JP2006025625A - Method for measuring activity of glucosaminoglycan-splitting enzyme - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、グリコサミノグリカン分解酵素の活性測定方法及び活性測定剤に関する。 The present invention relates to a method and an activity measuring agent for glycosaminoglycan degrading enzyme.
本明細書中で使用する略号は以下の通りである。
ＡＢＥＥ：４−アミノ安息香酸エチルエステル（4-amino benzoic acid ethyl ester）
ＣＨ：コンドロイチン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＤＳ：デルマタン硫酸
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimide）
ＦＰ分析法：蛍光偏光分析法（fliorescence polarization assay method）
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン（glycosaminoglycan）
ＧＰＣ：ゲル浸透クロマトグラフィー（gel permeation chromatography）
ＨＡ：ヒアルロン酸（hyaluronic acid）
ＨＡａｓｅ：ＨＡ分解酵素
Ｈｅｐ：ヘパリン
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー（high performance liquid chromatography）
ＨＳ：ヘパラン硫酸
ＫＳ：ケラタン硫酸
ＭＢＴＨ：３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン ヒドラゾン(3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone)
ＭＥＳ：２−モルホリノエタンスルホン酸（2-morpholinoethanesulfonic acid）
ＲＩ：示差屈折（Differential refractive index）
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸（trifluoroacetic acid）
特許文献１には、ＧＡＧ分解酵素の活性を測定する方法として、第１の重合高分子イオン（ＧＡＧ）及びこれと逆の電荷を持つ蛍光標識された第２の重合高分子イオン（例えばポリリジン、ポリアルギニン、キチン等）とを相互作用させ、イオン結合させて、その複合体をＦＰ分析する方法が開示されている。
Abbreviations used in this specification are as follows.
ABEE: 4-amino benzoic acid ethyl ester
CH: chondroitin CS: chondroitin sulfate DS: dermatan sulfate EDC: 1-ethyl-3- (3-dimethyl-aminopropyl) -carbodiimide
FP analysis method: fluorescence polarization assay method
GAG: glycosaminoglycan
GPC: gel permeation chromatography
HA: hyaluronic acid
HAase: HA-degrading enzyme Hep: heparin HPLC: high performance liquid chromatography
HS: heparan sulfate KS: keratan sulfate MBTH: 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone
MES: 2-morpholinoethanesulfonic acid
RI: Differential refractive index
TFA: trifluoroacetic acid
In Patent Document 1, as a method for measuring the activity of a GAG-degrading enzyme, a first polymerized polymer ion (GAG) and a fluorescently labeled second polymerized polymer ion having a charge opposite thereto (for example, polylysine, Polyarginine, chitin, etc.) are allowed to interact and ionically bind, and a method for FP analysis of the complex is disclosed.
本発明は、ＧＡＧ分解酵素の活性を、簡便、迅速、安価かつ高感度に、再現性・定量性良く測定する方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for measuring the activity of a GAG-degrading enzyme simply, rapidly, inexpensively and with high sensitivity and with good reproducibility and quantitativeness.
本発明の発明者らは上記課題を鑑みて鋭意検討した結果、「蛍光物質が結合したＧＡＧ」とＦＰ分析法を採用することによって、ＧＡＧ分解酵素の活性を、簡便、迅速、安価かつ高感度に、再現性・定量性良く測定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies in view of the above-mentioned problems, the inventors of the present invention have adopted GAP with a fluorescent substance and the FP analysis method, so that the activity of GAG-degrading enzyme can be easily, rapidly, inexpensively and highly sensitive. In addition, the present inventors have found that it is possible to measure with good reproducibility / quantitativeness and have completed the present invention.
すなわち本発明は、下記（Ａ）〜（Ｃ）の全てのステップを少なくとも含む、検体中のＧＡＧ分解酵素の活性測定方法（以下、「本発明方法」という。）を提供する。 That is, the present invention provides a method for measuring the activity of GAG-degrading enzyme in a specimen (hereinafter referred to as “the method of the present invention”), which includes at least all the following steps (A) to (C).
ステップ（Ａ）：「蛍光物質が結合したＧＡＧ」と検体を接触させ、当該ＧＡＧに検体中のＧＡＧ分解酵素を作用させるステップ。 Step (A): A step of bringing a specimen into contact with “GAG to which a fluorescent substance is bound” and allowing GAG-degrading enzyme in the specimen to act on the GAG.
ステップ（Ｂ）：前記作用後のＧＡＧをＦＰ分析法によって検出するステップ。 Step (B): detecting GAG after the action by FP analysis.
ステップ（Ｃ）：ステップ（Ｂ）で得られた検出結果と、検体中のＧＡＧ分解酵素の活性とを関連づけるステップ。 Step (C): A step of associating the detection result obtained in step (B) with the activity of GAG-degrading enzyme in the specimen.
ここにいうＧＡＧは、カルボキシル基を有するＧＡＧであることが好ましい。またこのＧＡＧはＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＨＳ又はＨｅｐであることが好ましい。 GAG here is preferably GAG having a carboxyl group. The GAG is preferably HA, CH, CS, HS or Hep.
