JP2005509595A - 示差的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）活性を有する結合作用因子 - Google Patents

示差的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）活性を有する結合作用因子 Download PDF

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Abstract

標的への結合が生じるまで、結合作用因子の第１の部分の特定の活性が低減または防止される示差的活性を有する結合作用因子を提供する。これは、結合作用因子をエフェクター細胞および破壊する標的の両方に結合させることを意図する場合に有用である。なぜなら、エフェクター細胞を、さもなくば生じてしまう(例えば、補体および/またはADCCの未熟活性による)有意な細胞損害から保護できるからである。このような結合作用因子は、例えば、癌の治療において有用である。

Description

本発明は、結合作用因子、特に、癌細胞または他の生物学的標的を標的化するのに有用な結合作用因子に関する。特に、本発明は、抗体および抗体構築物、特に二重特異性抗体構築物に関する。
抗体およびその誘導体は、長年の間、癌細胞を含む生物学的標的を標的化するために使用されてきた。抗体の主要なクラスは、長く(extended)かつ柔軟(flexible)なヒンジで連結された３つの球状モジュール(２つのFabおよび１つのFc)を有するIgGクラスである。Fabモジュールはそれぞれ、完全抗原結合部位を提示し、Fcは、(a)抗体被覆標的細胞を破壊するために必要な分子および細胞エフェクターを取り込む(recruit)こと、および(b)各抗体クラスの特定の転送および代謝特性を指図すること、に関与する。Fcモジュールにより取り込まれた細胞は、Fcの表面上の部位にドッキングするFc受容体(FcR)と呼ばれる分子を提示する。
マウスIgG1分子を、図１Ａおよび１Ｂに示す。図１Ａは、鎖の性質および鎖間ジスルフィド(SS)結合を示す。鎖(２本の軽鎖、２本の重鎖、上にＮ末端、下にＣ末端)を、黒いリボンとして表している。鎖間非共有結合のセットは斜線をひいた長方形で表し、２つの抗体部位は破線でひいた弧で表している。ヒトIgGは、重鎖間SS結合を３つではなく２つ有する点だけが異なる。
図１Ｂは、タンパク質コンホメーション全体の二次元図表示を示す。抗体部位は三角の窪み(indentation)で表し、鎖間の非共有相互作用は破線で表す。鎖は、各重鎖の延長配列を含むヒンジでつながった３つの球状領域で構成されているように示されている。Fc領域は、エフェクター分子(補体として知られるセット)およびエフェクター細胞(主にマクロファージおよびNKリンパ球)を取り込むための配列を提示する。Fcは、IgG分子を、リソソーム酵素から隔離することにより、その代謝生命を引き延ばすさらなる配列セットを含む。
モノクローナル抗体技術が70年代半ばに説明されてから間もなく、概してIgGクラスの抗体が、腫瘍細胞の表面上の分子を照準として、癌治療において試みられた。約15年の間、ほとんど成果は得られなかった。この理由をいくつか以下に記載する：
(a)マウスFc上のFcRI、IIおよびIIIのドッキング部位は、ヒトエフェクター細胞に対する親和性が低くかつ変化する(GT Stevenson. Immunotherapy of Tumours in Clinical Aspects of Immunology, PJ Lachmannら編, Blackwell Scientific Publications, 1993, pp 1799-1830)。そして、これは、現在、抗体被覆腫瘍標的を破壊するのに関与する主要な作用因子と考えられている(R ClynesらInhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets. Nature Medicine 6:443, 2000)。
(b)FcRnに対するマウスFc上のドッキング部位は、ヒトFcRnに対して検出可能な親和性を持たず、従って、治療用マウスIgG抗体はヒトにおける存続が非常に短い。
(c)マウスIgG分子は、ヒト免疫系により外来物とみなされ、多くの場合約10日後にそれに対する(多くはそのFcゾーンに対して)抗体を生成し、ヒト宿主におけるマウス抗体の存続をさらに短くする。
これらの問題は、抗原結合部位にマウスアミノ酸配列を保持するが、抗体の残り全体またはほとんどについてはヒトIgG配列を有するキメラ抗体の発明により、大分克服された。これにより、ヒトエフェクター細胞の取り込み、およびヒト宿主中での代謝的存続が改善され、抗体に対する任意の免疫応答は深刻でない規模にまで低くなった。いくつかのキメラ抗体が、臨床的用途について認可されているが、これらの有効性はまだ多くを望まれている。(DG Maloneyら IDEC-C2B8 (rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin's lymphoma. Blood 90:2188-2195, 1997)。これは、一般的に哺乳動物細胞等の癌細胞が、抗体攻撃に対して様々な有効な防御を有し、これらが都合の悪い自己免疫応答に対処するように進化したためと思われるからである。
抗体攻撃の効力を改善して、癌細胞の防御を制圧するかまたは回避するために多くの試みが行われてきた。これらの中でも卓越していたのが二重特異性抗体であり、これは同一の抗体部位ではなく２つの異なる抗体部位を有する。一方の部位は、腫瘍に対して特異的なままであり、他方は様々な目的のために使用する。多くの場合、ヒトエフェクター細胞上のFcRを標的とする。これにより、エフェクター細胞は、腫瘍細胞と接触し、適切に活性化されればそれを破壊する。この手段によるエフェクター細胞の取り込みは、Fcによる通常の取り込みよりも執拗である。FcRに対する抗体部位の親和性(KA＝107-108)は、典型的に、Fc-FcR親和性よりも約100倍上回る。
二重特異性抗体について２つの最もよくある設計を、図２Ａおよび２Ｂに示す。それぞれ、臨床的治験の対象となったが、成果は限定されていた。図２Ａに示す構築物は、腫瘍細胞への結合が弱く、約24時間の制限された半減期しか持たない。図２Ｂに示す構築物も、腫瘍細胞に弱くしか結合しない。さらに、エフェクター細胞にのみ付着した場合、構築物のFc部分によるエフェクターの取り込みにより損害を生じ得る。
上記議論から、生物学的標的に対する改善された結合作用因子、特に癌治療において有用な結合作用因子を開発する必要がおおいにあることが理解されるであろう。
本発明の第一の態様によれば、本発明者らは、(a)結合作用因子が生物学的標的に結合している場合に、抗体Fc領域の１つ以上の生物学的活性を含む第１の部分；(b)２以上の結合価で、該生物学的標的に結合可能な第２の部分；および(c)エフェクター細胞に一価結合して、該第２の部分が該生物学的標的に結合している場合に該エフェクター細胞が該生物学的標的に作用できるようにする第３の部分、を含む、結合作用因子を提供する。
好適な実施形態では、エフェクター細胞は、生物学的標的を、破壊、損害、変化または除去可能である。生物学的標的は、ヒトまたは非ヒト動物に対して有害であることが好ましい。生物学的標的は癌細胞またはその一部であることが好ましい。
結合作用因子がエフェクター細胞のみと結合する場合と比べて、結合作用因子が生物学的標的と結合した場合に第１の部分の生物学的活性の少なくとも１つが変化することが好ましい。
第１の部分の少なくとも１つの生物学的活性が、結合作用因子がエフェクター細胞のみに結合した場合よりも、該結合作用因子が生物学的標的に結合した場合に少なくとも10倍高いことがより好ましい。
結合作用因子は、第２の部分と生物学的標的との結合の不在下では、立体障害により第１の部分の少なくとも１つの生物学的活性が妨害または低減され、第２の部分が生物学的標的に結合した場合には該立体障害が除去または低減されるように構成されていてもよい。
第１の部分が、第２の部分と生物学的標的との結合の不在下で立体障害を受けないFcRnドッキング部位を有することが好ましい。第１の部分は、結合作用因子が生物学的標的に結合した場合に、以下の生物学的活性、すなわち(a)補体活性；および(b)新生児またはBrambell Fc受容体(FcRn)への結合、の生物学的活性の１つ以上を含むことが好ましい。
好適な実施形態では、結合作用因子と生物学的標的との結合の不在下ではエフェクター細胞の活性を低減するように、結合作用因子は改変される。
結合作用因子と生物学的標的との結合の不在下では、FcRI、RcRIIおよび/またはFcRII受容体への結合が低減するように、結合作用因子が改変されることが好ましい。
第１の部分が、天然型Fc分子が通常伴う１つ以上のグリカン(好ましくは２つのグリカン)を欠くFc領域を含むことが好ましい。グリカンは、IgG重鎖の297位に対応するアスパラギンに連結したものであることが好ましい。第１の部分は、好ましくはグリコアミダーゼPNGアーゼFで酵素的に脱グリコシル化されるFc領域を含むことが好ましい。
あるいはまた、またはさらに、第１の部分は、IgG重鎖の297位に対応するアスパラギン残基が、非グリコシル化可能なアミノ酸残基で置き換えられた組換えFc領域を含む。
別の実施形態では、第１の部分は、結合作用因子が生物学的標的に結合する場合に、以下の生物学的活性：すなわち、(c)食作用細胞による食作用の誘発または刺激；および(d)抗体依存性細胞傷害(ADCC)、の１つ以上をさらに含む。さらに、少なくとも１つの生物学的活性が、FcRI、FcRIIおよび/またはFcRIII受容体との結合を含み得る。
in vivoでの結合作用因子のリソソーム分解を低減する第１の部分へのエンドソーム結合が妨げられないことが好ましい。
第２の部分は、複数の異なる生物学的標的、または同じ生物学的標的の複数の異なる部分に結合可能であることが好ましい。
好適な実施形態では、結合作用因子は、１つ以上のFab、Fab'もしくはF(ab')2領域またはその部分を含む。結合作用因子は、１つ以上のFc領域、またはその部分を含むことが好ましい。結合作用因子は、少なくとも１つの抗標的Fab、Fab'もしくはF(ab')2領域もしくはその部分、少なくとも１つの抗エフェクター細胞Fab、またはFab'領域もしくはその部分、および少なくとも１つのFc領域もしくはその一部を含むことが好ましい。好適な実施形態では、結合作用因子は、少なくとも２つの抗標的Fab、Fab'もしくはF(ab')2領域またはその部分を含む。
結合作用因子の第１、第２および第３の部分の任意の１つ以上がIgG分子から誘導されることが好ましい。結合作用因子の第１、第２および第３の部分の任意の１つ以上が互いと共有結合していてもよい。結合作用因子は、システイン残基間を連結させる１つ以上のタンデムチオエーテル結合を含んでいてもよい。
第２の部分は、生物学的標的に特異的に結合することが好ましい。第２の部分は、抗CD20および/または抗CD-37結合活性を含むことが好ましい。
第３の部分は、エフェクター細胞に特異的に結合することが好ましい。第３の部分は、抗CD16結合活性を含むことが好ましい。
結合作用因子は、１つのモジュールは生物学的標的に結合可能で、１つのモジュールはエフェクター細胞に結合可能で、そして結合作用因子が生物学的標的に結合している場合に別のモジュールは抗体Fc領域の１つ以上の生物学的活性を含むモジュール構造を含み得る。結合作用因子は、同じ生物学的標的に結合可能な２つのモジュールを含むことが好ましい。
本発明の第３の態様では、エフェクター細胞に結合している、上記記載したような結合作用因子を提供する。
本発明の第４の態様では、記載の結合作用因子の製造において使用するための、結合作用因子の部分、成分またはモジュールを提供する。
本発明の第５の態様では、複数のモジュールを得て、それらをシステイン残基の間でタンデムチオエーテル結合により連結することを含む、結合作用因子を得る方法を提供する。
