JP2005507231A - Histone deacetylase inhibitors in the diagnosis and treatment of thyroid neoplasms - Google Patents

Abstract

A novel approach for the treatment of thyroid cancer is disclosed herein. These approaches include methods that enhance thyroid-specific gene expression, for example, methods that enhance expression of thyroglobulin and / or Na ⁺ / I ⁻ carriers in thyroid cancer cells. Enhanced expression of thyroid-specific genes promotes cell differentiation and reduces biologically aggressive behaviors such as invasion and metastasis. Furthermore, increased expression of thyroglobulin and / or Na ⁺ / I ⁻ carriers increases the ability of thyroid cancer cells to concentrate iodine or iodide, thereby making the cells more sensitive to radioactive iodine treatment . Administering a therapeutically effective amount of a histone deacetylase inhibitor, administering a detectable substance that increases its uptake or enrichment in thyroid cells upon administration of the histone deacetylase inhibitor, and Also disclosed is a method of detecting a thyroid neoplasm in a subject by detecting a detectable substance.

Description

【００３３】
アミノ酸変化が起こるｃＤＮＡ配列の変化は、保存的であるか否かによらず、コードされる蛋白質の機能的および免疫学的同一性を保存するために、理想的には最小限である。如何なるｃＤＮＡ配列変種も、好ましくはコードされるポリペプチドにわずかに２０個、好ましくは１０個または５個未満のアミノ酸置換を導入すると思われる。変種アミノ酸配列は、例えば、本来のアミノ酸配列と８０％、９０％、または９５％同一であってもよい。
【００３４】
一つの態様において、ポリペプチド変種は、ヒストン脱アセチル酵素ドミナントネガティブ断片または変種のような「ドミナントネガティブ断片または変種」である。ヒストン脱アセチル酵素断片または変種ドミナントネガティブ変種は、一つまたはそれ以上のヒストン脱アセチル酵素基質に結合することができるが、一つまたはそれ以上のヒストン脱アセチル酵素基質の脱アセチル化能を欠損する、または脱アセチル能が損なわれているヒストン脱アセチル酵素ポリペプチドである。例えば、ヒストン脱アセチル酵素断片または変種は、変種が、部分的または実質的に一つまたはそれ以上のヒストンに対する結合親和性を保持しているが、一つまたはそれ以上のヒストンの脱アセチル化能が欠損しているまたは損なわれているように、組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる。その結果、ドミナントネガティブヒストン脱アセチル酵素断片または変種は、細胞におけるヒストン脱アセチル酵素活性の競合的阻害剤として作用する。一つの態様において、ドミナントネガティブヒストン脱アセチル酵素断片または変種は融合ポリペプチドである。
【００３５】
融合蛋白質またはポリペプチド：
自然界において互いに結合して認められない二つまたはそれ以上のアミノ酸配列を含む組換え型核酸によってコードされる蛋白質またはポリペプチド。融合蛋白質またはポリペプチドには、蛋白質またはポリペプチドの機能的断片または変種が含まれうる。一つの態様において、アミノ酸配列の一つがエピトープタグである。一つの特定の非制限的な例において、融合蛋白質は、緑色蛍光蛋白質、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓタグ、または当技術分野で既知の如何なる数のエピトープタグのようなエピトープタグに融合したヒストン脱アセチル酵素のドミナントネガティブ断片である。そのような融合蛋白質を操作するために簡便なクローニングベクター（例えば、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社およびプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社によって製造されたベクター）が容易に入手可能であり、宿主細胞において融合蛋白質を発現するために用いることができる。理論に拘束されることなく、エピトープタグは、蛋白質蛋白質相互作用のような、融合蛋白質に含まれる他のポリペプチドの生物機能にほとんど影響を及ぼさない。しかし、エピトープタグは融合蛋白質の細胞内位置特定のために、融合蛋白質を精製するために、融合蛋白質の結合パートナーを精製するために、または免疫学的検出のために有用である。
【００３６】
ヒストン：
ヌクレオソームのコア蛋白質の一部である蛋白質。ヒストンのアセチル化および脱アセチル化は、ヌクレオソームおよび染色質の構造に影響を及ぼすことによって遺伝子発現の調節において何らかの役割を有する。ヒストン蛋白質には、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４が含まれるがこれらに限定されない。ヒストンは、二つの型、すなわちアセチル化型と脱アセチル化型となりうる。ヒストンアセチルトランスフェラーゼはヒストンのアセチル化を引き起こすが、ヒストン脱アセチル酵素はこのプロセスを逆転させる。ヒストンの脱アセチル化は、加水分解によるヒストンのリジン側鎖のε−アミノ基からのアセチル基の除去を含む。
【００３７】
ヒストン脱アセチル酵素：
蛋白質脱アセチル酵素とも呼ばれ、ヒストンまたは他の蛋白質（例えば、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、またはＨ４）におけるリジン側鎖のイプシロン−アミノ基からのアセチル基の除去を触媒して、それによってリジン側鎖上に陽性荷電を再構築するクラスの酵素（ＮｇとＢｉｒｄ、Ｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌ． Ｓｃｉ． ２５：１２１〜１３６、２０００、参照として本明細書に組み入れられる）。同様に、Ｅｍｉｌｉａｎｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：２７９５〜２８００、１９９８；Ｆｉｓｃｈｌｅら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１１７１３〜１１７２０、１９９０；Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１２８４５〜１２８５０、１９９６；Ｔａｕｎｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２、４０８〜４１１、１９９６を参照されたい。ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、およびＲＰＤ３を含むがこれらに限定されないいくつかのヒストン脱アセチル酵素が同定されている。ヒストン脱アセチル酵素の特定の非制限的な例には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ０５８２７７、ＮＭ１５４０１、ＡＦ４０７２７３、ＸＭ００４３７９、およびＡＦ４２６１６０、ＡＦ００６６０３、ＡＦ００６６０２、およびＡＦ０７４８８２が含まれるがこれらに限定されず、同様に、米国特許第６，２８７，８４３号も参照されたい。ヒストン脱アセチル酵素が阻害されると、反対の酵素であるヒストンアセチルトランスフェラーゼの活性は、比較的過剰量存在し、ヒストンまたは他の蛋白質の超アセチル化が起こる。理論に拘束されることなく、ヒストン脱アセチル酵素の阻害によって、ヒストンのリジンテールの中和が起こり、ヒストン構造が破壊され、ＤＮＡの変性が起こる。ヒストンが変性状態となることによって、転写因子はＤＮＡに近づくことができる。
【００３８】
ヒストン脱アセチル酵素阻害剤：
一つまたはそれ以上のヒストン脱アセチル酵素の機能を例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、８０％、９５％、またはそれ以上阻害する物質。そのような物質は、薬剤または薬物、治療的に有効なオリゴヌクレオチド、特異的結合物質、またはヒストン脱アセチル酵素の断片もしくは変種の形であってもよい。いくつかの構造クラスのヒストン脱アセチル酵素阻害剤が同定されている。これらには、（１）短鎖脂肪酸（例えば、ブチレート）、（２）ヒドロキサム酸（例えば、スベリン酸ビスヒドロキサム酸、スベロリルアニリドヒドロキサム酸、プロキサミド、ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサム酸）、（３）２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシ−デカノイル部分を含む環状テトラペプチド、および（４）ベンズアミドが含まれる。ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の特定の非制限的な例には、ＦＲ９０１２２８（デシペプチド）、スクリプタイド、Ｎ−アセチルジナリン（ＣＩ−９９４）、スクリプタイド、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、トラポキシンＡ、トラポキシンＢ、ＨＣ−トキシン、クラミドシン、Ｃｌｙ−２、ＷＦ−３１６１、Ｔａｎ−１７４６、アピシジン、アピシジン類似体、ベンズアミド、ベンズアミド誘導体、ヒドロキサム酸誘導体、アゼライン酸ビスヒドロキサム酸、酪酸およびその塩、酢酸塩、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スベリン酸ビスヒドロキサム酸、ｍ−カルボキシ−桂皮酸ビスヒドロキサム酸、オキサムフラチン、デプデシン、またはＭＳ−２７５（Ｍａｒｋｓら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｏｎｃｏｌ． １３：４７７、２００１、その全文が参照として本明細書に組み入れられる）が含まれる。または、物質は、アンチセンス分子またはリボザイムのようなヒストン脱アセチル酵素の発現または機能を阻害する治療的に有効なオリゴヌクレオチドであってもよい。または、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤は、ヒストン脱アセチル酵素のドミナントネガティブ断片または変種となりうる。
【００３９】
注射可能組成物：
少なくとも一つの活性成分、例えば二特異的融合蛋白質を含む薬学的に許容される液体組成物。活性成分は、通常、生理的に許容される担体に溶解または懸濁して、組成物はさらに、乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤等のような一つまたはそれ以上の非毒性補助物質の少量を含みうる。本発明の融合蛋白質に関して用いるために有用なそのような注射可能組成物は通常のものであり；適当な製剤は当技術分野で周知である。
【００４０】
新生物：
良性および悪性腫瘍と共に他の増殖性障害を含む異常な細胞増殖。
【００４１】
オープンリーディングフレーム：
如何なる内部停止コドンも含まないアミノ酸をコードする一連のヌクレオチドトリプレット（コドン）。これらの配列は通常、ペプチドに翻訳可能である。
【００４２】
機能的に結合する：
第一の核酸配列は、第一の核酸配列が第二の核酸配列に対して機能的な関係に存在する場合に、第二の核酸配列と機能的に結合している。例えば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列に機能的に結合している。一般的に、機能的に結合したＤＮＡ配列は連続しており、二つの蛋白質コード領域を結合する必要がある場合、同じ読み取り枠に存在する。
【００４３】
Ｎａ^＋／Ｉ⁻共搬体（ナトリウム／ヨウ素共搬体、ＮＩＳ）：
ヨウ化物陰イオンの甲状腺への能動的輸送を媒介する膜蛋白質。例えば、Ｄｅ ｌａ Ｖｉｅｊａら、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ８０：１０８３〜１１０５、２０００；Ｄａｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３７９：４５８〜４６０、１９６６を参照されたい。本明細書では、ナトリウム−ヨウ化物共搬体とも呼ぶ。
【００４４】
非経口：
腸以外の部分への投与、例えば消化管を経由しない投与。一般的に、非経口製剤は、摂取を除く如何なる可能な様式によっても投与される製剤である。この用語は特に、静脈内、髄腔内、筋肉内、腹腔内、または皮下注射、ならびに例えば鼻腔内、皮内、および局所投与を含む様々な表面適用を意味する。
【００４５】
薬剤または薬物：
特定の用量を被験者に投与した場合に所望の治療的または予防的効果を誘導することができる化学化合物または組成物。
【００４６】
薬学的に許容される担体：
本発明において有用な薬学的に許容される担体は通常通りである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ、マック出版社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）、ペンシルバニア州、イーストン、第１５版（１９７５）は、本明細書に開示の融合蛋白質の薬学的輸送に適した組成物および製剤を記述している。
【００４７】
一般的に、担体の特性は、用いる特定の投与様式に依存すると思われる。例えば、非経口製剤は通常、媒体として水、生理食塩液、緩衝塩溶液、水性デキストロース、グリセロール等のような薬学的および生理学的に許容される液体を含む注射可能な液体を含む。固体組成物の場合（例えば、粉剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤）、通常の非毒性固体担体には、例えば、薬学等級のマンニトール、乳糖、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれうる。生物学的に中性の担体の他に、投与される薬学的組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラウリル酸ソルビタンのような非毒性の補助物質の少量を含みうる。
【００４８】
プロモーター：
プロモーターは、核酸の転写を指示する核酸制御配列のアレイである。プロモーターには、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合のＴＡＴＡエレメントのような、転写の開始部位近傍の必要な核酸配列が含まれる。プロモーターにはまた、選択的に、転写開始部位から数千塩基対もの位置に存在しうるエンハンサーまたはリプレッサーエレメントが含まれる。
【００４９】
精製された：
「精製された」という用語は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ相対的な用語であると解釈される。このように、例えば、精製蛋白質調製物は、言及した蛋白質が細胞内でのその天然の環境における蛋白質より純粋である調製物である。
【００５０】
組換え型：
組換え型核酸は、天然に存在しない配列を有する、またはそうでなければ離れている配列の二つのセグメントの人為的な組み合わせによって作製される配列を有する核酸である。この人為的な組み合わせは、化学合成によって、またはより一般的には、単離された核酸セグメントの人為的な操作、例えば、遺伝子操作技術によって行うことができる。
【００５１】
特異的結合物質：
既定の標的のみに特異的に結合する物質。このように、ヒストン脱アセチル酵素特異的結合物質は、実質的にヒストン脱アセチル酵素イソ型のみに結合する。本明細書において用いられるように、「ヒストン脱アセチル酵素特異的結合物質」という用語には、ヒストン脱アセチル酵素蛋白質抗体および実質的にヒストン脱アセチル酵素に限って結合する他の物質が含まれる。
【００５２】
抗ヒストン脱アセチル酵素蛋白質抗体は、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨＬ、ニューヨーク、１９８８）を含む多くのテキストに記載される標準的な技術を用いて産生してもよい。特定の物質が実質的にヒストン脱アセチル酵素に限って結合するか否かの決定は、一般的な技術を用いて、またはそれらを合うように改変して容易に行われると思われる。一つの適したインビトロアッセイ法は、ウェスタンブロッティング法を利用する（ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨＬ、ニューヨーク州、１９８８；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＣＳＨＬ、ニューヨーク州、１９９８を含む多くのテキストに記載される）。
【００５３】
より短い抗体断片もまた、特異的結合物質として作用しうる。例えば、ヒストン脱アセチル酵素に結合するＦａｂｓ、Ｆｖｓ、および一本鎖Ｆｖｓ（ＳＣＦｖｓ）は、ヒストン脱アセチル酵素特異的結合物質であると考えられる。これらの抗体断片は以下のように定義される：（１）Ｆａｂ、全抗体を酵素パパインによって消化して、無傷の軽鎖と一つの重鎖の一部とを生じることによって産生された抗体分子の一価抗原結合断片を含む断片；（２）Ｆａｂ’、全抗体をペプシンによって処置した後に還元して、無傷の軽鎖と重鎖の一部とを生じることによって得られた抗体分子の断片；抗体１分子あたりＦａｂ’断片２個が得られ；（３）（Ｆａｂ’）２、全抗体を酵素ペプシンによって処置した後還元せずに得られた抗体断片；（４）Ｆ（ａｂ’）２、二つのジスルフィド結合によって互いに結合した二つのＦａｂ’断片の二量体；（５）Ｆｖ、二つの鎖として発現される軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む遺伝子操作された断片；および（６）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）、遺伝子融合された一本鎖分子として適したポリペプチドリンカーによって結合した軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む遺伝子操作された分子。
【００５４】
治療的有効量：
疾患の進行を予防する、もしくは寛解を引き起こすために十分な用量、または発熱、疼痛、食欲減退、もしくは悪性疾患に関連したカヘキシアのような、疾患によって引き起こされた症状を軽減することができる用量。
【００５５】
治療的に有効なオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体：
治療的に有効なオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、例えば、蛋白質の発現の阻害による蛋白質機能の阻害能を特徴とする。阻害は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の非存在下において標的蛋白質活性または発現と比較した場合に認められる標的蛋白質活性または発現の如何なる減少となりうる。さらに、いくつかのオリゴヌクレオチドは、標的蛋白質の活性または発現を少なくとも１５％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％またはそれ以上阻害することができると思われる。
【００５６】
いくつかの治療的に有効なオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体はさらに、標的蛋白質をコードする核酸配列と十分に相補的であることを特徴とする。本明細書に記載するように、十分な相補性は、治療的に有効なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が標的蛋白質の発現を特異的に破壊することができるが、他の標的核酸配列の遺伝子発現を有意に変化させないことを意味する。
【００５７】
例えば、治療的に有効なオリゴヌクレオチドは、細胞におけるヒストン脱アセチル酵素活性を少なくとも１５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれ以上減少させる可能性がある。
【００５８】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸またはデオキシリボ核酸のオリゴマーまたはポリマーを意味する。この用語には、天然に存在するヌクレオベース、糖、および共有結合した糖間（骨格）結合からなるオリゴヌクレオチドと共に、類似のように機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような改変または置換オリゴヌクレオチドは、例えば細胞取り込みの増強、標的に対する結合の増加、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増加のような所望の特性のために、しばしば本来の型より好ましい。
【００５９】
サイログロブリン：
甲状腺組織において特異的に発現され、甲状腺ホルモンであるチロキシンとトリヨードチロニンを合成するための基質である大きい（アミノ酸残基約２７５０個）ヨウ化糖蛋白質。Ｍａｌｔｈｉｅｒｙら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７１：１９５〜２０９、１９８９；Ｖａｓｓａｒｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ３０：８９〜９７、１９８５；ｖａｎ ｄｅ Ｇｒａａｆら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：５０８〜５１５、１９９７を参照されたい。
【００６０】
甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）：
濾胞細胞におけるヨウ化物陰イオンの酸化およびヨード有機化を触媒する甲状腺特異的酵素。Ｏｈｔａｋｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ４３：１〜１４、１９９６を参照されたい。
【００６１】
甲状腺特異的遺伝子発現：
非甲状腺細胞タイプと比較して甲状腺濾胞細胞において高レベルで（例えば、非甲状腺細胞タイプの場合より少なくとも５倍高く）発現される遺伝子。これらには、例えば、サイログロブリン、Ｎａ^＋／Ｉ⁻共搬体、および甲状腺ペルオキシダーゼが含まれる。「甲状腺特異的」、「特異的に発現される」等という用語は、これらの遺伝子が他の細胞タイプには発現されないことを意味しない。例えば、Ｎａ^＋／Ｉ⁻共搬体は、授乳期の乳腺細胞、唾液腺細胞、および胃粘膜において発現されることが知られている。甲状腺特異的遺伝子の特定の非制限的な例は、甲状腺癌細胞におけるサイログロブリンおよび／またはＮａ^＋／Ｉ⁻共搬体である。理論に拘束されることなく、甲状腺特異的遺伝子の発現が増加することによって、細胞の分化が促進され、浸潤および転移のような生物学的に攻撃的な挙動が減少する。さらに、理論に拘束されることなく、サイログロブリンおよび／またはＮａ^＋／Ｉ⁻共搬体の発現が増加すれば、甲状腺癌細胞のヨウ素濃縮能が増加して、それによって細胞は放射活性ヨウ素治療に対してより感受性となる。
【００６２】
腫瘍：
悪性（癌様）または非悪性のいずれかである可能性がある新生物。
【００６３】
