JP2005506472A

JP2005506472A - Oxidase in the manufacture of paper materials

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Publication number: JP2005506472A
Application number: JP2003538460A
Authority: JP
Inventors: ボルシュ，キム; フランクス，ニール; ルント，ヘンリク; シュー，フイ; ルオ，ジン
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ; ノボザイムスノースアメリカ，インコーポレイティド
Priority date: 2001-10-23
Filing date: 2002-10-17
Publication date: 2005-03-03
Also published as: EP1448848A1; AU2002336917B2; CA2461447A1; CN1575363A; CN100336970C; WO2003035972A1

Abstract

紙材料、たとえば、紙、ライナボード、段ボール板紙、ティッシュペーパー、ペーパータオル、段ボール製容器および箱、の製造における脂肪酸酸化酵素の使用法。脂肪酸酸化酵素の例は、EC 1.13.11として分類されるオキシゲナーゼであり、その如何なる亜綱、たとえばリポキシゲナーゼ、EC 1.13.11.12、を含む。これらの酵素の効果は、ピッチの沈着を減少することであり、ならびに漂白および脱インキ効果もまた紙パルプおよび結果の紙材料に観察される。脂肪酸酸化酵素は、基質と、プロテアーゼ、リパーゼ、キシリナーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、アミラーゼ、マンナナーゼ、ステリルエステラーゼ、および/またはコレステロールエステラーゼと、あるいは界面活性剤および他の補助剤と共同して使用できる。Use of fatty acid oxidase in the manufacture of paper materials such as paper, linerboard, corrugated paperboard, tissue paper, paper towels, corrugated containers and boxes. Examples of fatty acid oxidases are oxygenases classified as EC 1.13.11, including any subclass such as lipoxygenase, EC 1.13.11.12. The effect of these enzymes is to reduce pitch deposition, and bleaching and deinking effects are also observed in paper pulp and the resulting paper material. Fatty acid oxidase can be combined with substrates and proteases, lipases, xylinases, cutinases, oxidoreductases, cellulases, endoglucanases, amylases, mannanases, steryl esterases, and / or cholesterol esterases, or with surfactants and other adjuvants. Can be used.

