【技術分野】
【０００１】
本願は、その全体が参照として組み入れられる、2001年3月8日出願の国際特許出願番号PCT/US01/07527に対しての優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明の分野は食品補助剤および関連する方法である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
血中グルコースおよび血中脂質の上昇は、多数の疾患における比較的一般的な基礎状態であり、様々な方法で起こりうる。他の原因の中でも、血中グルコースレベルの上昇はしばしば、糖尿病状態に関連した代謝の変化によって促進され、糖尿病状態の治療にはしばしば、メトホルミン、スルホニル尿素等のような合成経口抗糖尿病薬と共に、インスリン治療が含まれる。血中脂質および血中グルコースが上昇した人において何らかの臨床パラメータが改善するにもかかわらず（すなわち、少なくともある程度の血中グルコースの低下）、インスリン抵抗性、アレルギー反応等を含む様々な副作用が、インスリンを用いる長期治療によって生じる可能性がある。
【０００４】
糖尿病、特に非インスリン依存型真性糖尿病（NIDDM）のもう一つの治療はしばしば、酵母、または酵母の誘導体に基づく。酵母は、クロム塩の存在下で増殖することができ、そのようにして増殖した酵母細胞または酵母抽出物は、インスリンの生物作用を増強することが知られている化合物である「耐糖能因子（GTF）」が特に豊富である。いくつかの酵母調製物は、上昇した血中グルコース濃度を低下させるために役立つが、多くの場合、高血糖状態を改善するためにはかなりの量の酵母調製物をかなりの期間摂取しなければならない。その上、長期間に及ぶ酵母調製物の長期使用は、いくらかの患者、特に、患者が酵母感染症の既往を有する場合に、問題となる傾向がある。なおさらに、多くの粗酵母調製物は味が苦く、患者によっては、不快である可能性がある。
【０００５】
酵母調製物に関連した問題の少なくともいくつかを軽減するために、濃縮して、苦みのない、凍結乾燥した酵母調製物が開発されている。そのような調製物は、典型的に錠剤型であり、食事の際に都合よく摂取することができる。しかし、そのような細胞／抽出物の比較的高度の処理は、酵母調製物の生物活性を低下させる可能性がある。その上、少なくともいくつかの抗高血糖活性を維持するためには、保存剤および添加剤（例えば、錠剤を圧縮またはそうでなければ成形するため）が典型的に必要である。
【０００６】
非インスリンに基づく血中グルコースを低下させるなお他の方法において、ピコリン酸クロムを投与してもよい。ピコリン酸クロムは、ヒトにおいて上昇した血中グルコースを低下させるために中等度に有効であると報告されている。しかし、ピコリン酸クロムは、かなりの毒性を示し、したがって、一般的に安全でないと見なされる可能性がある。
【０００７】
高い血中グルコース濃度を低下させる様々な方法が当技術分野で既知であるが、それらの全てまたはほとんど全てが一つまたはそれ以上の短所を有する。したがって、依然としてグルコース濃度を低下させる改善された組成物および方法を提供する必要がある。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、生物においてグルコース濃度を減少させる組成物および方法に向けられる。
【０００９】
本発明の主題の一つの局面において、組成物は植物から単離され、AICAR活性を有し、細胞へのグルコースの取り込みを増加させる。組成物は、インスリン非依存的であることが好ましい。組成物はまた、分子量がわずか2000に過ぎず、約260 nmでUV光の最大吸収を有することが好ましい。組成物は、細胞周囲の培地に約2〜10 μg/mlの濃度で存在すること、および細胞周囲の培地は、栄養と酸素の少なくとも一つが枯渇していることがさらに好ましい。細胞は、筋細胞、または肝組織、骨格筋組織、膵組織、もしくは脂肪細胞組織のようなインビボ組織の一部であることが企図される。
【００１０】
本発明の主題のもう一つの局面において、化合物は、オオムギ（Hordeum vulgare）から単離した分子と同一であり、AICAR様活性を有し、細胞へのグルコースの取り込みを増加させ、オオムギから単離した分子は、グルコース濃度を減少させるために有効な濃度で分子を投与した場合に、生物における血中グルコースを減少させる。化合物は、インビトロで合成されることが好ましく、以下の少なくとも一つを増加または減少させるように改変されることが好ましい：細胞へのグルコースの取り込みの増加；溶媒中での溶解度；化学的安定性；およびインビボ特異性。
【００１１】
本発明の主題の第三の局面において、化合物は、AICAR様活性を有し、細胞におけるAMPKを活性化させる非インスリン化合物である。化合物はオオムギ植物の種子から単離されることが好ましい。同様に、化合物が2〜10 μg/mlの濃度で細胞周囲の培地に存在する場合、インスリン非依存的にグルコースの取り込みを増加させることが好ましい。グルコースの取り込みの増加は、培地がL-N-モノ-メチル-L-アルギニンを300 μM/Lの濃度で含む場合に減少することがさらに好ましい。
【００１２】
本発明の主題のさらなる局面において、細胞を処置する方法には、AMPKを活性化する状態を有する細胞を同定する段階、分子の取り込み、排出、または合成の少なくとも一つを調節するために有効な濃度でAICAR様活性を有する化合物を細胞を提示する段階が含まれることが企図される。
【００１３】
本発明の様々な目的、特徴、局面、および長所は、本発明の好ましい態様に関する以下の詳細な記述からより明らかとなると思われる。
【００１４】
詳細な説明
図1において、生物におけるグルコース濃度を低下させる方法100は、タウマチン様蛋白質に結合する化合物を含む組成物が提供される段階110を有する。続く段階120において、組成物を、グルコースの血中濃度を低下させるために有効な用量で哺乳類に投与する。
【００１５】
本発明において用いられるように、「タウマチン様蛋白質に結合する化合物」という用語は、他のオオムギ蛋白質に対する結合と比較して、オオムギからのタウマチン様蛋白質に対して少なくとも10倍、より好ましくは少なくとも100倍の結合選択性を示す任意の化合物または化合物の混合物を意味し、意図される化合物のタウマチン様蛋白質に対する結合は、好ましくはKDが10-3 M未満、より好ましくは10-4 M未満であると考えられる。結合様式は、一つの相互作用（例えば、疎水性相互作用）に限定される必要はなく、多数の相互作用（例えば、静電気的相互作用および水素結合等）を含んでもよい。結合は可逆的であるが、非可逆的結合も除外されないと特に考えられる。オオムギからのタウマチン様蛋白質は、本発明の主題に係る化合物の一般的に好ましい結合パートナーであるが、微生物、植物、および動物を含む別の起源からのタウマチン様蛋白質も同様に考慮される。タウマチン様蛋白質は、十分に特徴が調べられたクラスのポリペプチドであり、例えば、その全てが参照として本明細書に組み入れられる、Cvetkovicら（J. Serb. Chem. Soc. 62(9)：777〜786（1997））、Cvetkovicら（J. Serb. Chem. Soc. 62(1)：51〜56（1997））、およびCvetkovicら（J. Inst. Brew. 103：183〜186（1997））に記載されている。
【００１６】
同様に、本明細書において用いられるように、「グルコース濃度の上昇」という用語は、正常と見なされる臨床範囲より上である濃度（すなわち、110 mg/dl以上）を意味する。同様に、「脂質濃度の上昇」という用語は、正常と見なされる臨床範囲より上である血中脂質濃度を意味する。
【００１７】
図2において、細胞を処置する方法100は、細胞がAMPK（アデノシン5'-一燐酸活性化蛋白質キナーゼ）を活性化する状態を有する段階110を有する。その後の段階120において、分子の取り込み、排出、および合成の少なくとも一つを調節するために有効な濃度でAICAR様活性を有する化合物を細胞に提示する。
【００１８】
AICARという用語は、5'-アミノイミダゾール-4-カルボキサミド1-リボヌクレオチドを意味する。本明細書において用いられるように、「AICAR様活性」および「5'-アミノイミダゾール-4-カルボキサミド1-リボヌクレオチド」という用語は、L-NMMAによって阻害されるL-6筋細胞へのインスリン非依存的グルコース取り込みを刺激するが、AICA、AICAR、またはグルコースを含まない如何なる活性も意味する。同様に、企図される化合物にはトコールまたはトコトリエン化合物が含まれない。本明細書において用いられるように、「L-NMMA」という用語は、酸化窒素シンターゼ（NOS）の阻害剤であるNG-メチル-L-アルギニンの酢酸塩を意味する。AMPKは、肝臓、脂肪細胞組織、膵臓β細胞、および骨格筋における脂肪酸と炭化水素代謝に対して既知の代謝調節作用を有する。AMPKは、グルコースの取り込みの増加、骨格筋における脂肪酸酸化の増加、脂肪酸酸化の増加、コレステロール合成の減少、および肝臓における脂質形成の減少を行うことが知られている。さらに、AMPKは、膵島においてインスリン分泌を調節することが知られている。
【００１９】
組成物は、糖尿病を治療するための薬剤または栄養剤であると企図される。本発明の主題の好ましい局面において、組成物はオオムギ（下記の実施例において概要するように）から調製して、インスリン非依存型真性糖尿病（NIDDM）と診断された人にそれぞれ、500 mgを1日3回経口投与する。このように、特に好ましい組成物には、化合物をグルコース濃度を減少させるために有効な濃度で生物に投与した場合に、タウマチン様の蛋白質に結合して、生物におけるグルコース濃度を減少させる化合物が含まれる。
【００２０】
本発明の主題のもう一つの局面において、適当な組成物および化合物は、オオムギからの調製物に限定される必要はなく、オオムギ以外の様々な植物からの調製物を含んでもよく、特に意図されるもう一つの植物には、オオムギ種、およびイネ科植物が含まれる。意図される組成物および／または化合物の調製物は好ましくは植物抽出物由来であるが、意図される組成物および／または化合物はまた、意図される化合物がタウマチン様蛋白質に結合して、生物におけるグルコース濃度を低下させる限り、微生物（すなわち、細菌、真菌、酵母、単細胞真核生物）、または動物から単離してもよい。
【００２１】
本発明の主題の企図される態様において、企図される組成物は、オオムギから単離した分子と同一である、またはその誘導体である。誘導体は、生物学的利用率、ターゲティングならびに他の特異性、有効性、および毒性の減少の問題に対処するように都合よく開発することができる。さらに、分子は、麦芽製造、仕込み、塩抽出、緩衝液抽出、エタノール抽出、陰イオン交換クロマトグラフィー、および分子ふるいを含む如何なる方法によってオオムギから単離してもよいと企図される。なおさらに、分子は、オオムギまたはオオムギ植物の種子の如何なる部分からも単離されると企図される。分子はオオムギの麦芽処理した種子から単離されることが好ましい。
【００２２】
なおさらなるもう一つの局面において、意図される化合物は、均一になるまで単離、精製してもよく、構造を解明してもよいと認識すべきである。その結果、意図される化合物および／または組成物は、インビトロで完全に（新たに）または部分的に合成／改変してもよいと認識すべきである。例えば、意図される化合物が部分合成される場合、意図される化合物の前駆物質を植物または微生物から単離してもよく、次に意図される化合物に達するように一つまたはそれ以上の段階を行ってもよい。または、意図される化合物を一つまたはそれ以上の段階において改変して、特に望ましい物理化学的特性を付与してもよい。例えば、意図される化合物は、極性化合物（例えば、ポリエチレングリコール）によってエステル化して、水溶性を増加させてもよい。もう一つの例において、意図される化合物は、生物に対する放出速度を制御するために、樹脂またはその他の材料にカップリングさせてもよい。
【００２３】
好ましい意図される化合物は比較的低い分子量を有し、典型的に2000 Daに過ぎないが、分子量はかなり変動し、化合物が単離される起源、合成による改変、二量体形成、および多量体形成に大きく左右されると認識すべきである。同様に、適した化合物は、約260 nmでUV吸収極大を有する化合物に限定される必要はなく（下記に概要する方法を用いて単離された意図される化合物について特徴的である）、UV260のピーク以外の様々な光学的特徴も同様に適している。同様に、オオムギから単離された意図される化合物は、少なくとも10 mg/mlの濃度で親油性溶媒に溶解性であるが、より高いまたはより低い溶解性も同様に意図され、典型的に、意図される化合物が単離された起源、および／または意図される化合物のさらなる化学修飾に依存すると考えられる。本明細書において用いられるように「親油性溶媒」という用語には、水との混和性が10容量％未満である全ての溶媒が含まれる。
