the piston is slidable with respect to an inner surface of the container and defines a slidable seal with the inner surface; and An instrument comprising a piston located inside the container.
[7]
The instrument according to [6], further including a second container connected to the container so that the liquid can flow through the container.
[8]
A porous body for internalizing cells in a porous body containing a liquid inside the porous body.
本発明による方法、器具または装置を用いることにより多孔質体に効率よく細胞を内在化させ、保持することができる。その結果、細胞を３次元的な培養及び組織の形成が簡便かつ安定に行えるようになる。 By using the method, instrument or device according to the present invention, cells can be efficiently internalized and retained in the porous body. As a result, three-dimensional culture and tissue formation of cells can be performed easily and stably.
本発明において多孔質体とは、内部に連通する多数の微細な孔または空隙を有する成形物を意味する。例えば、多孔質体は、細胞を内部に内在化すると同時に血清成分や栄養因子、また老廃物等の循環が円滑に行われるような構造を持つ、細胞培養のための支持体であってもよい。 In the present invention, the porous body means a molded product having a large number of fine pores or voids communicating with the inside. For example, the porous body may be a support for cell culture having a structure in which cells are internalized and at the same time the circulation of serum components, nutrient factors, wastes, etc. is performed smoothly. .
多孔質体の形状は、三次元であれば限定されないが、球状、粒状、平膜状、繊維状、中空糸状、直方体、立方体、平板状等いずれも有効に用いられる。多孔質体が球状または粒状であるばあい、平均粒径は約５μｍから１０００μｍであることが好ましく、より好ましくは約２０〜８００μｍ、最も好ましくは約３０〜６００μｍである。形状は、厚み方向に縦長な形状の孔が面方向に並列的に配置された概平板状形状を有し、一方の面が開孔処理されているものである、前記多孔質体を含む。概平板状形状とは、完全な平板形状はもちろんのこと、平板形状に近い形状であるものをすべて含む。 The shape of the porous body is not limited as long as it is three-dimensional, but any shape such as a spherical shape, a granular shape, a flat membrane shape, a fiber shape, a hollow fiber shape, a rectangular parallelepiped shape, a cube shape, and a flat plate shape can be used effectively. When the porous body is spherical or granular, the average particle size is preferably about 5 μm to 1000 μm, more preferably about 20 to 800 μm, and most preferably about 30 to 600 μm. The shape includes the porous body having a substantially flat plate shape in which holes having a vertically long shape in the thickness direction are arranged in parallel in the surface direction, and one surface is subjected to a hole opening treatment. The substantially flat plate shape includes not only a complete flat plate shape but also all shapes that are close to a flat plate shape.
多孔質体は、限定されないが、例えばガラスビーズ、シリカゲルなどの無機多孔質体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストリンなどの多糖類からなる有機多孔質体、セルロース、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラスさらにはこれらの組み合わせによって得られうる有機−有機、有機−無機などの複合多孔質体などが代表例としてあげられる。 The porous body is not limited, but for example, an inorganic porous body such as glass beads and silica gel, a synthetic polymer such as crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked polyacrylate, crosslinked polyacrylamide, and crosslinked polystyrene, crystalline cellulose, crosslinked cellulose, and crosslinked agarose. , Organic porous materials composed of polysaccharides such as cross-linked dextrin, cellulose, polyvinyl alcohol, saponified ethylene-vinyl acetate copolymer, polyacrylamide, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polymethyl methacrylate, polyacrylic acid grafting Typical examples include polyethylene, polyacrylamide-grafted polyethylene, glass, and organic-organic, organic-inorganic composite porous bodies that can be obtained by a combination thereof.
無機多孔質体について、活性炭、及びガラスビーズなどが挙げられるが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。その他の多孔質体の材料は、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン１１、ポリエチレン、ポリ（塩化ビニリデン）、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−ジビニルベンゼン、ポリ（トリフルオロエチレン）、ポリ（クロロトリフィルオロエチレン）、ポリ（テレフタル酸エチレン）、ポリプロピレン、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリアクリル酸エステル、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリメタクリル酸エステル、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアミドなどの合成高分子化合物、またはヒドロキシアパタイト、βＴＣＰ（β-三リン酸カルシウム）などのセラミック化合物からなる群より選択されるがこれらに限定されない。
Examples of the inorganic porous material include activated carbon and glass beads, but the present invention is not limited to these. Other porous materials are
多孔質体は好ましくは、生体適合性材料を含む。好ましくは、この多孔質体の材料はコラーゲンやキチン、キトサン等の生体由来物質、αまたはβ−ヒドロキシカルボン酸の加水分解性ポリマー、例えばＰＧＡ（ポリグリコール酸重合体）、ＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸共重合体）、ＰＬＬＡ（ポリＬ−乳酸重合体）等の人工物、あるいはそれらのうち２種以上の物質の複合体等前述の構造を実現できる材料であれば特に限定されることはない。 The porous body preferably comprises a biocompatible material. Preferably, the porous material is a biological material such as collagen, chitin, or chitosan, a hydrolyzable polymer of α or β-hydroxycarboxylic acid, such as PGA (polyglycolic acid polymer), PLGA (polylactic acid-glycol). The material is not particularly limited as long as it is a material that can realize the above-described structure, such as an artificial material such as an acid copolymer) or PLLA (poly L-lactic acid polymer), or a composite of two or more of them. .
特に好ましくは、グリコール酸と乳酸の共重合体（ＰＬＧＡ）であって、グリコール酸と乳酸の重量比が、約９９：１−１：９９、特に約７５：２５−２５：７５であるである。なお好ましくは、多孔質体は、孔径約１０μｍ以上５００μｍ以下、孔長約２０μｍ以上１ｃｍ以下の縦長形状の孔が並列的に配置され、並置された各孔間は、孔径約１０μｍ以下の小孔で連通した構造を有する、三次元多孔質体を含む。 Particularly preferred is a copolymer of glycolic acid and lactic acid (PLGA), wherein the weight ratio of glycolic acid to lactic acid is about 99: 1-1: 99, especially about 75: 25-25: 75. . Preferably, in the porous body, vertically long holes having a hole diameter of about 10 μm to 500 μm and a hole length of about 20 μm to 1 cm are arranged in parallel, and between the juxtaposed holes, small holes having a hole diameter of about 10 μm or less A three-dimensional porous body having a structure communicated with each other is included.