また「蛍光物質が結合したＧＡＧ」における蛍光物質は、ＧＡＧのカルボキシル基部分に結合していることが好ましい。この蛍光物質は、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドであることが好ましい。また「蛍光物質が結合したＧＡＧ」における蛍光物質とＧＡＧとの結合は、共有結合であることが好ましい。 Moreover, it is preferable that the fluorescent substance in “GAG to which a fluorescent substance is bonded” is bonded to the carboxyl group portion of GAG. This fluorescent material is preferably fluorescein-5-thiosemicarbazide. Moreover, it is preferable that the coupling | bonding of the fluorescent substance and GAG in "GAG which the fluorescent substance couple | bonded" is a covalent bond.
また本発明は、「蛍光物質が結合したＧＡＧ」を少なくとも含有する、ＧＡＧ分解酵素の活性測定剤（以下、「本発明測定剤」という。）を提供する。 The present invention also provides a GAG-degrading enzyme activity measuring agent (hereinafter referred to as “the measuring agent of the present invention”) containing at least “GAG to which a fluorescent substance is bound”.
ここにいうＧＡＧは、カルボキシル基を有するＧＡＧであることが好ましい。またこのＧＡＧはＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＨＳ又はＨｅｐであることが好ましい。 GAG here is preferably GAG having a carboxyl group. The GAG is preferably HA, CH, CS, HS or Hep.
また「蛍光物質が結合したＧＡＧ」における蛍光物質は、ＧＡＧのカルボキシル基部分に結合していることが好ましい。この蛍光物質は、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドであることが好ましい。また「蛍光物質が結合したＧＡＧ」における蛍光物質とＧＡＧとの結合は、共有結合であることが好ましい。 Moreover, it is preferable that the fluorescent substance in “GAG to which a fluorescent substance is bonded” is bonded to the carboxyl group portion of GAG. This fluorescent material is preferably fluorescein-5-thiosemicarbazide. Moreover, it is preferable that the coupling | bonding of the fluorescent substance and GAG in "GAG which the fluorescent substance couple | bonded" is a covalent bond.
さらに本発明は、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドとＨＡとが共有結合していることを特徴とする、ＨＡ誘導体又はその塩（以下、「本発明誘導体」という。）を提供する。この誘導体において、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドのヒドラジノ基とＨＡのカルボキシル基とがヒドラジド結合していることが好ましい。 Furthermore, the present invention provides an HA derivative or a salt thereof (hereinafter referred to as “the derivative of the present invention”) characterized in that fluorescein-5-thiosemicarbazide and HA are covalently bonded. In this derivative, it is preferable that the hydrazino group of fluorescein-5-thiosemicarbazide and the carboxyl group of HA are hydrazide-bonded.
本発明方法は、これを用いることにより、簡便、迅速、安価かつ高感度に、高い再現性と高い定量性をもって検体中のＧＡＧ分解酵素活性を測定することができ、極めて有用である。さらに本発明測定剤は、本発明方法のより簡便かつ迅速な実施を可能にすることから非常に有用である。また本発明誘導体は、本発明方法や本発明測定剤の有効成分等として用いることができ、極めて有用である。 By using this method, the method of the present invention can measure GAG-degrading enzyme activity in a sample with high reproducibility and high quantitativeness, simply, rapidly, inexpensively and with high sensitivity, and is extremely useful. Furthermore, the measurement agent of the present invention is very useful because it enables simpler and faster implementation of the method of the present invention. The derivative of the present invention can be used as an active ingredient of the method of the present invention or the measuring agent of the present invention and is extremely useful.
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
＜１＞本発明方法
本発明方法は、下記（Ａ）〜（Ｃ）の全てのステップを少なくとも含む、検体中のＧＡＧ分解酵素の活性測定方法である。
ステップ（Ａ）：「蛍光物質が結合したＧＡＧ」と検体を接触させ、当該ＧＡＧに検体中のＧＡＧ分解酵素を作用させるステップ。
ステップ（Ｂ）：前記作用後のＧＡＧをＦＰ分析法によって検出するステップ。
ステップ（Ｃ）：ステップ（Ｂ）で得られた検出結果と、検体中のＧＡＧ分解酵素の活性とを関連づけるステップ。
Hereinafter, the present invention will be described in detail by embodiments of the invention.
<1> Method of the Present Invention The method of the present invention is a method for measuring the activity of a GAG-degrading enzyme in a sample, comprising at least all the following steps (A) to (C).
Step (A): A step of bringing a specimen into contact with “GAG to which a fluorescent substance is bound” and allowing GAG-degrading enzyme in the specimen to act on the GAG.
Step (B): detecting GAG after the action by FP analysis.
Step (C): A step of associating the detection result obtained in step (B) with the activity of GAG-degrading enzyme in the specimen.
以下、ステップごとに説明する。
（１）ステップ（Ａ）
本ステップは、「蛍光物質が結合したＧＡＧ」と検体を接触させ、当該ＧＡＧに検体中のＧＡＧ分解酵素を作用させるステップである。
（１−１）蛍光物質が結合したＧＡＧ
ここにいう「蛍光物質」は、ＧＡＧに結合しうるものであり、かつＦＰ分析法によって検知しうるものである限りにおいて特に限定されず、種々のフルオレセイン誘導体、蛍光標識リガンド等が例示される。このようなものとしては、例えば、フルオレセイン−５−チオセミカルバジド、ローダミン、クマリン、テキサスレッド、ウンベリフェロン、エオシン、ピレン等が例示される。なかでも、ＧＡＧのカルボキシル基部分に結合するものが好ましく、このようなものとしては、例えば、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドテキサスレッド ヒドラジド、１−アミノメチルピレン、カスケードブルーカダベリン等が例示される。なかでもフルオレセイン−５−チオセミカルバジドが好ましい。
Hereinafter, each step will be described.
