JP2006014653A - Kit for detecting gene polymorphism - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒトから採取したゲノムＤＮＡにおけるビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）遺伝子の遺伝子多型（ＳＮＰ）の検出を簡便に行うことが出来る遺伝子多型検出キット関する。好ましくは、エストロゲン受容体（ＥＲ）遺伝子のＳＮＰと同時に検出する遺伝子多型検出キットであり、さらに好ましくは、多剤耐性（ＭＤＲＩ）遺伝子のエクソン１２の１２３６番目、エクソン２１の２６７７番目およびエクソン２６の３４３５番目のＳＮＰをも同時に検出することができる遺伝子多型検出キットに関する。
The present invention relates to a gene polymorphism detection kit that can easily detect a gene polymorphism (SNP) of a vitamin D receptor (VDR) gene in genomic DNA collected from a human. Preferably, it is a gene polymorphism detection kit that detects simultaneously with the SNP of the estrogen receptor (ER) gene, and more preferably, the 1236th of exon 12 of the multidrug resistance (MDRI) gene, the 2677th of
従来、特定の病気には特定の薬剤を投与するのが主であるが、患者によって薬剤の効果に差がある上に、場合によっては副作用が発生する可能性もある。
近年、患者の体質や環境、病態などを調べ、複数存在する薬剤のうちどの薬剤が最も効果的であるか、または薬剤投与後の副作用が将来起こる可能性があるかどうかを、薬剤投与前に予測し、患者に最適な医療を提供するテーラーメイド医療が注目を浴びている。特に、高血圧や癌、糖尿病など、生活習慣病の３〜４割は、遺伝的な要因によるものであるとされている。このような遺伝的な要因として、ヒトの遺伝子において塩基配列が個人によって異なる箇所が存在することが挙げられる。このような個人による特定の箇所の遺伝子配列の差は遺伝子多型と呼び、特に１箇所のみの塩基配列がことなることを一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、以下ＳＮＰ）と呼ぶ。
Conventionally, a specific drug is mainly administered for a specific disease, but the effect of the drug varies depending on patients, and in some cases, side effects may occur.
In recent years, the patient's constitution, environment, pathological condition, etc. have been examined, and before the drug is administered, which of the multiple drugs is most effective or whether side effects after drug administration are likely to occur in the future. Tailor-made medical care that predicts and provides optimal medical care to patients is attracting attention. In particular, 30 to 40% of lifestyle-related diseases such as high blood pressure, cancer, and diabetes are due to genetic factors. As such a genetic factor, there is a place where a human gene has a different base sequence depending on an individual. Such a difference in gene sequence at a specific location by an individual is referred to as a gene polymorphism, and in particular, a single nucleotide polymorphism (hereinafter referred to as a SNP) is referred to as a single nucleotide polymorphism.
ステロイド剤は、効能の強さゆえに膠原病や皮膚炎など様々な分野で治療薬として使用される。特に臓器移植や一部の膠原病の治療などの際に大量に投与する。その反面、易感染、糖尿病、高血圧、緑内障などのさまざまな副作用が生じる可能性も高く、使用においては厳重な注意が必要とされる。
これらの副作用の一つとして、ステロイド性の骨疾患があげられる。ステロイド投与による続発性の骨粗鬆症は、ステロイド性骨粗鬆症と呼ばれ、患者数は１００万人ともいわれている。
また、大腿骨頭壊死症の半数も、ステロイド投与の副作用が原因といわれている。
骨粗鬆症・大腿骨頭壊死症などは、寝たきり・歩行不能などの症状を伴い、深刻な社会問題となっている。
Steroids are used as therapeutic agents in various fields such as collagen disease and dermatitis because of their high efficacy. It is administered in large doses especially for organ transplantation and treatment of some collagen diseases. On the other hand, various side effects such as easy infection, diabetes, hypertension and glaucoma are likely to occur, and strict attention is required in use.
One of these side effects is steroidal bone disease. Secondary osteoporosis caused by steroid administration is called steroidal osteoporosis, and the number of patients is said to be 1 million.
Half of the femoral head necrosis is also said to be caused by side effects of steroid administration.
Osteoporosis and femoral head necrosis are serious social problems accompanied by symptoms such as bedridden and inability to walk.
原発性の骨粗鬆症とＳＮＰ検知によるテーラーメイド医療の研究としては、骨粗鬆症の治療薬の選択方法が挙げられる。骨粗鬆症の治療薬には、ビタミンＤ、ビタミンＫおよびエストロゲンなど複数存在する。これらの薬剤のうち、どの薬剤が骨粗鬆症の治療の際に最も効果的であるかを予測する方法が開示されている（特許文献１〜５）。
Research on tailor-made medicine by primary osteoporosis and SNP detection includes a method for selecting a therapeutic agent for osteoporosis. There are a plurality of osteoporosis therapeutic agents such as vitamin D, vitamin K, and estrogen. Among these drugs, a method for predicting which drug is most effective in the treatment of osteoporosis is disclosed (
一方で、ステロイド性骨粗鬆症に関するテーラーメイド医療の研究は、これからの領域であるが、ＭＤＲ１遺伝子や、ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型などが候補としてあげられている。（特許文献６） On the other hand, research on tailor-made medical treatment for steroidal osteoporosis is a future area, but MDR1 gene, vitamin D receptor gene, gene polymorphism of estrogen receptor gene and the like are listed as candidates. (Patent Document 6)
以上の問題より、ステロイド性骨疾患に対するテーラーメイド医療は非常に有効である。上記ステロイド性骨疾患に関連するＳＮＰの候補は幾つか存在し、具体的には、ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ切断部位におけるＳＮＰが近年注目されており、他にはエストロゲン受容体（ＥＲ）遺伝子のＸｂａ−Ｉ切断部位におけるＳＮＰ、多剤耐性（ＭＤＲ１）遺伝子の１２３６番目、２６７７番目および３４３５番目のＳＮＰなども参考にすることができる。
したがって、上記ＳＮＰ、主にＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ切断部位におけるＳＮＰを容易に検知することが出来るキットの開発が求められている。
From the above problems, tailor-made medical treatment for steroidal bone disease is very effective. There are several SNP candidates related to the steroidal bone disease. Specifically, SNPs at the Fok-I cleavage site of the VDR gene have recently attracted attention, and others include the estrogen receptor (ER) gene. SNPs at the Xba-I cleavage site, 1236th, 2677th and 3435th SNPs of the multidrug resistance (MDR1) gene can also be referred to.
Therefore, development of a kit that can easily detect the SNP, mainly the SNP at the Fok-I cleavage site of the VDR gene, is required.