特に説明していない限り、全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実践または試験にあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の方法および材料を用いることができるが、適した方法および材料を下記に説明する。一致しない場合は、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は説明のために限られ、制限すると解釈されない。
【００６４】
いくつかの開示の方法の概要
本明細書において、甲状腺癌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。方法には、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の治療的有効量を投与することが含まれる。本明細書に開示のように、ヒストン脱アセチル酵素を阻害すると、甲状腺特異的サイログロブリンプロモーター−エンハンサーエレメントの転写活性が増加して、同様に、甲状腺特異的遺伝子の転写が活性化する。発現の増加を示す遺伝子の特定の非制限的な例には、Ｎａ^＋／Ｉ⁻共搬体（ＮＩＳ）およびサイログロブリンが含まれ、二つの蛋白質は、甲状腺細胞におけるヨウ化物の輸送、ヨウ素の濃縮、および甲状腺ホルモン産生に関与する。理論に拘束されることなく、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤によって誘導される甲状腺特異的遺伝子の発現の増加によって、甲状腺癌細胞の分化が促進して、それによって浸潤および転移のような生物学的に攻撃的な挙動が減少すると考えられる。さらに、甲状腺特異的遺伝子の発現の増加によって、ヨウ化物の濃縮能が増強または回復して、それによって甲状腺癌細胞は放射活性ヨウ素治療による治療に対して感受性となる。
【００６５】
少なくとも一つのヒストン脱アセチル酵素を阻害する物質を甲状腺癌細胞に導入することによって、甲状腺癌細胞における甲状腺特異的遺伝子の発現を増強する方法を本明細書において開示する。一つの態様において、サイログロブリンコード配列を含むサイログロブリン遺伝子を含むサイログロブリンプロモーター−エンハンサーエレメントを含む遺伝子、または異種核酸配列に機能的に結合したサイログロブリンプロモーターを含む遺伝子の発現を増強する方法を提供する。もう一つの態様において、Ｎａ^＋／Ｉ⁻共搬体または異種核酸配列に機能的に結合したＮａ^＋／Ｉ⁻共搬体プロモーターを含む遺伝子の発現を増強する方法が提供される。さらなる態様において、甲状腺癌細胞のヨウ化物またはヨウ素の取り込み能または濃縮能を増強する方法が提供される。さらにもう一つの態様において、甲状腺細胞のＫＩのようなヨウ化物またはヨウ素の取り込み能を増強する方法が提供される。
【００６６】
ヒストン脱アセチル酵素を阻害する物質は、例えば、ＦＲ９０１２２８（デプシペプチド）、トリコスタチンＡ、トラポキシンＡ、トラポキシンＢ、ＨＣ−トキシン、クラミドシン、Ｃｌｙ−２、ＷＦ−３１６１、Ｔａｎ−１７４６、アピシジン、アピシジン類似体、ベンズアミド、ベンズアミド誘導体、ヒドロキサム酸誘導体、アゼライン酸ビスヒドロキサム酸、酪酸およびその塩、酢酸塩、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スベリン酸ビスヒドロキサム酸、ｍ−カルボキシ−桂皮酸ビスヒドロキサム酸、オキサムフラチン、デプデシン、またはＭＳ−２７−２７５の治療的有効量となりうる。または、物質は、ヒストン脱アセチル酵素の発現または機能を阻害する治療的有効量のオリゴヌクレオチド、またはヒストン脱アセチル酵素のドミナントネガティブ断片もしくは変種となりうる。ヒストン脱アセチル酵素を阻害する物質はまた、国際公開公報第００７１７０３Ａ２号、国際公開公報第０１７６７５Ａ２号、および国際公開公報第０００８０４８Ａ２号にも記載されている。
【００６７】
甲状腺癌細胞は、被験者における甲状腺癌細胞となりえて、方法は、放射活性ヨウ素、例えば、^１３１Ｉの治療的有効量を被験者に投与することによって甲状腺癌を治療する方法となりうる。^１３１Ｉの治療的有効量は、例えば、約１ ｍＣｉ〜約５００ ｍＣｉ、または約３０ ｍＣｉ〜約３００ ｍＣｉとなりうる。特定の態様において、被験者における甲状腺癌細胞は、乳頭甲状腺癌、濾胞甲状腺癌、島甲状腺癌、未分化甲状腺癌、または甲状腺癌の如何なる組織学的変種に由来しうる。
【００６８】
他の特定の例において、放射活性ヨウ素による治療は、甲状腺切除術、外部放射線照射、または抗癌化学療法剤の治療的有効量の被験者への投与を伴うことができる。なお他の特定の態様において、放射活性ヨウ素は、被験者に複数回、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれ以上被験者に投与することができる。これらの回数は、一定期間、例えば、約１２時間を超える、約２４時間を超える、約４８時間を超える、約７２時間を超える、約１週間を超える、約２週間を超える、約４週間を超える、約８週間を超える、約１２週間を超える、約６ヶ月を超える、約１年を超える、または約２年を超える間隔をあけることができる。これらの如何なる一つまたはそれ以上の回数において、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤および／または放射活性ヨウ素の投与は、甲状腺刺激ホルモンの治療的有効量の投与を伴うことができる。
【００６９】
同様に、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の治療的有効量を被験者に投与すること；甲状腺癌におけるその濃度がヒストン脱アセチル酵素阻害剤の投与によって増加する検出可能な物質を被験者に投与すること；および検出可能な物質を検出することによって、被験者における甲状腺新生物を検出する方法が開示される。方法には、甲状腺新生物細胞におけるその濃度がヒストン脱アセチル酵素阻害剤の投与によって増加する物質を検出することによって、甲状腺新生物を検出することが含まれる。物質は、Ｎａ^＋／Ｉ⁻共搬体によって甲状腺細胞に輸送される物質となりうる。物質は、例えば、放射活性ヨウ化物分子、例えば、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、もしくは^１３１Ｉ；または放射標識過塩素酸塩もしくはペルテクニテートとなりうる。
【００７０】
特定の態様において、方法は、乳頭、濾胞、島、または未分化甲状腺癌を検出する方法となりうる。他の特定の態様において、方法は、甲状腺癌を治療するために一つまたはそれ以上の治療を受けた被験者における残留甲状腺癌を検出する方法となりうる。例えば、方法は、甲状腺切除術、^１３１Ｉ外部照射を受けたことがある、または抗癌化学療法を受けたことがある被験者における残留甲状腺癌を検出する方法となりうる。
【００７１】
さらに他の態様において、甲状腺癌の発生に対する放射線予防の有効性を増強するために、放射線曝露後に（例えば、核施設の事故、または核兵器への曝露後）ヨウ化物またはヨウ素化合物を予防的に投与する。
【００７２】
ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の例
参照として本明細書に組み入れられる、Ｍａｒｋｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ９２：１２１０〜１２１６、２０００は、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤のタイプおよびクラスの概要を示している。Ｍａｒｋｓらに記載されるヒストン脱アセチル酵素阻害剤は全て、本開示の方法において有用である。例えば、Ｍａｒｋｓらの図３および４（頁１２１２〜１２１３）に記載されるＨＤＩｓを参照されたい。
【００７３】
国際公開公報第００／０８０４８号および国際公開公報第００／２１９７９号、ならびに米国特許第５，９２２，８３７号に記載されるような環状テトラペプチドを、本発明において用いることができる。米国特許第４，９７７，１３８号に開示されるＦＲ９０１２２８および関連化合物もまた適している。他の有用なＨＤＩｓには、酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、トラポキシンＡ、トラポキシンＢ、ＨＣ−トキシン、クラミドシン、Ｃｌｙ−２、ＷＦ−３１６１、Ｔａｎ−１７４６、ならびにアピシジンおよびその類似体が含まれる。
【００７４】
ＨＣ−トキシンは、Ｌｉｅｓｃｈら（１９８２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３８、４５〜４８に記載され；トラポキシンＡおよびトラポキシンＢは、Ｉｔａｚａｋｉら（１９９０）Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． ４３、１５２４〜１５３２および欧州特許第０４０６７２５号に記載され；ＷＦ−３１６１は、Ｕｍｅｈａｎａら（１９８３）Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． ３６、４７８〜４８３に記載され；Ｃｌｙ−２は、Ｈｉｒｏｔａら（１９７３）Ａｇｒｉ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３７、９５５〜５６に記載され；クラミドシンはＣｌｏｓｓｅら（１９７４）Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ５７、５３３〜５４５に記載され、およびＴａｎ １７４６は、武田薬品工業に対する日本国特許第７１９６６８６号に記載されている。ベンズアミドおよび誘導体は、Ｓｕｚｕｋｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：３００１〜３００３、１９９９、および日本国特許第１１３３５３７５号に記載される。
【００７５】
ヒドロキサム酸誘導体は、本開示の方法において有用である。例には、Ｑｉｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ １１：２０６９〜２０８３、２０００に記載されるアゼライン酸ビスヒドロキサム酸；およびＲｉｃｈｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：１００１４〜１００１９、２０００に記載されるスベロイルアニリドヒドロキサム酸が含まれる。
【００７６】
このように、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の特定の非制限的な例には、ＦＲ９０１２２８（デプシペプチド）、トリコスタチンＡ、トラポキシンＡ、トラポキシンＢ、ＨＣ−トキシン、クラミドシン、Ｃｌｙ−２、ＷＦ−３１６１、Ｔａｎ−１７４６、アピシジン、アピシジン類似体、ベンズアミド、ベンズアミド誘導体、ヒドロキサム酸誘導体、アゼライン酸ビスヒドロキサム酸、酪酸およびその塩、酢酸塩、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スベリン酸ビスヒドロキサム酸、ｍ−カルボキシ−桂皮酸ビスヒドロキサム酸、オキサムフラチン、デプデシン、またはＭＳ−２７−２７５が含まれるがこれらに限定されない。
【００７７】
特異的結合物質はまた、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤、例えばヒストン脱アセチル酵素に特異的に結合して、その機能を阻害する抗体および／または抗体断片となりうる。
【００７８】
治療的に有効なオリゴヌクレオチドも同様に、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤として用いることができる。一つの特定の非制限的な例において、オリゴヌクレオチドは、ヒストン脱アセチル酵素の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。治療的に有効なオリゴヌクレオチドを用いることを実施例６においてさらに説明する。
【００７９】
ヒストン脱アセチル酵素の断片および変種も同様に、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤として用いてもよい。一つの特定の非制限的な例において、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤は、ヒストン脱アセチル酵素のドミナントネガティブ変種である。ヒトヒストン脱アセチル酵素Ａは、アミノ酸残基約４９０位からＣ−末端アミノ酸残基９６７位までの触媒的活性ドメインを有することがわかっている（Ｆｉｓｃｈｌｅら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１１７１３〜１１７２０、１９９９）。さらに、残基約４９５位から残基約５５０位までの領域は、ヒストン脱アセチル酵素触媒活性にとって必須であることがわかっている。このように、残基５４０位からＣ−末端残基９６７位までを含むヒトヒストン脱アセチル酵素Ａ断片は、ヒストン基質の結合能を保持するが、基質の脱アセチル化能を欠損すると思われる。このように、この断片は、ヒストン脱アセチル酵素のドミナントネガティブ断片であり、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤として用いることができる。さらなるドミナントネガティブヒストン脱アセチル酵素断片は、配列相同性検索によって容易にデザインされ、ＡｕｓｕｂｅｌらのＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９８に記載されるような標準的なＤＮＡ組換え技術を用いて構築される。
【００８０】
ドミナントネガティブヒストン脱アセチル酵素断片または変種は、甲状腺細胞におけるヒストン脱アセチル酵素を阻害する。そのような断片は、多様な方法で甲状腺新生物細胞に輸送してもよい。例えば、ドミナントネガティブヒストン脱アセチル酵素断片をコードする核酸を適当な真核細胞遺伝子移入ベクターに移入して腫瘍細胞に輸送してもよい。
【００８１】
レトロウイルスベクターのようなウイルスベクターは、真核細胞遺伝子移入にとって有用であり、感染効率が高く、安定に組み込みおよび発現される（Ｏｒｋｉｎら、Ｐｒｏｇ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ７：１３０〜１４２、１９８８）。ドミナントネガティブヒストン脱アセチル酵素断片または変種をコードする核酸は、レトロウイルスベクターにクローニングして、その内因性のプロモーター、異種プロモーター（構成的または誘導型）、またはレトロウイルスＬＴＲ（長末端反復）のいずれかによって駆動される。アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：１９６３〜１９７３、１９８８）、ワクシニアウイルス（Ｍｏｓｓら、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５：３０５〜３２４、１９８７）、ウシ乳頭腫ウイルス（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １３９：６４２〜６５４、１９８７）、エプスタイン−バーウイルスのようなヘルペスウイルスメンバー（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：２８３７〜２８４７、１９８８）、またはレンチウイルスおよび関連ベクター（米国特許第６，０１３，５１６号）を含む他のウイルストランスフェクション系も同様に、このタイプのアプローチのために利用してもよい。
【００８２】
非常に大きい核酸インサートをウイルス系に組み入れることができる。Ｋｏｃｈａｎｅｋら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：５７３１〜５７３９、１９９６は、遺伝子移入治療において用いるための２８．２ ｋｂ発現カセットのアデノウイルス系における効率的なパッケージングを証明した。同様に、アデノウイルスでの研究のＰａｒｋｓとＧｒａｈａｍは、１５．１〜３３．６ ｋｂの範囲の大きさのベクターのパッケージングを証明した（Ｐａｒｋｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１３５６５〜１３５７０、１９９６；ＰａｒｋｓとＧｒａｈａｍ、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：３２９３〜３２９８、１９９７）。
【００８３】
一つの態様において、アデノウイルス媒介遺伝子輸送を用いて、甲状腺細胞における核酸の発現を指示する。Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ８３（７）：２５１６〜２２、１９９８は、アデノウイルス媒介遺伝子移入が、未分化甲状腺癌細胞に対して機能的ｐ５３状態を回復するために非常に有効であることを示した。Ｚｅｉｇｅｒら、Ｓｕｒｇｅｒｙ １２０：９２１〜９２５、１９９６は、ガンシクロビル投与による腫瘍細胞障害の促進におけるアデノウイルス媒介チミジンキナーゼ遺伝子移入の有効性を証明した。
【００８４】
真核細胞遺伝子移入技術における最近の進歩には、Ｃｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１３８６〜１３８９、１９９６）によって記述されるように、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチドを利用することが含まれる。この技術によって、クローニングした配列の部位特異的組み込みを行うことができ、それによって遺伝子改変を正確にターゲティングすることができると思われる。
【００８５】
感染によらない輸送方法を用いることが可能である。例えば、様々な遺伝子をトランスフェクトするために（論評に関しては、ＴｅｍｐｌｅｔｏｎとＬａｓｉｃ、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １１：１７５〜１８０、１９９９；ＬｅｅとＨｕａｎｇ、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ． Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． １４：１７３〜２０６；およびＣｏｏｐｅｒ、Ｓｅｍｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２３：１７２〜１８７、１９９６を参照されたい）、およびペプチドを輸送するために、脂質およびリポソーム媒介遺伝子輸送を用いることができる。例えば、陽イオンリポソームは単球白血病細胞にトランスフェクトできるか否かが分析されており、ウイルスベクターを用いることに対する実行可能な代用法であることが示されている（ｄｅ Ｌｉｍａら、Ｍｏｌ． Ｍｅｍｂｒ． Ｂｉｏｌ． １６：１０３〜１０９、１９９９）。そのような陽イオンリポソームはまた、例えば、モノクローナル抗体または他の適当なターゲティングリガンドを含めることによって特定の細胞にターゲティングすることができる（Ｋａｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３：２５０〜２５６、１９９６）。Ｓｉｋｅｓら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：８３７〜８４４、１９９４は、甲状腺濾胞細胞を形質転換するために甲状腺にプラスミドＤＮＡの直接間質内注射を用いて成功した。
【００８６】
このように、甲状腺新生物細胞にドミナントネガティブヒストン脱アセチル酵素断片および変種を導入するために多様な技術が利用可能である。
【００８７】
ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の治療的利用の例
ヒトまたは動物における甲状腺新生物を治療する場合、疾患が診断された後にヒストン脱アセチル酵素阻害剤（ＨＤＩ）を投与する。治療は、間欠的であっても連続的であってもよい。間欠的治療の例は、実施例５およびその中に記載される参考文献に記載されるように、^１３１Ｉの投与前にＨＤＩの治療的有効量を短期間投与することである。例えば、ＨＤＩの治療的有効量は、^１３１Ｉを投与する前約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間、約５日間、約１週間、約２週間、または約４週間投与することができると思われる。１日量は、約０．０１ μｇ／ｋｇ〜約５００ ｍｇ／ｋｇの範囲となると思われる。治療は、ＨＤＩの治療的有効量が投与されるまで、または最大治療的ＨＤＩ阻害が得られるまで１日１回またはそれ以上の経腸または非経口投与となりうる。または、１日量は、ほぼ連続的に、例えば静脈内注入によって投与することができる。
【００８８】
ＨＤＩは、甲状腺癌細胞の分化を促進して、それによって組織浸潤および転移のような生物学的に攻撃的な挙動に対する傾向を減少するために投与してもよい。治療は、上記のように間欠的または連続的であってもよい。甲状腺癌細胞の分化を促進するための連続的治療の一例は、好ましい治療反応が認められるまで、または被験者における全ての甲状腺癌細胞が消滅または死滅するまで、約０．０１ μｇ／ｋｇ〜約５００ ｍｇ／ｋｇの範囲の１日量を投与することであると考えられる。そのような分化促進ＨＤＩ治療は、放射活性ヨウ素または他の甲状腺癌治療も同様に行うか否かによらず行うことができる。
【００８９】
いくつかの例において、甲状腺切除術を受けた、または受ける予定である被験者にＨＤＩの治療的有効量を投与することができる。甲状腺切除術を受けた、または受ける予定である被験者にＨＤＩを投与することは、甲状腺切除術を受けなかった被験者の場合と物質的な差がない。
【００９０】
ヒストン脱アセチル酵素阻害剤は、治療を必要とする被験者に経腸または非経口投与することができる。投与される用量は、用いる特定の化合物、関係する甲状腺癌の組織学タイプ、特定の宿主、疾患の重症度および程度、宿主の身体状態、ならびに選択した投与経路に従って変更してもよい。適当な用量は、当業者によって容易に決定することができる。例えば、ヒトおよび動物における甲状腺癌の治療に関して、１日量は約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５００ ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。
【００９１】
本明細書に開示の組成物には、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤と不活性な担体とが含まれる。組成物は、ヒトおよび獣医学で用いるための薬学的組成物の形、または家禽におけるコクシジウム症を制御するための飼料組成物の形となりうる。「組成物」という用語は、一つもしくはそれ以上の活性成分、および担体を構成する一つもしくはそれ以上の不活性成分と共に、如何なる二つもしくはそれ以上の成分の組み合わせ、配合、もしくは凝集に直接もしくは間接的に起因する、一つもしくはそれ以上の成分の解離に起因する、または一つもしくはそれ以上の成分の他のタイプの反応に起因する如何なる産物も含む産物を含むと解釈される。このように、組成物には、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤と不活性担体とを混合することによって作製される組成物が含まれる。
【００９２】
薬学的組成物には、活性成分としてのヒストン脱アセチル酵素阻害剤が含まれ、同様に、薬学的に許容される担体および選択的に他の化学療法剤のような他の治療成分を含みうる。組成物には、経口、直腸内、局所、および非経口（皮下、筋肉内、および静脈内投与を含む）投与のために適した組成物が含まれるが、如何なる場合にも最も適した経路は、特定の宿主、ならびに活性成分が投与される病態の特性および重症度に依存すると思われる。薬学的組成物は、単位用量剤形であることが都合よく、薬学の技術分野において周知の如何なる方法によっても調製してもよい。
【００９３】
実際に用いる場合、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤は、通常の薬学的合成技術に従って薬学的担体との密接混合における活性成分として組み合わせることができる。担体は、投与、例えば経口または非経口（静脈内を含む）投与のために望ましい調製物の形に応じて幅広い形であってもよい。
【００９４】