本発明の第６の態様では、(a)結合作用因子が生物学的標的に結合している場合に抗体Fc領域の１つ以上の生物学的活性を含む第１の部分を得るステップ；(b)２以上の結合価を有する生物学的標的に結合可能な第２の部分を得るステップ；(c)エフェクター細胞と一価結合可能で、第２の部分が該生物学的標的と結合している場合にエフェクター細胞が生物学的標的に対して作用できるようにする第３の部分を得るステップ；ならびに第１、第２および第３の部分を共有結合させるステップを含む、結合作用因子を得る方法を提供する。
結合作用因子のモジュールまたは部分は、本発明の上記態様に記載されるとおりであることが好ましい。モジュールまたは部分は、マレイミドリンカー(例えば、ｏ-フェニレンジマレイミド(PDM))を介して連結されることが好ましい。
本発明の第７の態様では、医薬に使用する、上記態様のいずれかに記載の結合作用因子を提供する。
本発明の第８の態様では、生物学的標的によって引き起こされるかまたは生物学的標的が関与する疾患または障害を治療するための医薬の調製における結合作用因子の使用を提供する。疾患または障害は、癌、リンパ腫(例えば、Ｂ細胞リンパ腫)、感染症または障害、および自己免疫疾患または障害からなる群より選択されることが好ましい。
本発明の第10の態様では、製薬上許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を任意に含む、記載の結合作用因子を含む医薬組成物を提供する。
本発明の第11の態様では、好ましくはコンピュータで作成された画像またはモデルである、記載の結合作用因子の画像またはモデルを提供する。本発明の第12の態様では、このような画像またはモデルについてのデータを含む、データ担体を提供する。本発明の第13の態様では、このような画像もしくはモデルについてのデータを含む、および/またはこのようなデータ担体を含む、コンピュータを提供する。
本発明の第14の態様では、記載の画像もしくはモデル、記載のデータ担体、または記載のコンピュータを得ること、ならびにそれを使用して、可能性のある新規治療結合作用因子の構造および/または機能について予測すること、を含む方法を提供する。本方法は、１つ以上の変化を画像またはモデルに加えること、および任意にこれらの変化の影響を予測または分析すること、を含むことが好ましい。
本発明の第15の態様では、記載の結合作用因子、記載の画像もしくはモデル、記載のデータ担体、記載のコンピュータ、または記載の方法を使用する薬剤開発プログラムを提供する。
本発明の第16の態様では、このような薬剤開発プログラムを使用して得られたまたは同定された、薬剤または薬剤候補物質を提供する。
本発明の第17の態様では、記載の結合作用因子、または記載の薬剤もしくは薬剤候補物質を得ること、ならびに生物学的標的に対する該結合作用因子、薬剤または薬剤候補物質の活性および/または結合をin vivoまたはin vitroでテストすることを含む、方法を提供する。
本発明の第18の態様では、記載の結合作用因子、または記載の薬剤もしくは薬剤候補物質を得ること、および該結合作用因子、薬剤または薬剤候補物質の毒性をin vivoまたはin vitroでテストすることを含む、方法を提供する。
本発明の第19の態様では、固定化形態の、記載の結合作用因子、または記載の薬剤もしくは薬剤候補物質を提供する。
本発明の第20の態様では、記載の結合作用因子、または記載の薬剤もしくは薬剤候補物質を含むアレイを提供する。
本発明の第21の態様では、(a)マトリックスにFc含有ポリペプチドを曝すステップ；(b)疎水性相互作用によりFc含有ポリペプチドをマトリックスに結合させるステップ；(c)疎水性相互作用を妨害することにより該マトリックスからFc含有ポリペプチドを除去するステップ、を含む方法を提供する。
本発明の第22の態様では、(a)サンプルをマトリックスに曝すこと；(b)疎水性相互作用によりFc含有ポリペプチドをマトリックスに結合させること；および任意に、該マトリックスを洗浄することにより該サンプルの１つ以上の成分を除去すること；ならびに(c)該疎水性相互作用を妨害することで、マトリックスからFc含有ポリペプチドを取り出すことを含む、サンプル中の他の成分からFc含有ポリペプチドを分離する方法を提供する。
マトリックスは、Toyopearl TSK-ブチル-650を含むことが好ましい。
多くの場合、標的は、ヒトまたは非ヒト動物に対して有害である。従って、エフェクター細胞は、標的を、破壊、損害、変化または除去できることが好ましい。エフェクター細胞は、(例えば、サイトカインまたは他の細胞等の他の部分の取り込みを介して)これを直接的におよび/または間接的に行い得る。
従って、本明細書において使用する「エフェクター細胞」とは、所望の生物学的効果を上昇または促進できる任意の細胞であり得る。好ましい細胞としては、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球細胞および樹状細胞が挙げられる。
エフェクター細胞は、分子の第１の部分により仲介される抗体Fc生物学的活性から都合良く保護される。好適な実施形態では、Fcモジュールの活性は、標的結合の不在下にて(例えば、立体的手段により)妨害され、標的細胞結合の不在下では結合作用因子-エフェクター細胞複合体の抗体Fc活性が比較的低減される。少なくとも１つの抗体Fc活性が、標的結合に対して10倍、好ましくは20倍、40倍、60倍、100倍以上高められることが都合がよい。さらに好適な態様では、１つを上回る抗体Fc活性(例えば、２、３、４以上以上のこのような活性)もこのように高められ得る。
好適な態様では、結合作用因子は、抗体フラグメント同士を共有結合させることにより構築される。第１の部分は抗体Fc領域を含み、第２および第３の部分はFv、scFv、Fab、F(ab')2およびFab'等の抗体フラグメントから選択されることが好ましい。フラグメントは、ｏ-フェニレンジマレイミド等のマレイミドリンカーを介して都合良く連結される。
本明細書に記載する方法および組成物は、以下に記載するように獣医学および診断を含む医学に様々に適用できる。
さらに、本明細書に記載する分子は、分子モデリングおよび薬剤設計の用途のためにコンピュータ内(in silico)で提供され得る。従って、本発明者らは、記載する分子のコンピュータ内モデルを提供する。上記態様では、結合作用因子の構造モデルは、分子モデリング技術を用いて生成されることが好ましい。これらは、コンピュータ実行型モデリング技術であることが有利である。適切なプログラムとしては、グリッド利用型(grid-based)技術および/または多コピー同時検索(MCSS)方法が挙げられる。これらは、当業者によく知られている。あるいはまた、官能基のモデルをその結合ポケットにマニュアルでドッキングさせて、結合作用因子のコンピュータモデルの視覚的な検査を行ってもよい。
本明細書に記載するように構造モデルを生成した後、標的結合をシミュレートまたはモジュレートする可能性のある標的および/またはエフェクター基を、例えば、以下の、本明細書に定義するような活性基(pharmacophore)を定義することによる新規化合物設計、および/または本明細書に記載する自動化ドッキングアルゴリズムを使用した新規化合物設計のうちの１つ以上の技術により同定し得る。
第一の態様では、新規化合物設計は、適切なコンピュータソフトウェアを使用して行ってもよい。本態様の好適な実施形態では、ソフトウェアは、QUANTA、SYBYL、HOOKおよびCAVEATからなる群より選択される。あるいはまた、官能基の連結はマニュアルで行ってもよい。
本明細書に記載する方法および組成物における使用に適したコンピュータ内ライブラリーは、当業者に公知であり、Available Chemical Directory (MDL Inc)、Derwent World Drug Index (WDI)、BioByteMasterFile、National Cancer Instituteデータベース(NCI)、およびMaybridgeカタログが挙げられる。
別の態様では、本明細書に記載する１つ以上の方法を使用して同定可能な化合物を提供する。
さらに別の態様では、本明細書に記載する結合作用因子の原子配位を含むことを特徴とする、コンピュータ用のコンピュータ読出し可能媒体を提供する。
本明細書に記載の方法および組成物は、特に明記しない限り、当業者の技能範囲内にある、化学、分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の従来技術を採用し得る。このような技術は、文献で説明されている。例えば、J. Sambrook, E.F. FritschおよびT. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel, F.M.ら(1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, 第9, 13および16章, John Wiley and Sons, New York, N.Y.)；B. Roe, J. CrabtreeおよびA. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley and Sons；J.M. PolakおよびJames O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press；M.J Gait(編集), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press；D.M.J. LilleyおよびJ.E.Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press；Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO.I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies: A Laboratory Manual by Ed Harlow(編集), David Lane(編集)(1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855. Handbook of Drug Screening, Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes編(2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9)；ならびにLab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Jane RoskamsおよびLinda Rodgers編, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3を参照のこと。これらの文献は、参照により本明細書に援用する。
本明細書に記載する結合作用因子は３つの部分からなる。結合作用因子の第１の部分は、結合作用因子が生物学的標的に結合した場合に、抗体Fc領域の１つ以上の生物学的活性を有する。
結合作用因子の第１の部分は、結合作用因子が生物学的標的に結合した場合に以下の： (a)補体活性(C1qに結合することにより哺乳動物において得られる)；および(b)食作用の誘発または刺激；のうちの１つ以上の生物学的活性を有することが望ましい。
以下にさらに詳細に記載する特定の実施形態では、結合作用因子の第１の部分は、結合作用因子が生物学的標的に結合した場合に以下の： (c)抗体依存性細胞傷害(ADCC)；(d)新生児またはBrambell Fc受容体(FcRn)への結合；のうちの１つ以上の生物学的活性をさらに含む。
示差的（differential）活性
結合作用因子が標的に結合しない場合、第１の部分の生物学的活性の一部または全てが存在する必要はない。しかし、結合作用因子が標的に結合しない場合に、新生児受容体FcRnに結合する能力が、結合作用因子に存在することが好ましい。
実際、これらの１つ以上の活性が不在であるか、または比較的低いレベルでのみ存在することが好ましい。比較的低いレベルとは、例えば、結合作用因子が標的に結合する場合に存在する活性のレベルの50％未満、10％未満、または１％未満であると考えられ得る。天然型抗体分子(IgG)では、生物学的活性の活性化は、凝集結合に依存して、複数の(arrays of)Fc部分を形成する；エフェクター細胞への結合もこのような活性を上向き調節し得る。本明細書に記載する構築物の１つの実施形態では、上記活性(a)〜(c)は、エフェクター細胞のみが結合する事象において妨げになり、標的結合に依存する。
