JP2006003154A - Sample analyzer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、分子間相互作用に関する情報を一分子レベルで計測して解析することができる手法に関する。 The present invention relates to a technique capable of measuring and analyzing information related to intermolecular interactions at a single molecule level.
蛋白質機能解析の研究は、従来は蛋白質をコードする遺伝子配列の解析が主な研究対象であったが、近年のヒトゲノム解析の急速な進展により、細胞内に存在する遺伝子から合成される蛋白質がどのように動き、機能しているかの解析に重点が移行しつつある。 In the past, research on protein function analysis has mainly focused on the analysis of gene sequences that encode proteins, but due to the rapid progress of human genome analysis in recent years, which proteins are synthesized from genes present in cells? The focus is shifting to analysis of how it works and functions.
生体内ではさまざまな遺伝子発現やシグナル伝達作用によって、特異的な機能を有する様々な分子（酵素、受容体をはじめとする機能蛋白質、細胞構造を保持する蛋白質、脂質、糖鎖蛋白質、イオン等の生物学的活性分子等）が常に変化していることにより、その生命機構を維持している。このような生体機能を観測・解析するには、これらの細胞内における分子を動態観測すると同時に、おのおのの分子動態を１分子レベルで観測する必要がある。 In vivo, various molecules with specific functions (enzymes, functional proteins such as receptors, proteins that retain cell structures, lipids, glycoproteins, ions, etc.) due to various gene expression and signal transduction actions Biologically active molecules, etc.) are constantly changing to maintain their life mechanisms. In order to observe and analyze such biological functions, it is necessary to observe the dynamics of molecules in these cells and simultaneously observe the molecular dynamics at the single molecule level.
細胞動態を観測するための手法の１つとして、顕微鏡により細胞の時間的な変化を観測する手法がある。細胞内にはオルガネラや細胞骨格、細胞質などさまざまな分子、構造体が３次元的に存在している。そこで、ある特定の器官や分子を蛍光色素にて染色し蛍光顕微鏡によって観察することが多く行われている。さらにより詳細な蛍光観測として、ＸＹ走査型共焦点蛍光顕微鏡による細胞断層の蛍光観測も行われている。特に細胞の時間変化の観測（タイムラプス観測）を行うときは、細胞を生きたまま観測して、その蛍光画像を所定時間ごとに取得し細胞内での目的の器官の局在変化を観測する。 One technique for observing cell dynamics is to observe temporal changes in cells using a microscope. Various molecules and structures such as organelles, cytoskeleton, and cytoplasm exist three-dimensionally in the cell. Therefore, it is often performed that a specific organ or molecule is stained with a fluorescent dye and observed with a fluorescent microscope. Furthermore, as a more detailed fluorescence observation, a fluorescence observation of a cell fault is also performed by an XY scanning confocal fluorescence microscope. In particular, when observing temporal changes of cells (time-lapse observation), the cells are observed while they are alive, and the fluorescence images are acquired at predetermined time intervals to observe changes in the location of the target organ in the cells.
しかし、この手法では、画像より得られる情報は定性的なものであるため、たとえば細胞内のある分子の動態についての定量的な情報が少ないという課題がある。 However, in this technique, since information obtained from an image is qualitative, there is a problem that, for example, there is little quantitative information about the dynamics of a certain molecule in a cell.
一方、分子の相互作用を１分子レベルで観測する１分子蛍光分光分析装置が知られている。この１分子蛍光分光分析装置には、蛍光標識分子の相互作用を微細に解析する手法である、蛍光相関分光法（ＦＣＳ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）が用いられている。ＦＣＳは、蛍光で標識した標的分子の媒質中におけるゆらぎ運動を測定し、自己相関関数（Ａｕｔｏ−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を求めることにより、個々の標的分子の媒質中でのブラウン運動を正確に測定する技術である。この方法により、分子の数、大きさ等の物理量を算出することができる（例えば、非特許文献１参照）。 On the other hand, single-molecule fluorescence spectrometers that observe molecular interactions at the single-molecule level are known. In this single-molecule fluorescence spectroscopic analyzer, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), which is a technique for finely analyzing the interaction of fluorescently labeled molecules, is used. FCS is a technology that accurately measures the Brownian motion of each target molecule in the medium by measuring the fluctuation motion of the target molecule labeled with fluorescence in the medium and calculating the auto-correlation function. It is. By this method, physical quantities such as the number and size of molecules can be calculated (for example, see Non-Patent Document 1).
このＦＣＳを用いて細胞内の分子の動きを解析する場合、細胞のどの部分を観測するのかを判断するための情報が極めて少ないことが問題となる。細胞内には核や小胞体、ミトコンドリアなどのオルガネラ、細胞内での物質輸送や細胞形態維持のための細胞骨格など、さまざまな器官が存在している。したがって目的の蛍光標識分子を解析する場合はその分子が何処に存在しているのかを把握しておかないと、得られたデータが、分子の大きさと周りの溶媒の粘度のどちらの影響をより強く受けているのか判断することが難しくなる。 When analyzing the movement of molecules in a cell using this FCS, there is a problem that there is very little information for determining which part of the cell to observe. There are various organs in the cell, such as organelles such as the nucleus, endoplasmic reticulum, and mitochondria, and cytoskeleton for transporting substances and maintaining cell morphology. Therefore, when analyzing the target fluorescently labeled molecule, it is necessary to know where the molecule exists, and the obtained data will affect the influence of the size of the molecule and the viscosity of the surrounding solvent. It becomes difficult to judge whether you are receiving it strongly.
これを解決するためには、装置に光学顕微鏡機能をもたせる必要がある。そして、細胞の全体像が把握でき、なおかつ現在解析を行なっている場所が細胞のどの部分かを視覚的に把握できることが必要となる。 In order to solve this, it is necessary to give the apparatus an optical microscope function. And it is necessary to be able to grasp the whole picture of the cell and to visually grasp which part of the cell is currently analyzed.
光学顕微鏡としては、位相差観察、微分干渉観察、明視野観察などの透過照明を用いた観察法や、白色光源と光学フィルターを用いた蛍光観察、レーザ光と共焦点光学系を用いた共焦点蛍光観察などがある（例えば、特許文献１参照）。 Optical microscopes include observation methods using transmitted illumination such as phase contrast observation, differential interference observation, and bright field observation, fluorescence observation using a white light source and an optical filter, confocal light using a laser beam and a confocal optical system. There is fluorescence observation or the like (for example, see Patent Document 1).
そこで、特許文献１に記載の共焦点顕微鏡を、非特許文献１のＦＣＳ装置に適用することが考えられる。
Thus, it is conceivable to apply the confocal microscope described in
具体的には、特許文献１に記載の走査型共焦点レーザー顕微鏡モジュールを用い、まず対物レンズに入射する励起光をＸＹ走査することによって得られる蛍光シグナルを画像データに変換して細胞像を得る。そして、その蛍光画像の位置情報をもとに目的の画像での点を選択し、走査型顕微鏡モジュールを用いて、選択した点を励起しその点から発生する蛍光シグナルを高感度の検出器を用いてある時間検出し、ＦＣＳ解析を行い蛍光分子の動きを観測する。
しかし、２つの技術を単に組合せただけでは、課題の解決を図ることは困難である。励起光を走査する時間は、素子を駆動する機能、蛍光による退色、生きた細胞の蛍光観測などを考えると、通常１点あたり０．５秒である。それよりも長くなると、蛍光退色が生じたり、細胞にダメージを与える。またそれよりも短いと蛍光シグナルが充分検出できなくなり蛍光画像の信頼性が低下する。一方、任意の点をＦＣＳ観測する場合、その計測に必要な時間は数秒から数十秒である。特に細胞計測の場合、細胞内や細胞膜内は溶媒の粘性が高いため計測時間は長いほうが望ましい。 However, it is difficult to solve the problem simply by combining the two technologies. The time for scanning the excitation light is usually 0.5 seconds per point in consideration of the function of driving the element, fading due to fluorescence, and fluorescence observation of living cells. If it is longer than that, fluorescent fading will occur or the cells will be damaged. On the other hand, if it is shorter than that, the fluorescence signal cannot be detected sufficiently and the reliability of the fluorescence image is lowered. On the other hand, when an arbitrary point is observed by FCS, the time required for the measurement is several seconds to several tens of seconds. In particular, in the case of cell measurement, it is desirable that the measurement time is long because the viscosity of the solvent is high in the cell or cell membrane.
これらの事実から、細胞の蛍光画像の取得と、その細胞の任意の点における蛍光分子の振る舞いをＦＣＳ解析することを同時に行なうことには困難が伴なうことが推認できる。事実、生きた細胞について観測する場合、細胞内においては分子のみならず、細胞内に存在するオルガネラや細胞骨格などの器官についても絶えず揺らぎもしくは動きが存在する。そのため、過去に取得した蛍光画像に基づいて分子のデータを解析しても分子のＸＹ位置に時間的な差が生じてしまい、目的の分子を解析することが難しくなる。 From these facts, it can be inferred that it is difficult to simultaneously obtain the fluorescence image of the cell and perform the FCS analysis of the behavior of the fluorescent molecule at an arbitrary point of the cell. In fact, when observing living cells, there are constant fluctuations or movements not only in molecules but also in organelles and cytoskeletons in the cells. Therefore, even if molecular data is analyzed based on fluorescence images acquired in the past, a time difference occurs in the XY position of the molecule, making it difficult to analyze the target molecule.
この解決を図るため、ＸＹ走査することによって得られる蛍光シグナルを画像解析用とＦＣＳ解析用の２つに分けてそれぞれ解析を行なうことも考えられる。しかし、上述のように生きた細胞画像を取得するための励起光走査時間は、０．５秒程度の短い時間でなくてはならず、一方、粘性の高い細胞内でのＦＣＳ解析のためには少なくとも１０秒以上の計測時間が必要である。従って、蛍光像取得とＦＣＳ解析データ実行を同時に行うことは難しい。 In order to solve this problem, it is conceivable that the fluorescence signal obtained by XY scanning is divided into two for image analysis and FCS analysis. However, as described above, the excitation light scanning time for acquiring a living cell image must be as short as about 0.5 seconds, while for the FCS analysis in a highly viscous cell. Requires a measurement time of at least 10 seconds. Therefore, it is difficult to simultaneously perform fluorescent image acquisition and FCS analysis data execution.
このように、細胞機能の解析においては細胞内の分子の相互作用を検出する際には、計測を行なう場所を時間的空間的に高精度で検出する方法が求められている。 As described above, in the analysis of cell functions, there is a demand for a method for detecting a place where measurement is performed with high accuracy in terms of time and space when detecting the interaction of molecules in cells.