【００２４】
意図される化合物は化学的に実質的に純粋であることが一般的に好ましいが（すなわち、意図される化合物の濃度は90重量％を超える、好ましくは95重量％以上、最も好ましくは99重量％を超える）、意図される化合物は一つまたはそれ以上のある分子にカップリングしてもよく、特に意図される分子には、タウマチン様蛋白質が含まれるとも認識すべきである。このように、意図される組成物には、意図される化合物とタウマチン様蛋白質との複合体が含まれ、特に、意図される化合物と適当な起源から単離されるタウマチン様蛋白質との複合体が含まれる（下記）。
【００２５】
グルコース濃度に関して、グルコース濃度は血中グルコース濃度であると一般的に意図される。しかし、さらに意図されるグルコース濃度には、生体内に認められる分子に共有結合または非共有結合したグルコース濃度も含まれ、特に意図されるもう一つのグルコース濃度には、グリコシル化蛋白質濃度が含まれる（例えば、グリコシル化ヘモグロビンまたはコラーゲン）。
【００２６】
適したタウマチン様蛋白質は、オオムギから単離されると一般的に考えられるが、代わりのタウマチン様蛋白質も同様に考慮され、組換え系において発現されてもよく、またはされなくてもよい微生物、植物、および動物から単離されたタウマチン様蛋白質が含まれる。当技術分野で既知のタウマチン様蛋白質の単離に関して様々なプロトコールが存在し（例えば、Barrreら、「Purification and structural analysis of an abundant thaumatin-like protein from ripe banana fruit」、Planta 2000、11月号；211(6)：791〜9）；Ohら（「Isolation of a cDNA encoding a 31-kDa, pathogenesis-related 5/thaumatin-like (PR5/TL)protein abundantly expressed in apple fruit.」、Biosci. Biotechnol.Biochem. 2000、2月号；64(2)：355〜62）；Tattersallら、「Identification and characterization of a fruit-specific, thaumatin-like protein that accumulates at very high levels in conjunction with the onset of sugar accumulation and berry softening in grapes」、Plant Physiol. 1997、7月号；114(3)：759〜69）、既知の全てのプロトコールは、本明細書に示した開示と共に用いるために適していると見なされる。
【００２７】
意図される組成物は、NIDDMを患っている人における血中グルコース濃度の上昇を低下させるのみならず、肥満、食事の影響等を含むNIDDM以外の理由のために血中グルコース濃度が上昇した人における血中グルコース濃度も低下させる可能性があると特に認識すべきである。NIDDMを有する、または有さない人は、血中グルコース濃度が少なくとも90 mg/dl、より好ましくは少なくとも120 mg/dl、および最も好ましくは少なくとも200 mg/dlであると特に考えられる。
【００２８】
さらに、意図される組成物はまた、上昇した血中脂質濃度（下記）を都合よく低下させることが示されており、この場合血中脂質には特に、トリグリセリド、脂肪酸、HDL-コレステロール、およびLDL-コレステロールが含まれ、血中脂質の低下は血中グルコースレベルの低下と同時に起こってもよく、または血中グルコースレベルの低下と無関係であってもよいとさらに考えられる。
【００２９】
本発明の主題のさらなる局面において、意図される組成物はさらに、血中脂質濃度を低下させることが知られている組成物、および／または血糖濃度を低下させることが知られている組成物を含む活性または不活性成分をさらに含んでもよいと認識されるべきである。例えば、代わりの組成物は、トコール、ビタミン類、および／または無機質調製物、GTF、メトホルミン、スルホニル尿素等の少なくとも一つを含んでもよい。不活性成分には、増量剤、着色剤、安定化剤等が含まれる。
【００３０】
このように、上昇した血中のグルコース濃度が約150 mg/mlであって、上昇した血中の総コレステロール濃度が280 mg/mlまたはそれ以上である人（例えば、NIDDMと診断された人）を治療する例示的な方法は、意図される組成物が提供される一つの段階を有する。さらなる段階において、組成物は、グルコース濃度を低下させるために有効な用量で人に投与される。
【００３１】
血中グルコースレベルに関して、本発明の主題に係る治療が、約150 mg/dlの血中グルコースレベルに限定される必要はないが、これはまた、70〜110 mg/dl以上の多くのグルコース濃度において必要とされる可能性があると考えられる。特定の理論またはメカニズムに拘束されたくはないが、血中グルコースレベルの低下は、細胞へのグルコース取り込みの増強による可能性があると考えられる。しかし、本発明の主題に係る組成物は、非GTF組成物であることに注意しなければならない。意図される治療の期間は有意に変化してもよく、適した期間は1回投与の範囲内であってもよく、同様に、1週間、数週間、数ヶ月、およびさらに数年を含む既定の期間であってもよい。その結果、本発明の主題に係る組成物はまた、高血糖症、または何らかの形の異常脂血症を予防するために人に予防的に投与してもよいと認識されるべきである。
【００３２】
本発明のなおさらなる局面において、企図される組成物は、細胞へのグルコースの取り込みを増加させる。細胞は、筋細胞を含む如何なる細胞または植物の一部であってもよいと企図される。細胞は、インスリン依存的またはインスリン非依存的のいずれであってもよいとさらに企図される。企図される組織は、インビボであることが好ましく、肝組織、骨格筋組織、膵組織および脂肪細胞組織が含まれてもよい。細胞は筋細胞であって、インスリン非依存的であることがさらに好ましい。
【００３３】
企図される組成物は、血清または間質液のような細胞周囲の培地に存在してもよい。組成物は、化合物が細胞周囲の培地に2〜10 μg/mlの濃度で存在する場合に、細胞へのグルコースの取り込みを増加させる可能性があるとさらに企図される。さらに、細胞または細胞周囲の培地は、栄養または酸素の少なくとも一つが枯渇されていると企図される。「枯渇された」という用語は、通常の適当な細胞が10％未満または特定の栄養（すなわち、グルコース）が15％未満であることを意味する。その上、細胞周囲の培地がL-N-モノ-メチル-L-アルギニンを300 μM/Lの濃度で含む場合、グルコース取り込みの増加は減少すると認識されなければならない。
【００３４】
組成物は、細胞へのグルコースの取り込みの増加を増加させる、または減少させるように改変してもよいとさらに企図される。さらに、組成物は、溶媒中の溶解度、化学的安定性、またはインビボ特異性を増加または減少するように改変してもよいと企図される。
【００３５】
本発明の主題のさらにもう一つの局面において、組成物は、人以外の生物に投与してもよく、特に好ましい代わりの生物には、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ウマ等）およびペット（例えば、イヌ、ネコ、齧歯類、トリ等）が含まれる。意図される組成物に関して上記と同じ検討が適用される。
【００３６】
本発明の主題に係る治療によって、特に肥満、NIDDM、または体重増加に関連したその他の病態を有する人において有意な体重低下が起こる可能性があると特に考えられる。本発明の主題に係る治療は、血中グルコースの低下のみに限定されず、特定の脂質または脂質群の低下が同時に（または単独で）含まれる可能性があると一般的に考えられる。例えば、総コレステロールのわずかな上昇（例えば、220 mg/dl）は、意図される化合物による治療の適応となる可能性がある。または、HDLとLDLとの不均衡（すなわち、LDL＞＞HDL）は、本発明の主題に係る治療を用いて正常となる可能性があると考えられる。同様に、患者における総コレステロールが上昇する必要はないが、トリグリセリドレベルの上昇により意図される方法による治療がなおも必要とされる可能性がある。
【００３７】
用量、投与剤形、および投与経路に関して、500 mgを1日3回毎日経口投与の他にも多くの代わりの経口調製物が存在すると考えられる。例えば、比較的高用量を必要とする場合、用量は500 mg〜5g/日またはそれ以上まで増加してもよい。抽出物の効力が比較的弱い場合、より高い用量をまた必要としてもよい。同様に、低用量（例えば、維持療法）を必要とする場合、または抽出物の効力が比較的高い場合、500 mg〜25 mgまたはそれ未満の1日量が適当である。したがって、他のパラメータの中でも患者の特定の病態および調製物の効力は、適用回数を少なくとも部分的に左右すると一般的には考えられる。例えば、高用量を患者に投与する場合、4〜6回およびそれ以上を含む1日3回を超えるの用量が考えられる。低用量、特に、500 mg/日より低い用量を考慮する場合、1回、2日に1回、またはより少ない投与が適当である。
【００３８】
当然、投与剤形はかなり変化してもよいと認識すべきでもある。例えば、経口投与は錠剤に限定される必要はなく、代わりの経口投与剤は、粉末、ゲルカプセル剤、シロップ剤、ゲル等を含んでもよい。経口投与が望ましくない場合、注射剤、経皮、肺内、または鼻腔内輸送を含む代わりの経路も同様に適当であるとさらに考えられる。
【００３９】
実施例
以下の実施例は、本発明の主題に係る意図される化合物を作製および使用するための様々な実験方法を提供する。実施例1および2はそれぞれ、本発明の主題に係る組成物を作製するための基礎的および改善された方法を記述する。実施例1および2の方法に従って単離された化合物の生物活性を実施例3および4に記載し、実施例5は、タウマチン様蛋白質に対する意図される化合物の特異的結合に関する実験的根拠を提供する。実施例6により、GMNにおける分子の分子量を決定する実験方法が提供される。実施例7により、GMM残留物のクロマトグラフィー画分について実験データが提供され、実施例8によりGMM浸透物のL6筋細胞におけるグルコースの取り込みの増加についての実験的裏付けを提供する。
【００４０】
実施例 1
オオムギの穀粒をビールの醸造の技術分野で周知の方法に従って、麦芽処理した（例えば、「Principles of Brewing Science」、第二版、George J. Fix；醸造出版；ISBN：0937381748、または「The Brewers' Handbook by Ted Goldhammer」；KVP出版；ISBN：0967521203を参照のこと）。麦芽から可溶性物質を抽出して、制御された酵素的変換によってさらなる不溶性の固体を可溶性の物質に変換するために、典型的な醸造のスケジュールに従って、すりつぶした麦芽（水に懸濁）に洗浄段階を続いて適用した。温度サイクルは以下の通りであった：40℃で60分間のインキュベーション、50℃で60分間のインキュベーション、60℃で60分間のインキュベーション、72℃で60分間のインキュベーション、および75〜80℃で60分間のインキュベーション。試料の可溶性部分を殻およびその他の不溶性物質から分離して、凍結乾燥した。
【００４１】
40℃でひきつぶした後に得られた凍結乾燥したオオムギ抽出物を、その成分に分画するための基礎とした。第一の画分は、pH 7.8の50 mM燐酸緩衝液によって平衡にしたDEAEセファセルカラム（2.6×20 cm）を用いる調製用液体クロマトグラフィーによって行った。凍結乾燥試料150 mgを緩衝液10 mlに溶解して、カラムに載せた。直線的NaCl勾配（0〜0.5 M）を流速10 ml/hで流した。画分（各2ml）を回収して、溶出を280 nmでモニターした。DEAEクロマトグラフィーによって、明確な4つの蛋白質ピーク画分が得られた：I−塩基性、II−中性、III−およびIV−酸性。それぞれのピーク画分を回収して、脱塩し、カットオフの孔サイズが1000ダルトンであるメンブレンを用いるメンブレン限外濾過によって濃縮し、濃縮した対応する画分が、酵母の発酵速度に影響を及ぼすか否かを調べた。塩基性画分Iは有意な阻害作用を示したが（すなわち、酵母発酵速度の減少）、残りの3つの濃縮画分はほとんど不活性であった。後に同定できるが（データは示していない）、画分Iにおける主な蛋白質様成分はタウマチン様蛋白質を表す。プールした蛋白質画分I〜IV（すなわち、イオン交換クロマトグラフィーによって得られた画分）のメンブレン限界濾過の際に、いくつかの画分の濾液が、約260 nmでのUV吸収極大を示すLMW（低分子量）物質を含むことが認められた。これらの知見が元となり、本発明者らは、分子ふるいクロマトグラフィーを用いてこれらの画分の蛋白質からこれらのLMW物質を分離した。