本発明は、
（１） ヒトから採取した生体試料中に含むゲノムＤＮＡにおける遺伝子多型（ＳＮＰ）を検出するキットであって、少なくとも配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群を含んでなる遺伝子多型検出キット、
（２） 少なくとも下記の（i）または(ii)のプローブ群を含んでなる（１）に記載の遺伝子多型検出キット；
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群、
（３） 少なくとも下記の（i）〜（v）のプローブ群を含んでなる（１）に記載の遺伝子多型検出キット；
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号５のＤＮＡおよび配列番号６のＤＮＡからなる第３のプローブ群：
（iv）配列番号７のＤＮＡ、配列番号８のＤＮＡおよび配列番号９のＤＮＡからなる第４のプローブ群：
（v）配列番号１０のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第５のプローブ群。
（４） プローブ群が坦体表面上に固定化された検出ストリップを含んでなる（１）に記載の遺伝子多型検出キット、
（５） 坦体が、ビニル系ポリマーまたはポリエステルである（４）に記載の遺伝子多型検出キット。
（６） 坦体が、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンまたはポリエチレンテレフタレートである（４）に記載の遺伝子多型検出キット、
（７） 少なくとも配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第１のプライマー対を含んでなる（１）に記載の遺伝子多型検出キット、
（８） 少なくとも下記の(i)および(ii)を含んでなる（７）に記載の遺伝子多型検出キット；
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第２のプライマー対、
（９） 少なくとも下記の（i）〜（v）のＤＮＡを含んでなる（７）に記載の遺伝子多型検出キット：
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第２のプライマー対：
（iii）配列番号５のＤＮＡおよび配列番号６のＤＮＡからなる第３のプローブ群、ならびに配列番号１６のＤＮＡおよび配列番号１７のＤＮＡからなる第３のプライマー対：
（iv）配列番号７のＤＮＡ、配列番号８のＤＮＡおよび配列番号９のＤＮＡからなる第４のプローブ群、ならびに配列番号１８のＤＮＡおよび配列番号１９のＤＮＡからなる第４のプライマー対：
（v）配列番号１０のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第５のプローブ群、ならびに配列番号２０のＤＮＡおよび配列番号２１のＤＮＡからなる第５のプライマー対、
（１０） 配列番号１２〜２１のＤＮＡ、配列番号１２、１４、１６、１８および２０のＤＮＡ、または配列番号１３、１５、１７、１９および２１のＤＮＡに、蛍光物質または放射性同位体を修飾した（９）に記載の遺伝子多型検出キット。
（１１） 配列番号１２〜２１のＤＮＡ、配列番号１２、１４、１６、１８および２０のＤＮＡ、または配列番号１３、１５、１７、１９および２１のＤＮＡの５’末端に、ビオチンを修飾した（９）に記載の遺伝子多型検出キット、
（１２） さらに、ストレプトアビジン、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ ｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）を含む（１１）に記載の遺伝子多型検出キットに関する。
The present invention
(1) A kit for detecting a gene polymorphism (SNP) in genomic DNA contained in a biological sample collected from a human, comprising at least a first probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 1 and DNA of SEQ ID NO: 2 A gene polymorphism detection kit consisting of
(2) The gene polymorphism detection kit according to (1), comprising at least the following probe group (i) or (ii):
(I) First probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 1 and DNA of SEQ ID NO: 2:
(Ii) a second probe group comprising DNA of SEQ ID NO: 3 and DNA of SEQ ID NO: 4,
(3) The gene polymorphism detection kit according to (1), comprising at least the following probe groups (i) to (v):
(I) First probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 1 and DNA of SEQ ID NO: 2:
(Ii) Second probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 3 and DNA of SEQ ID NO: 4:
(Iii) Third probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 5 and DNA of SEQ ID NO: 6:
(Iv) Fourth probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 7, DNA of SEQ ID NO: 8 and DNA of SEQ ID NO: 9:
(V) A fifth probe group consisting of the DNA of SEQ ID NO: 10 and the DNA of SEQ ID NO: 11.
(4) The gene polymorphism detection kit according to (1), wherein the probe group comprises a detection strip immobilized on the carrier surface,
(5) The genetic polymorphism detection kit according to (4), wherein the carrier is a vinyl polymer or polyester.
(6) The gene polymorphism detection kit according to (4), wherein the carrier is polyethylene, polypropylene, polystyrene, or polyethylene terephthalate,
(7) (1) comprising at least a first probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 1 and DNA of SEQ ID NO: 2, and a first primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 12 and DNA of SEQ ID NO: 13 The gene polymorphism detection kit described,
(8) The gene polymorphism detection kit according to (7), comprising at least the following (i) and (ii):
(I) a first probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 1 and DNA of SEQ ID NO: 2, and a first primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 12 and DNA of SEQ ID NO: 13:
(Ii) a second probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 3 and DNA of SEQ ID NO: 4, and a second primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 14 and DNA of SEQ ID NO: 15;
(9) The gene polymorphism detection kit according to (7), comprising at least the following DNAs (i) to (v):
(I) a first probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 1 and DNA of SEQ ID NO: 2, and a first primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 12 and DNA of SEQ ID NO: 13:
(Ii) a second probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 3 and DNA of SEQ ID NO: 4, and a second primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 14 and DNA of SEQ ID NO: 15:
(Iii) a third probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 5 and DNA of SEQ ID NO: 6, and a third primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 16 and DNA of SEQ ID NO: 17:
(Iv) a fourth probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 7, DNA of SEQ ID NO: 8 and DNA of SEQ ID NO: 9, and a fourth primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 18 and DNA of SEQ ID NO: 19:
(V) a fifth probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 10 and DNA of SEQ ID NO: 11, and a fifth primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 20 and DNA of SEQ ID NO: 21;
(10) A fluorescent substance or a radioisotope was modified to the DNAs of SEQ ID NOs: 12 to 21, the DNAs of SEQ ID NOs: 12, 14, 16, 18 and 20, or the DNAs of SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19 and 21 The gene polymorphism detection kit according to (9).
(11) Biotin was modified at the 5 ′ end of DNAs of SEQ ID NOs: 12 to 21, DNAs of SEQ ID NOs: 12, 14, 16, 18 and 20, or DNAs of SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19 and 21 ( 9) the genetic polymorphism detection kit according to
(12) The gene polymorphism detection kit according to (11), further comprising streptavidin, nitroblue tetrazolium (NBT) and 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatase p-toluidinyl salt (BCIP).
本発明は、ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ切断部位におけるＳＮＰの検知を容易に可能とするとともに、好ましくは、エストロゲン受容体（ＥＲ）遺伝子のＸｂａ−Ｉ切断部位におけるＳＮＰとの計２箇所同時検出、さらに好ましくは多剤耐性（ＭＤＲ１）遺伝子の１２３６番目、２６７７番目および３４３５番目のＳＮＰを含めた計５箇所同時検出が可能であり、ステロイド投与の後に将来人がステロイド性骨疾患になる可能性を予測できる。 The present invention enables easy detection of SNPs at the Fok-I cleavage site of the VDR gene, and preferably, simultaneous detection of a total of two sites with SNPs at the Xba-I cleavage site of the estrogen receptor (ER) gene. More preferably, a total of five sites including the 1236th, 2677th and 3435th SNPs of the multidrug resistance (MDR1) gene can be detected simultaneously, and the possibility of future human steroid bone disease after steroid administration Predictable.
本発明は、ヒトから採取した生体試料中に含むゲノムＤＮＡにおけるＳＮＰを検出するキットである。本発明における生体試料とは、血液、唾液または毛髪などが挙げられ、好ましくは、血球細胞、表皮細胞および粘膜細胞などの各種ヒト細胞である。これらの生体試料からＤＮＡを抽出する方法は、公知の方法で行うことができ、例えばフェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法、バナジルリボヌクレオシド複合抽出法等が公知である。 The present invention is a kit for detecting SNPs in genomic DNA contained in a biological sample collected from a human. Examples of the biological sample in the present invention include blood, saliva, and hair, and preferably various human cells such as blood cells, epidermal cells and mucosal cells. Methods for extracting DNA from these biological samples can be performed by known methods, for example, phenol extraction method, guanidine thiocinate extraction method, vanadyl ribonucleoside complex extraction method and the like.