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、細胞内における分子の相互作用を目的の場所において精密に測定することが可能な試料解析装置を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a sample analyzer capable of accurately measuring the interaction of molecules in a cell at a target location.
上記課題を解決するための、本発明に係る請求項１に記載の試料解析装置は、光源と、この光源からの光を試料に集光する集光手段と、前記試料からの発生光を検出する少なくとも１つの検出手段と、前記検出手段からの検出信号に基づいて、２次元または３次元で前記試料の画像を生成する画像生成手段と、前記検出手段からの検出信号に基づいて、前記画像の任意の位置ごとの時系列信号を生成する信号生成手段と、前記時系列信号を前記画像のそれぞれの位置に対応付ける対応付け手段とを備えた。
In order to solve the above-mentioned problems, the sample analyzer according to
また、本発明に係る請求項２に記載の試料解析装置は、上記記載の発明である試料解析装置において、前記画像を表示する表示手段と、前記表示された画像の少なくとも１つの任意の点を指定する指定手段と、前記画像の指定された少なくとも１つの任意の点に対応する前記時系列信号に基づいて前記試料を解析する解析手段を備えた。
The sample analyzer according to
また、本発明に係る請求項３に記載の試料解析装置は、上記記載の発明である試料解析装置において、前記試料から発生する光には蛍光が含まれ、前記検出手段は蛍光を検出し、前記解析手段は、蛍光相関解析、蛍光偏光解析、蛍光共鳴エネルギー移動解析、蛍光寿命解析、蛍光強度解析、蛍光強度分布解析、燐光解析、生物発光解析、化学発光解析、散乱光解析のうち少なくとも１つを実行する。
Further, in the sample analysis apparatus according to
また、本発明に係る請求項４に記載の試料解析装置は、上記記載の発明である試料解析装置において、前記蛍光の直交する偏光成分を分光する分光手段を有し、前記信号生成手段は、前記偏光成分を検出する前記検出手段からの検出信号に基づいて、前記画像の任意の位置ごとの時系列信号を生成する。 Further, the sample analysis apparatus according to claim 4 of the present invention is the sample analysis apparatus according to the invention described above, further comprising a spectroscopic unit that splits the polarized components of the fluorescence orthogonal to each other, and the signal generation unit includes: Based on a detection signal from the detection means for detecting the polarization component, a time series signal for each arbitrary position of the image is generated.
また、本発明に係る請求項５に記載の試料解析装置は、上記記載の発明である試料解析装置において、試料からの自発光を検出する少なくとも１つの検出手段と、前記検出手段からの検出信号に基づいて、２次元または３次元で前記試料の画像を生成する画像生成手段と、前記検出手段からの検出信号に基づいて、前記画像の任意の位置ごとの時系列信号を生成する信号生成手段と、前記時系列信号を前記画像のそれぞれの位置に対応付ける対応付け手段とを備えた。
The sample analysis apparatus according to
また、本発明に係る請求項６に記載の試料解析装置は、上記記載の発明である試料解析装置において、前記試料は、細胞又は組織である。 Moreover, the sample analyzer according to claim 6 of the present invention is the sample analyzer according to the invention described above, wherein the sample is a cell or a tissue.
また、本発明に係る請求項７に記載の試料解析装置は、試料をＸＹ走査しながら励起する光学系と、蛍光標識された試料の蛍光画像を取得する画像取得手段と、前記蛍光画像の取得と同時に走査する試料の任意の領域における蛍光標識された分子から発生する蛍光を検出する検出手段と、前記検出手段からの任意の領域ごとの蛍光信号を保存する保存手段と、任意の領域ごとに蛍光相関分光法により、並進拡散時間、共焦点領域に存在する蛍光分子の数、回転拡散時間を解析する解析手段とを備えた。 According to a seventh aspect of the present invention, there is provided a sample analyzing apparatus comprising: an optical system that excites a sample while performing XY scanning; an image acquisition unit that acquires a fluorescent image of a fluorescently labeled sample; and acquisition of the fluorescent image. At the same time, detection means for detecting fluorescence generated from fluorescently labeled molecules in an arbitrary region of the sample to be scanned, storage means for storing a fluorescence signal for each arbitrary region from the detection means, and for each arbitrary region Analyzing means for analyzing the translational diffusion time, the number of fluorescent molecules present in the confocal region, and the rotational diffusion time by fluorescence correlation spectroscopy.
また、本発明に係る請求項８に記載の試料解析装置は、試料をＸＹ走査しながら励起する光学系と、蛍光標識された試料の蛍光画像を取得する画像取得手段と、前記蛍光画像の取得と同時に走査する試料の任意の領域における蛍光標識された分子から発生する蛍光を検出する検出手段と、前記検出手段からの任意の領域ごとの蛍光信号を保存する保存手段と、任意の領域ごとに蛍光強度分布解析により、領域に存在する蛍光分子の数、一分子あたりの蛍光強度を解析する解析手段とを備えた。
The sample analyzer according to
また、本発明に係る請求項９に記載の試料解析装置は、試料をＸＹ走査しながら励起する光学系と、蛍光標識された試料の蛍光画像を取得する画像取得手段と、前記蛍光画像の取得と同時に走査する試料の任意の領域における蛍光標識された分子から発生する蛍光を、偏光素子を用いて各偏光成分ごとに検出する検出手段と、前記検出手段からの任意の領域ごとの蛍光信号を保存する保存手段と、任意の領域ごとに蛍光強度分布解析により、蛍光分子の回転拡散時間、領域に存在する蛍光分子の数、一分子あたりの蛍光強度を解析する解析手段とを備えた。
The sample analyzer according to
また、本発明に係る請求項１０に記載の試料解析装置は、蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせる複数の蛍光物質で蛍光標識された試料をＸＹ走査しながら励起する光学系と、蛍光標識された試料の蛍光画像を取得する画像取得手段と、前記蛍光画像の取得と同時に走査する試料の任意の領域における蛍光標識された分子から発生する蛍光を、分光素子を用いて各波長成分ごとに検出する検出手段と、各波長成分ごとの検出信号から、蛍光強度分布解析により、蛍光分子の回転拡散時間、共焦点領域に存在する蛍光分子の数、一分子あたりの蛍光強度を解析する解析手段とを備えた。 According to a tenth aspect of the present invention, there is provided a sample analyzing apparatus comprising: an optical system that excites a fluorescently labeled sample with a plurality of fluorescent substances that cause fluorescence resonance energy transfer while performing XY scanning; and a fluorescently labeled sample. Image acquisition means for acquiring a fluorescence image of the light, and detection for detecting, for each wavelength component, fluorescence generated from fluorescently labeled molecules in an arbitrary region of the sample scanned simultaneously with the acquisition of the fluorescence image And analysis means for analyzing the rotational diffusion time of fluorescent molecules, the number of fluorescent molecules present in the confocal region, and the fluorescent intensity per molecule from the detection signal for each wavelength component by fluorescence intensity distribution analysis. It was.
本発明によれば、細胞内における分子の相互作用を目的の場所において精密に測定することができる。 According to the present invention, molecular interactions in cells can be accurately measured at a target location.
［第１の実施の形態］
本発明に係る試料解析装置は、走査型共焦点顕微鏡機能を用いて試料の画像を取得する機能を備え、同時に種々の解析を行なうことができる。解析としては、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、蛍光相互相関分光法（ＦｘＣｓ）、蛍光強度分布解析（ＦＩＤＡ解析）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、蛍光偏光、化学発光、光散乱、蛍光寿命が可能である。特に、ＦＣＳとＦＩＤＡの同時解析、化学発光を検出することによるＦＣＳとＦＩＤＡの同時解析、ＦＩＤＡと偏光の同時解析、ＦＩＤＡとＦＲＥＴの同時解析が行える点に特徴がある。
[First Embodiment]
The sample analysis apparatus according to the present invention has a function of acquiring an image of a sample using a scanning confocal microscope function, and can simultaneously perform various analyses. Analysis includes fluorescence correlation spectroscopy (FCS), fluorescence cross-correlation spectroscopy (FxCs), fluorescence intensity distribution analysis (FIDA analysis), fluorescence resonance energy transfer (FRET), fluorescence polarization, chemiluminescence, light scattering, and fluorescence lifetime. Is possible. In particular, it is characterized in that simultaneous analysis of FCS and FIDA, simultaneous analysis of FCS and FIDA by detecting chemiluminescence, simultaneous analysis of FIDA and polarization, and simultaneous analysis of FIDA and FRET can be performed.
図１は、本発明に係る試料解析装置の構成を示す図である。本装置は、上述のように種々の解析が可能であり、図１は、装置のフルスペックの構成を示している。従って、それぞれの機能をユニット化して適宜ニーズに応じた構成に容易に変更することができる。 FIG. 1 is a diagram showing a configuration of a sample analyzer according to the present invention. As described above, this apparatus can perform various analyses, and FIG. 1 shows the full-spec configuration of the apparatus. Therefore, each function can be unitized and easily changed to a configuration according to needs.
［画像取得及びＦＣＳ解析］
先ず本試料解析装置の、画像取得及び蛍光相関分光（ＦＣＳ）解析についての動作を説明する。
[Image acquisition and FCS analysis]
First, the operation of the sample analyzer for image acquisition and fluorescence correlation spectroscopy (FCS) analysis will be described.