孔径約１０μｍ以下の小孔で連通した構造とは、上記縦長形状の孔の全個数の約５０％以上、好ましくは約７０％以上が、孔径約１０μｍ以下である小孔で互いに連結された構造を意味する。またこの多孔質体を作製する方法に関しても前述の構造を実現できるものであれば特に限定されることはない。さらに、この多孔質体の構造も前述の特徴を実現できるものであれば、スポンジ状のものであっても不織布であっても、あるいはそれ以外のものであってもよく、特に限定されるものではない。前記多孔質体は、例えばＷＯ２００４／０３５１０１号公報に見出されるような公知の方法で製造できる。簡単には、多孔質体材料を有機溶媒に溶解し、調製した溶液を型枠に流し込んだ後、約３℃／分以上の冷却速度で凍結し、凍結した溶液を真空乾燥して、有機溶媒を除去する、ことによって製造する。 A structure in which small holes having a hole diameter of about 10 μm or less are connected to each other is a structure in which about 50% or more, preferably about 70% or more of the total number of the vertically long holes are connected to each other through small holes having a hole diameter of about 10 μm or less. Means. Further, the method for producing the porous body is not particularly limited as long as the above-described structure can be realized. Furthermore, as long as the structure of the porous body can realize the above-described characteristics, it may be sponge-like, non-woven fabric, or other, and is particularly limited. is not. The porous body can be produced by a known method as found in, for example, WO 2004/035101. Briefly, after dissolving the porous material in an organic solvent, pouring the prepared solution into a mold, it is frozen at a cooling rate of about 3 ° C./min or more, and the frozen solution is vacuum-dried. It is manufactured by removing.
本発明はまた、多孔質の多孔質体の内部に液体を浸透させて多孔質体の内部構造の表面をあらかじめ濡らすことにより、効率よく細胞懸濁液を多孔質体内部に注入し、細胞の多孔質体への内在化を促進させる方法、及びその方法を実現する器具または装置を提供する。 The present invention also efficiently injects a cell suspension into the porous body by infiltrating the liquid into the porous body to pre-wet the surface of the internal structure of the porous body. Provided are a method for promoting internalization into a porous body, and a device or apparatus for realizing the method.
本発明はまた、液体を多孔質体内に浸透させた後に、該液体の一部を除去し、液体を多孔質体内に部分的に含ませることを含む方法に関する。この場合の液体としては、限定されないが、水、油、好適な溶媒、例えば、ジメチルフォルムアミド、アセトン、ジメチルスルフォキシド、Ｎ−メチル−２−ピロリドンまたはアルコール性溶媒、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールまたはｔｅｒｔ−ブタノール、またはエーテル溶媒、例えば、テトラヒドロフランまたは１，４−ジオキサン（約０．５ないし１５容量％、好ましくは約２容量％）またはエステル溶媒、例えば、酢酸エチルまたは炭化水素溶媒、例えば、オクタンまたはシクロヘキサンまたはトルエンまたはキシレン、の単独または混合物として使用しうる。 The present invention also relates to a method comprising removing a portion of the liquid after allowing the liquid to penetrate into the porous body and partially including the liquid within the porous body. Liquids in this case include, but are not limited to, water, oil, suitable solvents such as dimethylformamide, acetone, dimethyl sulfoxide, N-methyl-2-pyrrolidone or alcoholic solvents such as methanol, ethanol, Isopropanol or tert-butanol, or ether solvents such as tetrahydrofuran or 1,4-dioxane (about 0.5 to 15% by volume, preferably about 2% by volume) or ester solvents such as ethyl acetate or hydrocarbon solvents such as , Octane or cyclohexane or toluene or xylene, alone or as a mixture.
好ましくは、液体はＰＢＳ等の緩衝液や生理食塩水、あるいは血清を含む培地や無血清培地等があるが、特に限定されるものではない。好ましい培地としては、ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、Ｅａｒｌｅ’ｓ １９９培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地等の一般的な動物細胞用培地だけでなく、ハイブリドーマやＥＳ細胞を含む幹細胞、リンパ球を含む血球系細胞、その他の各種組織の初代培養用に調製された培地、さらにはＧｒａｃｅ’ｓ 培地、ＴＣ−１００培地などの昆虫細胞用培地、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地、Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ培地などの植物細胞用培地などが挙げられる。 Preferably, the liquid includes a buffer solution such as PBS, physiological saline, a serum-containing medium, a serum-free medium, and the like, but is not particularly limited. Preferred media include MEM medium, αMEM medium, DMEM medium, IMEM medium, Earle's 199 medium, Ham's F-12 medium, Ham's F-10 medium, RPMI1640 medium, McCoy's 5A medium, etc. In addition to typical animal cell culture media, stem cells containing hybridomas and ES cells, blood cells containing lymphocytes, media prepared for primary culture of various other tissues, Grace's media, TC-100 Insect cell culture media such as culture media, plant cell culture media such as Murashige-Skoog media, Linsmaier-Skoog media, and the like.
さらに好ましくは、任意の濃度の血清を含有するαＭＥＭ培地またはＤＭＥＭ培地を使用する。ただし、多孔質体の材料が疎水性の高い物質である場合、この液体に血清等の界面活性作用を有する物質が含まれていることがさらに望ましい。界面活性剤は、イオン性、非イオン性及び両性イオン性界面活性剤、また、界面活性剤の混合物を含み、細胞の適切な増殖と生存に与える影響が小さいものと理解されるべきである。 More preferably, αMEM medium or DMEM medium containing any concentration of serum is used. However, when the material of the porous body is a highly hydrophobic substance, it is more desirable that this liquid contains a substance having a surface active action such as serum. Surfactants should be understood to include ionic, non-ionic and zwitterionic surfactants, and mixtures of surfactants, with a small impact on the proper growth and survival of cells.