本発明の遺伝子多型検出キットは、少なくとも配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群を含んでなる。該プローブは、市販されているＤＮＡ／ＲＮＡ合成機などによって合成することができ、その合成方法は限定されるものではなく、以下に説明する全てのプローブおよびプライマーも同様である。 The gene polymorphism detection kit of the present invention comprises a first probe group consisting of at least the DNA of SEQ ID NO: 1 and the DNA of SEQ ID NO: 2. The probe can be synthesized by a commercially available DNA / RNA synthesizer or the like, and the synthesis method is not limited, and all probes and primers described below are the same.
配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡは、ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ多型を検出するためプローブである。ＶＤＲ遺伝子は、第１２染色体上に存在する。Ｆｏｋ−Ｉとは、塩基配列ＧＧＡＴＧを認識する公知の制限酵素であり、ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ多型とは、ＶＤＲ遺伝子におけるエクソン２のＦｏｋ−Ｉ認識部位（ＧＧＡＴＧ）を含むＤＮＡと、該Ｆｏｋ−Ｉ認識部位の配列がＦｏｋ−Ｉでは認識されない配列（ＧＧＡＣＧ）を含むＤＮＡの２種類が存在することを意味する。配列番号１のＤＮＡプローブは、Ｆｏｋ−Ｉ認識部位（ＧＧＡＴＧ）を含むＤＮＡを検知できるものであり、配列番号２のＤＮＡプローブは、該Ｆｏｋ−Ｉ認識部位の配列がＦｏｋ−Ｉでは認識されない配列（ＧＧＡＣＧ）を含むＤＮＡを検知できるものである。以下、本明細書では、配列番号１のＤＮＡプローブで認識できるＤＮＡ、つまり、Ｆｏｋ−Ｉ認識部位（ＧＧＡＴＧ）を含み、Ｆｏｋ−Ｉで切断されるＤＮＡを「ｆ」、配列番号２のＤＮＡプローブで認識できるＤＮＡ、つまり、該Ｆｏｋ−Ｉ認識部位の配列がＦｏｋ−Ｉでは認識されない配列（ＧＧＡＣＧ）を含み、Ｆｏｋ−Ｉで切断されないＤＮＡを「Ｆ」と略す。そして、ヒトの染色体は二量体であることから、ＦＦ型、Ｆｆ型およびｆｆ型の３タイプのＳＮＰが存在する。
The DNA of SEQ ID NO: 1 and the DNA of SEQ ID NO: 2 are probes for detecting the Fok-I polymorphism of the VDR gene. The VDR gene is present on chromosome 12. Fok-I is a known restriction enzyme that recognizes the base sequence GGATG. The Fok-I polymorphism of the VDR gene is a DNA containing the Fok-I recognition site (GGATG) of
さらに、本発明の遺伝子多型検出キットは、ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ多型に加え、ＥＲ遺伝子のＸｂａ−Ｉ多型も同時に検出できることが好ましい。ＥＲ遺伝子は、第６染色体上に存在する。Ｘｂａ−Ｉとは、塩基配列ＴＣＴＡＧＡを認識する公知の制限酵素であり、ＥＲ遺伝子のＸｂａ−Ｉ多型とは、ＥＲ遺伝子におけるエクソン１およびエクソン２の間のイントロン領域におけるＸｂａ−Ｉ認識部位（ＴＣＴＡＧＡ）を含むＤＮＡと、該Ｘｂａ−Ｉ認識部位の配列がＸｂａ−Ｉでは認識されない配列（ＴＣＴＡＧＡ）を含むＤＮＡの２種類が存在することを意味する。
Furthermore, it is preferable that the gene polymorphism detection kit of the present invention can simultaneously detect the Xba-I polymorphism of the ER gene in addition to the Fok-I polymorphism of the VDR gene. The ER gene is present on
したがって、本発明の遺伝子多型検出キットは、上記の第１のプローブ群に加えて、配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群を含んでなる。
配列番号３のＤＮＡは、Ｘｂａ−Ｉ認識部位（ＴＣＴＡＧＡ）を含むＤＮＡを検知できるものであり、配列番号４のＤＮＡは、該Ｘｂａ−Ｉ認識部位の配列がＸｂａ−Ｉでは認識されない配列（ＴＣＣＡＧＡ）を含むＤＮＡを検知できるものである。以下、本明細書では、配列番号３のＤＮＡプローブで認識できるＤＮＡ、つまり、Ｘｂａ−Ｉ認識部位（ＴＣＴＡＧＡ）の配列を有するＤＮＡを「ｘ」、配列番号２のＤＮＡプローブで認識できるＤＮＡ、つまり、該Ｆｏｋ−Ｉ認識部位の配列がＸｂａ−Ｉでは認識されない配列（ＴＣＣＡＧＡ）を含むＤＮＡを「Ｘ型」と略す。そして、ヒトの染色体は二量体であることから、ＸＸ型、Ｘｘ型およびｘｘ型の３タイプのＳＮＰが存在する。
Therefore, the gene polymorphism detection kit of the present invention comprises a second probe group consisting of the DNA of SEQ ID NO: 3 and the DNA of SEQ ID NO: 4 in addition to the first probe group described above.
The DNA of SEQ ID NO: 3 can detect DNA containing an Xba-I recognition site (TCTAGA), and the DNA of SEQ ID NO: 4 has a sequence (TCCAGA) in which the sequence of the Xba-I recognition site is not recognized by Xba-I. ) Can be detected. Hereinafter, in this specification, DNA that can be recognized by the DNA probe of SEQ ID NO: 3, that is, DNA having the sequence of the Xba-I recognition site (TCTAGA) is “x”, DNA that can be recognized by the DNA probe of SEQ ID NO: 2, A DNA containing a sequence (TCCAGA) in which the sequence of the Fok-I recognition site is not recognized by Xba-I is abbreviated as “X type”. Since human chromosomes are dimers, there are three types of SNPs, XX, Xx, and xx.
さらに、本発明の遺伝子多型検出キットは、上記のＳＮＰに加え、ＭＤＲ１遺伝子における３箇所のＳＮＰも検出するキット、つまり、５箇所同時に検出するキットであることが好ましい。上記ＭＤＲ１遺伝子における３箇所のＳＮＰとは、エクソン１２の１２３６番目、エクソン２１の２６７７番目またはエクソン２６の３４３５番目の塩基の多型である。
Furthermore, the gene polymorphism detection kit of the present invention is preferably a kit that also detects three SNPs in the MDR1 gene in addition to the above SNPs, that is, a kit that simultaneously detects five sites. The three SNPs in the MDR1 gene are polymorphisms of base 1236 of exon 12, 2677 of
エクソン１２の１２３６番目の塩基は、チミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）であることが知られている。ヒトの染色体は二量体であることから、ＴＴ型、ＴＣ型およびＣＣ型の３タイプのＳＮＰが存在する。配列番号５のＤＮＡプローブは、エクソン１２の１２３６番目の塩基がシトシン（Ｃ）の場合に検出することができ、配列番号６のＤＮＡプローブは、エクソン１２の１２３６番目の塩基がチミン（Ｔ）の場合に検出することができる。したがって、配列番号５のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＣＣ型、配列番号６のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＴＴ型、配列番号５および６のＤＮＡプローブの両方で検出される場合はＣＴ型であると容易に検知することができる。 It is known that the 1236th base of exon 12 is thymine (T) or cytosine (C). Since human chromosomes are dimers, there are three types of SNPs: TT, TC, and CC. The DNA probe of SEQ ID NO: 5 can be detected when the 1236th base of exon 12 is cytosine (C), and the DNA probe of SEQ ID NO: 6 has thymine (T) as the 1236th base of exon 12 Can be detected in case. Therefore, when detected only with the DNA probe of SEQ ID NO: 5, when detected only with the DNA probe of SEQ ID NO: 6, when detected with only the DNA probe of SEQ ID NO: 6 It can be easily detected that it is a CT type.