(1) Step (A)
This step is a step of bringing a specimen into contact with “GAG to which a fluorescent substance is bound” and causing GAG-degrading enzyme in the specimen to act on the GAG.
(1-1) GAG to which a fluorescent substance is bound
The “fluorescent substance” here is not particularly limited as long as it can bind to GAG and can be detected by FP analysis, and examples thereof include various fluorescein derivatives, fluorescently labeled ligands and the like. Examples of such include fluorescein-5-thiosemicarbazide, rhodamine, coumarin, Texas red, umbelliferone, eosin, pyrene and the like. Especially, what couple | bonds with the carboxyl group part of GAG is preferable, For example, fluorescein-5-thiosemicarbazide Texas red hydrazide, 1-aminomethyl pyrene, cascade blue cadaverine etc. are illustrated. Of these, fluorescein-5-thiosemicarbazide is preferable.
また、蛍光物質が結合されるＧＡＧも、活性測定の対象となるＧＡＧ分解酵素の基質となり得るＧＡＧである限りにおいて特に限定されない。このようなＧＡＧとしては、ＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＤＳ、ＫＳ、ＨＳ、Ｈｅｐ等が例示されるが、カルボキシル基を有するＧＡＧであることが好ましい。カルボキシル基を有するＧＡＧとしては、ＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＤＳ、ＨＳ、Ｈｅｐが例示されるが、なかでもＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＨＳ及びＨｅｐからなる群から選ばれることが好ましい。そのなかでも、ＨＡ又はＣＨが好ましい。 Further, the GAG to which the fluorescent substance is bound is not particularly limited as long as it is a GAG that can be a substrate of a GAG degrading enzyme that is a target of activity measurement. Examples of such GAG include HA, CH, CS, DS, KS, HS, and Hep. GAG having a carboxyl group is preferable. Examples of the GAG having a carboxyl group include HA, CH, CS, DS, HS, and Hep. Among them, it is preferable that the GAG is selected from the group consisting of HA, CH, CS, HS, and Hep. Among these, HA or CH is preferable.
またＧＡＧは塩であってもよい。塩としては、例えばアルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩や、ジエタノールアミン塩、シクロへキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩などが例示される。 GAG may be a salt. Examples of the salt include salts with inorganic bases such as alkali metal salts (sodium salts, lithium salts, potassium salts, etc.), alkaline earth metal salts, ammonium salts, and organic compounds such as diethanolamine salts, cyclohexylamine salts, and amino acid salts. Examples include salts with bases.
蛍光物質が結合されるＧＡＧは、本発明方法における活性測定の対象となるＧＡＧ分解酵素の種類に応じて、当業者が適宜選択することができる。
例えばＨＡａｓｅを活性測定の対象とする場合には、ＧＡＧとしてＨＡを用いることができる。同様に、例えば、ヘパラン硫酸分解酵素を活性測定の対象とする場合には、ＧＡＧとしてヘパラン硫酸を用いることができる。
蛍光物質が結合されるＧＡＧのサイズも特に限定されない。例えば、ＨＡであれば重量平均分子量が１万〜３００万程度のものを例示することができる。なかでも重量平均分子量が２万〜２００万程度のものが好ましく、重量平均分子量４万〜１２０万のものがより好ましい。ＣＨとしては、例えば重量平均分子量１千〜５万程度のものを用いることができる。
The GAG to which the fluorescent substance is bound can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of GAG-degrading enzyme that is the target of activity measurement in the method of the present invention.
For example, when HAase is the target of activity measurement, HA can be used as GAG. Similarly, for example, when heparan sulfate degrading enzyme is the target of activity measurement, heparan sulfate can be used as GAG.
The size of GAG to which the fluorescent substance is bound is not particularly limited. For example, in the case of HA, those having a weight average molecular weight of about 10,000 to 3 million can be exemplified. Among them, those having a weight average molecular weight of about 20,000 to 2,000,000 are preferable, and those having a weight average molecular weight of 40,000 to 1,200,000 are more preferable. As CH, for example, one having a weight average molecular weight of about 1,000 to 50,000 can be used.
このようなＧＡＧは、公知の方法で製造することができ、また市販のものを用いることもできる。 Such GAG can be produced by a known method, and a commercially available product can also be used.
「蛍光物質が結合したＧＡＧ」における「蛍光物質」と「ＧＡＧ」との結合様式は、両者が何らかの形で結合するものである限りにおいて特に限定されないが、共有結合であることが好ましい。 The binding mode of “fluorescent substance” and “GAG” in “GAG to which fluorescent substance is bound” is not particularly limited as long as both are bound in some form, but is preferably a covalent bond.
すなわち本発明における「蛍光物質が結合したＧＡＧ」として特に好ましいのは、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドが共有結合したＨＡ、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドが共有結合したＣＳ、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドが共有結合したＤＳ、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドが共有結合したＫＳ、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドが共有結合したＨＳ及びフルオレセイン−５−チオセミカルバジドが共有結合したＨｅｐである。 That is, particularly preferred as the “fluorescent substance-bound GAG” in the present invention is HA in which fluorescein-5-thiosemicarbazide is covalently bonded, CS in which fluorescein-5-thiosemicarbazide is covalently bonded, and fluorescein-5-thiosemicarbazide is covalently bonded. Bound DS, KS covalently bound with fluorescein-5-thiosemicarbazide, HS covalently bound with fluorescein-5-thiosemicarbazide and Hep covalently bound with fluorescein-5-thiosemicarbazide.