液体を多孔質体内に浸透させるとは、液体を多孔質体内の孔隙中に含ませる、すなわち充填することを意味する。細胞を多孔質体に内在化するためには、多孔質体中への液体の充填率が約１％〜１００％、好ましくは約５％〜７５％、さらに好ましくは約１０％〜５０％であることが望ましい。液体の充填率は、多孔質体の全空隙が液体に満たされている状態を１００％とし、以下の示した方法により測定した。乾燥状態の多孔質体の重量（ア）、本明細書記載のいずれかの方法により全空隙を液体で満たした状態の多孔質体の重量（イ）及び本特許記載のいずれかの方法により液体を一部を除去した状態の多孔質体の重量（ウ）を電子天秤（ザルトリウス）により測定し、［（ウ）−（ア）／（イ）−（ア）］×１００を液体の充填率とした。 Permeating liquid into the porous body means that the liquid is contained in the pores in the porous body. In order to internalize the cells in the porous body, the filling rate of the liquid in the porous body is about 1% to 100%, preferably about 5% to 75%, more preferably about 10% to 50%. It is desirable to be. The filling rate of the liquid was measured by the following method, assuming that the whole void of the porous body was filled with the liquid as 100%. Weight of porous body in dry state (a), weight of porous body in a state where all voids are filled with liquid by any of the methods described in this specification (b), and liquid by any of the methods described in this patent The weight (c) of the porous body with a part removed is measured by an electronic balance (Sartorius), and [(c)-(a) / (b)-(a)] × 100 is the liquid filling rate. It was.
多孔質体に液体を浸透させる方法は、液体を多孔質体に滴下する、多孔質体を液体中に浸す等の方法のほか、液体と多孔質体を含む系を提供し、系の圧力を変化させる方法を含む。該方法は、圧力を増加させついで低下させ、そしてその逆であることもある。該方法は、多孔質体内部の気体を除去しつつ、液体の浸透を促進しうる。圧力の増加及び低下は１回または必要により何回でも繰り返しうる。簡便には、後述する本発明の器具または装置を使用する。 The method of infiltrating the liquid into the porous body provides a system including the liquid and the porous body in addition to a method of dripping the liquid into the porous body, immersing the porous body in the liquid, etc. Including methods of changing. The method may increase and then decrease the pressure and vice versa. The method can promote the penetration of the liquid while removing the gas inside the porous body. The pressure increase and decrease can be repeated once or as many times as necessary. For convenience, the device or apparatus of the present invention described later is used.
多孔質体内部に液体を浸透させた多孔質体は、無処理の多孔質体よりもはるかに細胞を内部に内在化させやすい。好ましくは、多孔質体内に浸透させた一部の液体を除去することにより、さらに効率よく細胞を多孔質体に内在化させうる。 A porous body in which a liquid has penetrated inside the porous body is much easier to internalize cells inside than an untreated porous body. Preferably, by removing a part of the liquid that has permeated into the porous body, the cells can be more efficiently internalized in the porous body.
多孔質体に内部に浸透させた液体を除去する方法は特に限定されない。上記空隙率を達成することが好ましい。多孔質体を手または器具により加圧する、多孔質体を絞る、など公知の方法を使用できる。好ましくは、毛細管現象を利用する方法、遠心力を利用する方法等が有効である。毛細管現象を利用する方法とは液体を浸透させた多孔質体を濾紙等の上に置き余分の液体を吸い取らせることによるものである。ここで余分の液体を吸い取らせるために用いるものとしては、滅菌ガーゼ等多孔質体に内在化させる細胞に対して悪い影響を及ぼさないものが望ましいが、特に限定されるものではない。 The method for removing the liquid that has permeated the porous body is not particularly limited. It is preferable to achieve the above porosity. A known method such as pressurizing the porous body with a hand or an instrument or squeezing the porous body can be used. Preferably, a method using capillary action, a method using centrifugal force, and the like are effective. The method utilizing the capillary phenomenon is by placing a porous material infiltrated with liquid on a filter paper or the like and sucking off excess liquid. Here, what is used for sucking off excess liquid is preferably one that does not adversely affect the cells to be internalized in the porous body, such as sterilized gauze, but is not particularly limited.
また、遠心力による方法は、液体を浸透させた多孔質体を遠心チューブや培養シャーレ等の適当な容器の中に置き、容器ごと遠心分離機にかけることにより余分の液体を漏出させることができる。この場合、多孔質体から漏出した液体が多孔質体の周囲あるいは容器から排除される構造になっていることが望ましいが、特に限定されるものではない。本発明は液体を多孔質体内に含む多孔質体およびその製造方法を含む。好ましくは、この多孔質体中の液体は、一部除去されている。 In addition, the method using centrifugal force can place a porous material infiltrated with a liquid in a suitable container such as a centrifuge tube or a culture dish, and the excess liquid can be leaked by applying the whole container to a centrifuge. . In this case, it is desirable that the liquid leaking from the porous body is excluded from the surroundings of the porous body or the container, but there is no particular limitation. The present invention includes a porous body containing a liquid in the porous body and a method for producing the same. Preferably, the liquid in the porous body is partially removed.
本発明は多孔質体に細胞を注入し、多孔質体に細胞を内在化させることによって完結する。多孔質体内に細胞を注入するためには細胞を培地等の液体に懸濁したものを注入することが一般的である。本発明による方法を遂行するための細胞懸濁液の細胞濃度は特に限定されないが、望ましくは約１／ｍＬ〜１×１０10／ｍＬ、さらに望ましくは約１×１０3〜１×１０9／ｍＬ、またさらに望ましくは約１×１０5〜１×１０8／ｍＬである。 The present invention is completed by injecting cells into the porous body and internalizing the cells into the porous body. In general, in order to inject cells into the porous body, cells suspended in a liquid such as a medium are injected. The cell concentration of the cell suspension for carrying out the method according to the present invention is not particularly limited, but is preferably about 1 / mL to 1 × 10 10 / mL, more preferably about 1 × 10 3 to 1 × 10 9 / mL. mL, and more desirably about 1 × 10 5 to 1 × 10 8 / mL.