エクソン２１の２６７７番目のＳＮＰを検出することができる。エクソン２１の２６７７番目の塩基は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）もしくはチミン（Ｔ）であることが知られている。ヒトの染色体は二量体であることから、ＧＧ型、ＡＡ型、ＴＴ型、ＧＡ型、ＧＴ型およびＡＴ型の６タイプのＳＮＰが存在する。配列番号７のＤＮＡプローブは、エクソン２１の２６７７番目の塩基がグアニン（Ｇ）の場合に検出することができ、配列番号８のＤＮＡプローブは、エクソン２１の２６７７番目の塩基がアデニン（Ａ）の場合に検出することができ、配列番号９のＤＮＡプローブは、エクソン２１の２６７７番目の塩基がチミン（Ｔ）の場合に検出することができる。したがって、配列番号７のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＧＧ型、配列番号８のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＡＡ型、配列番号９のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＴＴ型、配列番号７および８のＤＮＡプローブで検出される場合はＧＡ型、配列番号７および９のＤＮＡプローブで検出される場合はＧＴ型、配列番号８および９のＤＮＡプローブで検出される場合はＡＴ型であると容易に検知することができる。
The 2677th SNP of
エクソン２６の３４３５番目の塩基は、チミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）であることが知られている。ヒトの染色体は二量体であることから、ＴＴ型、ＴＣ型およびＣＣ型の３タイプのＳＮＰが存在する。配列番号１０のＤＮＡプローブは、エクソン２６の３４３５番目の塩基がチミン（Ｔ）の場合に検出することができ、配列番号１１のＤＮＡプローブは、エクソン２６の３４３５番目の塩基がシトシン（Ｃ）の場合に検出することができる。したがって、配列番号１０のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＣＣ型、配列番号１１のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＴＴ型、配列番号６および１０のＤＮＡプローブ、または配列番号１１のＤＮＡプローブで検出される場合はＣＴ型であると容易に検知することができる。 It is known that the 3435th base of exon 26 is thymine (T) or cytosine (C). Since human chromosomes are dimers, there are three types of SNPs: TT, TC, and CC. The DNA probe of SEQ ID NO: 10 can be detected when the 3435th base of exon 26 is thymine (T), and the DNA probe of SEQ ID NO: 11 has the 3435th base of exon 26 having cytosine (C). Can be detected in case. Therefore, the CC type is detected only with the DNA probe of SEQ ID NO: 10, the TT type is detected only with the DNA probe of SEQ ID NO: 11, the DNA probes of SEQ ID NOS: 6 and 10, or the DNA probe of SEQ ID NO: 11. Can be easily detected as the CT type.
したがって、本発明の遺伝子多型検出キットは、少なくとも下記の（i）〜（v）の全てのプローブ群を含むものである。
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号５のＤＮＡおよび配列番号６のＤＮＡからなる第３のプローブ群：
（iv）配列番号７のＤＮＡ、配列番号８のＤＮＡおよび配列番号９のＤＮＡからなる第４のプローブ群：
（v）配列番号１０のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第５のプローブ群。
Therefore, the gene polymorphism detection kit of the present invention includes at least all the probe groups (i) to (v) below.
(I) First probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 1 and DNA of SEQ ID NO: 2:
(Ii) Second probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 3 and DNA of SEQ ID NO: 4:
(Iii) Third probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 5 and DNA of SEQ ID NO: 6:
(Iv) Fourth probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 7, DNA of SEQ ID NO: 8 and DNA of SEQ ID NO: 9:
(V) A fifth probe group consisting of the DNA of SEQ ID NO: 10 and the DNA of SEQ ID NO: 11.
本発明は、上記のＤＮＡプローブ群を、坦体表面上に物理的または化学的に固定されることで検出ストリップを含む。
坦体は、ビニル系ポリマーまたはポリエステル、より詳しくは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレートもしくはニトロセルロースなどの有機材料、ガラスもしくはシリカなどの無機材料、金もしくは銀などの金属材料などが挙げられ、特に限定されるものではないが、成型加工性が容易である有機材料が好ましく、さらに好ましくは、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル類である。これらの坦体は、発色法での検知において、その発色を見やすくするために白色であることが好ましい。
The present invention includes a detection strip by physically or chemically immobilizing the above-described DNA probe group on a carrier surface.
The carrier is a vinyl polymer or polyester, more specifically, an organic material such as polyethylene, polypropylene, polystyrene, polyethylene terephthalate or nitrocellulose, an inorganic material such as glass or silica, a metal material such as gold or silver, and the like. Although not particularly limited, organic materials that are easy to mold are preferable, and polyesters such as polyethylene terephthalate are more preferable. These carriers are preferably white in order to make the color development easy to see in the detection by the color development method.
これらの坦体表面にＤＮＡプローブを物理的に固定化する方法として、例えば、ポリリジンなどのポリカチオン性の高分子を坦体表面に被覆することで、ポリアニオンであるＤＮＡプローブとの静電相互作用により、固定化の効率を上げることができる、また、プローブＤＮＡに無関係な塩基配列（ポリチミン鎖など）を付加し、ＤＮＡの分子量を増大させることにより固定化の効率をあげることもできる。さらに、担体表面がガラスなどの場合、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤など、担体表面が金などの場合、２−アミノエタンチオールなどのアミノ基を有するチオールもしくはジスルフィド化合物などで坦体表面を処理することで、ポリアニオンであるＤＮＡプローブとの静電相互作用により、固定化の効率が良くなることが知られている。 As a method for physically immobilizing DNA probes on the surface of these carriers, for example, by covering the surface of the carrier with a polycationic polymer such as polylysine, electrostatic interaction with a DNA probe that is a polyanion Thus, the efficiency of immobilization can be increased, and the efficiency of immobilization can be increased by adding a base sequence (such as a polythymine chain) unrelated to the probe DNA and increasing the molecular weight of the DNA. Furthermore, when the carrier surface is glass or the like, a silane coupling agent having an amino group such as aminoethoxysilane, or when the carrier surface is gold or the like, a thiol or disulfide compound having an amino group such as 2-aminoethanethiol is used. It is known that by treating the surface of the carrier, the efficiency of immobilization is improved by electrostatic interaction with a DNA probe that is a polyanion.