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、紙材料の製造における脂肪酸酸化酵素の使用、並びに紙材料の製造方法に関するものであり、該方法は製紙用パルプおよび/または製紙工程水を脂肪酸酸化酵素で処理する工程を含む。
【背景技術】
【０００２】
紙材料の製造において酵素を使用することは、よく知られている。この目的のために使用された酵素の例は、プロテアーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、同様にオキシドレダクターゼ（フェノール酸化酵素）のような種々の酸化酵素、たとえばラッカーゼおよびペルオキシダーゼである。
これらの酵素の効果は広範であり、たとえばピッチのような種々の残渣の制御、強度改善、脱インキ、排水改良、組織軟化、漂白、などである。
【０００３】
製紙工程において、溶解したコロイド状物質（DCS）が、パルプおよび紙の製造中に工程水に分散する。DCSは、しばしば木材ピッチまたは木材樹脂と称される。ピッチは、ローラーに付着して製紙機械に問題を生じ、その結果紙材料に斑点または穴を生じる。
木材は、その主要成分、セルロース、ヘミセルロース、およびリグニンに加えて約1〜10%のピッチまたは抽出物を含む。ピッチの主要成分は、脂肪酸、トリグリセライド、ステロール、ステリルエステル、およびいわゆる樹脂酸、たとえばアビエチン酸である。
【０００４】
WO 00/53843は、ある種のステリルエステラーゼ酵素の調製、およびピッチのステリルエステル部分を加水分解するための紙製造時におけるその使用法を開示している。
米国特許6,066,486は、シュードモナス・フラギ（Pseudomonas fragi）に由来するコレステロールエステラーゼを含む酵素の調製およびパルプ樹脂を加水分解するためのその使用法を開示している。
日本特許2000080581は、パルプ化または製紙工程中におけるアビエチン酸の分解のためのある種のペルオキシダーゼの使用法を開示している。
【０００５】
X. Zhang; Pulp & Paper Canada,101:3 (2000), page59-62は、溶解したコロイド状物質を除去するために、たとえばラッカーゼの能力の研究を開示している。
Karlssonら：脂肪酸および樹脂酸とのTrametesラッカーゼの反応性；Appl. Microbiol. Biotechnol. (2001) 55;317-320もまた、ラッカーゼをモデルピッチ調製品処理のために使用した実験を開示している。
然しながら、上述した参照文献のいずれも紙資材製造のためにここに定義している如き、脂肪酸酸化酵素の使用を開示していない。
【発明の開示】
【０００６】
本発明者らは、驚くべきことに、ある種の酸化酵素、すなわち脂肪酸酸化酵素が紙材料の製造に有利である事を発見した。これらの酵素の重要な効果は、ピッチの沈着を減少する事である。さらに、これらの酵素は、紙パルプおよび得られる紙材料に対して漂白効果を有する。そうして最後に、脱インキ効果もまた観察されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
紙およびパルプ
述語「製紙工程」又は「製紙方法」は、パルプを水に懸濁し、種々の添加物と混合し、ついで紙、段ボール、ティッシュペーパー、ペーパータオルなどを形成し、プレスし、乾燥する設備に通す工程を意味する。
述語「紙資材料」は、パルプから製造できる製品、たとえば、紙、ライナボード、段ボール製板紙、ティッシュペーパー、ペーパータオル、段ボール製容器または箱に関する。
【０００８】
述語「製紙用パルプ」または「パルプ」は、紙材料の製造に使用出来る如何なるパルプをも意味する。たとえば、パルプは、バージンパルプとして供給出来るし、またはリサイクル源に由来することも出来る。製紙用パルプは、木材パルプ、非木材パルプ、または古紙から製造されたパルプであろう。木材パルプは、松、セコイア、樅、スプルース、杉および栂のような針葉樹、または楓、榛の木、樺、ヒッコリー、ぶな、箱柳、アカシアおよびユーカリのような広葉樹から製造される。非木材パルプは、たとえばバガス、竹、綿、またはケナフから製造されるであろう。古紙パルプは、新聞紙、混合事務所廃棄物、コンピュータープリントアウト、白紙台帳、雑誌、牛乳カートン、紙コップ等の様な古紙を再パルプ化して製造されるであろう。
【０００９】
特定の具体例においては、処理されるべき製紙用パルプは、広葉樹パルプおよび針葉樹パルプの両方を含む。
処理されるべき木材パルプは、機械パルプ（たとえば砕木パルプ、GP）、化学パルプ（たとえばクラフトパルプまたは亜硫酸パルプ）、セミケミカルパルプ（SCP）、サーモメカニカルパルプ（TMP）、ケミサーモメカニカルパルプ（CTMP）、または漂白ケミサーモメカニカルパルプ（BCTMP）であろう。
【００１０】
機械パルプは、粉砕および精製法により製造される。ここで原料は、周期的な圧力衝撃を受ける。TMPはサーモメカニカルパルプ、GWは砕木パルプ、PGWは加圧砕木パルプ、RMPは精製機械パルプ、PRMPは加圧精製機械パルプおよびCTMPはケミサーモメカニカルパルプである。
【００１１】
化学パルプは、大部分のリグニンおよびヘミセルロース成分が除去されるアルカリ蒸解により製造される。クラフトパルプ化すなわち硫酸塩蒸解においては、硫化ナトリウムまたは苛性ソーダが主たる蒸解薬品として使用される。これらの型のパルプにおいては、アルカリ蒸解の結果として、ピッチのトリグリセライド部分は、脂肪酸およびグリセロールに加水分解されるであろう。表題が示す如く、脂肪酸酸化酵素はトリグリセライドのアルカリ加水分解の結果生じる脂肪酸のさらなる分解を触媒するので、これらの酵素はそのようなパルプの処理に特に有益である。
【００１２】
処理されるべきクラフトパルプは、漂白クラフトパルプであろう。そうしてそれは、針葉樹漂白クラフトパルプ（SWBK、NBKP(Nadel Holz漂白クラフトパルプ)とも呼ばれる）、広葉樹漂白クラフトパルプ（HWBK、LBKP（Laub Holz 漂白クラフトパルプ）とも呼ばれる）、および/またはこれらの混合物からなる。
【００１３】
本発明の方法で使用されるべきパルプは、機械または化学パルプの懸濁液、あるいはその組み合わせである。たとえば、本発明のプロセスで使用されるべきパルプは、0%、10-20%、20-30%、30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90%、または90-100%の化学パルプを含むであろう。特定の具体例において、化学パルプは紙資材を製造するために使用されるパルプの一部を成している。本発明の文脈で、「一部を成す」という表現は、本発明のプロセスで使用されるべきパルプにおいて、化学パルプの割合は、1-99%の範囲内にあることを意味する。特定の具体例において、化学パルプの割合は、2-98%、3-97%、4-96%、5-95%、6-94%、7-93%、8-92%、9-91%、10-90%、15-85%、20-80%、25-75%、30-70%、40-60%、または45-55％の範囲内にある。
【００１４】
本発明の使用および工程の特定の具体例において、化学パルプは、クラフトパルプ、亜硫酸パルプ、セミケミカルパルプ(SCP)、サーモメカニカルパルプ(TMP)、ケミサーモメカニカルパルプ(CTMP)、漂白ケミサーモメカニカルパルプ（BCTMP）である。特定の具体例において、クラフトパルプは、漂白クラフトパルプ、たとえば針葉樹漂白クラフトパルプ（SWBK、NBKP(Nadel Holz漂白クラフトパルプ)とも呼ばれる）、広葉樹漂白クラフトパルプ（HWBK、LBKP（Laub Holz 漂白クラフトパルプ）とも呼ばれる）、および/またはこれらの混合物からなる。
【００１５】
工程条件
本発明の方法は、パルプ化または製紙工程中に、たとえばピッチによる問題を避けるために、ピッチを構成する化合物の酸化および加水分解に特に適用できる。
本発明の方法は、如何なるピッチ含有パルプにも、特に相当量のリノール酸または他の不飽和脂肪酸を有するパルプに適用されるであろう。
【００１６】
紙およびパルプ加工の場合には、本発明に従うプロセスは、どのパルプ製造段階でも実施できる。酵素は、どの貯蔵タンク、たとえば、パルプ貯蔵容器（貯蔵箱）、貯蔵塔、混合容器または計測容器、にも添加出来る。酵素処理は、パルプ漂白前に、パルプ漂白プロセスとの関連で、または漂白後に、実施出来る。パルプ漂白との関連で実施する時には、酵素調製品は、塩素、二酸化塩素の様な漂白薬剤と一緒に添加されるであろう。酸素ガス、過酸化水素またはオゾン、あるいはそれらの混合物の適用もまた、パルプの漂白を遂行するであろう。
【００１７】
酵素調製品もまた、これらの物質と共に添加されるであろう。好ましくは、酵素調製品は漂白に先立って添加される。酵素はまた、漂白から生じる循環プロセス水（白水）および機械またはケミメカニカルパルプ化プロセスから生じるプロセス水（茶色水）にも添加出来る。クラフトパルプ化プロセスの特定の具体例で、酵素は褐色紙料洗浄中に添加される。
【００１８】
本発明の文脈で、述語「工程水」は、１）製紙工程に原料として添加される水、２）紙材料の製造のための工程のいずれかの工程から生じる中間水製品、同様に３）プロセスの産物または副産物としての廃水を含む。特定の具体例において、プロセス水は、循環(再循環)される、された、されている、または循環を意図される。すなわち、プロセスの他工程で再利用される。術語「水」は、かわるがわる如何なる水媒体、溶液、懸濁液、たとえば、普通の水道水、ならびに製紙プロセスで通常使用される種々の添加物および補助剤と混合した水道水を意味する。特定の具体例において、プロセス水は、低含量の固形(乾燥)物、たとえば、20%、18%、16%、14%、12%、10%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%未満の乾燥物を含む。
【００１９】
本発明の使用および方法は、廃水でのパルプ工業用漂白染料のための、PCT/DK02/00251の例２に述べられている様なマグナポルセ・サルビニ（Magnaporthe salvinii）に由来するリポキシゲナーゼの使用法を含まない。
本発明の方法は、紙およびパルプ加工の通常の条件下で実施されるであろう。プロセス条件は、適用される酵素、反応時間および与件の関数である。
本発明の酵素は、有効量で添加されるべきである。術語「有効量」により、ピッチ成分を酸化し、望ましい漂白および/または脱インキなどの様な、望ましくかつ期待される効果を達成するのに十分な量を意味する。
【００２０】
特定の具体例において、脂肪酸酸化酵素および、もしあるならば、追加酵素の量は、１ｔの紙パルプ当たり(各酵素の)約0.1 mg の酵素蛋白質から約100.000 mg の酵素蛋白質である。
さらなる特定の具体例において、脂肪酸酸化酵素および、もしあるならば、追加の酵素の量は、１ｇ（乾燥重量）のリグノセルロース物質当たり0.00001〜20 mgの酵素（純酵素蛋白質として計算）の範囲であり、あるいは0.0001〜20 mg、たとえば0.0001〜10 mg/g、0.0001〜1 mg/g、0.001〜0.1 または0.01〜0.1 mg/gのリグノセルロース物質当たり酵素である。尚、これらの量は、各酵素の量に関する。
【００２１】
酵素処理は、通常の濃度、たとえば乾燥物の0.5〜10%で実施出来る。特定の具体例において、濃度は、乾燥物の0.5〜45；0.5〜40；0.5〜35；0.5〜30；0.5〜25；0.5〜20；0.5〜15；0.5〜10；0.5〜8；0.5〜6；0.5〜5%の範囲内である。
酵素処理は、約10から約100℃の温度で実施されるであろう。温度範囲のさらなる例（全て「約---から」および「約---へ」）は、下記の通りである：20〜100、30〜100、35〜100、37〜100、40〜100、50〜100、60〜100、70〜100、10〜90、10〜80、10〜70、10〜60、および30〜60℃であり、また同様に、ここに示した上方値および下方値のいずれかの組み合わせである。典型的な温度は、約20から90℃、または20から95℃、好ましくは約40から70℃、または40から75℃である。
【００２２】
酵素処理は、約2から約12のpHで実施されるであろう。さらなるpH領域の例は(全て「約---から」および「約---まで」)、下記の通りである：3〜12、4〜12、5〜12、6〜12、7〜12、8〜12、9〜12、2〜11、2〜10、2〜9、2〜8、4〜10、5〜8、また同様に、ここに示した上方値および下方値のいずれかの組み合わせである。典型的なpH範囲は、約2から12、好ましくは約4.5から9または6から9の範囲内である。
【００２３】
酵素処理の適切な時間は、数秒から数時間の範囲である。たとえば、約30秒から約48時間、または約1分から約24時間、あるいは約1分から約18時間、あるいは約1分から約12時間、あるいは約1分から約5時間、あるいは約1分から約2時間、あるいは約1分から約1時間、あるいは約1分から約30分である。典型的な反応時間は、約10分から3時間、10分から10時間、好ましくは、15分から1時間、または15分から2時間である。
大気からの分子酸素は、もし必要であれば、通常十分な量が存在する。それ故、反応は開放型反応器で、すなわち大気圧下で実施する。
【００２４】
脂肪酸酸化酵素および追加の酵素のほかに種々の添加剤は、もしあるならば、本発明の方法または使用において使用出来る。界面活性剤および/または分散剤は、しばしば製紙パルプに存在しおよび/または添加される。かくて、本発明のプロセスおよび使用法は、製紙パルプに通常使用される陰イオン、非イオン、陽イオン、および/または両性イオン界面活性剤および/または分散剤の存在下で実施されるであろう。陰イオン界面活性剤の例は、アルキル、置換アルキル、またはアリールのカルボン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、または燐酸塩である。
【００２５】
脂肪酸は、アルキルカルボン酸塩の例である。非イオン界面活性剤の例は、ポリオキシエチレン化合物、たとえばアルコールのエトキシレート、プロポキシレート、またはエトキシレート/プロポキシレート混合物、他のポリグリセロールおよび他のポリオール、また同様にある種のブロック共重合体である。陽イオン界面活性剤の例は、水溶性陽イオン重合体、たとえば、4級硫酸アンモニウムおよびある種のアミン、たとえば、エピクロロヒドリン/ジメチルアミン重合体（EPI-DMA）およびこれらの架橋溶液、ポリジアリルジメチル塩化アンモニウム（DADMAC）、DADMAC/アクリルアミド共重合体、ならびに米国特許No.5,681,862およびNo.5,575,993に開示されている様なイオネン重合体である。双性イオンまたは両性イオン界面活性剤の例は、ベタイン、グリシネート、プロピオン酸アミン、プロピオン酸イミン、および種々のイミダゾリン誘導体である。米国特許No.5,256,252に開示された重合体もまた使用されるであろう。
【００２６】
本発明に従ってもまた、上述の様な界面活性剤は、その如何なる組み合わせも含んで、ここに定義した如き脂肪酸酸化酵素と共に製紙プロセスで使用され、およびその様な酵素と共に組成物に含まれるであろう。その様な組成物中の各界面活性剤の量は、組成物の約8から約40%(重量/重量)の量であろう。特定の具体例において、各界面活性剤の量は、約10から約38、または約12から約36、あるいは約14から約34、あるいは約16から約34、あるいは約18から約34、あるいは約20から約34、あるいは約22から約34、あるいは約24から約34、あるいは約26から約34、あるいは約26から32%(重量/重量)の量である。
他の特定の具体例において、上記範囲の夫々は界面活性剤の総量に関する。
【００２７】
酵素
酵素番号(EC No.)は、酵素の分類、たとえば、リパーゼ活性を有する酵素に対するリパーゼの酵素番号、などに使用されるであろう。国際生化学・分子生物学連合命名法委員会の勧告案(1992)、Academic Press Inc., 1992を参照せよ。
術語、酵素は、ここに述べた種々の酵素および酵素の種類と同様、野生種および問題の活性を維持している如何なる変異種も同様に含む。その様な変異種は、組換技術で作られるであろう。野生種酵素もまた、組換技術、または自然発生源からの単離および精製により作られるであろう。
【００２８】
特定の具体例において、問題の酵素はよく定義されている。すなわち、唯一つの主要な酵素成分が存在する。これは、たとえば適切なサイズ排除カラムでの分画により推論される。そのような良く定義された、または精製された、あるいは高度に精製された、酵素は当業界で知られている如く、および/または問題の特定の酵素に関して文献に記載されている如く入手できる。
【００２９】
脂肪酸酸化酵素
術語「一つの」脂肪酸酸化酵素は、その様な酵素の少なくとも一つを意味する。術語「少なくとも一つ」は、その様な酵素が1、2、3、4、5、6、またはそれより多いことを意味する。
【００３０】
本発明の文脈において、一つの脂肪酸酸化酵素は、基質シリンガルダジンよりもっと効率的に基質リノール酸を加水分解する酵素である。「もっと効率的に」は、より高い反応速度を意味する。これは、例2に記述された方法を用い、ならびに(1)基質リノール酸での吸光度の1分間当たりの増加（234 nmの吸光度）、および(2)基質シリンガルダジンでの吸光度の1分間当たりの増加（530 nmの吸光度）の差を計算、すなわち反応速度の差(RRD)＝(d(A₂₃₄)/dt - d(A₅₃₀)/dt)を計算することにより試験できる。もしRRDが0より大きければ、問題の酵素は、ここに定義されている様な脂肪酸酸化酵素の資格がある。もしRRDが0または0より小さければ、問題の酵素は、脂肪酸酸化酵素ではない。
特定の具体例において、RRDは1分間当たり少なくとも0.05、0.10、0.15、0.20、または少なくとも0.25吸光度単位である。
【００３１】
例２の方法の特定の具体例において、酵素はよく定義されている。さらにまた、例２の方法に対して酵素用量は、234 nmまたは530 nmでの１分間当たりの吸光度増加が最大になるように調整されている。特定の具体例において、最大の吸光度増加は、1分間当たり0.05〜0.50、0.07〜0.4、0.08〜0.3、0.09〜0.2、または0.10〜0.25吸光度単位の範囲内である。酵素用量は、1 mL当たり0.01〜20、0.05〜15、または0.10〜10 mgの酵素蛋白質である。
あるいは、「脂肪酸酸化酵素」は、シリンガルダジンよりもっと効率的に不飽和脂肪酸を酸化出来る酵素として定義できるであろう。酵素の活性は、基質としてシリンガルダジンまたはリノール酸を含み、pH 6および30℃で、本出願の例1に記述されている様な標準酸素計の設定で比較することが出来る。
【００３２】
特定の具体例において、脂肪酸酸化酵素は、EC 1.13.1.3またはEC 1.13.11.-と分類されている酵素として定義される。EC 1.13.11.-は、現在49個存在する、それらの亜綱の酵素EC 1.13.11.1-EC 1.13.11.49のいずれか１個を意味する。EC. 1.11.1.3は、指定された脂肪酸ペルオキシダーゼであり、およびEC 1.13.11.-は、2原子の酸素を伴う単一の供与体に働く指定されたオキシゲナーゼである。
【００３３】
さらに特定の具体例において、EC 1.13.11.-酵素は、夫々EC 1.13.11.12、EC 1.13.11.31、EC 1.13.11.33、EC 1.13.11.34、EC 1.13.11.40、EC 1.13.11.44またはEC 1.13.11.45、指定されたリポキシゲナーゼ、アラキドン酸塩12-リポキシゲナーゼ、アラキドン酸塩15-リポキシゲナーゼ、アラキドン酸塩5-リポキシゲナーゼ、アラキドン酸塩8-リポキシゲナーゼ、リノール酸塩ジオール合成酵素、およびリノール酸塩11-リポキシゲナーゼとして分類される。
【００３４】
さらに特定の具体例において、脂肪酸酸化酵素は、ポリ不飽和脂肪酸、ことにcis,cis-1,4ジエン、たとえば、リノール酸の酸化を触媒し、およびヒドロペルオキシダーゼを作る酵素であるEC 1.13.11.12として分類されるリポキシゲナーゼ（LOX)である。しかし他の基質、たとえばモノ不飽和脂肪酸もまた酸化されるであろう。
【００３５】
微生物のリポキシゲナーゼは、たとえば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サーモアクチノミセス・ブルがリス（Thermoactinomyces vulgaris）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・プロリフェラツム（Fusarium proliferatum）、サーモミセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）、ピリクラリア・オリゼー（Pyricularia oryzae）、およびゲオトリカム（Geotrichum）の菌株に由来する。ガエウマンノミセス・グラミニス（Gaeumannomyces graminis）に由来するリポキシゲナーゼの調製は、WO 02/20730の例3-4に記述されている。マグナポルセ・サルビニー（Magnaporthe salvinii）に由来するリポキシゲナーゼのAspergillus oryzaeでの発現は、特許協力条約PCT/DK02/00251の例2に記述されており、そしての酵素は、たとえばWO 02/20730の例4に記述されている如き標準法を用いて精製できる。
【００３６】
リポキシゲナーゼ（LOX）もまた、植物の種、たとえば、大豆、えんどう豆、ひよこ豆、および隠元豆から抽出される。代わりに、リポキシゲナーゼは、哺乳動物細胞、たとえば、兎の網状赤血球から得られるであろう。
【００３７】
リポキシゲナーゼ活性は、ヒドロペルオキシダーゼの生成を監視することにより、25℃で吸光光度法的に測定されるであろう。標準分析のために、980μLの25 mM燐酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）および10μLの基質溶液（0.2%(v/v)のTween 20で分散した10 mMのリノール酸(長時間保存しないこと)）を含む1 mLの石英セルに10μLの酵素を添加した。酵素は、典型的に最初の1分以内に添加された基質の最大10%のターンオ−バーを保証するに十分な様に希釈した。234 nmの吸収を追跡し、曲線の直線部分から速度を推定した。Cis-trans-共役ヒドロ(ペル)オキシ脂肪酸は、23,000M^-1cm^-1の分子吸光係数を有すると推測された。
【００３８】
脂肪酸酸化酵素はまた、酵素効果を促進する能力のある酵素に対する基質と共にも適用されるであろう。適切な基質は、大豆油（リノール酸に富む）またはトール油の様な加水分解油である。脂肪酸基質は、脂肪分解酵素により添加油から遊離されるかあるいはクラフトパルプ化または硫酸塩蒸解中に製造されるであろう。
特定の具体例において、基質は1,4-ペンタジエン構造を有する化合物、たとえばcis,cis-1,4-ペンタジエン構造、すなわち構造式にその様な要素を少なくとも1個有する化合物、である。その様な基質の例は、不飽和脂肪酸、たとえば、パルミトオレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、およびアラキドン酸、また同様に、それらの塩およびエステル、たとえばメチル、およびエチルエステル、である。
【００３９】
さらに特定の具体例において、基質は、リノール酸、リノール酸のメチルまたはエチルエステル、リノレン酸、あるいはリノレン酸のメチルまたはエチルエステル、である。
問題の脂肪酸酸化酵素に対する基質の添加効果を調べるために、以下の方法が使用されるであろう：10 mMのアビエチン酸（0.2%のTween 20に乳化された）のスペクトルを記録する。特徴的なピークが、200 nmおよび250 nm近傍に観察される。最初の実験で、脂肪酸酸化酵素をアビエチン酸乳化液に添加する。第2の実験で、脂肪酸酸化酵素に対する基質もまた添加する。酵素はたとえば上述した如くM. salviniiから誘導したリポキシゲナーゼであり、および基質はたとえばリノール酸である。アビエチン酸の分解を吸光光度法で追跡する。リノール酸をリポキシゲナーゼと共に添加する時には、200 nmおよび250 nm近傍のピークはより早く減少する。
【００４０】
上記方法および本発明のプロセスの特定の具体例において、基質、たとえばリノール酸を、5〜10000 ppm (mg/L)、または10〜9000、10〜8000、25〜7500、30〜7000、50〜6000、50〜5000、50〜4000、75〜3000、80〜2000、90〜1500、100〜1000、150〜800、あるいは200〜700 ppm の量で添加する。例4で、333 ppmのリノール酸もまた脂肪酸酸化酵素と共に使用された。
上記の方法および本発明のプロセスのさらなる特定の具体例において、脂肪酸酸化酵素は、0.005〜50 ppm (mg/L)、または0.01〜40、0.02〜30、0.03〜25、0.04〜20、0.05〜15、0.05〜10、0.05〜5、0.05〜1、0.05〜0.8、0.05〜0.6、あるいは0.1〜0.5 ppmの量で使用される。酵素の量は、良く定義された酵素調製品のmgに関する。
【００４１】
本発明のプロセスにおいて、脂肪酸酸化酵素は、単独でまたは追加の酵素と共に適用されるであろう。術語「追加の酵素」は、少なくとも1個の追加の酵素、たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 個またはそれより多い追加の酵素を意味する。
術語「共に適用される」(または「共に使用される」)は、追加の酵素が本発明のプロセスの同一のまたは他の工程に適用されるであろう事を意味する。他のプロセス工程は、製紙パルプまたはプロセス水が脂肪酸酸化酵素で処理される工程に比較して、製紙プロセスにおける上流または下流であろう。
【００４２】
特定の具体例において、追加の酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、キシナラーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、アミラーゼ、マンナナーゼ、ステリルエステラーゼ、および/またはコレステロールエステラーゼ活性を有する酵素である。オキシドレダクターゼ酵素の例は、ラッカーゼおよび/またはペルオキシダーゼ活性を有する酵素である。好ましい具体例において、追加の酵素はリパーゼである。
【００４３】
術語「工程」は、少なくとも一つの工程を意味し、1、2、3、4、5またはそれより多いプロセス工程であり得る。換言すれば、本発明の脂肪酸酸化酵素は、少なくとも一つのプロセス工程に適用されるであろうし、そして追加の酵素は、少なくとも一つのプロセス工程にも適用されるであろう。そうしてそれは脂肪酸酸化酵素が使用される工程と比較して、同一または他のプロセス工程であろう。
【００４４】
術語「酵素調製品」は、少なくとも1個の脂肪酸酸化酵素を含む製品を意味する。
酵素調製品はまた、他の酵素活性を有する酵素、好ましくは脂肪分解酵素またはオキシドレダクターゼ活性を有する酵素、最も好ましくは脂肪分解酵素を含むであろう。その酵素活性に加えて、その様な調製品は、好ましくは少なくとも一つの補助剤を含む。紙およびパルプ工業のための酵素調製品に使用される補助剤の例は、緩衝剤、高分子、界面活性剤、および安定剤である。
【００４５】
追加の酵素
プロテアーゼ、リパーゼ、キシナラーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、アミラーゼ、マンナナーゼ、ステリルエステラーゼ、および/またはコレステロールエステラーゼ活性を有する如何なる酵素も、本発明の使用法およびプロセスにおける追加の酵素として使用できる。下記に、その様な追加の酵素の幾つかの非限定的な例を列挙する。大文字で書かれた酵素は、Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmarkにあるノボザイム（Novozymes A/S）社から商業的に入手できる酵素である。これらのどの追加酵素の活性も、引用参照文献に言及されている方法を含んで、問題の酵素に対して当業界で知られている如何なる方法を用いても分析できる。
【００４６】
クチナーゼの例は、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens)（米国特許6.827,719）から誘導されたもの；フサリウム（Fusarium）の菌株、たとえば、フサリウム・ロセウム・クルモルム（F. roseum culmorum）、または特にフサリウム・ソラニ・ピシ（F. solani pisi)(WO 90/09446; WO 94/14964; WO 94/03578)、からの誘導品である。クチナーゼはまた、リゾクトニア（Rhizoctonia）菌株、たとえばリゾクトニア・ソラニ（R. solani、またはアルターナリア（Alternaria）菌株、たとえばアルターナリア・ブラッシシコラ（A. brassicicola)(WO 94/03578)、あるいはWO 00/34450に記述されている様なそれらの変異株から,あるいはWO/ 01/92502誘導されるであろう。
【００４７】
プロテアーゼの例は、ALCALASE、ESPERASE、SAVINASE、NEUTRASE、およびDURAZYMプロテアーゼである。他のプロテアーゼは、ノカルヂオプシス（Nocardiopsis）、アスペルギルス（Aspergillus）、リゾプス（Rhizopus）、バシルス・アルカロフィルス（Bacillus alcalophilus）、バシルス・セレウス（B.cereus）、バシルス・ナット（B. natto）、バシルス・ブルガトウス（B. vulgatus）、バシルス・ミコイデス（B. mycoide）、およびバシルス（Bacillus）からのスブチリシン、特にWO 88/03947に開示されている様なノカルディオプシス・スぺシス（Nocardiopsis sp.）種および（ノカルデヂィイオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、ならびにそれらの突然変異体、たとえばWO 91/00345およびEP 415296に開示されている様なもの、からのプロテアーゼである。
【００４８】
アミラーゼの例は、BAN、AQUAZYM、TERMAMYL、およびAQUAZYM Ultraアミラーゼである。リパーゼの例は、RESINAZE A2Xリパーゼである。キシナラーゼの例は、PULPZYME HCヘミセルラーゼである。エンドグルカナーゼの例は、NOVOZYM 613,342および476酵素製品である。
マンナナーゼの例は、Stahlbrandら、J. Biotechol. 29 (1993), 229-242に記述されたトリコデルマ・レーセイ（Trichoderma reesei）エンド-β-マンナナーゼである。
【００４９】
ステリルエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、およびコレステロールエステラーゼの例は、本発明の背景技術の項で言及した参照文献に開示されている。オキシドレダクターゼのさらなる例は、EP 730641、WO 01/98469、EP 719337、EP 765394、EP 767836、EP 763115、およびEP 788647に開示されているペルオキシダーゼおよびラッカーゼである。
【００５０】
本発明の文脈において、オキシドレダクターゼ酵素が、受容体（たとえば酸素または過酸化水素）、エンハンサー、メディエイター、および/またはアクチベーターの存在を必要としたりまたは利益を得たりする時にはいつでも、その様な化合物は含まれるべきと考えるべきである。エンハンサーおよびメディエイターの例は、EP 705327、WO 98/56899、EP 677102、EP781328、およびEP 707637に開示されている。もし望ましければ、問題の酵素およびその受容体の組み合わせならびに任意に問題の酵素に対するエンハンサーおよび/またはメディエイターとしてオキシドレダクターゼ酵素系（たとえば、ラッカーゼまたはペルオキシダーゼ酵素系）を定義することにより区別できる。
【００５１】
本発明の特定の具体例を以下に示す：製紙方法におけるピッチの沈着を減少するための脂肪酸酸化酵素の使用法。製紙方法におけるピッチの減少方法であって、パルプおよび/または工程水を脂肪酸酸化酵素を含む酵素調製品にて処理することを含み、好ましくは、この方法はは、パルプが機械パルプまたは化学パルプあるいはそれらの組み合わせ、たとえば化学パルプであることを特徴とする方法。前記酵素が、EC 1.13.11、好ましくは1.13.11.12、好ましくは該酵素は、マグナポルサセア（Magnaporthaceae）属の菌株、好ましくはマグナポルサセア・サルビニー（M. salvinii）、またはガエウマンノミセス（Gaeumannomyces）属、好ましくはガエウマンノミセス・グラミニス（G. graminis）であることを特徴とする方法。
【００５２】
前記の処理が、酵素のための基質、好ましくはリノール酸を添加することにより実施することを特徴とする前記の方法。前記酵素調製品が、脂肪分解酵素および/またはさらにオキシドレダクターゼを含むことを特徴とする前記の方法。前記処理を、20〜90℃、好ましくは40〜70℃の範囲の温度、および/または2〜11、好ましくは4〜9.5、より好ましくは6〜9の範囲のpHで実施し、そして/または処理を10分から3時間、好ましくは15分から1時間で実施し、そして/または該酵素を、0.0001〜20 mg/g、好ましくは0.0001〜10 mg/g、より好ましくは0.001〜1 mg/g、そして最も好ましくは0.01〜0.1 mg/gの範囲の濃度で添加することを特徴とする方法。上記方法の1具体例において、前記酵素調製品は、製紙機の前の貯蔵箱または混合箱に添加される。
【００５３】
ここに記述されおよび請求されている本発明は、ここに開示された特定の具体例により範囲を限定されるものではない。なぜならこれらの具体例は本発明の幾つかの観点の例示を意図しているものであるからである。どの相当する具体例も、本発明の範囲内にあることを意図される。実際ここに示され、および記述されているものに加えて本発明の種々の変更は、前述の記述から当業者にとり明白である。その様な変更もまた、付け加えた請求の範囲内にあることが意図される。紛争の場合には、定義を含む本発明の開示が支配する。
種々の参照文献がここに引用されているが、それらの開示は全体として参照として取り入れられている。
【実施例】
【００５４】
実施例１ . リノール酸に対する脂肪酸酸化酵素活性の測定法
TriOxamatic 300 酸素電極付“Oxi 3000 Oximeter”(WTW社製、Wilheim, Germany)および4 mLの標準反応容積を用いた。
10 mg のリノール酸（10 mLの60％リノール酸）を1 mLのエタノールに溶解し、次に2 μLのTween 20を添加した。この原料基質溶液から50μLを、溶液を良く混ぜるように小さな撹拌棒と共に、3.85 mLの緩衝溶液（Britton-Robinson社製; 100 mM 燐酸、酢酸、および硼酸；pHをNaOHで調整）を含む反応ビーカーに添加した。酸素電極を反応ビーカーに挿入した。
【００５５】
100μLの精製酵素溶液を添加した。すなわち、(a)マグナポルセ・サルビニー（Magnaporthe salvinii）由来のリポキシゲナーゼを約0.4 mg/mL濃度で、または(b)ガエウマンノミセス・グラミニス（Gaeumannomyces graminis）由来のリポキシゲナーゼを約0.76 mg/mL濃度で(最終反応で、約0.02 mg/mLを意味する)添加した。これらのリポキシゲナーゼは、前述の如く調製した。温度は、25℃であった。溶解酸素濃度（mg/L）を測定し、時間(分)の関数としてプロットした。酵素活性を、酵素添加後の曲線の直線部分の勾配（mg/L/分）として計算した。基線を、あてはまる時には、減算により修正した。すなわち、もし時間の関数としての酸素濃度を示す曲線が脂肪酸酸化酵素の添加前に約0.05 mg酸素/mL/分以上の勾配を示すならば(すなわち対照)、この値を試料勾配の値から減算した。
【００５６】
【表１】

