JP2005500057A

JP2005500057A - Cancer-specific oligosaccharide sequences and uses thereof

Info

Publication number: JP2005500057A
Application number: JP2003521773A
Authority: JP
Inventors: サーリネン，ユハニ; ヘリン，ヤリ; サトマー，テロ
Original assignee: バイオティセラピィーズコープ
Priority date: 2001-08-17
Filing date: 2002-08-16
Publication date: 2005-01-06
Also published as: US8313912B2; WO2003016464A2; FI20011664A; FI20011664A0; US20040253651A1; EP1417214A2; WO2003016464A3; AU2002319338A1

Abstract

本発明は、癌細胞によって特異的に発現されるオリゴ糖配列を開示する。本発明は、LacdiNAc構造を含む癌特異的オリゴ糖鎖の存在を生物学的試料中に検出し、該糖鎖の存在を指標として、癌の検出を行う方法に関する。本発明は、該オリゴ糖鎖または該オリゴ糖鎖に結合する結合性物質を包含する抗原性物質、診断剤、医薬組成物および癌ワクチンを提供する。また、本発明は癌の治療方法にも関する。The present invention discloses oligosaccharide sequences that are specifically expressed by cancer cells. The present invention relates to a method for detecting cancer in a biological sample by detecting the presence of a cancer-specific oligosaccharide chain containing a LacdiNAc structure and detecting the presence of the sugar chain as an index. The present invention provides an antigenic substance, a diagnostic agent, a pharmaceutical composition, and a cancer vaccine including the oligosaccharide chain or a binding substance that binds to the oligosaccharide chain. The present invention also relates to a method for treating cancer.

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、ある種の癌細胞、腫瘍および他の悪性組織が特異的に発現するオリゴ糖配列に関する。本発明は、癌特異的オリゴ糖配列と結合する試薬を製造するための方法だけでなく、癌特異的オリゴ糖配列を検出するための方法も開示する。また、本発明は、上記オリゴ糖配列およびそれに結合する試薬を用いた、癌および悪性腫瘍の診断方法にも関する。さらに本発明は、オリゴ糖配列およびそれに結合する試薬を用いた、癌および悪性腫瘍の治療方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の癌細胞または癌化組織は、同種の細胞や組織の非悪性グリコシル化産物とは異なるオリゴ糖配列を発現する。公知のまたは推測される癌関連オリゴ糖構造の例としては、次のオリゴ糖構造が挙げられる：糖脂質構造、例えばグロボ−Ｈ（Fucα2Galβ3GalNAcβ3Galα4LacβCer）、ガングリオシドであるＧＭ１（Galβ3GalNAcβ4(NeuNAcα3)LacβCer）またはＧＤ２（GalNAcβ4(NeuNAcα8NeuNAcα3)LacβCer）；ルイス型フコシル化構造、例えばルイスａおよびｘ（Galβ3/4(Fucα4/3)GlcNAc）、ルイスｙ（Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAc）、シアリルルイスｘ（NeuNAcα3Galβ4(Fucα3)GlcNAc）およびポリラクトサミン鎖中でのこれらの組み合わせ；ならびにＯ−グリカンコア構造、例えばＴ−抗原（Galβ3GalNAcαSer/Thr-タンパク質）、Ｔｎ−抗原（GalNAcαSer/Thr-タンパク質）またはシアリルＴｎ−抗原（NeuNAcα6GalNAcαSer/Thr-タンパク質）。非ヒト型の構造、例えばＮ−グリコリルノイラミン酸、が癌に存在するとも示されている。癌においては、関連するオリゴ糖構造およびその特異性について十分に確立されている症例はわずかであり、これらの構造の中には、正常な細胞および組織に存在するものもあることから、癌には単に高濃度で存在しているだけだと考えられる。しかしながら、治療を目的とした用途においては、完全な癌特異性が必ずしも必要ではないと考えられる。
【０００３】
LacdiNAc（GalNAcβ4GlcNAc）型グリコシル化産物は、ヒト組織には一般的に提示されていないが、しかしながら、LacdiNAc型糖配列は、ヒト以外の多くの動物、ウシ糖タンパク質、ヒト糖タンパク質ホルモン（Manzella et al., 1997）およびヒトグリコデリン（glycodelin）タンパク質（van den Eijnden et al., 1997）から見出されている。一般的に、この構造は無脊椎動物や初期発生に関連すると考えられる。数種の変異型LacdiNAcは、ヒト胎児腎臓２９３細胞が発現したタンパク質から見出されている（Do et al., 1997）。近年、本発明者らは、トランスフェクトされた繊維芽細胞から得たLacdiNAcを基本とする構造について発表した（Saarinen et al., 1999）。この研究においては、グリコシル化が癌に関連するのか、繊維芽細胞のアデノウイルス由来ＥＩＡ−プロモーター配列のトランスフェクトに関連するのかは示しておらず、ＥＩＡ−プロモーターはグリコシル基転移酵素の遺伝子発現を調節してグリコシル化を修飾する場合がある。LacdiNAc型糖類は、ボーズ（Bowes）メラノーマ細胞の組織型プラスミノーゲンアクチベーターにおいて、他の構造と共に見出されたが、これらは“神経系関連”構造であると考えられた（Jaques et al., 1996）。これらの先の研究は、固形腫瘍から誘導した細胞系からの類似のオリゴ糖構造の検出についても記載している（Do et al., 1997; Jaques et al., 1996; Saarinen et al., 1999）。しかしながら、細胞間の接触が変わると（例えば固形腫瘍を単一細胞に分離すると）、炭水化物および他の表面抗原は通常変化する。さらに、細胞系の細胞はおそらく遺伝学的に修飾されており、それゆえに単一細胞として培養することが可能となる。細胞表面のグリコシル化は、細胞系または組織の分化状態に非常に特異的であり、細胞または組織の種類にも特異的である。したがって、本明細書に記載した従来技術には、単一癌細胞または固形腫瘍組織の天然のグリコシル化状態について記載されていない。しかしながら、細胞の種類または分化状態とグリコシル化との潜在的な相互関係は、癌細胞および腫瘍の型判定（typing）に癌抗原を用いることを可能にする。
【０００４】
以下の特許には、癌抗原、ならびにそれを用いた治療用および診断用の抗体の製造方法および癌ワクチンの製造方法に関する記載がある。しかし、抗原の構造は、本願で開示する糖類とは関係ない。
癌ワクチン：米国特許第5,102,663号は、9-OAc NeuNAcα8NeuNAcα3Lac-Cer (GD3)に対する抗体の産生を刺激または増強するための、9-OAc GD3を包含する組成物を開示する。
米国特許第5,660,834号は、Ｔｎ（GalNAcα-Ser/Thr）抗原またはシアリル−Ｔｎ（NeuNAcα6GalNAcα-Ser/Thr）抗原から実質的になるムチン型糖タンパク質を含有する医薬組成物およびそれをアジュバンドとともに用いて癌細胞の増殖速度を低下させる方法を開示する。これと同じムチン配列に関する発明が、他の特許にも開示されている：米国特許第5,747,048号（ヒトに対するアジュバンド療法）および米国特許第5,229,289号。