一方で、プローブＤＮＡに官能基を導入して化学的に固定化する方法としては、例えば、担体の材料がガラス、シリコンなどの無機材料の場合には、核酸検出用プローブの末端にトリメトキシシラン、トリエトキシシランなどのシランカップリング反応が可能な官能基を修飾し、その溶液に２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄することによることもできる。または、ガラス、シリコンなどの無機材料坦体上に、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤で処理することで、坦体の表面をアミノ化し、末端にカルボン酸を導入したプローブＤＮＡとアミノカップリング反応させることで、固定化する方法などがある。さらに、担体の材料が金、銀などの金属材料の場合、核酸検出用プローブの末端にチオール基、ジスルフィド基などの金属と結合可能な官能基を修飾し、その溶液に２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄し、固定化することができる。 On the other hand, as a method of chemically immobilizing a probe DNA by introducing a functional group, for example, when the carrier material is an inorganic material such as glass or silicon, trimethoxysilane is attached to the end of the nucleic acid detection probe. The functional group capable of silane coupling reaction such as triethoxysilane is modified, immersed in the solution for 24 to 48 hours, taken out, and then washed. Alternatively, probe DNA in which the surface of the carrier is aminated by treatment with a silane coupling agent having an amino group such as aminoethoxysilane on an inorganic material carrier such as glass or silicon, and a carboxylic acid is introduced at the terminal. There is a method of immobilizing by an amino coupling reaction. Further, when the carrier material is a metal material such as gold or silver, a functional group capable of binding to a metal such as a thiol group or a disulfide group is modified at the end of the nucleic acid detection probe and immersed in the solution for 24 to 48 hours. After removal, it can be washed and immobilized.
また、合成されたＤＮＡプローブを固定するのでなく、リソグラフィー技術を利用して、望む配列を固定表面上で直接ＤＮＡプローブを合成する方法も知られており、本発明においてもこの方法も含む。 In addition, a method of synthesizing a DNA probe directly on a fixed surface using a lithography technique instead of fixing a synthesized DNA probe is also known, and this method is also included in the present invention.
ＳＮＰの検出において十分な感度を有するために、予め検出すべきＳＮＰを含むＤＮＡを増幅する必要がある。核酸の増幅は、ヒトの生体試料から抽出されたＤＮＡを公知の方法、例えばＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法またはＩＣＡＮ法等により行うことができ、好適にはＰＣＲ法により行うことができる。 In order to have sufficient sensitivity in detecting SNPs, it is necessary to amplify DNA containing SNPs to be detected in advance. Amplification of nucleic acid can be performed on DNA extracted from a human biological sample by a known method such as PCR, NASBA, LAMP, or ICAN, and preferably by PCR.
上記ＰＣＲ法に用いるプライマーは、ＶＤＲ遺伝子におけるエクソン２のＦｏｋ−Ｉ認識部位（ＧＧＡＴＧ）を含むＤＮＡおよび／または該Ｆｏｋ−Ｉ認識部位の配列がＦｏｋ−Ｉでは認識されない配列（ＧＧＡＣＧ）を含むＤＮＡを増幅することができれば特に限定されるものではないが、増幅すべき核酸の塩基数が１００〜４００塩基対、好ましくは１５０〜３００塩基対である。該プライマーは、市販されているＤＮＡ／ＲＮＡ合成機などによって合成することができ、その合成方法は限定されるものではない。本発明におけるＶＤＲ遺伝子におけるエクソン２のＦｏｋ−Ｉ認識部位（ＧＧＡＴＧ）を含むＤＮＡおよび／または該Ｆｏｋ−Ｉ認識部位の配列がＦｏｋ−Ｉでは認識されない配列（ＧＧＡＣＧ）を含むＤＮＡを増幅するプライマーとしては、配列番号１２および配列番号１３のＤＮＡが好ましい。
Primers used in the PCR method include DNA containing a Fok-I recognition site (GGATG) of
したがって、本発明の遺伝子多型検出キットは、少なくとも配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第１のプライマー対を含んでなる。配列番号１２および１３のＤＮＡは、それぞれＶＤＲ遺伝子におけるエクソン２のＦｏｋ−Ｉ認識部位（ＧＧＡＴＧ）を含むＤＮＡおよび／または該Ｆｏｋ−Ｉ認識部位の配列がＦｏｋ−Ｉでは認識されない配列（ＧＧＡＣＧ）を含むＤＮＡを増幅するフォワードプライマーおよびリバースプライマーである。
Therefore, the gene polymorphism detection kit of the present invention comprises at least a first probe group comprising DNA of SEQ ID NO: 1 and DNA of SEQ ID NO: 2, and a first primer comprising DNA of SEQ ID NO: 12 and DNA of SEQ ID NO: 13. Comprising a pair. The DNAs of SEQ ID NOs: 12 and 13, respectively, contain DNA containing the Fok-I recognition site (GGATG) of
さらに、本発明の遺伝子多型検出キットにおいてＥＲ遺伝子のＸｂａ−Ｉ多型を同時に検知する場合は、ＥＲ遺伝子におけるエクソン１およびエクソン２の間のイントロン領域におけるＸｂａ−Ｉ認識部位（ＴＣＴＡＧＡ）を有するＤＮＡおよび／または該Ｘｂａ−Ｉ認識部位の配列がＸｂａ−Ｉでは認識されない配列（ＴＣＣＡＧＡ）を含むＤＮＡを増幅できるプライマーを含むことが好ましい。該プライマーは、配列番号１４および配列番号１５のＤＮＡが好ましい。
Furthermore, when the Xba-I polymorphism of the ER gene is detected simultaneously in the gene polymorphism detection kit of the present invention, it has an Xba-I recognition site (TCTAGA) in the intron region between
したがって、本発明の遺伝子多型検出キットは、少なくとも以下の（i）および（ii）のＤＮＡを含んでなる。
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群、配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第２のプライマー対。
ここで、配列番号１４および１５のＤＮＡは、それぞれＥＲ遺伝子におけるエクソン１およびエクソン２の間のイントロン領域におけるＸｂａ−Ｉ認識部位（ＴＣＴＡＧＡ）を有するＤＮＡおよび／または該Ｘｂａ−Ｉ認識部位の配列がＸｂａ−Ｉでは認識されない配列（ＴＣＣＡＧＡ）を含むＤＮＡを増幅するフォワードプライマーおよびリバースプライマーである。
Therefore, the gene polymorphism detection kit of the present invention comprises at least the following DNAs (i) and (ii).
(I) a first probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 1 and DNA of SEQ ID NO: 2, first primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 12 and DNA of SEQ ID NO: 13:
(Ii) A second probe group consisting of the DNA of SEQ ID NO: 3 and the DNA of SEQ ID NO: 4, the second primer pair consisting of the DNA of SEQ ID NO: 14 and the DNA of SEQ ID NO: 15.
Here, the DNAs of SEQ ID NOs: 14 and 15 are DNA having an Xba-I recognition site (TCTAGA) in the intron region between
さらに、本発明の遺伝子多型検出キットにおいてＭＤＲ１遺伝子のＳＮＰを検知する場合は、エクソン１２の１２３６番目の塩基、エクソン２１の２６７７番目の塩基およびエクソン２６の３４３５番目の塩基を含むＤＮＡを増幅できるプライマーを含むことが好ましい。該プライマーは、特に配列番号１６〜２１のＤＮＡが好ましい。
Furthermore, when the SNP of the MDR1 gene is detected by the gene polymorphism detection kit of the present invention, DNA containing the 1236th base of exon 12, the 2677th base of
したがって、本発明における遺伝子多型検出キットは少なくとも下記の（i）〜（v）の全てを含む。
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第２のプライマー対：
（iii）配列番号５のＤＮＡおよび配列番号６のＤＮＡからなる第３のプローブ群、ならびに配列番号１６のＤＮＡおよび配列番号１７のＤＮＡからなる第３のプライマー対：
（iv）配列番号７のＤＮＡ、配列番号８のＤＮＡおよび配列番号９のＤＮＡからなる第４のプローブ群、ならびに配列番号１８のＤＮＡおよび配列番号１９のＤＮＡからなる第４のプライマー対：
（v）配列番号１０のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第５のプローブ群、ならびに配列番号２０のＤＮＡおよび配列番号２１のＤＮＡからなる第５のプライマー対。
ここで、配列番号１６および１７のＤＮＡは、それぞれエクソン１２の１２３６番目の塩基を含むＤＮＡを増幅できるフォワードプライマーおよびリバースプライマーであり、配列番号１８および１９のＤＮＡは、それぞれエクソン２１の２６７７番目の塩基を含むＤＮＡを増幅できるフォワードプライマーおよびリバースプライマーであり、配列番号２０および２１のＤＮＡは、それぞれエクソン２６の３４３５番目の塩基を含むＤＮＡを増幅できるフォワードプライマーおよびリバースプライマーである。
Therefore, the gene polymorphism detection kit in the present invention includes at least all of the following (i) to (v).