また、「蛍光物質」が結合しているＧＡＧ上の位置も特に限定されないが、ＧＡＧのカルボキシル基であることが好ましい。 Further, the position on the GAG to which the “fluorescent substance” is bonded is not particularly limited, but is preferably a carboxyl group of GAG.
また、「蛍光物質」としてフルオレセイン−５−チオセミカルバジドを用いる場合には、そのヒドラジノ基とＧＡＧのカルボキシル基とがヒドラジド結合しているものが好ましい。 When fluorescein-5-thiosemicarbazide is used as the “fluorescent substance”, it is preferable that the hydrazino group and the carboxyl group of GAG are hydrazide-bonded.
すなわち、本発明における「蛍光物質が結合したＧＡＧ」として最も好ましいのは、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドのヒドラジノ基と、ＨＡのカルボキシル基とがヒドラジド結合しているＨＡである。 That is, the most preferable “GAG to which a fluorescent substance is bound” in the present invention is HA in which the hydrazino group of fluorescein-5-thiosemicarbazide and the carboxyl group of HA are hydrazide-bonded.
また、ＧＡＧに結合している蛍光物質の分子数も特に限定されないが、２分子以上であることが好ましい。
蛍光物質をＧＡＧに結合させる方法（「蛍光物質が結合したＧＡＧ」の製造方法）は、蛍光物質とＧＡＧとを結合させることができる方法である限りにおいて特に限定されない。具体例については実施例を参照されたい。
（１−２）検体
本発明方法における「検体」は、活性測定の対象となるＧＡＧ分解酵素が含有されているか、又は含有されている可能性があるものである限りにおいて特に限定されない。また検体は、予め精製されている必要もない。すなわち、検体中に、活性測定の対象とするＧＡＧ分解酵素以外のＧＡＧ分解酵素やその他の蛋白質等が含有されていても、本発明方法では活性測定の対象とするＧＡＧ分解酵素を特異的に測定することができる。
Further, the number of molecules of the fluorescent substance bonded to GAG is not particularly limited, but is preferably 2 or more.
The method for binding the fluorescent substance to GAG (the method for producing “GAG to which the fluorescent substance is bound”) is not particularly limited as long as it is a method capable of binding the fluorescent substance and GAG. See the Examples for specific examples.
(1-2) Specimen The “specimen” in the method of the present invention is not particularly limited as long as it contains or may contain a GAG-degrading enzyme that is a target for activity measurement. In addition, the specimen need not be purified in advance. That is, even if the sample contains a GAG-degrading enzyme other than the GAG-degrading enzyme whose activity is to be measured, other proteins, etc., the method of the present invention specifically measures the GAG-degrading enzyme whose activity is to be measured. can do.
検体として具体的には、ＧＡＧ分解酵素溶液、細胞培養上清、組織抽出物、体液（例えば血液、尿等）等が例示される。
（１−３）「蛍光物質が結合したＧＡＧ」と検体との接触等
「蛍光物質が結合したＧＡＧ」と検体を接触させる方法は、「蛍光物質が結合したＧＡＧ」と検体中のＧＡＧ分解酵素分子とが接触する状態となる限りにおいて特に限定されない。なおこれらを接触させた後、酵素反応させるためにインキュベートすることが好ましい。インキュベートの条件は、検体中のＧＡＧ分解酵素が「蛍光物質が結合したＧＡＧ」に作用してこれを分解する反応が惹起される条件である限りにおいて限定されない。具体例については実施例を参照されたい。
Specific examples of the specimen include GAG-degrading enzyme solution, cell culture supernatant, tissue extract, body fluid (for example, blood, urine, etc.) and the like.
(1-3) Contact between “GAG to which fluorescent substance is bound” and specimen, etc. “GAG to which fluorescent substance is bound” and specimen are brought into contact with “GAG to which fluorescent substance is bound” and GAG-degrading enzyme in specimen. There is no particular limitation as long as the molecule comes into contact. In addition, after making these contact, it is preferable to incubate in order to make an enzyme reaction. The incubation conditions are not limited as long as the GAG-degrading enzyme in the specimen acts on “GAG to which a fluorescent substance is bound” to cause a reaction to decompose it. See the Examples for specific examples.
「蛍光物質が結合したＧＡＧ」と検体を接触させることによって、当該ＧＡＧに検体中のＧＡＧ分解酵素が作用して、当該ＧＡＧが低分子化されることになる。
（２）ステップ（Ｂ）
ステップ（Ｂ）は、前記作用後のＧＡＧをＦＰ分析法によって検出するステップである。
By contacting the specimen with “GAG to which a fluorescent substance is bound”, the GAG degrading enzyme in the specimen acts on the GAG, and the GAG is reduced in molecular weight.
(2) Step (B)
Step (B) is a step of detecting the GAG after the action by an FP analysis method.