【００５７】
実施例２ . 脂肪酸酸化酵素
4種類の酵素、すなわち２種類のラッカーゼおよび２種類リボキシゲナーゼを下記の如く試験した。ポリポルス・ピンシツス（Polyporus pinsitus）由来のラッカーゼは、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-Page）による分子量が65 kDa、等電的電気泳動（IEF）によるplが3.5、およびpH 5.5での最適温度が60℃であった。コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）由来のラッカーゼは、SDS-Pageによる分子量が67〜68 kDa、IEFによるplが3.5〜3.8、およびpH 7.5での最適温度が65℃であった。酵素を、WO 96/00290および米国特許No. 6,008,029に記述されている如く調製および精製した。２種類のリポキシゲナーゼは、マグナポルセ・サルビニー（Magnaporthe salvinii）およびガエウマンノミセス・グラミニス（Gaeumannomyces graminis）に由来し、そして前述した様に調製した。
【００５８】
酵素の用量を、234 nm/530 nmでの1分間当たりの吸光度増加が最大、すなわち1分間当たり0.1〜0.25吸光度単位の範囲になる様に調整した。
基質溶液：11.65 mgのリノール酸（60%、 Sigma社製）、同様に12.5 mLの0.56 mM シリンガルダジン (Sigma社製)エタノール溶液を、全容積を25 mLとなる様に脱イオン水と混合した。
【００５９】
50μLの試験用酵素調製品を、900μLのリン酸塩緩衝液（50μM、pH 7.0）および50μLの基質溶液を入れた石英セルに移した。セルを、温度を23℃に調整した吸光度計に置き、そうして234 nmおよび530 nmでの吸光度を時間の関数として測定した。530 nmでの吸光度は、シリンガルダジンの分解を示し、一方234 nmでの吸光度は、リノール酸の分解を示す。時間の関数としての吸光度の増加を、2から4分までの反応時間を基に、すなわち、d(A₂₃₄)/dtと、また同様にd(A₅₃₀)/dtを計算した。
結果を下表2に示す。これら4酵素のうち2つのリポキシゲナーゼのみが、ここに定義した脂肪酸酸化酵素としての資格がある。何故なら、RRD ＝反応速度の差＝ (dA₂₃₄/dt-dA₅₃₀/dt)がこれら2酵素に対してのみ0より大きいからである。
【００６０】
【表２】