余分な液体を除去した多孔質体の表面に細胞懸濁液を滴下すると細胞は多孔質体内部に均等に浸透していき、細胞の、多孔質体内への内在化を促進することができる。「細胞の、多孔質体内への内在化を促進する」なる表現は、多孔質体内に、播種された細胞が、十分とどまる状態が達成されることを意味する。本方法によれば、細胞の数において、播種した細胞の少なくとも約９５％以上、好ましくは約９８％以上、より好ましくは、約９９．５％以上、そしてもっとも好ましくは約９９．９％以上が、多孔質体内にとどまることもできる。もっとも、該パーセンテージは、細胞の種類、多孔質体の形状、大きさ、材料、孔隙率、液体の種類などに依存して変化することもある。本明細書では、「細胞の、多孔質体内への内在化を促進する」は、細胞を多孔質体内に播種した後に、該多孔質体から細胞が漏出するのを防止または低減化する事を意味する場合もある。 When the cell suspension is dropped on the surface of the porous body from which the excess liquid has been removed, the cells uniformly penetrate into the porous body, and the internalization of the cells into the porous body can be promoted. The expression “promoting internalization of cells into the porous body” means that a state in which the seeded cells are sufficiently retained in the porous body is achieved. According to this method, at least about 95% or more of the seeded cells, preferably about 98% or more, more preferably about 99.5% or more, and most preferably about 99.9% or more in the number of cells. It can also stay in the porous body. However, the percentage may vary depending on the cell type, the shape, size, material, porosity, liquid type, etc. of the porous body. In the present specification, “promoting the internalization of cells into the porous body” means preventing or reducing leakage of cells from the porous body after seeding the cells into the porous body. Sometimes it means.
本発明者らは、多孔質体と液体が置かれている空間の圧力を変化させることにより効率よく多孔質体内に液体を浸透させることができることを見出し、本発明は、それを簡便に実現できる装置または器具を提供する。 The present inventors have found that the liquid can be efficiently infiltrated into the porous body by changing the pressure in the space where the porous body and the liquid are placed, and the present invention can easily realize this. A device or instrument is provided.
本発明による多孔質体に液体を浸透させる器具または装置は、上記細胞を多孔質体内に内在化させることを促進する方法において、多孔質体内に液体を浸透させるために使用できる。具体的には、多孔質体と液体を含む系を提供すること、及び該系の圧力を、１又は２以上の回数変化させることに使用できる。 A device or apparatus for infiltrating a liquid into the porous body according to the present invention can be used to infiltrate the liquid into the porous body in a method for promoting the internalization of the cells into the porous body. Specifically, it can be used to provide a system containing a porous body and a liquid, and to change the pressure of the system one or more times.
本器具または装置は、容器内に多孔質体及び液体を共存させ、ピストンにより閉鎖し、ピルトンを該容器についてしゅう動することによって、系、例えば容器内の圧力を変化させることができることを特徴とするものである。圧力の変化のさせ方は特に限定されるものではないが、最初に容器内を陽圧にすることにより多孔質体内に液体を浸透させた後、容器内を陰圧にして多孔質体内に残存する気体を脱気することが望ましい。またはその逆の作業順序を使用しうる。さらにこの操作を１回または２、３、４、５またはそれ以上の回数繰り返すことがより望ましい。 This instrument or apparatus is characterized in that the pressure in a system, for example, a container, can be changed by allowing a porous body and a liquid to coexist in a container, closing with a piston, and sliding a Pilton with respect to the container. To do. The method of changing the pressure is not particularly limited, but first, the liquid is infiltrated into the porous body by making the inside of the container positive, and then the inside of the container is made negative and remains in the porous body. It is desirable to degas the gas. Or the reverse order of work may be used. It is more desirable to repeat this operation once or 2, 3, 4, 5 or more times.
好ましくは、該容器内に、多孔質体及び液体を共存させ、ピストンによって閉鎖させ、当該ピストンが動作することによって、密閉系内の圧力を変化させ、そして該支持体への液体の浸透を促進する。 Preferably, the porous body and liquid coexist in the container, closed by a piston, and the piston operates to change the pressure in the closed system and promote the penetration of the liquid into the support. To do.
あるいは、該容器内に多孔質体として、ビーズ内の気体を該液体と置換するために使用する。具体的には、多孔質ビーズと液体を共存させ、ピストンによって閉鎖させ、当該ピストンを動作させ、密閉された系内の圧力を変化させ、そして該ビーズ内の、液体の気体との置換を促進する。慣行的には、ビーズ内の空気を、液体と置換するために、ビーズをエタノール等の両親媒性溶媒に浸せきし、ついで両親媒性溶媒の一部を水等と一部置換した液体に、該ビーズを浸せきし、当該操作を反復することにより、ビーズ内への、気体の、液体との置換を達成する。該操作は、本装置または器具を使用して、容易に達成できる。 Alternatively, it is used as a porous body in the container to replace the gas in the beads with the liquid. Specifically, porous beads and liquid coexist, closed by a piston, the piston is operated, the pressure in the sealed system is changed, and the substitution of liquid gas in the bead is promoted To do. Conventionally, in order to replace the air in the beads with a liquid, the beads are immersed in an amphiphilic solvent such as ethanol, and then a liquid in which a part of the amphiphilic solvent is partially replaced with water or the like, By immersing the beads and repeating the operation, the replacement of the gas with the liquid into the beads is achieved. The operation can be easily accomplished using the present apparatus or instrument.