試料の画像を取得するための光源１としてレーザを用いる。レーザの波長は紫外から可視、赤外までどの波長でも良い。ただし、試料に組織を用いる場合は、レーザの波長は赤外の方が望ましい。実施例ではレーザを用いているが、水銀ランプやキセノン、ハロゲンなどでも良い。
A laser is used as the
光源１から発せられたレーザービームはコリメータレンズ２で拡大されて平行光となる。そして、ガルバノスキャナー３とダイクロイックミラー４とを介し対物レンズ５を通して集光し、試料８内の蛍光色素を励起する。
The laser beam emitted from the
レーザ光は、互いに走査方向が直交する一対の機構を備えたガルバノスキャナー３によって試料面上をＸＹ走査される。ガルバノスキャナー３は、指定された速度によって試料８の指定された範囲を走査する。なお、スキャン手段はガルバノスキャナー３の他に、光音響光学素子を用いてもよい。また光源を固定し、試料台６を走査することでレーザ光を試料上で走査させても良い。このときは、ガルバノスキャナー３を設ける必要はない。また、ダイクロイックミラー４に代えてビームスプリッタ−、回折光学素子、光音響光学素子、結晶光学素子、液晶光学素子などを用いても良い。
The laser beam is XY scanned on the sample surface by a
試料８からの蛍光及び反射光は対物レンズ５を通り、ダイクロイックミラー４によって蛍光のみが透過する。蛍光は結像レンズ１２によって集光され、ピンホール１３を介してさらにハーフミラー１４によって分割され、蛍光の一部が画像データを取得する光学系、即ち図の左方向へと導かれる。
The fluorescence and reflected light from the
画像を取得する光学系では、分割された蛍光信号（フォトンパルス）をフォトマルなどの光検出器１５が受光し、信号処理装置（不図示）で波形整形した後、ｏｎ−ｏｆｆの２値化パルスに変換し、コンピューター１６に導く。コンピューター１６は走査した各ＸＹの座標点ごとのデータを保存する。このデータは画像データとして、ＴＶモニター（不図示）に表示される。
In an optical system for acquiring an image, the divided fluorescence signal (photon pulse) is received by a
なお、対物レンズ５を光軸方向に移動させることにより、レーザ光のフォーカス位置を光軸方向に沿って上下させることができる。これにより、３次元画像をＴＶモニター上に生成させることもできる。
The focus position of the laser beam can be moved up and down along the optical axis direction by moving the
一方、ハーフミラー１４によって分割された、もうひとつの蛍光信号は、図の下方向へと導かれ、光検出器２２で受光される。光検出器２２はフォトマルチプライアーもしくはアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）を用いているが、この実施の形態に限定されず、２次元のＣＣＤを用いても良い。
On the other hand, another fluorescent signal divided by the half mirror 14 is guided downward in the figure and received by the
光検出器２２に入射した光強度信号は電気信号に変換され、信号処理装置（不図示）で波形整形され、ｏｎ−ｏｆｆの２値化パルスに変換されて、コンピューター２５に導かれる。コンピュータ２５は、入力された測定データを時間、座標データと対応付けて保存する。
The light intensity signal incident on the
このようにして、画像と蛍光信号とを取得して計測を終了する。 In this way, the image and the fluorescence signal are acquired and the measurement is finished.
続いて、計測後において、取得した画像を用いて、試料内の所望の位置を選定して解析開始を指示すると、コンピューター２５が、その位置における２値化パルス信号を処理して蛍光相関分光解析を実行する。蛍光相関分光法は、蛍光分子からのシグナルを自己相関解析することによって、蛍光分子の、微小な観測領域での滞在時間と観測領域に存在する蛍光分子の数を知ることができる解析方法である。この解析によって、蛍光分子の他の分子との相互作用や、蛍光分子の存在している溶媒の環境などを知ることができる。
Subsequently, after measurement, when a desired position in the sample is selected and an analysis start is instructed using the acquired image, the
なお、蛍光分子の拡散運動（または現象）を観察するためにＦＣＳ解析を行なう場合は、ＸＹ座標の１点あたり１０〜数十秒の計測が必要となることがある。そのためには、レーザ光を長く照射するために生じてしまう、蛍光分子の蛍光退色や細胞へのダメージを避けるために退色の起こりにくい蛍光色素を使用する、もしくは散乱光を計測する手法を用いることで、蛍光標識の必要がなくなる。また励起のための光源の波長を近赤外もしくは赤外をもちいるか、２光子励起法を用いることによって細胞へのダメージを防ぐ。あるいは、細胞のごく微小な領域を走査することによっても、退色や細胞へのダメージを防ぎながら、ＦＣＳ解析をすることが可能である。 In addition, when performing FCS analysis in order to observe the diffusion motion (or phenomenon) of a fluorescent molecule, it may be necessary to measure 10 to several tens of seconds per point on the XY coordinates. To that end, use fluorescent dyes that do not easily fade to avoid fluorescent fading of fluorescent molecules and damage to cells that occur due to long laser irradiation, or use a method that measures scattered light. This eliminates the need for fluorescent labels. Moreover, the wavelength of the light source for excitation uses near infrared or infrared, or damage to a cell is prevented by using the two-photon excitation method. Alternatively, it is possible to perform FCS analysis while scanning a very small area of a cell while preventing fading and damage to the cell.
［蛍光相互相関分光解析］
蛍光相互相関分光解析法（ＦｘＣＳ）は、分子の相互作用を解析するための手法として、異なる分子をそれぞれ分光特性の異なる蛍光色素にて標識し、それぞれの蛍光シグナル相互の相関を解析する手法である。この手法を用いてそれぞれの分子からの時系列蛍光シグナルで相互相関解析を実行し、異なる分子の動きに同時性があるかどうかを確認することができる。本解析法は、分子が相互に作用を及ぼしても大きさにあまり変化が無いため、拡散状態の変化を検出しにくい場合に適用すると効果的である。
[Fluorescence cross-correlation spectroscopy]
Fluorescence cross-correlation spectroscopy (FxCS) is a technique for analyzing the correlation between fluorescent signals by labeling different molecules with fluorescent dyes with different spectral characteristics as a technique for analyzing molecular interactions. is there. Using this technique, cross-correlation analysis can be performed on the time-series fluorescence signals from each molecule, and it can be confirmed whether the movements of different molecules are synchronized. This analysis method is effective when applied to a case where it is difficult to detect a change in the diffusion state because the size does not change much even if molecules interact with each other.
図１に示す試料解析装置を用いて、蛍光相互相関分光解析（ＦｘＣＳ）を行う動作は、コンピュータ２５が、蛍光信号を収集してそのデータを時間、座標データと対応付けて保存するまでは、上述のＦＣＳの動作と同一であるため、その詳細の説明は省略する。そして、計測後において取得した画像を用いて、試料内の所望の位置を２点選定して解析開始を指示すると、コンピューター２５はその２つの位置における２値化パルス信号を処理して相互相関解析を実行する。
The operation of performing fluorescence cross-correlation spectroscopy analysis (FxCS) using the sample analyzer shown in FIG. 1 is performed until the
［蛍光強度分布解析］
蛍光強度分布解析（ＦＩＤＡ）は、ＦＣＳと同様のプロセスを用いて得られる蛍光シグナルを統計分布解析することによって、蛍光の１分子あたりの強度および計測している領域に存在する分子の数を算出する解析手法である。
[Fluorescence intensity distribution analysis]
Fluorescence intensity distribution analysis (FIDA) calculates the intensity per molecule of fluorescence and the number of molecules present in the region being measured by analyzing the statistical distribution of fluorescence signals obtained using the same process as FCS. This is an analysis method.
この解析法は自己相関関数を求めないため、計測時間が短くても、比較的精度良く解析をすることが可能である。従って、ＦＣＳ解析で１０秒〜数十秒計測時間を必要とする大きな分子の計測あるいは細胞内の計測には、ＦＩＤＡ解析は特に有用である。またＦＩＤＡ解析は蛍光強度分布解析により蛍光分子１分子あたりの蛍光強度および観測する共焦点領域中に存在する蛍光分子の数を算出することが可能である。 Since this analysis method does not obtain an autocorrelation function, analysis can be performed with relatively high accuracy even if the measurement time is short. Therefore, FIDA analysis is particularly useful for measurement of large molecules or measurement in cells that require measurement time of 10 seconds to several tens of seconds in FCS analysis. In FIDA analysis, it is possible to calculate the fluorescence intensity per fluorescent molecule and the number of fluorescent molecules present in the confocal region to be observed by fluorescent intensity distribution analysis.
仮に蛍光標識された分子が、他の分子と相互作用した場合、分子の構造などが変化するため分子を標識している蛍光色素の環境が変化する場合がある。その際には蛍光色素からのシグナルが変化する。蛍光強度が大きくなるかもしくは小さくなるかは、蛍光色素によって異なる。また、複数の蛍光分子が会合したり、あるいは他の分子に複数の蛍光分子が相互作用する場合は、検出される蛍光分子の数は少なくなる。また、酵素によって蛍光分子が分解される場合には検出される蛍光分子の数が増える。このようにＦＩＤＡを用いて、蛍光強度及び蛍光分子の数を算出することで、蛍光分子の相互作用についての知見を得ることが可能である。 If a fluorescently labeled molecule interacts with another molecule, the structure of the molecule or the like changes, so the environment of the fluorescent dye that labels the molecule may change. At that time, the signal from the fluorescent dye changes. Whether the fluorescence intensity increases or decreases depends on the fluorescent dye. Further, when a plurality of fluorescent molecules are associated or a plurality of fluorescent molecules interact with other molecules, the number of detected fluorescent molecules is reduced. In addition, when fluorescent molecules are decomposed by an enzyme, the number of fluorescent molecules detected increases. Thus, it is possible to obtain knowledge about the interaction of fluorescent molecules by calculating the fluorescence intensity and the number of fluorescent molecules using FIDA.
図１に示す試料解析装置を用いて、蛍光強度分布解析（ＦＩＤＡ）を行う動作は、コンピュータ２５が、蛍光信号を収集してそのデータを時間、座標データと対応付けて保存するまでは、上述のＦＣＳの動作と同一であるためその詳細の説明は省略する。そして、計測後において、取得した画像を用いて試料内の所望の位置を選定して解析開始を指示すると、コンピューター２５がその位置における２値化パルス信号を演算処理して蛍光強度分布解析を実行する。
The operation of performing fluorescence intensity distribution analysis (FIDA) using the sample analyzer shown in FIG. 1 is the above-described operation until the
上述のＦＣＳ解析、ＦｘＣＳ解析、ＦＩＤＡ解析は解析する手法はそれぞれ異なるが、その解析に使用する蛍光シグナルの時系列データは同一である。従って、目的の試料について、画像、ＦＣＳ解析、ＦｘＣＳ解析、ＦＩＤＡ解析を同時に行なうことも可能である。これらを同時に解析することで、蛍光分子の拡散などの動きの情報と同時に、蛍光強度の変化に関する知見も得ることが可能である。たとえば分子の相互作用の際に分子の構造変化や存在環境の変化が生じ、その場合に蛍光強度が変化することがある。ＦＣＳ解析にて大きさの変化を観測すると同時にＦＩＤＡを行なうことで蛍光分子の周りの環境変化による蛍光強度の変化なども知ることができる。 The above-described FCS analysis, FxCS analysis, and FIDA analysis have different analysis methods, but the time series data of the fluorescence signals used for the analysis are the same. Therefore, it is possible to simultaneously perform image, FCS analysis, FxCS analysis, and FIDA analysis on the target sample. By analyzing these simultaneously, it is possible to obtain information on changes in fluorescence intensity as well as information on movement such as diffusion of fluorescent molecules. For example, a change in the structure of the molecule or a change in the environment exists during the interaction of the molecules, and in that case, the fluorescence intensity may change. By observing the change in size in the FCS analysis and performing FIDA at the same time, it is possible to know the change in fluorescence intensity due to the environmental change around the fluorescent molecule.