好適な実施形態では、結合作用因子が標的に結合していない場合の結合作用因子の細胞溶解活性は、標的に結合している場合よりも比較的低い。第１の部分の細胞溶解活性は、作用因子がエフェクター細胞のみに結合している場合と比べて、作用因子が標的に結合している場合に少なくとも10倍高いことが好ましい。細胞溶解活性は、少なくとも10倍高いことが好ましい。50％の平坦域細胞溶解を誘導する結合作用因子の力価は、エフェクター細胞にのみ結合している場合と比べて、標的に結合している場合に、少なくとも５分の１、好ましくは10分の１、より好ましくは50分の１または100分の１であることが好ましい。
従って、本明細書に記載する方法および組成物は、結合作用因子の第１の部分の特定の活性が、第２の部分と標的との結合が生じるまで低減または妨げられるような「示差的活性」を可能にする。
エフェクター細胞が結合作用因子に結合し、標的には結合していない場合に示差的活性の性質は有用である。なぜなら、エフェクター細胞は、さもなければ(例えば、補体および/またはADCCの未熟活性により)生じ得る有意なFc仲介型細胞損害から守られるからである。しかし、標的が結合作用因子に結合している場合でも、標的に対する比較的高い活性を得ることができる。
これまで、このような示差的活性を有する結合作用因子を提供することは、当該分野において考慮されていなかった。実際、エフェクター細胞および癌細胞標的の両方に結合するように設計された先行技術の結合作用因子は、初期の段階で補体活性および/またはADCCが生じるという欠点に見舞われて、エフェクター細胞が標的細胞近くに辿りつくまでに破壊または損害を受けるということが多かった。従って、本明細書に記載する結合作用因子の提供は、免疫療法の分野において多大な進展を示す。
理論に限定されることなく、示差的活性は、結合作用因子がエフェクター細胞には結合し標的に結合していない場合に結合作用因子の第１の部分上に存在する１つ以上の部位の立体障害により得られると考えられている；立体障害の除去または低減は、結合作用因子の第２の部分が標的に結合したときに生じると考えられている。より具体的には、結合作用因子の第２の部分は、結合していない状態で、結合作用因子の第１の部分上に存在する１つ以上の機能的部位の立体障害を生じ、標的に対する結合のコンホメーション的な変化が生じて、第１の部分の該１つ以上の部位の立体障害を除去または低減すると考えられている。さらに、第２の部分が２以上の結合価を有する実施形態では、標的およびエフェクター細胞エピトープに対する分子における示差的な価数も示差的活性に寄与し得る。
結合作用因子の第１の部分
非常に好適な実施形態では、第１の部分は、免疫グロブリンのFc領域の少なくとも一部、好ましくはIgG抗体のFc領域を含む。
Fc領域は、エフェクター分子(補体として知られるセット)およびエフェクター細胞(主にマクロファージおよびNKリンパ球)の取り込みのための配列を提示する。Fcは、IgG分子をリソソーム酵素から隔離することによりその代謝生命を延ばすさらに別の配列セットを含む。ヒンジ近傍領域における２つの重鎖の間の空間は、図１中で長方形で示す、各重鎖上のアスパラギン297に付着した２本のオリゴ糖鎖の形態の炭水化物により、埋められている。
Fc相互作用のためのドッキング部位は、図１中で斜線領域として示している。(分子の対称を反映する第２の鏡像部位セットは図示していない)。マクロファージ等のエフェクター細胞は、IgGのFcについて３つのクラスの受容体(FcRI、IIおよびIII)を提示する。これらの受容体は、低い方のヒンジに関与しかつ隣接する共通部位(炭水化物鎖により開放状態にされた(kept patent)なカップ形領域)について競合する。補体についての部位も、図１中で、低い方のヒンジ付近に示される。全身の様々な細胞において見とめられる、代謝存続を延ばすための受容体(新生児Fc受容体(FcRn)またはBrambell受容体)は、重鎖のＣ末端にさらに向かってドッキング部位を有する。
FcRI、IIおよびIIIについてのドッキング部位は、FcRnについての部位と同様(WL Martinら Crystal structure at 2.8Å of an FcRn/heterodimeric Fc complex: mechanism of pH-dependent binding. Molecular Cell 7:876-77, 2001)、Ｘ線結晶学により可視化されてきた(P Sondermannら The 3.2-Å crystal structure of the human IgG1 Fc fragment-FcγRIII complex. Nature 406:267-273, 2000)。補体部位は部位特異的突然変異誘発により推定されてきたが、詳細はいくらか曖昧である(AR DuncanおよびG Winter. The binding site for C1q on IgG. Nature 332:738-740, 1988；MH Taoら. Structural features of human immunoglobulin-G that determine isotype-specific differences in complement activation. J. Exp. Med. 178:661-667, 1993)。
FcRn部位
FcRnドッキング部位は、エフェクター細胞上のFcRI、FcRIIおよびRcRIIIファミリーに対する共通部位と区別される(図１)。FcRnは、様々な細胞上に存在し、妊婦IgGが胎盤および新生児内臓に輸送されることに関与するために「新生児Fc受容体」と呼ばれる。これらの輸送機能に加えて、FcRnは、IgG分子の代謝存続の延長に関与する。ヒトにおいては、IgGは、他の抗体クラスが３〜４日間であるのに比べて、約20日間の半減期で身体中で存続すると思われる(治療上非常に重要な点)。FcRnは、血漿タンパク質を内在化し分解する、細胞のエンドソーム上に提示される。摂取されるIgGのほとんどが、このFcRnに結合され、これは、IgGを、他のタンパク質と共に細胞のリソソーム中で破壊させる代わりに、血流に戻す。
結合作用因子が(標的に結合する前に)エフェクター細胞に結合した場合に立体障害を起こすと考えられている１つの部位が、IgGのFc領域上に存在し、結合作用因子が標的に結合した場合に補体仲介型細胞傷害の誘発に関与する。ヒトにおいては、この部位はC1q結合部位である。
立体障害を起こすと考えられている別の部位は、FcRI、FcRIIおよびFcRIII受容体に結合する部位である。
対照的に、(エンドソーム受容体への結合に関与して、リソソーム分解を防止または低減させる)FcRn結合部位は、実質的に立体障害を受けないと考えられている。この部位における実質的な立体障害の不在は、結合作用因子が使用される際の半減期を高めるのに非常に有利であると考えられている。ヒトにおける半減期は少なくとも１日であることが好ましい。この半減期は、少なくとも２日間、少なくとも４日間または少なくとも８日間であることがより好ましい。この半減期は、少なくとも16日間であることが最も好ましい。
好ましい結合作用因子としては、エフェクター細胞結合部分よりも高い結合価を有する標的結合部分を含む。例えば、標的結合部分は、２、３または４つのエピトープ(これらは同じであっても異なってもよい)に結合し得、エフェクター細胞結合部位はより少ない数のエピトープ(例えば、単一のエピトープ)に結合し得る。好適な実施形態では、標的結合部分は２つのエピトープに結合し、エフェクター細胞結合部分は１つのエピトープに結合する。
好適な実施形態は、２以上の結合価を有する標的結合部分からなるが、一価結合作用因子も想定される。このような構築物は、２つではなく１つのFab(抗標的)モジュールを有し、特定の状況において有用であり得る。非常に速いモジュレーション(細胞表面分子を標的とするあらゆる抗体による攻撃にも抵抗するように細胞を支援する、再分配および内在化のプロセス)を経て架橋に応答する細胞表面分子が少数ある。このような標的では、一価抗体が、二価抗体よりも有効であることが示されている(MJ GlennieおよびGT Stevenson. Univalent antibodies kill tumour cells in vitro and in vivo. Nature 295:712-714, 1982)。
結合は特異的であって、エフェクターおよび標的結合部分が、エフェクターおよび標的にそれぞれ結合する際に所望でない部分と交差反応しないことが望ましい。例えば、エフェクター結合部分は、特異的な抗CD16結合活性を有し、標的結合部分は特異的な抗CD20および/または抗CD37結合活性を有し得る。
場合により、結合作用因子は、既にエフェクター細胞に結合した形態で提供され得る。あるいはまた、未結合状態で提供され、in vivoでエフェクター細胞に結合し得る。
好適な実施形態では、結合作用因子の第１の部分は、Fc受容体に対する結合が低減または損なわれるように改変される。第１の部分は、Fc受容体結合活性を含まないことが好ましい。Fc受容体は、FcRI、FcRIIおよびFcRIII受容体ファミリーの１つ以上から選択される。
Fc結合活性の低減または失活は、天然型IgG Fc領域が通常伴う１つ以上のオリゴ糖またはグリカンの除去により達成されることが好ましい。Fc領域に共有結合したグリカンは、除去されることが好ましい。グリカンは、好ましくはアスパラギン結合グリカン、より好ましくはIgG重鎖上の残基番号297に対応するアスパラギン残基に付着したグリカンを含む。
脱グリコシル化は、例えば、アミダーゼまたはグリコアミダーゼ等の適切なオリゴ糖切断酵素により、酵素的に達成され得る。あらゆる適切なグリコアミダーゼが使用され得るが、好ましい酵素は、TarentinoおよびPlummer(1994, Meth Enz 230, 44-57)に詳細に記載されているペプチド-N4-(N-アセチル-β-グルコサミニル(glucosaminyl))アスパラギンアミダーゼPNGアーゼF(EC 3.5.1.52)である。結合作用因子は、その成分部分が一緒にされる前、途中または後で、酵素と反応させてもよい(すなわち、グリカンは、任意のFab成分との連結の前または後にFc領域から除去され得る)。結合作用因子の第１の部分を含むFc成分は、アセンブルされる前に酵素で処置された方が好ましい。
さらに、グリカン除去は、遺伝子手段により生じ得ることが理解されるであろう。従って、突然変異を、Fc領域のコード配列、または重鎖コード配列に導入してもよい。適切な突然変異は、コードするアミノ酸中のアスパラギン残基を、非グリコシル化可能残基(セリンまたはトレオニン以外の残基、好ましくはアラニン残基等)と置換するものである。
免疫グロブリン
好ましい結合作用因子は、IgG分子またはその部分から誘導されるが、所望であれば他の免疫グロブリンまたはその部分を使用してもよい。
IgG分子(または他のIg分子)は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体として得ることができる。例えば、ポリクローナル抗体は、宿主を免疫原に曝した後にヒトまたは動物宿主から精製することにより得ることができる。所望であれば、アジュバントも宿主に投与して免疫刺激を助けてもよい。周知のアジュバントとしては、フロイントアジュバント(完全または不完全)、および水酸化アルミニウムが挙げられる。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマから作製され得る。これらは、不死化細胞系統を形成するための所望の抗体を生成する骨髄腫細胞および脾臓細胞を共に融合させることで形成され得る。従って、周知のKohlerおよびMilstein技術(Nature 256 (1975))、またはこの技術に対するその後の改変版が使用できる。
さらに最近では、ファージ提示等の技術を使用して抗体を発現させている。これらの技術は、ますます普及し、例えば、Tibtech 10, 75-76に掲載のMJ Geisow、およびTibtech 10, 8-84, (1992)に掲載のD. Chiswellにより記載されている。これらを使用して、所望のエピトープを認識する抗体を発現させることができる。