(I) a first probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 1 and DNA of SEQ ID NO: 2, and a first primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 12 and DNA of SEQ ID NO: 13:
(Ii) a second probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 3 and DNA of SEQ ID NO: 4, and a second primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 14 and DNA of SEQ ID NO: 15:
(Iii) a third probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 5 and DNA of SEQ ID NO: 6, and a third primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 16 and DNA of SEQ ID NO: 17:
(Iv) a fourth probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 7, DNA of SEQ ID NO: 8 and DNA of SEQ ID NO: 9, and a fourth primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 18 and DNA of SEQ ID NO: 19:
(V) a fifth probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 10 and DNA of SEQ ID NO: 11, and a fifth primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 20 and DNA of SEQ ID NO: 21;
Here, the DNAs of SEQ ID NOs: 16 and 17 are forward primers and reverse primers, respectively, that can amplify DNA containing the 1236th base of exon 12, and the DNAs of SEQ ID NOs: 18 and 19 are the 2677th of
上記ＰＣＲ法は公知の手法により核酸を増幅することができる。例えば、（１）２本鎖ゲノムＤＮＡを約９２〜９５℃、約３０秒〜１分間の反応条件で熱処理することにより１本鎖にする変性工程、該１本鎖ＤＮＡのそれぞれに約５０〜６５℃を約２０秒〜１分間の反応条件で、（２）少なくとも２種類の増幅プライマーを結合させることによりＰＣＲの反応開始点となる２本鎖部分を作製するアニール工程、（３）約７０〜７５℃を約２０秒〜５分間の反応条件でＤＮＡポリメラーゼを用いて反応させる鎖伸張工程の（１）〜（３）の工程を通常の方法により２０〜４０回繰り返すことで核酸を増幅することができる。 The PCR method can amplify nucleic acids by a known technique. For example, (1) a denaturation step in which a double-stranded genomic DNA is heat-treated at about 92 to 95 ° C. under reaction conditions of about 30 seconds to 1 minute to form a single strand; (2) An annealing step in which a double-stranded portion serving as a PCR reaction starting point is produced by binding at least two kinds of amplification primers under a reaction condition of 65 ° C. for about 20 seconds to 1 minute, (3) about 70 Nucleic acid is amplified by repeating steps (1) to (3) of the chain extension step of reacting with DNA polymerase under a reaction condition of about 75 seconds at about 75 ° C. for about 20 seconds to 5 minutes by a usual method. be able to.
上記の方法によって増幅した核酸は、ＤＮＡプローブを固定化した坦体表面に接触させ、ＤＮＡハイブリダイゼーションにより反応させる。このハイブリダイゼーション反応によって目的のＤＮＡを検知する。検知の方法としては、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などを用いて検出することができ、これらの検出を容易に行うためには、リバースプライマーに標識したものを用いる。 The nucleic acid amplified by the above method is brought into contact with the surface of the carrier on which the DNA probe is immobilized, and reacted by DNA hybridization. The target DNA is detected by this hybridization reaction. As a detection method, detection can be performed using a radioisotope, a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, and the like. In order to easily detect these, a reverse primer labeled one is used.
上記検知方法の中で特に好ましいのは、比較的安価で容易に実施できるニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ ｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）発色法である。具体的には、上記プライマーの３’または５’末端にアビジンを修飾したものを用いて、核酸を増幅する。５’にアビジンを有する増幅された核酸は、ＤＮＡハイブリダイゼーション後、ストレプイトアビジンに接触させることができ、次いでＮＢＴ、ＢＣＩＰと反応させることにより発光させることができる。 Particularly preferred among the above detection methods is the nitroblue tetrazolium (NBT) / 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatase p-toluidinyl salt (BCIP) color development method which is relatively inexpensive and can be easily carried out. . Specifically, the nucleic acid is amplified by using the above primer with the 3 'or 5' end modified with avidin. The amplified nucleic acid having avidin at 5 'can be contacted with streptavidin after DNA hybridization and then allowed to emit light by reacting with NBT or BCIP.
したがって、本発明は、配列番号１２〜２１のＤＮＡ、配列番号１２、１４、１６、１８および２０のＤＮＡ、または配列番号１３、１５、１７、１９および２１のＤＮＡに蛍光もしくはＲＩ標識を行う、または上記ＤＮＡの５‘末端にビオチンを修飾したプライマーを用いることが好ましい。 Therefore, the present invention performs fluorescence or RI labeling on DNA of SEQ ID NOs: 12 to 21, DNA of SEQ ID NOs: 12, 14, 16, 18 and 20, or DNA of SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19 and 21. Alternatively, it is preferable to use a primer in which biotin is modified at the 5 ′ end of the DNA.
本発明の遺伝子多型キットを用いて検知された遺伝子多型から、ヒトのステロイド剤投与後の骨疾患（ステロイド性骨疾患）が起こる可能性を予想することができる。一般的に、
(a) ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ多型が、ＦＦおよびＦｆ型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、ｆｆ型のヒトはＣＴおよびＴＴ型に比べて副作用が生じやすい。
(b) ＥＲ遺伝子のＸｂａ−Ｉ多型が、ｘｘ型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、ＸＸおよびＸｘ型のヒトは他のＳＮＰに比べて副作用が生じやすい。
(c) ＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２の１２３６番目のＳＮＰが、ＣＴおよびＴＴ型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、ＣＣ型のヒトはＣＴおよびＴＴ型に比べて副作用が生じやすい。
(d) ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１の２６７７番目のＳＮＰが、ＧＴ、ＧＡ、ＴＴ、ＴＡおよびＡＡ型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、ＧＧ型のヒトは他のＳＮＰに比べて副作用が生じやすい。
(e) ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６の３４３５番目のＳＮＰが、ＴＴ型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、ＣＣ型およびＣＴ型のヒトはＴＴ型に比べて副作用が生じやすい。
と言われている。
From the gene polymorphism detected using the gene polymorphism kit of the present invention, the possibility of occurrence of bone disease (steroid bone disease) after administration of a human steroid agent can be predicted. Typically,
(a) FDR-I polymorphism of VDR gene, FF and Ff type humans are less likely to cause side effects of steroids, and ff type humans are more likely to have side effects than CT and TT types.
(b) The Xba-I polymorphism of the ER gene is less likely to cause side effects of steroids in humans of type xx, and humans of types XX and Xx are more likely to have side effects than other SNPs.
(c) The 1236th SNP of exon 12 of the MDR1 gene is less susceptible to side effects of steroids in CT and TT type humans, and side effects are more likely to occur in CC type humans than in CT and TT types.