【００６１】
実施例３ . 脂肪酸酸化酵素によるピッチの減少
ピッチモデルを以下の様に調製する：
50%リノール酸60% (Sigma L-1626)
20%アビエチン酸 (Sigma A9424)
20%オレイン酸 (Merck 471)
5%コレステロールリノール酸塩 (Sigma C-0289)
5%オリーブ油 (Sigma O-1500)
65℃で30分間混合した。保存は冷蔵庫内で30日未満とした。
【００６２】
0.1% ピッチ懸濁液の調製
50 mgピッチモデル
1 mLエタノール
1 mL 0.1 M NaOH
48 mL緩衝液（50 mMホウ酸塩、pH 9.0）
室温で10分間混合した。
【００６３】
円形紙片（直径＝5.5-6 mm、マルチコピー用紙 80 g/m²）を、AおよびBと名付けた2個の96孔の微量定量プレート（NUNC社製ID 269620）に移す。2個の別の同様の微量定量プレートCおよびDも、紙片無しで使用する。100μLの0.1%ピッチ懸濁液を、これら4個の各微量定量プレートの各孔に添加する。前述のマグナポルセ・サルビニー（Magnaporthe salvinii）由来のリポキシゲナーゼを脂肪酸酸化酵素として使用し、そしてそれを孔内濃度10ppmを得るように微量定量プレートAおよびCの孔に添加する。同様な量の緩衝液（50 mMホウ酸塩、pH9.0）を、微量定量プレートBおよびDの孔に添加する。次に微量定量プレートを振盪（600 rpm）しながら30分間培養する。
【００６４】
30分後、20μLの酵素処理をしたピッチ懸濁液を、各孔に200μLのエタノール（ピッチ成分を溶解する）を入れた微量定量プレートA-Dに対応する、2組目の微量定量プレートに移す（Corning Inc. Costar UV plate 96 well No. 3635）。ピッチの主要成分であるアビエチン酸は、約255nmで強く吸収する。従って、A₂₅₅は、懸濁液に残留するピッチの量を示す。A₂₅₅は、8回の同一実験の平均値として測定され、そうして紙に吸着したピッチの量は、（エタノールで11xに希釈後）紙の存在および不存在での培養後に得られたピッチ懸濁液で測定されたA₂₅₅の変化に基づいて推測される。
【００６５】
結果は、下表３の様に示される。脂肪酸酸化酵素の不在下で紙へのピッチの基本的な（ブラインド）吸着は、D/B比として計算されるであろう。紙に対するピッチの吸着に関して酵素（サンプル）の効果は、C/A比として計算される。酵素がピッチの沈着を減少させたことを示す1方法は、(C/A - D/B)が0より小さいかどうかである。代わりに、酵素効果は((C-A)-(D-B))として計算されるであろう、そうしてもしこの値が0より小さければ、これがピッチの分解に対する酵素効果を示す他の方法であろう。紙以外の他の固体、たとえば金属および線維(Style 4000綿)もまた試験されるであろう。ピッチ沈着の減少を示す上述の方法は、他の固体物質への沈着に関して類推により同様に適用される。
【００６６】
勿論、分析pH(すなわち、緩衝液)、および分析温度は、問題の脂肪酸酸化酵素の特徴を顧慮して選択される。たとえば、4、5、6、7、8、9、10、または11位の分析pH、および10、15、20、25、30、37、40、50、60、70、80、90、または95℃位の分析温度である。
【００６７】
【表３】

【００６８】
実施例４ . 脂肪酸酸化酵素による紙の漂白
ユウカリ（Eucalyptus grandis）から得た未漂白クラフトパルプを使用した。パルプを、Loretzen and Wettre社製パルプ製造機で、4%濃度で再パルプ化した。再パルプ化は、pH=9.0で緩衝液（Britton-Robinson）中で行った。
【００６９】
Britton-Robinson 緩衝液
100 mM燐酸（85%） 6.28 mL
100 mM酢酸（100%） 5.72 mL
100 mM硼酸 6.18 g
脱塩水で 1000 mLにする
pHを水酸化ナトリウムの添加により9.0に調整した。
再パルプ化後、パルプスラリーに緩衝液を添加して1%に希釈し、pHをpH = 9.0に再調整した。
【００７０】
脂肪酸酸化酵素による処理を、3 gの乾燥パルプ、すなわち300 mLパルプスラリーを含むビーカーで実施した。処理を、磁石撹拌棒で500 rpmで撹拌しながら、水浴中で25℃にて実施した。333 ppmのリノール酸を全てのビーカーに添加した。使用した脂肪酸酸化酵素は、前述した如く調製したガウエマンノミセス・グラミニス（Gaeumannomyces graminis）由来の精製リポキシゲナーゼであった。使用した酵素量は、下記の表４および表５に示す。酵素処理を2時間実施した。2個のビーカーを、夫々の条件下で実験した。
2時間後、酵素実験を5 mL（固定量）のNaOH（27.65%溶液）の添加により中止した。この添加により、pHは12より高くなり、酵素は失活する。
【００７１】
ビーカーの内容物を、700 mLの脱イオン水を用いて、1000 mLのビーカーに定量的に移した。このパルプ懸濁液を、濾紙を付けたブーフナー漏斗(直径15 cm)上に注いだ。水を吸引して、紙のシートを形成した。紙シートを漏斗から取り出し、濾紙と分けた。シートを、Lorentzen and Wettre社製のシートプレス機で、圧搾した。シートを、金属板、2枚の吸取紙、2枚の濾紙、シート、2枚の濾紙、2枚の吸取紙、金属板のサンドイッチにして、0.4 MPaで、5.5分間圧搾した。濡れた紙を乾いた紙で交換して、0．4 MPaで2分間圧搾を繰り返した。シートを一晩風乾した。
【００７２】
シートの明るさを、Macbeth Color-Eye 7000反射率計を用いて測定した。明るさを、600 nmで記録した。各シートにつき4回測定した。得られた結果を下記の表４に示す。
パルプの脱リグニン度を示す、Kappa数もまた、Tappi 試験法T236(Tappi Press)に記載された方法で各シートについて測定した。各測定に使用した量は、標準法に記載された量の1/4であった。シートの乾燥物含量を、Kappa数を計算するために測定した。得られた結果を、下記の表5に示す。
【００７３】
【表４】