ステップ（Ａ）において「蛍光物質が結合したＧＡＧ」がＧＡＧ分解酵素の作用によって低分子化されるが、その程度は検体中に存在するＧＡＧ分解酵素の活性に依存する。本ステップは、「蛍光物質が結合したＧＡＧ」の低分子化の程度をＦＰ分析法で検出するステップである。したがって、「前記作用後のＧＡＧ」とは、ＧＡＧ分解酵素の作用を受けた後の「蛍光物質が結合したＧＡＧ」を意味する。 In step (A), “GAG to which a fluorescent substance is bound” is reduced in molecular weight by the action of GAG-degrading enzyme, the degree of which depends on the activity of GAG-degrading enzyme present in the specimen. This step is a step of detecting the degree of low molecular weight of “GAG to which a fluorescent substance is bound” by FP analysis. Accordingly, “GAG after the action” means “GAG to which a fluorescent substance is bound” after being subjected to the action of a GAG degrading enzyme.
ＦＰ分析法は、公知の方法で行うことができ、そのための各種装置も市販されており、いずれをも使用することができる。具体例は実施例を参照されたい。 The FP analysis method can be performed by a known method, and various apparatuses for the method are commercially available, and any of them can be used. See the Examples for specific examples.
前記作用後のＧＡＧを、このようなＦＰ分析法によって検出することにより、その検出結果が得られる。
（３）ステップ（Ｃ）
ステップ（Ｃ）は、ステップ（Ｂ）で得られた検出結果と、検体中のＧＡＧ分解酵素の活性とを関連づけるステップである。
The detection result can be obtained by detecting the GAG after the action by such an FP analysis method.
(3) Step (C)
Step (C) is a step of associating the detection result obtained in step (B) with the activity of the GAG-degrading enzyme in the sample.
ステップ（Ｂ）において、「蛍光物質が結合したＧＡＧ」の低分子化の程度が検出される。低分子化の程度は検体中に存在するＧＡＧ分解酵素の活性に依存することから、ステップ（Ｂ）で得られた検出結果（低分子化の程度の指標となる）と検体中のＧＡＧ分解酵素の活性とを関連づけることにより、検体中のＧＡＧ分解酵素の活性を測定することができる。 In step (B), the degree of molecular weight reduction of “GAG to which a fluorescent substance is bound” is detected. Since the degree of molecular weight reduction depends on the activity of the GAG-degrading enzyme present in the specimen, the detection result obtained in step (B) (which serves as an indicator of the degree of molecular weight reduction) and the GAG-degrading enzyme in the specimen The activity of GAG-degrading enzyme in the specimen can be measured by correlating with the activity of GAG.
「ステップ（Ｂ）で得られた検出結果」は、ＦＰ分析法によって得られた生データ（例えば、ｍＰ値など。）であってもよく、当該生データから所定の数式等を用いて算出された値（例えば、分子量として算出された値など。）であってもよい。 The “detection result obtained in step (B)” may be raw data (for example, mP value) obtained by the FP analysis method, and is calculated from the raw data using a predetermined mathematical formula or the like. (For example, a value calculated as a molecular weight).
検体中のＧＡＧ分解酵素の活性が高ければ、「蛍光物質が結合したＧＡＧ」の低分子化の程度が高くなるので、これを利用して、「ステップ（Ｂ）で得られた検出結果」と検体中のＧＡＧ分解酵素の活性との関連づけを行うことができる。 If the activity of the GAG-degrading enzyme in the sample is high, the degree of molecular weight reduction of “GAG bound with a fluorescent substance” becomes high. By using this, “the detection result obtained in step (B)” Correlation with the activity of GAG-degrading enzyme in the specimen can be performed.
例えば、「ステップ（Ｂ）で得られた検出結果」として、ＧＡＧの低分子化の程度が高いほど高い値を示すもの（例えば、ｍＰ値など。）を用いる場合には、当該値が高いほど、検体中のＧＡＧ分解酵素の活性は高いと関連づけることができる。 For example, in the case of using a “detection result obtained in step (B)” that shows a higher value as the degree of molecular weight reduction of GAG is higher (for example, mP value), the higher the value is, the higher the value is. The activity of GAG-degrading enzyme in the sample can be correlated with high activity.
また、「ステップ（Ｂ）で得られた検出結果」として、ＧＡＧの低分子化の程度が高いほど低い値を示すもの（例えば、分子量として算出された値など。）を用いる場合には、当該値が低いほど、検体中のＧＡＧ分解酵素の活性は高いと関連づけることができる。 In addition, when using the “detection result obtained in step (B)” that shows a lower value as the degree of molecular weight reduction of GAG is higher (for example, a value calculated as a molecular weight), It can be related that the lower the value, the higher the activity of the GAG-degrading enzyme in the specimen.
なお、本発明方法における「活性測定方法」とは、定量的な測定のみならず、定性的な測定（ＧＡＧ分解酵素の存否の検出）をも含む概念である。したがって、「ステップ（Ｂ）で得られた検出結果」と検体中のＧＡＧ分解酵素の活性との関連づけは、定量的なものであっても、定性的なもの（ＧＡＧ分解酵素活性の有無についての関連づけ）であってもよい。 The “activity measurement method” in the method of the present invention is a concept including not only quantitative measurement but also qualitative measurement (detection of the presence or absence of GAG-degrading enzyme). Therefore, the correlation between the “detection result obtained in step (B)” and the activity of the GAG-degrading enzyme in the sample is quantitative, but qualitative (the presence or absence of GAG-degrading enzyme activity). Association).
定量的な関連づけは、活性のレベルが既知のＧＡＧ分解酵素を用いた結果をもとに予め検量線や関係式を作成しておき、これを用いることによって行うことができる。 Quantitative association can be performed by preparing a calibration curve or a relational expression in advance based on the result of using a GAG-degrading enzyme with a known activity level.