１実施態様では、本発明のために、多孔質体に液体を浸透させる器具または装置の例示的な構成を図１に示す。該装置は、所望により液体（８）および多孔質体（１）を解放または密封するための開閉可能な孔（５）を底部に有する、液体（８）および多孔質体（１）を封入するための容器（２）；当該容器の内部表面についてしゅう動可能であり、当該内部表面とのしゅう動可能性シールを定義し、かつ当該容器の内部に位置するピストン（３）；当該ピストン、及び当該容器を、ピストンが動作可能に保持する架台（７）；所望により当該ピストンを動作させるための駆動部（４）；及び所望により当該容器底部から流出する液体を受容する他の容器（６）；を含む。 In one embodiment, for the purposes of the present invention, an exemplary configuration of an instrument or device for infiltrating liquid into a porous body is shown in FIG. The device encloses the liquid (8) and the porous body (1), optionally having openable and closable holes (5) at the bottom for releasing or sealing the liquid (8) and the porous body (1). A container (2) for; a piston (3) that is slidable with respect to an inner surface of the container and defines a slidable seal with the inner surface and is located within the container; A pedestal (7) for holding the container operatively by the piston; a drive part (4) for operating the piston if desired; and another container (6) for receiving liquid flowing out from the bottom of the container if desired ;including.
装置または器具は、圧力を発生させる部分と閉鎖された容器（多孔質体及び液体が存在する部分）が一体になっているものでも閉鎖それらが分離されているものでも多孔質体の内部に液体を浸透させることができるものであれば構造は特に限定されない。該容器（２）の内部表面と、ピストン（３）の表面は、しゅう動可能であるために、十分に平滑に構成されている。内部の液体（８）がもれないために、両者の間は十分な密着が好ましく、より好ましくはもれのないように、すなわちシールを定義するように構成すべきである。具体的には弾性体、例えばゴムをピストン表面のしゅう動部分に被覆してもよい。 The device or instrument can be either a unit that generates a pressure and a closed container (portion where the porous body and liquid exist) or a closed container that separates the liquid inside the porous body. The structure is not particularly limited as long as it can be penetrated. The inner surface of the container (2) and the surface of the piston (3) are configured to be sufficiently smooth because they can slide. Since there is no leakage of the internal liquid (8), there should be sufficient adhesion between the two, and more preferably there should be no leakage, that is, a seal should be defined. Specifically, an elastic body such as rubber may be coated on the sliding portion of the piston surface.
本実施態様では、該装置を例えば以下のように使用する：多孔質体（１）および液体（８）を予め、容器（２）に入れ、そしてピストン（３）を該容器に挿入し、それらを封入する。ピストン（３）を例えば上下に操作し、液体（８）および多孔質体（１）を含む系に加圧または減圧する。所望により該操作を繰り返す。該操作は駆動部（４）により実施してもよいし、人手により実施してもよい。多孔質体（１）内への液体の十分な浸透が達成されたならば、ピストン（３）を該容器（２）から取り外し、多孔質体（１）を取り出す。該多孔質体（１）は本発明の、細胞を多孔質体に内在化するのを促進する方法において、細胞を内在化、すなわち播種するために使用できる。液体（８）は開閉可能な孔（５）を通して排出するのが、該装置を架台（７）に固定したまま作業できる点で有利である。該開閉可能な孔（５）は三方活栓を用いて液体の排出と注入、操作中に生じた気泡の除去等を行うことができる。 In this embodiment, the device is used, for example, as follows: porous body (1) and liquid (8) are previously placed in container (2) and piston (3) is inserted into the container, Enclose. The piston (3) is operated up and down, for example, to pressurize or depressurize the system including the liquid (8) and the porous body (1). Repeat the operation as desired. The operation may be performed by the drive unit (4) or may be performed manually. When sufficient penetration of the liquid into the porous body (1) is achieved, the piston (3) is removed from the container (2) and the porous body (1) is removed. The porous body (1) can be used to internalize, ie seed, cells in the method of the invention that promotes the internalization of cells into the porous body. Discharging the liquid (8) through the openable / closable hole (5) is advantageous in that the apparatus can be operated while being fixed to the gantry (7). The openable / closable hole (5) can discharge and inject liquid using a three-way cock, remove bubbles generated during operation, and the like.
１実施態様は、所望により液体（８）および多孔質体（１）を解放または密封するための開閉可能な孔（５）を底部に有する容器、及び容器の内部表面についてしゅう動可能であり、当該内部表面とのしゅう動可能性シールを定義し、かつ当該容器の内部に位置するピストンを含む、器具である。例示的な構成は、図１の波線による枠内に示される。 One embodiment is slidable with respect to a container having an openable / closable hole (5) at the bottom for releasing or sealing the liquid (8) and the porous body (1) as desired, and the inner surface of the container; An instrument that defines a slidable seal with the inner surface and includes a piston located within the container. An exemplary configuration is shown in a dashed line frame in FIG.
この場合、使用方法、用途および特徴は基本的に前記装置と同様であるが、ピストンは人手によって操作するのが好ましい。 In this case, the method of use, application and characteristics are basically the same as those of the apparatus, but the piston is preferably operated manually.
１実施態様では、本発明による多孔質体に液体を浸透させる装置の望ましい構造を図２に示す。 In one embodiment, the preferred structure of a device for infiltrating liquid into a porous body according to the present invention is shown in FIG.
該装置は、所望により内容物を解放または密封するための開閉可能な孔（５）を底部に有する、液体（９）および多孔質体（１）を封入するための第一容器（２）；当該第一容器と液体（９）が流通可能に接続された第二の容器（８）；当該第二容器（８）の内部表面についてしゅう動可能であり、当該内部表面とのしゅう動可能性シールを定義し、かつ当該容器の内部に位置するピストン（３）；当該ピストン（３）、及び当該第二容器を、該ピストン（３）がしゅう動可能に保持する架台（７）；所望により当該ピストンを動作させるための駆動部（４）；所望により当該容器底部の孔（５）から流出する液体を受容する他の容器（６）を含む。 The device comprises a first container (2) for enclosing a liquid (9) and a porous body (1), having an openable and closable hole (5) at the bottom for releasing or sealing the contents as desired; A second container (8) in which the first container and the liquid (9) are connected so as to be able to flow; the inner surface of the second container (8) can be slidable and slidable with the inner surface A piston (3) defining a seal and located inside the container; the piston (3), and a pedestal (7) on which the piston (3) is slidably held; optionally A drive (4) for operating the piston; optionally including another container (6) for receiving liquid flowing out of the hole (5) in the bottom of the container.