【００７４】
【表５】

【００７５】
実施例５ . 脂肪酸酸化酵素を用いた古新聞紙の脱インキ
200 g の細断した古新聞を1500 mLの水と共にHobartミキサーに入れた。水浴の温度を45℃に設定した。約0.5-1分間低速で撹拌した。次に、3.6 kg/ton (7 lb/ton)の界面活性剤、および前述の如く調製したマグナポルセ・サルビニー（Magnaporthe salvinii）由来の2 mg (10 mg/tonパルプ)のリポキシゲナーゼをミキサーに添加し、さらに500 mLの水をHobartに追加し、よく混合した。ミキサーを30分間低速で運転した。パルプ機温度を45℃に、pHを7に設定した。
【００７６】
パルプの半量をミキサーから容器に移し、10 Lに希釈した。2分間撹拌した。
原料パッド：30 mLのパルプをミキサーから計量し、水で300 mLに希釈し、良く混合した。パルプを真空下でWattman #40濾紙を通して濾過した。パッドを10分間、90℃（195°F）で乾燥した。
【００７７】
パッドの通常洗浄：900 mLのパルプスラリーを容器から計量し、80メッシュの篩上にゆっくりと注ぎ、全ての遊離水が排出するまでゆっくりと振動した。全てのパルプを取り除いて、1000 mLのビーカーに入れる。ビーカーを900 mL線まで水で満たした。パルプをゆっくりと撹拌した。300 mLのパルプスラリーを計量し、真空下でWattman #40濾紙で濾過した。パッドを10分間、90℃（195°F）で乾燥した。
パッドの明るさは、Tappi標準法（T452）を用いて、Macbeth color eyeにより測定した。
【００７８】
パッドの超洗浄：900 mLのパルプスラリーを容器から計量し、80メッシュの篩上にゆっくりと注ぎ、全ての遊離水が排出するまでゆっくりと振動した。パルプを水道水で3分間洗浄し、取り除いて、1000 mLのビーカーに入れる。ビーカーを900 mL線まで水で満たした。パルプをゆっくりと撹拌した。濾過パッドを作るために、300 mLのパルプスラリーを計量し、Wattman #40濾紙で濾過した。パッドを10分間、90℃（195°F）で、迅速乾燥機で乾燥した。
【００７９】
パッドの明るさは、Tappi標準法（T452）を用いて、Macbeth color eyeにより測定した。
２種類の市販酵素、すなわち、両者共Novozymes A/S社、Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmarkから商業的に入手できる、リパーゼRESINASE A 2X、およびセルラーゼDENIMAX L、を用いた比較実験を上述の如く実施した。これらの酵素調製品を、パルプ1トン当たり0.51 kg(1 lb/t)の量で使用した。
結果を下記の表６に示す。
【００８０】
【表６】

