JP2005519604A - 部位特異的組換を用いた、組換ウイルス生産のための高生産性機構 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、組換ウイルスの生産方法、及び組換ウイルスベクターの生産方法に関し、さらに、前記生産方法およびその生産方法によって生産される組換ウイルスにおけるDNA構成に関するものである。
組換ウイルスベクターとは、遺伝学的に作りだされたベクターであり、ワクチンの生成、遺伝子の機能解析、遺伝子群の解析、または遺伝子ドメインの解析等に使用され、さらに蛋白質の生成及び、遺伝子療法等にも使用される。ウイルスベクターに組み込まれるゲノム材料として、遺伝子、cDNA、ゲノムDNA、ペプチドあるいは蛋白質をコードしたDNA配列、RNA、アンチセンスRNA、siRNA(低干渉性RNA)、DNA用のsiRNA、プロモーター、エンハンサー等がある。ベクターの生成に使用されるウイルスとしては、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、B型肝炎ウイルス、ポリオーマウイルス、シンドビド(sindbid)ウイルス、バクシニア(vacxnia)ウイルス等がある。
本発明をより詳細に説明するために、参照の刊行物は本願の一部として含むものである。
〔実施例1:pBacHTSの作製〕
pBacHTSウイルスベクターを作製した。作製にあたり、まず、pBacPAK8(Clontech製、Genebank:U2446)のシャトルベクターのBamHI/EcoRI部位(Clontech社のGenebank:U2446)において、増幅したattR1部位と、pBacPAK8のBsu36I認識塩基配列とをクローニングして、Life Technologies(LTI)社のDH5aを形質転換させ、アンピシリンを含む寒天培地において、培養しスクリーニングすることによって、pBacPAK8-R1(図4参照)を作製した。同様に、pBacPAK8-R1のEcoRI/PacI部位配列にて、PCRで増幅されたattR2部位と、Bsu36I認識部位配列とをクローニングすることによってpBacPAK8-R1R2を生成した(図5参照)。pBacHTSを得るために、pEntr4プラスミド(Invitrogen社)のEcoR1消化断片由来のccdB遺伝子を含むDNA断片(427bp)をpBacPAK8-R1R2に挿入し、得られたプラスミドをDB3.1 cell(LTI社)に導入された。pBacHTSは、attR1部位とattR2部位との間に、二つの異なるBsu36I認識配列を有していた(図2)。attR1部位及びattR2部位には、λバクテリオファージ、Xis、IHF-a及び、IHF-b由来のインテグラーゼ存在下で、attL1及びattL2部位それぞれと反応する部位特異的リコンビナーゼ標的配列を含む。
各種の融合蛋白質を発現する組換バキュロウイルスを作製するために、融合タグをポリヘドリンプロモーターの下流(in the back of polyhedrin promoter)に挿入した。pBacHTS-Gstは、GST融合蛋白質の発現ベクターを生成するために構築された。そのため、pGEX-2T(Genbank:U13850)を、Bg1IIを含むプライマー及び、BamH1 linkerを含むプライマーを用いてPCR増幅し、BglII及びBamHIで処理して、pBacHTS/BamHI制限部位に挿入した。加えて、6個のHisリンカーをpBacHTSのBamHI部位に挿入することによってHisタグ融合蛋白質を発現するベクターを生成pBacHTS-Hisが構築された。さらにPCR増幅され、BglIIとBamHIとで処理されたGST遺伝子をpBacHTS-HisのBamHI部位に挿入することによってpBacHTS-HisGSが構築された。一方、GFP遺伝子をBamHIリンカーを含むプライマー及び、KpnIリンカーを含むプライマーを用いてPCR増幅し、BamHI/KpnIを用いて消化した。その後、消化された遺伝子をpBacHTSのBamHI/KpnI制限部位に挿入し、pBacHTS-GFPを生成した。さらに、pBacHTSのBamHI/KpnI部位において、Flagタグを発現するリンカーを挿入することによって、pBacHTS-Flagを生成した(図7参照)。