このような関連づけを行うことにより、検体中のＧＡＧ分解酵素の活性を測定することができる。測定される「活性」は、純然たる「酵素の活性」のみならず、酵素の濃度、重量、分子数等として求めてもよい。 By performing such association, the activity of the GAG-degrading enzyme in the specimen can be measured. The “activity” to be measured may be determined not only as “enzyme activity” but also as the concentration, weight, number of molecules, etc. of the enzyme.
本発明測定方法は、このようなステップ（Ａ）〜（Ｃ）のステップを全て含んでいる限りにおいて、さらに他のステップが加わってもよい。
＜２＞本発明測定剤
本発明測定剤は、「蛍光物質が結合したＧＡＧ」を少なくとも含有する、ＧＡＧ分解酵素の活性測定剤である。
As long as the measurement method of the present invention includes all the steps (A) to (C), other steps may be added.
<2> Measuring Agent of the Present Invention The measuring agent of the present invention is a GAG-degrading enzyme activity measuring agent containing at least “GAG to which a fluorescent substance is bound”.
「蛍光物質が結合したＧＡＧ」の説明は、本発明測定方法における説明と同じである。 The description of “GAG to which a fluorescent substance is bound” is the same as that in the measurement method of the present invention.
したがって、ＧＡＧはカルボキシル基を有するＧＡＧであることが好ましく、このＧＡＧはＨＡであることが好ましい。また「蛍光物質が結合したＧＡＧ」における蛍光物質は、ＧＡＧのカルボキシル基部分に結合していることが好ましく、この蛍光物質は、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドであることが好ましく、また「蛍光物質が結合したＧＡＧ」における蛍光物質とＧＡＧとの結合は共有結合であることが好ましい。
本発明測定剤は、このような「蛍光物質が結合したＧＡＧ」を少なくとも含有する限りにおいて特に限定されず、さらに医薬的又は試薬的に許容される担体（例えば、緩衝剤や安定化剤など。）が含まれていてもよい。また、ＧＡＧ分解酵素の活性測定に使用する「蛍光物質が結合したＧＡＧ」以外のコンポーネント（例えば、ＰＢＳ、ＧＡＧ分解酵素の標準品など。）とセットにしたキットの形態であってもよい。
Therefore, GAG is preferably GAG having a carboxyl group, and this GAG is preferably HA. In addition, the fluorescent substance in “GAG to which fluorescent substance is bound” is preferably bonded to the carboxyl group part of GAG, and this fluorescent substance is preferably fluorescein-5-thiosemicarbazide. The bond between the fluorescent substance and GAG in “bonded GAG” is preferably a covalent bond.
The measuring agent of the present invention is not particularly limited as long as it contains at least such “GAG to which a fluorescent substance is bound”, and further a pharmaceutically or reagent acceptable carrier (for example, a buffer or a stabilizer). ) May be included. Alternatively, it may be in the form of a kit set with a component (for example, PBS, standard GAG degrading enzyme) other than “GAG to which a fluorescent substance is bound” used for measuring the activity of GAG degrading enzyme.
本発明測定剤は、前記の本発明測定方法に従って使用することができる。
＜３＞本発明誘導体
本発明誘導体は、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドとＨＡとが共有結合していることを特徴とする、ＨＡ誘導体又はその塩である。
The measuring agent of the present invention can be used according to the above-described measuring method of the present invention.
<3> Derivative of the present invention The derivative of the present invention is an HA derivative or a salt thereof, characterized in that fluorescein-5-thiosemicarbazide and HA are covalently bonded.
フルオレセイン−５−チオセミカルバジドとＨＡとを共有結合させる方法としては、
ＥＤＣのような水溶性カルボジイミドの存在下で、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドに存在するアミノ基やヒドラジノ基を、ＨＡ上のカルボキシル基に結合させる方法が例示される。
As a method of covalently binding fluorescein-5-thiosemicarbazide and HA,
An example is a method in which an amino group or hydrazino group present in fluorescein-5-thiosemicarbazide is bonded to a carboxyl group on HA in the presence of a water-soluble carbodiimide such as EDC.
なかでも、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドのヒドラジノ基とＨＡのカルボキシル基とがヒドラジド結合していることが好ましい。 Especially, it is preferable that the hydrazino group of fluorescein-5-thiosemicarbazide and the carboxyl group of HA are hydrazide-bonded.
「塩」としては、例えばアルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩や、ジエタノールアミン塩、シクロへキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩などが例示される。 Examples of the “salt” include salts with inorganic bases such as alkali metal salts (sodium salts, lithium salts, potassium salts, etc.), alkaline earth metal salts, ammonium salts, diethanolamine salts, cyclohexylamine salts, amino acid salts, etc. And salts with organic bases.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
＜１＞材料
以下に、本実施例で用いた材料を説明する。
ＭＥＳ溶液：２．１ ｇのＭＥＳ（同仁化学製）を１００ ｍｌの蒸留水に溶解し、５ Ｍの水酸化カリウムでｐＨ ５．５に調整し、これを０．２２ μｍ 孔径のフィルター（ミリポア社製）を用いて濾過滅菌した。
ＥＤＣ溶液：ＥＤＣ（ＳＩＧＭＡ社製）を０．１ Ｍ ＭＥＳ溶液に溶解し、１００ ｍｇ/ｍｌに調製した。
ＨＡ：以下の３種類のＨＡを用いた。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
<1> Materials The materials used in this example are described below.