該装置において、ピストンを動作させることによって、第二容器内（８）の液体（９）に圧力が加わる。該圧力は、液体が流通可能に接続された第一容器（２）に伝達され、液体（９）と多孔質体（１）を含む第一容器内の、多孔質体への、液体の浸透を促進しうる。液体が流通可能に接続され、とは、液体が自由に、例えば圧力または重力によって移動しうるように中空管等によって連結されていることを意味する。該開閉可能な孔（５）は三方活栓を用いて液体の排出と注入、操作中に生じた気泡の除去等を行うことができる。 In the apparatus, pressure is applied to the liquid (9) in the second container (8) by operating the piston. The pressure is transmitted to the first container (2) to which the liquid can be circulated, and the liquid penetrates into the porous body in the first container including the liquid (9) and the porous body (1). Can be promoted. The phrase “liquid is connected so as to be able to flow” means that the liquid is freely connected, for example, by a hollow tube or the like so that it can move by pressure or gravity. The openable / closable hole (5) can discharge and inject liquid using a three-way cock, remove bubbles generated during operation, and the like.
本実施態様でも、使用方法、用途および特徴は前記の実施態様と基本的に同様である。特に、本実施態様では、該第二容器を、第一容器から取り外し、該第二容器のみを洗浄および殺菌することができ、作業性の点で有利である。また、多孔質体を該第二容器内に配置する作業が容易である。さらに多孔質体を第二容器ごと輸送することが容易である。例えば、多孔質体（１）を液体（９）とともに第二容器（２）に封入する作業を、別の場所で実施することもできる。 Also in this embodiment, the method of use, application and characteristics are basically the same as those of the above-described embodiment. In particular, in this embodiment, the second container can be removed from the first container, and only the second container can be cleaned and sterilized, which is advantageous in terms of workability. Moreover, the operation | work which arrange | positions a porous body in this 2nd container is easy. Furthermore, it is easy to transport the porous body together with the second container. For example, the operation of enclosing the porous body (1) together with the liquid (9) in the second container (2) can be performed in another place.
１実施態様は、
所望により内容物を解放または密封するための開閉可能な孔（５）を底部に有する、液体を封入するための第一容器（２）；当該第一容器（２）と液体（９）が流通可能に接続された第二の容器（８）；当該第二容器（８）の内部表面についてしゅう動可能であり、当該内部表面とのしゅう動可能性シールを定義し、かつ当該容器の内部に位置するピストン（３）を含む器具を含む。例示的構成は図２の波線による囲み枠内に示される。本実施態様でも使用方法、用途および特徴は前記の実施態様と基本的に同様である。特に、該実施態様では、ピストンを手動で操作しうる。該器具は小型軽量である。
One embodiment is:
A first container (2) for enclosing a liquid, having an openable / closable hole (5) at the bottom for releasing or sealing the contents as desired; the first container (2) and the liquid (9) are in circulation A second container (8) operatively connected; is slidable on an inner surface of the second container (8), defines a slidable seal with the inner surface and is located within the container; Including an instrument comprising a piston (3) located. An exemplary configuration is shown in a dashed box in FIG. In this embodiment, the method of use, application and characteristics are basically the same as those of the above-described embodiment. In particular, in this embodiment, the piston can be operated manually. The instrument is small and light.
本発明による器具または装置の材質は特に限定されないが、構造材料は、ポリマーまたは金属または合金またはガラスを含む。該ポリマーは、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー等；ハロゲン化ポリマー、例えばポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、コポリマーテトラフルオロエチレン及びヘキサフルオロプロピレン等;ポリアミド；ポリスルホン；ポリカーボネート；ポリエチレン；ポリプロピレン；ポリビニルクロリドアクリルコポリマー；ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン;ポリスチレン;等を含む。容器のために有用な金属材料は、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、及びそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、及び窒化チタン被覆ステンレス鋼を含む。とくに好ましくは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的にはシリコンコートされたガラス、ポリプロピレン、塩化ビニール、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ポリメチルペンテンなどがあげられる。 The material of the instrument or device according to the invention is not particularly limited, but the structural material comprises a polymer or metal or alloy or glass. Examples of the polymer include acrylonitrile polymers such as acrylonitrile butadiene styrene terpolymer; halogenated polymers such as polytetrafluoroethylene, polychlorotrifluoroethylene, copolymers tetrafluoroethylene and hexafluoropropylene; polyamides; polysulfones; polycarbonates; polyethylenes; Polyvinyl chloride acrylic copolymer; polycarbonate acrylonitrile butadiene styrene; polystyrene; Useful metallic materials for the container include stainless steel, titanium, platinum, tantalum, gold, and alloys thereof, as well as gold-plated alloy iron, platinum-plated alloy iron, cobalt chromium alloy, and titanium nitride coated stainless steel. Particularly preferred are materials having sterilization resistance, and specific examples include silicon-coated glass, polypropylene, vinyl chloride, polycarbonate, polysulfone, and polymethylpentene.
該材料は、γ線、電子線、エチレンオキサイド、またはオートクレーブ等何らかの方法により滅菌できる材質であることが望ましい。具体的には、該材料はポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレンまたはその他高温に耐えられるポリマー材料、ガラス材料、または金属材料である。 The material is preferably a material that can be sterilized by some method such as γ-ray, electron beam, ethylene oxide, or autoclave. Specifically, the material is polycarbonate, polystyrene, polypropylene, polytetrafluoroethylene, or other polymer materials that can withstand high temperatures, glass materials, or metal materials.