pBacHTSプラスミドによってポリヘドリン座位が取り除かれたバキュロウイルスは、相同的組換を用いて準備された。つまり、pBacHTSプラスミド、Bsu36I消化BacPAK6ウイルスDNA(Clontech製、#6144-1)及び、リポフェクチン(LTI製)の混合物をSf21昆虫細胞にトランスフェクト(形質移入)し、細胞内での相同的組換を促した。PCRの対象となる組換えウイルスを、二度繰り返されるプラーク測定を通して単離した。精製されたウイルスクローンをvBacHTSウイルス(配列番号1:ポリヘドリン座位の配列)と呼ぶ(図15参照)。図13に示されるように、pBacHTS-His(図8参照)、pBacHTS-HisGst(図9参照)、pBacHTS-GST(図10参照)、pBacHTS-GFP(図6参照)をそれぞれ、BacPAK6ウイルスと共に導入し、vBacHTS-His(配列番号2:ポリヘドリン座位の配列)、vBacHTS-HisGst(配列番号3:ポリヘドリン座位の配列)、vBacHTS-Gst(配列番号4:ポリヘドリン座位の配列)及び、vBacHTS-GFP(配列番号5:ポリヘドリン座位の配列)を作製した(図15参照)。得られたウイルスは、前記ポリヘドリン座位の配列以外において、野生型AcNPV(GenBank:NC001623)と同じである。ウイルスプラークは寒天培地から選択した。
vBacHTSウイルスDNAを単離するために、Sf21細胞を、細胞培養皿(直径100mm)に蒔くことにより、3日後にウイルス力価が1.2×108pfu/mlのウイルス培養培地を作成した。そして、Sf21細胞1.25×107を、再度細胞培養皿(直径150mm)に蒔き、20倍の量のウイルス(MOI=20)に感染させた。48時間培養した後、一皿当たり、25mlの細胞培養培地を得た。6皿(直径150mm)から得た、計150mlの細胞培養培地を、20,000回転/分(rpm)で90分間遠心分離させることによって、ウイルス粒子を沈殿させ、この沈殿したウイルス粒子をHanil, Supra22kを用いて回収した。回収したウイルス粒子を2mlのTE(10mMのTris―HCl、pH=8.0、1mMのEDTA)に懸濁させ、ショ糖濃度勾配超遠心機(Beckman SW41 rotor)を用いて、30,000回転/分で処理し、50%〜40%ショ糖溶液の層からウイルス粒子を精製した。精製されたウイルスを再度18,000回転/分で90分間、遠心分離した。その後、再度ウイルス粒子の沈殿物を2mlのTE(10mMのTris-HCl、pH=8.0、1mMのEDTA)に懸濁させ、0.5%のSDS、1%のβ−メルカプトエタノール、0.2mgのプロテイナーゼKを加え、42℃で2時間放置し、ウイルス包膜を分離した。同量のフェノール/クロロホルム溶液を用いてウイルスライセート(lysate)を二度抽出し、抽出物にエタノールを加えることにより、沈殿物である純粋なウイルスDNAを得た。そして、50単位(ユニット)の制限酵素Bsu36I(New England Bio labs 社 NEB#524)を、精製されたDNA(10μg)に加えた混合物を、以下の研究に使用する前に2時間、37℃で放置した(図16参照)。
GFPのPCR生成物をattL1とattL2部位との間に挿入しpEntr-GFP遺伝子カセットを作製した。LTI社のpEntr-Gus遺伝子カセットを使用した。
GFP及び、Gusを発現する組換えウイルスを、本研究では作製した。pEntr-GFP遺伝子カセット(100ng)又は、pEntr-Gus遺伝子カセット(100ng)を試験管に移し、4μLのインテグラーゼ、Xis、IHF-a及び、IHF-bを含むインテグラーゼ混合物の存在下で、100ngのBsu36I処理済vBacHTSウイルスDNAと25℃、2時間反応させた。そして、Sf21細胞に、前記の反応混合物をリポフェクチン(LTI製)と共に感染させることによって、組換えウイルスを作製した。二日後、GFP遺伝子カセットを有する昆虫細胞に、緑色蛍光が観測された。また、四日後、ほぼ全ての細胞が緑色蛍光を表した。また、感染した感染細胞内に、蛍光及びウイルス感染の症状が観測された。