MES solution: 2.1 g of MES (manufactured by Dojindo Chemical Co., Ltd.) was dissolved in 100 ml of distilled water, adjusted to pH 5.5 with 5 M potassium hydroxide, and this was adjusted to a 0.22 μm pore size filter (Millipore And sterilized with a filter.
EDC solution: EDC (manufactured by SIGMA) was dissolved in a 0.1 M MES solution to prepare 100 mg / ml.
HA: The following three types of HA were used.
ブタ皮由来の重量平均分子量４万〜６万のＨＡ（生化学工業株式会社製。以下、「ＨＡ−Ｌ」という。）。 HA having a weight average molecular weight of 40,000 to 60,000 derived from pig skin (manufactured by Seikagaku Corporation, hereinafter referred to as “HA-L”).
鶏冠由来の重量平均分子量約９０万のＨＡ（生化学工業株式会社製。以下、「ＨＡ−Ｈ１」という。）。 HA with a weight average molecular weight of about 900,000 derived from chicken crown (manufactured by Seikagaku Corporation. Hereinafter referred to as “HA-H1”).
鶏冠由来の重量平均分子量約９０万のＨＡ製剤（商品名：アルツ、生化学工業株式会社製。以下、「ＨＡ−Ｈ２」という。）
ＣＨ：サメ軟骨由来のＣＨ（生化学工業株式会社製）。
＜２＞方法と結果
１．本発明誘導体の調製
ＧＡＧ（ＨＡ−Ｌ、ＨＡ−Ｈ１、ＨＡ−Ｈ２及びＣＨ）を、それぞれ終濃度が１０ ｍｇ/ｍｌになるように０．１ Ｍ ＭＥＳに溶解し、ＧＡＧ溶液を調製した。このＧＡＧ溶液 １ ｍｌに、５０ ｍＭ フルオレセイン−５−チオセミカルバジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製） １００ μｌ、１００ ｍｇ/ｍｌ ＥＤＣ ５０ μｌを加え、混合溶液を調製した。この混合溶液を室温で一晩インキュベートした後、１４０００ ｒｐｍ、室温で１０分間遠心し、少量の沈殿を得た。上清を新しいチューブに移した後、室温で１〜２日間ＰＢＳに対して透析し（時折ＰＢＳを交換する）、遊離のフルオレセイン−５−チオセミカルバジドを除き、本発明誘導体（フルオレセイン−５−チオセミカルバジドのヒドラジノ基がＨＡのカルボキシル基にヒドラジド結合しているＨＡ）を得た。
HA formulation having a weight average molecular weight of about 900,000 derived from chicken crown (trade name: Alz, manufactured by Seikagaku Corporation. Hereinafter, referred to as “HA-H2”.)
CH: CH derived from shark cartilage (Seikagaku Corporation).
<2> Method and result Preparation of derivative of the present invention GAG (HA-L, HA-H1, HA-H2 and CH) was dissolved in 0.1 M MES so that the final concentration was 10 mg / ml, respectively, to prepare a GAG solution. To 1 ml of this GAG solution, 100 μl of 50 mM fluorescein-5-thiosemicarbazide (Molecular Probes) and 50 μl of 100 mg / ml EDC were added to prepare a mixed solution. This mixed solution was incubated at room temperature overnight, and then centrifuged at 14000 rpm at room temperature for 10 minutes to obtain a small amount of precipitate. The supernatant was transferred to a new tube and then dialyzed against PBS for 1-2 days at room temperature (sometimes changing the PBS) to remove free fluorescein-5-thiosemicarbazide and to remove the derivative of the present invention (fluorescein-5-thio) HA) in which the hydrazino group of semicarbazide is hydrazide-bonded to the carboxyl group of HA was obtained.
この本発明誘導体を蒸留水に希釈し、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した結果、ＧＡＧにフルオレセイン−５−チオセミカルバジドが結合していることが確認された。
２．蛍光偏光装置を用いたＨＡａｓｅの活性測定
蛍光標識されたＧＡＧ（ＨＡ−Ｈ１又はＣＨ）各２０ μl、５Ｍ ＮａＣｌ ３μl（終濃度１５０ｍＭ）、３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ ５〜ｐＨ ６）１．７μl（終濃度５０ｍＭ）、及び、種々のレベルの活性を有するＨＡａｓｅ溶液を混合し、１００ μlの混合溶液を調製した。この混合溶液を３７℃で４時間インキュベートして酵素反応させた。
As a result of diluting this derivative of the present invention in distilled water and measuring the absorbance at 492 nm, it was confirmed that fluorescein-5-thiosemicarbazide was bound to GAG.
2. Measurement of HAase activity using a fluorescence polarization apparatus Fluorescently labeled GAG (HA-H1 or CH) 20 μl each, 5 M NaCl 3 μl (final concentration 150 mM), 3 M sodium acetate (pH 5 to pH 6) 1.7 μl (final) HAase solution having a concentration of 50 mM) and various levels of activity were mixed to prepare 100 μl of a mixed solution. This mixed solution was incubated at 37 ° C. for 4 hours to cause an enzyme reaction.