抗体は、ブドウ球菌タンパク質Ａへの吸着を含む様々な技術により精製され得る。ブドウ球菌タンパク質は、通常、セファロースビース等の固体支持体に共役される。これは、臭化シアン共役を介して実施され得る。抗体は、(例えば、低pHへの一時的な曝露を介して)所望なときに妨害して抗体を溶出できる疎水性相互反応により主にタンパク質Ａに結合する。公知のエピトープへ結合した抗体は、固定化形態のエピトープを用いて溶出し、抗体を選択し、その後適切な緩衝液での溶出を行うことで精製できる。
所望であれば、抗体は、天然では生じない形態(すなわち、合成形態)で提供され得る。従って、例えば、ヒト化(または霊長類化(primatised))抗体が提供され得る。ヒト化抗体の一例は、ヒトフレームワーク領域を有するが、げっ歯類超可変領域を有する抗体である。キメラ抗体を作製するための方法は、例えば、PNAS, 81, 6851-6855(1984)に掲載のMorrisonら、Nature. 314, 452-454 (1985)に掲載のTakedaら、およびTibtech 10, 112-113(1992)に掲載のCunnninghamらにより議論されている。合成抗体構築物は、Tibtech 12, 372-379 (1994年9月)に掲載のDougallらによっても議論されている。
要約すると、様々な種類の抗体を作製および精製するための技術は、当該分野において周知である。これらは、標準的な免疫学テキストブックにおいて(例えば、Roitt, I.M.ら(1998, Immunology, 第5版, Mosby International Ltd)において)議論されている。
結合作用因子は、抗体の部分を得て、それらを共有結合により連結させることにより得ることができる。これらの部分は、酵素切断により得てもよい(ただし、化学合成および遺伝子操作を含む他の技術も使用できる)。例えば、パパイン切断を使用して、IgG分子から２つのFabフラグメントおよび１つのFcフラグメントを得ることができる。あるいはまた、ペプシン切断を使用して、このような分子からF(ab')2フラグメントおよびpFc'フラグメントを得ることがもできる。次いで、F(ab')2フラグメントの化学還元を使用して、２つのFab'フラグメントを得ることができる。Roittら(前掲)は、上記フラグメントの提供を含み、免疫グロブリン構造および機能を詳細に記載している。
結合作用因子は、複数のFab、Fab'もしくはF(ab')2領域、またはそれらの部分を含むことが好ましい。１つ以上のFc領域またはその部分も含むことが望ましい。
例えば、結合作用因子は、少なくとも２つの抗標的抗原結合領域またはその部分(例えば、少なくとも２つの抗標的Fabγ'フラグメント)；少なくとも１つの抗エフェクター細胞抗原結合領域またはその部分(例えば、少なくとも１つの抗エフェクターFabγ'フラグメント)；および少なくとも１つのFcγフラグメントまたはその部分、を含み得る。所望であれば、抗抗標的結合領域(または、少なくともそのCDRセグメント)は、結合作用因子を治療に使用する対象となる種とは異なる種に由来していてもよい。しかし、Fc領域の一部または全体が、結合作用因子を治療に使用する対象となる種と同じ種に由来することが好ましい。従って、結合作用因子は、キメラであり得、ヒト化され得る。
当然、所望の機能的特性を保持したままの上記特異的フラグメントの変種を使用することも可能である。このような変種は、本明細書に記載する方法および組成物の範囲内にある。
例えば、当業者は、様々なアミノ酸が同様の特徴を有し、ポリペプチドの所望の特性を失うことなく１つ以上のアミノ酸が１つ以上の他の同様のアミノ酸により置き換えられ得ることを知っている。このような置換は、「保存的」または「半保存的」置換としばしば呼ばれる。例えば、アミノ酸グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよび/またはイソロイシンが、互い(脂肪族側鎖を有するアミノ酸)と置換され得る。これらの可能性のある置換のうち、グリシンおよびアラニンが互いと置換されるために使用されること(なぜなら、これらは比較的短い側鎖を有するため)、ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが互いと置換されるために使用されること(なぜなら、これらは疎水性のより大きい脂肪族側鎖を有するため)が好ましい。互いと置換され得ることの多い他のアミノ酸としては、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン(芳香族側鎖を有するアミノ酸)；リシン、アルギニンおよびヒスチジン(塩基性側鎖を有するアミノ酸)；アスパラギン酸およびグルタミン酸(酸性側鎖を有するアミノ酸)；アスパラギンおよびグルタミン(アミド側鎖を有するアミノ酸)；ならびに/またはシステインおよびメチオニン(硫黄含有側鎖を有するアミノ酸)が挙げられる。
他の可能性は、１つ以上の欠失を提供することである。これは、所望の特性を保持したままポリペプチドの全体の長さおよび分子量を小さくできるために有利であり得る。従って、所望であれば、必須でないまたは重要でない配列を所与のポリペプチドから除去してもよい。
アミノ酸挿入も行える。これは、ポリペプチドの性質を変えるため(例えば、同定、精製または発現を支援するため)に行うことができる。
いずれのアミノ酸変化を行うにしろ、記載する結合作用因子の適切な部分については、天然型のFab、Fab'、F(ab')2、FcまたはFc'領域の配列と少なくとも40％の配列同一性を保持することが好ましい。該部分と該領域との配列同一性の程度は、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、または少なくとも80％であることがより好ましい。少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも99％の高い配列同一性が最も好ましい。２つのアミノ酸配列間の配列同一性％は、多数の方法により決定できる。例えば：
1) 最大数のアミノ酸またはヌクレオチドが互いと合致するようにギャップを作らずに、所与の配列と参照配列とをアラインさせる単純な手法により決定できる。次いで、配列同一性％(S)を、以下の等式を用いて計算できる：S＝100×(M/N)；式中、Mは、参照配列中の対応位置におけるヌクレオチドまたはアミノ酸と同一である所与の配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の数、およびNは参照配列中のアミノ酸またはヌクレオチドの合計数。
ギャップが許容される場合、ギャップペナルティーが課される。例えば、ギャップを、存在する全てのギャップの完全長にわたりアミノ酸またはヌクレオチド不合致と考える単純な手法により、ペナルティーを課してもよい。従って、5および10アミノ酸の２つのギャップは、合計15アミノ酸になる不合致を表すと考えられ、(ギャップにペナルティーを課さないシステムと比べて)合致の割合が減らされる。ギャップペナルティーを科すためのより高度なシステムも公知であり、ギャップ長さおよび存在するギャップの数について別々のペナルティーを科してもよい。
2) 様々なアルゴリズムを用いて決定でき、これはコンピュータプログラムに採用できる。(所望であれば、これらのプログラムのデフォルトパラメータを使用できる)。
例えば、KarlinおよびAltschul(1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68)のアルゴリズム、またはその改変版(例えば、KarlinおよびAltschul 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77を参照)が使用できる。このアルゴリズムを、AltschulらのNBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)(1990 J. Mol. Biol. 215:403-10)に取り入れる。ヌクレオチド検索は、NBLASTプログラム(例えば、スコア＝100、文字長さ＝11)で行うことができる。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラム(例えば、スコア＝50、文字長さ＝3)で行うことができる。比較の目的でギャップ付きアライメントを得るためには、Altschulら, 1997 Nucleic Acids Research 25(17):3389-3403に記載のギャップ付きBLASTを利用できる。BLASTおよびギャップ付きBLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメータを使用することが好ましい(例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTを参照)。
あるいはまた、FASTAプログラムも使用できる。これは、WilburおよびLipmanアルゴリズムの改変版に基づいている(例えば、http://www2.ebui.ac.uk/fasta 3を参照)。
使用できる別のアルゴリズムは、MyersおよびMillerのものである(CABIOS, 4:11-17 (1989))。
このアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に採用される(例えば、http://www2.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgiを参照)。配列を比較するためにALIGNプログラムを使用する場合、例えば、PAM 120重み残基(weight residue)表、12のギャップ長さペナルティー、および４のギャップペナルティーが使用できる。
本明細書に記載する方法および組成物の目的のためには、指示されるデフォルトパラメータを用いたギャップ付きBLAST(バージョン2.0)を使用して、配列同一性が決定されることが好ましい。
記載の結合作用因子の異なる部分は、共有結合され得る。１つ以上のタンデムチオエーテル結合を使用して、システイン残基を連結して、ヒンジ構造またはその付近における異なる部分を共有結合させることが望ましい。チオエーテル結合およびヒンジ構造の提供についての詳細は、Stevenson(Antibody Engineering, Chem. Immunol., Basel, Karger, 1997, 65, 57-72)に記載されている。
部分同士を連結させて、２つのモジュールが生物学的標的(または２つの異なる生物学的標的)に結合可能な(結合作用因子が生物学的標的に結合した際に、一方のモジュールはエフェクター細胞に結合可能であり、他方のモジュールは抗体Fc領域の１つ以上の生物学的活性を有する)四次モジュール(tetramodular)構造を有する結合作用因子を得ることが好ましい。
所望であれば、結合作用因子は、実質的に純粋な形態で提供され得る。「実質的に純粋な形態」という用語は、所与の成分が高いレベルで存在することを示す場合に使用する。成分は、組成物中に存在する主要タンパク質成分であることが望ましい。75％を超えるレベル、90％を超えるレベル、または95％を超えるレベル(考慮する合計タンパク質組成に対する乾燥重量/乾燥重量に基づき測定したレベル)で存在することが好ましい。非常に高いレベル(例えば、90％を超えるレベル、95％を超えるレベル、または99％を超えるレベル)では、成分は「単離形態」であると見なされ得る。緩衝液中にタンパク質が存在する場合、無機緩衝塩成分が存在し得、考慮すればそれらの質量はタンパク質画分の質量を超えることもあり、従って上記％値を実質的に低くする。
Fc含有ポリペプチドの精製
タンパク質表面疎水性に基づく分離による、Fc領域(またはFc領域の任意の実質的な部分)を含むポリペプチドの新規精製方法も提供する。このような精製は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて行われることが好ましい。