米国特許第6,083,929号は、伸長１型鎖スフィンゴ脂質（Galβ3GlcNAc）を腫瘍関連組成物として開示し、更にそれをアジュバンドとともに用いた医薬組成物を開示する。
治療用抗体：米国特許第4,851,511号は、ジシアロシルルイスａ−構造（NeuNAcα3Galβ3(Fucα4)[NeuNAcα6]GlcNAc）に結合するモノクローナル抗体、診断試験キット、抗体を産生するハイブリドーマ、マーカー分子および抗体と結合した抗腫瘍剤を開示する。
米国特許第4,904,596号は、NeuNAcα3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3LacCerで表される構造に結合するモノクローナル抗体、ハイブリドーマ、診断方法および抗腫瘍剤、免疫調整剤または分化誘導剤にカップリングした抗体を開示する。
米国特許第5,874,060号は、ルイスｙ−抗原（Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAc）を認識する人体に適応させた抗体を開示する。
米国特許第6,025,481号は、ルイスｂ−抗原を認識する、人体に適応させた抗体をコードする核酸分子を開示する。ルイスｂ−構造（Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAc-）の発現は、癌細胞では増加している。米国特許第5,795,961号は、さらに抗ルイスｂ抗体も開示する。
【０００５】
診断方法：米国特許第4,725,557号は、タンパク質結合抗原であるFucα3Gal-、Fucα4Gal-およびFucα6Gal-、これらの構造を認識する抗体、癌関連炭水化物の結合を検出する方法ならびに診断キットを開示する。抗体はヒト消化器系の癌細胞に結合する。
米国特許第5,059,520号は、癌の診断に用いることのできる、血液型Ａ−抗原（GalNAcα3(Fucα2)Galβ-）を認識する数種のモノクローナル抗体を開示する。
米国特許第5,171,667号は、フコシル化２型ラクトサミン（-Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ-）に対する抗体およびそれを用いた癌の診断方法を開示する。
米国特許第5,173,292号は、癌に特異的な構造である、Gal-グロボシド（Galβ3GalNAcβ3Galα4LacCer）に結合するモノクローナル抗体を開示する。
米国特許第6,090,789号および5,708,163号は、Fucα2Galβ3GalNAcβ3Galα4LacCer（グロボＨ、ＭＢｒ１、乳腫瘍関連抗原）結合体およびその類似体の合成、ならびにそれらを包含する医薬組成物を開示する。米国特許第5,679,769号は、糖ペプチドに結合したアスパラギンの合成を開示する。米国特許第5,543,505号は、細菌であるHelicobacter pyloriに結合する合成化合物を開示する。
米国特許第5,902,725号および6,203,999号は、前立腺特異的抗原上の少なくともトリアンテナリー（triantennary）オリゴ糖の分析による前立腺特異的癌の検出を開示する。抗体またはレクチンＰＨＡ−Ｌを検出に用いる。これらの特許は、細胞系から得た癌型ＰＳＡに存在するトリアンテナリーＮ−グリカンをクロマトグラフィーによって特徴付けている。
【０００６】
従来技術には、比較的大きなＮ−グリカン構造を含むフコシル化lacdiNAcを包含する医薬組成物（ＥＰ特許第0565241号）およびコア２型Ｏ−グリカン構造を包含する医薬組成物（ＥＰ特許第0919563号）に関する開示がある。これらの組成物は、セレクチン仲介細胞接着の阻害を目的としており、ＥＰ第0919563号では、セレクチン仲介細胞接着の阻害による転移の阻害も目的としている。しかしながら、本発明は、本発明のオリゴ糖エピトープを、抗体を含めた特異的認識分子の標的とする方法に関する。具体的には、本発明は、診断および治療に用いる抗体を誘導するのに適切な抗原性を有する結合体および組成物に関する。本発明は、特異的抗体による認識において最適なサイズのオリゴ糖配列を包含する医薬組成物に関する。最適なオリゴ糖エピトープは、末端lacdiNAc構造のみを含むものか、末端オリゴ糖配列と一種または二種の単糖残基を含むものである。
【０００７】
発明の概要
本発明は、癌細胞によって特異的に発現されるオリゴ糖配列を開示する。本発明は、下記式（Ｉ）：
(Sac1)_xGalNAcβ4(Fucα3)_yGlcNAc （Ｉ）
（式中、ｘおよびｙは各々独立に０または１の整数であり、Sac1はNeuNAcα3またはNeuNAcα6である。）
で表される癌特異的配列を含むオリゴ糖鎖の存在を生物学的試料中に検出し、該配列の存在を指標として、癌の検出および／または癌の型判定を行う方法に関する。本発明は、多価の形態で該オリゴ糖鎖を含む抗原性物質を提供し、さらに該オリゴ糖鎖または該オリゴ糖鎖に結合する結合性物質を包含する診断剤、医薬組成物および癌ワクチンを提供する。また、本発明は癌の治療方法にも関する。
発明の詳細の説明
いくつかのlacdiNAc（GalNAcβ4GlcNAc）型構造が分泌タンパク質、例えば糖タンパク質ホルモンから見出されている。ヒトの糖タンパク質ホルモンにおいては、通常lacdiNAcは、ホルモンの機能に重要であると考えられる4sulfo-GalNAcβ4GlcNAc-配列に修飾されているが、いくつかの異型が分泌lacdiNAc構造に存在する。糖タンパク質ホルモンは希少な可溶性タンパク質であり、一般的に比較的小さく、グリコシル化部位をほとんど有していないため、採りうるlacdiNAc構造が非常に限定されている。ヒトのグリコシル化に関する多くの構造研究がこの３０年の間に行われているが、ヒトの膜結合性の非分泌タンパク質におけるlacdiNAc配列の構造は特徴付けられていない。
【０００８】
細胞内分泌マーカーとしてのlacdiNAc構造の役割は報告されており、同じ報告は、lacdiNAc構造はＭＤＣＫ細胞の膜タンパク質に提示されていないことを明確に記述している（Ohkura, et al. 2001）。分泌タンパク質において特徴付けられたlacdiNAc構造のヒトの癌との関連は示されていない。癌による異常発現産物であるlacdiNAc構造ならびに特に希少なその異型であるフコシル化体およびシアリル化体は、正常な組織では発現されないので、このような構造の認識に基づく癌の処置および治療が有効な可能性は非常に高い。限られた量の正常組織にのみ提示されているか、低い密度で正常の組織および／または血清に存在する炭水化物を用いる方法は、診断方法および治療方法として成功している。
【０００９】
効果的な癌の処置のために診断および治療を組み合わせる方法
本発明で得られたデータは、本願で開示するlacdiNAc構造が、癌細胞に提示されている炭水化物構造を認識する診断方法および治療方法に有用であることを示している。グリコシル化のパターンは、組織間、腫瘍間、更には個々の患者間でも変化するので、本発明は、特に腫瘍から異常な炭水化物構造をスクリーニングし、特定の患者の癌が特異的に発現するグリコシル化の形態に対応した個別の治療を提供するための方法に関する。具体的には、本発明は、特に腫瘍または癌の試料に存在する、本願で開示するlacdiNAc構造のグリコシル化産物をスクリーニングし、本発明のlacdiNAc標的治療を用いて、（特に腫瘍、悪性化した組織または細胞に特異的に提示された）特定の癌関連グリコシル化産物を有する患者を治療する方法に関する。
【００１０】
本発明者らは、lacdiNAcが正常な組織上の細胞表面マーカーではないことを証明するために、効果的な質量分析法で複数の正常な組織のスクリーニングを行った。本発明の研究過程において、以下の事柄が判明した。
（ｉ）lacdiNAc配列は、単細胞癌（例えば白血病）および固形腫瘍の両方に存在する；
（ｉｉ）lacdiNAc配列は、正常な組織上で多数観察されることはなかった；
（ｉｉｉ）lacdiNAc配列は、癌細胞の形質膜または膜結合タンパク質、ならびに分泌タンパク質の両方に存在し、細胞表面に組み込まれたlacdiNAc配列は、癌診断、免疫療法および癌のlacdiNAc配列の認識に基づく他の治療のための標的となる；そして