［蛍光共鳴エネルギー移動］
２種類の異なる分光特性をもつ蛍光色素で標識された蛍光分子を使用しＦＩＤＡ解析を行なうと蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の計測が可能である。ＦＲＥＴ計測は２種類の異なる分子間の相互作用を確認するとき用いられる。この場合は分光素子を用いてそれぞれの波長毎に分離した蛍光シグナルを検出する。
[Fluorescence resonance energy transfer]
When FIDA analysis is performed using fluorescent molecules labeled with two types of fluorescent dyes having different spectral characteristics, fluorescence resonance energy transfer (FRET) can be measured. FRET measurement is used when confirming the interaction between two different molecules. In this case, a fluorescence signal separated for each wavelength is detected using a spectroscopic element.
次に、ＦＲＥＴ計測を行なう場合の試料解析装置の構成について説明する。ＦＲＥＴ計測を行なう場合は、１もしくは２種類の異なる波長特性をもつ励起光を使用する。従って、試料解析装置は、試料からの波長の異なる複数の蛍光シグナルを分光するためのダイクロイックミラーもしくは分光素子と、波長毎の蛍光を検出する光検出器とを備えている。 Next, the configuration of the sample analyzer when performing FRET measurement will be described. When performing FRET measurement, excitation light having one or two types of different wavelength characteristics is used. Therefore, the sample analyzer includes a dichroic mirror or a spectroscopic element for spectroscopically analyzing a plurality of fluorescence signals having different wavelengths from the sample, and a photodetector for detecting fluorescence for each wavelength.
図１において、試料８からの蛍光はダイクロイックミラー１７によってまず２つの波長領域の光に分けられる。図の左方向に進んだ蛍光は、さらに光学フィルター（不図示）を透過することによって特定の波長の蛍光のみが取り出され、光検出器１９によって検出される。図の下方向に進んだ蛍光は、次段に配されたダイクロイックミラー２１によってさらに２つの波長域に分けられる。２つに分けられた蛍光はそれぞれの波長を選択的に取り出すフィルター（不図示）を通過し光検出器２０、２２によって検出され、コンピュータ２５が、これら光検出器１９、２０、２２の信号と、時間、座標データとを対応付けて保存する。なお、図１には、２段階ＦＲＥＴの場合の構成を示しているが、１段階ＦＲＥＴの場合には、ダイクロイックミラー２１と検出器２０は取り外しておく。
In FIG. 1, the fluorescence from the
そして、計測後において、取得した画像を用いて試料内の所望の位置を選定して解析開始を指示すると、コンピュータ２５は、その位置における２値化パルス信号を処理してＦＲＥＴ解析を実行する。
After measurement, when a desired position in the sample is selected using the acquired image and an analysis start is instructed, the
次に、本試料解析装置によるＦＲＥＴ解析について説明する。 Next, FRET analysis by this sample analyzer will be described.
まず複数種類の異なる分光特性をもつ蛍光物質に蛍光色素を使用し、それぞれの蛍光色素で標識した、異なる分子の反応について考える。 First, let us consider the reaction of different molecules labeled with each fluorescent dye, using fluorescent dyes for multiple types of fluorescent materials with different spectral characteristics.
分子の相互作用を解析する際に問題となるのは、複数の分子が相互作用する順番や、相互作用する際に関与する分子構造の場所であり、また分子構造がどのように変化するのかということである。このような分子間の微細な相互作用を計測するため、１分子蛍光分光計測を行う本試料解析装置を用い、蛍光色素のＦＲＥＴを利用した計測を行う。本試料解析装置では、蛍光標識された分子からの蛍光情報を１分子レベルで解析することができるので、反応のおこっていない多数の分子の蛍光シグナルに埋もれてしまい、検出が困難になることはないからである。 The problem in analyzing molecular interactions is the order in which multiple molecules interact, the location of the molecular structure involved in the interaction, and how the molecular structure changes. That is. In order to measure such a fine interaction between molecules, measurement using FRET of a fluorescent dye is performed using this sample analyzer that performs single-molecule fluorescence spectroscopy measurement. In this sample analyzer, the fluorescence information from the fluorescently labeled molecules can be analyzed at the single molecule level, so that it is buried in the fluorescence signals of many molecules that have not reacted, making detection difficult. Because there is no.
ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）とは、蛍光物質イの発光波長の光により蛍光物質ロが励起されて、蛍光物質イの発光波長とは別の波長の光が発光する現象である。そこで試料Ａ、ＢについてＦＲＥＴを検出するため試料ＡをＦＩＴＣ、試料Ｂをテトラメチルローダミンで標識しておく。 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) is a phenomenon in which the fluorescent substance B is excited by light having the emission wavelength of the fluorescent substance A, and light having a wavelength different from the emission wavelength of the fluorescent substance A is emitted. Therefore, in order to detect FRET for samples A and B, sample A is labeled with FITC, and sample B is labeled with tetramethylrhodamine.
試料Ａ及び試料Ｂを混合し反応させたサンプルについて、試料Ａを標識しているＦＩＴＣを励起する４８８ｎｍの光を照射する。試料に標識された蛍光物質からの蛍光シグナルは、ダイクロイックミラーを用いてＦＩＴＣの蛍光とテトラメチルローダミンの蛍光に分けられ、それぞれ独立した光検出器によって検出される。ここで、試料Ａと試料Ｂが相互作用を起こさない場合はＦＩＴＣの蛍光のみが検出される。試料ＡとＢが反応し分子間の距離が近接している場合は、ＦＩＴＣの蛍光エネルギーがテトラメチルローダミンに移動し、テトラメチルローダミンの蛍光シグナルが検出される。 A sample obtained by mixing and reacting the sample A and the sample B is irradiated with light of 488 nm that excites the FITC labeling the sample A. The fluorescence signal from the fluorescent substance labeled on the sample is divided into FITC fluorescence and tetramethylrhodamine fluorescence using a dichroic mirror, and each is detected by an independent photodetector. Here, when sample A and sample B do not interact, only the fluorescence of FITC is detected. When samples A and B react and the distance between the molecules is close, the fluorescence energy of FITC moves to tetramethylrhodamine, and the fluorescence signal of tetramethylrhodamine is detected.
試料の反応の時間変化を測定すれば、相互作用する試料の結合の強さだけでなく、結合の速さや解離の速さなどの情報も得ることが可能となる。また、細胞計測において、目的の場所のみを蛍光標識することで、目的の試料の拡散を調べることも可能となる。蛍光強度分布解析はシグナルを検出する計測時間が０．１から０．５秒程度で充分であり、励起光を走査しながら細胞画像を取得する時間内で解析が可能である。 By measuring the time change of the reaction of the sample, it is possible to obtain not only the strength of binding of the interacting sample but also information such as the speed of binding and the speed of dissociation. In cell measurement, it is also possible to examine the diffusion of the target sample by fluorescently labeling only the target location. The fluorescence intensity distribution analysis requires a measurement time of 0.1 to 0.5 seconds for detecting a signal, and can be analyzed within a time period for acquiring a cell image while scanning excitation light.
もし、相互作用は起こっているが、ＦＲＥＴが観測されなかった場合には、各蛍光分子を励起する波長の光を同時に照射し、蛍光相互相関解析（ＦｘＣｓ）を行なう。そして各分子からの蛍光シグナルについてＦｘＣＳを実行して、相互作用しているかどうかを検出する。 If an interaction has occurred but no FRET has been observed, light having a wavelength that excites each fluorescent molecule is simultaneously irradiated, and fluorescence cross-correlation analysis (FxCs) is performed. Then, FxCS is performed on the fluorescence signals from each molecule to detect whether they are interacting.
［蛍光偏光度解析］
蛍光シグナルを偏光素子を用い入射光の偏光方向に対して平行な成分と垂直な成分に分けて検出し、蛍光１分子あたりの蛍光偏光度解析（ＦＩＤＡ−ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を行なうと分子の運動の速さがわかり、結果として分子の大きさや蛍光分子の存在している溶媒の粘度を知ることができる。
[Fluorescence polarization analysis]
When the fluorescence signal is detected by using a polarization element and separated into a component parallel to the polarization direction of the incident light and a component perpendicular to the polarization direction, and the fluorescence polarization degree analysis (FIDA-polarization) per fluorescence molecule is performed, the speed of the movement of the molecule As a result, the size of the molecule and the viscosity of the solvent in which the fluorescent molecule exists can be known.
図１において、ハーフミラー１４によって分割された試料８からの蛍光は、ダイクロイックミラー１７の代わりに直交偏光成分に分離することのできる偏光ビームスプリッタ１８に入射する。偏光ビームスプリッタ１８で分離されたそれぞれの偏光成分は、検出器１９、２２で検出され、コンピュータ２５が、これら検出器１９、２２の信号と、時間、座標データとを対応付けて保存する。
In FIG. 1, the fluorescence from the
そして、計測後に取得した画像を用いて試料内の所望の箇所を選定し、その位置における偏光成分をコンピュータ２５で演算して蛍光偏光度解析を実行する。
And the desired location in a sample is selected using the image acquired after measurement, and the polarization component in the position is calculated with the
蛍光偏光度解析では、たとえば直交偏光成分を検出して各成分ごとに蛍光強度を求める。これから、蛍光偏光度を算出し、計測している分子がどれくらいの速さで回転しているかを知ることができる。 In the fluorescence polarization degree analysis, for example, orthogonal polarization components are detected, and the fluorescence intensity is obtained for each component. From this, it is possible to calculate the degree of fluorescence polarization and know how fast the molecule being measured is rotating.
励起光の振動成分の方向と平行に振動する偏光成分Ｉ／／、直角に振動する偏光成分Ｉ⊥とすると蛍光偏光度Ｐは式（１）で表わされる。 When the polarization component I 1 // oscillates in parallel with the direction of the vibration component of the excitation light and the polarization component I 振動 oscillates at a right angle, the degree of fluorescence polarization P is expressed by equation (1).