従って、本発明者らは、(a)マトリックスにFc含有ポリペプチドを曝すステップ；(b)疎水性相互作用によりFc含有ポリペプチドをマトリックスに結合させるステップ；(c)疎水性相互作用を妨害することによりマトリックスからFc含有ポリペプチドを除去するステップ、を含む方法を提供する。本発明者らは、(a)サンプルをマトリックスに曝すこと；(b)疎水性相互作用によりFc含有ポリペプチドをマトリックスに結合させること；および任意に、マトリックスを洗浄することによりサンプルの１つ以上の成分を除去すること；ならびに(c)疎水性相互作用を妨害することで、マトリックスからFc含有ポリペプチドを取り出すことを含む、サンプル中の他の成分からFc含有ポリペプチドを分離する方法をさらに提供する。
マトリックスは、例えばフェニル基またはブチル基等の１つ以上の疎水基を含むことが好ましい。マトリックスは、フェニル基またはブチル基に結合したポリヒドロキシメタクリレートゲルを含むことがより好ましい。マトリックスは、カラムの形態であることが好ましい。ステップ(b)は、ステップ(c)よりも高い塩分濃度の存在下で行われることが好ましい。ステップ(c)は、好ましくは有機溶媒の存在下で、希釈塩水溶液でのマトリックスの溶出により行われることがより好ましい。適切な有機溶媒は、10％ジメチルホルムアミドを含む。
本方法によれば、Fc含有ポリペプチドを含む組成物を、高塩分条件下で適切な疎水性カラムに曝す。次いで、結合したタンパク質を、適切な溶媒(減少していく塩勾配等)で溶出する。このような精製は、サンプル中のタンパク質の濃度を上げるための手段として使用できることが理解されよう。
新規技術は、他の物質(汚染物質等)から、Fc領域を含む任意のポリペプチドを分離するのに適している。本明細書に記載する結合作用因子を作製するのに使用するFc領域を分離するのに特に適している。このような精製の具体的な例は、実施例５の(d)に記載する。
疎水性相互作用クロマトグラフィーに適したカラムは、当該分野において公知であり、例えば、Amersham Biosciences(例えば、HiTrap HIC選択キット)およびAgilent Technologies(例えば、TSKフェニル-5PW、TSKエーテル-5PW、またはSynChropak H-プロピル)から入手可能である。好適な実施形態では、マトリックスはToyoperal TSK-ブチル-650を含む。
疎水性相互作用クロマトグラフィー(HICとしても知られる)は、生物分子の表面疎水性の差に基づき生物分子を精製および分離するための技術である。HIC技術は、GFおよびIEX等の他のクロマトグラフィー技術、およびタンパク質コンホメーション変化を検出する分析ツールと組み合わせて、タンパク質精製戦略の一部として使用されてきた。一般的に親水性であると考えられている多くの生物分子も、クロマトグラフィーマトリックスに共役した疎水性リガンドとの相互作用を可能にする十分な数の疎水基を有する。HICおよびRPCは、密接に関係した技術であるが、RPC用の吸着剤は、HIC吸着剤とよりも疎水性リガンドとより高度に置換される。この特徴により、緩やかな溶出条件を使用して、サンプルの生物学的活性を維持し易くできる。
Fc含有ポリペプチドの疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施するために他の精製技術も使用できることが理解されよう。このような他の技術としては、イオン交換、サイズ排他、およびアフィニティークロマトグラフィー等の当該分野で公知のクロマトグラフィー方法が挙げられる。
用途
本明細書に記載の結合作用因子は、医薬において特に有用である。
これらは、生物学的標的が原因となるまたは関与する疾患または障害を治療するための医薬を調製するのに使用できる。
治療は、ヒトまたは非ヒト動物のためになり得る。従って、ヒトおよび獣医学的治療は、本明細書に記載する方法および組成物の範囲内にある。哺乳動物の治療が特に好ましい。
治療は、既に存在する症状に関するものであっても、または予防的なものであってもよい。治療は、成人、若年、幼児、胎仔、細胞、組織、器官、またはそれらの一部であり得る。
本明細書に記載する結合作用因子は、癌(例えば、リンパ腫)を治療するのに有用である。しかし、これらは、ヒトまたは非ヒト動物に対して標的が有害である他の疾患または障害を治療するためにも使用できる。このような他の疾患または障害の例としては、病原性または自己免疫性の疾患または障害、および感染細胞が検出され得る感染性疾患(ウイルス感染等)が挙げられる。
医薬組成物
薬剤は、通常、医薬組成物の一部として提供され得る。医薬組成物は、滅菌形態で提供されることが望ましい。単位投薬量形態で提供されても、および密封容器に入れられて提供されてもよい。複数の単位投薬量形態で提供されてもよい。
医薬組成物は、以下：製薬的担体、保存剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、着臭剤、塩、緩衝液、被覆剤、抗酸化剤、アジュバント、賦形剤、および希釈剤のうちの１つ以上を含み得る。これらは、結合作用因子に加えて、他の治療的に活性な薬剤も含み得る。２つ以上の治療剤が使用される場合、これらは別々に(例えば、異なる時間および/または異なる経路を介して)投与されてよく、従って、必ずしも単一の組成物で存在する必要はない。従って、組み合わせ療法は、本明細書に記載する方法および組成物の範囲内にある。
医薬組成物は、制御下放出形態で提供され得る。これは、製薬上活性な薬剤を、所定の様式で生理学的条件下で分解する基質と共に提供することにより達成され得る。分解は、酵素的またはpH依存的であり得る。
医薬組成物は、血液脳関門(BBB)を通るように設計され得る。例えば、BBBを通過可能な、脂肪酸、イノシトールまたはコレステロール等の担体が選択され得る。担体は、インスリン様IまたはII型成長因子等の脳内皮細胞中の特定の輸送系を介して脳に入る物質であり得る。担体は、活性剤に共役されるか、または活性剤を含有/活性剤と混合され得る。リポソームを使用してBBBを通過できる。WO91/04014は、活性剤をカプセル化/埋込み化可能で、通常BBBを通って輸送される分子(例えば、インスリンまたはインスリン様IもしくはII型成長因子)がリポソーム外面に存在するリポソーム送達系を記載している。リポソーム送達系は、米国特許第4704355号でも議論されている。
医薬組成物は、任意の適切な経路により、投与に適合され得る。例えば、医薬組成物は、経口経路(口腔もしくは舌下経路を含む)、直腸経路、鼻腔経路、局部経路(口腔、舌下もしくは経皮経路を含む)、膣経路、または非経口経路(皮下、筋内、静脈、もしくは皮内経路)により投与され得る。このような組成物は、薬学分野において公知の任意の方法により(例えば、１つ以上の活性成分を適切な担体と混合することにより)調製され得る。
異なる薬剤送達系を使用して、所望の投与経路に応じて、医薬組成物を投与してもよい。薬剤送達系は、例えば、Langer(Science 249:1527-1533 (1991))、ならびにIllumおよびDavis(Current Opinions in Biotechnology 2:254-259 (1991))により記載されている。
ここで、結合作用因子の２つの好ましい投与経路をより詳細に熟考する：
(i)非経口投与
非経口投与に適合した医薬組成物としては、水性および非水性滅菌注射可能溶液または懸濁液が挙げられる。これらは、組成物を、意図するレシピエントの血液と実質的に等張性にする、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および溶質を含み得る。このような組成物中に存在し得る他の成分としては、例えば、水、アルコール、多価アルコール、グリセリン、および植物油が挙げられる。非経口投与に適合する組成物は、単位用量または複数用量容器(例えば、密封アンプルおよびバイアル)に入れられて提供され、使用直前に滅菌液体担体(例えば注射用の滅菌水)を加えることのみを必要とするフリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存され得る。即席(extemporaneous)注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
(ii)静脈内投与
注射用途に適した医薬剤形としては、滅菌緩衝化水溶液または分散液、および滅菌注射可能溶液または分散液の即席調製用の滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、剤形は、滅菌、かつ注射が容易な程度まで流動性を有していなければならない。製造および保存の条件下で安定していなければならず、細菌および菌類等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等)、それらの適切な混合液、ならびに植物油を含む溶剤または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等の被膜の使用、分散液の場合には所望の粒径の維持、および界面活性剤の使用により維持され得る。
微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗菌類剤(例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール(thirmerosal)等)により達成され得る。多くの場合、等張剤(例えば、糖または塩化ナトリウム)を含むことが好ましい。注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤(例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン)を組成物中で使用することにより達成され得る。
滅菌注射可能溶液は、所望に応じて、上記列挙した様々な他の成分と共に、適切な溶媒に入った必要量の活性化合物を採用し、その後、濾過滅菌することにより調製される。一般的に、分散液は、滅菌活性成分を、塩基性分散媒体および上記列挙したもののうち所望の他の成分を含む滅菌ビヒクルに入れることにより調製される。滅菌注射可能溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末、および滅菌濾過済みのその溶液から任意の追加の所望の成分を産生する真空乾燥および凍結乾燥技術である。
結合作用因子の投薬量は、治療の性質、治療する個体の年齢および症状等に応じて、幅広い範囲内で変化し得、最終的に医師が、使用する適切な投薬量を決定する。しかし、特定の投薬量に限定されることなく、１日当たり１μg〜１mg/体重kgの投薬量が適切であり得る。投薬は、適切に何度も繰り返されてもよい。副作用が出た場合、投薬の量および/または頻度を、良好な臨床的治療に合わせて減らすことができる。主要な活性成分は、適切な製薬上許容可能な担体と共に、有効量で、単位投薬量形態で、都合が良くかつ有効な投与のために化合される。補助的活性成分を含む組成物の場合、投薬量は、該成分の通常の用量および手段を参考にして決定される。例えば、Houghton AN, Chapman PB, Bajorin DF. Antibodies in cancer therapy: clinical applications.(Devita VT Jr, Hellman S, Rosenberg SA編 Biologic Therapy of Cancer. Philadelphia, Pa: Lippincott; 1991;533-549に掲載)を参照のこと。一般的に、最適用量は、最大寛容用量が決定されるまで抗体を段階的に増大した用量で投与することにより、臨床治験において経験的に決定され得る。MTDは、患者の50％が用量限定毒性に直面する用量に達する前の最高用量として定義する。
さらなる態様は、本明細書に記載する結合作用因子の画像またはモデルを提供することである。これは、コンピュータにより生成されてもよいし、物理的であってもよい。画像またはモデルは、二次元または三次元であることが好ましい。Ｘ線結晶画像またはモデルであってもよく、複数の配位(co-ordinates)を含み得る。以下の１つ以上を示し得る：すなわち、結合部位、親水性または疎水性領域、結合等。見易くするために、画像またはモデルは、操作可能に適応化されて、(例えば、回転、ズームインまたはズームアウト等により)異なる部分が見られるようにすることが好ましい。