本研究では、GFPを発現する組換ウイルスを作製した。作製にあたり、pEntr-GFP遺伝子カセット100ngを、4μLのインテグラーゼ混合物の存在下で反応させた。前記100ngのpEntr-GFP遺伝子カセットには、GFP遺伝子及び、200ngのBsu36I処理されたvBacHTS、vBacHTS-His又は、vBacHTS-HisGstのウイルスDNAが含まれており、前記4μLのインテグラーゼ混合物には、インテグラーゼ、Xis(エグシオネーゼ)(exisionase)、IHF-a及び、IHF-bが含まれている。反応は、25℃で6時間行われた。このようにして、得られた混合物を、組換バキュロウイルスを作製するために、リポフェクチン(LTI製)と共に、Sf21細胞に導入した。27℃で48時間培養した後、蛍光顕微鏡下でGFPの発現が確認された。バキュロウイルスが複製された細胞が蛍光を示したことから、緑色蛍光を示した細胞を数えることによって組換ウイルスの発現効率を測定した。一方、Bsu36I及び500ngのpBacPAK-GFPで処理したBacPAK6ウイルスDNA(Clontech製)をSf21細胞に導入し、Sf21細胞内でのGFPの発現を観察した。
Gusを発現する組換えウイルスを作製し、Gus遺伝子を発現しているプラークの数を数えた。そのために、まず、100ngのpEntr-Gus遺伝子カセットを4μLのインテグラーゼ混合物存在下で反応させた。前記100ngのpEntr-Gus遺伝子カセットには、Gus遺伝子の他に、Bsu36Iにより処理されたvBacHTS、vBacHTS-His又は、vBacHTS-HisGstのウイルスDNAをそれぞれ200ngずつ有しており、前記4μLのインテグラーゼ混合物には、インテグラーゼ、エグシオネーゼ、IHF-a及び、IHF-bが含まれている。反応は、25℃で6時間行われた。このようにして、作られた混合物をリポフェクチン(LTI社)と共にSf21細胞へ導入し、組換バキュロウイルスを生成した。ウイルス培養培地に対し、プラーク測定を行った。一方、組換えウイルスの生産性を測定するために、四日目のウイルス培養培地を拡散し昆虫細胞に導入した。続いて、前記昆虫細胞に、1%低融点アガロースを含む培地を加えた後、四日間培養した。100μLの0.33%中性赤色水溶液及び、25μLのX-Gluc(DMSO 1mlに対し20mg)を加えた後、染色処理を施して四日後に、Gus遺伝子を発現しているプラークの数を数えた(表4参照)。
マルチウエルプレートから所望の組換ウイルスを同時に生成するために、vBacHTSウイルスDNAをBsu36I制限酵素で処理した。本研究では、組換バキュロウイルスの作製と、遺伝子発現を確認するためにGFP遺伝子カセットを採用した。前記GFP遺伝子カセットを同時に96ディープウエルプレート(96-deep well plate)内で培養し、自動装置で精製した。組換反応、昆虫細胞の培養及び、ウイルス感染を8チャンネル・ピペットを用いて行う間、その全工程はマルチウエルプレート内で行われた。2μLのリコンビナーゼ及び4μLの緩衝液の存在下で、約50ngの遺伝子カセットと、200ngのvBacHTSバキュロウイルスDNAとを25℃で12時間反応させた。計20μLの反応混合物をこの反応に使用した。遺伝子カセットの挿入を検知するために、プライマーを用いて、ポリヘドリン座位増幅のためのPCR増幅を行った。
Baculo-Forwardプライマー: 5-actgttttcgtaacagttttg-3(配列番号6)
Baculo-Reverse プライマー: 5-acaacgcacagaatctagc-3 (配列番号7)
結果、極めて高い効率で組換ウイルスDNAが作製された。一方、5μLの組換反応混合物と、5μLの10%リポフェクチン希釈溶液(10% lipofectin dilates)とを混合することによってリポゾームが作製された。次に、このリポゾームは、96ウエルプレート(SPL)内の50,000のSf21細胞に導入された後、細胞を4日間培養した。10μLのウイルスを再度感染させた培養三日目のSf21細胞50,000個が蛋白質発現を示した。GFPウイルスに関しては、蛍光顕微鏡下で、緑色蛍光の発現が確認された。また、GFPウイルス感染による症状の発症も確認された。それぞれのウエルからSDS−PAGEを用いて細胞を単離し、GFP抗体を用いたウエスタンブロットでGFP発現を測定した。GFP蛋白質に関しては、計測値が蛍光顕微鏡下で見られたパターンと類似していた(図22参照)。