（ｉｖ）癌細胞表面に提示されたlacdiNAc配列は、治療および診断用の特異的抗体によって認識することができる。これらの構造は、細胞表面上に有効な形態で存在し、他の細胞表面成分によって被覆されていない。
【００１１】
白血病細胞を単細胞癌細胞のモデルとして選んだ。白血病細胞は血液癌における単細胞癌細胞の代表例である。可溶性標的タンパク質は、非悪性腫瘍細胞に関する構造比較データが存在するものを選んだ。癌細胞上のLacdiNAc配列の異常発現を示すために、メタロプロテアーゼ−９（MMP-9）を白血病細胞（U-937）から単離し、Ｎ−グリコシド結合グリカンをＮ−グリコシダーゼＦで遊離させた。グリカン画分をトリヒドロキシアセトフェノンマトリックス中でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いて分析したところ（図１Ａ）、無視できるほど少量のシアル酸残基の開裂が見られた。帰属された単糖組成を、続くグリコシダーゼ処理で推定された構造と共に表１に示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによるオリゴ糖の分析は比較的計量的であることが示されているので、各成分の相対的な存在量も示す。最も多量に存在するグリカン種を、(Hex)₅(HexNAc)₄(Fuc)₃の[M+Na]⁺に帰属した。典型的なＮ−グリカン構造はわかっているので、仮にこの構造をトリフコシル化ジアンテナリー複合体型グリカンとして帰属した。他の主要なグリカン種は、シアリル化、ジフコシル化ジアンテナリー複合体型グリカン、および１つのアンテナに末端単糖としてGalの代わりにGalNAcを有する（いわゆるLacdiNAc構造を有する）トリフコシル化ジアンテナリー複合体型グリカンとして同定した。一連のグリコシダーゼ処理によって示されるように、これらの帰属は正しいことが判った。比較のために、非悪性白血球細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼMMP-9の構造も決定したところ、このタンパク質にはlacdiNAc配列は含まれていなかった（Rudd P et al., 1999）。
【００１２】
本発明は、U-937細胞誘導MMP-9が、そのＮ−グリカンの大きな画分（およそ３０％）にLacdiNAc構造を有することを示す。LacdiNAc構造の存在は、二種の独立した方法、すなわち完全糖ペプチドのＬＣ−ＥＳＩＭＳだけでなく、遊離したＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析でも証明された。構造の帰属は、さらに一連のグリコシダーゼ処理によって確認した。本研究で用いた方法の有効性は、合成オリゴ糖と公知の天然の構造体の両方を用いたいくつかのアプローチで立証されている。
【００１３】
正常な組織から得た lacdiNAc 構造の質量分析法によるスクリーニング
ヒトの胃、肺および結腸を含むいくつかの非悪性組織の膜タンパク質試料を、上記のように質量分析法で分析した。Ｎ−結合型またはＯ−結合型のlacdiNAc配列は観察されなかった。従来技術にも、ヒトの正常な膜タンパク質と癌の膜タンパク質のいずれかに提示されているlacdiNAcに関する報告はない。
【００１４】
固形腫瘍上の lacdiNAc 構造の分析
本発明は、lacdiNAc-配列がヒトの固形腫瘍に提示されていることも初めて示す。本願の実施例の１つは、ヒト喉頭癌の試料から得たlacdiNAc構造の特徴づけを示す。
【００１５】
形質膜試料から得た lacdiNAc 構造の特徴づけ
本発明は、癌における、形質膜型のlacdiNAc発現タンパク質にも関する。マトリックスメタロプロテアーゼMMP-9は、膜結合型で存在することも知られており(Koivunen et al., 1999）、これは本発明における癌の診断および免疫療法に用いる理想的な標的を形成する。他の一つの例として、メラノーマ関連膜の二種の異なる試料のグリコシル化産物を分析した。特有のＮ−グリカン構造を含む多量の種々のlacdiNAc型オリゴ糖配列が、膜結合性の糖タンパク質に見出された。グリコシル化膜タンパク質は、細胞および組織の表面に提示されていることが知られている。
【００１６】
本発明で示した癌に特異的な欠陥
本発明は、癌細胞の新規な欠陥を開示する。分泌タンパク質と関連する希少な構造は、通常lacdiNAc構造を発現しないタンパク質上に発現される。さらに、グリコシル化の不全は、より異常なシアリル化体、フコシル化体およびGalNacの４位の通常の硫酸化を欠いた異型を誘導する。癌に対する一般的な知見によると、癌細胞においては細胞内機構が乱されている。ゴルジ装置のこのような欠陥によって種々の細胞型における非常に特異的なグリコシル化が生じ、その結果が明かに上記のような問題を誘導する。可溶性タンパク質における癌を示す異常なグリコシル化産物の存在は、明かに癌の診断に有用であり、膜と結合した癌グリコシル化産物の存在によって可溶性タンパク質そのものが治療に有用となる。
【００１７】
上述のように、癌抗原の存在について、白血病細胞系U-937細胞の分泌MMP-9タンパク質、固形腫瘍および膜調製物を検討した。白血病細胞系の単一細胞は、単一細胞癌白血病との妥当な関連性を示すモデルであるとも考えられる。LacdiNAc-構造が固形腫瘍から得られ、それが膜結合性であるという知見は、グリコシル化産物を発現する固形腫瘍に対する治療において、癌グリコシル化産物が有用であることを示す。
【００１８】
本発明は、下記式（Ｉ）で表されるLacdiNAc構造が癌特異的抗原であることを示す。
(Sac1)_xGalNAcβ4(Fucα3)_yGlcNAc （Ｉ）
（式中、ｘおよびｙは各々独立に０または１の整数であり、Sac1はNeuNAcα3またはNeuNAcα6である。）
細胞結合型のMMP-9が知られていることから（Koivunen et al., 1999）、本発明は、癌細胞および腫瘍組織から癌抗原を直接検出する方法に関する。しかしながら、癌抗原は、癌細胞および腫瘍組織から検出される以外にも、本明細書で説明するように、癌細胞または組織から誘導された分泌糖タンパク質から検出される場合がある。このような癌特異的タンパク質としては、プロテアーゼ、ホルモンまたは分泌ムチン型糖タンパク質が挙げられる。
【００１９】
本発明は、癌抗原は糖タンパク質から検出できることを示し、この現象は悪性転換の際に上向き調節されることが知られている。癌関連糖タンパク質と推定されるものには癌抗原が存在するという知見は、初期の癌に対するより確実な診断手法を提供すると考えられる。このような好ましい癌関連タンパク質の例には、マトリックスメタロプトテアーゼタンパク質ファミリーに属するタンパク質（例えばMMP-9）、前立腺特異的抗原、カリクレイン２、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンおよび胎児性癌抗原が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
LacdiNAc型の癌特異的オリゴ糖は、GalNAcβ4GlcNAc-オリゴ糖配列を含んでいる。この配列は、癌細胞のオリゴ糖結合体の一部である。オリゴ糖配列は以下に示す配列のように置換することもでき、これらも癌細胞に提示されていることが知られている：GalNAcβ4(Fucα3)GlcNAc-、NeuNAcα3GalNAcβ4GlcNAc-、NeuNAcα6GalNAcβ4GlcNAc-、NeuNAcα3GalNAcβ4(Fucα3)GlcNAc-またはNeuNAcα6GalNAcβ4(Fucα3)GlcNAc-。癌オリゴ糖エピトープが単独でシアル酸およびフコースの両方を含む場合は、その構造は NeuNAcα3GalNAcβ4(Fucα3)GlcNAc- となる。癌細胞が硫酸化に必要なスルフォトランスフェラーゼを有する場合には、LacdiNAc配列は、例えば４位のGalNAcが硫酸化もされていてもよい。LacdiNAc型配列は、癌細胞または組織の糖タンパク質配列の一部であってもよく、例えばLacdiNAc型配列は糖タンパク質のＮ−結合グリカン中のマンノース残基にβ２−、β４−またはβ６−結合しているか、LacdiNAc型配列は糖タンパク質のＮ−結合グリカン中のマンノース残基にβ２−結合している。
【００２１】