反応後の溶液を、ＰＢＳで１００〜５００倍に希釈して十分に撹拌した。撹拌後、この溶液を蛍光偏光システム（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ社製）に付し、ｍＰ値を測定した。 The solution after the reaction was diluted 100 to 500 times with PBS and sufficiently stirred. After stirring, this solution was subjected to a fluorescence polarization system (manufactured by Associates of Cape Cod), and the mP value was measured.
ＨＡａｓｅの活性と検出されたｍＰ値との関係を図１及び図２に示す。図中の丸印は蛍光標識されたＨＡ−Ｈ１を用いた結果を、四角印は蛍光標識されたＣＨを用いた結果を示す。その結果、ＨＡ−Ｈ１とＣＨのいずれを用いた場合においても、ＨＡａｓｅの活性と検出されたｍＰ値との間には高い相関性が見られた。特にＨＡａｓｅの活性が０〜１００単位の範囲では、直線的な相関（相関係数：０．９５〜０．９８）が見られた。 The relationship between the activity of HAase and the detected mP value is shown in FIG. 1 and FIG. The circles in the figure indicate the results using fluorescently labeled HA-H1, and the squares indicate the results using fluorescently labeled CH. As a result, in either case of using HA-H1 or CH, a high correlation was observed between the activity of HAase and the detected mP value. In particular, a linear correlation (correlation coefficient: 0.95 to 0.98) was observed in the HAase activity range of 0 to 100 units.
したがって本発明方法によって、ＧＡＧ分解酵素の活性を測定できることが示された。また、図１及び図２は、そのまま検量線として用いることができる。 Therefore, it was shown that the activity of GAG degrading enzyme can be measured by the method of the present invention. Moreover, FIG.1 and FIG.2 can be used as a calibration curve as it is.
また、０〜１００単位のＨＡａｓｅを用いてこの測定を３回行った結果を、標準誤差とともに図３に示す。図中の斜線の棒グラフはＨＡ−Ｈ１の結果を、白抜きの棒グラフはＣＨの結果をそれぞれ示す。０．１単位のＨＡａｓｅを用いたＣＨの結果と、１００単位のＨＡａｓｅを用いたＨＡ−Ｈ１の結果については、実施していないため表示していない。図３より、本発明方法は、再現性及び正確性が高い方法であることが示された。 Moreover, the result of having performed this measurement 3 times using 0-100 unit HAase is shown in FIG. 3 with a standard error. In the figure, the hatched bar graph shows the result of HA-H1, and the open bar graph shows the result of CH. The results of CH using 0.1 units of HAase and the results of HA-H1 using 100 units of HAase are not displayed because they are not implemented. From FIG. 3, it was shown that the method of the present invention is a method with high reproducibility and accuracy.
また、蛍光標識されたＨＡとして、蛍光標識されたＨＡ−Ｌ及びＨＡ−Ｈ２を用いて同様に測定した結果、いずれも蛍光標識されたＨＡ−Ｈ１を用いた場合と同様の結果が得られた。 Moreover, as a result of measuring in the same manner using fluorescently labeled HA-L and HA-H2 as fluorescently labeled HA, the same results as in the case of using fluorescently labeled HA-H1 were obtained. .
本発明方法は、簡便、迅速、安価かつ高感度なＧＡＧ分解酵素活性の測定に利用することができる。また本発明測定剤は、本発明方法のより簡便かつ迅速な実施に利用することができる。また本発明誘導体は、本発明方法や本発明測定剤の有効成分等として利用することができる。 The method of the present invention can be used for measurement of GAG-degrading enzyme activity which is simple, rapid, inexpensive and highly sensitive. Moreover, this invention measuring agent can be utilized for simpler and quick implementation of this invention method. Moreover, this invention derivative | guide_body can be utilized as an active ingredient etc. of this invention method or this invention measuring agent.
Claims (14)
ステップ（Ａ）：「蛍光物質が結合したグリコサミノグリカン」と検体を接触させ、当該グリコサミノグリカンに検体中のグリコサミノグリカン分解酵素を作用させるステップ。
ステップ（Ｂ）：前記作用後のグリコサミノグリカンを蛍光偏光分析法によって検出するステップ。
ステップ（Ｃ）：ステップ（Ｂ）で得られた検出結果と、検体中のグリコサミノグリカン分解酵素の活性とを関連づけるステップ。 A method for measuring the activity of a glycosaminoglycan-degrading enzyme in a specimen, comprising at least all the following steps (A) to (C).
Step (A): A step of bringing a specimen into contact with a “glycosaminoglycan to which a fluorescent substance is bound”, and allowing the glycosaminoglycan-degrading enzyme in the specimen to act on the glycosaminoglycan.
Step (B): a step of detecting glycosaminoglycan after the action by fluorescence polarization analysis.
Step (C): A step of associating the detection result obtained in Step (B) with the activity of glycosaminoglycan degrading enzyme in the specimen.
The hyaluronic acid derivative or a salt thereof according to claim 13, wherein the hydrazino group of fluorescein-5-thiosemicarbazide and the carboxyl group of hyaluronic acid are hydrazide-bonded.
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| US9750827B2 (en) | 2013-02-22 | 2017-09-05 | Canon Kabushiki Kaisha | Near-infrared dye-conjugated hyaluronic acid derivative and contrast agent for optical imaging including them |
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| US20020115071A1 (en) * | 2001-01-04 | 2002-08-22 | Insight Strategy & Marketing Ltd. | High throughput assay for monitoring polycation or polyanion molecular weight, degradation or synthesis |
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