このような画像またはモデルについてのデータを含むデータ担体は、本明細書に記載する方法および組成物の範囲内にあり、このようなデータまたはデータ担体を含むコンピュータも同様である。コンピュータは、画像またはモデルを表示するように設定されることが好ましい。
画像またはモデルは、可能性のある新規治療薬の構造および/または機能を予測するのに有用である。例えば、画像またはモデルに１つ以上の変化を加え、これらの変化の影響を予測または分析してもよい。
上述した結合作用因子、画像もしくはモデル、データ担体、またはコンピュータは、薬剤開発プログラムにおいて有用である。結合作用因子、画像もしくはモデル、データ担体、またはコンピュータを使用した薬剤開発プログラムを経て得られた薬剤または薬剤候補物質も、本明細書に記載する方法および組成物の範囲内にある。
薬剤または薬剤候補物質は、活性および/または活性についてテストされる。上述したように結合作用因子、薬剤もしくは薬剤候補物質を得ること、ならびに結合作用因子、薬剤または薬剤候補物質の活性および/または毒性をin vivoまたはin vitroでテストすることを含む方法も提供する。
スクリーニング、テスト、分析、精製等を支援するため、本明細書に記載するように結合作用因子を固定化することが望ましいかもしれない。従って、結合作用因子を固定化形態で提供する。固定化は、ブドウ球菌タンパク質Ａの使用またはエピトープの使用を含む様々な手法により達成され得る。
固定化結合作用因子は、組織化されたアレイ(例えば、格子様構造を有するアレイ)の一部として提供され得る。これは、スクリーニングの際の識別を助け、ハイスループットスクリーニングにおいても有用である。アレイは、それぞれ記載された複数の結合作用因子を含むかまたはそれらからなり得る。これは、ほぼ平面上で提供され得る。
以下、本発明を、限定しない実施例により説明する。
実施例
示差的活性化二重特異性(DAB)抗体
結合作用因子の一例は、示差的活性化二重特異性(DAB)抗体である。これは、体から異常細胞を治療的に除去するために設計されたキメラ二重特異性抗体である。
２つのFabモジュールは、異常細胞を標的化する。エフェクターは、ヒトFcモジュール、およびエフェクター細胞に向けられたFabモジュールにも取り込まれる。エフェクター細胞への初期結合により、標的細胞へ結合した場合よりも、Fc取り込みエフェクター機能の実現が低くなるという点で、構築物は示差的に活性である。このようにして、エフェクター細胞への損害、および血液中のエフェクター細胞からのサイトカイン放出による所望でない症状が最小限にされる。
DAB抗体の操作の原理
図４は、DAB抗体の操作の原理を示す。各モジュールは、ヒンジ領域鎖間SS結合が低減され、場合によって、ジスルフィド相互作用により１つ以上のSH基を残すようにさらに操作される。次いで、１つのモジュール(この例の場合Fc)は、ビスマレイミドリンカーの余剰に曝され、リンカーの一端がSH基と反応してチオエーテル結合を形成し、他端は反応性マレイミド基を提示し続ける。未反応リンカーを除去し、マレイミド提示モジュールを、第２のSH提示モジュール(この場合、Fab)と反応させて、二次モジュール(bimodular)またはより高次元の構築物を形成する。約９Åの連結ユニットは、ｏ-フェニレンジスクシンイミジル基の一方の側に対するチオエーテル結合からなる。ジスルフィド相互作用により、いくらかの初期SH基が残った場合、さらなるモジュールの追加が可能である。
DAB構築物の特定の実施形態では、Fcγモジュールを、構造要素として使用する前に、酵素的に脱グリコシル化する。
非脱グリコシル化示差的活性化二重特異性(DAB)抗体の構造および性質
構造
(脱グリコシル化していない)DABの一形態の構造を、図３(ａ)および３(ｂ)に示す。
ヒンジ領域またはその付近にシステイン残基を伴う全てのモジュール−モジュール連結を有する四次モジュール構造である。従って、２つの抗標的Fab(抗CD20)およびFcモジュールは全て、抗エフェクターFab(抗CD16)に連結される。タンデムチオエーテル結合は、約９Åの長さで、各モジュールのヒンジにおいてシステイニル残基に連結したビスクシンイミジルフェニル基(bisuccinimidylphenyl group)により提供される。各Fabモジュールにはチオエーテル結合のための硫黄を提供できる５つのシステイン、およびFcモジュールには４つのシステインが存在する。
性質
非脱グリコシル化DABのいくつかの性質を以下に挙げる：
(a)標的細胞との結合は、Fab取り込みエフェクター細胞との結合よりも強い；
(b)エフェクター細胞のみとの結合の場合、受容体FcRI、IIおよびIIIについてFc上のドッキング部位が利用可能になり、および遊離抗標的Fabモジュールにより立体障害を起こしている、標的補体についてのドッキング部位が利用可能になる。これは、抗エフェクターFabのヒンジ周辺における２つの抗標的FabおよびFcの混みにより生じる。標的細胞との結合が生じる場合、２つの抗標的Fabは、Fc上の全てのドッキング部位の利用を提供する。これは、DAB抗体＋エフェクター細胞が、補体の存在下においてエフェクター細胞に対して極めて小さい損害を生じるのみであることを示すことにより、in vitroで機能的に検証されてきた。対照的に、DAB抗体＋標的細胞は、標的細胞に対する完全な補体損害を可能にし、他方で、エフェクター細胞も存在する場合、Fcおよび抗エフェクターFabの両方による取り込みにより、標的細胞に深刻な損害が生じる；
(c)上記性質a)およびb)の組み合わせは、DAB抗体が取り込むエフェクター細胞よりも標的細胞により大きいFc仲介型細胞損害を与える点で、DAB抗体に実質的な示差的活性を与える；
(d)FcRnに対するドッキング部位は、Fcヒンジからある程度離れているため、抗標的Fabが遊離状態である間に立体障害を生じるとは考えられない。従って、DAB抗体構築物は、ヒトまたは動物被検体において高い半減期を有する可能性が高い。
非脱グリコシル化示差的活性化二重特異性抗体の合成
１つの合成方法の簡単な概要を、ヒトにおけるＢ細胞リンパ腫の治療のために設計されたDAB抗体の具体的な例を用いて以下に示す。新形成Ｂ細胞上の分子標的は、CD20分子であり、Fabでエフェクター細胞を取り込むのに使用する分子はCD16である。出発モジュールは：
(1)マウスモノクローナルIgG2a 1F5(抗CD20)由来のF(ab'γ)2
(2)マウスモノクローナルIgG1 3G8(抗CD16)由来のF(ab'γ)2
(3)ヒト正常IgG由来のFcγ1
合成方法は以下のとおりである：
(a)Fab'γ-マレイミド(抗CD20)
F(ab'γ)2ex 1F5をpH8.0の1 mMジチオトレイトール(DTT)により還元し、得られたFab'γ(-SH)5をゲルクロマトグラフィーにより分離する。すると、pH5.0の１mM ｏ-フェニレンジマレイミド(PDM)と反応し、Fab'γ-マレイミドを産生する。これを、イオン交換クロマトグラフィーにより分離および濃縮する。
(b)Fab'γ(-SH) 5 (抗CD16)
F(ab'γ)2ex 3G8を、pH8.0の1 mM DTTで還元し、得られたFab'γ(-SH)5をゲルクロマトグラフィーにより分離する。
(c)F(ab'γ) 3 -マレイミド
Fab'γ-マレイミドおよびFab'γ(-SH)5を、2.2：1の比率で混合し、pH5.0で反応させる。得られたF(ab'γ)3を、ゲルクロマトグラフィーにより分離し、PDMと反応させて、F(ab'γ)3-マレイミドを産生させる。
(d)Fcγ(-SH) 4
Fcγ1を、pH8.0の1mM DTTにより還元し、得られるFcγ(-SH)4をゲルクロマトグラフィーにより分離する。
(e)Fab 3 Fc(DAB抗体)
F(ab'γ)3-マレイミドおよびFcγ(-SH)4を、２：１の質量比で混合し、pH5.0で反応させる。最終的に、反応混合物は、pH8.4の0.5 mMシステインとのSS-変換を経て、Fcヒンジを閉じ、Fab3Fc生成物をゲルクロマトグラフィーにより分離する。
脱グリコシル化示差的活性化二重特異性抗体の性質
(a)標的細胞の不在下におけるエフェクター細胞との結合は、受容体FcRI、IIおよびIIIについてFc上のドッキング部位を利用可能にし、補体については遊離抗標的Fabモジュールにより立体障害が生じ、抗エフェクターFabモジュールのヒンジの周辺がFcで埋められる。Fc受容体および補体についてのドッキング部位は、Fcの脱グリコシル化によっても損なわれる。(手元の証拠は、FcRI、IIおよびIIIについての部位は、完全に無能にされるが、枯渇部位が補体について残ることを示唆している)。これらの事実の組み合わせは、標的細胞の不在下で、DAB抗体で被覆されたエフェクター細胞が、(1)Fcモジュール上にドッキングしている他のエフェクター細胞による、抗体依存性細胞傷害；または(2)Fcモジュールにドッキングしている補体による補体仲介型細胞傷害、のいずれによっても損害を受けにくいことを意味する。
(b)標的細胞の不在下におけるエフェクター細胞との結合により、エフェクター細胞表面を架橋させる可能性はほとんどない。なぜなら、(1)Fabモジュールは、エフェクター細胞について一価性でしかなく；(2)被覆エフェクター細胞の表面上の受容体FcRI、IIおよびIIIとの結合は、他のエフェクター細胞について上述したのと同じ理由のために損なわれ；(3)細胞外流体のpHは、被覆エフェクター細胞上に存在し得る任意のFcRn受容体との結合を支持しないからである(下記d.を参照)。架橋の不在は、標的細胞の不在下でのDAB抗体で被覆されたエフェクター細胞が、毒性誘発型サイトカインを放出する可能性がほぼないことを意味する。(DM SegalらBispecific antibodies in cancer therapy. Curr. Opin. Immunol. 11:558-562, 1999において大規模なサイトカイン放出の危険性が強調されている)。
(c)標的細胞との結合は二価性であるため、エフェクターとの単独結合よりも強く長い。さらに以下のことが生じる：
(1)Fcモジュールにドッキングした成分C1により誘発されるある程度の補体仲介型細胞傷害。脱グリコシル化により、この現象は低減されることが分かっているが、無くすことはできない。２つの抗標的Fabモジュールの係合により、C1ドッキングに対する立体障害が除去されると思われる。
(2)受容体FcRIII、主にNK細胞およびマクロファージを提示するエフェクター細胞と抗エフェクターモジュールとの係合。複数の固定(anchoring)により、エフェクター細胞が固く保持され、FcRIII分子の有効な架橋により細胞傷害について細胞が活性化される。架橋は、サイトカイン放出にもつながり、細胞傷害を増強し、標的化細胞付近における炎症を生じる。これらの事象が体内で広がれば、いくらかの毒性症状は不可避であろうが、医師は、標的化細胞の既知の質量および配分により予め警告を受けるであろう。
標的細胞表面に取り込まれたエフェクター細胞により誘発される細胞死は、腫瘍を目標とするDAB抗体により発揮される断然最も有力な抗腫瘍効果であると予想される。FcRIII仲介型細胞傷害が、FcRI、IIおよびIIIについてのFc部位の障害により増強され得ることもあり得る。なぜなら、RcRIIの亜型の中には、係合によってマクロファージの活性を大幅に下げることができる阻害受容体FcRIIbがあるからである。マウスにおけるFcRIIの単独の障害は、腫瘍を破壊する抗体の能力を増強する(RA ClynesらInhibitory Fc receptors modulate in vivo cytotoxicity against tumor targets. Nature Medicine 6:443-446, 2000)。
(3)標的細胞表面に架橋し、「死経路」へ続くシグナルを開始するDAB抗体により誘発されるある程度のアポトーシス(プログラム細胞死)。このシグナリングは、エフェクター細胞の拘束により増強され、表面結合抗体の架橋の程度を有効に増加する。(ShanらApoptosis of malignant human B cells by ligation of CD20 with monoclonal antibodies. Blood 91:1644-1652, 1998.)