フコシル化LacdiNAc糖類は、ルイス型癌関連オリゴ糖との相似性を示す。ルイス型癌関連オリゴ糖は正常な組織にも多量に存在するものの、ルイス型癌関連オリゴ糖の認識が弱いヒト抗体が産生される有望な理由は、ルイス型癌関連オリゴ糖とフコシル化LacdiNAc糖類との潜在的な弱い交差反応性である。
【００２２】
本発明は、細胞または組織の悪性化を、癌特異的グリコシル化産物を指標として検出する方法に関する。このような検出は、本願で開示する癌特異的オリゴ糖配列に特異的に結合する分子によって行うことができる。好ましい分子は、アプタマー、レクチン、遺伝子工学的に作製したレクチン、抗体、モノクローナル抗体、抗体の断片、LacdiNAc-構造を認識する酵素（例えばグリコシダーゼやグリコシル基転移酵素）および遺伝子工学的に作製したそれらの異型である。標識した細菌、ウイルスまたは細胞、あるいは重合体の表面であって、LacdiNAc構造を認識する分子を有するものを検出に用いることができる。オリゴ糖配列は、エンドグリコシダーゼ酵素によって癌細胞から遊離することができる。また、オリゴ糖配列をプロテアーゼ酵素により糖脂質として遊離することができる。オリゴ糖またはその誘導体を遊離させるための化学的方法の具体例には、糖脂質の音波分解法（otsonolysis）、および糖タンパク質からオリゴ糖を遊離させるためのβ-脱離法（beta-elimination）またはヒドラジン分解法（hydrazinolysis method）が含まれる。その他の方法としては、糖脂質画分の単離が挙げられる。癌特異的オリゴ糖配列に特異的に結合する結合性物質は、細胞表面上の該配列の分析に用いることもできる。該配列は、例えば糖結合体あるいは遊離のおよび／または単離したオリゴ糖画分として検出することができる。種々の形態の該配列の分析に用いることができる方法としては、ＮＭＲ分光法、質量分析法およびグリコシダーゼ分解法が挙げられる。特に、特異性に限定のある方法を用いる場合には、少なくとも二種の分析法を用いることが好ましい。
【００２３】
質量分析法は、試料中に存在する、少なくとも一種の本発明の癌特異的オリゴ糖配列を検出するための好ましい方法である。式（Ｉ）で表されるオリゴ糖配列を含む画分からHexNAc-HexNAc-断片を検出するために質量分析走査法（mass spectrometric scanning method）を用いることが特に好ましい。
【００２４】
本発明は、癌特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を用いて、オリゴ糖構造を認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を製造する方法に関し、以下の工程に従って該抗体を製造する：
１）本願で開示するオリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を多価の形態で含んでいる結合体を、化学的または生化学的に合成する。多価の結合体は、例えば、本願で開示する癌特異的末端オリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖（ＯＳ）が、そのＣ１位の還元末端からスペーサー基（Ｙ）を介して、所望により単糖またはオリゴ糖残基（Ｘ）をさらに介して、オリゴ価または多価の担体（Ｚ）に原子（Ｌ）によって結合している、下記式（ＩＩ）で表される構造を形成する：
[OS-(X)_n-L-Y]_m-Z （ＩＩ）
（式中、
ｍは１より大きい整数であり、
ｎは各々独立に０または１であり、
Ｌは酸素原子、窒素原子、硫黄原子または炭素原子であり、
Ｘは、好ましくはラクトシル残基、ガラクトシル残基、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミニル残基、あるいはＯ−グリカンまたはＮ−グリカンオリゴ糖配列の一部であり、
Ｙはスペーサー基または末端結合体、例えばセラミド脂質部またはＺへの結合部であり；
上記式（ＩＩ）で表される好ましい構造は、次の特徴のいずれか一つを満足する：オリゴ糖鎖（ＯＳ）はシアリル化されている、Ｘは少なくとも一つのマンノース残基またはＮ−アセチルガラクトサミン残基を含む、及びＺは炭水化物材料、例えば多糖を包含する）；そして
２）免疫応答活性化物質と共に多価結合体で動物またはヒトを免疫する。
オリゴ糖鎖は免疫応答活性化物質に多価の形態で結合していることが好ましく、結合体は単独、またはさらなる免疫応答活性化物質と共に免疫に用いる。より好ましい態様においては、オリゴ糖結合体を、少なくとも一種のアジュバンド分子と共に抗体産生生物に注射または粘膜投与する。抗体産生のためには、オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体をタンパク質、例えばＢＳＡ、スカシガイ（keyhole limpet）ヘモシアニン、リポペプチド、ペプチド、細菌の毒素、ペプチドグリカンまたは免疫活性多糖の一部、あるいは他の抗体産生活性化分子に多価の形態で結合する。当業界で知られている慣習的な抗体産生法で抗体を誘導するために、多価結合体をアジュバンド分子と共に動物に注射することができる。また、本発明の抗原性物質は、ヒトを免疫するための物質と関連して上述した、式（Ｉ）で表される末端オリゴ糖配列を化学的または生化学的に合成した多価の形態で含むものであることが好ましい。より好ましくは、抗原性物質は、末端NeuNAcα3または末端NeuNAcα6を含む（すなわち、式（Ｉ）においてＸが１である）か、糖配列がマンノースまたはＮ−アセチルガラクトサミンに結合する（例えば、式（ＩＩ）においてＸがManまたはGalNAcである）。
【００２５】
本発明は、本発明のオリゴ糖配列を含む一価および／またはオリゴ価の抗原性結合体にも関する。一価の抗原性結合体は抗原性脂質構造、例えば本願に記載した方法や公知の方法で抗体産生を誘導することの可能なセラミド、合成脂質または細菌型の脂質を含んでいてもよい。
【００２６】
特に本発明は、最適なサイズの抗原性エピトープおよびそれを包含する医薬組成物の用途に関する。抗体は通常、少数の単糖残基からなるエピトープしか効果的に認識することができない。また、小さなエピトープはより経済効率の高い合成が可能なため、このような構造を用いることが好ましい。
【００２７】
好ましい最適な抗原性エピトープは下記式（ＩＩ）で表される構造を含む：
[OS-(X)_n-L-Y]_m-Z （ＩＩ）
（式中、
Ｙは非炭水化物スペーサーまたはグリコシド結合していない末端結合体であり、
ｎは各々独立に０または１であり、
Ｘはラクトシル残基、ガラクトシル残基、Ｎ−アセチルラクトサミニル残基、マンノシル残基、Man₂残基、Man₃残基、Man₃GlcNAc残基、Man₄GlcNAc残基、Ｎ−アセチルグルコサミニル残基またはＮ−アセチルガラクトサミニル残基であり、好ましくは、Ｘはラクトシル残基、ガラクトシル残基、マンノシル残基またはＮ−アセチルガラクトサミニル残基である）。
好ましい態様においては、Ｘはマンノシル残基であり、ＯＳはＸにβ２−、β４−またはβ６−結合、さらに好ましくはβ２−結合している。他の好ましい態様においては、Ｘはラクトシル残基またはＮ−アセチルラクトサミニル残基であり、ＯＳはＸのGal残基にβ３−またはβ６−結合しているか、Ｘはガラクトシル残基またはＮ−アセチルガラクトサミニル残基であり、ＯＳはＸにβ３−またはβ６−結合しており；さらに好ましくは、ＸはGal残基またはGalNAc残基であり、ＯＳはＸにβ３−またはβ６−結合しているか、Ｘはラクトシル残基であり、ＯＳはＸのGal残基にβ３−またはβ６−結合しており；最も好ましくは、ＸはGal残基であり、ＯＳはＸにβ３−結合しているか、Ｘはラクトシル残基であり、ＯＳはＸのGal残基にβ３−結合しているか、ＸはGalNAc残基であり、ＯＳはＸにβ６−結合している。より好ましい態様においては、上記の最適な抗原エピトープ中のオリゴ糖配列はフコースを含まない。
【００２８】
Man₂残基、Man₃残基、Man₃GlcNAc残基およびMan₄GlcNAc残基は、オリゴ糖配列であるManα3Man、Manα6Man、Manα3(Manα6)Man、Manα3(Manα6)ManまたはManα3(Manα6)Manβ4GlcNAcあるいはこれらのハイブリッド型の構造を含むＮ−グリカンコア構造の好ましい部分を示す。付加されたMan残基は、いずれかの非還元末端Man残基、好ましくはManα6分岐鎖に結合し、本発明のオリゴ糖配列は該分子の他の分岐鎖に結合する。
【００２９】