【００４２】
その目的のため、DEAE-セファセルカラムI〜IVによる4つの分離された画分をプールして凍結乾燥した。セファデックス（Sephadex）G-75〜50カラム（2.8×80 cm）上で、0.5 M NaClを含むpH 7.8の50 mM燐酸緩衝液によって分子ふるいクロマトグラフィーを行った（流速−12 ml/h、画分2ml、溶出は260 nmで記録）。吸光度が260 nm付近のLMW化合物は比較的高い溶出容量で溶出された。分離された画分に、個々にセファデックスG-75〜50カラム上での分子ふるいを行うと、LMW化合物は、分離終点付近で溶出され、これらは典型的に60〜80番目の画分の間にあった。これらの画分はGMM-1、GMM-2、およびGMM-4と命名された。またこの画分はLMW成分で構成される。
【００４３】
GMM-1、GMM-2、およびGMM-4は全て、酵母の発酵を増強し、タウマチン様蛋白質に強くかつ可逆的に結合し（低塩濃度でタウマチン様蛋白質に結合し、高塩濃度でタウマチン様蛋白質から遊離される）、NIDDMと診断された人における高い血中グルコース濃度および高い血中脂質濃度を低下させた。
【００４４】
実施例 2
麦芽処理したオオムギ粉20 gを水80 mlに懸濁して、室温で一晩攪拌した。懸濁液に0.8 M NaCl溶液120 mlを加えて、攪拌しながら塩抽出を24時間継続した。水性抽出物をセルロースフィルターパッド上で減圧濾過によって懸濁液から分離した。または、クエン酸もしくはその他の緩衝液も同様に、水性抽出物の調製にとって適していると考えられる。
【００４５】
濾過した抽出物を凍結乾燥するか、または減圧蒸発させた。そのようにして得られた乾燥麦芽抽出物（収率約12〜14 g）は、抽出溶媒を起源とするNaCl 5.6 gと水溶性オオムギ成分の複雑な混合物とを含んだ。濾過した凍結乾燥抽出物を、温エタノール50 mlずつ2回にわけて激しく攪拌しながら2時間抽出することによって精製した。エタノール抽出物を濾過して、合わせ、減圧下で蒸発させて油性残査を得た。油性残査を水15 mlに再度溶解して凍結乾燥すると、硬いガラス状の黄色がかった産物が全量で約3g得られた。
【００４６】
ガラス状の黄色がかった産物は酵母の発酵を増強し、タウマチン様蛋白質に強くかつ可逆的に結合し（低塩濃度でタウマチン様蛋白質に結合し、高塩濃度でタウマチン様蛋白質から遊離される）、NIDDMと診断された人における高い血中グルコース濃度および高い血中脂質濃度を低下させた。
【００４７】
このように、意図される組成物は、植物種子が麦芽処理されて（好ましくは約30℃〜65℃の温度で）、抽出物が水性抽出段階（例えば、クエン酸緩衝液のような水性緩衝液を用いて）を含むプロトコールを用いて麦芽処理された植物種子から調製され、抽出物がグルコース濃度を低下させるために有効な濃度で生物に投与される場合に生物におけるグルコース濃度を低下させる、植物の種子抽出物（好ましくはオオムギ由来）を含むことが認識されるべきである。
【００４８】
実施例 3
実施例1からのLMW画分（GMM-1、GMM-2、およびGMM-4）および実施例2からのガラス状の黄色がかった産物の生物活性を、改変ワールブルク法を用いて嫌気条件で醸造酵母発酵速度の定量によってモニターした（Mirsky, N.ら、J. Inorg. Biochem. 13(1)：11〜21（1980）、参照として本明細書に組み入れられる）。
【００４９】
湿った醸造酵母細胞2g（約20％乾燥重量）を発酵培地（pH 5.7の60 mM燐酸緩衝液25 mlおよび5％（w/v）グルコース溶液10 ml）に懸濁させて、実施例1または2からの産物のアリコートを試験のために発酵培地に加えた。インキュベーションは、50 ml発酵フラスコにおいて25℃で60分間行った。発酵速度は生成されたCO2の容積から測定した。調べたLMW画分または実施例2からの産物は全て、約20〜40％の範囲で酵母の発酵速度を増加させたという点において有意な生物活性または生理活性を示した。本明細書において用いられるように、生理活性化合物は、発酵を増加させるまたは減少させる化合物である。さらなる実験において、GMM-2の活性を好気条件で調べた。緩衝液からのNaClと空気中の酸素の複合作用によって酵母発酵が一般的に制限されるにもかかわらず（パスツール効果）、生成されたCO2の相対量は実験に含めた対照と比較して倍加した。嫌気および好気条件でGMM-2画分に関する同等の結果を下記の図6に示す。結果は、酵母の代謝に及ぼす単離されたLMW物質の調節活性を明らかに証明している。
【００５０】
実施例 4
実施例2において得られた産物をNIDDMと診断された人において用いるために調べた。男性25人を外来診療（内分泌科）から募集した。群の平均年齢は51歳で、範囲は36〜74歳であった。カルテをスクリーニングして、インスリンまたは経口血糖降下剤を服用している糖尿病患者を除外した。被験者全員が、試験期間中、その通常の食事習慣と健康関連行動を維持することに同意した。実験的治療は6ヶ月間行った。参加者は、調製物を錠剤として各1,000 mgを1日3回経口投与するように指示された。
【００５１】
被験者全員を、補充前と、試験の種類に応じて試験期間中2週間に1回、または毎月の間隔で、血漿中グルコース、グルコシル化ヘモグロビンHbAc1、トリグリセリドおよびコレステロールに関して調べた。被験者を下記のパターンに従って群にさらに分類した。
【００５２】
血漿グルコース：
血漿グルコースレベルに従って、被験者を効果の差によって3つの群に分類した：I−血漿グルコース濃度8mMol/Lまで；II−8〜10.5 mMol/LおよびIII−10.5 mMol/Lを超える。グリコシル化ヘモグロビン（HbAc1）；HbAc1レベルに従って、被験者を2つの群に分類した：I−修飾ヘモグロビン10％未満およびII−10％以上。治療前後の血糖症に関連する試験結果を図4Aに示す。
【００５３】
さらなる組の臨床試験を上記に概要したものと類似のプロトコールに従って10人のボランティアの人々について実施した。この第二の実験において、血中グルコースを絶食時と食後に90日間にわたって測定し、結果を図4Bに示す。明らかにわかるように、意図される化合物の投与によって、絶食時および／または食後の血中グルコースは少なくとも5％低下し、より典型的に少なくとも10％、および最も典型的に少なくとも20％低下した。同様に、グリコシル化ヘモグロビンのレベルは、意図される化合物の投与後に、少なくとも5％、より典型的に少なくとも20％、および最も典型的に少なくとも50％低下した。
【００５４】
NIDDMと診断された被験者の脂質状態は、血漿中のトリグリセリド、およびコレステロール（総、LDLおよびHDL型として）レベルを調べることによって治療前後に決定した。図5Aおよび5Bに示す試験結果には、糖尿病疾患による脂質代謝の乱れを有する被験者が含まれる。
【００５５】
図5Aに示す被験者の脂質状態には、トリグリセリドの血漿レベル、総コレステロールに対するトリグリセリドの比、およびLDL/HDL比が含まれる。後者の2つの比は、アテローム性動脈硬化症の危険因子として知られている。図5Aからわかるように、意図される化合物の投与によって、トリグリセリドは50％まで低下し、HDLコレステロールに対するトリグリセリドの比は約1〜20％有意に低下し、LDL対HDLコレステロールの比はさらにより劇的に低下した（約40％）。図5Bに示す脂質状態には、意図される化合物および／または組成物の90日間に及ぶ投与後の試験患者10人のさらなる結果が含まれる。
【００５６】
実施例 5
タウマチン様蛋白質は、実施例1および図3に一般的に概要した方法に従って調製した。そのように単離されたタウマチン様蛋白質に、分子量カットオフ約1000ダルトンのメンブレンを用いてメンブレン濃縮器において反復分子ふるいを行った。蛋白質調製物の最初の濾過の第一ラウンド後、緩衝液99 ml（pH 7.8の50 mM燐酸緩衝液、0.5 M NaCl）を残留物（すなわち、タウマチン様蛋白質画分）約1mlに加え、その後同じ緩衝液によって濾過ラウンド3回を行って、残りのGMM化合物（すなわち、本明細書において示した上昇したグルコースを低下させる化合物）をタウマチン様蛋白質調製物から除去した。濾液のUV吸収を260 nmでモニターして、濾液からの試料容積の生物活性を実施例3に概要したプロトコールに従って調べた。そのように調製したタウマチン様蛋白質をNaCl不含緩衝液（pH 7.8の50 mM燐酸緩衝液）を用いるメンブレン濾過によって脱塩し、以下の方法においてさらに用いた。
【００５７】
脱塩したタウマチン様蛋白質溶液（10 mg/ml）1mlに、GMM-1溶液（1mg/ml）1.0 mlを加え、混合物を室温で2時間インキュベートした。2時間後、pH 7.8の50 mM燐酸緩衝液98 mlを混合物に加えて、未結合のGMM-1を、緩衝液によるその後の限外濾過3ラウンド（各ラウンドは容積で1：100希釈）によって除去した。
【００５８】
GMM-1が結合したタウマチン様蛋白質を試料1とした。次に、試料1に溶媒としてpH 7.8の50 mM燐酸緩衝液、0.5 M NaClを用いセファデックスG-75カラムを用いて、分子ふるいクロマトグラフィーを行ったところ、低分子量画分が、吸光度280 nmのタウマチン様蛋白質の高分子量画分から分離されて吸光度260 nmで溶出された。低分子量画分を濃縮して、脱塩し、全量を1.0 mlにして、これを試料2とした。次に、試料1および2を実施例3に概要する方法を用いて生物活性に関して調べた。試料1は、発酵速度を増加させなかったが、試料2は、好気的および嫌気的実験条件の双方において発酵速度を有意に増加させ、それによって、タウマチン様蛋白質に対するGMM-1の可逆的結合が明らかに示された。同じ方法をGMM-2およびGMM-4について繰り返した。得られた結果は、示したGMM-1実験と類似であった。
【００５９】
このように、生物におけるグルコース濃度を低下させるための組成物および方法の特定の態様および適用を開示している。しかし、既に記載したそれら以外にもより多くの改変は、本明細書に記載した本発明の概念を逸脱することなく実施可能であることは、当業者に明らかであるはずである。したがって、本発明の主題は、添付の意図される特許請求の範囲の真意以外に制限されない。その上、明細書および意図される特許請求の範囲の双方を解釈する場合、全ての用語は、本文と一致するように可能な限り最も広い意味で解釈されるべきである。特に、「含む（comprise）」および「含む（comprising）」という用語は、要素、成分または段階を非排他的に言及すると解釈されるべきであり、言及された要素、成分、または段階は、表現として言及されていないその他の要素、成分または段階と共に存在、使用または組み合わせてもよいことを示している。
【００６０】
実施例 6
GMMは、活性なGMM成分の分子量分布を決定するため、および活性成分を精製して濃縮するために透析した。試験管一本あたりGMM調製物3 gの部分について、一連の実験を行った。GMM試料を水40 mlに溶解して、水500 mlに対して24時間透析した。分離をよりよくするために、24時間後に外部の水を新しい水に交換した。外部の水の部分を合わせて、真空で濃縮して遠心し、蒸発乾固させると、浸透物が得られた。透析チューブの内容物を遠心して、真空で蒸発乾固させると残留物が得られた。
【００６１】
浸透物対残留物の百分率比は58.5：25.1であり、16.4は残留物および浸透物の双方からの不溶性材料に相当した。不溶性部分は廃棄した。
【００６２】
酵母の発酵における二つの可溶性画分の速度論（作用速度）を図7に示す。図7は、GMMには少なくとも二つのタイプの活性化合物が存在することを示している。これらの二つのタイプには以下が含まれる：発酵プロセスが進行するにつれて活性が増加する高分子量（HMW、残留物）物質（複数）および発酵プロセスが進行するにつれて初期活性が減少する（複数の）低分子量（LMW、浸透物）物質。さらに、浸透物の速度論は残留物の活性と重なり合う。これは、透析チューブの孔径が非選択的であるために、残留物成分が孔を通して部分的に通過できる可能性があったためである可能性がある。この現象は、繰り返し透析サイクルにおいて繰り返された。結果は、浸透物化合物の分子量がほぼ2,000ダルトンであることを示している。