経口投与剤形の組成物を調製する場合、如何なる通常の薬学的媒体も用いることができる。例えば、懸濁剤、エリキシル剤、および溶液のような経口液体調製物の場合、水、グリセロール、油、アルコール、着香料、保存剤、着色剤等を用いることができる；または粉剤、カプセル剤、および錠剤のような経口固体調製物の場合、デンプン、糖、微結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等のような担体を含めることができる。投与しやすいことから、錠剤およびカプセル剤は、固体薬学的担体が明白に用いられる場合には、最も都合のよい経口単位投与剤形である。望ましければ、錠剤は標準的な水性または非水性技術によってコーティングすることができる。上記の一般的な投与剤形の他に、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤はまた、徐放手段および／または輸送装置によって投与することができる。
【００９５】
経口投与に適した薬学的組成物は、それぞれが規定量の活性成分を含むカプセル剤、カシェ剤、もしくは錠剤のような個別の単位の形、粉剤もしくは顆粒剤、または水性液体、非水性液体、水中油型乳剤、もしくは油中水型乳剤における溶液もしくは懸濁液となりうる。そのような組成物は、如何なる薬学的方法によっても調製することができるが、全ての方法には、一つまたはそれ以上の必要な成分を構成する担体と活性成分とを会合させる段階が含まれる。一般的に、組成物は、活性成分を液体担体、細かく粉砕した固体担体、またはその双方と均一に密接に混合すること、および必要であれば、産物を所望の形状に成形することによって調製される。例えば、錠剤は、選択的に一つまたはそれ以上の補助成分と共に、圧縮または成型によって調製することができる。圧縮された錠剤は、適した機械において粉末または顆粒のような自由に流動する形での活性成分を、選択的に結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、界面活性剤、または分散剤と混合して圧縮することによって調製することができる。成型された錠剤は、不活性な液体希釈剤によって湿らせた粉末化合物の混合物を適した機械において成型することによって作製することができる。望ましくは、それぞれの錠剤は、活性成分約１ ｍｇ〜約５００ ｍｇを含み、それぞれのカシェ剤またはカプセル剤は、活性成分約１〜約５００ ｍｇを含む。
【００９６】
非経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適当に混合した水においてこれらの活性化合物の溶液または懸濁液として調製することができる。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその油中での混合物として調製することができる。通常の保存および使用条件では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。
【００９７】
注射での使用に適した薬学的製剤の例には、滅菌水溶液または分散剤、および滅菌注射用溶液または分散液との即時調製用滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、剤形は無菌的で、容易なシリンジ操作性が存在する程度に流動性でなければならない。剤形は、製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、その適した混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体となりうる。
【００９８】
上記の担体成分の他に、上記の薬学的製剤には、適当であれば、希釈剤、緩衝材、着香料、結合剤、界面活性剤、濃化剤、潤滑剤、保存剤（抗酸化剤を含む）等のような一つまたはそれ以上のさらなる担体成分、および意図するレシピエントの血液に対して製剤を等張にする目的のために含まれる物質を含んでもよいと理解すべきである。
【００９９】
ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の診断的使用
ヒストン脱アセチル酵素阻害剤は、甲状腺新生物を有することがわかっている、または有することが疑われる被験者に経腸または非経口投与することができる。ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の投与は、甲状腺新生物の診断において、例えば甲状腺新生物の存在および程度の決定を可能にすることによって役立ちうる。ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の投与はまた、甲状腺新生物に関する診断試験の感度、特異性、または予想される価値を増強しうる。
【０１００】
甲状腺または他の領域における機能的または非機能的甲状腺組織の位置は、おそらく、外部シンチスキャン技術によって特定することができる。基礎となる原理は、甲状腺組織によって異なるように蓄積される同位元素をインサイチューで検出および定量することができるという点である。データをデジタル化して視覚ディスプレイに変換することができる。そのような蓄積された同位元素は、Ｌａｒｓｅｎら、Ｔｈｅ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｇｌａｎｄ、第１１章、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、Ｊ． Ｗｉｌｓｏｎ編、１９９８に記載される外部シンチレーション検出器によって検出してもよい。
【０１０１】
甲状腺造影剤は一般的に、Ｎａ^＋／Ｉ⁻共搬体のような甲状腺特異的遺伝子によって甲状腺に取り込まれる。このように、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤が甲状腺特異的遺伝子、例えばＮａ^＋／Ｉ⁻共搬体および／またはＴＧの発現を増加させることができることによって、甲状腺細胞のそのような造影剤の取り込みおよび／または保持能が増強される。このように、ヒストン脱アセチル酵素阻害によって、甲状腺組織は外的に、例えば外部シンチスキャンによってより容易に検出可能となる。
【０１０２】
ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の投与は、一般的な多様な臨床状況において特に有用となりうる。例えば、分化の不十分な甲状腺癌はしばしば、それらが診断物質の濃縮能を失っているために検出することが難しい。理論に拘束されることなく、これはＮａ^＋／Ｉ⁻共搬体および／またはサイログロブリンのような甲状腺特異的遺伝子の発現の減少に関連する可能性がある。ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の投与は、分化の不十分な甲状腺癌における甲状腺特異的遺伝子の発現を増強し、それによって診断物質の取り込みが増強され、甲状腺癌はより容易に検出可能となる。このように、そのような試験の感度および正の予測値が改善され、それらの結果は臨床的により有用となる。Ｇｏｌｄｍａｎ、Ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅａｓｏｎｉｎｇ、第３章、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１４版、Ａ． Ｆａｕｃｉ編、著作権１９９８年を参照のこと。
【０１０３】
甲状腺癌の検出に関する問題は、例えば、甲状腺切除術、放射活性ヨウ素、抗癌化学療法剤、または外部放射線照射による処置後に起こりうる。
【０１０４】
いくつかの放射性同位元素が甲状腺の造影に用いられている。^９９ｍＴｃ−ペルテクネテート（ＴｃＯ⁻４）は、一価の陰イオンであり、ヨウ化物と同様に、Ｎａ^＋／Ｉ⁻共搬体によって甲状腺において能動的に濃縮される。^９９ｍＴｃの物理的半減期が短いこと（６時間）およびそれが甲状腺に一過性に留まることから、標準的な用量によって甲状腺に輸送される放射線は非常に低くなる。その結果、分画の取り込みが低すぎて放射性ヨウ素によるシンチスキャンを行うことができない場合、大量（＞３７ ＭＢｑ［１ ｍＣｉ］）の投与によって高い計数率と甲状腺の適切な造影を行うことができる。ペルテクネテートは通常、１回静脈内投与として投与され、造影は約３０分後に行う。連続造影によって、甲状腺の血流と同位元素の蓄積の動力学に関して可能性がある研究を行うことができる。
【０１０５】
ヨウ素の三つの放射活性同位元素が甲状腺の造影に用いられている。^１３１Ｉは、過去に一般的に用いられていたが、甲状腺癌の機能的転移を求める場合にはなおも有用である。^１２５Ｉの物理的半減期（６０日）は、^１３１Ｉ（８日）より長いが、その放射線エネルギーがより低いために、投与された放射活性の単位あたりの甲状腺に対する線量の輸送は放射線照射量^１３１Ｉによって輸送される場合の約３分の２に過ぎない。第三の同位元素^１２３Ｉは、多くの点において^１２５Ｉまたは^１３１Ｉよりよい。その短い半減期およびβ放射線が存在しないことによって、甲状腺に対する線量は^１３１Ｉの同等の用量によって輸送された場合の約１％である。三つ全てのヨウ素同位元素は、その正常な位置で甲状腺の満足のゆく像を提供する。甲状腺に対する線量が低いことから、^１２３Ｉはヒト小児科の現場において甲状腺シンチグラフィーにとって有用である。
【０１０６】
実施例１
細胞生存率に及ぼすヒストン脱アセチル酵素阻害剤の影響
本実施例は、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤であるＦＲ９０１２２８が有意に細胞障害性ではないことを証明する。特に、１ ｎｇ／ｍｌまでのＦＲ９０１２２８に７２時間曝露しても、異なる四つの甲状腺細胞株に対して有意に細胞障害性ではなかった。
【０１０７】
方法および材料
ＦＴＣ１３３およびＦＴＣ２３６細胞は、ヒト濾胞性甲状腺癌の原発腫瘍（ＦＴＣ １３３）および結節性転移（ＦＴＣ ２３６）から得た培養物に由来した。ＦＴＣ １３３およびＦＴＣ２３６細胞は、当初ＴＳＨを含む培地において維持したが、これは、ＴＳＨが細胞の増殖速度に全く影響を及ぼさないことが判明した後に中止した。未分化甲状腺癌細胞株ＳＷ−１７３６およびＫＡＴ−４は、ヒト未分化甲状腺癌腫瘍の初代培養に由来した。
【０１０８】
これらの四つの細胞株のそれぞれに、様々な濃度のＦＲ９０１２２８（０．０１ ｎｇ／ｍｌ、０．１ ｎｇ／ｍｌ、１ ｎｇ／ｍｌ、１０ ｎｇ／ｍｌ）を７２時間曝露した後、Ｍｏｓｍａｎｎ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５〜６３、１９８３およびＤｅｎ Ｂｏｅｒら、Ｂｒ． Ｊ． Ｈａｅｍ． １０５：８７６〜８８２、２０００に記載されるように、３−［４，５−ジメチルチアゾル−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ法を用いて細胞生存率を決定した。ＭＴＴアッセイ法は、細胞死に関連したミトコンドリア代謝活性の喪失に関する比色アッセイ法である。
【０１０９】
結果および結論
本実施例は、１ ｎｇ／ｍｌ濃度のＦＲ９０１２２８に対する７２時間の曝露が、調べた四つの細胞タイプ（ＦＴＣ １３３、ＦＴＣ２３６、ＳＷ−１７３６およびＫＡＴ−４）の如何なるものに関しても有意に細胞障害性ではないことを証明した。このように、細胞ＦＲ９０１２２８を評価するためのその後の方法は、ＦＲ９０１２２８誘導細胞障害性による結果と混同されないように、１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８を用いれば安全に行うことができると思われる。したがって、その後の実施例において記述した方法は、特に明記していない限り１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８で行った。
【０１１０】
実施例２
ＦＲ９０１２２８は甲状腺癌細胞株においてヒストン脱アセチル酵素を阻害する
ＦＲ９０１２２８がヒストンのアセチル化を阻害するために有効であることを証明するために、ヒストンのアセチル化の程度をＦＲ９０１２２８処置および対照処置甲状腺癌細胞において評価した。これらの免疫蛍光試験から、１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８による７２時間の処置によって、より分化した（ＦＴＣ ２３６）および分化度の低い（ＳＷ−１７３６）甲状腺癌細胞の双方においてヒストンアセチル化が顕著に増加することが示された。このように、１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８は、有意な細胞障害性を引き起こすことなく、甲状腺癌細胞においてヒストンの脱アセチル化を有効に阻害した。
【０１１１】
方法および材料
ヒストンのアセチル化は、免疫蛍光顕微鏡によって検出した。この実験アプローチにおいて、固定細胞を、アセチル化ヒストンに特異的に結合する一次抗体に曝露した後、一次抗体に結合するＦＩＴＣ標識二次抗体に曝露した。アセチル化ヒストンを含む細胞は、アセチル化ヒストンの存在を反映する核蛍光を示す。
【０１１２】
ＦＴＣ ２３６およびＳＷ−１７３６細胞を実施例１に記載するように培養して、１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８と共に７２時間処置した。対照ＦＴＣ ２３６およびＳＷ−１７３６にはＦＲ９０１２２８を処置しなかったが、それ以外はＦＲ９０１２２８曝露細胞と同じように処置した。７２時間後、それぞれの培養物をトリプシンによって処置して、回収し、低速遠心を行って細胞沈降物を形成した。それぞれの沈降物からの細胞を顕微鏡スライドガラス上に載せて、９５％エタノール／５％酢酸によって室温で１分間固定した。固定後、スライドガラスを燐酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）によって１５分間２回洗浄して、８％ウシ血清アルブミンのＰＢＳ溶液によって室温で１時間処置し、ＰＢＳによって１５分間洗浄した。
【０１１３】
次に、固定細胞を５ μｇ／ｍｌ抗αアセチル化ヒストンＨ３の２％ウシ血清アルブミンＰＢＳ溶液と共に４℃で一晩インキュベートした（アップステートバイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、レークプラシッド、ニューヨーク州から得た抗体）。その後、細胞をＰＢＳによって室温で５分間２回洗浄した後、ウマ抗ウサギＦＩＴＣ結合二次抗体（ベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）、バーリンガム、カリフォルニア州）と共にインキュベートした。スライドガラスをＰＢＳによって１５分間３回洗浄してから、ＤＡＰＩ含有色あせ防止化合物（ベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）、バーリンガム、カリフォルニア州）によって対比染色した。
【０１１４】
結果および結論
対照細胞を調べたところ、適度の核蛍光バックグラウンドレベルを認めたが、分化したＦＴＣ ２３６細胞では未分化ＳＷ−１７３６細胞の場合より大きいことが判明した。対照的に、ＦＲ９０１２２８処置ＦＴＣ ２３６およびＳＷ−１７３６細胞は強い核蛍光を示し、このことは対照細胞と比較してヒストンアセチル化が顕著に増加していることを反映した。このように、１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８による処置によって、分化度の高いおよび分化度の低い甲状腺癌細胞株のいずれにおいてもヒストンのアセチル化は顕著に増加する。
【０１１５】
実施例３
ヒストン脱アセチル酵素は甲状腺特異的プロモーターを活性化する
サイログロブリン（ＴＧ）は、正常な完全に分化した甲状腺細胞によって産生され、他の細胞タイプでは産生されない甲状腺ホルモン結合蛋白質である。ＴＧの発現は、転写レベルで、甲状腺特異的ＴＧエンハンサー−プロモーターエレメントの活性化によって主として調節される。
【０１１６】
甲状腺癌では、甲状腺特異的遺伝子発現は障害されているか、または失われている。甲状腺特異的遺伝子発現がこのように失われることは、癌様表現型を維持するために重要な要因となる可能性がある。甲状腺特異的遺伝子発現を促進する物質は、甲状腺癌細胞の分化を促進して、それによってこれらの腫瘍の生物学的に攻撃的な挙動を減少させる可能性がある。
【０１１７】
ヒストン脱アセチル酵素阻害が甲状腺特異的遺伝子発現に及ぼす影響を調べるために、サイログロブリンプロモーター活性に及ぼすＦＲ９０１２２８の作用を示した。これは、１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８が甲状腺癌細胞におけるＴＧプロモーター−エンハンサー活性を顕著に増加することを示した。
【０１１８】
方法および材料
ＦＴＣ ２３６およびＳＷ−１７３６細胞に、ＴＧプロモーター−エンハンサーエレメントに機能的に結合したルシフェラーゼをコードするレポータープラスミドを一過性にトランスフェクトした。このレポータープラスミドをトランスフェクトした細胞は、ＴＧプロモーターエンハンサーの活性化時にルシフェラーゼを発現すると思われる。細胞溶解物におけるルシフェラーゼ活性は、細胞におけるＴＧプロモーターエンハンサー活性を正確に反映する。
【０１１９】
陽性対照として、ＦＴＣ ２３６およびＳＷ−１７３６細胞に、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターエンハンサーに機能的に結合したルシフェラーゼをコードするレポータープラスミドをトランスフェクトした。ＴＫプロモーターエンハンサーは、構成的に活性なプロモーターエレメントであり、このことはこれが甲状腺特異的でなく、全ての細胞タイプにおいて十分に活性であることを意味している。
【０１２０】
トランスフェクションに関して、ＦＴＣ ２３６およびＳＷ−１７３６細胞にプラスミドＤＮＡ ０．５ μｇ、トランスファーストトランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＦａｓｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社、マディソン、ウィスコンシン州）４．５ μｌ、およびＲＰＭＩ培地２００ μｌのトランスフェクション混合物に曝露した。プラスミドＤＮＡは、ＴＧ−ルシフェラーゼ（ＴＧ−ｌｕｃ）構築物またはＴＫ−ルシフェラーゼ（ＴＫ−ｌｕｃ）構築物のいずれかであった。トランスフェクションは全て１試料あたり３個ずつ行った。
【０１２１】
細胞をトランスフェクション混合物と１時間インキュベートした後、細胞を１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８の存在下または非存在下で２日間培養した。次に、細胞を回収して溶解し、細胞蛋白質の抽出物を得た。抽出物における総蛋白質濃度は、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）蛋白質アッセイ系（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社、リッチモンド、カリフォルニア州）を用いて決定した。ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼアッセイ系（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いて決定し、総蛋白質濃度に対して標準化した。
【０１２２】
結果
結果を図２に示す。ＴＫ ｌｕｃ−トランスフェクトした細胞における標準化したルシフェラーゼ活性に１００％の値を割付して、ＴＧ ｌｕｃ−トランスフェクトした細胞における標準化したルシフェラーゼ活性を、相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）としてこれと比較して表記した。
【０１２３】
ＨＤＩ処置を行わなかった場合、ＴＧ ｌｕｃ−トランスフェクトした細胞における標準化したルシフェラーゼ活性は、ＴＫ ｌｕｃトランスフェクト細胞において認められた場合より小さかった。比較的よく分化したＦＴＣ １３３およびＦＴＣ ２３６細胞では、ＴＧ ｌｕｃ−トランスフェクト細胞のＲＬＵは約５０〜８０％であった。分化度の低いＳＷ−１７３６およびＫＡＴ−４細胞では、ＴＧ ｌｕｃトランスフェクションによってＲＬＵは約３０％となった。このように、基準値ＴＧプロモーターエンハンサー活性は、分化した甲状腺癌細胞では分化度の低い未分化細胞より大きい。
【０１２４】
１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８による処置は、ＴＫ ｌｕｃトランスフェクト細胞においてルシフェラーゼ活性に影響を及ぼさなかった。しかし、ＦＲ９０１２２８処置によって、ＴＧ−ｌｕｃトランスフェクト細胞におけるＲＬＵは顕著に増加した。例えば、ＦＴＣ １３３およびＦＴＣ ２３６細胞におけるＲＬＵは約１０００％であり、未処置細胞において認められた場合よりルシフェラーゼ活性の１０倍を超える増加を示した。分化度の低いＳＷ−１７３６およびＫＡＴ−４細胞では、ＲＬＵは４００〜５００％であり、この場合も未処置細胞において認められたＲＬＵに対して１０倍を超える増強を示した。
【０１２５】
これらの結果は、ＨＤＩ処置が甲状腺癌細胞タイプにおいて甲状腺特異的ＴＧプロモーターエンハンサーの活性を顕著に増強することを証明している。
【０１２６】
実施例４
ヒストン脱アセチル酵素を阻害すると甲状腺特異的遺伝子の発現が増加する
ＴＧプロモーター活性のＨＤＩ増強は生理的に関連するため、ＨＤＩ処置はまた、ＴＧプロモーター調節遺伝子の発現も増加させる。本実施例において、ＦＲ９０１２２８処置によって、二つのＴＧプロモーター調節遺伝子の発現が顕著に増加することが証明された。
【０１２７】
材料および方法
ＲＴ ＰＣＲおよびノザンブロット分析を用いて、ＦＲ９０１２２８処置および未処置甲状腺癌細胞におけるサイログロブリンおよびＮａヨウ化物共搬体（Ｎａ^＋／Ｉ⁻共搬体、またはＮＩＳ）発現が転写的に調節されることを証明した。ＲＴ ＰＣＲおよびノザンブロット分析は、標準的な分子生物学の参考となる多くの研究、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９８において詳細に説明されている。
【０１２８】
総ＲＮＡは、ＲＮＡ ＳＴＡＴ−６０（テルテスト社（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ， Ｉｎｃ））を用いて、ＦＲ９０１２２８処置および未処置甲状腺癌細胞から、ＦＲ９０１２２８含有または対照溶液を細胞培養物に加えた２４時間、４８時間、および７２時間後に抽出した。ＲＮＡも同様に、比較目的のために正常な甲状腺細胞から抽出した。抽出したＲＮＡは、ノザンブロットに関してはこれ以上改変せずに用いた。ＲＴ ＰＣＲの場合、抽出したＲＮＡは、標準的な技術を用いてｃＤＮＡに逆転写した。
【０１２９】
ヒトサイログロブリン発現のＰＣＲ分析のために用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは以下の通りであった：

【０１３０】
これらのプライマーを用いると、ヒトサイログロブリンｃＤＮＡ鋳型が存在することは、２１９ ｂｐ ＰＣＲ産物によって反映される。
【０１３１】
ヒトＮａ^＋／Ｉ⁻共搬体発現のＰＣＲ分析のために用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは以下の通りであった：

【０１３２】
これらのプライマーを用いると、ヒトＮａ^＋／Ｉ⁻共搬体ｃＤＮＡ鋳型が存在することは、３０３ ｂｐ ＰＣＲ産物によって反映される。
【０１３３】
結果
未処置ＡＴＣ細胞では、ＴＧもＮＩＳ発現も検出できなかった。このように、これらの遺伝子は、未処置の未分化甲状腺癌細胞では発現されない。未処置ＦＴＣ細胞では、非常にかすかなバンドがＲＴ ＰＣＲによって検出されたが、ノザンブロットでは検出されなかった。このことは、より分化した甲状腺癌細胞ではＴＧおよびＮａ^＋／Ｉ⁻共搬体の双方が非常に低レベルで発現されることを示している。
【０１３４】
ＦＴＣ細胞において、ＴＧおよびＮａ^＋／Ｉ⁻共搬体発現の増加は、ＦＲ９０１２２８の添加後ＲＴ ＰＣＲおよびノザンブロット分析の双方によって２４時間以内に検出され、７２時間後ではさらなる増加を認めた。ＡＴＣ細胞において、発現の増加は、ＦＲ９０１２２８の添加後４８時間に初めて認められ、ＦＲ９０１２２８の曝露後７２時間ではさらなる増加を認めた。対照処置細胞は、ＴＧまたはＮａ^＋／Ｉ⁻共搬体の発現の増加を示さなかった。