【Technical field】
[0001]
The present invention relates to the use of fatty acid oxidase in the production of paper material and to a method for producing paper material, the method comprising the step of treating paper pulp and / or papermaking process water with fatty acid oxidase.
[Background]
[0002]
The use of enzymes in the manufacture of paper materials is well known. Examples of enzymes used for this purpose are proteases, lipases, xylanases, amylases, cellulases as well as various oxidases such as oxidoreductases (phenol oxidases) such as laccases and peroxidases.
The effects of these enzymes are extensive, such as control of various residues such as pitch, strength improvement, deinking, drainage improvement, tissue softening, bleaching, and the like.
[0003]
In the papermaking process, the dissolved colloidal material (DCS) is dispersed in the process water during the manufacture of pulp and paper. DCS is often referred to as wood pitch or wood resin. The pitch attaches to the rollers and causes problems for the papermaking machine, resulting in spots or holes in the paper material.
Wood contains about 1-10% pitch or extract in addition to its major components, cellulose, hemicellulose, and lignin. The main components of the pitch are fatty acids, triglycerides, sterols, steryl esters, and so-called resin acids such as abietic acid.
[0004]
WO 00/53843 discloses the preparation of certain steryl esterase enzymes and their use in making paper to hydrolyze the steryl ester portion of pitch.
US Pat. No. 6,066,486 discloses the preparation of an enzyme comprising cholesterol esterase derived from Pseudomonas fragi and its use to hydrolyze pulp resin.
Japanese patent 2000080581 discloses the use of certain peroxidases for the degradation of abietic acid during the pulping or papermaking process.
[0005]
X. Zhang; Pulp & Paper Canada, 101: 3 (2000), page 59-62, for example, discloses a study of the ability of laccase to remove dissolved colloidal material.
Karlsson et al: Reactivity of Trametes laccase with fatty acids and resin acids; Appl. Microbiol. Biotechnol. (2001) 55; 317-320 also discloses experiments using laccase for model pitch preparation processing. .
However, none of the above-mentioned references disclose the use of fatty acid oxidase as defined herein for paper material manufacture.
DISCLOSURE OF THE INVENTION
[0006]
The inventors have surprisingly found that certain oxidases, namely fatty acid oxidases, are advantageous for the production of paper materials. An important effect of these enzymes is to reduce pitch deposition. Furthermore, these enzymes have a bleaching effect on the paper pulp and the resulting paper material. And finally, a deinking effect has also been observed.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[0007]
Paper and pulp
The predicate “papermaking process” or “papermaking method” is a process in which pulp is suspended in water, mixed with various additives, then formed into paper, cardboard, tissue paper, paper towels, etc., pressed and dried. Means.
The predicate "paper material" relates to products that can be made from pulp, such as paper, linerboard, cardboard board, tissue paper, paper towels, cardboard containers or boxes.
[0008]
The predicate “paper pulp” or “pulp” means any pulp that can be used in the manufacture of paper material. For example, the pulp can be supplied as virgin pulp or can be derived from a recycling source. Papermaking pulp may be wood pulp, non-wood pulp, or pulp made from waste paper. Wood pulp is made from coniferous trees such as pine, sequoia, oak, spruce, cedar and oak, or hardwoods such as oak, oak, oak, hickory, beech, box willow, acacia and eucalyptus. Non-wood pulp may be made from bagasse, bamboo, cotton, or kenaf, for example. Waste paper pulp will be produced by repulping waste paper such as newspaper, mixed office waste, computer printouts, blank paper ledgers, magazines, milk cartons, paper cups and the like.
[0009]
In certain embodiments, the papermaking pulp to be treated includes both hardwood and softwood pulp.
Wood pulp to be treated is mechanical pulp (eg groundwood pulp, GP), chemical pulp (eg kraft pulp or sulfite pulp), semi-chemical pulp (SCP), thermomechanical pulp (TMP), chemithermomechanical pulp (CTMP) Or bleached chemi-thermomechanical pulp (BCTMP).
[0010]
Mechanical pulp is produced by grinding and refining methods. Here, the raw material is subjected to periodic pressure impact. TMP is thermomechanical pulp, GW is groundwood pulp, PGW is pressure groundwood pulp, RMP is refined mechanical pulp, PRMP is pressure refined mechanical pulp, and CTMP is chemithermomechanical pulp.
[0011]
Chemical pulp is produced by alkaline cooking where most of the lignin and hemicellulose components are removed. In kraft pulping or sulfate cooking, sodium sulfide or caustic soda is used as the main cooking chemical. In these types of pulp, as a result of alkaline cooking, the triglyceride portion of the pitch will be hydrolyzed to fatty acids and glycerol. As the title indicates, these enzymes are particularly useful for the treatment of such pulps, since fatty acid oxidases catalyze further degradation of fatty acids resulting from alkaline hydrolysis of triglycerides.
[0012]
The kraft pulp to be treated will be bleached kraft pulp. And it is from softwood bleached kraft pulp (also called SWBK, NBKP (Nadel Holz bleached kraft pulp)), hardwood bleached kraft pulp (also called HWBK, LBKP (Laub Holz bleached kraft pulp)), and / or mixtures thereof Become.
[0013]
The pulp to be used in the method of the present invention is a mechanical or chemical pulp suspension, or a combination thereof. For example, the pulp to be used in the process of the present invention is 0%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80 %, 80-90%, or 90-100% chemical pulp. In certain embodiments, the chemical pulp forms part of the pulp used to make the paper material. In the context of the present invention, the expression “part of” means that in the pulp to be used in the process of the present invention, the proportion of chemical pulp is in the range of 1-99%. In certain embodiments, the percentage of chemical pulp is 2-98%, 3-97%, 4-96%, 5-95%, 6-94%, 7-93%, 8-92%, 9-91 %, 10-90%, 15-85%, 20-80%, 25-75%, 30-70%, 40-60%, or 45-55%.
[0014]
In particular embodiments of the use and process of the present invention, the chemical pulp is kraft pulp, sulfite pulp, semi-chemical pulp (SCP), thermomechanical pulp (TMP), chemithermomechanical pulp (CTMP), bleached chemithermomechanical pulp. (BCTMP). In certain embodiments, kraft pulp is also bleached kraft pulp, such as softwood bleached kraft pulp (also called SWBK, NBKP (Nadel Holz bleached kraft pulp)), hardwood bleached kraft pulp (HWBK, LBKP (Laub Holz bleached kraft pulp)) And / or a mixture thereof.
[0015]
Process conditions
The method of the present invention is particularly applicable to the oxidation and hydrolysis of the compounds making up the pitch during the pulping or papermaking process, for example, to avoid problems with the pitch.
The method of the present invention will be applied to any pitch-containing pulp, especially to pulps having a significant amount of linoleic acid or other unsaturated fatty acids.
[0016]
In the case of paper and pulp processing, the process according to the invention can be carried out at any pulp production stage. The enzyme can be added to any storage tank, for example, a pulp storage container (storage box), storage tower, mixing container or measuring container. Enzymatic treatment can be performed before pulp bleaching, in the context of the pulp bleaching process, or after bleaching. When practiced in the context of pulp bleaching, the enzyme preparation will be added along with bleaching agents such as chlorine, chlorine dioxide. Application of oxygen gas, hydrogen peroxide or ozone, or mixtures thereof will also effect pulp bleaching.
[0017]
Enzyme preparations will also be added with these materials. Preferably, the enzyme preparation is added prior to bleaching. Enzymes can also be added to circulating process water resulting from bleaching (white water) and process water resulting from mechanical or chemimechanical pulping processes (brown water). In a particular embodiment of the kraft pulping process, the enzyme is added during the brown stock wash.
[0018]
In the context of the present invention, the predicate “process water” is 1) water added as a raw material to the papermaking process, 2) intermediate water products resulting from any of the processes for the production of paper material, as well as 3) Includes wastewater as a product or by-product of the process. In certain embodiments, the process water is circulated (recirculated), has been, has been, or is intended to be circulated. That is, it is reused in other steps of the process. The term “water” refers to any aqueous medium, solution, suspension, such as ordinary tap water, as well as tap water mixed with various additives and adjuvants commonly used in papermaking processes. In certain embodiments, the process water is a low solid content (dry), e.g., 20%, 18%, 16%, 14%, 12%, 10%, 8%, 7%, 6%, 5% , 4%, 3%, 2%, or less than 1% dry matter.
[0019]
The use and method of the present invention comprises the use of a lipoxygenase from Magnaporthe salvinii as described in Example 2 of PCT / DK02 / 00251 for pulp industry bleaching dyes in wastewater. Not included.
The method of the invention will be carried out under normal conditions of paper and pulp processing. Process conditions are a function of the enzyme applied, the reaction time and the requirements.
The enzyme of the present invention should be added in an effective amount. By the term “effective amount” is meant an amount sufficient to oxidize the pitch component and achieve the desired and expected effect, such as desired bleaching and / or deinking.
[0020]
In certain embodiments, the amount of fatty acid oxidase and, if any, additional enzyme is from about 0.1 mg enzyme protein (for each enzyme) to about 100.000 mg enzyme protein per tonne of paper pulp.
In a further specific embodiment, the amount of fatty acid oxidase and, if any, additional enzyme is in the range of 0.00001-20 mg enzyme (calculated as pure enzyme protein) per gram (dry weight) of lignocellulosic material. Yes, or 0.0001-20 mg, for example 0.0001-10 mg / g, 0.0001-1 mg / g, 0.001-0.1 or 0.01-0.1 mg / g of enzyme per lignocellulosic substance. These amounts relate to the amount of each enzyme.
[0021]
The enzyme treatment can be carried out at a usual concentration, for example, 0.5 to 10% of the dried product. In certain embodiments, the concentration is 0.5 to 45; 0.5 to 40; 0.5 to 35; 0.5 to 30; 0.5 to 25; 0.5 to 20; 0.5 to 15; 0.5 to 10; 0.5 to 8; 6: Within the range of 0.5-5%.
The enzyme treatment will be performed at a temperature of about 10 to about 100 ° C. Further examples of temperature ranges (all from "about ---" and "to ---") are as follows: 20-100, 30-100, 35-100, 37-100, 40-100 , 50-100, 60-100, 70-100, 10-90, 10-80, 10-70, 10-60, and 30-60 ° C, as well as the upper and lower values shown here Any combination of Typical temperatures are about 20 to 90 ° C, or 20 to 95 ° C, preferably about 40 to 70 ° C, or 40 to 75 ° C.
[0022]
Enzymatic treatment will be performed at a pH of about 2 to about 12. Examples of further pH ranges (all from "about ---" and "up to about ---") are as follows: 3-12, 4-12, 5-12, 6-12, 7-12 , 8-12, 9-12, 2-11, 2-10, 2-9, 2-8, 4-10, 5-8, as well as any of the upper and lower values shown here It is a combination. A typical pH range is in the range of about 2 to 12, preferably about 4.5 to 9 or 6 to 9.
[0023]
Suitable times for enzyme treatment are in the range of seconds to hours. For example, from about 30 seconds to about 48 hours, or from about 1 minute to about 24 hours, alternatively from about 1 minute to about 18 hours, alternatively from about 1 minute to about 12 hours, alternatively from about 1 minute to about 5 hours, alternatively from about 1 minute to about 2 hours, Alternatively, from about 1 minute to about 1 hour, or from about 1 minute to about 30 minutes. Typical reaction times are about 10 minutes to 3 hours, 10 minutes to 10 hours, preferably 15 minutes to 1 hour, or 15 minutes to 2 hours.
If necessary, molecular oxygen from the atmosphere is usually present in sufficient amounts. The reaction is therefore carried out in an open reactor, i.e. under atmospheric pressure.
[0024]
In addition to fatty acid oxidase and additional enzymes, various additives, if any, can be used in the method or use of the present invention. Surfactants and / or dispersants are often present and / or added to paper pulp. Thus, the processes and uses of the present invention are carried out in the presence of anionic, nonionic, cationic, and / or zwitterionic surfactants and / or dispersants commonly used in paper pulp. Let's go. Examples of anionic surfactants are alkyl, substituted alkyl, or aryl carboxylates, sulfates, sulfonates, or phosphates.
[0025]
Fatty acids are examples of alkyl carboxylates. Examples of nonionic surfactants are polyoxyethylene compounds, such as alcohol ethoxylates, propoxylates, or ethoxylate / propoxylate mixtures, other polyglycerols and other polyols, as well as certain block copolymers. It is. Examples of cationic surfactants include water-soluble cationic polymers such as quaternary ammonium sulfate and certain amines such as epichlorohydrin / dimethylamine polymer (EPI-DMA) and their cross-linking solutions, poly Diallyldimethylammonium chloride (DADMAC), DADMAC / acrylamide copolymers, and ionene polymers such as those disclosed in US Patent Nos. 5,681,862 and No. 5,575,993. Examples of zwitterionic or zwitterionic surfactants are betaine, glycinate, amine propionate, imine propionate, and various imidazoline derivatives. The polymers disclosed in US Pat. No. 5,256,252 may also be used.
[0026]
In accordance with the present invention, surfactants as described above, including any combination thereof, may be used in a papermaking process with a fatty acid oxidase as defined herein and included in a composition with such an enzyme. Let's go. The amount of each surfactant in such compositions will be in the amount of about 8 to about 40% (weight / weight) of the composition. In certain embodiments, the amount of each surfactant is from about 10 to about 38, or from about 12 to about 36, alternatively from about 14 to about 34, alternatively from about 16 to about 34, alternatively from about 18 to about 34, or from about An amount of 20 to about 34, alternatively about 22 to about 34, alternatively about 24 to about 34, alternatively about 26 to about 34, alternatively about 26 to 32% (weight / weight).
In other specific embodiments, each of the above ranges relates to the total amount of surfactant.
[0027]
enzyme
The enzyme number (EC No.) will be used for the classification of the enzyme, for example, the enzyme number of the lipase for an enzyme with lipase activity. See Draft Recommendations from the International Commission on Biochemistry and Molecular Biology (1992), Academic Press Inc., 1992.
The term enzyme, as well as the various enzymes and enzyme types described herein, includes wild species as well as any variant that maintains the activity in question. Such variants will be created by recombinant techniques. Wild species enzymes will also be made by recombinant techniques or by isolation and purification from natural sources.
[0028]
In certain embodiments, the enzyme in question is well defined. That is, there is only one major enzyme component. This is inferred, for example, by fractionation on a suitable size exclusion column. Such well-defined or purified or highly purified enzymes are available as known in the art and / or as described in the literature for the particular enzyme in question.
[0029]
Fatty acid oxidase
The term “one” fatty acid oxidase means at least one such enzyme. The term “at least one” means that there are 1, 2, 3, 4, 5, 6, or more such enzymes.
[0030]
In the context of the present invention, one fatty acid oxidase is an enzyme that hydrolyzes the substrate linoleic acid more efficiently than the substrate syringaldazine. “More efficiently” means a higher reaction rate. This was done using the method described in Example 2 and (1) an increase in absorbance per minute with the substrate linoleic acid (234 nm absorbance), and (2) 1 minute of absorbance with the substrate syringaldazine. Calculate the difference in per unit increase (absorbance at 530 nm), ie the difference in reaction rate (RRD) = (d (A₂₃₄) / dt-d (A₅₃₀It can be tested by calculating) / dt). If RRD is greater than 0, the enzyme in question is eligible for a fatty acid oxidase as defined herein. If RRD is 0 or less than 0, the enzyme in question is not a fatty acid oxidase.
In certain embodiments, the RRD is at least 0.05, 0.10, 0.15, 0.20, or at least 0.25 absorbance units per minute.
[0031]
In a particular embodiment of the method of Example 2, the enzyme is well defined. Furthermore, for the method of Example 2, the enzyme dose is adjusted to maximize the increase in absorbance per minute at 234 nm or 530 nm. In certain embodiments, the maximum absorbance increase is in the range of 0.05 to 0.50, 0.07 to 0.4, 0.08 to 0.3, 0.09 to 0.2, or 0.10 to 0.25 absorbance units per minute. The enzyme dose is 0.01-20, 0.05-15, or 0.10-10 mg enzyme protein per mL.
Alternatively, “fatty acid oxidase” could be defined as an enzyme that can oxidize unsaturated fatty acids more efficiently than syringaldazine. Enzyme activity can be compared with standard oximeter settings as described in Example 1 of this application at pH 6 and 30 ° C. with syringaldazin or linoleic acid as substrate.
[0032]
In certain embodiments, fatty acid oxidase is defined as an enzyme classified as EC 1.13.1.3 or EC 1.13.11.-. EC 1.13.11.- means any one of those subclass enzymes EC 1.13.11.1-EC 1.13.11.49, which currently exists. EC. 1.11.1.3 is a designated fatty acid peroxidase and EC 1.13.11.- is a designated oxygenase that works on a single donor with two atoms of oxygen.
[0033]
In more specific embodiments, the EC 1.13.11.-enzyme is EC 1.13.11.12, EC 1.13.11.31, EC 1.13.11.33, EC 1.13.11.34, EC 1.13.11.40, EC 1.13.11.44 or EC 1.13. 11.45 as designated lipoxygenase, arachidonate 12-lipoxygenase, arachidonate 15-lipoxygenase, arachidonate 5-lipoxygenase, arachidonate 8-lipoxygenase, linoleate diol synthase, and linoleate 11-lipoxygenase being classified.
[0034]
In a more specific embodiment, the fatty acid oxidase is EC 1.13.11.12, an enzyme that catalyzes the oxidation of polyunsaturated fatty acids, especially cis, cis-1,4 dienes, such as linoleic acid, and produces hydroperoxidase. Lipoxygenase (LOX) classified as However, other substrates such as monounsaturated fatty acids will also be oxidized.
[0035]
Microbial lipoxygenases include, for example, Saccharomyces cerevisiae, Thermoactinomyces bull squirrel (Thermoactinomyces vulgaris), Fusarium oxysporum, Fusarium proliferatumes lanuginosus), Pyricularia oryzae, and Geotrichum strains. The preparation of lipoxygenase derived from Gaeumannomyces graminis is described in Example 3-4 of WO 02/20730. Expression of lipoxygenase from Magnaporthe salvinii in Aspergillus oryzae is described in Example 2 of the Patent Cooperation Treaty PCT / DK02 / 00251, and the enzyme is described in Example 4 of WO 02/20730, for example. Purification can be done using standard methods as described.
[0036]
Lipoxygenase (LOX) is also extracted from plant seeds such as soybeans, peas, chickpeas, and hidden beans. Alternatively, lipoxygenase will be obtained from mammalian cells, such as spider reticulocytes.
[0037]
Lipoxygenase activity will be measured spectrophotometrically at 25 ° C. by monitoring the production of hydroperoxidase. For standard analysis, 980 μL of 25 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) and 10 μL of substrate solution (10 mM linoleic acid dispersed in 0.2% (v / v) Tween 20 (do not store for a long time)) 10 μL of enzyme was added to a 1 mL quartz cell containing. Enzymes were diluted enough to ensure up to 10% turnover of substrate typically added within the first minute. The absorption at 234 nm was followed and the velocity was estimated from the linear part of the curve. Cis-trans-conjugated hydro (per) oxy fatty acid is 23,000M^-1cm^-1It was estimated to have a molecular extinction coefficient of
[0038]
Fatty acid oxidase will also be applied with substrates for enzymes capable of promoting enzymatic effects. Suitable substrates are hydrolyzed oils such as soybean oil (rich in linoleic acid) or tall oil. The fatty acid substrate may be liberated from the added oil by lipolytic enzymes or produced during kraft pulping or sulfate cooking.
In certain embodiments, the substrate is a compound having a 1,4-pentadiene structure, such as a cis, cis-1,4-pentadiene structure, ie, a compound having at least one such element in the structural formula. Examples of such substrates are unsaturated fatty acids such as palmitooleic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, and arachidonic acid, as well as their salts and esters such as methyl and ethyl esters. is there.
[0039]
In a more specific embodiment, the substrate is linoleic acid, the methyl or ethyl ester of linoleic acid, linolenic acid, or the methyl or ethyl ester of linolenic acid.
To investigate the effect of substrate addition on the fatty acid oxidase in question, the following method will be used: Record the spectrum of 10 mM abietic acid (emulsified in 0.2% Tween 20). Characteristic peaks are observed around 200 nm and 250 nm. In the first experiment, fatty acid oxidase is added to the abietic acid emulsion. In a second experiment, a substrate for fatty acid oxidase is also added. The enzyme is, for example, a lipoxygenase derived from M. salvinii as described above, and the substrate is, for example, linoleic acid. The degradation of abietic acid is followed by spectrophotometry. When linoleic acid is added with lipoxygenase, the peaks near 200 nm and 250 nm decrease faster.
[0040]
In certain embodiments of the above methods and processes of the present invention, the substrate, such as linoleic acid, is 5 to 10,000 ppm (mg / L), or 10 to 9000, 10 to 8000, 25 to 7500, 30 to 7000, 50 Add in amounts of 6000, 50-5000, 50-4000, 75-3000, 80-2000, 90-1500, 100-1000, 150-800, or 200-700 ppm. In Example 4, 333 ppm of linoleic acid was also used with fatty acid oxidase.
In further specific embodiments of the above methods and processes of the present invention, the fatty acid oxidase is 0.005-50 ppm (mg / L), or 0.01-40, 0.02-30, 0.03-25, 0.04-20, 0.05- Used in amounts of 15, 0.05 to 10, 0.05 to 5, 0.05 to 1, 0.05 to 0.8, 0.05 to 0.6, or 0.1 to 0.5 ppm. The amount of enzyme relates to mg of a well-defined enzyme preparation.
[0041]
In the process of the present invention, fatty acid oxidase will be applied alone or with additional enzymes. The term “additional enzyme” means at least one additional enzyme, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more additional enzymes.
The term “applied together” (or “used together”) means that additional enzymes will be applied to the same or other steps of the process of the invention. Other process steps may be upstream or downstream in the papermaking process as compared to the step where papermaking pulp or process water is treated with fatty acid oxidase.
[0042]
In certain embodiments, the additional enzyme is an enzyme having protease, lipase, xynalase, cutinase, oxidoreductase, cellulase, endoglucanase, amylase, mannanase, steryl esterase, and / or cholesterol esterase activity. Examples of oxidoreductase enzymes are enzymes with laccase and / or peroxidase activity. In a preferred embodiment, the additional enzyme is a lipase.
[0043]
The term “step” means at least one step and may be 1, 2, 3, 4, 5 or more process steps. In other words, the fatty acid oxidase of the present invention will be applied to at least one process step and the additional enzyme will be applied to at least one process step. Thus it may be the same or other process step compared to the step where fatty acid oxidase is used.
[0044]
The term “enzyme preparation” means a product comprising at least one fatty acid oxidase.
The enzyme preparation will also contain enzymes with other enzymatic activities, preferably lipolytic enzymes or enzymes with oxidoreductase activity, most preferably lipolytic enzymes. In addition to its enzymatic activity, such preparations preferably contain at least one adjuvant. Examples of adjuvants used in enzyme preparations for the paper and pulp industry are buffers, polymers, surfactants, and stabilizers.
[0045]
Additional enzymes
Any enzyme with protease, lipase, xynalase, cutinase, oxidoreductase, cellulase, endoglucanase, amylase, mannanase, steryl esterase, and / or cholesterol esterase activity can be used as an additional enzyme in the methods and processes of the present invention. . Listed below are some non-limiting examples of such additional enzymes. The enzyme written in capital letters is a commercially available enzyme from Novozymes A / S, located in Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark. The activity of any of these additional enzymes can be analyzed using any method known in the art for the enzyme in question, including the methods mentioned in the cited references.
[0046]
Examples of cutinases are those derived from Humicola insolens (US Pat. No. 6.828,719); strains of Fusarium, such as F. roseum culmorum, or in particular Fusarium culmorum. Derived from F. solani pisi (WO 90/09446; WO 94/14964; WO 94/03578). Cutinase can also be used in Rhizoctonia strains such as R. solani, or Alternaria strains such as A. brassicicola (WO 94/03578), or WO 00/34450. Will be derived from those mutants as described or from WO / 01/92502.
[0047]
Examples of proteases are ALCALASE, ESPERASE, SAVINASE, NEUTRASE, and DURAZYM proteases. Other proteases include Nocardiopsis, Aspergillus, Rhizopus, Bacillus alcalophilus, B. cereus, Bacillus nut, B. natto, and Bacillus natto. Subtilisins from B. vulgatus, B. mycoide, and Bacillus, especially Nocardiopsis sp. Species as disclosed in WO 88/03947 And (Nocardiopsis dassonvillei) and their mutants, such as those disclosed in WO 91/00345 and EP 415296.
[0048]
Examples of amylases are BAN, AQUAZYM, TERMAMYL, and AQUAZYM Ultra amylase. An example of a lipase is RESINAZE A2X lipase. An example of a xynarase is PULPZYME HC hemicellulase. Examples of endoglucanases are the NOVOZYM 613,342 and 476 enzyme products.
An example of a mannanase is the Trichoderma reesei endo-β-mannanase described in Stahlbrand et al., J. Biotechol. 29 (1993), 229-242.
[0049]
Examples of steryl esterases, peroxidases, laccases, and cholesterol esterases are disclosed in the references mentioned in the background section of the present invention. Further examples of oxidoreductases are the peroxidases and laccases disclosed in EP 730641, WO 01/98469, EP 719337, EP 765394, EP 767836, EP 763115, and EP 788647.
[0050]
In the context of the present invention, whenever an oxidoreductase enzyme requires or benefits from the presence of a receptor (eg, oxygen or hydrogen peroxide), an enhancer, a mediator, and / or an activator, such a compound Should be included. Examples of enhancers and mediators are disclosed in EP 705327, WO 98/56899, EP 677102, EP781328, and EP 707637. If desired, a distinction can be made by defining an oxidoreductase enzyme system (eg a laccase or peroxidase enzyme system) as an enhancer and / or mediator for the enzyme in question and its receptor combination and optionally the enzyme in question.
[0051]
Specific embodiments of the invention are shown below: Use of fatty acid oxidase to reduce pitch deposition in papermaking processes. A method for pitch reduction in a papermaking process, comprising treating pulp and / or process water with an enzyme preparation comprising a fatty acid oxidase, preferably the process comprises mechanical pulp or chemical pulp or A method characterized by being a combination thereof, for example chemical pulp. Said enzyme is EC 1.13.11, preferably 1.13.11.12, preferably said enzyme is a strain of the genus Magnaporthaceae, preferably M. salvinii, or the genus Gaeumannomyces, Preferably, the method is G. graminis.
[0052]
Said process characterized in that said treatment is carried out by adding a substrate for the enzyme, preferably linoleic acid. Said method, characterized in that said enzyme preparation comprises lipolytic enzyme and / or further oxidoreductase. Said treatment is carried out at a temperature in the range 20-90 ° C, preferably 40-70 ° C, and / or a pH in the range 2-11, preferably 4-9.5, more preferably 6-9, and / or The treatment is carried out for 10 minutes to 3 hours, preferably 15 minutes to 1 hour, and / or the enzyme is 0.0001-20 mg / g, preferably 0.0001-10 mg / g, more preferably 0.001-1 mg / g, And most preferably, it is added at a concentration in the range of 0.01 to 0.1 mg / g. In one embodiment of the above method, the enzyme preparation is added to a storage box or mixing box in front of the paper machine.
[0053]
The invention described and claimed herein is not to be limited in scope by the specific embodiments disclosed herein. This is because these embodiments are intended to illustrate some aspects of the present invention. Any corresponding embodiments are intended to be within the scope of this invention. Indeed, various modifications of the invention in addition to those shown and described herein will be apparent to those skilled in the art from the foregoing description. Such modifications are also intended to fall within the scope of the appended claims. In case of conflict, the present disclosure, including definitions, will control.
Various references are cited herein, the disclosures of which are incorporated by reference in their entirety.
【Example】
[0054]
Example 1 . Method for measuring fatty acid oxidase activity for linoleic acid
A “Oxi 3000 Oximeter” with TriOxamatic 300 oxygen electrode (WTW, Wilheim, Germany) and a standard reaction volume of 4 mL were used.
10 mg of linoleic acid (10 mL of 60% linoleic acid) was dissolved in 1 mL of ethanol and then 2 μL of Tween 20 was added. Reaction beaker containing 50 μL from this raw substrate solution with 3.85 mL buffer solution (Britton-Robinson; 100 mM phosphoric acid, acetic acid, and boric acid; pH adjusted with NaOH) with a small stir bar to mix the solution well Added to. An oxygen electrode was inserted into the reaction beaker.
[0055]
100 μL of purified enzyme solution was added. That is, (a) lipoxygenase derived from Magnaporthe salvinii at a concentration of about 0.4 mg / mL, or (b) lipoxygenase derived from Gaeumannomyces graminis at a concentration of about 0.76 mg / mL ( In the final reaction, meaning approximately 0.02 mg / mL). These lipoxygenases were prepared as described above. The temperature was 25 ° C. The dissolved oxygen concentration (mg / L) was measured and plotted as a function of time (minutes). Enzyme activity was calculated as the slope (mg / L / min) of the linear portion of the curve after enzyme addition. The baseline was corrected by subtraction when applicable. That is, if the curve showing oxygen concentration as a function of time shows a slope of about 0.05 mg oxygen / mL / min or more prior to the addition of fatty acid oxidase (i.e. control), subtract this value from the sample slope value. did.
[0056]
[Table 1]