【００６３】
その上、残留物の活性によって、対照を超えて44％の範囲の酵母バイオマスの有意な増加が得られる。この結果は、残留物GMM画分が細胞の複製に至る遺伝子レベルで作用するのに対し、浸透物GMM画分はおそらく、インスリン非依存的経路におけるグルコース取り込みを増強することによってその作用を発揮することを示している可能性がある。
【００６４】
実施例 7
実施例6からの残留物産物に、2×80 cmのカラムでセファデックスG-75-50によって、50 mM燐酸緩衝液、pH 7.8を用いてゲル浸透クロマトグラフィーを行った。GMM/R試料40〜50 mgを緩衝液に溶解した。溶出物を分画回収器において15分間隔で分画して、1.5 mlの画分を得た。溶出は、280 nmでの分光光度計での測定によって追跡した。
【００６５】
酵母活性試験を、重量分析法より簡便な気圧分析法を用いて行った。試験は対照と平行して同時に実施した。溶出画分を連続して三つの部分にプールした：区画1−画分17〜50；区画2−画分51〜60；および区画3−画分61〜70。
【００６６】
図8に示すように、画分17〜50の一部を用いて酵母の活性に関して試験した。図8における活性成分は活性が遅れて発現することを特徴とした。図8の溶出パターンの初期の位置は、画分17〜50の成分の大きさが12,000ダルトン以上であったことを示している。画分17〜50の残っている一部を、カットオフ12,000ダルトンの透析チューブにおいて水に対して透析した。チューブに保持された内容物を酵母活性に関して分析したところ、比較的強い阻害を示し、このことは、分子量2000〜12,000ダルトンの活性成分が存在することを示している。
【００６７】
画分51〜60の少量も同様に酵母活性に関して調べ、早期の活性発現が得られた。さらに、画分61〜70の少量を酵母活性に関して調べたところ、三つの画分の中で最も強い阻害作用が得られた。これらのデータは、図に示していない。
【００６８】
次に、溶出した画分を五つの連続区画でプールした：
区画1−画分18〜32
区画2−画分33〜46
区画3−画分47〜56
区画4−画分57〜61
区画5−画分61〜80
【００６９】
区画を酵母活性に関してさらに分析した。画分19〜32は、図10に示されるように活性が遅れて発現することを示した。結果は画分19〜32が20,000ダルトンを超える高い分子量を有する可能性があることを示している。醸造オオムギ抽出物におけるマッチする蛋白質は、GPクロマトグラフィーにおいて同じ位置に溶出する。その蛋白質は、抽出物には大量に存在せず、これはカットオフ12,000ダルトンのチューブによる透析によってその活性を放出しないことから、12,000ダルトンを超える分子量を有する。二つの主要な蛋白質の酵母活性プロフィールを、図10に比較して示す。
【００７０】
画分33〜46および画分47〜56を酵母活性に関して調べたところ、阻害作用を示した。
【００７１】
画分57〜61の酵母活性を調べたところ、図8および9に示すように早期の活性発現を示した。この蛋白質の位置は、265 nmでUV吸収リガンドを有することが知られている醸造オオムギのHL-蛋白質の位置と一致する。HL-蛋白質は、濃度0.5 Mで塩の存在下でそのリガンドを放出することが、過去の試験から示されている。HL-蛋白質は分子量14,000ダルトンを有する。図9は、HL-蛋白質の同等の酵母発酵活性および画分57〜61でGMMのそのマッチする成分を示す。試験におけるHL-蛋白質の量は、5 mgもの低さであった。
【００７２】
このように、ゲル浸透サイズ排除によるGMM残留物のクロマトグラフィーによる分画化によって、GMM調製物に高分子種が存在することが明らかとなり、そのほとんどが蛋白質であった。GMM残留物における蛋白質のいくつかは、酵母発酵に対して有意な阻害作用を示した。二つの高分子成分は、明白な酵母発酵活性と共に検出された。活性のピークは、溶出パターンの最初の部分に存在し、これは、カットオフ12,000ダルトンの透析膜を通過する分子種に属した。
【００７３】
実施例 8
GMMの浸透物部分を、L6筋細胞におけるグルコース取り込みに関して試験した。L6細胞は、1 mMグルタミン、1 mMピルビン酸塩および25 mMグルコースを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において単層として増殖させた。培地には5％仔ウシ胎児血清（FCS）を添加した。実験は、コンフルエント前のフラスコから細胞50,000個/ウェルを播種した48ウェルプレートにおいて行った。細胞をコンフルエンスまで増殖させて、培地を0.5％FCSおよび2.5 mMグルコース（L6 Myo培地）を含むDMEMに少なくとも76時間変更して、L6細胞の分化およびL6筋管の形成を誘導した。次に、筋管を試験物質と共に30分間インキュベートした−Fryerら（「Activation of glucose transport by AMP-activated protein kinase via stimulation of Nitric oxide synthase」、Diabetes 49（12）、1978〜85、2000、Fryer LGDら）によって記述される、プロトコールSMM、または20 mM HEPESおよび2 mMグルコースを含むが血清を含まないダルベッコPBS−血清不含培地（SFM）プロトコール。
【００７４】
次に、2-NBDG 30 μMを22℃で2分間添加した。その後細胞培養培地を除去して細胞を冷DPBSによって2回洗浄した。次に、細胞を0.5％SDS中で溶解した。水2 mlにおいて細胞溶解物100 μlを用いて466/542 nm（励起／発光）で蛍光を測定した。
【００７５】
図11において、血清不含培地（DPBS）においてインスリンを処置したL6細胞は、40〜50％までのグルコース取り込みの増加に反応した。しかし、0.5％FCSを添加した培養培地（SSM）においてインスリンによってL6を処置すると、グルコースの取り込みは平均で100〜120％増加した。これらの結果は、筋細胞が血清の存在下でインスリンに対してより感受性があることを示唆する可能性がある。
【００７６】
図12は、L6細胞におけるグルコース取り込みに及ぼす浸透物の影響を示す。細胞を培養して、Fryerらに記述されるように、L6 Myo培地（SSM）−SSMプロトコールまたは血清不含培地（SFM−20 mM Hepes、2 mMグルコースを含むDPBS）−SFMプロトコールにおいて処置した。グルコースの取り込みは、22℃で2-NBDG 30 μMを2分間添加することによって測定した。実験は1試料あたり2個ずつ行った。
【００７７】
図13は、グルコース取り込みの刺激に及ぼすAICAの影響およびグルコース取り込みの阻害に及ぼすL-NMMAの影響を示す。類似の効果が、Fryerら（「Activation of glucose transport by AMP-activated protein kinase via stimulation of Nitric oxide synthase」、Diabetes 49（12）、1978〜85、2000、Fryer LGDら）によって記述されている。浸透物細胞をDPBSにおいてL-NMMAによって予め30分間処置した後、AICAによって30分間処置した。グルコースの取り込みは22℃で2分間処置した後に測定した。
【００７８】
一般的に、骨格筋におけるグルコースの輸送は、二つの異なる刺激、すなわちインスリンと運動によって刺激される。最近、AMP活性化蛋白質キナーゼ（AMPK）が骨格筋の運動によって活性化されることが示されている。AICAR（5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシド）によってAMPKを薬理学的に活性化すると、グルコースの取り込みの増加が起こる。興味深いことに、骨格筋細胞をL-N-モノ-メチル-L-アルギニン（L-NMMA）またはL-N-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル（L-NAME）のような酸化窒素シンターゼ（NOS）阻害剤によって処置すると、AMPKの活性化後のグルコース輸送の増加が完全に遮断される。
【００７９】
図14に示す試験ではAICARが市販されていないため、AICAを用いた。AICAはAICARの前駆体であり、これは骨格筋においてAICARに代謝されてグルコースの取り込みを増加させる。
【００８０】
L-NMMAは、L6細胞におけるGMM誘導型グルコース輸送がNOS阻害剤によって阻害されるか否か、このようにグルコース輸送の増加に関するAICAR-誘導メカニズムを模倣するか否かを確認するために実験において用いられている。Fryerの実験の設定を採用したが、これはDPBSにおいて細胞を阻害剤と共に30分間前処置した後、グルコース取り込みを行う前に、AICARのようなアゴニストと共に、またはわれわれの場合ではGMMと共に37℃でさらに30分間処置することからなった。
【００８１】
図14において、グルコース取り込みに及ぼすAICA作用の阻害のために用いた濃度と同じ濃度で、浸透物によるグルコースの取り込みがL-NMMAによって阻害されうるか否かを決定するために、浸透物細胞を調べた。図14は、L-NMMAが、インビトロでL6筋細胞におけるグルコース取り込みの増加に及ぼす浸透物の作用を阻害することを示している。L6細胞は、DPBSにおいてL-NMMAによって30分間前処置した後GMMのみを処置するか、または阻害剤を処置した細胞にGMMをさらに30分間加えた。グルコースの取り込みは22℃で2分間測定した。
【００８２】
図14の結果によれば、濃度300 μMのL-NMMAによってL6細胞を前処置すると、これらの実験条件においてGMM誘導グルコース輸送が遮断される。GMMは、AICARと同様にAMPK経路を通して作用することを示唆する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】本発明の主題に係る血中グルコース濃度を低下させる例示的な方法を示す流れ図である。
【図２】本発明の主題に係る細胞を処理する例示的な方法を示す流れ図である。
【図３】意図される化合物とタウマチン様蛋白質の例示的な調製を示す図である。
【図４】図4Aは、本発明の主題に従って意図される組成物を用いた場合のボランティアの人々における血中グルコース濃度の低下を示す表である。図4Bは、本発明の主題に従って意図される組成物を用いた場合のボランティアの人々における血中グルコース濃度の低下を示すもう一つの表である。
【図５】図5Aは、本発明の主題に従って意図される組成物を用いた場合のボランティアの人々における血中脂質濃度の低下を示す表である。図5Bは、本発明の主題に従って意図される組成物を用いた場合のボランティアの人々における血中脂質濃度の低下を示すもう一つの表である。
【図６】嫌気性および好気性条件で意図される化合物と共にインキュベートした酵母の発酵速度を示すグラフである。
【図７】透析後のGMM試料の残留物（高分子量）および浸透物（低分子量）の時間ごとの中間活性を示す表である。
【図８】GMM試料の残留部分からの溶出物の画分を示すグラフである。
【図９】GMM試料の残留部分からの溶出物の画分を示すもう一つのグラフである。
【図１０】GMM試料の残留部分からの溶出物の画分を示すもう一つのグラフである。
【図１１】血清不含および血清添加培地においてインスリンを処置したL6細胞を示すグラフである。
【図１２】L6細胞におけるグルコースの取り込みに及ぼすGMM試料の浸透部分の影響を示すグラフである。
【図１３】グルコースの取り込みに及ぼすAICA、L-NMMA、およびAICAR＋L-NMMAの影響を示すグラフである。
【図１４】グルコースの取り込みに及ぼすGMM試料の浸透部分の影響と浸透物部分＋L-NMMAの影響とを示すグラフである。【Technical field】
[0001]
This application claims priority to International Patent Application No. PCT / US01 / 07527, filed March 8, 2001, which is incorporated by reference in its entirety.