Ｐ＝（Ｉ／／−Ｉ⊥）／（Ｉ／／＋ Ｉ⊥） ・・・式（１）
蛍光偏光度Ｐは、蛍光分子の回転の速さ（回転拡散）を知る上での目安となるパラメータである。分子の大きさが小さく回転が速い場合はＰは小さい。また、分子が大きくなる、もしくは分子の回りの溶媒の粘度が高くなるなどで分子の回転が遅くなるとＰが大きくなる。たとえば分子間相互作用が起こっていれば、蛍光偏光度は高くなる。また目的の蛍光分子が細胞膜、オルガネラ、細胞骨格などに捕捉されるなど、動きが制限されると蛍光偏光度は高くなる。目的の蛍光分子が膜や核内に移動するなど、分子の溶媒環境が変化し、溶媒の粘度が高い場所へ移動すると蛍光偏光度は高くなり、逆に溶媒粘度が低い場所へ移動すると蛍光偏光度は小さくなる。このような蛍光分子の挙動を蛍光偏光度から観測することができる。
P = (I // -I ⊥) / (I // + I ⊥) ··· formula (1)
The degree of fluorescence polarization P is a parameter that serves as a guide for knowing the rotational speed (rotational diffusion) of fluorescent molecules. P is small when the size of the molecule is small and the rotation is fast. In addition, when the rotation of the molecule is slowed due to an increase in the molecule or a increase in the viscosity of the solvent around the molecule, P increases. For example, when an intermolecular interaction occurs, the degree of fluorescence polarization increases. In addition, the degree of fluorescence polarization increases when movement is restricted, such as when the target fluorescent molecule is captured by a cell membrane, organelle, cytoskeleton, or the like. If the solvent environment of the molecule changes, such as when the target fluorescent molecule moves into the film or nucleus, and moves to a place where the viscosity of the solvent is high, the degree of fluorescence polarization increases. The degree becomes smaller. Such behavior of fluorescent molecules can be observed from the degree of fluorescence polarization.
なお、蛍光偏光解析は蛍光強度分布解析から回転拡散を見ているため、観測点１点あたりの計測時間を０．１から数秒と短縮することができる。そのため、画像取得のための励起光走査の際にデータを取得することが可能である。 In addition, since the fluorescence polarization analysis looks at the rotational diffusion from the fluorescence intensity distribution analysis, the measurement time per observation point can be shortened from 0.1 to several seconds. Therefore, it is possible to acquire data during excitation light scanning for image acquisition.
［化学発光］
化学発光、生物発光は、分子が光を発する現象である。
[Chemiluminescence]
Chemiluminescence and bioluminescence are phenomena in which molecules emit light.
特に細胞機能の解析においては、細胞内のカルシウムイオン濃度変化の観測が頻繁に行なわれている。この際に、あらかじめ標識された分子を用いなくとも、蛍光分子、たとえばエコーリンやルシフェラーゼなどのカルシウムイオン濃度の測定に利用される発光タンパク質などを用いても良い。発光タンパク質は遺伝子工学的に細胞内に導入でき、カルシウムイオン濃度感受性色素とは異なり、目的の細胞内の器官に発現させることが可能である。 In particular, in the analysis of cell functions, changes in intracellular calcium ion concentration are frequently observed. In this case, a fluorescent molecule such as a photoprotein used for measurement of calcium ion concentration such as echolin and luciferase may be used without using a pre-labeled molecule. Photoproteins can be introduced into cells by genetic engineering and, unlike calcium ion concentration-sensitive dyes, can be expressed in target organs in cells.
これらの蛍光分子では、酸化反応によって発光のためのエネルギーが与えられるので、蛍光分子を励起するための光源を必要としない。従って、これらの分子を測定する装置では、励起光を必要せず発光を検出するための光学系のみを必要とすることが特徴である。そこで、図１において、光源１のレーザ光を遮断するシャッタを設け、蛍光分子の励起に対応してシャッタを制御してもよい。また、光源１を取り外すこともできる。
In these fluorescent molecules, energy for light emission is given by the oxidation reaction, so that a light source for exciting the fluorescent molecules is not required. Therefore, an apparatus for measuring these molecules is characterized by requiring only an optical system for detecting luminescence without requiring excitation light. Therefore, in FIG. 1, a shutter that blocks the laser light from the
［蛍光寿命］
蛍光寿命計測は、溶媒緩和を見るのに適した計測法である。
[Fluorescence lifetime]
Fluorescence lifetime measurement is a measurement method suitable for seeing solvent relaxation.
図１の光源１にパルス光を用いて試料を励起し、それによって発生した蛍光の減衰状況を検出器１９で検出し、コンピュータ２５が、検出器１９の信号と、時間、座標データとを対応付けて保存する。そして、計測後において、取得した画像を用いて試料内の所望の位置を選定して解析開始を指示すると、コンピュータ２５はその位置における成分信号を処理して蛍光寿命解析を実行する。
The sample is excited by using pulsed light in the
蛍光分子の蛍光寿命はその蛍光分子の周りの溶媒環境に影響される。蛍光分子が他の分子と相互作用して結合したり、もしくは相互作用によって分子の高次構造が変化すると、その蛍光分子の周りの環境が親水的な状態から疎水的な状態に変化する。このような蛍光分子の局所的な溶媒環境の変化によってその蛍光分子の蛍光寿命が変化する。 The fluorescence lifetime of a fluorescent molecule is affected by the solvent environment around the fluorescent molecule. When a fluorescent molecule interacts with and binds to other molecules, or when a higher-order structure of the molecule changes due to the interaction, the environment around the fluorescent molecule changes from a hydrophilic state to a hydrophobic state. The fluorescence lifetime of the fluorescent molecule is changed by the local change of the solvent environment of the fluorescent molecule.
たとえば、細胞内の蛍光標識分子が他の分子と相互作用したり、細胞内で何かの刺激によって目的の分子が活性化され蛍光分子が細胞質から細胞膜やオルガネラの膜内に入りこんだり、蛍光分子の構造そのものが変化したりすると、蛍光分子の周りの環境（極性）が変化することがある。 For example, fluorescent labeled molecules in the cell interact with other molecules, the target molecule is activated by something in the cell, and the fluorescent molecule enters the cell membrane or organelle membrane from the cytoplasm. If the structure itself changes, the environment (polarity) around the fluorescent molecule may change.
蛍光分子の蛍光寿命の計測はこのような知見を得るには重要な計測法である。また、蛍光寿命計測は、蛍光分子の励起をごく短いパルス光を用いて行なうため、励起光による細胞へのダメージも少なくすることが可能である。 Measurement of the fluorescence lifetime of a fluorescent molecule is an important measurement method for obtaining such knowledge. In addition, since the fluorescence lifetime measurement is performed using a very short pulsed light, the damage to the cells due to the excitation light can be reduced.
［光散乱］
また試料を蛍光標識することができない場合には、散乱計測を行なう方法もある。これは分子に光を照射しその散乱光を観測することで、分子の大きさを知る方法である。
[Light scattering]
In addition, when the sample cannot be fluorescently labeled, there is a method of performing scattering measurement. This is a method of knowing the size of a molecule by irradiating the molecule with light and observing the scattered light.
図１の試料解析装置において、光散乱計測を行う際には、ダイクロイックミラーの代わりにハーフミラーを用いる。即ち、光散乱と蛍光観測を同時に行なう場合は、ダイクロイックミラー４をハーフミラー４’に置き換え、散乱光を検出する光学系を追加する。 In the sample analyzer of FIG. 1, when performing light scattering measurement, a half mirror is used instead of a dichroic mirror. That is, when light scattering and fluorescence observation are performed simultaneously, the dichroic mirror 4 is replaced with a half mirror 4 ', and an optical system for detecting scattered light is added.
ハーフミラー４’を通過した光は、さらにハーフミラー９によって反射され、図の左方向に配置された散乱光を検出するための光学系に導かれる。ハーフミラー９からの光は結像レンズによって集光されピンホール１３を通り、さらに集光レンズを介して光検出器２３にて検出される。そして、コンピュータ２４が、検出器２３の信号と、時間、座標データとを対応付けて保存する。そして、計測後において、取得した画像を用いて試料内の所望の位置を選定して解析開始を指示すると、コンピュータ２４はその位置における時系列信号を処理して光散乱解析を実行する。一方、ハーフミラー９を通過した光はダイクロイックミラー１０によって蛍光信号のみが抽出され、上述の蛍光検出系に導かれる。
The light that has passed through the half mirror 4 ′ is further reflected by the
散乱計測は、目的の分子を標識することなく観測するので、たとえば蛍光分子によって目的の分子の活性が失われたり、活性に変化が起こったりする危険がない。目的の分子が他の分子と相互作用すると分子の大きさが変化する（この場合は大きくなる）。分子の大きさの変化に伴い散乱が変化する。この変化を観測することによって、分子の相互作用や分子の分解などを見ることができるのである。 Since the scatterometry is observed without labeling the target molecule, there is no risk that the activity of the target molecule is lost or the activity is changed due to, for example, a fluorescent molecule. When the target molecule interacts with other molecules, the size of the molecule changes (in this case, it becomes larger). Scattering changes with changes in molecular size. By observing this change, we can see molecular interactions and molecular decomposition.
散乱計測によって分子の他の分子との相互作用の検出や分解の検出を行なうことができる。また細胞内にあらかじめラテックスや金粒子を注入しておき細胞からの開口放出や抱食などの減少について細胞質内での局在や拡散などを見ることが可能である。この計測方法の場合は蛍光標識を行なわないので、毒性がない、粒子を用いる場合でも金を用いれば毒性に関しては問題ない。また蛍光退色の影響もないので細胞の動きを長時間観測する場合には有利である。さらに、励起波長を選ばないので、細胞へのダメージの少ない波長を用いて計測することができ、他の蛍光標識分子を用いる場合はそれと同様の波長を用いて計測することが可能である。 It is possible to detect interaction of molecules with other molecules and detection of decomposition by scattering measurement. In addition, latex or gold particles can be injected into the cell in advance, and it is possible to observe the localization and diffusion in the cytoplasm with respect to the decrease in the release of cells from the cells and the decrease in engulfment. In the case of this measurement method, since no fluorescent labeling is performed, there is no toxicity. Even when particles are used, there is no problem with respect to toxicity if gold is used. Moreover, since there is no influence of fluorescence fading, it is advantageous when observing cell movement for a long time. Further, since the excitation wavelength is not selected, measurement can be performed using a wavelength with little damage to cells, and when using other fluorescently labeled molecules, measurement can be performed using the same wavelength.