マルチウエルプレートから同時に所望の組換バキュロウイルス(約1〜3.2kb)を作製するために、vBacHTS-GFPウイルスDNAをBsu36I制限酵素で処理した。本研究では、pEntr-LacZdelの遺伝子カセットを採用した。pEntr-LacZdelの遺伝子カセットは、96ウエルプレート内において、大腸菌E coli(約3.2kb)由来のβ−ガラクトシダーゼの遺伝子を、PCRクローニングすることによって作製された。なお、このβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、3'-末端において切除されている。具体的には、LacZの遺伝子をPCRクローニングすることによってpEntr-LacZを生成し、その後、ExoIII/S1ディリーションキット(ExoIII/S1 deletion kit)(#K0421)(Fermentas製)を用いて、pEntr-LacZを処理することによってpEntr-LacZdelを作製した。この全工程は、組換反応、昆虫細胞の培養及び、ウイルス感染を、8チャンネルピペットを用いて行うのと同時に、マルチウエルプレート内で行われた。2μLの組換物及び4μLの緩衝液の存在下で、50ngの遺伝子カセット及び200ngのvBacHTSバキュロウイルスDNAを25℃で12時間反応させた。計20μLの反応混合物がこの反応に使用された。遺伝子カセットの挿入を検知するために、一対のプライマー(actgttttcgtaacagttttg 及び acaacgcacagaatctagc)を用いて、PCR増幅を行い、ポリヘドリン座位を増幅した。結果、極めて高い効率で組換ウイルスが作製された(図25参照)。一方、5μLの組換反応混合物と、5μLの10%リポフェクチン希釈液とを混合しリポゾームを作製した。このリポゾームは、96ウエルプレート(SPL)内のSf21細胞50,000個に導入され、細胞を4日間培養された(図26参照)。GFP融合蛋白質の発現を測定するために、SDS−PAGE解析及び、GFP抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った(図26参照)。
本研究では、124個のプロテインキナーゼ遺伝子を有するS. cerevisieを採用した。S. cerevisieゲノムから112個の遺伝子カセットを得るために、遺伝子特異的プライマーを用いて、PCR増幅と、クローニングとを行った。前記遺伝子カセットの組換と、vBacHTS-GFPベクターDNAとにより組換バキュロウイルスを生成した。それぞれの組換ウイルスが、融合した蛋白質に応じて、特有の蛍光を表した(図28参照)。また、ヒトcDNAを32個有する組換バキュロウイルスも同様に作製された。
複製が可能であり、かつ、生体外での組換反応に適用可能なvBacHTS2ウイルス(配列番号8:ポリヘドリン座位配列)を生成するために、pBacHTS2のバキュロウイルス導入ベクターが作製された。得られたvBacHTS2ウイルスの配列は、前記ポリヘドリン座位配列以外において、野生型AcNPV(GenBank:NC001623)のものと同じであった。前記pBacHTS2は、attR1部位とattR2部位との間にあるBsu36I制限酵素認識部位に、BACベクター由来の複製開始点及びCmR(クロラムフェニコール耐性遺伝子)を有していた。したがって、前記pBacHTS2は、バクテリア内での複製が可能なBACベクターの一種であった。BACベクター由来の複製開始点とCmRとを、所望の遺伝子カセットに置き換えることで、vBacHTSウイルスが生体外において生成される。