(d)Fcヒンジからある程度離れたFcモジュール上のFcRnについてのドッキング部位は、他のモジュールからの立体障害を受けないし、Fcの脱グリコシル化により影響されるとも思われない(DoraiらAglycosylated chimeric mouse/human IgG1 antibody retains some effector functions. Hybridoma 10:211-217, 1991)。従って、DAB抗体は、持続性代謝生存を示すと予測され、ヒトIgGのものに匹敵する。
FcRnは、IgGの異化作用についての主要部位と考えられている血管内皮細胞を含む、多くの体細胞に存在する。細胞外流体のpH(7.4)にて、Fcγは、FcRnについて有意な親和性を持たない。エンドサイトーシス(異化作用の前段階)の際に、IgGは、低下するpHのエンドソームに存在し、FcRnについてのドッキング部位中のヒスチジンはプロトン化され、IgGはエンドソーム壁上のFcRnと組み合わさる。これは、分子を、破壊的エンドリソソーム(endolysosome)への経路から迂回させる：その代わり細胞表面上に転送し、より高いpHにより細胞外流体へ戻す。
脱グリコシル化示差的活性化二重特異性抗体の合成
脱グリコシル化示差的活性化二重特異性抗体(Fab3Fcdと呼ぶ)は、ステップ(d)および(e)が改変されたこと以外は、上記実施例３に記載するのと同様に作製される。出発材料は同一であるが、合成は２つの主要な段階(すなわち、Fab3の合成、およびFab3への脱グリコシル化Fcの付着)を伴う。
(a)Fab-マレイミド(抗CD20)
F(ab'γ)2 ex 1F5は、pH8.0の1 mMジチオトレイトール(DTT)により還元され、得られるFab(-SH)5は、ゲルクロマトグラフィーにより分離される。次いで、pH5.0の1 mMｏ-フェニレンジマレイミド(PDM)と反応して、Fab-マレイミドを産生し、これは、イオン交換クロマトグラフィーにより分離および濃縮される。
(b)Fab(-SH)5(抗-CD16)
F(abγ)2 ex 3G8は、pH8.0の1 mM DTTで還元され、得られたFab(-SH)5はゲルクロマトグラフィーにより分離される。
(c)Fab3-マレイミド
Fab-マレイミドおよびFab(-SH)5を、2.2：1の比率で混合し、pH 5.0で反応させる。得られたFab3を、ゲルクロマトグラフィーにより分離し、次いでPDMと反応させてFab3-マレイミドを産生する。反応は確率論的で、Fab4およびFab2が副産物として形成される。ゲルクロマトグラフィーの間、後者を取り出し、Fab-マレイミドとのさらなる反応に供する。
(d)Fcd(-SH)4
まず、グリコアミダーゼPNGアーゼFとの反応により、Fcを脱グリコシル化する(AL TarentinoおよびTHPlummer. Enzymatic deglycosylation of asparagine-linked glycans: purification, properties, and specificity of oligosaccharide-cleaving enzymes from Flavobacterium meningosepticum. Meth Enzymol 230:44-57, 1994)。不完全に脱グリコシル化されたものは、様々な炭水化物を提示することが予想されるため、完全に脱グリコシル化された(従って、相当に疎水性である)Fcを、Toyopearl TSK-ブチル-650上での疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分離および濃縮する。溶出した脱グリコシル化Fcγ1はFcdと称する。
FcdをpH8.0の1 mM DTTで還元し、得られたFcd(-SH)4をゲルクロマトグラフィーにより分離する。
(e)Fab3Fcd(DAB抗体)
Fab3-マレイミドおよびFcd(-SH)4を、2：1の質量比で混合し、pH 5.0で反応させる。最終的に、反応混合物を、pH8.0の10 mMヨウ化酢酸でアルキル化して、余剰分のSH基をブロックし、Fab3Fcd生成物をゲルクロマトグラフィーにより分離する。
さらなる態様
パラグラフ１．(a)結合作用因子が生物学的標的に結合している場合に、抗体Fc領域の１つ以上の生物学的活性を有する第１の部分；(b)２以上の結合価で、該生物学的標的に結合可能な第２の部分；および(c)エフェクター細胞に一価結合して、該第２の部分が該標的に結合している場合に該エフェクター細胞が該生物学的標的に作用できるようにする第３の部分、を含む、結合作用因子。
パラグラフ２．前記エフェクター細胞は、前記標的を、破壊、損害、変化または除去可能である、パラグラフ１に記載の結合作用因子。
パラグラフ３．前記標的は、ヒトまたは非ヒト動物に対して有害である、パラグラフ１または２に記載の結合作用因子。
パラグラフ４．前記標的は癌細胞またはその一部である、パラグラフ３に記載の結合作用因子。
パラグラフ５．前記第１の部分は、前記結合作用因子が前記生物学的標的に結合した場合に、以下の生物学的活性、すなわち(a)補体活性；(b)食作用細胞による食作用の誘発または刺激；(c)抗体依存性細胞傷害(ADCC)；および(d) 新生児またはBrambell Fc受容体(FcRn)への結合、の生物学的活性の１つ以上を有する、前記パラグラフのいずれか１つに記載の結合作用因子。
パラグラフ６．前記作用因子が前記エフェクター細胞のみと結合する場合と比べて、該作用因子が前記標的細胞と結合した場合に前記第１の部分の生物学的活性の少なくとも１つが変化する、前記パラグラフのいずれか一つに記載の結合作用因子。
パラグラフ７．前記第１の部分の少なくとも１つの生物学的活性が、前記作用因子が前記エフェクター細胞のみに結合した場合よりも、該作用因子が前記標的細胞に結合した場合に少なくとも10倍高い、前記パラグラフのいずれか一つに記載の結合作用因子。
パラグラフ８．前記第２の部分と前記標的との結合の不在下では、立体障害により前記第１の部分の少なくとも１つの生物学的活性が妨害または低減され、該第２の部分が該標的に結合した場合には該立体障害が除去または低減されるように構成されている、前記パラグラフのいずれか１つに記載の結合作用因子。
パラグラフ９．前記少なくとも１つ生物学的活性が補体活性を含む、パラグラフ８に記載の結合作用因子。
パラグラフ１０．前記少なくとも１つの生物学的活性が、FcRI、FcRIIおよび/またはFcRIII受容体との結合を含む、パラグラフ８または９に記載の結合作用因子。
パラグラフ１１．in vivoでの前記結合作用因子のリソソーム分解を低減する前記第１の部分へのエンドソーム結合が妨げられていない、パラグラフ８〜１０のいずれか１つに記載の結合作用因子。
パラグラフ１２．前記第１の部分が、前記第２の部分と前記標的との結合の不在下で立体障害を受けないFcRnドッキング部位を有する、パラグラフ１１に記載の結合作用因子。
パラグラフ１３．前記第２の部分は、複数の異なる標的、または同じ標的の複数の異なる部分に結合可能な、前記パラグラフのいずれか１つに記載の結合作用因子。
パラグラフ１４．Fab、Fab'もしくはF(ab')2領域、またはそれらの部分を１つ以上含む、前記パラグラフのいずれか１つに記載の結合作用因子。
パラグラフ１５．Fc領域、またはその部分を１つ以上含む、前記パラグラフのいずれか１つに記載の結合作用因子。
パラグラフ１６．少なくとも２つの抗標的Fab、Fab'もしくはF(ab')2領域またはその部分、少なくとも１つの抗エフェクター細胞FabもしくはFab'領域またはその部分、および少なくとも１つのFc領域またはその部分を含む、前記パラグラフのいずれか１つに記載の結合作用因子。
パラグラフ１７．結合作用因子の部分は、IgG分子から誘導される、前記パラグラフのいずれか１つに記載の結合作用因子。
パラグラフ１８．前記部分同士は共有結合している、前記パラグラフのいずれか１つに記載の結合作用因子。
パラグラフ１９．システイン残基の間を連結させる１つ以上のタンデムチオエーテル結合を含む、前記パラグラフのいずれか１つに記載の結合作用因子。
パラグラフ２０．前記第２の部分は前記標的に特異的に結合する、前記パラグラフのいずれか１つに記載の結合作用因子。
パラグラフ２１．前記第２の部分は抗CD20および/または抗CD37結合活性を有する、前記パラグラフのいずれか１つに記載の結合作用因子。
パラグラフ２２．前記第３の部分は前記エフェクター細胞に特異的に結合する、前記パラグラフのいずれか１つに記載の結合作用因子。
パラグラフ２３．前記第３の部分は抗CD16結合活性を有する、前記パラグラフのいずれか１つに記載の結合作用因子。
パラグラフ２４．三次モジュール構造を有し、２つのモジュールが生物学的標的に結合可能であり、結合作用因子が生物学的標的に結合した場合に、一方のモジュールはエフェクター細胞に結合可能で、他方のモジュールは抗体Fc領域の１つ以上の生物学的活性を有する、前記パラグラフのいずれか１つに記載の結合作用因子。
パラグラフ２５．前記エフェクター細胞に結合した、前記パラグラフのいずれか１つに記載の結合作用因子。
パラグラフ２６．複数のモジュールを得ること、およびそれらをシステイン残基間のタンデムチオエーテル結合を介して連結することを含む、前記パラグラフのいずれか１つに記載の結合作用因子を得る方法。
パラグラフ２７．前記モジュールをマレイミドリンカー(例えば、ｏ-フェニレンジマレイミド)を介して連結させる、パラグラフ２６に記載の方法。
パラグラフ２８．医薬に使用する、パラグラフ１〜２５のいずれか１つに記載の結合作用因子。
パラグラフ２９．前記生物学的標的により引き起こされるかまたは該生物学的標的が関与する疾患または障害を治療するための医薬の調製において、パラグラフ１〜２５のいずれか１つに記載の結合作用因子の使用。
パラグラフ３０．前記疾患または障害が癌である、パラグラフ２９に記載の使用。
パラグラフ３１．前記疾患または障害がリンパ腫(例えば、Ｂ細胞リンパ腫)である、パラグラフ３０に記載の使用。
パラグラフ３２．前記疾患または障害が病原性疾患または障害である、パラグラフ２９に記載の使用。
パラグラフ３３．前記疾患または障害が自己免疫性疾患または障害である、パラグラフ２９に記載の使用。
パラグラフ３４．パラグラフ１〜２５のいずれか１つに記載の結合作用因子を含み、任意に製薬上許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物。
パラグラフ３５．パラグラフ１〜２５のいずれか１つに記載の結合作用因子の画像またはモデル。
パラグラフ３６．コンピュータで作成された、パラグラフ１〜２５のいずれか１つに記載の画像またはモデル。
パラグラフ３７．パラグラフ３５に記載の画像またはモデルについてのデータを含む、データ担体。
パラグラフ３８．パラグラフ３５もしくは３６に記載の画像もしくはモデルについてのデータ、および/またはパラグラフ３７に記載のデータ担体を含む、コンピュータ。
パラグラフ３９．パラグラフ３５もしくは３６に記載の画像もしくはモデル、パラグラフ３７に記載のデータ担体、またはパラグラフ３８に記載のコンピュータを得ること、ならびにそれを使用して、可能性のある新規治療剤の構造および/または機能について予測すること、を含む方法。
パラグラフ４０．１つ以上の変化を加えてパラグラフ３５または３６に記載の画像またはモデルを得ること、および任意にこれらの変化の影響を予測または分析すること、を含む方法。
パラグラフ４１．パラグラフ１〜２５のいずれか一つに記載の結合作用因子、パラグラフ３５もしくは３６に記載の画像またはモデル、パラグラフ３７に記載のデータ担体、パラグラフ３８に記載のコンピュータ、またはパラグラフ３９もしくは４０に記載の方法を使用する、薬剤開発プログラム。
パラグラフ４２．パラグラフ４１に記載の薬剤開発プログラムを使用して得られたまたは同定された、薬剤または薬剤候補物質。
パラグラフ４３．パラグラフ１〜２５のいずれか一つに記載の結合作用因子、またはパラグラフ４２に記載の薬剤もしくは薬剤候補物質を得ること、ならびに生物学的標的に対する該結合作用因子、薬剤または薬剤候補物質の活性および/または結合をin vivoまたはin vitroでテストすることを含む、方法。
パラグラフ４４．パラグラフ１〜２５のいずれか一つに記載の結合作用因子、またはパラグラフ４２に記載の薬剤もしくは薬剤候補物質を得ること、および該結合作用因子、薬剤または薬剤候補物質の毒性をin vivoまたはin vitroでテストすることを含む、方法。
パラグラフ４５．固定化形態の、パラグラフ１〜２５のいずれか一つに記載の結合作用因子、またはパラグラフ４２に記載の薬剤もしくは薬剤候補物質。
パラグラフ４６．パラグラフ１〜２５のいずれいか一つに記載の結合作用因子、またはパラグラフ４２に記載の薬剤もしくは薬剤候補物質を含むアレイ。
本明細書で言及する各出願および特許、ならびに上記各出願および特許において引用または参照される各文献(各出願および特許の遂行の間のもの(「出願引用文献」)、ならびに各出願および特許および任意の出願引用文献において引用または言及される任意の製品の製造元の指示書またはカタログも含む)を、参照により本明細書に援用する。さらに、本明細書において引用する全ての文献、本明細書で引用する文献中で引用または参照される全ての文献、および本明細書で引用または言及する任意の製品についての製造元の任意の指示書またはカタログを、参照により本明細書に援用する。
記載した本明細書の方法および系の様々な改変および変更が、本明細書の範囲および思想から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、具体的な好適な実施形態について記載してきたが、請求の発明は、このような具体的な実施形態に不当に限定されないことが理解されよう。実際、分子生物学または関連分野の当業者には明らかな、記載の発明を実施するためのモードの様々な改変は、請求項の範囲内にあることを意図する。