図２は、試料解析装置による主な解析動作手順を示すフロー図である。 FIG. 2 is a flowchart showing a main analysis operation procedure by the sample analyzer.
ステップＳ０１では、光源１からレーザ光が照射される。ステップＳ０２において、このレーザ光は、ガルバノスキャナー３によってＸＹ走査する光となる。なお、走査する範囲は指定することが可能である。ステップＳ０３〜Ｓ０５において、励起された試料８からの光は、ハーフミラーなどによって蛍光のみが分離されて検出光学系に導かれる。
In step S01, laser light is emitted from the
ステップＳ０６において、コンピュータ１６は、検出した蛍光の位置、時間情報から画像データを生成して保存する。そして、それと同時に、ステップＳ０７において、コンピュータ２５は、蛍光信号のフォトンカウント時系列データを試料８の測定位置と対応付けて保存する。また、ＦＲＥＴ解析を行う場合は、ステップＳ０８において、コンピュータ２５は、ダイクロイックミラーなどによって分光された複数の蛍光信号のフォトンカウント時系列データを試料８の測定位置と対応付けて保存する。さらに、偏光解析を行う場合は、ステップＳ０９において、コンピュータ２５は、偏光ミラーなどによって分光された複数の偏光成分のフォトンカウント時系列データを試料８の測定位置と対応付けて保存する。
In step S06, the
計測が終了したときは、ステップＳ１１〜Ｓ１２において、モニターに画像を表示する。そして、ステップＳ１３〜Ｓ１５において、ユーザが画像上の点を指定して解析内容を指示すると、コンピュータ２５は、指定された解析を実行する。
When the measurement is completed, an image is displayed on the monitor in steps S11 to S12. In steps S13 to S15, when the user designates a point on the image and designates analysis contents, the
解析に必要なデータは全て得られた蛍光画像座標で管理されているため、コンピュータ２５は、蛍光画像のどの部分であるかが把握できる。コンピュータ２５は、２値化パルス信号の相関演算もしくは蛍光強度分布解析を実行し、自己相関関数、あるいは相互相関関数、蛍光強度分布を得る。
Since all data necessary for the analysis are managed by the obtained fluorescence image coordinates, the
そして、試料内の所望の位置における蛍光の明るさの分布解析を行い、１分子あたりの蛍光の明るさを情報として得ることができる。また蛍光信号について自己相関関数解析を行い共焦点領域に蛍光分子が滞在する時間（並進拡散時間）を算出する。さらに、ＦＲＥＴ計測で波長の異なるレーザを用い複数の蛍光物質をそれぞれの波長で同時に励起し同時に各蛍光物質の蛍光シグナルを分離して得ることにより蛍光の相互相関解析を行い、異なる試料の相互作用の有無そして存在する蛍光分子のうち相互作用している分子割合を知ることができる。 Then, the distribution of fluorescence brightness at a desired position in the sample is analyzed, and the brightness of fluorescence per molecule can be obtained as information. In addition, the autocorrelation function analysis is performed on the fluorescence signal, and the time (translation diffusion time) for the fluorescent molecule to stay in the confocal region is calculated. In addition, FRET measurement is performed by using lasers with different wavelengths to simultaneously excite a plurality of fluorescent substances at their respective wavelengths and simultaneously separating and obtaining the fluorescence signals of the respective fluorescent substances, thereby performing a cross-correlation analysis of fluorescence, and the interaction between different samples. And the proportion of interacting molecules among the existing fluorescent molecules.
また、蛍光偏光解析では画像における所定の点について、各偏光成分ごとに蛍光の明るさの分布解析を行ない、そのデータをもとに計算し蛍光偏光度を算出する。このデータから蛍光分子の大きさや溶媒の粘度の情報を得ることができるので、蛍光分子が相互作用しているとか蛍光分子が細胞質存在するか、オルガネラの膜上や細胞骨格に捕捉されているなどの状態を知ることが可能である。 In the fluorescence polarization analysis, the distribution of fluorescence brightness is analyzed for each polarization component at a predetermined point in the image, and the fluorescence polarization degree is calculated based on the data. From this data, information on the size of the fluorescent molecule and the viscosity of the solvent can be obtained, so whether the fluorescent molecule is interacting, the fluorescent molecule is present in the cytoplasm, captured on the organelle membrane or cytoskeleton, etc. It is possible to know the state of.
さらに励起光を走査しているため、ある時間内で細胞内の複数の点について、これらの蛍光分析を行なうことが可能である。したがって、たとえば細胞内で情報の伝達が行なわれる場合は、細胞内での不均一な分子の動きがあると考えられる。そこで、細胞内での複数の点における解析を行なうことによって細胞内で目的の分子がどのように振舞うかを知ることが可能となる。 Furthermore, since the excitation light is scanned, it is possible to perform fluorescence analysis on a plurality of points in the cell within a certain time. Therefore, for example, when information is transmitted in a cell, it is considered that there is uneven molecular movement in the cell. Therefore, it is possible to know how the target molecule behaves in the cell by performing analysis at a plurality of points in the cell.
燐光検出の場合は分子が光を発する時間が蛍光よりも長い（10−4〜10秒）。そのため、燐光観測には蛍光分子を励起する励起光を遮断しておく必要がある。この場合はレーザ光のシャッターを用い蛍光分子を励起する時は観測せず、分子を励起後シャッターを閉じる制御装置を用い計測を行なえば良い。 In the case of phosphorescence detection, the time for the molecule to emit light is longer than that of fluorescence (10 −4 to 10 seconds). For this reason, it is necessary to block excitation light that excites fluorescent molecules for phosphorescence observation. In this case, measurement is performed using a control device that closes the shutter after exciting the molecules without observing when the fluorescent molecules are excited using the shutter of the laser beam.
図３は、本試料解析装置が同時に測定できる機能の組合せを示す図である。図中◎を付した組合せは、特徴的な構成を示している。○を付した組合せは、拡張機能の構成を示している。△を付した組合せは、構成可能なものを示している。 FIG. 3 is a diagram showing combinations of functions that can be simultaneously measured by the sample analyzer. Combinations marked with ◎ in the figure indicate characteristic structures. Combinations with a circle indicate the configuration of extended functions. Combinations marked with Δ are configurable.
図３に示すように、本実施の形態の試料解析装置によれば、細胞内における分子の相互作用を目的の場所において精密に測定することができるとともに、あらゆる解析の要求に対してフレキシブルに応えることができる。 As shown in FIG. 3, according to the sample analyzer of the present embodiment, it is possible to accurately measure the molecular interaction in the cell at the target location and flexibly respond to any analysis request. be able to.
なお、本発明において標識として使用できる蛍光物質は、種々の蛍光色素や希土類元素等を含有した蛍光ガラス粒子を用いることができる。 In addition, the fluorescent substance which can be used as a label | marker in this invention can use the fluorescent glass particle containing various fluorescent dyes, rare earth elements, etc.
続いて、本試料解析装置を用いて解析を行った実施例について説明する。 Subsequently, an example in which analysis was performed using the sample analysis apparatus will be described.
［実施例１］ 細胞内カルシウムイオン濃度変化によるプロテインキナーゼの局在
細胞内での情報伝達には細胞内カルシウムイオン濃度変化が重要であることがわかっている。基本的には細胞がカルシウムイオン濃度変化を察知して、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）という酵素群がかかわっておりその機能によって、シナプスの伸長や神経、内外分泌細胞からの開口放出、筋収縮、細胞の増殖分化など広範な細胞機能の調節に関与していることがわかっている。ＰＫＣはカルシウムイオン結合部位を持ち、その活性化機構と細胞内のカルシウムイオン濃度の変化は非常に密接な関係がある。
[Example 1] Localization of protein kinase due to changes in intracellular calcium ion concentration It has been found that changes in intracellular calcium ion concentration are important for intracellular signal transduction. Basically, cells detect changes in calcium ion concentration, and an enzyme group called protein kinase C (PKC) is involved. Depending on the function, synaptic elongation, opening of neurons and endocrine cells, muscle contraction, cells It is known to be involved in the regulation of a wide range of cellular functions such as proliferation and differentiation. PKC has a calcium ion binding site, and its activation mechanism is closely related to changes in intracellular calcium ion concentration.
細胞内のカルシウムイオン濃度変化とＰＫＣの局在は、それぞれの特有の蛍光色素を用いて、細胞が刺激を受けてから細胞が機能する際のそれぞれの状態について蛍光顕微鏡観察されている。しかし、実際細胞内でのさまざまな部位でのＰＫＣの動きに関しては定量的なデータを得ることができない。また細胞内のカルシウムイオン濃度変化は数分以内に起こりその変化をモニターするためには細胞全体の画像を取り込む時間を１枚あたり３０秒以下にしたほうが良い。 The intracellular calcium ion concentration change and the localization of PKC are observed using a fluorescent dye for each state when the cells function after the cells are stimulated. However, quantitative data cannot be obtained regarding the movement of PKC at various sites in cells. In addition, the change in intracellular calcium ion concentration occurs within a few minutes, and in order to monitor the change, it is better to set the time for capturing the whole cell image to 30 seconds or less per sheet.
これまで、細胞が刺激を受け、細胞内に刺激を伝達しそれを細胞内のＰＫＣが感知し作用するという一連の反応について、モニターすることはできなかった。しかし、本試料解析装置を用いてリアルタイムに蛍光画像取得と同時にＦＩＤＡを行なうことにより、細胞内カルシウムイオン濃度変化とＰＫＣの局在変化の画像と同時に各画像取得時間における細胞の任意点でのＰＫＣ分子の動きの解析を行なうことが可能となった。そして、細胞に刺激が与えられてから、細胞内カルシウムイオンの濃度が変化することにより細胞内に刺激が伝達されていく過程におけるＰＫＣの動き及び他のタンパク質とのリン酸化のための相互作用をリアルタイムで観測することができた。 Heretofore, it has not been possible to monitor a series of reactions in which cells are stimulated, transmit stimuli into cells, and PKC in the cells senses and acts. However, by performing FIDA simultaneously with fluorescence image acquisition in real time using this sample analyzer, PKC at any point of the cell at each image acquisition time simultaneously with images of changes in intracellular calcium ion concentration and localization of PKC It became possible to analyze the movement of molecules. Then, after stimulating the cell, the interaction of PKC in the process in which the stimulus is transmitted into the cell due to the change in intracellular calcium ion concentration and the interaction for phosphorylation with other proteins It was possible to observe in real time.