[0057]
Example 2 . Fatty acid oxidase
Four enzymes were tested as follows: two laccases and two riboxygenases. Laccase from Polyporus pinsitus has a molecular weight of 65 kDa by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-Page), a pl of 3.5 by isoelectric electrophoresis (IEF), and an optimum temperature at pH 5.5. It was 60 ° C. Laccase from Coprinus cinereus had a molecular weight of 67-68 kDa by SDS-Page, a pl of 3.5-3.8 by IEF, and an optimum temperature at pH 7.5 of 65 ° C. The enzyme was prepared and purified as described in WO 96/00290 and US Pat. No. 6,008,029. Two types of lipoxygenases were derived from Magnaporthe salvinii and Gaeumannomyces graminis and were prepared as described above.
[0058]
The enzyme dose was adjusted so that the increase in absorbance per minute at 234 nm / 530 nm was maximal, ie, in the range of 0.1 to 0.25 absorbance units per minute.
Substrate solution: 11.65 mg linoleic acid (60%, Sigma) and 12.5 mL of 0.56 mM syringaldazine (Sigma) ethanol solution mixed with deionized water to a total volume of 25 mL did.
[0059]
50 μL of the test enzyme preparation was transferred to a quartz cell containing 900 μL phosphate buffer (50 μM, pH 7.0) and 50 μL substrate solution. The cell was placed in an absorptiometer adjusted to a temperature of 23 ° C., and the absorbance at 234 nm and 530 nm was measured as a function of time. Absorbance at 530 nm indicates degradation of syringaldazin, while absorbance at 234 nm indicates degradation of linoleic acid. The increase in absorbance as a function of time is based on reaction times from 2 to 4 minutes, i.e. d (A₂₃₄) / dt and d (A₅₃₀) / dt was calculated.
The results are shown in Table 2 below. Only two of these four enzymes are qualified as fatty acid oxidases as defined here. Because RRD = reaction rate difference = (dA₂₃₄/ dt-dA₅₃₀This is because / dt) is greater than 0 only for these two enzymes.
[0060]
[Table 2]