本発明による器具または容器の大きさは、例えば、支持体を容器内に収容できる大きさである。容器およびピストンの断面形状は円形、楕円形、長方形、正方形、５角形、など、任意の形状であり得るが、両者の断面形状は、両者間のシール性の観点から、実質的に同じであるべきである。 The size of the device or container according to the present invention is, for example, a size that can accommodate the support in the container. The cross-sectional shape of the container and the piston may be any shape such as a circle, an ellipse, a rectangle, a square, a pentagon, and the like, but the cross-sectional shapes of both are substantially the same from the viewpoint of the sealing property between them. Should.
本発明の装置または器具は、自体公知の部材を組み立てることにより製造できる。容器およびピストンは、金属材料を使用する場合は、例えば鋳造、旋盤加工、鍛造、溶接などによって、樹脂材料を使用する場合は、例えば圧縮成型、射出成型、押出し成型、ブロー成型、注型成型、接着などによって形成できる。容器およびピストンのために、適当な大きさである、商業的入手可能な任意の同様の機能を有するもの、例えばシリンジ、注射器等を転用できる。架台、三方活栓のために、当業者に明らかな公知の部材または手段を使用できる。容器の底部の孔および液体が流通可能である部分は、機械的ドリリング、レーザードリリング、鋳造、旋盤加工、鍛造、溶接、圧縮成型、射出成型、押出し成型、ブロー成型、注型成型などによって形成できる。駆動部は任意の手段、例えば電動モーター、発動機、電磁的手段などを使用しうる。 The apparatus or instrument of the present invention can be manufactured by assembling a member known per se. When using a metal material, the container and the piston, for example, by casting, lathe processing, forging, welding, etc., and when using a resin material, for example, compression molding, injection molding, extrusion molding, blow molding, cast molding, It can be formed by bonding or the like. For the container and piston, any commercially available one having any similar function, such as a syringe, syringe, etc., can be diverted. Known members or means obvious to those skilled in the art can be used for the gantry and the three-way cock. The hole at the bottom of the container and the part where the liquid can flow can be formed by mechanical drilling, laser drilling, casting, lathe processing, forging, welding, compression molding, injection molding, extrusion molding, blow molding, cast molding, etc. . The driving unit may use any means such as an electric motor, a motor, and electromagnetic means.
多孔質体内部に液体が浸透したことは、多孔質体及び液体が存在する閉鎖された容器内を陰圧の状態に保っても多孔質体が液体中で浮上してこないことを指標に判定することができる。 The permeation of liquid into the porous body is determined by an indicator that the porous body does not float in the liquid even if the inside of the closed container where the porous body and liquid exist is kept at a negative pressure. can do.
以下本発明について例を挙げて説明するが、必ずしもここに挙げた例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described by way of examples, but the present invention is not necessarily limited to the examples given here.
（実施例１）
ジオキサンに溶解したＰＬＧＡ（ポリ乳酸グリコール酸共重合体）を凍結乾燥処理することにより作製したスポンジ状のＰＬＧＡ支持体にウサギ骨髄間葉系細胞を内在化させて本発明の効果を検証した。
Example 1
Rabbit bone marrow mesenchymal cells were internalized on a sponge-like PLGA support prepared by freeze-drying PLGA (polylactic acid glycolic acid copolymer) dissolved in dioxane, and the effect of the present invention was verified.
ＰＬＧＡ支持体は、縦１０ｍｍ、横１０ｍｍの正方形の形状に整形した厚さ３ｍｍのものを用いた。細胞はウサギ骨髄より培養基材への付着能を指標に調製した骨髄間葉系細胞を用いたが、その調製法は次の通りである。体重３．５〜４．０ｋｇの日本白色兎の上腕骨頭より骨髄穿刺針（アリージャンス）を用いて骨髄液を採取した。１．５ｍＬの骨髄液に対し、１５％ウシ胎児血清（ギブコ）を含有するαＭＥＭ培地（ギブコ）１３．５ｍＬを添加し、Ｔ−７５フラスコ（旭テクノグラス）を用いて３７℃、５％ＣＯ2の環境下で培養した。２〜３日に１回培地交換し、２回継代を行ったものを検証用の細胞として用いた。
A PLGA support having a thickness of 3 mm shaped into a square shape having a length of 10 mm and a width of 10 mm was used. The cells used were bone marrow mesenchymal cells prepared from rabbit bone marrow using the adherence to the culture substrate as an index. The preparation method is as follows. Bone marrow fluid was collected from the humeral head of a Japanese white rabbit weighing 3.5 to 4.0 kg using a bone marrow puncture needle (Alliance). 13.5 mL of αMEM medium (Gibco) containing 15% fetal bovine serum (Gibco) is added to 1.5 mL of bone marrow fluid, and 37 ° C., 5
図１に示した装置を用いて支持体内部に培地を浸透させた。ＰＬＧＡ支持体と１５％ウシ胎児血清を含有するαＭＥＭ培地を図１の第一容器（２）内に入れ、ピストン（３）を押して容器内を陽圧にした。培地（赤色）が支持体（白色）内に浸入したことを支持体の色の変化で確認した後ピストンを引いて容器内を陰圧にした。陰圧の状態を５〜６０秒程度保持し、支持体内部に残存する空気を脱気した。この時支持体表面に気泡が付着するが、これは容器を振盪するなどして除去することが望ましい。再び容器内を陽圧にした培地を支持体内に浸入させた後陰圧にして脱気した。この操作を繰り返すことにより支持体内に培地を浸透させた。培地が支持体内に完全に浸透したことを、容器内を陰圧にしても培地中で支持体が浮上して来なくなることを指標に判断した。 The medium was infiltrated into the support using the apparatus shown in FIG. An αMEM medium containing a PLGA support and 15% fetal calf serum was placed in the first container (2) of FIG. 1, and the piston (3) was pushed to make the inside of the container positive. After confirming that the medium (red) entered the support (white) by the change in the color of the support, the piston was pulled to create a negative pressure in the container. The negative pressure state was maintained for about 5 to 60 seconds, and the air remaining inside the support was deaerated. At this time, bubbles adhere to the surface of the support, and it is desirable to remove them by shaking the container. The medium in which the inside of the container was set to a positive pressure again was infiltrated into the support body and then degassed by using a negative pressure. By repeating this operation, the medium was infiltrated into the support. It was judged as an indicator that the medium completely penetrated into the support body and that the support body did not float in the medium even if the inside of the container was subjected to negative pressure.