図４は、細胞の解析結果を示す図である。本実施例では、細胞内のカルシウムイオン濃度をカルシウムイオン濃度感受性蛍光色素ｆｌｕｏ３、もしくはＩｎｄｏ１を用いてモニターした。また、ＰＫＣは分子生物学的な手法を用いＧＦＰもしくはＹＦＰを用いて蛍光標識を行った。 FIG. 4 is a diagram showing the results of cell analysis. In this example, the intracellular calcium ion concentration was monitored using a calcium ion concentration sensitive fluorescent dye fluo3 or Indo1. PKC was fluorescently labeled with GFP or YFP using molecular biological techniques.
図４の（１）は、細胞の蛍光画像を示し、図４の（２）は、細胞の所定の点におけるカルシウムイオン濃度の変化を示している。図中の矢印は、画像とグラフとの対応を示している。この図から細胞の変化の様子を画像とグラフから明確に把握することができる。 (1) in FIG. 4 shows a fluorescence image of the cell, and (2) in FIG. 4 shows a change in the calcium ion concentration at a predetermined point of the cell. The arrows in the figure indicate the correspondence between images and graphs. From this figure, it is possible to clearly grasp the state of cell change from images and graphs.
図５は、蛍光偏光度と細胞内カルシウムイオン濃度の変化を示す図である。 FIG. 5 is a diagram showing changes in the degree of fluorescence polarization and the intracellular calcium ion concentration.
この測定結果から、まず細胞内カルシウムイオン濃度が高くなり、続いてＰＫＣが膜に捕捉され蛍光偏光度が高くなり、そしてカルシウムイオン濃度が規定値に戻るに連れてＰＫＣが膜から離れていき、蛍光偏光度が元に戻っていくのが観測された。 From this measurement result, the intracellular calcium ion concentration first increases, then PKC is trapped in the membrane, the degree of fluorescence polarization increases, and PKC moves away from the membrane as the calcium ion concentration returns to the specified value, It was observed that the degree of fluorescence polarization returned.
リン脂質関連酵素がＰＩを分解し、分解したそれぞれがＣａイオン貯蔵部位からカルシウムを動員し、Ｃａイオンと分解物がＰＫＣを活性化することが知られている。今回の測定結果は、この事実を裏付けるものである。 It is known that phospholipid-related enzymes break down PI, each of which breaks down mobilizes calcium from the Ca ion storage site, and Ca ions and degradation products activate PKC. The current measurement results confirm this fact.
［実施例２］ 膜タンパク質と膜タンパク質結合タンパク質との相互作用
蛋白質が、翻訳の場である細胞質から膜を越えて配置されるために必要な膜透過（トランスロケーション）過程を補助する細胞装置である。大腸菌の細胞質膜における膜内在性トランスロケーター蛋白質複合体（チャネル構成因子）の中心となるＳｅｃＹは他の二つの蛋白質（大腸菌ではＳｅｃＥ，ＳｅｃＧ）との３者複合体として存在する。
[Example 2] Interaction between a membrane protein and a membrane protein-binding protein A cellular device that assists in the translocation process required for a protein to be placed across the membrane from the cytoplasm, which is the translation site. is there. SecY, which is the center of the integral translocator protein complex (channel constituent factor) in the cytoplasmic membrane of E. coli, exists as a ternary complex with the other two proteins (SecE and SecG in E. coli).
実施例２では、これら膜蛋白質間の相互作用、および膜透過の駆動力を提供するＡＴＰａｓｅであるＳｅｃＡとの相互作用についての解析を行なう。特にＳｅｃＡはそれ自体が前駆体蛋白質を伴ってＡＴＰ存在下で膜内に深く挿入しＡＴＰ加水分解によって戻るという動きによって蛋白質を膜内に送り込んでいる。この動きはＳｅｃＹＥが３量体を形成し細胞質中のＴｓｅｃＡ、および膜タンパク質との結合、次に膜内への挿入という４段階である。 In Example 2, the interaction between these membrane proteins and the interaction with SecA, which is an ATPase that provides membrane driving force, are analyzed. In particular, SecA itself sends the protein into the membrane by the movement of being inserted deep into the membrane in the presence of ATP with the precursor protein and returning by ATP hydrolysis. This movement is a four-stage process in which SecYE forms a trimer, binds to TsecA in the cytoplasm, and membrane proteins, and then inserts into the membrane.
実施例２では、ＴｓｅｃＡを６３３ｎｍで励起される蛍光色素Ｃｙ５で蛍光標識し、膜タンパク質のＴｓｅｃＹをＴｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ，ＦＩＴＣで標識しておく。ＴｓｅｃＡは細胞内でシグナルペプチドが存在するとそれを介して、ＴｓｅｃＹＥと結合する。そこで、シグナルペプチド添加前後において、ＦＩＴＣが励起される４８８ｎｍの波長の光で細胞を照射して、ＴｓｅｃＡとＴｓｅｃＹの蛍光をそれぞれ解析した。 In Example 2, TsecA is fluorescently labeled with the fluorescent dye Cy5 excited at 633 nm, and TsecY of the membrane protein is labeled with Tetramylrhodamine, FITC. TsecA binds to TsecYE through the presence of a signal peptide in the cell. Therefore, before and after the addition of the signal peptide, the cells were irradiated with light having a wavelength of 488 nm at which FITC was excited, and fluorescence of TsecA and TsecY was analyzed.
図６は、シグナルペプチド添加前後の蛋白質の相互作用を説明する図である。 FIG. 6 is a diagram illustrating protein interactions before and after addition of a signal peptide.
図６の（１）に示すシグナルペプチド添加前、即ち、ＴｓｅｃＡが膜と結合する前は、ＴｓｅｃＹＥが３量体を形成しＦＩＴＣとＲｈｏｄａｍｉｎｅのＦＲＥＴが観測される。つまりＦＩＴＣとＣｙ５の蛍光強度は低く、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅの蛍光強度が高くなる。図６の（２）に示すシグナルペプチド添加後、即ち、ＴｓｅｃＡが膜と結合するとＲｈｏｄａｍｉｎｅ−ＳｅｃＹＥとＣｙ５−ＴｓｅｃＡが接近しＦＲＥＴが起こる。その結果、ＦＩＴＣとＲｈｏｄａｍｉｎｅの蛍光強度が小さくなりＣｙ５の蛍光強度が大きくなる。 Before addition of the signal peptide shown in (1) of FIG. 6, that is, before TsecA binds to the membrane, TsecYE forms a trimer and FRET of FITC and Rhodamine is observed. That is, the fluorescence intensity of FITC and Cy5 is low, and the fluorescence intensity of Rhodamine is high. After addition of the signal peptide shown in (2) of FIG. 6, that is, when TsecA binds to the membrane, Rhodamine-SecYE and Cy5-TsecA come close to each other and FRET occurs. As a result, the fluorescence intensity of FITC and Rhodamine decreases and the fluorescence intensity of Cy5 increases.
この測定を、本試料解析装置を用いて細胞膜から細胞質にかけたＺ方向で複数の点について解析することにより分子の反応の様子をリアルタイムで観測することが可能となった。 By analyzing this measurement with respect to a plurality of points in the Z direction from the cell membrane to the cytoplasm using this sample analyzer, it becomes possible to observe the state of molecular reaction in real time.
図７は、細胞の各部位におけるシグナルペプチド添加前後の測定結果を示す図である。 FIG. 7 is a diagram showing measurement results before and after addition of a signal peptide at each site of a cell.
図７の（２）に示す膜近傍においては、シグナルペプチド添加後でＣｙ５の蛍光強度が高くなり、上述の反応が発生していることが示される。しかし、図７の（１）、（２）に示す膜、細胞質においては、シグナルペプチド添加後でもＣｙ５の蛍光強度は増加しておらず、上述の反応が生じていないことがわかる。 In the vicinity of the membrane shown in (2) of FIG. 7, the fluorescence intensity of Cy5 increases after addition of the signal peptide, indicating that the above-described reaction occurs. However, in the membrane and cytoplasm shown in (1) and (2) of FIG. 7, the fluorescence intensity of Cy5 does not increase even after addition of the signal peptide, indicating that the above reaction does not occur.
［実施例３］ 生物発光の検出
生物で見られる発光現象のなかで、エコーリン及びルシフェリン−ルシフェラーゼは生物学の研究でよく利用されている。
[Example 3] Detection of bioluminescence Among the luminescence phenomena observed in living organisms, echolin and luciferin-luciferase are often used in biological research.
エコーリンはクラゲなどから単離された、カルシウムイオンの濃度測定に利用される発光蛋白質である。エコーリンはアポエコーリンという蛋白質と発光分子が結合したもので、この複合体にカルシウムイオンが結合すると発光分子とアポエコーリンが離れ、そのとき青色に発光する（〜４６６ｎｍ）。 Echoline is a photoprotein isolated from jellyfish and used for measuring calcium ion concentration. Echoline is a protein that binds a protein called apoecholine and a light-emitting molecule. When calcium ions bind to this complex, the light-emitting molecule and apoecholine are separated, and light is emitted in blue at that time (˜466 nm).
蛍光色素によるカルシウムイオン濃度測定と異なり励起を必要としないので自家蛍光などの影響を受けない。遺伝子工学によりつくられたものを用いることによって簡単にまた細胞に負担をかけることなく導入し、細胞内のカルシウムイオン濃度のモニターをすることができる。アポエコーリンの遺伝子も利用でき、ミトコンドリアのなかで発現させミトコンドリア内のカルシウムイオン濃度が測定など細胞内でのある特定のオルガネラについてカルシウムイオン濃度変化の観測をすることが可能である。 Unlike calcium ion concentration measurement with fluorescent dyes, it does not require excitation and is not affected by autofluorescence. By using a gene engineered one, it can be introduced easily and without burdening the cell, and the intracellular calcium ion concentration can be monitored. The apoecholine gene can also be used, and it is possible to observe changes in the calcium ion concentration of a specific organelle in the cell, such as measurement of the calcium ion concentration in the mitochondria when expressed in the mitochondria.