[0002]
Field of Invention
The field of the invention is food supplements and related methods.
[Background]
[0003]
Background of the Invention
Elevated blood glucose and blood lipids are a relatively common underlying condition in many diseases and can occur in a variety of ways. Among other causes, elevated blood glucose levels are often facilitated by metabolic changes associated with the diabetic condition, often in conjunction with synthetic oral antidiabetic drugs such as metformin, sulfonylureas, etc. Insulin treatment is included. Despite some clinical parameters improving in people with elevated blood lipids and blood glucose (ie, at least some reduction in blood glucose), various side effects including insulin resistance, allergic reactions, etc. May be caused by long-term treatment with
[0004]
Another treatment for diabetes, especially non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM), is often based on yeast, or derivatives of yeast. Yeast can be grown in the presence of chromium salts, and the yeast cells or yeast extract so grown are compounds that are known to enhance the biological action of insulin, “Glucose Tolerance Factor ( GTF) ”is particularly abundant. Some yeast preparations help reduce elevated blood glucose levels, but in many cases, significant amounts of yeast preparations must be ingested for a significant period to improve hyperglycemia Don't be. Moreover, long-term use of yeast preparations over a long period tends to be problematic in some patients, especially if the patient has a history of yeast infection. Still further, many crude yeast preparations are bitter and may be uncomfortable in some patients.
[0005]
To alleviate at least some of the problems associated with yeast preparations, concentrated, bitter-free, lyophilized yeast preparations have been developed. Such preparations are typically in tablet form and can be conveniently ingested with meals. However, relatively high processing of such cells / extracts can reduce the biological activity of the yeast preparation. Moreover, preservatives and additives (eg, for compressing or otherwise shaping tablets) are typically required to maintain at least some antihyperglycemic activity.
[0006]
In still other methods of reducing blood glucose based on non-insulin, chromium picolinate may be administered. Chromium picolinate has been reported to be moderately effective in reducing elevated blood glucose in humans. However, chromium picolinate is quite toxic and may therefore be generally considered unsafe.
[0007]
Various methods for lowering high blood glucose levels are known in the art, but all or almost all of them have one or more disadvantages. Accordingly, there is a need to provide improved compositions and methods that still reduce glucose concentrations.
DISCLOSURE OF THE INVENTION
[0008]
Summary of the Invention
The present invention is directed to compositions and methods for reducing glucose concentration in an organism.
[0009]
In one aspect of the present inventive subject matter, the composition is isolated from a plant, has AICAR activity, and increases glucose uptake into cells. It is preferred that the composition is insulin independent. The composition also preferably has a molecular weight of only 2000 and a maximum absorption of UV light at about 260 nm. More preferably, the composition is present in the medium surrounding the cell at a concentration of about 2-10 μg / ml, and the medium surrounding the cell is depleted of at least one of nutrients and oxygen. It is contemplated that the cell is a muscle cell or part of an in vivo tissue such as liver tissue, skeletal muscle tissue, pancreatic tissue, or adipocyte tissue.
[0010]
In another aspect of the present inventive subject matter, the compound is identical to a molecule isolated from barley (Hordeum vulgare), has AICAR-like activity, increases glucose uptake into cells and is isolated from barley The resulting molecules reduce blood glucose in an organism when the molecule is administered at a concentration effective to reduce the glucose concentration. The compounds are preferably synthesized in vitro and are preferably modified to increase or decrease at least one of the following: increased glucose uptake into cells; solubility in solvents; chemical stability And in vivo specificity.
[0011]
In a third aspect of the present inventive subject matter, the compound is a non-insulin compound that has AICAR-like activity and activates AMPK in the cell. The compound is preferably isolated from the seed of a barley plant. Similarly, when the compound is present in the medium surrounding the cells at a concentration of 2-10 μg / ml, it is preferred to increase glucose uptake in an insulin-independent manner. More preferably, the increase in glucose uptake is reduced when the medium contains L-N-mono-methyl-L-arginine at a concentration of 300 μM / L.
[0012]
In a further aspect of the present inventive subject matter, a method of treating a cell is effective for modulating at least one of identifying, mobilizing, excretion, or synthesizing a cell having a condition that activates AMPK. It is contemplated that the step of presenting the cell with a compound having AICAR-like activity at a concentration is included.
[0013]
Various objects, features, aspects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of preferred embodiments of the invention.
[0014]
Detailed description
In FIG. 1, a method 100 for reducing glucose concentration in an organism has a step 110 in which a composition comprising a compound that binds to a thaumatin-like protein is provided. In a subsequent step 120, the composition is administered to the mammal at a dose effective to reduce blood levels of glucose.
[0015]
As used in the present invention, the term “compound that binds to thaumatin-like protein” means at least 10 times, more preferably at least 100, more than thaumatin-like protein from barley compared to binding to other barley proteins. Means any compound or mixture of compounds exhibiting double the binding selectivity, the binding of the intended compound to the thaumatin-like protein is preferably KD10-3 Less than M, more preferably 10-Four It is considered to be less than M. The binding mode need not be limited to a single interaction (eg, hydrophobic interaction), but may include multiple interactions (eg, electrostatic interaction and hydrogen bonding). It is particularly contemplated that the binding is reversible, but irreversible binding is not excluded. A thaumatin-like protein from barley is a generally preferred binding partner for the compounds according to the present subject matter, but thaumatin-like proteins from other sources including microorganisms, plants, and animals are equally contemplated. Thaumatine-like proteins are a well-characterized class of polypeptides, such as Cvetkovic et al. (J. Serb. Chem. Soc. 62 (9): 777, all of which are incorporated herein by reference. -786 (1997)), Cvetkovic et al. (J. Serb. Chem. Soc. 62 (1): 51-56 (1997)), and Cvetkovic et al. (J. Inst. Brew. 103: 183-186 (1997)) It is described in.
[0016]
Similarly, as used herein, the term “increased glucose concentration” means a concentration that is above the clinical range considered normal (ie, 110 mg / dl or higher). Similarly, the term “increased lipid concentration” means blood lipid concentration above the clinical range considered normal.
[0017]
In FIG. 2, the method 100 for treating a cell has a stage 110 in which the cell has a state of activating AMPK (adenosine 5′-monophosphate activated protein kinase). In subsequent step 120, the cell is presented with a compound having AICAR-like activity at a concentration effective to modulate at least one of molecular uptake, excretion, and synthesis.
[0018]
The term AICAR means 5'-aminoimidazole-4-carboxamide 1-ribonucleotide. As used herein, the terms “AICAR-like activity” and “5′-aminoimidazole-4-carboxamide 1-ribonucleotide” refer to non-insulin to L-6 myocytes that are inhibited by L-NMMA. It means any activity that stimulates dependent glucose uptake but does not contain AICA, AICAR, or glucose. Similarly, contemplated compounds do not include tocol or tocotriene compounds. As used herein, the term “L-NMMA” refers to the acetate of NG-methyl-L-arginine, an inhibitor of nitric oxide synthase (NOS). AMPK has known metabolic regulatory effects on fatty acid and hydrocarbon metabolism in the liver, adipocyte tissue, pancreatic β cells, and skeletal muscle. AMPK is known to increase glucose uptake, increase fatty acid oxidation in skeletal muscle, increase fatty acid oxidation, decrease cholesterol synthesis, and decrease lipid formation in the liver. Furthermore, AMPK is known to regulate insulin secretion in islets.
[0019]
The composition is contemplated as an agent or nutrient for treating diabetes. In a preferred aspect of the present inventive subject matter, the composition is prepared from barley (as outlined in the examples below) and 1 500 mg each for persons diagnosed with non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM). Orally administered 3 times a day. Thus, particularly preferred compositions include compounds that bind to thaumatin-like proteins and reduce the glucose concentration in the organism when the compound is administered to the organism at a concentration effective to reduce the glucose concentration. It is.
[0020]
In another aspect of the present subject matter, suitable compositions and compounds need not be limited to preparations from barley, but may include preparations from various plants other than barley, and are specifically contemplated. Other plants include barley species and gramineous plants. The intended composition and / or compound preparation is preferably derived from a plant extract, but the intended composition and / or compound may also be bound in a living organism by binding the intended compound to a thaumatin-like protein. As long as the glucose concentration is reduced, it may be isolated from microorganisms (ie bacteria, fungi, yeast, unicellular eukaryotes) or animals.