【０１３５】
これらの実験は、ＨＤＩ処置が甲状腺癌細胞において甲状腺特異的遺伝子の発現を顕著に増加する証明を提供する。
【０１３６】
実施例５
ヒストン脱アセチル酵素を阻害するとＮａ−Ｉ共搬体の発現が増加する
遺伝子の転写が増加しても、細胞における機能的蛋白質レベルは必ずしも増加しない。ｍＲＮＡおよび蛋白質安定性のような無数の他の要因が蛋白質濃度に影響を及ぼす。本実施例は、（１）機能的Ｎａ^＋／Ｉ⁻共搬体が甲状腺癌細胞において発現されること、および（２）Ｎａ^＋／Ｉ⁻共搬体の発現がＨＤＩ処置によって増加しうることを証明する。
【０１３７】
これらの実験は、甲状腺癌細胞が低レベルの機能的Ｎａ^＋／Ｉ⁻共搬体を含むが、これらの低レベルはＨＤＩ処置によって顕著に増加しうることを明らかにした。
【０１３８】
方法および材料
Ｎａ^＋／Ｉ⁻共搬体の機能を評価するために、ヨウ素蓄積実験を行った。ＦＴＣ １３３、ＦＴＣ ２３６、ＳＷ−１７３６、およびＫＡＴ−４細胞に１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８を２日間もしくは３日間処置したか、または未処置のままとした。次に細胞を、約２ μＣｉの担体不含Ｎａ^１２５Ｉ（デュポン（Ｄｕ Ｐｏｎｔ）ＮＥＮ社、ボストン、マサチューセッツ州）および３０μＭ Ｎａ^１２５Ｉを含むハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ；ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）、エッゲンスタイン、ドイツ）０．５ ｍｌ中で１０分間インキュベートした。過塩素酸研究の場合、放射標識ヨウ素を添加した直後に、ＮａＣｌＯ_４を１００×ＨＢＳＳ溶液として、最終濃度３０μＭおよび１００μＭとなるように加えた。過剰量の放射標識ヨウ素を除去した後、細胞に蓄積した^１２５Ｉの量をγ計数によって決定した。
【０１３９】
結果
ＦＲ９０１２２８処置を行わない場合、ＦＴＣ細胞におけるヨウ素の蓄積は、ＡＴＣ細胞より高かった。この結果は、ＲＴ ＰＣＲ研究において認められたＮａ^＋／Ｉ⁻共搬体の発現がより高いこと（実施例４）と一致し、同様にＡＴＣ細胞と比較してＦＴＣ細胞のより分化した状態と一致する。
【０１４０】
ヨウ素の蓄積の顕著な増加は、ＦＲ９０１２２８を添加した２日後および３日後に四つの細胞株において認められた。ヨウ素の蓄積は、過塩素酸ナトリウムによって用量依存的に阻害され、ヨウ素の蓄積がＮａ^＋／Ｉ⁻共搬体の活性の結果であったことを示している。このように、ＦＴＣおよびＡＴＣ甲状腺癌細胞の双方において、ヒストン脱アセチル酵素阻害は、Ｎａ^＋／Ｉ⁻共搬体の転写を誘導し（実施例４）、機能的なＮａ^＋／Ｉ⁻共搬体の発現を増加させた。
【０１４１】
実施例５
甲状腺癌の治療におけるヒストン脱アセチル酵素阻害
本明細書に含まれる開示は、ヒトおよび動物被験者における甲状腺癌の治療に対する新規アプローチを可能にする。ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の投与は、本明細書において甲状腺癌治療において利用される可能性がある有益な作用を有することが示されている。例えば、ＨＤＩの投与によって、甲状腺癌細胞は分化誘導して、それによって急速な増殖および転移傾向のような生物学的に攻撃的な挙動が減少する。さらに、ＨＤＩ投与は、甲状腺癌細胞における機能的Ｎａ^＋／Ｉ⁻共搬体およびＴＧのレベルを増加させる。機能的Ｎａ^＋／Ｉ⁻共搬体を発現する細胞がより多くのヨウ素を蓄積し、したがって、放射活性ヨウ素治療に対してより感受性が高くなる。ＴＧの発現の増加はまた、甲状腺癌細胞における細胞内ヨウ素の蓄積を増強する。
【０１４２】
^１３１Ｉ放射線治療と組み合わせたＨＤＩ阻害剤治療のプロトコール
甲状腺癌被験者に、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の治療的有効量を投与する。望ましければ、ＨＤＩ治療の治療的有効性は、「トレーサー」、例えば診断用量の^１３１Ｉ（例えば、ＭｃＤｏｕｇａｌｌら、Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｃｏｍｍｕｎ． １８：５０５〜５１０、１９９７）を投与後に放射性ヌクレオチドスキャンによってモニターする。他の適したトレーサーには、^１２３Ｉおよび^９９ｍＴｃ標識ペルテクニテートが含まれる。そのような放射性核種スキャンは、トレーサーの投与後のトレーサーの蓄積の増加を追跡および定量するために、ＨＤＩ阻害剤治療の前、あいだ、および後に行うことができる。ＨＤＩ阻害剤治療は、トレーサーの蓄積を約２倍、約５倍、約１０倍、または１０倍以上増加させる。
【０１４３】
一つの態様において、被験者はこれまで治療をうけていない。もう一つの態様において、被験者は、甲状腺癌のために甲状腺切除術および／または放射活性ヨウ素治療を受けていた。いくつかの場合において、被験者は、体内の一つまたはそれ以上の部位に残留および／または転移性甲状腺癌を有するまたは有することが疑われる被験者であり、方法は、残留および／または転移性甲状腺癌を治療する方法である。
【０１４４】
ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の治療的有効量による治療後またはそれと同時に、放射活性ヨウ素治療を行う。放射性ヨウ素治療は、甲状腺ホルモン補充を中止して、それによって臨床的甲状腺機能低下症を誘導することを伴ってもよい。甲状腺機能低下状態は、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の下垂体分泌を誘発して、これはＮａ^＋／Ｉ⁻共搬体活性およびＴＧ発現の増加に関してＨＤＩ治療と相加的または相乗的となり、それによって^１３１Ｉの取り込みおよび細胞内蓄積の増加を誘導する。一つの代用として、ＴＳＨはまた、Ｍｅｉｅｒら、Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ７８：１８８、１９９４に記載されるように外から投与してもよい。外因性のＴＳＨもまた、Ｎａ^＋／Ｉ⁻共搬体活性およびＴＧ発現の増加に関してＨＤＩ治療と相加的または相乗的となる。
【０１４５】
放射活性ヨウ素治療はしばしば、大量の^１３１Ｉ（例えば、５０〜５００ ｍＣｉを７０ ｋｇのヒト被験者に）として投与される。細胞内放射活性ヨウ素蓄積のＨＤＩ増強によって、放射活性ヨウ素治療の有効性が増強され、または抗腫瘍作用を失うことなく低用量を投与することができる。例えば、ＨＤＩ治療が甲状腺癌細胞におけるヨウ素蓄積を５倍増加すれば、^１３１Ｉの投与量を例えば、１〜５０ ｍＣｉを７０ ｋｇのヒト被験者に減少することが可能である。用量の大きさは体重、体表面積および／または種に関して調節してもよい。
【０１４６】
放射活性ヨウ素治療の他に、ＨＤＩ治療は他の如何なる治療とも組み合わせることができる。例えば、ＨＤＩ治療を受ける被験者に対して、ＨＤＩ治療とほぼ同時に、またはＨＤＩ治療の前もしくは後に外部放射線照射または抗癌化学療法を行ってもよい。ＨＤＩ治療は、これらの他の治療的様相と相化的または相乗的となりうる。
【０１４７】
放射活性ヨウ素の投与後、甲状腺細胞が放射線によって死滅したため、およびほとんどの被験者が同様に甲状腺切除術を受けるという事実のために、被験者は甲状腺機能低下症となる。したがって、甲状腺ホルモン補充療法を開始する、または再開する。
【０１４８】
特に、残留甲状腺癌が存在する場合には、この、または類似のプロトコールを一定間隔で繰り返してもよい（例えば、約２〜２４ヶ月ごと、または約６〜１２ヶ月ごとに）。
【０１４９】
実施例６
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＨＤＩ阻害
本実施例は、アンチセンス化合物、特にヒストン脱アセチル酵素をコードする核酸分子の機能を調節して、最終的に産生されるヒストン脱アセチル酵素の量を減少させるために用いられるオリゴヌクレオチドを用いる（参照として本明細書に組み入れられる、国際公開公報第００７１７０３Ａ２号を参照されたい）。これは、核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、好ましくはヒストン脱アセチル酵素イソ型をコードするｍＲＮＡを提供することによって行われる。
【０１５０】
オリゴヌクレオチドのようなアンチセンス化合物と、それがハイブリダイズするその相補的な核酸標的とのこの関係は一般的に「アンチセンス」であると呼ばれる。オリゴヌクレオチドを選択した核酸標的に「ターゲティング」することは、通常、その機能が調節される核酸配列を同定することによって始まる。ヒストン脱アセチル酵素ｍＲＮＡは、現在好ましい標的である。ヒストン脱アセチル酵素ｍＲＮＡには、三文字遺伝子コードを用いて蛋白質をコードする情報のみならず、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、５’キャップ領域、およびイントロン／エキソン結合リボヌクレオチドとして当業者に既知の領域を形成する関連するリボヌクレオチドが含まれる。標的に対して十分に相補的である、すなわち治療的に有効なオリゴヌクレオチドとして機能するために十分にかつ十分な特異性でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを選択する。
【０１５１】
本開示の意味において、「ハイブリダイゼーション」とは、通常、反対の核酸鎖、または核酸鎖の二つの領域に存在する相補的な塩基間の、ワトソン−クリック塩基対形成としても知られる水素結合を意味する。グアニンとシトシンは、それらのあいだの三つの水素結合を形成することが知られている相補的塩基の例である。アデニンおよびチミンは、それらのあいだに二つの水素結合を形成する相補的塩基の例である。
【０１５２】
「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」とは、安定で特異的な結合がＤＮＡまたはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドとのあいだに起こるように、十分な相補性の程度を意味するために用いられる用語である。
【０１５３】
オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能となるためにその標的核酸配列に対して１００％相補性である必要はないと理解される。オリゴヌクレオチドは、標的に対するオリゴヌクレオチドの結合が標的分子の正常な機能を妨害して、有用性を喪失し、特異的結合が望ましい条件で、すなわちインビボアッセイ法もしくは治療的治療の場合では生理的条件、またはインビトロアッセイ法の場合には、アッセイ法が行われる条件で、非標的配列に対するオリゴヌクレオチドの非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性が存在する場合に特異的にハイブリダイズ可能である。
【０１５４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、ｍＲＮＡの一つまたはそれ以上の正常な機能を妨害する。妨害されるｍＲＮＡの機能には、例えば、ＲＮＡの蛋白質翻訳部位への転位、ＲＮＡからの蛋白質の翻訳、一つまたはそれ以上のｍＲＮＡ種を生じるためのＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡが関係する可能性がある触媒活性のような全ての重要な機能が含まれる。ＲＮＡに対する一つもしくはそれ以上の特異的蛋白質の結合もまた、ＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって妨害される可能性がある。
【０１５５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドをデザインするために、ヒストン脱アセチル酵素のような所望の分子からのｍＲＮＡ配列を調べる。ＴＴＴＴＴＴＴＴのような多数の反復配列を含む配列の領域は、それらが特異性を欠損することから望ましくない。いくつかの異なる領域を選択することができる。それらの中で、以下の特徴を有するオリゴヌクレオチドを選択する：溶液中で最善のコンフォメーションを有するオリゴヌクレオチド；ハイブリダイゼーション特徴に関して最適なオリゴヌクレオチド；および二次構造を形成する可能性が低いオリゴヌクレオチド。二次構造を形成する性向を有するアンチセンス分子はあまり望ましくない。
【０１５６】
このような調節は、当技術分野で一般的な方法、例えばヒストン脱アセチル酵素ｍＲＮＡ発現のノザンブロットアッセイ法、本出願の実施例において教示される逆転写ＰＣＲ、またはヒストン脱アセチル酵素蛋白質発現のウェスタンブロットもしくはＥＬＩＳＡアッセイ法、またはヒストン脱アセチル酵素蛋白質発現の免疫沈降アッセイ法によって測定することができる。
【０１５７】
本発明において有用なアンチセンス化合物の特定の例には、改変骨格または非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書において定義するように、改変骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格に燐原子を保持するオリゴヌクレオチドおよび骨格に燐原子を有しないオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書の目的に関して、当技術分野において時に言及されているように、そのヌクレオシド間結合に燐原子を含まない改変オリゴヌクレオチドもまたオリゴヌクレオシドであると見なすことができる。
【０１５８】
改変オリゴヌクレオチド骨格には、例えば、ホスホロチオエート、カイラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびカイラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な３’−５’結合を有するボラノホスホネート、これらの２’−５’結合類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接する対が３’−５’から５’−３’に、または２’−５’から５’−２’に結合している、逆極性を有する類似体が含まれる。様々な塩、混合塩、および遊離の核酸型も同様に含まれる。
【０１５９】
上記の燐含有結合の調製物を教示する代表的な米国特許には、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，６２５，０５０号、および第５，６９７，２４８号が含まれるがこれらに限定されない。
【０１６０】
本発明の原理を応用してもよい多くの可能性がある態様を考慮して、説明した態様は本発明の例であって、本発明の範囲を制限するものと解釈してはならないと認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の請求の範囲によって定義される。したがって、われわれは、これらの請求の範囲の範囲および精神に入る全てのものをわれわれの発明であると主張する。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト被験者における甲状腺の図（図１Ａ）、および甲状腺ホルモンが産生されて貯蔵される（図１Ｂ）甲状腺濾胞の拡大図である（図１Ｂ）。図１Ｃは、図１Ｂに示す甲状腺濾胞の拡大図であり、甲状腺濾胞細胞の機能を示す。甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）は、甲状腺特異的遺伝子の発現を活性化して、図に示すプロセスの全てを活性化する。細胞は、Ｎａ^＋／Ｉ⁻共搬体（ＮＩＳ）を通してヨウ化物（Ｉ⁻）とナトリウムとを取り込む。細胞はまた、サイログロブリン（ＴＧ）を合成して、これを濾胞内腔に輸送する。内腔表面において、ヨウ化物は酸化され、ＴＧ上のチロシン残基に酵素的に結合する。ＴＧチロシン残基は、酵素的にカップリングして、甲状腺ホルモン、図の場合ではチロキシン（Ｔ４）を形成する。改変されたサイログロブリンは、エンドサイトーシスによって内腔から濾胞細胞の先端に輸送される。エンドライソゾームにおいて、ＴＧは分解されて活性なＴ４を放出する。
【図２】甲状腺癌細胞におけるサイログロブリンプロモーターエンハンサーの活性に及ぼすヒストン脱アセチル酵素阻害剤の影響を示す棒グラフである。四つの甲状腺癌細胞株に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に機能的に結合したサイログロブリンプロモーターエンハンサーエレメントを含むプラスミドをトランスフェクトさせた。次に、トランスフェクトした細胞に、処置を行わないか、またはヒストン脱アセチル酵素阻害剤ＦＲ９０１２２８（デシペプチドとしても知られる）による７２時間の処置のいずれかを行った。細胞溶解物におけるルシフェラーゼ活性を決定した。ルシフェラーゼ活性に及ぼすＦＲ９０１２２８の影響を決定し、未処置細胞（白い棒）対ＦＲ９０１２２８処置細胞におけるルシフェラーゼ活性の棒グラフとしてプロットする。
【図３】甲状腺癌の放射活性ヨウ素の取り込み能に及ぼすヒストン脱アセチル酵素阻害の影響を示す棒グラフである。図３Ａは、四つの甲状腺癌細胞株における^１２５Ｉ取り込みを示し、ＦＲ９０１２２８処置（表記のように２日間または３日間の処置）細胞における取り込みを未処置細胞における取り込みと比較する。図３Ｂは、ＦＲ９０１２２８処置甲状腺癌細胞における^１２５Ｉ取り込みに及ぼす過塩素酸ナトリウム処置の影響を示す。[0001]
Field
The present disclosure relates to the field of diagnosis and treatment of thyroid neoplasms, and in particular to the use of histone deacetylase inhibitors in the diagnosis and treatment of thyroid neoplasms.
[0002]
background
The thyroid gland is located in the neck of a mammalian subject and is divided into two lateral lobes connected by a small central canyon. The leaves are divided into pseudo leaves consisting of spherical structures called follicles by a fibrous septum, which consists of a single layer of epithelial cells (follicular cells) surrounding the lumen (see FIG. 1). The follicular lumen is filled with a colloidal material composed of 75% or more of thyroglobulin, a precursor protein molecule of thyroid hormone. Larsen et al., The Thyroid Gland, Chapter 11, Williams' Textbook of Endocrinology, J. Am. See Wilson, 1998.
[0003]
Thyroid follicle cells produce two active thyroid hormones, triiodothyronine (T3) and thyroxine (T4). Structurally, thyroid hormone is coupled to tyrosine residues that have been modified to contain 3 or 4 iodine atoms. They are formed by a multi-step process in thyroid follicular cells. Follicular cells express thyroglobulin (TG) polypeptide, take up and concentrate iodide anions, and iodinate tyrosyl residues in the TG polypeptide chain. Monoiodotyrosine (MIT; 1 iodine atom) and diiodotyrosine (DIT; 2 iodine atoms) are obtained by iodination of tyrosyl in TG. The MIT and DIT residues are then coupled in a process called a coupling reaction. T3 and T4 are released into the blood after being cleaved from TG by proteolysis.
[0004]
Thyroid hormone biosynthesis requires the thyroid gland to actively take up and concentrate iodine. To do this, the thyroid follicular cells are sodium iodide conjugated (Na), a membrane protein that simultaneously transports sodium and iodine to the thyroid follicular cells. ⁺ / I ⁻ Expresses a carrier or NIS). NIS concentrates iodine about 100 times more than the levels found in plasma in follicular cells. TG assists the concentration process by acting as a reservoir or reservoir of structured iodine in the cell.
[0005]
The hypothalamus-pituitary-thyroid feedback loop regulates thyroid hormone production and secretion. The hypothalamus produces thyroid releasing hormone (TRH) to stimulate the synthesis and release of pituitary thyroid stimulating hormone (TSH). TSH stimulates thyroid hormone production and release into the blood. Conversely, thyroid hormone provides negative feedback control by reducing TRH and TSH release.
[0006]
TSH stimulates follicular cell proliferation and regulates gene expression in follicular cells. TSH upregulates expression of thyroid specific genes including thyroglobulin, NIS, and thyroid peroxidase (TPO). Dai et al., Nature 379: 458-461, 1996; Suzuki et al., Proceedings the National Academy Of Sciences USA 95: 8251-8256, 1998; Ulanich et al. Biol. Chem. 274: 25099-25107, 1999; De La Vieja et al., Physiological Reviews 80: 1083-1105, 2000. Enhancement of thyroid-specific gene expression by TSH is one way that TSH stimulates increased production of thyroid hormone.