ホタルなどから得られる発光分子であるルシフェリンはルシフェラーゼという酵素（蛋白質）により酸化されるときに発光する（〜５６０ｎｍ）。ホタルのルシフェリン−ルシフェラーゼ反応ではＡＴＰが必須で、非常に感度のよいＡＴＰ検出キットとして利用されている。ルシフェラーゼの遺伝子も得られていて、細胞内で発現させることができる。したがって、細胞内カルシウムイオン濃度変化の計測で必要なカルシウムイオン濃度感受性色素をマイクロインジェクションを用いて導入したり、膜透過性のＡＭ（アセトキシメチルエステル）をもつ色素を用いて蛍光染色する必要が無い。 Luciferin, which is a luminescent molecule obtained from fireflies, emits light (˜560 nm) when oxidized by an enzyme (protein) called luciferase. In the firefly luciferin-luciferase reaction, ATP is essential and is used as a highly sensitive ATP detection kit. A luciferase gene has also been obtained and can be expressed in cells. Therefore, there is no need to introduce a calcium ion concentration sensitive dye necessary for measuring changes in intracellular calcium ion concentration using microinjection or fluorescent dye using a dye having membrane-permeable AM (acetoxymethyl ester). .
このようなアポエコーリンの機能を用い、その他の細胞内の分子を他の分光特性をもつ蛍光色素で染める。励起光は蛍光色素用として用い、生物発光と蛍光色素からの蛍光をそれぞれの光検出器を用いて検出する。この手法を用いると相互相関分光法のように２つの波長で励起し、２つの波長を検出する方法で問題となる試料を励起する領域の色収差によるずれを考慮することなく２つの蛍光を検出することが可能となる。 Using such apoecholine function, other intracellular molecules are dyed with fluorescent dyes having other spectral characteristics. Excitation light is used for a fluorescent dye, and bioluminescence and fluorescence from the fluorescent dye are detected using respective photodetectors. When this method is used, excitation is performed at two wavelengths as in the case of cross-correlation spectroscopy, and two fluorescences are detected without considering a shift due to chromatic aberration in a region that excites the sample in question by a method of detecting two wavelengths. It becomes possible.
なお、この発明は、上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合せにより種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。更に、異なる実施形態に亘る構成要素を適宜組み合せてもよい。 Note that the present invention is not limited to the above-described embodiment as it is, and can be embodied by modifying the constituent elements without departing from the scope of the invention in the implementation stage. Further, various inventions can be formed by appropriately combining a plurality of constituent elements disclosed in the embodiment. For example, some components may be deleted from all the components shown in the embodiment. Furthermore, you may combine suitably the component covering different embodiment.
１…光源、３…ガルバノスキャナー、４…ダイクロイックミラー、４’…ハーフミラー、５…対物レンズ、８…試料、１４…ハーフミラー、１５…検出器、１６…コンピュータ、１７…ダイクロイックミラー、１８…偏光ビームスプリッタ、１９…検出器、２０…検出器、２２…検出器、２４…コンピュータ、２５…コンピュータ。
DESCRIPTION OF
Claims (10)
この光源からの光を試料に集光する集光手段と、
前記試料からの発生光を検出する少なくとも１つの検出手段と
前記検出手段からの検出信号に基づいて、２次元または３次元で前記試料の画像を生成する画像生成手段と、
前記検出手段からの検出信号に基づいて、前記画像の任意の位置ごとの時系列信号を生成する信号生成手段と、
前記時系列信号を前記画像のそれぞれの位置に対応付ける対応付け手段と
を備えたことを特徴とする試料解析装置。 A light source;
Condensing means for condensing light from the light source on the sample;
At least one detection means for detecting light generated from the sample; and an image generation means for generating an image of the sample in two dimensions or three dimensions based on a detection signal from the detection means;
Signal generating means for generating a time-series signal for each arbitrary position of the image based on the detection signal from the detecting means;
A sample analyzing apparatus comprising: an association unit that associates the time-series signal with each position of the image.
前記表示された画像の少なくとも１つの任意の点を指定する指定手段と、
前記画像の指定された少なくとも１つの任意の点に対応する前記時系列信号に基づいて前記試料を解析する解析手段を備えたことを特徴とする請求項１に記載の試料解析装置。 Display means for displaying the image;
Designating means for designating at least one arbitrary point of the displayed image;
The sample analyzing apparatus according to claim 1, further comprising an analyzing unit that analyzes the sample based on the time-series signal corresponding to at least one arbitrary point specified in the image.
前記検出手段は蛍光を検出し、
前記解析手段は、蛍光相関解析、蛍光偏光解析、蛍光共鳴エネルギー移動解析、蛍光寿命解析、蛍光強度解析、蛍光強度分布解析、燐光解析、生物発光解析、化学発光解析、散乱光解析のうち少なくとも１つを実行することを特徴とする請求項２に記載の試料解析装置。 The light generated from the sample contains fluorescence,
The detection means detects fluorescence;
The analysis means includes at least one of fluorescence correlation analysis, fluorescence polarization analysis, fluorescence resonance energy transfer analysis, fluorescence lifetime analysis, fluorescence intensity analysis, fluorescence intensity distribution analysis, phosphorescence analysis, bioluminescence analysis, chemiluminescence analysis, and scattered light analysis. The sample analyzer according to claim 2, wherein one of the two is executed.
前記信号生成手段は、前記偏光成分を検出する前記検出手段からの検出信号に基づいて、前記画像の任意の位置ごとの時系列信号を生成することを特徴とする請求項３に記載の試料解析装置。 A spectroscopic means for spectroscopically splitting the orthogonal polarization components of the fluorescence,
The sample analysis according to claim 3, wherein the signal generation unit generates a time-series signal for each arbitrary position of the image based on a detection signal from the detection unit that detects the polarization component. apparatus.
前記検出手段からの検出信号に基づいて、２次元または３次元で前記試料の画像を生成する画像生成手段と、
前記検出手段からの検出信号に基づいて、前記画像の任意の位置ごとの時系列信号を生成する信号生成手段と、
前記時系列信号を前記画像のそれぞれの位置に対応付ける対応付け手段と
を備えたことを特徴とする試料解析装置。 At least one detection means for detecting self-luminescence from the sample; and an image generation means for generating an image of the sample in two dimensions or three dimensions based on a detection signal from the detection means;
Signal generating means for generating a time-series signal for each arbitrary position of the image based on the detection signal from the detecting means;
A sample analyzing apparatus comprising: an association unit that associates the time-series signal with each position of the image.
蛍光標識された試料の蛍光画像を取得する画像取得手段と、
前記蛍光画像の取得と同時に走査する試料の任意の領域における蛍光標識された分子から発生する蛍光を検出する検出手段と、
前記検出手段からの任意の領域ごとの蛍光信号を保存する保存手段と、
任意の領域ごとに蛍光相関分光法により、並進拡散時間、共焦点領域に存在する蛍光分子の数、回転拡散時間を解析する解析手段と
を備えたことを特徴とする試料解析装置。 An optical system for exciting the sample while performing XY scanning;
An image acquisition means for acquiring a fluorescent image of the fluorescently labeled sample;
Detection means for detecting fluorescence generated from fluorescently labeled molecules in an arbitrary region of the sample that is scanned simultaneously with acquisition of the fluorescence image;
Storage means for storing a fluorescence signal for each arbitrary region from the detection means;
A sample analysis apparatus comprising: analysis means for analyzing a translational diffusion time, the number of fluorescent molecules present in a confocal region, and a rotational diffusion time by fluorescence correlation spectroscopy for each arbitrary region.
蛍光標識された試料の蛍光画像を取得する画像取得手段と、
前記蛍光画像の取得と同時に走査する試料の任意の領域における蛍光標識された分子から発生する蛍光を検出する検出手段と、
前記検出手段からの任意の領域ごとの蛍光信号を保存する保存手段と、
任意の領域ごとに蛍光強度分布解析により、領域に存在する蛍光分子の数、一分子あたりの蛍光強度を解析する解析手段と
を備えたことを特徴とする試料解析装置。 An optical system for exciting the sample while performing XY scanning;
An image acquisition means for acquiring a fluorescent image of the fluorescently labeled sample;
Detection means for detecting fluorescence generated from fluorescently labeled molecules in an arbitrary region of the sample that is scanned simultaneously with acquisition of the fluorescence image;
Storage means for storing a fluorescence signal for each arbitrary region from the detection means;
A sample analysis apparatus comprising: an analysis means for analyzing the number of fluorescent molecules present in a region and the fluorescence intensity per molecule by fluorescence intensity distribution analysis for each arbitrary region.
蛍光標識された試料の蛍光画像を取得する画像取得手段と、
前記蛍光画像の取得と同時に走査する試料の任意の領域における蛍光標識された分子から発生する蛍光を、偏光素子を用いて各偏光成分ごとに検出する検出手段と、
前記検出手段からの任意の領域ごとの蛍光信号を保存する保存手段と、
任意の領域ごとに蛍光強度分布解析により、蛍光分子の回転拡散時間、領域に存在する蛍光分子の数、一分子あたりの蛍光強度を解析する解析手段と
を備えたことを特徴とする試料解析装置。 An optical system for exciting the sample while performing XY scanning;
An image acquisition means for acquiring a fluorescent image of the fluorescently labeled sample;
Detection means for detecting fluorescence generated from fluorescently labeled molecules in an arbitrary region of the sample that is scanned simultaneously with the acquisition of the fluorescence image for each polarization component using a polarizing element;
Storage means for storing a fluorescence signal for each arbitrary region from the detection means;
Specimen analysis device comprising: analysis means for analyzing the rotational diffusion time of fluorescent molecules, the number of fluorescent molecules present in a region, and the fluorescence intensity per molecule by analyzing the fluorescence intensity distribution for each arbitrary region .
蛍光標識された試料の蛍光画像を取得する画像取得手段と、
前記蛍光画像の取得と同時に走査する試料の任意の領域における蛍光標識された分子から発生する蛍光を、分光素子を用いて各波長成分ごとに検出する検出手段と、
各波長成分ごとの検出信号から、蛍光強度分布解析により、蛍光分子の回転拡散時間、共焦点領域に存在する蛍光分子の数、一分子あたりの蛍光強度を解析する解析手段と
を備えたことを特徴とする試料解析装置。 An optical system for exciting a sample fluorescently labeled with a plurality of fluorescent substances that cause fluorescence resonance energy transfer while performing XY scanning;
An image acquisition means for acquiring a fluorescent image of the fluorescently labeled sample;
Detection means for detecting fluorescence generated from fluorescently labeled molecules in an arbitrary region of the sample that is scanned simultaneously with acquisition of the fluorescence image for each wavelength component using a spectroscopic element;
Analytical means for analyzing the rotational diffusion time of fluorescent molecules, the number of fluorescent molecules present in the confocal region, and the fluorescent intensity per molecule from the detection signal for each wavelength component by fluorescence intensity distribution analysis Characteristic sample analyzer.
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
2004
- 2004-06-16 JP JP2004178254A patent/JP2006003154A/en not_active Withdrawn
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