[0061]
Example 3 . Pitch reduction by fatty acid oxidase
Pitch modelIs prepared as follows:
50% linoleic acid 60% (Sigma L-1626)
20% abietic acid (Sigma A9424)
20% oleic acid (Merck 471)
5% cholesterol linoleate (Sigma C-0289)
5% olive oil (Sigma O-1500)
Mix for 30 minutes at 65 ° C. Storage was less than 30 days in the refrigerator.
[0062]
0.1% Preparation of pitch suspension
50 mg pitch model
1 mL ethanol
1 mL 0.1 M NaOH
48 mL buffer (50 mM borate, pH 9.0)
Mix for 10 minutes at room temperature.
[0063]
Circular paper piece (diameter = 5.5-6 mm, multi-copy paper 80 g / m²) Are transferred to two 96-well microtiter plates (NUNC ID 269620) named A and B. Two other similar microtiter plates C and D are also used without a piece of paper. 100 μL of 0.1% pitch suspension is added to each hole of each of these four microtiter plates. The aforementioned lipoxygenase from Magnaporthe salvinii is used as the fatty acid oxidase and it is added to the pores of the microtiter plates A and C to obtain a pore concentration of 10 ppm. A similar amount of buffer (50 mM borate, pH 9.0) is added to the pores of microtiter plates B and D. The microtiter plate is then incubated for 30 minutes with shaking (600 rpm).
[0064]
After 30 minutes, 20 μL of the enzyme-treated pitch suspension is transferred to a second set of microtiter plates corresponding to a microtiter plate AD with 200 μL of ethanol (dissolving pitch components) in each hole ( Corning Inc. Costar UV plate 96 well No. 3635). Abietic acid, the main component of the pitch, absorbs strongly at about 255 nm. Therefore, A₂₅₅Indicates the amount of pitch remaining in the suspension. A₂₅₅Is measured as the average of 8 identical experiments, so the amount of pitch adsorbed on the paper is the pitch suspension obtained after incubation in the presence and absence of paper (after dilution to 11x with ethanol) A measured in liquid₂₅₅Inferred based on changes in
[0065]
The results are shown in Table 3 below. The basic (blind) adsorption of pitch to paper in the absence of fatty acid oxidase would be calculated as the D / B ratio. The effect of the enzyme (sample) on the pitch adsorption to the paper is calculated as the C / A ratio. One way to show that the enzyme has reduced pitch deposition is whether (C / A-D / B) is less than zero. Instead, the enzyme effect will be calculated as ((CA)-(DB)), and if this value is less than 0, this would be another way of showing the enzyme effect on pitch degradation . Other solids besides paper, such as metal and fiber (Style 4000 cotton) will also be tested. The method described above showing reduced pitch deposition is equally applicable by analogy with deposition on other solid materials.
[0066]
Of course, the analysis pH (ie buffer) and the analysis temperature are selected in view of the characteristics of the fatty acid oxidase in question. For example, the analytical pH at position 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11 and 10, 15, 20, 25, 30, 37, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or 95 The analysis temperature is in the order of ° C.
[0067]
[Table 3]

[0068]
Example 4 . Bleaching of paper with fatty acid oxidase
Unbleached kraft pulp obtained from Eucalyptus grandis was used. The pulp was repulped at a concentration of 4% on a Loretzen and Wettre pulp machine. Repulping was performed in buffer (Britton-Robinson) at pH = 9.0.
[0069]
Britton-Robinson Buffer
100 mM phosphoric acid (85%) 6.28 mL
100 mM acetic acid (100%) 5.72 mL
100 mM boric acid 6.18 g
Make up to 1000 mL with demineralized water
The pH was adjusted to 9.0 by addition of sodium hydroxide.
After repulping, the pulp slurry was diluted with buffer to 1% and the pH was readjusted to pH = 9.0.
[0070]
The treatment with fatty acid oxidase was carried out in a beaker containing 3 g of dry pulp, ie 300 mL pulp slurry. Treatment was carried out at 25 ° C. in a water bath with stirring at 500 rpm with a magnetic stir bar. 333 ppm of linoleic acid was added to all beakers. The fatty acid oxidase used was purified lipoxygenase derived from Gaeumannomyces graminis prepared as described above. The amount of enzyme used is shown in Table 4 and Table 5 below. Enzyme treatment was performed for 2 hours. Two beakers were tested under each condition.
After 2 hours, the enzyme experiment was stopped by adding 5 mL (fixed amount) of NaOH (27.65% solution). This addition raises the pH above 12 and inactivates the enzyme.
[0071]
The contents of the beaker were quantitatively transferred to a 1000 mL beaker using 700 mL deionized water. This pulp suspension was poured onto a Buchner funnel (15 cm diameter) fitted with filter paper. Water was aspirated to form a sheet of paper. The paper sheet was removed from the funnel and separated from the filter paper. The sheet was squeezed with a sheet press machine manufactured by Lorentzen and Wettre. The sheet was pressed into a metal plate, two blotter papers, two filter papers, a sheet, two filter papers, two blotter papers and a metal plate sandwich at 0.4 MPa for 5.5 minutes. The wet paper was replaced with dry paper, and pressing was repeated at 0.4 MPa for 2 minutes. The sheet was air dried overnight.
[0072]
The brightness of the sheet was measured using a Macbeth Color-Eye 7000 reflectometer. Brightness was recorded at 600 nm. Four measurements were made for each sheet. The results obtained are shown in Table 4 below.
The Kappa number, which indicates the delignification degree of the pulp, was also measured for each sheet by the method described in Tappi test method T236 (Tappi Press). The amount used for each measurement was 1/4 of the amount described in the standard method. The dry matter content of the sheet was measured to calculate the Kappa number. The results obtained are shown in Table 5 below.
[0073]
[Table 4]

[0074]
[Table 5]

[0075]
Example 5 . Deinking old newspaper using fatty acid oxidase
200 g of shredded old newspaper was placed in a Hobart mixer with 1500 mL of water. The water bath temperature was set at 45 ° C. Stir at low speed for about 0.5-1 minutes. Next, 3.6 kg / ton (7 lb / ton) surfactant and 2 mg (10 mg / ton pulp) lipoxygenase from Magnaporthe salvinii prepared as described above were added to the mixer, An additional 500 mL of water was added to the Hobart and mixed well. The mixer was run at low speed for 30 minutes. The pulper temperature was set at 45 ° C and the pH at 7.
[0076]
Half of the pulp was transferred from the mixer to a container and diluted to 10 L. Stir for 2 minutes.
Raw material pad: 30 mL of pulp was weighed from a mixer, diluted to 300 mL with water, and mixed well. The pulp was filtered through a Wattman # 40 filter paper under vacuum. The pad was dried for 10 minutes at 90 ° C (195 ° F).
[0077]
Normal washing of the pad: 900 mL of pulp slurry was weighed from the container and poured slowly onto an 80 mesh screen and shaken slowly until all free water was drained. Remove all pulp and place in a 1000 mL beaker. The beaker was filled with water up to the 900 mL line. The pulp was stirred slowly. 300 mL of pulp slurry was weighed and filtered through a Wattman # 40 filter paper under vacuum. The pad was dried for 10 minutes at 90 ° C (195 ° F).
The brightness of the pad was measured by Macbeth color eye using the Tappi standard method (T452).
[0078]
Pad super-wash: 900 mL of pulp slurry was weighed from a container and poured slowly onto an 80 mesh sieve and gently shaken until all free water was drained. The pulp is washed with tap water for 3 minutes, removed and placed in a 1000 mL beaker. The beaker was filled with water up to the 900 mL line. The pulp was stirred slowly. To make a filter pad, 300 mL of pulp slurry was weighed and filtered through a Wattman # 40 filter paper. The pad was dried in a quick drier at 90 ° C (195 ° F) for 10 minutes.
[0079]
The brightness of the pad was measured by Macbeth color eye using the Tappi standard method (T452).
Comparative experiments using two commercially available enzymes, lipase RESINASE A 2X and cellulase DENIMAX L, both commercially available from Novozymes A / S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark, are described above. It was carried out as follows. These enzyme preparations were used in an amount of 0.51 kg (1 lb / t) per ton of pulp.
The results are shown in Table 6 below.
[0080]
[Table 6]

Claims

Use of fatty acid oxidase in the manufacture of paper materials.

Use according to claim 1 for reducing pitch deposition.

Use according to claim 1 or 2 for bleaching.

Use according to any one of claims 1 to 3 for deinking in a process for producing paper material from papermaking pulp comprising pulp from recovered printed paper material.

Use according to any one of claims 1 to 4, wherein the chemical pulp constitutes the part of the pulp that is used for the production of paper material.

Use of a fatty acid oxidase according to any one of claims 1 to 5 together with a substrate for the enzyme.

Claims 1-6 of fatty acid oxidase in combination with an additional enzyme having protease, lipase, xylanase, cutinase, oxidoreductase, cellulase, endoglucanase, amylase, mannanase, steryl esterase, and / or cholesterol esterase activity Use of any one of Claims.

8. Use according to claim 7, wherein the additional enzyme has laccase and / or peroxidase activity.

Use according to claim 7 or 8, wherein the additional enzyme has lipase activity.

A method for producing a paper material, comprising a step of treating paper pulp and / or process water with a fatty acid oxidase.

11. The method of claim 10, further comprising the steps of forming and drying the enzyme treated pulp.

The enzyme treatment is
a) reduced pitch deposition,
12. A process according to claim 10 or 11 which results in b) bleaching of the resulting paper material.

13. A method according to any one of claims 10 to 12, wherein the chemical pulp constitutes the part of the pulp used for the production of paper material.

The papermaking pulp comprises recycled printed paper material and the enzyme treatment results in bleaching of the resulting paper material, at least in part due to the deinking effect of the enzyme. The method according to item.

15. A method according to any one of claims 10 to 14, wherein a substrate for the enzyme is added before or during the enzyme treatment step.

Further comprising treating the paper pulp and / or process water with a lipase, cutinase, oxidoreductase, cellulase, amylase, mannanase, steryl esterase, and / or an additional enzyme having cholesterol esterase activity. 16. The method according to any one of 15.

17. The method of claim 16, wherein the additional oxidoreductase enzyme has laccase and / or peroxidase activity.

The method according to any one of claims 16 to 17, wherein the additional enzyme has lipase activity.

The method according to any one of claims 16 to 18, wherein the treatment with the additional enzyme is carried out before, simultaneously with and / or after treatment with a fatty acid oxidase.