[0007]
Current therapeutic approaches for thyroid cancer
Thyroid cancer is the most common endocrine malignancy and is responsible for many deaths from endocrine cancer. In the United States alone, about 17,200 new cases of thyroid cancer are diagnosed each year, and about 1500 deaths are caused by this disease.
[0008]
Currently, normal thyroid cancer therapy includes surgical resection to remove the primary tumor (thyroidectomy). This is generally followed by radioactive iodine ( ¹³¹ I) Treatment is performed, which utilizes the iodine enrichment ability of thyroid cells. These measures are followed by continuous treatment with oral thyroid hormone replacement to suppress any remaining thyroid by reducing pituitary production of TSH. Other measures such as external radiation and chemotherapy may be added to the usual treatment as an adjunct. Schlumberger et al., New England Journal of Medicine 338: 297-3006, 1998; Macdonald et al., Endocrine System, Clinical Oncology Chapter 56, M.C. See Abeloff et al., Ed., 2nd edition, 2000.
[0009]
The role of histological subtypes in the prognosis of thyroid cancer
The prognosis of thyroid cancer is related to histological subtypes, degree of differentiation, invasiveness, presence of distant metastases, and other factors. Generally more fully differentiated thyroid cancer is associated with slower growth, less tissue infiltration, fewer distant metastases, and better prognosis. Less differentiated tumors are invasive, aggressively metastatic, and associated with poor prognosis.
[0010]
In general, it is believed that there are two types of thyroid cancer that are relatively well differentiated. Papillary thyroid cancer (PTC) is an unencapsulated tumor that exhibits papillary and follicular structures and has distinct nuclear characteristics (overlapping cell nuclei with round glassy appearance and longitudinal grooves). Follicular thyroid cancer (FTC) is an encapsulated tumor in which the follicle is differentiated but lacks the nuclear features of PTC. Various histological subtypes have been described for each and are discussed in Schlumberger et al., New England Journal of Medicine 338: 297-306, 1998.
[0011]
Two histological types are similarly described for poorly differentiated or undifferentiated thyroid cancer. Insular cancer is generally considered to be a form of FTC with a low degree of differentiation. It is characterized by a small cell oval nest (island) with round nuclei and poor cytoplasm. Proliferation is invasive and vascular invasion is common. The disease is aggressive and often fatal. Undifferentiated thyroid cancer (ATC) accounts for 5-10% of thyroid cancer and is composed of undifferentiated atypical spindle-shaped multinucleated giant cells. It is very malignant and rapidly invades adjacent structures and metastasizes throughout the body.
[0012]
The problem of resistance to treatment
Depending on the histology subtype and extent of the disease, thyroid cancer is often treated with thyroidectomy. ¹³¹ Can be cured with I treatment. However, many histological subtypes of thyroid cancer are essentially ¹³¹ Resistant to I treatment. This is especially true for undifferentiated and islet thyroid cancer, but is also observed in PTC and FTC. further, ¹³¹ Resistance to I can also occur in thyroid cancers that are relatively well differentiated from the start and are relatively sensitive to radioactive iodine.
[0013]
Although usual means are often effective, up to 15% of thyroid cancer subjects eventually die from the disease. Thus, new therapeutic approaches for thyroid cancer are needed.
[0014]
Summary of disclosure
Disclosed are methods for enhancing iodide, iodine, or iodine compound uptake in the thyroid by administering an effective amount of a histone deacetylase inhibitor. In some examples, iodine or iodide is a radioactive compound that can be administered to treat thyroid tumors. A novel approach to the treatment of thyroid tumors is disclosed herein. In particular, the use of histone deacetylase inhibitors to treat thyroid neoplasia is disclosed. In another example, a histone deacetylase inhibitor is used to enhance iodide uptake for radiation prevention after radiation exposure. In one embodiment, a method for enhancing thyroid specific gene expression is provided.
[0015]
A method for detecting a thyroid neoplasm in a subject is disclosed. The method includes administering an effective amount of a histone deacetylase inhibitor and administering a detectable substance whose uptake or enrichment in thyroid cells is increased by administration of the histone deacetylase inhibitor. Next, the presence of a detectable substance in the thyroid gland is detected.
[0016]
Detailed description
As disclosed herein, histone deacetylase inhibitors affect gene expression in thyroid cancer cells. The action of histone deacetylase inhibitors can be used as a novel approach to the diagnosis and treatment of thyroid cancer.
[0017]
Abbreviations used
DIT Diiodotyrosine
MIT Monoiodotyrosine
NIS Na ⁺ / I ⁻ Co-transporter
T3 triiodothyronine, thyroid hormone
T4 thyroxine, thyroid hormone
TG Thyroglobulin
TPO thyroid peroxidase
[0018]
Explanation of terms used
Antisense, Sense, and Antigene:
Double-stranded DNA (dsDNA) has two strands, a 5 ′-> 3 ′ strand called a plus strand and a 3 ′-> 5 ′ strand (reverse complementary strand) called a minus strand. Since RNA polymerase adds nucleic acids in the 5 '->3' direction, the minus strand of DNA acts as an RNA template during transcription. Thus, the formed RNA has a sequence that is complementary to the minus strand and identical to the plus strand (except that U is replaced by T).
[0019]
An antisense molecule is a molecule that is particularly hybridizable to, or in particular complementary to, either RNA or the plus strand of DNA. A sense molecule is a molecule that is particularly hybridizable or particularly complementary to the minus strand of DNA. Antigene molecules are either antisense or sense molecules that are directed to dsDNA targets.
[0020]
cancer:
A malignant neoplasm that can metastasize in response to the characteristic degeneration of loss of differentiation, increased proliferation rate, and infiltration of surrounding tissues. Thyroid cancer is a malignant neoplasm that arises in or from thyroid tissue. Residual thyroid cancer is thyroid cancer that remains in a subject after any form of treatment performed on the subject to reduce or eliminate thyroid cancer. Metastatic thyroid cancer is thyroid cancer that is present in one or more sites in the body other than the site of origin of the original (primary) thyroid cancer from which the metastatic thyroid cancer originates.
[0021]
Chemotherapy, chemotherapeutic agents:
As used herein, any chemical having therapeutic utility in the treatment of diseases characterized by abnormal cell proliferation. Such diseases include diseases characterized by hyperplastic growth, such as psoriasis, along with tumors, neoplasms, and cancer. In one embodiment, the chemotherapeutic agent is a substance used to treat thyroid neoplasia. In one embodiment, the chemotherapeutic agent is radioactive iodine. One skilled in the art can readily identify the chemotherapeutic agents used (eg, Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapies, Chapter 86, Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th Edition; Chapter 17, Abeloff, Clinical Oceanology, 2nd edition, Copyright 2000, Churchill Livingstone Inc .; Baltzer L., Berker R. Ed .: Oncology Pocket Guide to Chemistry, 2nd edition. Book, 1995; Fischer DS, Knobf MF, D rivage HJ (eds.): The Cancer Chemotherapy Handbook, Fourth Edition, St. Louis, Moss Bee yearbook, see 1993).
[0022]
Effective amount of compound:
An amount of compound sufficient to obtain the desired effect in the subject to be treated. For example, a therapeutically effective amount of a compound is a detectable amount administered to detect one or more histone deacetylase isoforms in a subject's cells or to detect a neoplasm in a subject. Is the amount of material.
[0023]
A therapeutically effective amount of the compound may be administered in a single dose or in several doses, for example, daily during treatment. However, the therapeutically effective amount of the compound will depend on the compound applied, the subject being treated, the severity and type of morbidity, and the mode of administration of the compound.
[0024]
The term “administered to a subject” includes any route of administration to all animals (eg, humans, monkeys, dogs, cats, horses, and cows) that have or may develop thyroid neoplasia. It is understood.
[0025]
Enteral administration:
Related to the digestive tract. When a drug and / or therapeutic substance is administered, enteral means administration through the digestive tract, for example, administration by mouth, rectum, nasogastric tube, gastrostomy, and the like.
[0026]
Polypeptide fragments and variants:
The term includes fragments and variants that maintain one or more biological functions of the parent polypeptide. It will be appreciated that a gene or cDNA encoding a polypeptide may be significantly mutated without materially altering the biological function of one or more polypeptides. It is well known that the genetic code is degenerate and thus different codons encode the same amino acid. Even when amino acid substitutions are introduced, mutations are conservative and may not materially affect the essential function of the protein (Stryer, Biochemistry, 3rd edition, copyright, 1988). . Furthermore, a portion of the polypeptide chain can be deleted without impairing or loss of function, and / or inserted or added to the polypeptide chain (eg, with an epitope tag) without impairing or loss of function. (See Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1998).
[0027]
Other modifications that can be made without materially affecting one or more functions of the polypeptide include, for example, in vivo or in vitro chemical and biochemical modifications or modifications that incorporate rare amino acids. It is. Such modifications include, for example, acetylation, carboxylation, phosphorylation, glycosylation, ubiquitination, labels such as radionuclide labeling, and various enzymatic modifications. A variety of methods for labeling polypeptides, and a variety of substituents or labels useful for such purposes, are well known in the art and include: ³² Radioactive isotopes such as P, ligands that bind to labeled antiligands (eg, antibodies), fluorophores, chemiluminescent materials, enzymes, and antiligands are included.
[0028]
Functional fragments and variants may be of various lengths. For example, some fragments have at least about 5, 10, 25, 50, 75, 100, 200, 500, 750, or 900 amino acid residues. Such fragments may also have immunogenic activity and may be used to produce specific binding substances such as antibodies.
[0029]
Nucleic acid sequences encoding polypeptides, or fragments of polypeptides, can be engineered so that they can express proteins in eukaryotic cells, bacteria, insects, and / or plants. To effect this expression, the relevant regulatory sequences are operably linked to the nucleic acid sequence. Regulatory sequences operably linked to the nucleic acid sequence encoding the polypeptide can be included in the vector. This vector can then be introduced into a host cell. Host cells include, but are not limited to, eukaryotic cells, bacterial cells, insect cells, and plant cells.
[0030]
One skilled in the art will recognize that the nucleic acid encoding the polypeptide can be altered in various ways without affecting the biological activity of the encoded protein. For example, PCR may be used to obtain nucleic acid sequence changes. Such variants may be variants optimized for codon selectivity in the host cell used to express the protein, or other sequence changes that facilitate expression.
[0031]
Two types of cDNA sequence variants may be made. As noted above, variants of the cDNA sequence do not appear as changes in the amino acid sequence of the encoded polypeptide. These silent variants are merely a reflection of the degeneracy of the genetic code. In the second type, changes in the cDNA sequence result in changes in the amino acid sequence of the encoded protein. In such cases, the variant cDNA sequence produces a variant polypeptide sequence. It is preferred that any such amino acid substitutions be conservative in order to preserve the functional and immunological identity of the encoded polypeptide. A conservative substitution replaces one amino acid with another amino acid that is similar in size, hydrophobicity, and the like. Examples of conservative substitutions are shown in Table 1 below.
[0032]
[Table 1]

[0033]
The changes in the cDNA sequence in which amino acid changes occur are ideally minimal in order to preserve the functional and immunological identity of the encoded protein, whether conservative or not. Any cDNA sequence variant will preferably introduce as few as 20, preferably less than 10 or 5 amino acid substitutions into the encoded polypeptide. The variant amino acid sequence may be, for example, 80%, 90%, or 95% identical to the original amino acid sequence.
[0034]
In one embodiment, the polypeptide variant is a “dominant negative fragment or variant”, such as a histone deacetylase dominant negative fragment or variant. A histone deacetylase fragment or variant dominant negative variant can bind to one or more histone deacetylase substrates but lacks the ability to deacetylate one or more histone deacetylase substrates Or a histone deacetylase polypeptide with impaired deacetylation capacity. For example, a histone deacetylase fragment or variant is one in which the variant retains binding affinity for one or more histones partially or substantially, but the ability to deacetylate one or more histones. Can be constructed using recombinant DNA technology such that is deficient or damaged. As a result, the dominant negative histone deacetylase fragment or variant acts as a competitive inhibitor of histone deacetylase activity in the cell. In one embodiment, the dominant negative histone deacetylase fragment or variant is a fusion polypeptide.
[0035]
Fusion protein or polypeptide:
A protein or polypeptide encoded by a recombinant nucleic acid comprising two or more amino acid sequences that are not found to bind to each other in nature. A fusion protein or polypeptide can include functional fragments or variants of the protein or polypeptide. In one embodiment, one of the amino acid sequences is an epitope tag. In one particular non-limiting example, the fusion protein is a dominant of histone deacetylase fused to an epitope tag, such as a green fluorescent protein, FLAG, His tag, or any number of epitope tags known in the art. Negative fragment. Simple cloning vectors (eg, vectors produced by Clontech and Promega) are readily available for manipulating such fusion proteins and express the fusion protein in host cells. Can be used for Without being bound by theory, the epitope tag has little effect on the biological function of other polypeptides contained in the fusion protein, such as protein-protein interactions. However, epitope tags are useful for intracellular localization of the fusion protein, for purifying the fusion protein, for purifying the binding partner of the fusion protein, or for immunological detection.
[0036]
Histone:
A protein that is part of the core protein of a nucleosome. Histone acetylation and deacetylation has some role in the regulation of gene expression by affecting the structure of nucleosomes and chromatin. Histone proteins include, but are not limited to, H2A, H2B, H3 and H4. Histones can be of two types: acetylated and deacetylated. Histone acetyltransferase causes histone acetylation, whereas histone deacetylase reverses this process. Histone deacetylation involves the removal of the acetyl group from the ε-amino group of the histone lysine side chain by hydrolysis.
[0037]
Histone deacetylase:
Also called protein deacetylase, catalyzes the removal of the acetyl group from the epsilon-amino group of the lysine side chain in histones or other proteins (eg, histone H2A, H2B, H3, or H4), thereby lysine side A class of enzymes that reconstruct positive charges on the strand (Ng and Bird, Rends in Biol. Sci. 25: 121-136, 2000, incorporated herein by reference). Similarly, Emiliani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2795- 2800, 1998; Fischle et al., J. Biol. Biol. Chem. 274: 11713-11720, 1990; Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 12845-12850, 1996; see Taunton et al., Science 272, 408-411, 1996. Several histone deacetylases have been identified, including but not limited to HDAC1, HDAC2, and RPD3. Specific non-limiting examples of histone deacetylases include, but are not limited to, GenBank accession numbers NM058277, NM15401, AF407273, XM004379, and AF426160, AF006603, AF006602, and AF074882. See also US Pat. No. 6,287,843. When histone deacetylase is inhibited, the activity of the opposite enzyme, histone acetyltransferase, is present in a relatively excessive amount, resulting in hyperacetylation of histones or other proteins. Without being bound by theory, inhibition of histone deacetylase causes neutralization of histone lysine tails, destroying histone structures, and denaturing DNA. When histones are in a denatured state, transcription factors can approach DNA.
[0038]
Histone deacetylase inhibitors:
A substance that inhibits the function of one or more histone deacetylases, eg, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 80%, 95%, or more. Such substances may be in the form of drugs or drugs, therapeutically effective oligonucleotides, specific binding substances, or fragments or variants of histone deacetylase. Several structural classes of histone deacetylase inhibitors have been identified. These include (1) short chain fatty acids (eg, butyrate), (2) hydroxamic acids (eg, suberic acid bishydroxamic acid, suberylanilide hydroxamic acid, proxamide, m-carboxycinnamic acid bishydroxamic acid), ( 3) cyclic tetrapeptides containing a 2-amino-8-oxo-9,10-epoxy-decanoyl moiety, and (4) benzamide. Specific non-limiting examples of histone deacetylase inhibitors include FR901228 (decipeptide), scriptaid, N-acetyldinarin (CI-994), scriptaid, suberoylanilide hydroxamic acid, trichostatin A, trapoxin A, trapoxin B, HC-toxin, clamicin, Cly-2, WF-3161, Tan-1746, apicidin, apicidin analog, benzamide, benzamide derivative, hydroxamic acid derivative, azelaic acid bishydroxamic acid, butyric acid and its salt, acetic acid Salt, suberoylanilide hydroxamic acid, bishydroxamic acid suberic acid, bishydroxamic acid m-carboxy-cinnamate, oxamflatin, depudecin, or MS-275 (Marks et al., Curr. Opinion in On ol 13:. 477,2001, the entirety of which is incorporated herein by reference) it includes. Alternatively, the substance may be a therapeutically effective oligonucleotide that inhibits the expression or function of histone deacetylases such as antisense molecules or ribozymes. Alternatively, the histone deacetylase inhibitor can be a dominant negative fragment or variant of histone deacetylase.
[0039]
Injectable composition:
A pharmaceutically acceptable liquid composition comprising at least one active ingredient, such as a bispecific fusion protein. The active ingredient is usually dissolved or suspended in a physiologically acceptable carrier and the composition further comprises a small amount of one or more non-toxic auxiliary substances such as emulsifiers, preservatives, pH buffers and the like. Can be included. Such injectable compositions useful for use with the fusion proteins of the present invention are conventional; suitable formulations are well known in the art.
[0040]
Neoplasm:
Abnormal cell growth including other proliferative disorders along with benign and malignant tumors.
[0041]
Open reading frame:
A series of nucleotide triplets (codons) encoding amino acids that do not contain any internal stop codons. These sequences are usually translatable into peptides.
[0042]
Combine functionally:
A first nucleic acid sequence is operably linked to a second nucleic acid sequence when the first nucleic acid sequence is in a functional relationship with the second nucleic acid sequence. For example, a promoter is operably linked to a coding sequence if the promoter affects the transcription or expression of the coding sequence. In general, functionally linked DNA sequences are contiguous and exist in the same reading frame when two protein coding regions need to be linked.
[0043]
Na ⁺ / I ⁻ Carrier (sodium / iodine carrier, NIS):
A membrane protein that mediates active transport of iodide anions to the thyroid. See, for example, De la Vieja et al., Physical Reviews 80: 1083-1105, 2000; Dai et al., Nature 379: 458-460, 1966. In this specification, it is also referred to as a sodium-iodide carrier.
[0044]
Parenteral:
Administration to parts other than the intestine, for example, administration not via the digestive tract. In general, parenteral formulations are those that are administered by any possible manner except ingestion. This term refers specifically to various surface applications including intravenous, intrathecal, intramuscular, intraperitoneal, or subcutaneous injection, and for example, intranasal, intradermal, and topical administration.
[0045]
Drug or drug:
A chemical compound or composition capable of inducing a desired therapeutic or prophylactic effect when a particular dose is administered to a subject.
[0046]
Pharmaceutically acceptable carriers:
The pharmaceutically acceptable carriers useful in the present invention are conventional. Remington's Pharmaceutical Sciences, E.M. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975) describes compositions and formulations suitable for pharmaceutical delivery of the fusion proteins disclosed herein.
[0047]
In general, the characteristics of the carrier will depend on the particular mode of administration being employed. For example, parenteral formulations usually include injectable fluids that include pharmaceutically and physiologically acceptable fluids such as water, physiological saline, buffered saline solutions, aqueous dextrose, glycerol or the like as a vehicle. In the case of solid compositions (eg, powders, pills, tablets, or capsules), conventional non-toxic solid carriers can include, for example, pharmaceutical grade mannitol, lactose, starch, or magnesium stearate. In addition to biologically neutral carriers, the pharmaceutical compositions administered are non-toxic aids such as wetting or emulsifying agents, preservatives, pH buffering agents such as sodium acetate or sorbitan monolaurate. May contain small amounts of material.