好ましい態様においては、次の構造を含む最適な抗原性エピトープを用いる：OSβ2Man、OSβ2Manα3ManまたはOSβ2Manα6Man。これらは、本研究の初めに見つかったＮ−グリカンlacdiNAcの部分エピトープである。別の態様においては、癌細胞のグリコシル化には欠陥があるため、上記と類似の最適抗原性エピトープであるOSβ3GalおよびOSβ3GalNAc、特にOSβ6GalおよびOSβ6GalNAcを含むＯ−グリカン型lacdiNAcおよび部分ラクトサミン型lacdiNAcは、免疫や、これらの構造を有する腫瘍に対する本願で開示する他の用途に有用である。このような腫瘍は、lacdiNAc型オリゴ糖分泌機能と、ラクトサミンおよび／またはムチン産生との組み合わせによって特徴付けられる。
【００３０】
癌特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を、血清、好ましくはヒトの血清、から抗体を精製するために固定することができる。癌特異的オリゴ糖配列を、好ましくは多価の結合体として、癌特異的オリゴ糖配列に結合する抗体の検出および／または定量、例えば癌の診断のための酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）やアフィニティークロマトグラフィーによる分析にも用いることができる。
【００３１】
抗体産生または予防接種は、癌特異的オリゴ糖配列の類似体または誘導体によっても達成されうる。Ｎ−アセチル基を含むオリゴ糖配列の単純な類似体としては、修飾されたＮ−アセチル基、例えばＮ−プロパノイル基などのＮ−アシル基を含む化合物が挙げられる。本発明は、本発明の癌特異的オリゴ糖配列に対する特異的な類似体の製造にも関する。
【００３２】
さらに、癌特異的オリゴ糖配列に対するヒト抗体または人体に適応させた抗体を、腫瘍や癌を破壊したり、その増殖能を低下させるために用いることができる。ヒト抗体は、癌特異的オリゴ糖配列に対する天然のヒト抗体の耐性を高めた類似体でもよい。このような類似体は、組換え遺伝子工学および／または生物工学によって製造することができ、ヒト抗体の断片または最適化した誘導体などが挙げられる。精製した天然の抗腫瘍抗体は予想されるいかなる副作用も生じることなくヒトに投与することができ、標準的な輸血の際にこのような抗体は移植されている。これは、癌特異的構造が正常の組織または細胞に提示されておらず、且つ、血液型抗原とは異なり、個体差がないとした条件下では確実であり、本発明の癌特異的オリゴ糖配列には血液型のような多様性は知られていない。本願の他の一つの態様においては、種特異的動物抗体を特定の動物の腫瘍または癌に対して用いる。特異的な人体適応抗体を遺伝子工学および生物工学で製造することも可能であり、人体に適応させた抗体の製造方法は、例えば米国特許第5,874,060号および第6,025,481号に記載されている。人体に適応させた抗体はヒト抗体の配列を模倣するように設計されるので、ヒトの患者に投与した際に、動物抗体のように免疫系によって拒絶されることはない。癌の増殖能を低下させたり癌を破壊するための方法は、一般的に固形腫瘍および癌細胞の両方に適用可能であることが知られている。いかなるヒト癌特異的抗原、好ましくはオリゴ糖からなる抗原を認識する精製した天然のヒト抗体を、腫瘍または癌の増殖能を低下させたりそれを破壊するために用いることが可能であることも知られている。他の一つの好ましい態様においては、種特異的動物抗体を特定の動物の腫瘍または癌に対して用いる。
【００３３】
本発明によると、癌特異的オリゴ糖に対するヒト抗体または人体に適応させた抗体、あるいは癌特異的オリゴ糖に結合する、生体に許容される他の物質は、腫瘍または癌細胞を毒性物質の標的とするために有用である。毒性物質としては、例えば細胞殺傷化学療法薬（cell killing chemotherapeutics medicine）（例えばドキソルビシン（Arap et al., 1998））、毒性タンパク質または放射線化学薬剤などの腫瘍の破壊に有効な物質が挙げられる。このような療法は、当業界では発表されており、特許にもなっている。毒性物質は、癌細胞または腫瘍にアポトーシスを起こさせたり、その分化を誘導したり、癌細胞または腫瘍に対する防御反応を増強したりすることもできる。本願の他の一つの態様においては、種特異的動物抗体を特定の動物の腫瘍または癌に対して用いる。本発明の癌結合性抗体は、例えば、いわゆる「ＡＤＥＰＴ−アプローチ」において、癌に対して活性を示すプロドラッグ、あるいはプロドラッグを癌を破壊したり抑制する活性化毒性物質に変換する酵素または他の物質の標的とするために用いることもできる。
【００３４】
上記の治療用抗体は、癌の治療または予防を目的とした医薬組成物に用いることができる。本発明の治療方法は、患者が免疫抑制剤療法を受けているか、免疫不全に陥っている時にも用いることもできる。
【００３５】
免疫抑制剤療法は、例えば、腎臓、心臓、肝臓または肺の移植の際の拒絶反応を抑制するために、臓器移植と共に実施する。このような療法を実施している間に現れる腫瘍は通常は良性であるが、貴重な移植臓器の損失をしばしば引き起こす。腫瘍または癌に特異的な抗原に対する抗体の産生能は、免疫系に見られる個体差によって異なる場合がある。癌から生還したヒトは、特に多量の天然の抗癌抗体を保有している場合がある。
【００３６】
癌に対する治療的ターゲティングを行うための他の方法
診断物質の場合と同様に、癌に対する治療的ターゲティングに用いる物質としては、抗体、抗体断片や人体に適応させた抗体以外にも、多くの薬剤が利用可能であることが知られている。癌に対するターゲティングには、非免疫原性の許容される物質を用いることが特に好ましい。癌に結合するターゲティング物質の例には、癌を破壊または抑制する特異的な毒性、細胞溶解性または細胞調節性の薬剤も含まれる。癌に対する治療的ターゲティングに用いる非抗体分子は、本発明の癌特異的オリゴ糖配列に特異的に結合する分子を包含することが好ましく、このような結合性の分子（即ちオリゴ糖鎖結合性物質）としては、はアプタマー、レクチン、遺伝子工学的に作製したレクチン、LacdiNAc-構造を認識する酵素（例えばグリコシダーゼやグリコシル基転移酵素）および遺伝子工学的に作製したそれらの異型が挙げられる。標識した細菌、ウイルスまたは細胞、あるいは重合体の表面であって、その構造を認識する分子を有するものも癌に対する治療的ターゲティングに用いることができる。本願で開示する癌結合性非抗体物質は、癌を標的とする、癌に対して活性を示すプロドラッグ、あるいはプロドラッグを癌を破壊したり抑制する活性化毒性物質に変換する酵素または他の物質の標的とするためにも用いることもできる。
【００３７】
本発明は特に、本発明の癌特異的オリゴ糖配列に結合する物質および抗体を用いた、患者、好ましくはヒトの患者、の胃腸器系疾患の治療方法に関する。ヒトの胃腸器系で用いる治療用の抗体は、動物によって産生された抗体、例えば家畜（具体的には家畜用反芻動物であるウシ、ヒツジ、ヤギまたはスイギュウなど）の乳に含まれる抗体や、鶏卵で産生した抗体でもよい。公知の方法に従って、動物を癌特異的炭水化物結合体によって免疫することができる。本発明は、ヒトの胃腸器系の癌の抑制または破壊に用いることができる、他の許容される物質、好ましくは食品として許容されるタンパク質にも関し、このような物質の具体例には、癌特異的オリゴ糖配列に特異的な植物レクチンが含まれる。本発明は、胃腸器系に存在する本発明の癌特異的オリゴ糖配列を認識する抗体を含む、機能性食品および食品添加剤に関し、さらに本発明は、食品として許容される他の物質（特に胃腸器系に存在する癌特異的オリゴ糖配列に結合するレクチン）を用いた機能性食品または食品添加剤にも関する。
【００３８】