内部に培地を浸透させた支持体をクリーンベンチ内で滅菌ガーゼ（川本産業）上に５〜１０分間置き、余分な培地を毛細管現象によりガーゼに吸わせたて除去した。余分な培地を除去した支持体を直径６ｃｍの培養シャーレ（旭テクノグラス）に移して、５×１０7／ｍＬの細胞濃度になるようにαＭＥＭ培地に懸濁して調製したウサギ骨髄間葉系細胞懸濁液を６０μＬ（総細胞数３×１０6個）支持体に滴下した。細胞懸濁液を滴下後１５分間静置して細胞を支持体内部に浸透させた。培養シャーレに５ｍＬの培地を添加して軽く浸透した後支持体を取り出し、支持体内部に内在化されずに培地中に漏出した細胞数を血球計数盤を用いて計測した。この時、支持体内部に培地を浸透させなかったもの（試料Ａ）、培地を浸透させた後余分の培地を除去しなかったもの（試料Ｂ）と培地を浸透させた後余分の培地を除去したもの（試料Ｃ）を比較した。その結果を表１に示した。表１からわかるように支持体内部に培地を浸透させなかったものではほとんど細胞が内在化されなかったが、支持体に培地を浸透させることにより大半の細胞が支持体内部に内在化されるようになり、さらに余分の培地を除去することによりほとんど全ての細胞を支持体内部に保持させることができた。 The support medium infiltrated with the medium was placed on a sterile gauze (Kawamoto Sangyo) for 5 to 10 minutes in a clean bench, and the excess medium was removed by sucking the gauze by capillary action. Rabbit bone marrow mesenchymal cells prepared by suspending the support from which the excess medium had been removed into a 6 cm-diameter culture dish (Asahi Techno Glass) and suspending in αMEM medium to a cell concentration of 5 × 10 7 / mL The suspension was dropped onto a support of 60 μL (total number of cells: 3 × 10 6 cells). After dropping the cell suspension, the cells were allowed to stand for 15 minutes to permeate the inside of the support. After 5 mL of medium was added to the culture dish and lightly permeated, the support was taken out, and the number of cells leaked into the medium without being internalized inside the support was counted using a hemocytometer. At this time, the medium that did not permeate the support (sample A), the medium that did not remove excess medium after permeating the medium (sample B), and the medium that permeated the excess medium were removed. The samples (sample C) were compared. The results are shown in Table 1. As can be seen from Table 1, cells were hardly internalized when the medium was not permeated into the support, but most cells were internalized by allowing the medium to permeate the support. Furthermore, almost all cells could be retained inside the support by removing the excess medium.
表 １ 支持体からの細胞の内在化率および漏出率 Table 1 Rate of internalization and leakage of cells from the support
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011050320A (en) * | 2009-09-02 | 2011-03-17 | Futamura Chemical Co Ltd | Method for preserving microorganism, member for preserving microorganism, and method for producing porous sheet-formed material for preserving microorganism |
| KR20160025041A (en) | 2010-11-25 | 2016-03-07 | 가부시키가이샤 구라레 | Method for producing implant material |
| JP2016158542A (en) * | 2015-02-27 | 2016-09-05 | 富士ソフト株式会社 | Cell administration apparatus |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62215386A (en) * | 1986-03-14 | 1987-09-22 | Nitto Electric Ind Co Ltd | Culture of adhering animal cell and equipment therefor |
| JPH03126106U (en) * | 1990-04-02 | 1991-12-19 | ||
| JP2000004870A (en) * | 1998-06-23 | 2000-01-11 | Terumo Corp | Cell supporting base, culture apparatus and liquid treating apparatus |
| JP2002017846A (en) * | 2000-05-19 | 2002-01-22 | Mmt:Kk | Biological member |
| JP2003019195A (en) * | 2000-05-19 | 2003-01-21 | Mmt:Kk | Biological member |
| JP2004216119A (en) * | 2002-09-09 | 2004-08-05 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Support for tissue regeneration, and method of manufacturing the same |
| JP2004254516A (en) * | 2003-02-24 | 2004-09-16 | Olympus Corp | Method for cell culture, method for producing biological tissue supply material, apparatus for cell culture and apparatus for producing biological tissue supply material |
-
2004
- 2004-07-13 JP JP2004205703A patent/JP2006025635A/en active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62215386A (en) * | 1986-03-14 | 1987-09-22 | Nitto Electric Ind Co Ltd | Culture of adhering animal cell and equipment therefor |
| JPH03126106U (en) * | 1990-04-02 | 1991-12-19 | ||
| JP2000004870A (en) * | 1998-06-23 | 2000-01-11 | Terumo Corp | Cell supporting base, culture apparatus and liquid treating apparatus |
| JP2002017846A (en) * | 2000-05-19 | 2002-01-22 | Mmt:Kk | Biological member |
| JP2003019195A (en) * | 2000-05-19 | 2003-01-21 | Mmt:Kk | Biological member |
| JP2004216119A (en) * | 2002-09-09 | 2004-08-05 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Support for tissue regeneration, and method of manufacturing the same |
| JP2004254516A (en) * | 2003-02-24 | 2004-09-16 | Olympus Corp | Method for cell culture, method for producing biological tissue supply material, apparatus for cell culture and apparatus for producing biological tissue supply material |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011050320A (en) * | 2009-09-02 | 2011-03-17 | Futamura Chemical Co Ltd | Method for preserving microorganism, member for preserving microorganism, and method for producing porous sheet-formed material for preserving microorganism |
| KR20160025041A (en) | 2010-11-25 | 2016-03-07 | 가부시키가이샤 구라레 | Method for producing implant material |
| JP2016158542A (en) * | 2015-02-27 | 2016-09-05 | 富士ソフト株式会社 | Cell administration apparatus |
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