[0048]
promoter:
A promoter is an array of nucleic acid control sequences that direct transcription of a nucleic acid. A promoter includes necessary nucleic acid sequences near the start site of transcription, such as the TATA element in the case of a polymerase type II promoter. A promoter also optionally includes enhancer or repressor elements that can be located as much as several thousand base pairs from the start site of transcription.
[0049]
Purified:
The term “purified” does not require absolute purity, but is rather interpreted as a relative term. Thus, for example, a purified protein preparation is a preparation in which the protein referred to is more pure than the protein in its natural environment within the cell.
[0050]
Recombinant:
A recombinant nucleic acid is a nucleic acid having a sequence that is generated by an artificial combination of two segments having sequences that do not occur in nature or that are otherwise separated. This artificial combination can be done by chemical synthesis or, more generally, by artificial manipulation of isolated nucleic acid segments, eg, genetic engineering techniques.
[0051]
Specific binding substances:
A substance that specifically binds only to a given target. Thus, the histone deacetylase specific binding substance binds substantially only to the histone deacetylase isoform. As used herein, the term “histone deacetylase-specific binding agent” includes histone deacetylase protein antibodies and other substances that bind substantially exclusively to histone deacetylase.
[0052]
Anti-histone deacetylase protein antibodies may be produced using standard techniques described in a number of texts, including Harlow and Lane (Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988). The determination of whether a particular substance binds substantially only to histone deacetylase would be easily made using common techniques or modified to suit them. One suitable in vitro assay utilizes Western blotting (a number of texts including Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988; Ausubel et al., Molecular Biology, CSHL, New York, 1998). As described in).
[0053]
Shorter antibody fragments can also act as specific binding agents. For example, Fabs, Fvs, and single chain Fvs (SCFvs) that bind to histone deacetylase are considered to be histone deacetylase specific binding agents. These antibody fragments are defined as follows: (1) Fab, an antibody molecule produced by digesting the whole antibody with the enzyme papain to produce an intact light chain and part of one heavy chain (2) Fab ′, a fragment of an antibody molecule obtained by reducing the whole antibody after treatment with pepsin to yield an intact light chain and part of the heavy chain Two Fab ′ fragments are obtained per antibody molecule; (3) (Fab ′) 2, antibody fragments obtained without reduction after treating the whole antibody with the enzyme pepsin; (4) F (ab ′) 2, a dimer of two Fab ′ fragments joined together by two disulfide bonds; (5) Fv, a genetically engineered fragment comprising a light chain variable region and a heavy chain variable region expressed as two chains; And (6) single chain antibody ("SCA") , Genetically engineered molecule containing the light chain variable region and a heavy chain variable region linked by a polypeptide linker which is suitable as a single-chain molecule gene fusion.
[0054]
Therapeutically effective amount:
A dose sufficient to prevent disease progression or cause remission, or to reduce symptoms caused by the disease, such as fever, pain, loss of appetite, or cachexia associated with malignancy.
[0055]
Therapeutically effective oligonucleotides and oligonucleotide analogs:
Therapeutically effective oligonucleotides and oligonucleotide analogs are characterized, for example, by their ability to inhibit protein function by inhibiting protein expression. Inhibition can be any decrease in target protein activity or expression observed when compared to target protein activity or expression in the absence of oligonucleotide or oligonucleotide analog. In addition, some oligonucleotides may be able to inhibit the activity or expression of the target protein by at least 15%, 30%, 40%, 50%, 60%, or 70% or more.
[0056]
Some therapeutically effective oligonucleotides and oligonucleotide analogs are further characterized by being sufficiently complementary to the nucleic acid sequence encoding the target protein. As described herein, sufficient complementarity is that therapeutically effective oligonucleotides or oligonucleotide analogs can specifically disrupt the expression of the target protein, but genes of other target nucleic acid sequences. Means that expression is not significantly altered.
[0057]
For example, therapeutically effective oligonucleotides can reduce histone deacetylase activity in cells by at least 15%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% or more.
[0058]
The term “oligonucleotide” means an oligomer or polymer of ribonucleic acid or deoxyribonucleic acid. The term includes oligonucleotides with non-naturally occurring moieties that function similarly, as well as oligonucleotides that consist of naturally occurring nucleobases, sugars, and covalently linked intersugar (backbone) linkages. Such modified or substituted oligonucleotides are often preferred over the original type because of desirable properties such as enhanced cellular uptake, increased binding to the target, and increased stability in the presence of nucleases.
[0059]
Thyroglobulin:
A large (about 2750 amino acid residues) iodinated glycoprotein that is specifically expressed in thyroid tissue and is a substrate for synthesizing thyroxine and triiodothyronine, which are thyroid hormones. See Maltiery et al., Biochimie 71: 195-209, 1989; Vassart et al., Molecular and Cellular Endocrinology 30: 89-97, 1985; van de Graaf et al.
[0060]
Thyroid peroxidase (TPO):
A thyroid-specific enzyme that catalyzes the oxidation of iodide anions and the organization of iodine in follicular cells. See Ohtaki et al., Endocrine Journal 43: 1-14, 1996.
[0061]
Thyroid-specific gene expression:
A gene that is expressed at high levels in thyroid follicular cells compared to non-thyroid cell types (eg, at least 5 times higher than for non-thyroid cell types). These include, for example, thyroglobulin, Na ⁺ / I ⁻ Included are carriers, and thyroid peroxidase. The terms “thyroid specific”, “specifically expressed” and the like do not mean that these genes are not expressed in other cell types. For example, Na ⁺ / I ⁻ Co-carriers are known to be expressed in lactating mammary cells, salivary gland cells, and gastric mucosa. Specific non-limiting examples of thyroid specific genes include thyroglobulin and / or Na in thyroid cancer cells. ⁺ / I ⁻ It is a carrier. Without being bound by theory, increased expression of thyroid-specific genes promotes cell differentiation and reduces biologically aggressive behaviors such as invasion and metastasis. Furthermore, without being bound by theory, thyroglobulin and / or Na ⁺ / I ⁻ Increasing the expression of the symporter increases the ability of thyroid cancer cells to concentrate iodine, thereby making the cells more sensitive to radioactive iodine treatment.
[0062]
tumor:
A neoplasm that can be either malignant (cancerous) or non-malignant.
[0063]
Unless defined otherwise, all technical and scientific terms have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, suitable methods and materials are described below. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. In addition, the materials, methods, and examples are illustrative only and are not to be construed as limiting.
[0064]
Overview of some disclosed methods
Provided herein are methods for inhibiting the growth of thyroid cancer cells. The method includes administering a therapeutically effective amount of a histone deacetylase inhibitor. As disclosed herein, inhibition of histone deacetylase increases the transcriptional activity of the thyroid-specific thyroglobulin promoter-enhancer element and similarly activates the transcription of the thyroid-specific gene. Specific non-limiting examples of genes that exhibit increased expression include Na ⁺ / I ⁻ The two proteins are involved in the transport of iodide, the concentration of iodine, and the production of thyroid hormones in thyroid cells, including union (NIS) and thyroglobulin. Without being bound by theory, the increased expression of thyroid-specific genes induced by histone deacetylase inhibitors promotes the differentiation of thyroid cancer cells and thereby biologically such as invasion and metastasis. Aggressive behavior is expected to decrease. Furthermore, increased thyroid-specific gene expression enhances or restores the ability to concentrate iodide, thereby rendering thyroid cancer cells susceptible to treatment with radioactive iodine therapy.
[0065]
Disclosed herein is a method for enhancing expression of thyroid-specific genes in thyroid cancer cells by introducing at least one substance that inhibits histone deacetylase into the thyroid cancer cells. In one embodiment, a method is provided for enhancing expression of a gene comprising a thyroglobulin promoter-enhancer element comprising a thyroglobulin gene comprising a thyroglobulin coding sequence, or a gene comprising a thyroglobulin promoter operably linked to a heterologous nucleic acid sequence. In another embodiment, Na ⁺ / I ⁻ Na functionally linked to a symporter or heterologous nucleic acid sequence ⁺ / I ⁻ Methods are provided for enhancing expression of a gene comprising a sympathetic promoter. In a further aspect, a method is provided for enhancing the ability of thyroid cancer cells to take up or concentrate iodide or iodine. In yet another embodiment, a method is provided for enhancing the ability of thyroid cells to take up iodide such as KI or iodine.
[0066]
Substances that inhibit histone deacetylase include, for example, FR901228 (depsipeptide), trichostatin A, trapoxin A, trapoxin B, HC-toxin, clamidine, Cly-2, WF-3161, Tan-1746, apicidin, apicidin analogues Benzamide, benzamide derivatives, hydroxamic acid derivatives, azelaic acid bishydroxamic acid, butyric acid and its salts, acetate, suberoylanilide hydroxamic acid, suberic acid bishydroxamic acid, m-carboxy-cinnamic acid bishydroxamic acid, oxamflatin, depudecin, Or a therapeutically effective amount of MS-27-275. Alternatively, the agent can be a therapeutically effective amount of an oligonucleotide that inhibits the expression or function of histone deacetylase, or a dominant negative fragment or variant of histone deacetylase. Substances that inhibit histone deacetylase are also described in International Publication No. WO0071703A2, International Publication No. WO0167575A2 and International Publication No. WO08048A2.
[0067]
The thyroid cancer cell can be a thyroid cancer cell in a subject, and the method comprises radioactive iodine, eg, ¹³¹ It can be a method of treating thyroid cancer by administering a therapeutically effective amount of I to a subject. ¹³¹ A therapeutically effective amount of I can be, for example, from about 1 mCi to about 500 mCi, or from about 30 mCi to about 300 mCi. In certain embodiments, thyroid cancer cells in a subject can be derived from any histological variant of papillary thyroid cancer, follicular thyroid cancer, island thyroid cancer, undifferentiated thyroid cancer, or thyroid cancer.
[0068]
In other specific examples, treatment with radioactive iodine can involve thyroidectomy, external radiation, or administration of a therapeutically effective amount of an anti-cancer chemotherapeutic agent to a subject. In still other specific embodiments, the radioactive iodine is administered to the subject multiple times, eg, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or more times. Can be administered. These times may be over a period of time, for example, greater than about 12 hours, greater than about 24 hours, greater than about 48 hours, greater than about 72 hours, greater than about 1 week, greater than about 2 weeks, greater than about 4 weeks. Greater than, greater than about 8 weeks, greater than about 12 weeks, greater than about 6 months, greater than about 1 year, or greater than about 2 years. In any one or more of these times, administration of the histone deacetylase inhibitor and / or radioactive iodine can be accompanied by administration of a therapeutically effective amount of thyroid stimulating hormone.
[0069]
Similarly, administering to a subject a therapeutically effective amount of a histone deacetylase inhibitor; administering to the subject a detectable substance whose concentration in thyroid cancer is increased by administration of a histone deacetylase inhibitor; and A method of detecting a thyroid neoplasm in a subject by detecting a detectable substance is disclosed. The method includes detecting a thyroid neoplasm by detecting a substance whose concentration in thyroid neoplastic cells increases upon administration of a histone deacetylase inhibitor. The substance is Na ⁺ / I ⁻ It can be a substance transported to thyroid cells by the carrier. The substance is, for example, a radioactive iodide molecule, such as ¹²³ I, ¹²⁵ I or ¹³¹ I; or radiolabeled perchlorate or pertechnate.
[0070]
In certain embodiments, the method can be a method of detecting papillae, follicles, islets, or undifferentiated thyroid cancer. In other specific embodiments, the method can be a method of detecting residual thyroid cancer in a subject who has received one or more treatments to treat thyroid cancer. For example, methods include thyroidectomy, ¹³¹ I may be a method of detecting residual thyroid cancer in a subject who has received external radiation or who has received anti-cancer chemotherapy.
[0071]
In yet other embodiments, the iodide or iodine compound is administered prophylactically after radiation exposure (eg, after a nuclear facility accident or exposure to a nuclear weapon) to enhance the effectiveness of radiation prevention against the development of thyroid cancer. To do.
[0072]
Examples of histone deacetylase inhibitors
Marks et al., Journal of the National Cancer Institute 92: 1210-1216, 2000, incorporated herein by reference, provides an overview of the types and classes of histone deacetylase inhibitors. All of the histone deacetylase inhibitors described in Marks et al. Are useful in the disclosed methods. See, for example, the HDIs described in Marks et al. FIGS. 3 and 4 (pages 1212-1213).
[0073]
Cyclic tetrapeptides such as those described in WO 00/08048 and WO 00/21979, and US Pat. No. 5,922,837 can be used in the present invention. Also suitable are FR901228 and related compounds disclosed in US Pat. No. 4,977,138. Other useful HDIs include sodium butyrate, trichostatin A, trapoxin A, trapoxin B, HC-toxin, clamidine, Cly-2, WF-3161, Tan-1746, and apicidin and its analogs.
[0074]
HC-toxins are described in Liesch et al. (1982) Tetrahedron 38, 45-48; trapoxin A and trapoxin B are described in Itazuki et al. (1990) J. MoI. Antibiot. 43, 1524-1532 and European Patent No. 0406725; WF-3161 is described in Umehana et al. Antibiot. 36, 478-483; Cly-2 is described in Hirota et al. (1973) Agri. Biol. Chem. 37, 955-56; clamidosine is described in Closse et al. (1974) Helv. Chim. Acta 57, 533-545 and Tan 1746 are described in Japanese Patent No. 7196686 to Takeda. Benzamides and derivatives are described in Suzuki et al., Journal of Medical Chemistry 42: 3001-3003, 1999, and Japanese Patent No. 11335375.
[0075]
Hydroxamic acid derivatives are useful in the methods of the present disclosure. Examples include azelaic acid bishydroxamic acid described in Qiu et al., Molecular Biology of the Cell 11: 2069-2083, 2000; and Richon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 10013-10019, 2000, including suberoylanilide hydroxamic acid.
[0076]
Thus, specific non-limiting examples of histone deacetylase inhibitors include FR901228 (depsipeptide), trichostatin A, trapoxin A, trapoxin B, HC-toxin, clamidecin, Cly-2, WF-3161, Tan-1746, apicidin, apicidin analog, benzamide, benzamide derivative, hydroxamic acid derivative, azelaic acid bishydroxamic acid, butyric acid and its salts, acetate, suberoylanilide hydroxamic acid, suberic acid bishydroxamic acid, m-carboxy-cinnamon Acid bishydroxamic acid, including but not limited to oxamflatin, depudecin, or MS-27-275.
[0077]
A specific binding agent can also be an antibody and / or antibody fragment that specifically binds to a histone deacetylase inhibitor, such as histone deacetylase, and inhibits its function.
[0078]
Therapeutically effective oligonucleotides can also be used as histone deacetylase inhibitors. In one particular non-limiting example, the oligonucleotide is an antisense oligonucleotide that inhibits the expression of histone deacetylase. The use of therapeutically effective oligonucleotides is further illustrated in Example 6.
[0079]
Histone deacetylase fragments and variants may also be used as histone deacetylase inhibitors. In one particular non-limiting example, the histone deacetylase inhibitor is a dominant negative variant of histone deacetylase. Human histone deacetylase A is known to have a catalytically active domain from about amino acid residue 490 to the C-terminal amino acid residue 967 (Fischle et al., J. Biol. Chem. 274: 11713-11720). 1999). Furthermore, the region from about residue 495 to about residue 550 has been found to be essential for histone deacetylase catalytic activity. Thus, the human histone deacetylase A fragment containing residues 540 to C-terminal residue 967 retains the ability to bind histone substrates, but appears to lack substrate deacetylation. Thus, this fragment is a dominant negative fragment of histone deacetylase and can be used as a histone deacetylase inhibitor. Further dominant negative histone deacetylase fragments are readily designed by sequence homology search and using standard DNA recombination techniques as described in Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1998. Built.
[0080]
The dominant negative histone deacetylase fragment or variant inhibits histone deacetylase in thyroid cells. Such fragments may be transported to thyroid neoplastic cells in a variety of ways. For example, a nucleic acid encoding a dominant negative histone deacetylase fragment may be transferred to an appropriate eukaryotic gene transfer vector and transported to tumor cells.
[0081]
Viral vectors such as retroviral vectors are useful for eukaryotic gene transfer, have high infection efficiency, and are stably integrated and expressed (Orkin et al., Prog. Med. Genet. 7: 130-142, 1988). . Nucleic acid encoding a dominant negative histone deacetylase fragment or variant can be cloned into a retroviral vector and either its endogenous promoter, heterologous promoter (constitutive or inducible), or retroviral LTR (long terminal repeat) Driven by something. Adenovirus, adeno-associated virus (AAV) (McLaughlin et al., J. Virol. 62: 1963-1973, 1988), vaccinia virus (Moss et al., Annu. Rev. Immunol. 5: 305-324, 1987), bovine papilloma Viruses (Rasmussen et al., Methods Enzymol. 139: 642-654, 1987), herpes virus members such as Epstein-Barr virus (Margorskee et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2837-2847, 1988), or lentivirus and Other viral transfection systems including related vectors (US Pat. No. 6,013,516) may be utilized for this type of approach as well.
[0082]
Very large nucleic acid inserts can be incorporated into viral systems. Kochanek et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5731-5739, 1996 demonstrated efficient packaging in an adenoviral system of a 28.2 kb expression cassette for use in gene transfer therapy. Similarly, Parks and Graham in adenovirus studies have demonstrated the packaging of vectors ranging in size from 15.1 to 33.6 kb (Parks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13565-13570, 1996; Parks and Graham, J. Virol. 71: 3293-3298, 1997).
[0083]
In one embodiment, adenovirus-mediated gene transport is used to direct the expression of nucleic acid in thyroid cells. Bragosklonny et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 83 (7): 2516-22, 1998 is very effective for adenovirus-mediated gene transfer to restore functional p53 status against undifferentiated thyroid cancer cells Showed that. Zeiger et al., Surgery 120: 921-925, 1996 demonstrated the effectiveness of adenovirus-mediated thymidine kinase gene transfer in promoting tumor cell damage by ganciclovir administration.
[0084]
Recent advances in eukaryotic gene transfer techniques include the use of RNA-DNA hybrid oligonucleotides as described by Cole-Strauss et al. (Science 273: 1386-1389, 1996). This technique would allow site-specific integration of the cloned sequence, thereby allowing precise targeting of genetic modifications.
[0085]
It is possible to use transport methods that do not depend on infection. For example, to transfect various genes (for review, see Templeton and Lasic, Mol. Biotechnol. 11: 175-180, 1999; Lee and Huang, Crit. Rev. Ther. Drug Syst. 14: 173. -206; and Cooper, Semin. Oncol. 23: 172-187, 1996), and lipid and liposome-mediated gene transport can be used to transport peptides. For example, whether cationic liposomes can be transfected into monocyte leukemia cells has been analyzed and shown to be a viable alternative to using viral vectors (de Lima et al., Mol. Membr Biol.16: 103-109, 1999). Such cationic liposomes can also be targeted to specific cells, for example by including monoclonal antibodies or other suitable targeting ligands (Kao et al., Cancer Gene Ther. 3: 250-256, 1996). Sikes et al., Human Gene Therapy 5: 837-844, 1994, successfully used direct intrastromal injection of plasmid DNA into the thyroid to transform thyroid follicular cells.
[0086]
Thus, various techniques are available for introducing dominant negative histone deacetylase fragments and variants into thyroid neoplastic cells.
[0087]
Examples of therapeutic use of histone deacetylase inhibitors
When treating thyroid neoplasms in humans or animals, a histone deacetylase inhibitor (HDI) is administered after the disease has been diagnosed. Treatment may be intermittent or continuous. Examples of intermittent treatment, as described in Example 5 and the references described therein, ¹³¹ A short period of administration of a therapeutically effective amount of HDI prior to administration of I. For example, a therapeutically effective amount of HDI is ¹³¹ It may be possible to administer about 12 hours, about 24 hours, about 48 hours, about 72 hours, about 5 days, about 1 week, about 2 weeks, or about 4 weeks before administering I. Daily doses will range from about 0.01 μg / kg to about 500 mg / kg. Treatment can be enteral or parenteral once or more daily until a therapeutically effective amount of HDI is administered, or until maximum therapeutic HDI inhibition is obtained. Alternatively, the daily dose can be administered almost continuously, for example by intravenous infusion.