[0021]
In contemplated embodiments of the present inventive subject matter, contemplated compositions are identical to, or derivatives of, molecules isolated from barley. Derivatives can be conveniently developed to address the problems of bioavailability, targeting and other specificity, efficacy, and toxicity reduction. In addition, it is contemplated that the molecule may be isolated from barley by any method including malting, charging, salt extraction, buffer extraction, ethanol extraction, anion exchange chromatography, and molecular sieving. Still further, it is contemplated that the molecule is isolated from any part of the barley or barley plant seed. The molecules are preferably isolated from malted seeds of barley.
[0022]
In yet another aspect, it should be appreciated that the intended compound may be isolated, purified to homogeneity, and the structure may be elucidated. As a result, it should be appreciated that the intended compounds and / or compositions may be synthesized (modified) or partially synthesized / modified in vitro. For example, if the intended compound is partially synthesized, precursors of the intended compound may be isolated from plants or microorganisms, and then one or more steps are performed to reach the intended compound. May be. Alternatively, the intended compound may be modified in one or more steps to impart particularly desirable physicochemical properties. For example, a contemplated compound may be esterified with a polar compound (eg, polyethylene glycol) to increase water solubility. In another example, the contemplated compound may be coupled to a resin or other material to control the release rate to the organism.
[0023]
Preferred intended compounds have a relatively low molecular weight, typically only 2000 Da, but the molecular weight varies considerably, the origin from which the compound is isolated, synthetic modifications, dimer formation, and multimer formation It should be recognized that it depends greatly on Similarly, suitable compounds need not be limited to compounds having a UV absorption maximum at about 260 nm (characteristic for the intended compounds isolated using the methods outlined below), UV260Various optical features other than the peak are equally suitable. Similarly, intended compounds isolated from barley are soluble in lipophilic solvents at a concentration of at least 10 mg / ml, although higher or lower solubility is also contemplated as well, typically It is believed that the intended compound depends on the source from which it was isolated and / or further chemical modifications of the intended compound. As used herein, the term “lipophilic solvent” includes all solvents having a miscibility with water of less than 10% by volume.
[0024]
It is generally preferred that the intended compound be chemically substantially pure (ie the concentration of the intended compound is greater than 90% by weight, preferably greater than 95% by weight, most preferably 99% by weight. It should also be recognized that the intended compound may be coupled to one or more molecules, and that the specifically contemplated molecules include thaumatin-like proteins. Thus, intended compositions include complexes of the intended compound with a thaumatin-like protein, in particular a complex of the intended compound and a thaumatin-like protein isolated from a suitable source. Included (below).
[0025]
With respect to glucose concentration, it is generally intended that the glucose concentration is the blood glucose concentration. However, further contemplated glucose concentrations include those that are covalently or non-covalently bound to molecules found in vivo, and other specifically contemplated glucose concentrations include glycosylated protein concentrations. (Eg glycosylated hemoglobin or collagen).
[0026]
Suitable thaumatin-like proteins are generally considered to be isolated from barley, but alternative thaumatin-like proteins are considered as well, and microorganisms, plants that may or may not be expressed in a recombinant system And thaumatin-like proteins isolated from animals. There are various protocols for the isolation of thaumatin-like proteins known in the art (eg, Barrre et al., “Purification and structural analysis of an abundant thaumatin-like protein from ripe banana fruit”, Planta 2000, November; 211 (6): 791-9); Oh et al. ("Isolation of a cDNA encoding a 31-kDa, pathogenesis-related 5 / thaumatin-like (PR5 / TL) protein abundantly expressed in apple fruit.", Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000, February; 64 (2): 355-62); Tattersall et al., “Identification and characterization of a fruit-specific, thaumatin-like protein that accumulates at very high levels in conjunction with the onset of sugar accumulation and berry softening in grapes ", Plant Physiol. 1997, July; 114 (3): 759-69), all known protocols are considered suitable for use with the disclosure presented herein.
[0027]
The intended composition not only reduces the increase in blood glucose levels in people suffering from NIDDM, but also increases blood glucose levels for reasons other than NIDDM, including obesity, dietary effects, etc. It should be particularly recognized that blood glucose levels in can also decrease. Persons with or without NIDDM are particularly considered to have a blood glucose concentration of at least 90 mg / dl, more preferably at least 120 mg / dl, and most preferably at least 200 mg / dl.
[0028]
Furthermore, the contemplated compositions have also been shown to conveniently reduce elevated blood lipid levels (below), in which blood lipids include triglycerides, fatty acids, HDL-cholesterol, and LDL, among others. It is further contemplated that cholesterol is included and that the reduction in blood lipids may occur simultaneously with the reduction in blood glucose levels or may be independent of the reduction in blood glucose levels.
[0029]
In a further aspect of the present inventive subject matter, the contemplated composition further comprises a composition known to lower blood lipid levels and / or a composition known to lower blood glucose levels. It should be appreciated that an active or inactive ingredient may be further included. For example, an alternative composition may include at least one of tocols, vitamins, and / or mineral preparations, GTF, metformin, sulfonylureas, and the like. Inactive ingredients include bulking agents, colorants, stabilizers and the like.
[0030]
Thus, a person whose elevated blood glucose concentration is about 150 mg / ml and whose elevated blood total cholesterol concentration is 280 mg / ml or higher (eg, a person diagnosed with NIDDM) An exemplary method of treating has a stage in which the intended composition is provided. In a further step, the composition is administered to the person at a dose effective to reduce the glucose concentration.
[0031]
With respect to blood glucose levels, the treatment according to the present subject matter need not be limited to blood glucose levels of about 150 mg / dl, but this also means that many glucose concentrations above 70-110 mg / dl May be needed in Without wishing to be bound by any particular theory or mechanism, it is believed that the reduction in blood glucose levels may be due to enhanced glucose uptake into cells. However, it should be noted that the composition according to the present inventive subject matter is a non-GTF composition. The duration of the intended treatment may vary significantly, and a suitable period may be within the scope of a single dose, as well as defaults including one week, weeks, months, and even years It may be a period. As a result, it should be appreciated that the compositions according to the present inventive subject matter may also be administered prophylactically to a person to prevent hyperglycemia, or some form of dyslipidemia.
[0032]
In yet a further aspect of the invention, contemplated compositions increase glucose uptake into cells. It is contemplated that the cell may be any cell or plant part, including muscle cells. It is further contemplated that the cells may be either insulin dependent or insulin independent. The contemplated tissue is preferably in vivo and may include liver tissue, skeletal muscle tissue, pancreatic tissue and adipocyte tissue. More preferably, the cells are muscle cells and are insulin independent.
[0033]
The contemplated composition may be present in a pericellular medium such as serum or interstitial fluid. It is further contemplated that the composition may increase glucose uptake into cells when the compound is present in the medium surrounding the cells at a concentration of 2-10 μg / ml. Furthermore, it is contemplated that the cell or the medium surrounding the cell is depleted of at least one of nutrients or oxygen. The term “depleted” means less than 10% of normal suitable cells or less than 15% of a particular nutrient (ie glucose). Moreover, it must be recognized that the increase in glucose uptake decreases when the pericellular medium contains L-N-mono-methyl-L-arginine at a concentration of 300 μM / L.
[0034]
It is further contemplated that the composition may be modified to increase or decrease an increase in glucose uptake into the cell. Further, it is contemplated that the composition may be modified to increase or decrease solubility in a solvent, chemical stability, or in vivo specificity.
[0035]
In yet another aspect of the present subject matter, the composition may be administered to non-human organisms, and particularly preferred alternative organisms include livestock (eg, cows, pigs, horses, etc.) and pets (eg, Dogs, cats, rodents, birds, etc.). The same considerations apply as for the intended composition.
[0036]
It is particularly believed that treatment according to the subject matter of the present invention can cause significant weight loss, particularly in people with obesity, NIDDM, or other conditions associated with weight gain. It is generally believed that treatment according to the present subject matter is not limited to only lowering blood glucose, but may include simultaneously (or alone) the reduction of a particular lipid or group of lipids. For example, a slight increase in total cholesterol (eg, 220 mg / dl) may be indicated for treatment with the intended compound. Alternatively, it is believed that an imbalance between HDL and LDL (ie, LDL >> HDL) may become normal with the treatment according to the present subject matter. Similarly, total cholesterol in a patient need not be elevated, but treatment with the intended method may still be required due to elevated triglyceride levels.
[0037]
Many alternative oral preparations exist in addition to oral administration of 500 mg three times daily, with regard to dose, dosage form, and route of administration. For example, if a relatively high dose is required, the dose may be increased from 500 mg to 5 g / day or more. Higher doses may also be required if the efficacy of the extract is relatively weak. Similarly, a daily dose of 500 mg to 25 mg or less is appropriate if a low dose (eg, maintenance therapy) is required or if the extract is relatively potent. Thus, it is generally believed that the patient's particular condition and the efficacy of the preparation, among other parameters, will at least partially determine the number of applications. For example, if a high dose is administered to a patient, more than 3 doses per day, including 4-6 times and more, are contemplated. When considering low doses, especially lower than 500 mg / day, administration once, every two days or less is appropriate.
[0038]
Of course, it should also be recognized that the dosage form may vary considerably. For example, oral administration need not be limited to tablets; alternative oral dosage forms may include powders, gel capsules, syrups, gels, and the like. Where oral administration is not desired, alternative routes including injection, transdermal, pulmonary, or intranasal delivery are also considered appropriate.
[0039]
Example
The following examples provide various experimental methods for making and using the contemplated compounds according to the present inventive subject matter. Examples 1 and 2 each describe basic and improved methods for making compositions according to the present inventive subject matter. The biological activities of the compounds isolated according to the methods of Examples 1 and 2 are described in Examples 3 and 4, and Example 5 provides an experimental basis for the specific binding of the intended compound to a thaumatin-like protein. . Example 6 provides an experimental method for determining the molecular weight of molecules in GMN. Example 7 provides experimental data for the chromatographic fraction of GMM residues, and Example 8 provides experimental support for increased glucose uptake in L6 myocytes by GMM permeate.
[0040]
Example 1
Barley kernels were malted according to methods well known in the art of beer brewing (eg, “Principles of Brewing Science”, Second Edition, George J. Fix; Brewing Publishing; ISBN: 0937381748, or “The Brewers 'Handbook by Ted Goldhammer'; published by KVP; ISBN: 0967521203). Washing step into ground malt (suspended in water) according to typical brewing schedule to extract soluble material from malt and convert further insoluble solids into soluble material by controlled enzymatic conversion Was subsequently applied. The temperature cycle was as follows: 40 ° C for 60 minutes incubation, 50 ° C for 60 minutes incubation, 60 ° C for 60 minutes incubation, 72 ° C for 60 minutes incubation, and 75-80 ° C for 60 minutes Incubation. The soluble portion of the sample was separated from the shell and other insoluble materials and lyophilized.