(d)
(e) The 3435th SNP of exon 26 of the MDR1 gene is less susceptible to side effects of steroids in TT type humans, and side effects are more likely to occur in CC and CT type humans than in TT type.
It is said.
以下に本発明を参考例および実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference examples and examples, but the present invention is not limited to these examples.
（実施例１：ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ多型の検出）
配列番号１および２に示されるＤＮＡプローブ（シグマジェノシスジャパン社提供）の５’末端をターミナルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いて、ポリチミンの付加を行った。具体的には、ターミナル・トランスフェラーゼ（２０ｕｎｉｔ／μｌ）を４μｌ、チミジン三リン酸（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を１０μｌ、配列番号１もしくは２のＤＮＡプローブ（５０ｍＭ）を４μｌ、製品添付のＮＥＢｕｆｆｅｒ４を５μｌ、および製品添付のカコジル酸緩衝液を５μｌ含んだ精製水５０μｌを調製した後、３７℃で４時間反応させ、製品添付の２０＊ＳＳＣ緩衝液５０μｌを加えることで、ポリチミン付加された核酸プローブ２ｐｍｏｌ／μｌを得た。
その後、ポリチミン付加された配列番号１および２の核酸プローブは１．０ｐｍｏｌ／μｌとなるように、製品添付の１０＊ＳＳＣ緩衝液で希釈し、ポリエステル膜（４×０．４ｃｍ）上の別々の場所にそれぞれ０．５μＬずつ塗布し、３１２ｎｍの紫外線を２分間照射して固定化することで、検出ストリップを作成した。
(Example 1: Detection of Fok-I polymorphism of VDR gene)
Polythymine was added to the 5 ′ end of the DNA probe (provided by Sigma Genosys Japan) shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 using a terminal transferase (manufactured by New England Biolab). Specifically, 4 μl of terminal transferase (20 units / μl), 10 μl of thymidine triphosphate (10 pmol / μl), 4 μl of the DNA probe (50 mM) of SEQ ID NO: 1 or 2, 5 μl of NEBuffer 4 attached to the product, and After preparing 50 μl of purified water containing 5 μl of cacodylate buffer attached to the product, react for 4 hours at 37 ° C., and add 50 μl of 20 * SSC buffer attached to the product to add 2 pmol / μl of polythymine-added nucleic acid probe. Got.
Thereafter, the polythymine-added nucleic acid probes of SEQ ID NOS: 1 and 2 are diluted with 10 * SSC buffer attached to the product so that the concentration is 1.0 pmol / μl, and separated on a polyester membrane (4 × 0.4 cm). A detection strip was prepared by applying 0.5 μL each to the place and irradiating with ultraviolet rays of 312 nm for 2 minutes for immobilization.
無作為に選んだ健常な日本人９人から血液を採取し、血球細胞を分画して、フェノール抽出法によりゲノムＤＮＡを抽出精製した。配列番号８に示された塩基配列を有するフォワードプライマーおよび９に示された塩基配列を有し、かつ５’末端にビオチンを結合させたリバースプライマー、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いたＰＣＲ法によりＶＤＲ遺伝子におけるエクソン２のＦｏｋ−Ｉ認識部位（ＧＧＡＴＧ）を含むＤＮＡおよび／または該Ｆｏｋ−Ｉ認識部位の配列がＦｏｋ−Ｉでは認識されない配列（ＧＧＡＣＧ）を含むＤＮＡの増幅を行った。ＰＣＲの反応条件は、変性過程を９４℃、３０秒、アニール過程を５５℃、２０秒、鎖伸長過程を７２℃、２０秒とし、この工程を３０サイクルおこない増幅を行った。
Blood was collected from 9 healthy Japanese people randomly selected, blood cells were fractionated, and genomic DNA was extracted and purified by the phenol extraction method. A forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, a reverse primer having the base sequence shown in 9, and having biotin bound to the 5 ′ end, and Taq DNA polymerase (manufactured by Roche Diagnostics) DNA containing the Fok-I recognition site (GGATG) of
増幅したＤＮＡ溶液２０μＬに、水酸化ナトリウム（５Ｍ）、エチレンジアミン四酢酸（０．０５Ｍ）の溶液（２０μＬ）を加えてよく攪拌し、５分間放置して、増幅したＤＮＡを1本鎖に変性した。この試料溶液中に、ドデシル硫酸ナトリウム（０．０１ｗ／ｖ％）、塩化ナトリウム（１．８ｗ／ｖ％）、クエン酸ナトリウム（１．０ｗ／ｖ％）の溶液（１ｍＬ）および上記検出ストリップ１枚を加え、反応温度４５℃のもとで３０分間振とうして反応させた。その後、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを加え、さらにニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ ｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）を加えて、検出ストリップ上の各プローブと結合した試料に結合したアルカリホスファターゼを発色させた（図１）。また、図１における結果の判定の基準となる模式図を表１に示す。
To 20 μL of the amplified DNA solution, a solution (20 μL) of sodium hydroxide (5 M) and ethylenediaminetetraacetic acid (0.05 M) was added and stirred well, and allowed to stand for 5 minutes to denature the amplified DNA into single strands. . In this sample solution, a solution (1 mL) of sodium dodecyl sulfate (0.01 w / v%), sodium chloride (1.8 w / v%), sodium citrate (1.0 w / v%) and the
２：Ｆ型検出部位
３：ｆ型検出部位
●：発色
図１の結果から試料Ｎｏ．１〜９は、それぞれ表２に示す遺伝子多型（ＳＮＰ）を有すると判定した。 From the results of FIG. 1 to 9 were determined to have the gene polymorphisms (SNPs) shown in Table 2, respectively.
また、試料Ｎｏ．１〜９を別途でシーケンサーによるＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ多型を測定した結果は、表２の結果と一致することから、本発明の遺伝子多型検出キットおよび方法は非常に有用であることが示された。 Sample No. The results of measuring Fok-I polymorphism of the VDR gene by using a sequencer separately for 1 to 9 are consistent with the results of Table 2, so that the gene polymorphism detection kit and method of the present invention are very useful. Indicated.