[0088]
HDI may be administered to promote the differentiation of thyroid cancer cells, thereby reducing the tendency for biologically aggressive behavior such as tissue invasion and metastasis. Treatment may be intermittent or continuous as described above. An example of continuous treatment to promote differentiation of thyroid cancer cells is from about 0.01 μg / kg to about 500 until a favorable therapeutic response is observed or until all thyroid cancer cells in the subject disappear or die. It is believed that a daily dose in the range of mg / kg is to be administered. Such differentiation promoting HDI treatment can be performed with or without radioactive iodine or other thyroid cancer treatment as well.
[0089]
In some examples, a therapeutically effective amount of HDI can be administered to a subject who has or will undergo thyroidectomy. Administering HDI to subjects who have undergone or will undergo thyroidectomy is not materially different from subjects who did not have thyroidectomy.
[0090]
Histone deacetylase inhibitors can be administered enterally or parenterally to a subject in need of treatment. The dose administered may vary according to the particular compound used, the histological type of thyroid cancer involved, the particular host, the severity and extent of the disease, the physical condition of the host, and the chosen route of administration. Appropriate doses can be readily determined by one skilled in the art. For example, for the treatment of thyroid cancer in humans and animals, the daily dose may range from about 0.01 μg / kg to about 500 mg / kg.
[0091]
The compositions disclosed herein include a histone deacetylase inhibitor and an inert carrier. The composition can be in the form of a pharmaceutical composition for use in human and veterinary medicine or in the form of a feed composition for controlling coccidiosis in poultry. The term “composition” refers directly to any combination, combination, or aggregation of any two or more ingredients, with one or more active ingredients and one or more inert ingredients that make up the carrier. Or, it is interpreted to include products that are indirectly related, result from the dissociation of one or more components, or include any product resulting from other types of reactions of one or more components. Thus, the composition includes a composition made by mixing a histone deacetylase inhibitor and an inert carrier.
[0092]
The pharmaceutical composition includes a histone deacetylase inhibitor as the active ingredient, and may also include other therapeutic ingredients such as pharmaceutically acceptable carriers and optionally other chemotherapeutic agents. . Compositions include compositions suitable for oral, rectal, topical, and parenteral (including subcutaneous, intramuscular, and intravenous) administration, but in any case the most suitable route is The specific host and the nature and severity of the condition to which the active ingredient is administered. The pharmaceutical composition is conveniently in unit dosage form and may be prepared by any method well known in the pharmaceutical art.
[0093]
In practice, histone deacetylase inhibitors can be combined as the active ingredient in intimate mixing with a pharmaceutical carrier according to conventional pharmaceutical synthesis techniques. The carrier may take a wide variety of forms depending on the form of preparation desired for administration, eg, oral or parenteral (including intravenous).
[0094]
When preparing compositions for oral dosage form, any conventional pharmaceutical vehicle can be used. For example, for oral liquid preparations such as suspensions, elixirs and solutions, water, glycerol, oil, alcohol, flavoring agents, preservatives, coloring agents and the like can be used; or powders, capsules, And for oral solid preparations such as tablets, carriers such as starches, sugars, microcrystalline cellulose, diluents, granulating agents, lubricants, binders, disintegrating agents and the like can be included. Because of their ease of administration, tablets and capsules represent the most convenient oral unit dosage form when a solid pharmaceutical carrier is expressly used. If desired, tablets can be coated by standard aqueous or nonaqueous techniques. In addition to the general dosage forms described above, histone deacetylase inhibitors can also be administered by sustained release means and / or transport devices.
[0095]
Pharmaceutical compositions suitable for oral administration include individual unit forms such as capsules, cachets or tablets each containing a defined amount of the active ingredient, powders or granules, or aqueous, non-aqueous liquids, It can be an oil-in-water emulsion or a solution or suspension in a water-in-oil emulsion. Such compositions can be prepared by any pharmaceutical method, but all methods include the step of bringing into association the active ingredient with the carrier which constitutes one or more necessary ingredients. . In general, the compositions are prepared by uniformly and intimately bringing into association the active ingredient with liquid carriers, finely divided solid carriers or both, and, if necessary, shaping the product into the desired shape. The For example, a tablet can be prepared by compression or molding, optionally with one or more accessory ingredients. Compressed tablets selectively mix the active ingredient in a freely flowing form, such as powders or granules, in a suitable machine with a binder, lubricant, inert diluent, surfactant, or dispersant. And can be prepared by compression. Molded tablets can be made by molding in a suitable machine a mixture of the powdered compound moistened with an inert liquid diluent. Desirably, each tablet contains from about 1 mg to about 500 mg of the active ingredient, and each cachet or capsule contains from about 1 to about 500 mg of the active ingredient.
[0096]
Pharmaceutical compositions of the present invention suitable for parenteral administration can be prepared as solutions or suspensions of these active compounds in water suitably mixed with a surfactant such as hydroxypropylcellulose. Dispersants can also be prepared as glycerol, liquid polyethylene glycols, and mixtures thereof in oils. Under ordinary conditions of storage and use, these preparations contain a preservative to prevent the growth of microorganisms.
[0097]
Examples of pharmaceutical preparations suitable for injectable use include sterile aqueous solutions or dispersions and ready-to-use sterile powders with sterile injectable solutions or dispersion. In all cases, the dosage form must be sterile and must be fluid to the extent that easy syringability exists. The dosage form must be stable at the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. The carrier can be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (eg, glycerol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol), suitable mixtures thereof, and vegetable oils.
[0098]
In addition to the above carrier components, the above pharmaceutical preparations include, where appropriate, diluents, buffers, flavorings, binders, surfactants, thickeners, lubricants, preservatives (antioxidants). It is to be understood that the composition may comprise one or more additional carrier components such as) and substances included for the purpose of making the formulation isotonic to the blood of the intended recipient. .
[0099]
Diagnostic use of histone deacetylase inhibitors
The histone deacetylase inhibitor can be administered enterally or parenterally to a subject known or suspected of having a thyroid neoplasm. Administration of histone deacetylase inhibitors can be helpful in the diagnosis of thyroid neoplasia, for example by allowing the determination of the presence and extent of thyroid neoplasm. Administration of histone deacetylase inhibitors can also enhance the sensitivity, specificity, or expected value of diagnostic tests for thyroid neoplasia.
[0100]
The location of functional or non-functional thyroid tissue in the thyroid or other regions can probably be determined by external scintiscan techniques. The underlying principle is that isotopes accumulated differently depending on thyroid tissue can be detected and quantified in situ. Data can be digitized and converted to a visual display. Such accumulated isotopes are described in Larsen et al., The Thyroid Gland, Chapter 11, Williams' Textbook of Endocrinology, J. MoI. You may detect by the external scintillation detector described in Wilson edition, 1998.
[0101]
Thyroid contrast agents are generally Na ⁺ / I ⁻ It is taken up by the thyroid gland by a thyroid-specific gene such as a carrier. Thus, histone deacetylase inhibitors can be used for thyroid specific genes such as Na ⁺ / I ⁻ The ability to increase the expression of co-carriers and / or TGs enhances the ability of thyroid cells to take up and / or retain such contrast agents. Thus, by inhibiting histone deacetylase, thyroid tissue can be more easily detected externally, for example, by external scintiscan.
[0102]
Administration of histone deacetylase inhibitors can be particularly useful in a wide variety of general clinical situations. For example, poorly differentiated thyroid cancer is often difficult to detect because they have lost the ability to concentrate diagnostic substances. Without being bound by theory, this is Na ⁺ / I ⁻ It may be associated with decreased expression of thyroid-specific genes such as symporters and / or thyroglobulin. Administration of a histone deacetylase inhibitor enhances thyroid-specific gene expression in poorly differentiated thyroid cancer, thereby enhancing uptake of diagnostic material and making thyroid cancer more easily detectable. Thus, the sensitivity and positive predictive value of such tests are improved and their results are clinically more useful. Goldman, Quantitative Aspects of Clinical Reasoning, Chapter 3, Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition, A.M. See Fauci, Copyright 1998.
[0103]
Problems with detection of thyroid cancer may occur after treatment with, for example, thyroidectomy, radioactive iodine, anticancer chemotherapeutic agents, or external radiation.
[0104]
Several radioisotopes have been used for thyroid imaging. ^99m Tc-Pertechnetate (TcO ⁻ 4) is a monovalent anion and, like iodide, Na ⁺ / I ⁻ It is actively concentrated in the thyroid by the transporter. ^99m Because of the short physical half-life of Tc (6 hours) and it remains transient in the thyroid, the radiation delivered to the thyroid by standard doses is very low. As a result, when the fraction uptake is too low to perform scintillation scans with radioactive iodine, high count rates and proper thyroid imaging can be achieved by administration of large amounts (> 37 MBq [1 mCi]) . Pertechnetate is usually administered as a single intravenous dose and imaging is performed approximately 30 minutes later. Continuous imaging allows for potential studies on the kinetics of thyroid blood flow and isotope accumulation.
[0105]
Three radioactive isotopes of iodine are used for thyroid imaging. ¹³¹ I has been commonly used in the past, but is still useful when seeking functional metastasis of thyroid cancer. ¹²⁵ The physical half-life of I (60 days) is ¹³¹ The transport of dose to the thyroid per unit of radioactivity administered is longer than I (8 days) but due to its lower radiation energy ¹³¹ Only about two-thirds of those transported by I. Third isotope ¹²³ I in many ways ¹²⁵ I or ¹³¹ Better than I. Due to its short half-life and the absence of beta radiation, the dose to the thyroid is ¹³¹ About 1% when delivered by an equivalent dose of I. All three iodine isotopes provide a satisfactory picture of the thyroid gland in its normal position. Because the dose to the thyroid is low, ¹²³ I is useful for thyroid scintigraphy in human pediatric settings.
[0106]
Example 1
Effect of histone deacetylase inhibitors on cell viability
This example demonstrates that FR901228, a histone deacetylase inhibitor, is not significantly cytotoxic. In particular, exposure to FR901228 up to 1 ng / ml for 72 hours was not significantly cytotoxic to four different thyroid cell lines.
[0107]
Methods and materials
FTC133 and FTC236 cells were derived from cultures obtained from the primary tumor (FTC 133) and nodular metastasis (FTC 236) of human follicular thyroid cancer. FTC 133 and FTC236 cells were initially maintained in medium containing TSH, but this was discontinued after it was found that TSH had no effect on cell growth rate. Undifferentiated thyroid cancer cell lines SW-1736 and KAT-4 were derived from primary cultures of human undifferentiated thyroid cancer tumors.
[0108]
Each of these four cell lines was exposed to various concentrations of FR901228 (0.01 ng / ml, 0.1 ng / ml, 1 ng / ml, 10 ng / ml) for 72 hours prior to Mosmann, J . Immunol. Methods 65: 55-63, 1983 and Den Boer et al., Br. J. et al. Haem. 105: 876-882, 2000, using 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay to determine cell viability did. The MTT assay is a colorimetric assay for loss of mitochondrial metabolic activity associated with cell death.
[0109]
Results and conclusions
This example shows that 72 hours of exposure to a 1 ng / ml concentration of FR901228 is significantly cytotoxic for any of the four cell types examined (FTC 133, FTC236, SW-1736 and KAT-4). Prove that not. Thus, subsequent methods for evaluating cellular FR901228 may be safely performed using 1 ng / ml FR901228 so that it is not confused with the results due to FR901228-induced cytotoxicity. Therefore, the methods described in the subsequent examples were performed with 1 ng / ml FR901228 unless otherwise stated.
[0110]
Example 2
FR901228 inhibits histone deacetylase in thyroid cancer cell lines
To demonstrate that FR901228 is effective in inhibiting histone acetylation, the degree of histone acetylation was evaluated in FR901228-treated and control-treated thyroid cancer cells. From these immunofluorescence studies, treatment with 1 ng / ml FR901228 for 72 hours significantly increases histone acetylation in both more differentiated (FTC236) and less differentiated (SW-1736) thyroid cancer cells. It was shown that. Thus, 1 ng / ml FR901228 effectively inhibited histone deacetylation in thyroid cancer cells without causing significant cytotoxicity.
[0111]
Methods and materials
Histone acetylation was detected by immunofluorescence microscopy. In this experimental approach, fixed cells were exposed to a primary antibody that specifically bound to acetylated histone followed by a FITC-labeled secondary antibody that bound to the primary antibody. Cells containing acetylated histones display nuclear fluorescence that reflects the presence of acetylated histones.
[0112]
FTC 236 and SW-1736 cells were cultured as described in Example 1 and treated with 1 ng / ml FR901228 for 72 hours. Controls FTC 236 and SW-1736 were not treated with FR901228, but were otherwise treated the same as FR901228 exposed cells. After 72 hours, each culture was treated with trypsin, harvested, and subjected to low speed centrifugation to form a cell sediment. Cells from each sediment were mounted on a microscope slide and fixed with 95% ethanol / 5% acetic acid for 1 minute at room temperature. After fixation, the glass slide was washed twice with phosphate buffered saline (PBS) for 15 minutes, treated with 8% bovine serum albumin in PBS for 1 hour at room temperature, and washed with PBS for 15 minutes.
[0113]
The fixed cells were then incubated with 5 μg / ml anti-α-acetylated histone H3 in 2% bovine serum albumin in PBS overnight at 4 ° C. (Upstate Biotechnology, obtained from Lake Placid, NY) Antibody). Cells were then washed twice for 5 minutes at room temperature with PBS before incubation with equine anti-rabbit FITC conjugated secondary antibody (Vector Labs, Burlingham, Calif.). Glass slides were washed 3 times for 15 minutes with PBS and then counterstained with DAPI-containing anti-fading compound (Vector Labs, Burlingham, Calif.).
[0114]
Results and conclusions
Examination of control cells revealed a moderate nuclear fluorescence background level, but it was found that differentiated FTC 236 cells were larger than undifferentiated SW-1736 cells. In contrast, FR901228 treated FTC 236 and SW-1736 cells showed strong nuclear fluorescence, reflecting a marked increase in histone acetylation compared to control cells. Thus, treatment with 1 ng / ml FR901228 significantly increases histone acetylation in both highly differentiated and poorly differentiated thyroid cancer cell lines.
[0115]
Example 3
Histone deacetylase activates a thyroid-specific promoter
Thyroglobulin (TG) is a thyroid hormone binding protein that is produced by normal, fully differentiated thyroid cells and not by other cell types. TG expression is primarily regulated at the transcriptional level by activation of thyroid-specific TG enhancer-promoter elements.
[0116]
In thyroid cancer, thyroid-specific gene expression is impaired or lost. This loss of thyroid-specific gene expression can be an important factor in maintaining a cancerous phenotype. Substances that promote thyroid-specific gene expression may promote differentiation of thyroid cancer cells, thereby reducing the biologically aggressive behavior of these tumors.
[0117]
In order to investigate the influence of histone deacetylase inhibition on thyroid-specific gene expression, the effect of FR901228 on thyroglobulin promoter activity was shown. This indicated that 1 ng / ml FR901228 significantly increased TG promoter-enhancer activity in thyroid cancer cells.
[0118]
Methods and materials
FTC 236 and SW-1736 cells were transiently transfected with a reporter plasmid encoding luciferase operably linked to the TG promoter-enhancer element. Cells transfected with this reporter plasmid appear to express luciferase upon activation of the TG promoter enhancer. The luciferase activity in the cell lysate accurately reflects the TG promoter enhancer activity in the cell.
[0119]
As a positive control, FTC 236 and SW-1736 cells were transfected with a reporter plasmid encoding luciferase operably linked to a thymidine kinase (TK) promoter enhancer. The TK promoter enhancer is a constitutively active promoter element, which means that it is not thyroid specific and is fully active in all cell types.
[0120]
For transfection, FTC 236 and SW-1736 cells were treated with 0.5 μg plasmid DNA, Transfast transfection reagent (Promega, Madison, Wis.) 4.5 μl, and RPMI medium 200 Exposed to μl of transfection mixture. The plasmid DNA was either a TG-luciferase (TG-luc) construct or a TK-luciferase (TK-luc) construct. All three transfections were performed per sample.
[0121]
After incubating the cells with the transfection mixture for 1 hour, the cells were cultured for 2 days in the presence or absence of 1 ng / ml FR901228. Next, the cells were collected and lysed to obtain cell protein extracts. Total protein concentration in the extract was determined using the Bio-Rad protein assay system (Bio-Rad, Richmond, Calif.). Luciferase activity was determined using a luciferase assay system (Promega, Madison, Wis.) And normalized to total protein concentration.
[0122]
result
The results are shown in FIG. The normalized luciferase activity in TK luc-transfected cells is assigned a value of 100% and the normalized luciferase activity in TG luc-transfected cells is expressed relative to this as relative luciferase units (RLU). did.
[0123]
Without HDI treatment, normalized luciferase activity in TG luc-transfected cells was less than that observed in TK luc-transfected cells. In relatively well differentiated FTC 133 and FTC 236 cells, the RLU of TG luc-transfected cells was approximately 50-80%. In SW-1736 and KAT-4 cells with low differentiation, TG luc transfection resulted in an RLU of approximately 30%. Thus, the reference value TG promoter enhancer activity is greater in differentiated thyroid cancer cells than in undifferentiated cells with a low degree of differentiation.
[0124]
Treatment with 1 ng / ml FR901228 did not affect luciferase activity in TK luc transfected cells. However, FR901228 treatment significantly increased RLU in TG-luc transfected cells. For example, the RLU in FTC 133 and FTC 236 cells was approximately 1000%, indicating a more than 10-fold increase in luciferase activity compared to that observed in untreated cells. In poorly differentiated SW-1736 and KAT-4 cells, the RLU was 400-500%, again showing a more than 10-fold enhancement over the RLU found in untreated cells.
[0125]
These results demonstrate that HDI treatment significantly enhances the activity of thyroid-specific TG promoter enhancers in thyroid cancer cell types.
[0126]
Example 4
Inhibition of histone deacetylase increases thyroid-specific gene expression
Since HDI enhancement of TG promoter activity is physiologically relevant, HDI treatment also increases the expression of TG promoter regulatory genes. In this example, it was demonstrated that FR901228 treatment significantly increased the expression of two TG promoter regulatory genes.
[0127]
Materials and methods
Using RT PCR and Northern blot analysis, thyroglobulin and Na-iodide carriers (Na) in FR901228-treated and untreated thyroid cancer cells. ⁺ / I ⁻ Co-carrier, or NIS) expression was demonstrated to be transcriptionally regulated. RT PCR and Northern blot analysis are described in detail in a number of studies that serve as reference for standard molecular biology, such as Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1998.
[0128]
Total RNA was obtained from FR901228 treated and untreated thyroid cancer cells using RNA STAT-60 (Tel-Test, Inc) 24 hours 48 hours when FR901228 containing or control solution was added to the cell culture. And after 72 hours. RNA was also extracted from normal thyroid cells for comparison purposes. The extracted RNA was used without further modification for the Northern blot. In the case of RT PCR, the extracted RNA was reverse transcribed into cDNA using standard techniques.
[0129]
The oligonucleotide primers used for PCR analysis of human thyroglobulin expression were as follows:

[0130]
With these primers, the presence of the human thyroglobulin cDNA template is reflected by the 219 bp PCR product.
[0131]
Human Na ⁺ / I ⁻ The oligonucleotide primers used for PCR analysis of co-carrier expression were as follows:

[0132]
With these primers, human Na ⁺ / I ⁻ The presence of the commune cDNA template is reflected by the 303 bp PCR product.
[0133]
result
In untreated ATC cells, neither TG nor NIS expression could be detected. Thus, these genes are not expressed in untreated undifferentiated thyroid cancer cells. In untreated FTC cells, a very faint band was detected by RT PCR but not in the Northern blot. This means that TG and Na in more differentiated thyroid cancer cells ⁺ / I ⁻ It shows that both carriers are expressed at very low levels.