図１Ａおよび１Ｂは、マウスIgG1分子の模式図を示す。図１Ａは、鎖の性質および鎖間ジスルフィド(SS)結合を示す。図１Ｂは、タンパク質コンホメーション全体の二次元の図を示す。 ２種類の二重特異性抗体構築物を示す。図２Ａは、右側のFabは腫瘍細胞等の異常細胞を標的化し、異なる抗体部位を有する左側のFabはマクロファージ等のエフェクター細胞を取り込む、ビス-Fab二重特異性抗体を示す。図２Ｂは、通常ハイブリドーマ技術により調製されるIgG二重特異性抗体を示す。 示差的に活性化された二重特異性抗体の実施形態の模式図を示す。 リンカーを用いてポリペプチド鎖を連結する方法を示す。

Claims (56)

  1. (a)結合作用因子が生物学的標的に結合している場合に、抗体Fc領域の１つ以上の生物学的活性を含む第１の部分；
    (b)２以上の結合価で該生物学的標的に結合可能な第２の部分；および
    (c)上記第２の部分が該生物学的標的に結合している場合には、第３の部分に結合したエフェクター細胞が該生物学的標的に作用可能となるように、エフェクター細胞に一価で結合する第３の部分；
    を含む、結合作用因子。
  2. 前記エフェクター細胞は、前記生物学的標的を、破壊、損害、変化または除去可能である、請求項１に記載の結合作用因子。
  3. 前記生物学的標的は、ヒトまたは非ヒト動物に対して有害である、請求項１または２に記載の結合作用因子。
  4. 前記生物学的標的は、癌細胞またはその一部である、請求項１、２または３に記載の結合作用因子。
  5. 前記結合作用因子が前記エフェクター細胞のみと結合する場合と比べて、前記結合作用因子が前記生物学的標的と結合した場合に前記第１の部分の少なくとも１つの生物学的活性が変化する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の結合作用因子。
  6. 前記第１の部分の少なくとも１つの生物学的活性が、前記結合作用因子が前記エフェクター細胞のみに結合した場合よりも、該結合作用因子が前記生物学的標的に結合した場合に少なくとも10倍高い、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合作用因子。
  7. 前記第２の部分と前記生物学的標的との結合の不在下では、立体障害により前記第１の部分の少なくとも１つの生物学的活性が妨害または低減され、該第２の部分が該生物学的標的に結合した場合には該立体障害が除去または低減されるように構成されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合作用因子。
  8. 前記第１の部分が、前記第２の部分と前記生物学的標的との結合の不在下で立体障害を受けないFcRnドッキング部位を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の結合作用因子。
  9. 前記第１の部分は、前記結合作用因子が前記生物学的標的に結合した場合に、(a)補体活性化および(b)新生児またはBrambell Fc受容体(FcRn)への結合のうちの生物学的活性の１つ以上を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の結合作用因子。
  10. 前記結合作用因子と生物学的標的との結合の不在下では、エフェクター細胞の活性が低減するように改変されている、請求項９に記載の結合作用因子。
  11. 前記結合作用因子と生物学的標的との結合の不在下では、FcRI、RcRIIおよび/またはFcRII受容体への結合が低減するように改変されている、請求項９または１０に記載の結合作用因子。
  12. 前記第１の部分が、天然型Fc分子が通常伴う１つ以上のグリカンを欠くFc領域を含む、請求項９、１０または１１に記載の結合作用因子。
  13. 前記第１の部分が、好ましくはグリコアミダーゼPNGアーゼFで酵素的に脱グリコシル化されるFc領域を含む、請求項１２に記載の結合作用因子。
  14. 前記第１の部分が、IgG重鎖の297位に対応するアスパラギン残基が、非グリコシル化可能なアミノ酸残基で置換された組換えFc領域を含む、請求項１２に記載の結合作用因子。
  15. 前記第１の部分が、前記結合作用因子が前記生物学的標的に結合する場合に、 (c)食作用細胞による食作用の誘発または刺激および(d)抗体依存性細胞傷害(ADCC)のうちの１つ以上の生物学的活性をさらに含む、請求項９に記載の結合作用因子。
  16. 前記少なくとも１つの生物学的活性が、FcRI、FcRIIおよび/またはFcRIII受容体との結合を含む、請求項９または１５に記載の結合作用因子。
  17. in vivoでの前記結合作用因子のリソソーム分解を低減する前記第１の部分へのエンドソーム結合が妨げられていない、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の結合作用因子。
  18. 前記第２の部分は、複数の異なる生物学的標的、または同じ生物学的標的の複数の異なる部分に結合可能である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の結合作用因子。
  19. １つ以上のFab、Fab'もしくはF(ab')2領域またはその部分を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の結合作用因子。
  20. １つ以上のFc領域、またはその部分を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の結合作用因子。
  21. 少なくとも１つの抗標的Fab、Fab'もしくはF(ab')2領域もしくはその部分、少なくとも１つの抗エフェクター細胞Fab、またはFab'領域もしくはその部分、および少なくとも１つのFc領域もしくはその一部を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の結合作用因子。
  22. 少なくとも２つの抗標的Fab、Fab'もしくはF(ab')2領域またはその部分を含む、請求項２１に記載の結合作用因子。
  23. 前記結合作用因子の第１、第２および第３の部分の任意の１つ以上がIgG分子から誘導される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の結合作用因子。
  24. 前記結合作用因子の第１、第２および第３の部分の任意の１つ以上が互いと共有結合している、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の結合作用因子。
  25. システイン残基間を連結させる１つ以上のタンデムチオエーテル結合を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の結合作用因子。
  26. 前記第２の部分が前記生物学的標的に特異的に結合する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の結合作用因子。
  27. 前記第２の部分が抗CD20および/または抗CD-37結合活性を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の結合作用因子。
  28. 前記第３の部分は前記エフェクター細胞に特異的に結合する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の結合作用因子。
  29. 前記第３の部分が抗CD16結合活性を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の結合作用因子。
  30. １つのモジュールは生物学的標的に結合可能で、１つのモジュールはエフェクター細胞に結合可能で、そして前記結合作用因子が生物学的標的に結合している場合に別のモジュールは抗体Fc領域の１つ以上の生物学的活性を含むモジュール構造を有する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の結合作用因子。
  31. 同じ生物学的標的に結合可能な２つのモジュールを含む、請求項３０に記載の結合作用因子。
  32. エフェクター細胞に結合している、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の結合作用因子。
  33. 請求項１〜３２のいずれか一項に記載の結合作用因子の製造において使用するための、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の部分、成分またはモジュール。
  34. 複数のモジュールを得て、それらそのシステイン残基間でタンデムチオエーテル結合により連結することを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の結合作用因子を得る方法。
  35. (a)結合作用因子が生物学的標的に結合している場合に抗体Fc領域の１つ以上の生物学的活性を含む第１の部分を得るステップ；(b)２以上の結合価を有する該生物学的標的に結合可能な第２の部分を得るステップ；(c)該第２の部分が該生物学的標的と結合している場合にエフェクター細胞が該生物学的標的に対して作用できるようにエフェクター細胞と一価で結合可能である第３の部分を得るステップ；ならびに該第１、第２および第３の部分を共有結合させるステップを含む、結合作用因子を得る方法。
  36. 前記結合作用因子のモジュールまたは部分は請求項１〜３３のいずれか一項に記載のものである、請求項３４または３５に記載の方法。
  37. 前記モジュールまたは部分は、マレイミドリンカー(例えば、ｏ-フェニレンジマレイミド(PDM))を介して連結されている、請求項３４、３５または３６に記載の方法。
  38. 医薬に使用する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の結合作用因子。
  39. 前記生物学的標的によって引き起こされるかまたは該生物学的標的が関与する疾患または障害を治療するための医薬の調製における、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の結合作用因子の使用。
  40. 前記疾患または障害は、癌、リンパ腫(例えば、Ｂ細胞リンパ腫)、感染症または障害、および自己免疫疾患または障害からなる群より選択される、請求項３９に記載の使用。
  41. 製薬上許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を任意に含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の結合作用因子を含む、医薬組成物。
  42. 好ましくはコンピュータで作成された画像またはモデルである、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の結合作用因子の画像またはモデル。
  43. 請求項４２に記載の画像またはモデルについてのデータを含む、データ担体。
  44. 請求項４２に記載の画像もしくはモデルについてのデータを含み、かつ/または請求項４３に記載のデータ担体を含む、コンピュータ。
  45. 請求項４２に記載の画像もしくはモデル、請求項４３に記載のデータ担体、または請求項４４に記載のコンピュータを得ること、ならびにそれを使用して、可能性のある新規治療結合作用因子の構造および/または機能について予測すること、を含む方法。
  46. １つ以上の変化を加えて請求項４２に記載の画像またはモデルを得ること、および任意にこれらの変化の影響を予測または分析すること、を含む方法。
  47. 請求項１〜３２のいずれか一項に記載の結合作用因子、請求項４２に記載の画像もしくはモデル、請求項４３に記載のデータ担体、請求項４４に記載のコンピュータ、または請求項４５もしくは４６に記載の方法を使用する、薬剤開発プログラム。
  48. 請求項４７に記載の薬剤開発プログラムを使用して得られたまたは同定された、薬剤または薬剤候補物質。
  49. 請求項１〜３２のいずれか一項に記載の結合作用因子、または請求項４８に記載の薬剤もしくは薬剤候補物質を得ること、ならびに生物学的標的に対する該結合作用因子、薬剤または薬剤候補物質の活性および/または結合をin vivoまたはin vitroでテストすることを含む、方法。
  50. 請求項１〜３２のいずれか一項に記載の結合作用因子、または請求項４８に記載の薬剤もしくは薬剤候補物質を得ること、および該結合作用因子、薬剤または薬剤候補物質の毒性をin vivoまたはin vitroでテストすることを含む、方法。
  51. 固定化形態の、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の結合作用因子、または請求項４８に記載の薬剤もしくは薬剤候補物質。
  52. 請求項１〜３２のいずれか一項に記載の結合作用因子、または請求項４８に記載の薬剤もしくは薬剤候補物質を含むアレイ。
  53. (a)マトリックスにFc含有ポリペプチドを曝すステップ；(b)疎水性相互作用により該Fc含有ポリペプチドを該マトリックスに結合させるステップ；(c)疎水性相互作用を妨害することにより該マトリックスから該Fc含有ポリペプチドを除去するステップ、を含む方法。
  54. (a)サンプルをマトリックスに曝すこと；(b)疎水性相互作用によりFc含有ポリペプチドを該マトリックスに結合させること；および任意に、該マトリックスを洗浄することにより該サンプルの１つ以上の成分を除去すること；ならびに(c)該疎水性相互作用を妨害することで、該マトリックスから該Fc含有ポリペプチドを取り出すことを含む、サンプル中の他の成分からFc含有ポリペプチドを分離する方法。
  55. 前記マトリックスがToyopearl TSK-ブチル-650を含む、請求項５３または５４に記載の方法。
  56. 添付の図面の図３を参照しながら実質的に上記記載し、かつ図３に示す、結合作用因子。
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