（実施例２：５箇所のＳＮＰの同時検出）
次に、配列番号１〜１１のＤＮＡプローブを固定化した検出ストリップ上を作成した。実施例１と同じ日本人９人の血液から、ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ多型、ＥＲ遺伝子のＸｂａ−Ｉ多型、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２の１２３６番目、エクソン２１の２６７７番目、エクソン２６の３４３５番目の５箇所のＳＮＰの同時検知を行った。ＰＣＲ法におけるプライマーは、配列番号１２〜２１を用い、実施例１同様の条件で行った。検出は、それぞれの増幅したＤＮＡの溶液を２０μＬとした以外は実施例１と同様とした。その結果を図２に示す。また、図２おける結果の判定の基準となる模式図を表３に示す。
(Example 2: Simultaneous detection of 5 SNPs)
Next, a detection strip on which the DNA probes of SEQ ID NOs: 1 to 11 were immobilized was prepared. From the blood of nine Japanese people as in Example 1, the VDR gene Fok-I polymorphism, the ER gene Xba-I polymorphism, the MDR1 gene exon 12, 1236th,
１：発色の確認マーカー
２：ＭＤＲ１遺伝子３４３５番目のＣ型検出部位
３：ＭＤＲ１遺伝子３４３５番目のＴ型検出部位
４：ＭＤＲ１遺伝子２６７７番目のＧ型検出部位
５：ＭＤＲ１遺伝子２６７７番目のＴ型検出部位
６：ＭＤＲ１遺伝子２６７７番目のＡ型検出部位
７：ＭＤＲ１遺伝子１２３６番目のＣ型検出部位
８：ＭＤＲ１遺伝子１２３６番目のＴ型検出部位
９：ＥＲ遺伝子のＸ型検出部位
１０：ＥＲ遺伝子のｘ型検出部位
１１：ＶＤＲ遺伝子のＦ型検出部位
１２：ＶＤＲ遺伝子のｆ型検出部位
●：発色
1: Marking confirmation marker 2: MDR1 gene 3435th C type detection site 3: MDR1 gene 3435th T type detection site 4: MDR1 gene 2677th G type detection site 5: MDR1 gene 2677th T type detection site 6: MDR1 gene 2677th type A detection site 7: MDR1 gene 1236th type C detection site 8: MDR1 gene 1236th type T detection site 9: X type detection site of ER gene 10: x type detection of ER gene Site 11: F-type detection site of VDR gene 12: F-type detection site of VDR gene ●: Color development
また、図４の結果から試料Ｎｏ．１〜９は、それぞれ表４に示すＳＮＰを有すると判定した。ここで、ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ多型の結果は、実施例１と一致したことを確認した。 Further, from the result of FIG. 1 to 9 were determined to have the SNPs shown in Table 4, respectively. Here, it was confirmed that the Fok-I polymorphism result of the VDR gene was consistent with Example 1.
一方、ＥＲ遺伝子のＸｂａ−Ｉ多型、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２の１２３６番目、エクソン２１の２６７７番目、エクソン２６の３４３５番目それぞれを検知する検出ストリップを実施例１に従って作成し、同９検体の各ＳＮＰを検出した（図３〜６）。その結果は、表４の結果と一致し、同時検出が可能であることを確認した。
On the other hand, detection strips for detecting the Xba-I polymorphism of the ER gene, the 1236th of the exon 12 of the MDR1 gene, the 2677th of the
本発明の遺伝子多型キットは、ＳＮＰを容易に検知することができ、ステロイド投与の後に将来人がステロイド性骨疾患になる可能性を予測できる。そして、ステロイド性骨疾患になる可能性が低い場合は、ステロイド剤を投与し、ステロイド性骨疾患になる可能性が高い場合は、服用を避けることが出来るため、患者への負担を軽減できるのと同時に、医師の責任の追及を問われるケースが少なくなる。 The gene polymorphism kit of the present invention can easily detect SNPs and can predict the possibility of future human steroid bone disease after steroid administration. And if you are less likely to have steroid bone disease, you can administer steroids, and if you are more likely to have steroid bone disease, you can avoid taking it, which can reduce the burden on the patient. At the same time, there are fewer cases where doctors are asked to pursue their responsibilities.
Claims (12)
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群。 The genetic polymorphism detection kit according to claim 1, comprising at least the following probe group (i) or (ii):
(I) First probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 1 and DNA of SEQ ID NO: 2:
(Ii) A second probe group consisting of the DNA of SEQ ID NO: 3 and the DNA of SEQ ID NO: 4.
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号５のＤＮＡおよび配列番号６のＤＮＡからなる第３のプローブ群：
（iv）配列番号７のＤＮＡ、配列番号８のＤＮＡおよび配列番号９のＤＮＡからなる第４のプローブ群：
（v）配列番号１０のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第５のプローブ群。 The gene polymorphism detection kit according to claim 1, comprising at least the following probe groups (i) to (v):
(I) First probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 1 and DNA of SEQ ID NO: 2:
(Ii) Second probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 3 and DNA of SEQ ID NO: 4:
(Iii) Third probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 5 and DNA of SEQ ID NO: 6:
(Iv) Fourth probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 7, DNA of SEQ ID NO: 8 and DNA of SEQ ID NO: 9:
(V) A fifth probe group consisting of the DNA of SEQ ID NO: 10 and the DNA of SEQ ID NO: 11.
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第２のプライマー対。 The genetic polymorphism detection kit according to claim 7, comprising at least the following (i) and (ii):
(I) a first probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 1 and DNA of SEQ ID NO: 2, and a first primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 12 and DNA of SEQ ID NO: 13:
(Ii) a second probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 3 and DNA of SEQ ID NO: 4, and a second primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 14 and DNA of SEQ ID NO: 15.
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第２のプライマー対：
（iii）配列番号５のＤＮＡおよび配列番号６のＤＮＡからなる第３のプローブ群、ならびに配列番号１６のＤＮＡおよび配列番号１７のＤＮＡからなる第３のプライマー対：
（iv）配列番号７のＤＮＡ、配列番号８のＤＮＡおよび配列番号９のＤＮＡからなる第４のプローブ群、ならびに配列番号１８のＤＮＡおよび配列番号１９のＤＮＡからなる第４のプライマー対：
（v）配列番号１０のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第５のプローブ群、ならびに配列番号２０のＤＮＡおよび配列番号２１のＤＮＡからなる第５のプライマー対。 The genetic polymorphism detection kit according to claim 7, comprising at least the following DNAs (i) to (v):
(I) a first probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 1 and DNA of SEQ ID NO: 2, and a first primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 12 and DNA of SEQ ID NO: 13:
(Ii) a second probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 3 and DNA of SEQ ID NO: 4, and a second primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 14 and DNA of SEQ ID NO: 15:
(Iii) a third probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 5 and DNA of SEQ ID NO: 6, and a third primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 16 and DNA of SEQ ID NO: 17:
(Iv) a fourth probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 7, DNA of SEQ ID NO: 8 and DNA of SEQ ID NO: 9, and a fourth primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 18 and DNA of SEQ ID NO: 19:
(V) a fifth probe group consisting of DNA of SEQ ID NO: 10 and DNA of SEQ ID NO: 11, and a fifth primer pair consisting of DNA of SEQ ID NO: 20 and DNA of SEQ ID NO: 21;
The gene polymorphism detection kit according to claim 11, further comprising streptavidin, nitroblue tetrazolium (NBT) and 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatase p-toluidinyl salt (BCIP).
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001333799A (en) * | 2000-05-26 | 2001-12-04 | Nipro Corp | Method of estimating sensitivity to osteoporosis remedy and reagent kit therefor |
| JP2001333798A (en) * | 2000-05-26 | 2001-12-04 | Nipro Corp | Reagent for simultaneously detecting gene polymorphism in vitamin d receptor gene, apolipoprotein e gene and estrogen receptor gene, and method for simultaneously detecting the genes |
| JP2004024143A (en) * | 2002-06-26 | 2004-01-29 | Kansai Tlo Kk | Method for detecting base polymorphism of steroidal whirlbone necrosis diagnostic gene |
-
2004
- 2004-07-01 JP JP2004195394A patent/JP2006014653A/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001333799A (en) * | 2000-05-26 | 2001-12-04 | Nipro Corp | Method of estimating sensitivity to osteoporosis remedy and reagent kit therefor |
| JP2001333798A (en) * | 2000-05-26 | 2001-12-04 | Nipro Corp | Reagent for simultaneously detecting gene polymorphism in vitamin d receptor gene, apolipoprotein e gene and estrogen receptor gene, and method for simultaneously detecting the genes |
| JP2004024143A (en) * | 2002-06-26 | 2004-01-29 | Kansai Tlo Kk | Method for detecting base polymorphism of steroidal whirlbone necrosis diagnostic gene |
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