細菌内で複製される相同的組換を用いて、バキュロウイルスは準備された。つまり、この相同的組換体は、pBacHTS2プラスミドと、Bsu36I消化BacPAK6DNAと、リポフェクチン(LTI製)との混合物を導入することによって、Sf21細胞内で誘発された。感染細胞を、27℃で4日間培養し、100mm皿内において5×106のSf21細胞に導入した。これにより、ウイルスの高い力価を得た。2mlの50%PEG(ポリエチレングリコール)6000を細胞培養培地に加えた後の遠心分離によって、ウイルス粒子の沈殿物を生成した。次いで、プロテイナーゼKを、42℃の混合物に加え、2時間放置することによって、ウイルスエンベロープを取り除いた。同量のフェノール/クロロホルムを用いて、ウイルスライセートを二度抽出し、エタノールを加えた。これにより、沈殿・精製されたvBacHTS2ウイルスDNAを得た。その後、DH10B細胞株(LTI製)を、マイクロパルサー(MicroPulser)(Bio-Rad社)を用いて、前記の精製されたDNAで形質転換し、次に、Cm含有の培養培地で培養することによって、バクテリアコロニーを形成させた。そして、1Lの2×YT培地(1Lにつき、10gの酵母エキス粉末、16gのトリプトン、5gのNaCl)でバクテリアを培養し、その後、DNAを精製してbBacHTS2と命名した(図16)。したがって、この方法によれば、ウイルスDNAを昆虫細胞で培養することなく、バクテリア培養培地から得ることができるので、所要時間とコストの大幅な削減が可能になる。精製された10μgのDNAを、50単位(ユニット)のBsu36Iを用いて、37℃で5時間消化した後、80℃で20分間加熱してBsu36I酵素を不活性化した。同様に、vBacHTS2-GFP(配列番号9:ポリヘドリン座位配列)を相同的組換によってpBacHTS2-GFPベクターから準備し、エレクトロポレーションによってDH10Bに導入した。DNAは精製され、bBacHTS2-GFPと命名された(図16参照)。vBacHTS2-GFPウイルスの配列は、前記ポリヘドリン座位配列以外において、野生型AcNPV(GenBank:NC001623)のものと同じであった。
1μLのインテグラーゼ混合物の存在下において、50ngのpEntr-GFP及びpEntr-Gus遺伝子カセットを、200ngのBsu36I処理済vBacHTS2ウイルスDNAと、25℃で12時間、生体外で反応させた。pEntr-GFP遺伝子カセットの代わりにpEntr-Gus遺伝子カセットを使い、同様の反応を行った。前述の実施例と同様のPCR反応を行った。テンプレートとしての反応混合物、及び、ウイルスポリヘドリン座位を増幅する一対のプライマーを用いてPCR増幅を行い、組換反応があったかどうかを確認した。10pmoleの各プライマーと、Bioneerプレミックスキット(Bioneer premix kit)のチューブ一本とを用いて、計20サイクルのPCRを行った。各サイクルのPCRは、95℃で30秒、50℃で30秒、72℃で3分間行った。PCR反応を完了した後、1%アガロースゲルで、PCR生成物を電気泳動し、組換作業の効率(efficient performance)を確認した。遺伝子カセット反応混合物を、5μLのリポフェクチン(LTI)と共に、Sf21細胞へと導入し、バキュロウイルスを得た。GFP遺伝子カセット反応混合物を導入してから二日後に、昆虫細胞内で、緑色蛍光が観察された。さらに、導入後四日目に殆どの細胞が、緑色蛍光を表した(図25)。緑色蛍光及び感染症状を確認するために、Sf21細胞を、再度ウイルス培養培地を感染させた。同様に、pEntr-Gus遺伝子カセットを、Bsu36I処理済vBacHTS2DNAと25℃で12時間反応させた。その後、得られた反応混合物をSf21細胞に導入し、27℃で4日間培養した。培養した細胞に、6μLのX-Gluc(DMSO 1mlに対し20mg)を加えると、培養培地全体で強い青色を表し、Gus遺伝子の発現だけでなく、Gus遺伝子を有する組換えウイルスが効率的に生成されたことも示した。
前記のように、本発明によれば、より速く、より簡単に組換ウイルスを生成することが出来る。また、高い効率で高力価ウイルスを得ることが出来る。本発明では、部位特異的組換を生体外で行うので、ウイルスゲノムのどの目的部位にも正確に所望の遺伝子を挿入することが可能であり、また膨大な量のウイルスを同時に生成することが可能である。したがって、本発明を高生産性機構に適用し、遺伝子機能研究に用いる数百あるいは数千のウイルスを同時に生成したり、いくつかの組換ウイルスを生成することが可能である。さらに本発明により、組換バキュロウイルスライブラリーを構築し、前記バキュロウイルスライブラリーを、所望のゲノム材料のスクリーニングに利用することも可能である。
Claims (14)
- 発現用環状組換ウイルスベクターの構築方法であって、