さらに、本発明によると、癌特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体は、癌細胞を抑制するか排除するための免疫応答を刺激するためにヒトの癌ワクチンとして使用することができる。このような治療は必ずしも癌を根治しない場合もあるが、腫瘍による負担を軽減させたり、癌患者の病態を安定化し、癌の転移能も低下させることができる。ワクチンとして用いるためには、オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体をタンパク質（例えばＢＳＡまたはスカシガイ（keyhole limpet）ヘモシアニン）、脂質またはリポペプチド、細菌の毒素（例えばコレラ毒素または熱不安定毒素）、ペプチドグリカン、免疫活性多糖、あるいはワクチン分子に対する免疫反応を活性化する他の分子、細胞または細胞調製物に結合させることができる。癌ワクチンは、医薬的に許容される担体および所望によりアジュバンドをさらに包含してもよい。適切な担体またはアジュバンドは、例えば免疫応答を刺激することが知られている脂質である。糖類あるいはその誘導体または類似体、好ましくは該糖類の結合体は、少なくとも一種の許容されるアジュバンド分子と共に癌患者に注射あるいは粘膜的（例えば経口的または経鼻的）に投与することができる。癌ワクチンは、癌に対する治療方法において薬剤として使用することができる。このような方法は、ヒトの患者の治療に用いることが好ましい。また、この治療方法は、免疫抑制剤療法を受けているか、免疫不全に陥っている患者の癌の治療に用いることが好ましい。
【００３９】
さらに、癌特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を包含する、癌治療用医薬組成物を製造することができる。該医薬組成物は、ヒトの患者の治療に用いることが好ましい。免疫抑制剤療法を受けているか、免疫不全に陥っている患者の癌の治療に該医薬組成物を用いることが好ましい。上記の治療方法または医薬組成物は、本発明の癌特異的オリゴ糖配列を発現していると診断された癌の治療に用いることが特に好ましい。治療方法または医薬組成物は、癌の治療のための他の治療方法または医薬組成物と共に用いることができる。他の治療方法や医薬組成物には、細胞成長抑止剤、抗血管形成薬、抗癌タンパク質（例えばインターフェロンまたはインターロイキン）または放射線療法が含まれることが好ましい。
【００４０】
癌の診断および薬剤を癌に対してターゲティングするために抗体を用いる方法は、他の抗原やオリゴ糖構造と関連して開示されている（米国特許第4,851,511号、第4,904,596号、第5,874,060号、第6,025,481号、第5,795,961号、第4,725,557号、第5,059,520号、第5,171,667号、第5,173,292号、第6,090,789号、第5,708,163号、第5,902,725号および第6,203,999号）。癌特異的オリゴ糖を癌ワクチンとして用いることも、他のオリゴ糖配列に関連して開示されている（第5,102,663号、第5,660,834号、第5,747,048号、第5,229,289号および第6,083,929号）。
【００４１】
本発明の抗原性物質は、担体に結合することができる。オリゴ糖を一価または多価の担体に結合する方法は当業界では知られている。癌特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体をその還元末端から担体分子に結合することが好ましい。担体分子を用いると、一つの担体に多数の抗原性物質分子を結合することができるので、免疫応答の刺激および抗体結合効率が増大する。最適な抗体産生を達成するためには、分子量が１０ｋＤａよりも大きい結合体で、一般的に１０個を超えるオリゴ糖配列を担持したものを用いることが好ましい。
【００４２】
本発明のオリゴ糖配列は、グリコシル基転移酵素によって酵素的に合成するか、あるいはグリコシダーゼまたはトランスグリコシダーゼによって触媒されるトランスグリコシル化反応で合成することができる（文献としてErnst et al., 2000を参照）。これらの酵素の特異性および補因子の必要性については改良することができる。修飾された特定の酵素を用いてより効率よく合成することもでき、例えば、グリコシル基転移反応を触媒するが、グリコシダーゼ反応は触媒しない酵素を得ることができる。本発明で開示する糖類および糖結合体またはそれらと類似した化合物の有機合成も知られている（Ernst et al., 2000）。炭水化物材料を天然の原料から単離して、化学的または酵素学的に修飾して本願で開示する化合物とすることができる。種々の反芻動物の乳から天然のオリゴ糖を単離することができる。グリコシル化酵素を発現するトランスジェニックな生物、例えばウシや微生物も糖の製造に用いることができる。本発明のオリゴ糖配列は、所望により担体と共に、患者の癌の治療に適当な医薬組成物に加えることができる。本発明によって治療することのできる病態の例としては、本発明の癌特異的オリゴ糖を少なくとも一種発現している腫瘍からなる癌が挙げられる。治療可能な癌の症例は、患者から得た生物学的試料中に癌特異的オリゴ糖配列の存在を検出することによって発見することができる。該試料としては、例えば生検材料または血液試料が挙げられる。
【００４３】
LacdiNAc生合成に対する特異的な阻害剤によって、本願で開示する癌抗原の形成を阻害することができる。このような阻害剤としては、供与ヌクレオチドであるUDP-GalNAcの類似体を用いることができる。グリコシル基転移酵素に対する阻害性類似体を製造する方法は公知である。阻害剤は、LacdiNAcを合成するGalNAc-転移酵素に特異的であることが好ましい。
【００４４】
また、実質的に非抗原性である、化学的および／または酵素学的に合成したオリゴ価または多価の、本発明の癌特異的オリゴ糖配列の結合体は、癌細胞の接着および／または増殖の防止に用いることができる。それは、結合体が抗原性を有するが故に、抗体によって循環血液から阻害性オリゴマーまたはポリマーの消失が達成される。本発明の抗原性物質の例は上記した。非抗原性多糖結合体は、式（ＩＩ）（但し、式中のＸ、ＹおよびＺは免疫原性ではないものとする）にしたがって構築することができる。結合体の分子量は５０キロダルトン（ｋＤａ）未満であることが好ましく、１０ｋＤａ未満であることがさらに好ましい。本発明のオリゴ糖配列は、非タンパク質担体に結合することもできる。その場合、癌特異的オリゴ糖配列を非免疫原性多糖に結合することが好ましく、結合体の分子量が１０ｋＤａ未満であることが最も好ましい。
【００４５】
セレクチンと炭水化物との相互作用は癌転移を仲介するので、LacdiNAc型グリコシル化産物によって転移性癌細胞の標的が血管内皮上に存在するセレクチン含有部位となる場合があり、そのような部位の構造は、強力なセレクチンリガンドとして知られている（Grinnel et al., 1994; Jain et al., 1998）。LacdiNAc糖類は、Dell et al. (1995)に考察されているように、免疫応答から自らを保護することのできる免疫調節活性を有する。末端GalNAc残基は、肝臓のアシアロ糖タンパク質レセプターを癌細胞の標的とすることもできる（Yang et al., 2000）。癌細胞におけるLacdiNAc生合成を阻害することによって、癌の転移能および悪性度を低下させる。本発明は特に、癌細胞の転移能を阻害するための、LacdiNAc生合成の阻害に関する。最適な抗原性エピトープは、転移阻害剤としては設計されていない。正常な免疫系および白血球機能にも必要なセレクチン仲介細胞接着を阻害しないように、ワクチン型のアプローチにおいては、非常に少量のLacdiNAc構造を使用する。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、他の物質、例えば不活性なベヒクルまたは医薬的に許容される担体や保存剤などの公知の物質を包含してもよい。
【００４７】
本発明の抗原性物質または医薬組成物は、適当な方法で投与すればよい。治療用抗体またはワクチンの投与方法は公知である。
【００４８】
本願において「治療」とは、疾患または病態を治癒または改善するための治療と、疾患または病態の発症を予防するための治療の両方を意味する。治療は急性的または慢性的に行うことができる。
【００４９】
本願において「患者」とは、本発明による治療を必要とするいかなる哺乳類も意味する。
【００５０】
癌特異的オリゴ糖または本発明の癌特異的オリゴ糖を特異的に認識する化合物を診断または型の同定に用いる場合、例えば、オリゴ糖または化合物はプローブやテストスティックに含まれていてもよく、所望により、テストキットの一部を構成してもよい。このようなプローブやテストスティックが、癌患者から得た抗体を包含する試料あるいは患者の癌細胞または癌組織と接触すると、癌陽性試料の成分はプローブまたはテストスティックに結合し、試料から取り出されてさらに分析される。
【００５１】