[0041]
The lyophilized barley extract obtained after grinding at 40 ° C. served as the basis for fractionation into its components. The first fraction was performed by preparative liquid chromatography using a DEAE Sephacel column (2.6 × 20 cm) equilibrated with 50 mM phosphate buffer at pH 7.8. 150 mg of lyophilized sample was dissolved in 10 ml of buffer solution and loaded on the column. A linear NaCl gradient (0-0.5 M) was run at a flow rate of 10 ml / h. Fractions (2 ml each) were collected and elution was monitored at 280 nm. DEAE chromatography gave four distinct protein peak fractions: I-basic, II-neutral, III- and IV-acidic. Each peak fraction was collected, desalted, and concentrated by membrane ultrafiltration using a membrane with a cut-off pore size of 1000 Daltons, and the corresponding corresponding fractions affected the yeast fermentation rate. It was investigated whether it exerted. Basic fraction I showed a significant inhibitory effect (i.e. reduced yeast fermentation rate), while the remaining three concentrated fractions were almost inactive. Although it can be identified later (data not shown), the main protein-like component in fraction I represents a thaumatin-like protein. During membrane ultrafiltration of pooled protein fractions I-IV (ie, fractions obtained by ion exchange chromatography), several fractions of the filtrate show an LMW with a maximum UV absorption at approximately 260 nm. It was found to contain (low molecular weight) substances. Based on these findings, the present inventors separated these LMW substances from the proteins of these fractions using molecular sieve chromatography.
[0042]
For that purpose, the four separated fractions from DEAE-Sephacel columns I-IV were pooled and lyophilized. Molecular sieve chromatography was performed on a Sephadex G-75-50 column (2.8 x 80 cm) with 50 mM phosphate buffer at pH 7.8 containing 0.5 M NaCl (flow rate-12 ml / h, fractionation). Min 2ml, elution recorded at 260nm). The LMW compound having an absorbance near 260 nm was eluted with a relatively high elution volume. When the separated fractions are individually screened on a Sephadex G-75-50 column, the LMW compounds are eluted near the separation endpoint, which is typically the 60-80th fraction. It was in between. These fractions were named GMM-1, GMM-2, and GMM-4. This fraction is composed of LMW components.
[0043]
GMM-1, GMM-2, and GMM-4 all enhance yeast fermentation and bind strongly and reversibly to thaumatin-like proteins (binding to thaumatin-like proteins at low salt concentrations and thaumatin at high salt concentrations). Released from a protein like protein), decreased high blood glucose levels and high blood lipid levels in people diagnosed with NIDDM.
[0044]
Example 2
20 g of malted barley flour was suspended in 80 ml of water and stirred overnight at room temperature. 120 ml of 0.8 M NaCl solution was added to the suspension, and salt extraction was continued for 24 hours with stirring. The aqueous extract was separated from the suspension by vacuum filtration on a cellulose filter pad. Alternatively, citric acid or other buffers may be suitable for the preparation of aqueous extracts as well.
[0045]
The filtered extract was lyophilized or evaporated under reduced pressure. The dry malt extract so obtained (yield about 12-14 g) contained 5.6 g NaCl originating from the extraction solvent and a complex mixture of water-soluble barley ingredients. The filtered lyophilized extract was purified by extracting in 50 ml portions of warm ethanol in two portions with vigorous stirring for 2 hours. The ethanol extracts were filtered, combined and evaporated under reduced pressure to give an oily residue. When the oily residue was redissolved in 15 ml of water and lyophilized, about 3 g of a hard glassy yellowish product was obtained in total.
[0046]
The glassy yellowish product enhances yeast fermentation and binds strongly and reversibly to thaumatin-like proteins (binding to thaumatin-like proteins at low salt concentrations and released from thaumatin-like proteins at high salt concentrations) Reduced high blood glucose levels and high blood lipid levels in people diagnosed with NIDDM.
[0047]
Thus, the contemplated composition is that the plant seeds are malted (preferably at a temperature of about 30 ° C. to 65 ° C.) and the extract is in an aqueous extraction stage (eg, an aqueous buffer such as citrate buffer). Reducing the glucose concentration in the organism when the extract is administered to the organism at a concentration effective to reduce the glucose concentration, prepared from malt-treated plant seeds using a protocol comprising It should be appreciated that it contains a plant seed extract (preferably from barley).
[0048]
Example Three
Brewing the LMW fractions from Example 1 (GMM-1, GMM-2, and GMM-4) and the glassy yellowish product from Example 2 under anaerobic conditions using the modified Warburg method Monitored by quantification of yeast fermentation rate (Mirsky, N. et al., J. Inorg. Biochem. 13 (1): 11-21 (1980), incorporated herein by reference).
[0049]
Suspend 2 g of wet brewing yeast cells (approximately 20% dry weight) in fermentation medium (25 ml of 60 mM phosphate buffer at pH 5.7 and 10 ml of 5% (w / v) glucose solution) as in Example 1 or Aliquots of product from 2 were added to the fermentation medium for testing. Incubation was performed in a 50 ml fermentation flask at 25 ° C. for 60 minutes. The fermentation rate is the CO produced2Was measured from the volume. All LMW fractions examined or the products from Example 2 showed significant biological or physiological activity in that they increased the fermentation rate of the yeast in the range of about 20-40%. As used herein, a bioactive compound is a compound that increases or decreases fermentation. In further experiments, the activity of GMM-2 was examined under aerobic conditions. Despite the general restriction of yeast fermentation by the combined action of NaCl from the buffer and oxygen in the air (the Pasteur effect), the CO produced2The relative amount of was doubled compared to the control included in the experiment. The equivalent results for the GMM-2 fraction under anaerobic and aerobic conditions are shown in Figure 6 below. The results clearly demonstrate the regulatory activity of the isolated LMW substance on yeast metabolism.
[0050]
Example Four
The product obtained in Example 2 was examined for use in people diagnosed with NIDDM. Twenty-five men were recruited from an outpatient clinic (endocrinology). The average age of the group was 51 years and the range was 36-74 years. Medical charts were screened to exclude diabetic patients taking insulin or oral hypoglycemic agents. All subjects agreed to maintain their normal dietary habits and health-related behaviors throughout the study. Experimental treatment was performed for 6 months. Participants were instructed to orally administer each 1,000 mg of the preparation as tablets three times a day.
[0051]
All subjects were examined for plasma glucose, glucosylated hemoglobin HbAc1, triglycerides and cholesterol before supplementation and once every two weeks during the study period or monthly intervals depending on the type of study. Subjects were further classified into groups according to the following pattern:
[0052]
Plasma glucose:
According to plasma glucose levels, subjects were divided into three groups by difference in effects: I-plasma glucose concentrations up to 8 mMol / L; II-8 to 10.5 mMol / L and III-10.5 mMol / L above. Glycosylated hemoglobin (HbAc1); subjects were divided into two groups according to HbAc1 levels: I-modified hemoglobin less than 10% and II-10% or more. The test results related to glycemia before and after treatment are shown in FIG. 4A.
[0053]
An additional set of clinical trials was conducted on 10 volunteers following a protocol similar to that outlined above. In this second experiment, blood glucose was measured over 90 days at fast and after meal, and the results are shown in FIG. 4B. As can be clearly seen, administration of the intended compound reduced blood glucose at fasting and / or postprandial by at least 5%, more typically at least 10%, and most typically at least 20%. Similarly, the level of glycosylated hemoglobin decreased by at least 5%, more typically at least 20%, and most typically at least 50% after administration of the intended compound.
[0054]
The lipid status of subjects diagnosed with NIDDM was determined before and after treatment by examining plasma triglyceride and cholesterol (as total, LDL and HDL types) levels. The test results shown in FIGS. 5A and 5B include subjects with perturbed lipid metabolism due to diabetic disease.
[0055]
The lipid status of the subject shown in FIG. 5A includes the plasma levels of triglycerides, the ratio of triglycerides to total cholesterol, and the LDL / HDL ratio. The latter two ratios are known as risk factors for atherosclerosis. As can be seen from FIG. 5A, administration of the intended compound reduces triglycerides to 50%, the ratio of triglycerides to HDL cholesterol is significantly reduced by about 1-20%, and the ratio of LDL to HDL cholesterol is even more dramatic. Decreased (about 40%). The lipid status shown in FIG. 5B includes further results of 10 test patients after 90 days of administration of the intended compound and / or composition.
[0056]
Example Five
The thaumatin-like protein was prepared according to the method generally outlined in Example 1 and FIG. The thaumatin-like protein thus isolated was subjected to repeated molecular sieving in a membrane concentrator using a membrane with a molecular weight cut-off of about 1000 daltons. After the first round of filtration of the protein preparation, 99 ml of buffer (50 mM phosphate buffer, pH 7.8, 0.5 M NaCl) is added to about 1 ml of residue (ie, thaumatin-like protein fraction), and then the same Three rounds of filtration with buffer were performed to remove the remaining GMM compound (ie, the compound that reduces elevated glucose shown herein) from the thaumatin-like protein preparation. The UV absorption of the filtrate was monitored at 260 nm and the biological activity of the sample volume from the filtrate was examined according to the protocol outlined in Example 3. The thaumatin-like protein thus prepared was desalted by membrane filtration using a NaCl-free buffer (50 mM phosphate buffer at pH 7.8) and further used in the following method.
[0057]
To 1 ml of the desalted thaumatin-like protein solution (10 mg / ml), 1.0 ml of GMM-1 solution (1 mg / ml) was added, and the mixture was incubated at room temperature for 2 hours. After 2 hours, 98 ml of 50 mM phosphate buffer, pH 7.8, is added to the mixture, and unbound GMM-1 is removed by three subsequent ultrafiltrations with buffer (each round is diluted 1: 100 in volume). Removed.
[0058]
Sample 1 was a thaumatin-like protein bound to GMM-1. Next, when molecular sieve chromatography was performed on sample 1 using Sephadex G-75 column using 50 mM phosphate buffer, pH 7.8 as a solvent and 0.5 M NaCl, the low molecular weight fraction had an absorbance of 280 nm. From a high molecular weight fraction of thaumatin-like protein and eluted at an absorbance of 260 nm. The low molecular weight fraction was concentrated and desalted to a total volume of 1.0 ml. Samples 1 and 2 were then examined for biological activity using the method outlined in Example 3. Sample 1 did not increase the fermentation rate, whereas sample 2 significantly increased the fermentation rate in both aerobic and anaerobic experimental conditions, thereby reversibly binding GMM-1 to thaumatin-like protein. Was clearly shown. The same method was repeated for GMM-2 and GMM-4. The results obtained were similar to the GMM-1 experiment shown.
[0059]
Thus, certain aspects and applications of compositions and methods for reducing glucose concentration in an organism are disclosed. However, it should be apparent to those skilled in the art that many more modifications besides those already described can be practiced without departing from the inventive concepts described herein. Accordingly, the subject matter of the present invention is not limited except as by the appended claims. Moreover, when interpreting both the specification and the intended claims, all terms should be interpreted in the broadest possible sense consistent with the text. In particular, the terms “comprise” and “comprising” should be construed as referring non-exclusively to an element, component, or step, and the stated element, component, or step is expressed in terms of It may be present, used or combined with other elements, components or steps not mentioned as.