[0134]
TG and Na in FTC cells ⁺ / I ⁻ Increased co-carrier expression was detected within 24 hours by both RT PCR and Northern blot analysis after addition of FR901228, with a further increase observed after 72 hours. In ATC cells, increased expression was first observed 48 hours after the addition of FR901228, with a further increase 72 hours after FR901228 exposure. Control treated cells were TG or Na ⁺ / I ⁻ There was no increase in expression of the symporter.
[0135]
These experiments provide evidence that HDI treatment significantly increases the expression of thyroid-specific genes in thyroid cancer cells.
[0136]
Example 5
Inhibition of histone deacetylase increases Na-I symporter expression
Increasing gene transcription does not necessarily increase functional protein levels in cells. A myriad of other factors, such as mRNA and protein stability, affect protein concentration. In this example, (1) functional Na ⁺ / I ⁻ The union is expressed in thyroid cancer cells, and (2) Na ⁺ / I ⁻ It is demonstrated that the expression of commune can be increased by HDI treatment.
[0137]
These experiments show that thyroid cancer cells have low levels of functional Na ⁺ / I ⁻ Although including carriers, these low levels have been shown to be significantly increased by HDI treatment.
[0138]
Methods and materials
Na ⁺ / I ⁻ In order to evaluate the function of the carrier, an iodine accumulation experiment was conducted. FTC 133, FTC 236, SW-1736, and KAT-4 cells were treated with 1 ng / ml FR901228 for 2 or 3 days or left untreated. The cells are then washed with about 2 μCi of carrier-free Na ¹²⁵ I (Du Pont NEN, Boston, Mass.) And 30 μM Na ¹²⁵ Incubated in 0.5 ml of Hanks buffered salt solution (HBSS; Life Technologies Inc, Eggenstein, Germany) for 10 minutes. In the case of perchloric acid studies, NaClO immediately after the addition of radiolabeled iodine. ₄ Was added as a 100 × HBSS solution to a final concentration of 30 μM and 100 μM. Accumulated in cells after removing excess radiolabeled iodine ¹²⁵ The amount of I was determined by gamma counting.
[0139]
result
Without FR901228 treatment, iodine accumulation in FTC cells was higher than ATC cells. This result is consistent with the Na observed in RT PCR studies. ⁺ / I ⁻ This is consistent with higher expression of the symporter (Example 4) and also consistent with the more differentiated state of FTC cells compared to ATC cells.
[0140]
Significant increases in iodine accumulation were observed in the four cell lines 2 and 3 days after adding FR901228. Iodine accumulation is inhibited by sodium perchlorate in a dose-dependent manner; ⁺ / I ⁻ It is shown that it was a result of the activity of the carrier. Thus, in both FTC and ATC thyroid cancer cells, histone deacetylase inhibition is Na ⁺ / I ⁻ Induces transcription of co-transporter (Example 4) and functional Na ⁺ / I ⁻ Increased expression of commune.
[0141]
Example 5
Histone deacetylase inhibition in the treatment of thyroid cancer
The disclosure contained herein enables a new approach to the treatment of thyroid cancer in human and animal subjects. Administration of histone deacetylase inhibitors has been shown herein to have beneficial effects that may be utilized in thyroid cancer treatment. For example, administration of HDI induces thyroid cancer cells to differentiate, thereby reducing biologically aggressive behavior such as rapid growth and metastatic tendency. In addition, HDI administration resulted in functional Na in thyroid cancer cells. ⁺ / I ⁻ Increase levels of co-cargo and TG. Functional Na ⁺ / I ⁻ Cells expressing the symporter accumulate more iodine and are therefore more sensitive to radioactive iodine treatment. Increased expression of TG also enhances intracellular iodine accumulation in thyroid cancer cells.
[0142]
¹³¹ Protocol of HDI inhibitor treatment combined with radiotherapy
A thyroid cancer subject is administered a therapeutically effective amount of a histone deacetylase inhibitor. If desired, the therapeutic efficacy of HDI treatment can be determined by “tracers”, eg, diagnostic doses. ¹³¹ I (eg, McDougal et al., Nucl. Med. Commun. 18: 505-510, 1997) is monitored by radionucleotide scan after administration. Other suitable tracers include ¹²³ I and ^99m Tc-labeled pertechnate is included. Such radionuclide scans can be performed before, during, and after HDI inhibitor treatment to track and quantify the increase in tracer accumulation following administration of the tracer. HDI inhibitor treatment increases tracer accumulation by about 2-fold, 5-fold, 10-fold, or 10-fold or more.
[0143]
In one embodiment, the subject has not been previously treated. In another embodiment, the subject was undergoing thyroidectomy and / or radioactive iodine treatment for thyroid cancer. In some cases, the subject is a subject having or suspected of having residual and / or metastatic thyroid cancer at one or more sites in the body, and the method comprises residual and / or metastatic thyroid cancer How to treat.
[0144]
Radioactive iodine treatment is performed after or simultaneously with treatment with a therapeutically effective amount of a histone deacetylase inhibitor. Radioiodine treatment may involve discontinuing thyroid hormone replacement, thereby inducing clinical hypothyroidism. Hypothyroidism induces pituitary secretion of thyroid stimulating hormone (TSH), which is Na. ⁺ / I ⁻ Be additive or synergistic with HDI treatment with respect to increased carrier activity and TG expression, thereby ¹³¹ Induces increased I uptake and intracellular accumulation. As an alternative, TSH is also described by Meier et al. Clin Endocrinol. Metab. 78: 188, 1994, may be administered externally. Exogenous TSH is also Na ⁺ / I ⁻ Be additive or synergistic with HDI treatment in terms of increased carrier activity and TG expression.
[0145]
Radioactive iodine treatment is often large ¹³¹ I (eg, 50-500 mCi to a 70 kg human subject). Enhancement of HDI in intracellular radioactive iodine accumulation enhances the effectiveness of radioactive iodine treatment or allows low doses to be administered without loss of anti-tumor activity. For example, if HDI treatment increases iodine accumulation in thyroid cancer cells by a factor of 5, ¹³¹ It is possible to reduce the dose of I, for example, 1-50 mCi to a 70 kg human subject. The size of the dose may be adjusted with respect to body weight, body surface area and / or species.
[0146]
In addition to radioactive iodine treatment, HDI treatment can be combined with any other treatment. For example, a subject undergoing HDI treatment may be subjected to external radiation or anti-cancer chemotherapy at approximately the same time as HDI treatment or before or after HDI treatment. HDI treatment can be phased or synergistic with these other therapeutic aspects.
[0147]
Following administration of radioactive iodine, subjects develop hypothyroidism because of the death of thyroid cells by radiation and the fact that most subjects undergo thyroidectomy as well. Therefore, start or resume thyroid hormone replacement therapy.
[0148]
This or similar protocol may be repeated at regular intervals, particularly when residual thyroid cancer is present (eg, about every 2-24 months, or about every 6-12 months).
[0149]
Example 6
HDI inhibition using antisense oligonucleotides
This example uses antisense compounds, particularly oligonucleotides used to modulate the function of nucleic acid molecules encoding histone deacetylase to reduce the amount of histone deacetylase that is ultimately produced ( See WO 0071703 A2, which is incorporated herein by reference). This is done by providing an oligonucleotide that specifically hybridizes to the nucleic acid, preferably an mRNA encoding a histone deacetylase isoform.
[0150]
This relationship between an antisense compound, such as an oligonucleotide, and its complementary nucleic acid target to which it hybridizes is commonly referred to as “antisense”. “Targeting” an oligonucleotide to a selected nucleic acid target typically begins by identifying a nucleic acid sequence whose function is modulated. Histone deacetylase mRNA is a currently preferred target. The histone deacetylase mRNA includes not only information encoding a protein using a three-letter gene code, but also a 5 ′ untranslated region, 3 ′ untranslated region, 5 ′ cap region, and intron / exon-binding ribonucleotide. Related ribonucleotides that form regions known to those skilled in the art are included. An oligonucleotide is selected that is sufficiently complementary to the target, ie, hybridizes with sufficient and sufficient specificity to function as a therapeutically effective oligonucleotide.
[0151]
In the sense of this disclosure, “hybridization” usually refers to a hydrogen bond, also known as Watson-Crick base pairing, between opposite nucleic acid strands or complementary bases present in two regions of a nucleic acid strand. means. Guanine and cytosine are examples of complementary bases that are known to form three hydrogen bonds between them. Adenine and thymine are examples of complementary bases that form two hydrogen bonds between them.
[0152]
“Specifically hybridizable” and “complementary” are used to mean a sufficient degree of complementarity such that stable and specific binding occurs between the DNA or RNA target and the oligonucleotide. Term.
[0153]
It is understood that an oligonucleotide need not be 100% complementary to its target nucleic acid sequence in order to be specifically hybridizable. Oligonucleotides are those in which binding of the oligonucleotide to the target interferes with the normal functioning of the target molecule, losing utility, and specific binding is desired, i.e. physiological conditions in the case of in vivo assays or therapeutic treatments. Or, in the case of in vitro assays, specifically hybridize if there is a sufficient degree of complementarity to avoid non-specific binding of the oligonucleotide to the non-target sequence at the conditions under which the assay is performed. Is possible.
[0154]
Hybridization of the antisense oligonucleotide and the mRNA interferes with one or more normal functions of the mRNA. Interfering mRNA functions may involve, for example, translocation of RNA to protein translation sites, translation of proteins from RNA, splicing of RNA to produce one or more mRNA species, and RNA All important functions such as catalytic activity are included. Binding of one or more specific proteins to RNA can also be hindered by hybridization of antisense oligonucleotides to RNA.
[0155]
To design an antisense oligonucleotide, the mRNA sequence from the desired molecule, such as histone deacetylase, is examined. Regions of sequences that contain multiple repetitive sequences, such as TTTTTTTTTT, are undesirable because they lack specificity. Several different areas can be selected. Among them, oligonucleotides having the following characteristics are selected: oligonucleotides with the best conformation in solution; oligonucleotides that are optimal with respect to hybridization characteristics; and oligonucleotides that are less likely to form secondary structures . Antisense molecules with a propensity to form secondary structures are less desirable.
[0156]
Such regulation can be achieved by methods common in the art, such as Northern blot assay for histone deacetylase mRNA expression, reverse transcription PCR as taught in the examples of this application, or Western blot for histone deacetylase protein expression. Alternatively, it can be measured by ELISA assay or immunoprecipitation assay for histone deacetylase protein expression.
[0157]
Particular examples of antisense compounds useful in the present invention include oligonucleotides containing modified backbones or non-natural internucleoside linkages. As defined herein, oligonucleotides having modified backbones include oligonucleotides that retain a phosphorus atom in the backbone and oligonucleotides that do not have a phosphorus atom in the backbone. For the purposes of this specification, as is sometimes referred to in the art, modified oligonucleotides that do not contain a phosphorus atom in their internucleoside linkage can also be considered to be oligonucleosides.
[0158]
Modified oligonucleotide backbones include, for example, phosphorothioates, chiral phosphorothioates, phosphorodithioates, phosphotriesters, aminoalkyl phosphotriesters, 3'-alkylene phosphonates and methyl and other alkyl phosphonates, phosphinates, 3 ' -Phosphoramidates including aminophosphoramidates and aminoalkylphosphoramidates, thionophosphoramidates, thionoalkylphosphonates, thionoalkylphosphotriesters, and boranophosphonates with normal 3'-5 'linkages, These 2′-5 ′ linked analogs, as well as adjacent pairs of nucleoside units, are bound from 3′-5 ′ to 5′-3 ′, or from 2′-5 ′ to 5′-2 ′. Analogs with reverse polarity are included. Various salts, mixed salts, and free nucleic acid types are included as well.
[0159]
Representative US patents that teach the preparation of the above phosphorus-containing linkages include US Pat. Nos. 3,687,808, 4,469,863, 4,476,301, 5,023, No. 243, No. 5,177,196, No. 5,188,897, No. 5,264,423, No. 5,276,019, No. 5,278,302, No. 5,286,717 5,321,131, 5,399,676, 5,405,939, 5,453,496, 5,455,233, 5,466,677, 5,476,925, 5,519,126, 5,536,821, 5,541,306, 5,550,111, 5,563,253, 5, 571,799, 5,587,361, 5,625,050, Including but beauty No. 5,697,248 but not limited thereto.
[0160]
In view of the many possible embodiments in which the principles of the present invention may be applied, it is recognized that the described embodiments are examples of the present invention and should not be construed as limiting the scope of the invention. Should. Rather, the scope of the present invention is defined by the following claims. We therefore claim as our invention all that comes within the scope and spirit of these claims.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an illustration of a thyroid gland in a human subject (FIG. 1A) and an enlarged view of a thyroid follicle (FIG. 1B) where thyroid hormone is produced and stored (FIG. 1B). FIG. 1C is an enlarged view of the thyroid follicle shown in FIG. 1B, showing the function of the thyroid follicle cells. Thyroid-stimulating hormone (TSH) activates the expression of thyroid-specific genes and activates all of the processes shown in the figure. Cells are Na ⁺ / I ⁻ Iodide (I) through the carrier (NIS) ⁻ ) And sodium. Cells also synthesize thyroglobulin (TG) and transport it to the follicular lumen. At the luminal surface, iodide is oxidized and binds enzymatically to tyrosine residues on TG. TG tyrosine residues are enzymatically coupled to form a thyroid hormone, in the illustrated case thyroxine (T4). The modified thyroglobulin is transported from the lumen to the tip of the follicular cell by endocytosis. In the endolysosome, TG is degraded to release active T4.
FIG. 2 is a bar graph showing the effect of histone deacetylase inhibitors on the activity of thyroglobulin promoter enhancers in thyroid cancer cells. Four thyroid cancer cell lines were transfected with a plasmid containing a thyroglobulin promoter enhancer element operably linked to a luciferase reporter gene. The transfected cells were then either untreated or treated for 72 hours with the histone deacetylase inhibitor FR901228 (also known as decipeptide). Luciferase activity in the cell lysate was determined. The effect of FR901228 on luciferase activity is determined and plotted as a bar graph of luciferase activity in untreated cells (white bars) versus FR901228 treated cells.
FIG. 3 is a bar graph showing the effect of histone deacetylase inhibition on the ability of thyroid cancer to take up radioactive iodine. FIG. 3A shows in four thyroid cancer cell lines. ¹²⁵ I uptake is shown, and uptake in FR901228 treated (2 or 3 day treatment as indicated) cells is compared to uptake in untreated cells. FIG. 3B shows in FR901228 treated thyroid cancer cells. ¹²⁵ Figure 3 shows the effect of sodium perchlorate treatment on I uptake.

Claims (36)

A method for enhancing the expression of a thyroid-specific gene in a thyroid cell, comprising introducing an effective amount of a substance that inhibits histone deacetylase into the thyroid cell, thereby enhancing the expression of a thyroid-specific gene. Thyroid specific genes ^Na + / I ^- a co搬体The method of claim 1, wherein. 2. The method of claim 1, wherein the thyroid specific gene is thyroglobulin. The method according to claim 1, wherein the ability of thyroid cells to take up and / or concentrate iodide or iodine is increased by enhancing the expression of a thyroid-specific gene. The substance is FR901228 (depsipeptide), trichostatin A, trapoxin A, trapoxin B, HC-toxin, clamidine, Cly-2, WF-3161, Tan-1746, apicidin, apicidin analog, benzamide, benzamide derivative, hydroxamic acid derivative Azelaic acid bishydroxamic acid, butyric acid and its salts, acetate, suberoylanilide hydroxamic acid, suberic acid bishydroxamic acid, m-carboxy-cinnamic acid bishydroxamic acid, oxamflatin, depudecin, or MS-27-275, The method of claim 1. The method of claim 1, wherein the substance comprises FR901228 (depsipeptide). 2. The method of claim 1, wherein the substance comprises an oligonucleotide that inhibits the expression or function of histone deacetylase. The method of claim 1, wherein the substance comprises a dominant negative fragment or variant of histone deacetylase. The method of claim 1, wherein enhanced uptake of thyroid specific genes increases iodine or iodide uptake by cells. 10. The method of claim 9, wherein the thyroid cell is a thyroid cancer cell. 10. The method of claim 9, wherein the thyroid cell is in vitro. A method of treating thyroid cancer in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a substance that inhibits histone deacetylase, thereby treating thyroid cancer in the subject. Further comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of radioactive iodine, wherein administration of a substance that inhibits histone deacetylase increases the uptake and / or concentration of radioactive iodine in neoplastic cells in thyroid cancer, The method of claim 12. 14. The method of claim 13, wherein the radioactive iodine is ^131I . 13. The method of claim 12, wherein about 5 mCi to about 500 mCi of radioactive iodine is administered to the subject. 13. The method of claim 12, wherein from about 30 mCi to about 300 mCi of radioactive iodine is administered to the subject. The thyroid cancer is papillary thyroid cancer or a histological variant thereof, follicular thyroid cancer or a histological variant thereof, island thyroid cancer or a histological variant thereof, or undifferentiated thyroid cancer or a histological variant thereof. Method. 13. The method of claim 12, wherein the subject has or will undergo a thyroidectomy. 13. The method of claim 12, wherein the thyroid cancer is residual thyroid cancer remaining after thyroidectomy. 13. The method of claim 12, wherein the thyroid cancer is metastatic thyroid cancer. 13. The method of claim 12, wherein the radioactive iodine is administered to the subject at multiple doses. 12. The method of claim 11, further comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a chemotherapeutic agent. A method of detecting thyroid neoplastic cells in a subject comprising:
Administering to the subject an effective amount of a substance that inhibits histone deacetylase;
Administering to the subject a detectable substance taken up by a thyroid neoplastic cell, wherein the uptake or concentration of the detectable substance in the thyroid neoplastic cell is increased by a substance that inhibits histone deacetylase; and a thyroid neoplastic cell; Detecting a detectable substance in. The method of claim 21, wherein the neoplastic cell is a cell in thyroid cancer. 24. The method of claim 23, wherein the thyroid cancer is papillary thyroid cancer, follicular thyroid cancer, island thyroid cancer, or undifferentiated thyroid cancer. Detectable substance, Na + ^/ I ^- co搬体include substances that are transported to the thyroid cells through method of claim 23. 24. The method of claim 23, wherein the detectable substance is a radioactive iodine molecule. 24. The method of claim 23, wherein the detectable substance is ¹²³ I, ¹²⁵ I, ¹³¹ I, radiolabeled perchloric acid, or radiolabeled pertechnate. 24. The method of claim 23, wherein the neoplastic cell is a residual neoplastic cell in a subject treated for thyroid cancer. 28. The method of claim 27, wherein the treatment of thyroid cancer is thyroidectomy, ¹³¹ I treatment, external radiation, or administration of an anticancer chemotherapeutic agent. A method of increasing iodine uptake in a subject's thyroid comprising administering a therapeutically effective amount of a substance that inhibits a histone deacetylase inhibitor, thereby increasing iodine or iodide uptake. 26. The method of claim 25, wherein the iodine is radioactive. Iodine a radioactive iodine, ^{131 I,} The method of claim 26, wherein. Use of a substance that inhibits histone deacetylase for the treatment of thyroid cancer. Use of a substance that inhibits histone deacetylase to increase iodine or iodide uptake in the thyroid. The substance is FR901228, trichostatin A, trapoxin A, trapoxin B, HC-toxin, clamidine, Cly-2, WF-3161, Tan-1746, apicidin, apicidin analog, benzamide, benzamide derivative, hydroxamic acid derivative, azelaic acid 33. comprising bishydroxamic acid, butyric acid and salts thereof, acetate, suberoylanilide hydroxamic acid, bishydroxamic acid suberic acid, bishydroxamic acid m-carboxy-cinnamate, oxamflatin, depudecin, or MS-27-275. Or use according to 33.

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