本願において「癌」とは、「腫瘍」または「癌細胞」を意味する。「腫瘍」は、固形の多細胞腫瘍組織を意味する。さらに、本願において「腫瘍」は、前悪性状態の組織であって、固形腫瘍に分化し、癌に特異的な特徴を有するものを意味する。本願において「腫瘍」という用語は、白血病のような単一細胞癌、培養した癌細胞、またはそのような細胞のクラスターを意味するものではない。本願において「癌細胞」という表現は、腫瘍内の細胞、単一癌細胞（例えば白血病細胞）またはその他のいかなる種類の悪性細胞をも意味し、悪性細胞は癌または腫瘍に分化するもので、癌の特徴または癌特異的な特徴を有するものである。
【００５２】
LacdiNAc 構造およびフコシル化 LacdiNAc 構造並びにそれらの類似体の酵素学的合成
末端LacdiNAcエピトープは、多量のβ４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば市販のウシ乳ガラクトシルトランスフェラーゼ）および受容体に対して過剰モル量のUDP-GalNAcを用いて合成することができる。例えば、UDP-GalNAcとGlcNAcβ3Galβ4Glcを比較的多量のβ４−ガラクトシルトランスフェラーゼと共にNyame et al. (2000)の記載のようにインキュベートすると、GalNAcβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcが得られる。
【００５３】
上記の反応は、UDP-GalNAcから効率的にGalNAcを転移することのできる新規な組換え型ガラクトシルトランスフェラーゼによって行うこともできる（Ramakrishnan et al., 2001）。
【００５４】
GalNAcβ4GlcNAcエピトープまたはそのシアリル化誘導体（NeuNAcα3GalNAcβ4GlcNAc）を数種類のα３−フコシルトランスフェラーゼによってフコシル化することが可能であり、例えば、Bergwerff et al. (1993)の記載と実質的に同様にヒト乳から得たフコシルトランスフェラーゼによってフコシル化したり、フコシルトランスフェラーゼＶＩによってフコシル化することができる。
【００５５】
新規な GalN 誘導体、特に lacdiNAc 構造およびそれらの誘導体の製造
本発明は、酵素学的合成の新規な経路にも関する。これらの経路は、lacdiNAc構造、関連構造およびそれらの類似体の製造にin vitroで用いることができる。ヘキソサミンに対するグリコシダーゼ反応およびグリコシダーゼ反応に用いるヘキソサミン供与体については、従来技術に記載がある。本発明は、通常、末端Gal残基やGalNAc残基などを含む受容体構造を使用する種々のグリコシル基転移酵素のための受容体として、末端ヘキソサミン、特にガラクトサミンおよびGalNβ4Glc(NAc)末端構造を用いる方法に関する。
【００５６】
上記の反応はこれまで報告されておらず、負に電位を帯びたヌクレオチド糖供与体の近傍に存在する正に電位を帯びたアミン基が反応を阻害していると考えられていた。電荷を帯びたアミノ基は、受容体の２位の水酸基を必要とする酵素による認識を阻害するか、または酵素の活性部位に対する望ましくない不可逆的結合を生じるとも考えられていた。本発明は、新規なグリコシル基転移酵素反応が可能であり、このような反応は哺乳類のグリコシル基転移酵素によっても可能であることを初めて開示する。グリコシダーゼ触媒反応と比較して、グリコシル基転移酵素反応は、通常、一対の供与体および受容体物質から一種類の生成物のみを形成するといった特異性を示すが、一方、グリコシダーゼ触媒によるグリコシル基転移反応は、一般的に数種類の生成物を生じる。
【００５７】
以前から、Gal受容体を用いる酵素に強制的にGalNAcを使用させることによって、lacdiNAc誘導体は合成されていた。このような方法の収率は一般的に非常に低い。ある種の転移酵素を用いた反応の中には、末端GalNAcを用いた反応よりも効率の悪いものもあるが、アミン基の存在は、天然Gal/GalNAc配列のアミン誘導体または類似体の特異的な合成を可能にする。
【００５８】
新規な反応は、悪性腫瘍または疾患に関連する新規な抗原性構造の潜在的な生合成経路も明らかにした。このような抗原性構造は正常な組織からは特徴付けることのできないものである。特に、新規な血液型関連抗原は、天然のグリコシル化酵素によって製造されている。
【００５９】
好ましい反応としては、末端ヘキソサミン（より好ましくはガラクトサミン）の３位、４位または６位に対するグリコシル基転移反応が挙げられ、ガラクトサミンの３位または６位に対する反応が更に好ましく、ガラクトサミンの３位に対する反応が最も好ましい。好ましい反応の具体例には、次の反応が含まれる：α３−シアリルトランスフェラーゼ反応、α６−シアリルトランスフェラーゼ反応、α３−ガラクトシルトランスフェラーゼ反応、α３−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ反応、α３−ガラクトサミニルトランスフェラーゼ反応、β３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ反応、β６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ反応、β３−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ反応およびβ３−グルクロニルトランスフェラーゼ反応。最も好ましい反応はα３−シアリルトランスフェラーゼ反応、α３−ガラクトサミニルトランスフェラーゼ反応およびα３−ガラクトシルトランスフェラーゼ反応である。
【００６０】
好ましい合成反応は下記式（ＩＩＩ）で表される反応である。
SAC-供与体＋ GalNβ3/4 → SACyxGalNβ3/4 （ＩＩＩ）
［式中、
ｙはα−またはβ−結合であり、
ｘは各々独立して３位、４位または６位の結合位置を表し、
GalNβ3/4は、ヘキソース、ヘキソサミンまたはヘキソサミン誘導体、好ましくはGal、GalN、GalNAc、Glc、GlcNまたはGlcNAc、にβ３−またはβ４−結合している非還元末端GalNを表し、好ましい態様においては、GalNβ4は非還元末端構造（GalNβ4GlcNAcまたはGalNβ4Glc）の一部である、例えば、GalNβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcであり、
ＳＡＣはシアル酸または下記式で表される糖残基を表し、
Hex(A)_s1[N(Ac)_s2]_s3
（式中、HexはGalまたはGlcであり、ｓ１、ｓ２およびｓ３は各々独立に０
または１の整数であり、但しｓ１が１である場合には、ｓ３は０である）
上記式中のｓ１が１である場合には、ＳＡＣで表される構造はヘキスロン酸構造、好ましくはGlcA、を含み；ｓ３が１であり、且つ、ｓ２が１である場合には、ＳＡＣで表される構造はGlcNAcまたはGalNAcを含み；そして、ｓ２が０である場合には、ＳＡＣで表される構造はGalNまたはGlcNを含んでいる。］
【００６１】
さらに、本発明は下記式（ＩＶ）で表される新規な炭水化物に関する。
Gal[N(Am)_s2]_s3α3GalN(Am)_s2β3/4 （ＩＶ）
（式中、
Ａｍはアミン基の誘導残基であるが、但し、Ａｍはアセチル（Ａｃ）基またはイミド基ではなく、好ましくはGalN残基とカルボン酸を形成するアミド基、例えば、ホルムアミド、プロピオン酸アミド、他のアルキルアミド、カルボン酸を含むシクロヘキサンラジカルのアミドなどの環状アミド、および安息香酸のアミド基のような芳香族炭化水素のアミド基であり、
ｓ２およびｓ３は各々独立に０または１の整数である。）
アセチル基は天然のオリゴ糖配列に存在するので、上記式で表される類似体においては好ましくない。また、嵩高いイミド基（例えばフタルイミド基）は、類似体の立体構造を必要以上に変えてしまう大きな官能基であるために好ましくない。
【００６２】
さらに好ましい炭水化物としては、次の末端オリゴ糖配列が挙げられる：Gal[N(Am)_s2]_s3α3GalN(Am)_s2β4GlcNAcおよびGal[N(Am)_s2]_s3α3GalN(Am)_s2β4Glc。最も好ましい末端オリゴ糖配列としては、次の配列が挙げられる：Galα3GalN(Am)_s2β4GlcNAc、Galα3GalN(Am)_s2β4Glc、Galα3GalNβ4GlcNAcおよびGalα3GalNβ4Glc。
【００６３】