[0060]
Example 6
GMM was dialyzed to determine the molecular weight distribution of the active GMM component and to purify and concentrate the active component. A series of experiments was performed on 3 g portions of GMM preparation per test tube. The GMM sample was dissolved in 40 ml of water and dialyzed against 500 ml of water for 24 hours. For better separation, the external water was replaced with fresh water after 24 hours. The external water portions were combined, concentrated in vacuo, centrifuged, and evaporated to dryness to obtain a permeate. The contents of the dialysis tube were centrifuged and evaporated to dryness in vacuo to give a residue.
[0061]
The permeate to residue percentage ratio was 58.5: 25.1, with 16.4 corresponding to insoluble material from both residue and permeate. The insoluble part was discarded.
[0062]
The kinetics (action rate) of the two soluble fractions in yeast fermentation are shown in FIG. FIG. 7 shows that there are at least two types of active compounds in GMM. These two types include: high molecular weight (HMW) material (s) that increase in activity as the fermentation process proceeds and initial activity (s) that decrease as the fermentation process proceeds Low molecular weight (LMW, penetrant) material. Furthermore, the permeate kinetics overlap with the activity of the residue. This may be because the dialysis tube pore size is non-selective, which may have allowed residual components to partially pass through the pore. This phenomenon was repeated in repeated dialysis cycles. The results show that the molecular weight of the permeate compound is approximately 2,000 daltons.
[0063]
Moreover, the activity of the residue gives a significant increase in yeast biomass in the range of 44% over the control. This result suggests that the residual GMM fraction acts at the gene level leading to cell replication, whereas the permeate GMM fraction probably exerts its action by enhancing glucose uptake in an insulin-independent pathway May indicate that.
[0064]
Example 7
The residue product from Example 6 was subjected to gel permeation chromatography on a 2 × 80 cm column with Sephadex G-75-50 using 50 mM phosphate buffer, pH 7.8. GMM / R samples 40-50 mg were dissolved in buffer. The eluate was fractionated at 15 min intervals in a fraction collector to obtain 1.5 ml fractions. The elution was followed by measurement with a spectrophotometer at 280 nm.
[0065]
Yeast activity tests were performed using a barometric analysis method that was simpler than gravimetric analysis. The test was performed concurrently with the control. The eluted fractions were pooled sequentially into three parts: compartment 1-fractions 17-50; compartment 2-fractions 51-60; and compartment 3-fractions 61-70.
[0066]
As shown in FIG. 8, a portion of fractions 17-50 were used to test for yeast activity. The active ingredient in FIG. 8 is characterized in that the activity is expressed with a delay. The initial position of the elution pattern in FIG. 8 indicates that the size of the components in fractions 17-50 was greater than 12,000 daltons. The remaining portion of fractions 17-50 was dialyzed against water in a dialysis tube with a cut-off 12,000 dalton. Analysis of the contents retained in the tube for yeast activity showed a relatively strong inhibition, indicating the presence of an active ingredient with a molecular weight of 2000-12,000 daltons.
[0067]
A small amount of fractions 51-60 were also examined for yeast activity in the same manner, and early expression of activity was obtained. Furthermore, when a small amount of fractions 61 to 70 were examined for yeast activity, the strongest inhibitory action among the three fractions was obtained. These data are not shown in the figure.
[0068]
The eluted fractions were then pooled in 5 consecutive compartments:
Section 1-Fractions 18-32
Section 2-Fraction 33-46
Section 3-Fractions 47-56
Section 4-Fractions 57-61
Section 5-Fractions 61-80
[0069]
The compartment was further analyzed for yeast activity. Fractions 19-32 showed that the activity was delayed as shown in FIG. The results show that fractions 19-32 can have a high molecular weight above 20,000 daltons. Matching proteins in brewed barley extracts elute at the same position in GP chromatography. The protein is not present in large quantities in the extract, and it does not release its activity upon dialysis with a cut-off 12,000 dalton tube, so it has a molecular weight greater than 12,000 daltons. The yeast activity profiles of the two major proteins are shown in comparison with FIG.
[0070]
Fractions 33-46 and fractions 47-56 were examined for yeast activity and showed an inhibitory effect.
[0071]
When the yeast activities of fractions 57 to 61 were examined, early activity expression was shown as shown in FIGS. The position of this protein coincides with that of the brewed barley HL-protein known to have a UV absorbing ligand at 265 nm. Previous studies have shown that HL-protein releases its ligand in the presence of salt at a concentration of 0.5 M. HL-protein has a molecular weight of 14,000 daltons. FIG. 9 shows the equivalent yeast fermentation activity of HL-protein and its matching components of GMM in fractions 57-61. The amount of HL-protein in the study was as low as 5 mg.
[0072]
Thus, chromatographic fractionation of GMM residues by gel permeation size exclusion revealed the presence of high molecular species in GMM preparations, most of which were proteins. Some of the proteins in the GMM residue showed a significant inhibitory effect on yeast fermentation. Two polymeric components were detected with obvious yeast fermentation activity. A peak of activity was present in the first part of the elution pattern, which belonged to a molecular species that passed through a dialysis membrane with a cutoff of 12,000 daltons.
[0073]
Example 8
The permeate portion of GMM was tested for glucose uptake in L6 myocytes. L6 cells were grown as monolayers in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 1 mM glutamine, 1 mM pyruvate and 25 mM glucose. 5% fetal calf serum (FCS) was added to the medium. Experiments were performed in 48-well plates seeded with 50,000 cells / well from pre-confluent flasks. Cells were grown to confluence and the medium was changed to DMEM containing 0.5% FCS and 2.5 mM glucose (L6 Myo medium) for at least 76 hours to induce L6 cell differentiation and L6 myotube formation. Next, myotubes were incubated with test substances for 30 minutes-Fryer et al. ("Activation of glucose transport by AMP-activated protein kinase via stimulation of Nitric oxide synthase", Diabetes 49 (12), 1978-85, 2000, Fryer LGD Et al., Protocol SMM, or Dulbecco's PBS-serum free medium (SFM) protocol with 20 mM HEPES and 2 mM glucose but no serum.
[0074]
Next, 2-NBDG 30 μM was added at 22 ° C. for 2 minutes. The cell culture medium was then removed and the cells were washed twice with cold DPBS. The cells were then lysed in 0.5% SDS. Fluorescence was measured at 466/542 nm (excitation / emission) using 100 μl of cell lysate in 2 ml of water.
[0075]
In FIG. 11, L6 cells treated with insulin in serum-free medium (DPBS) responded to an increase in glucose uptake by 40-50%. However, treatment of L6 with insulin in culture medium (SSM) supplemented with 0.5% FCS increased glucose uptake on average by 100-120%. These results may suggest that myocytes are more sensitive to insulin in the presence of serum.
[0076]
FIG. 12 shows the effect of permeate on glucose uptake in L6 cells. Cells were cultured and treated in L6 Myo medium (SSM) -SSM protocol or serum-free medium (SFM-20 mM Hepes, DPBS with 2 mM glucose) -SFM protocol as described in Fryer et al. Glucose uptake was measured by adding 2-NBDG 30 μM at 22 ° C. for 2 minutes. Two experiments were performed per sample.
[0077]
FIG. 13 shows the effect of AICA on stimulation of glucose uptake and the effect of L-NMMA on inhibition of glucose uptake. Similar effects have been described by Fryer et al. ("Activation of glucose transport by AMP-activated protein kinase via stimulation of Nitric oxide synthase", Diabetes 49 (12), 1978-85, 2000, Fryer LGD et al.). The permeate cells were pretreated for 30 minutes with L-NMMA in DPBS and then for 30 minutes with AICA. Glucose uptake was measured after 2 minutes of treatment at 22 ° C.
[0078]
In general, glucose transport in skeletal muscle is stimulated by two different stimuli, insulin and exercise. Recently, AMP-activated protein kinase (AMPK) has been shown to be activated by skeletal muscle exercise. Pharmacological activation of AMPK by AICAR (5-amino-4-imidazolecarboxamide riboside) results in increased glucose uptake. Interestingly, skeletal muscle cells are treated with nitric oxide synthase (NOS) inhibitors such as LN-mono-methyl-L-arginine (L-NMMA) or LN-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) Then, the increase in glucose transport after AMPK activation is completely blocked.
[0079]
Since AICAR is not commercially available in the test shown in FIG. 14, AICA was used. AICA is a precursor of AICAR, which is metabolized to AICAR in skeletal muscle and increases glucose uptake.
[0080]
L-NMMA is used in experiments to confirm whether GMM-induced glucose transport in L6 cells is inhibited by NOS inhibitors and thus mimics the AICAR-induced mechanism for increased glucose transport. It is used. Fryer's experimental setup was adopted, but after pre-treating cells with inhibitors for 30 minutes in DPBS, before taking glucose uptake, with an agonist like AICAR, or in our case with GMM at 37 ° C It consisted of a further 30 minutes of treatment.
[0081]
In Figure 14, the permeate cells were examined to determine whether glucose uptake by the permeate can be inhibited by L-NMMA at the same concentration used to inhibit the AICA effect on glucose uptake. It was. FIG. 14 shows that L-NMMA inhibits the effect of permeate on increasing glucose uptake in L6 myocytes in vitro. L6 cells were either pretreated with L-NMMA for 30 minutes in DPBS and then treated with GMM alone, or GMM was added to cells treated with inhibitors for an additional 30 minutes. Glucose uptake was measured at 22 ° C. for 2 minutes.
[0082]
According to the results of FIG. 14, pretreatment of L6 cells with L-NMMA at a concentration of 300 μM blocks GMM-induced glucose transport in these experimental conditions. GMM may suggest that it acts through the AMPK pathway, similar to AICAR.
[Brief description of the drawings]
[0083]
FIG. 1 is a flow diagram illustrating an exemplary method for reducing blood glucose levels in accordance with the inventive subject matter.
FIG. 2 is a flow diagram illustrating an exemplary method for processing cells according to the present inventive subject matter.
FIG. 3 shows an exemplary preparation of intended compounds and thaumatin-like proteins.
FIG. 4A is a table showing the reduction in blood glucose concentration in volunteer people when using a composition contemplated according to the present inventive subject matter. FIG. 4B is another table showing the reduction of blood glucose levels in volunteer people when using the compositions contemplated according to the present inventive subject matter.
FIG. 5A is a table showing the reduction in blood lipid levels in volunteer people when using a composition contemplated according to the present inventive subject matter. FIG. 5B is another table showing the reduction in blood lipid levels in volunteer people when using the compositions contemplated according to the present inventive subject matter.
FIG. 6 is a graph showing the fermentation rate of yeast incubated with the intended compound under anaerobic and aerobic conditions.
FIG. 7 is a table showing the intermediate activity over time of residues (high molecular weight) and permeates (low molecular weight) of GMM samples after dialysis.
FIG. 8 is a graph showing the fraction of eluate from the remaining portion of the GMM sample.
FIG. 9 is another graph showing the fraction of eluate from the remaining portion of the GMM sample.
FIG. 10 is another graph showing the fraction of eluate from the remaining portion of the GMM sample.
FIG. 11 is a graph showing L6 cells treated with insulin in serum-free and serum-supplemented media.
FIG. 12 is a graph showing the influence of the permeation portion of a GMM sample on glucose uptake in L6 cells.
FIG. 13 is a graph showing the effect of AICA, L-NMMA, and AICAR + L-NMMA on glucose uptake.
FIG. 14 is a graph showing the influence of the permeation portion of the GMM sample and the influence of the permeate portion + L-NMMA on glucose uptake.