1)少なくとも2つの部位特異的組換部位と、少なくとも1つの制限酵素認識部位とを有するウイルスゲノムDNAを準備する工程と、
2)少なくとも2つの部位特異的部位に隣接した、所望のゲノム材料を含む遺伝子カセットを準備する工程と、
3)前記の1)において準備したDNA断片と、2)において準備した遺伝子カセットとを、生体外で反応させる工程とを含むことを特徴とする発現用環状組換ウイルスベクターの構築方法。 - 制限酵素を用いて前記ウイルスゲノムDNAの1つ以上の部位を消化し、線状のウイルスゲノムDNAを生成することを特徴とする請求項1に記載の発現用環状組換ウイルスベクターの構築方法。
- 前記制限酵素は、CCTNAGGの塩基配列を認識することを特徴とする請求項2に記載の発現用環状組換ウイルスベクターの構築方法。
- 前記ウイルスが、バキュロウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、あるいはHBVであることを特徴とする請求項1に記載の発現用環状組換ウイルスベクターの構築方法。
- 請求項1乃至4のいずれかに記載の構築方法によって生成された、組換ウイルスベクター。
- 所望のゲノム材料を含む組換ウイルスのスクリーニング方法であって、
1)少なくとも2つの部位特異的組換部位と、少なくとも一つの制限酵素認識部位とを含むウイルスゲノムDNA断片を準備する工程と、
2)少なくとも2つの部位特異的部位に隣接する所望のゲノム材料を含んだ遺伝子カセットを準備する工程と、
3)発現用環状変換ウイルスベクターを含む反応混合物を生成するために、前記の1)において準備したDNA断片と、2)において準備した遺伝子カセットとを生体外で反応させる工程と、
4)マルチウエルプレート内の宿主に、3)における前記反応混合物を導入する工程と、
5)宿主内における発現を識別する工程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。 - 前記ウイルスが、バキュロウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、HBVの何れかであることを特徴とする所望のゲノム材料を含む組換ウイルスのスクリーニング方法。
- 環状ゲノムDNAを有する組換ウイルスの準備方法であって、
1)少なくとも2つの部位特異的組換部位と、少なくとも1つの制限酵素認識部位とを含むウイルスゲノムDNA断片を準備する工程と、
2)少なくとも2つの部位特異的部位によって隣接された所望のゲノム材料を含む遺伝子カセットを準備する工程と、
3)発現用環状組換ウイルスベクターを含む反応混合物を生成するために、1)において準備したDNA断片と、2)において準備した遺伝子カセットとを生体外で反応させる工程と、
4)マルチウエルプレート内の宿主に、3)における前記反応混合物を導入する工程とを有する組換ウイルスの準備方法。 - 前記ウイルスゲノムDNA断片は、動物細胞に対して非感染性であるか、複製かつウイルス粒子形成が不可能であるとともに、細菌型の複製開始点と抗生物質耐性DNAとを含んでいることを特徴とする請求項8に記載の環状ゲノムDNAを有する組換ウイルスの準備方法。
- 宿主への前記反応混合物の導入は、マルチウエルプレート内で行われることを特徴とする請求項8に記載の環状ゲノムDNAを有する組換ウイルスの準備方法。
- 制限酵素を用いて前記ウイルスゲノムDNAの1つ以上の部位を消化し、線状のウイルスゲノムDNAを生成することを特徴とする請求項8に記載の環状ゲノムDNAを有する組換ウイルスの準備方法。
- 前記制限酵素は、CCTNAGGの塩基配列を認識することを特徴とする請求項8に記載の環状ゲノムDNAを有する組換ウイルスの準備方法。
- 前記ウイルスは、バキュロウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、HBVの何れかであることを特徴とする請求項8に記載の環状ゲノムDNAを有する組換ウイルスの準備方法。
- 請求項8乃至13のいずれかに記載の準備方法によって準備された組換ウイルス。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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