新規な炭水化物は、特に抗原として使用したり、免疫に用いるのに有用である。希少な、大部分が非天然または病原性関連の炭水化物は、関連構造も認識する抗体の製造を誘導するための免疫原として有用である。アミン含有炭水化物は、更なる類似体を製造するための出発物質や、グリコシダーゼの基質および／または阻害剤の候補物質、動物のまたは植物のレクチンに結合する天然オリゴ糖配列の類似体の候補物質として有用でもある。
【００６４】
本発明は、UDP-GalNをまず受容体（例えばGlcNAc、グルコースあるいは非還元末端のGlcNAcまたはグルコース）に転移する反応と、同じ反応容器内でUDP-GalNのGalNを受容体の３位、４位または６位、好ましくは３位または６位、最も好ましくは３位、に修飾する反応の二つを組み合わせた反応にも関する。他の反応の組み合わせにおいては、二種のグリコシル基転移酵素を使用することで、主要な反応系中でUDP-GalNの合成も同時に行うことができる。反応に用いるためのUDP-GalNをin situで製造する方法はすでに報告されている。
【００６５】
本発明においては、GalN1-リン酸およびUDP-GlcからUDP-GalNを作製する単純な方法が好ましい。lacdiNAc型構造の合成に関する好ましい態様には、ヘキソサミンのＮ−アセチル化によってＮ−アセチルヘキソサミンを得る反応（例えばGalNからGalNAcを得る反応）が含まれる。
【００６６】
好ましい態様においては、Ｎ−アセチルヘキソサミンまたはヘキソースを含有するオリゴ糖の類似体が製造され、lacdiNAc類似体が製造されることがより好ましい。本発明は、ヘキソサミンのアミン誘導体の製造にも関し、ヘキソサミンの好ましいアミン類似体または誘導体には、ホルムアミド、プロピオン酸アミド、他のアルキルアミド、カルボン酸を含むシクロヘキサンラジカルのアミドなどの環状アミド、および安息香酸のアミド基のような芳香族炭化水素のアミド基が含まれる。
【００６７】
好ましい態様においては、ヘキソサミンはグリコシル基転移酵素によってヘキソサミンに転移され、より好ましくはガラクトサミンがガラクトサミンに転移され、さらに好ましくは、GalNα3GalNβ4GlcNAcが形成される。この物質はアミノ基の誘導によってGalNAcα3GalNAcβ4GlcNAcまたは本発明で定義した類似体にさらに修飾することができる。
【００６８】
別の態様においては、UDP-GalNをα−ガラクトシルトランスフェラーゼまたはα−GalNAcトランスフェラーゼ、好ましくはα３−ガラクトシルトランスフェラーゼによって、Galβ-末端を有する受容体に転移する。アミン基は、Ｎ−アセチル基または誘導アミン基を含む類似体にさらに誘導することができる。このような方法で得られる生成物の例としてはGalNAcα3Galβ4GlcNAc、GalNα3Galβ4GlcNAc、GalNAcα3(Fucα2)Galβ4、GalNα3(Fucα2)Galβ4、GalNAcα3(Fucα2)Galβ3、GalNα3(Fucα2)Galβ3、GalNAcα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcおよびGalNα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcが挙げられ、これらはヒトＡ／Ｂ血液型抗原の末端構造および類似体に相当する。
【００６９】
さらに本発明は、下記式（Ｖ）で表される新規な炭水化物に関する。
GalN(Am)_r1α3(Fucα2)_r2Galβ3/4 （Ｖ）
（式中、
ｒ１およびｒ２は各々独立に０または１の整数であり、
Ａｍはアミン基の誘導残基であるが、但し、Ａｍはアセチル（Ａｃ）基またはイミド基ではなく、好ましくはGalN残基とカルボン酸を形成するアミド基、例えば、ホルムアミド、プロピオン酸アミド、他のアルキルアミド、カルボン酸を含むシクロヘキサンラジカルのアミドなどの環状アミド、および安息香酸のアミド基のような芳香族炭化水素のアミド基である。）
アセチル基は天然のオリゴ糖配列に存在するので、上記式で表される炭水化物においては好ましくない。また、嵩高いイミド基（例えばフタルイミド基）は、類似体の立体構造を必要以上に変えてしまう大きな官能基であるために好ましくない。
【００７０】
さらに好ましい炭水化物としては、以下の末端オリゴ糖配列が挙げられる：
GalNα3Galβ4GlcNAcおよびGalNα3Galβ4Glc；
GalNα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcおよびGalNα3(Fucα2)Galβ4Glc；
GalNAmα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcおよびGalNAmα3(Fucα2)Galβ4Glc；ならびに
GalNAmα3Galβ4GlcNAcおよびGalNAmα3Galβ4Glc。
最も好ましい炭水化物としては、以下の末端オリゴ糖配列が挙げられる：
GalNAmα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcおよびGalNAmα3(Fucα2)Galβ4Glc；ならびに
GalNAmα3Galβ4GlcNAcおよびGalNAmα3Galβ4Glc。
【００７１】
新規な炭水化物は、特に抗原として使用したり、免疫に用いるのに有用である。希少な、大部分が非天然または病原性関連の炭水化物は、関連構造も認識する抗体の製造を誘導するための免疫原として有用である。アミン含有炭水化物は、更なる類似体を製造するための出発物質や、グリコシダーゼの基質および／または阻害剤の候補物質、動物のまたは植物のレクチンに結合する天然オリゴ糖配列の類似体の候補物質として有用でもある。
【００７２】
本発明は、特に本発明で開示する新規な物質を用いた免疫方法ならびに本発明で開示する物質に結合するレクチンおよび抗体のスクリーニング方法に関する。具体的には、本発明は、血液型抗原に結合する抗体や関連した抗体の特異性を判断するためのスクリーニングに関する。
【００７３】
本発明は、特に口腔癌の診断および／または治療に関し、該口腔癌としては、本発明のオリゴ糖配列を発現する喉頭癌または白血病型の癌が好ましい。また、本発明は、特に本願で開示するlacdiNAc構造をその表面に発現する全ての種類の癌に対する、本発明の治療にも関する。他の一つの好ましい態様においては、本発明は、通常lacdiNAc配列を含むタンパク質を発現および分泌する組織の癌の治療に関し、そのような組織としては糖タンパク質ホルモン分泌組織が挙げられる。
【００７４】
糖脂質および炭水化物の命名は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会の推奨する命名法（Carbohydrate Res. 1998, 312, 167; Carbohydrate Res. 1997, 297, 1; Eur. J. Biochem. 1998, 257, 29）に従った。
【００７５】
Gal、Glc、GlcNAc および NeuNAcはＤ型であり、FucはＬ型であり、全ての単糖残基はピラノース環構造であるものとする。グルコサミンはGlcNと示し、ガラクトサミンはGalNと示す。グリコシド結合は略記で示す場合と正式名称で示す場合とあり、NeuNAc残基のα３およびα６結合はそれぞれα２−３およびα２−６結合と同じである。β１−３、β１−４およびβ１−６結合はそれぞれβ３、β４およびβ６と略すことができる。ラクトサミン、Ｎ−アセチルラクトサミンまたはGalβ3/4GlcNAcは、１型構造残基Galβ3GlcNAcおよび２型構造残基Galβ1-4GlcNAcのいずれかを示し、シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸またはNeuNAcであり、Lacはラクトースを示し、Cerはセラミドを示す。SAはシアル酸、例えばNeuNAcを示す。本発明の癌関連二糖配列であるGalNAcβ4GlcNAcはlacdiNAcまたはLacdiNAcと略す。
【００７６】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７７】
実施例１
MMP-9 の分析方法
MMP-9の単離
一連のＣＭ−セルロース（ＣＭ−５２）クロマトグラフィーと続くDEAE/REDセファロースクロマトグラフィーによって、U-937細胞からMMP-9を単離した（Saarinen et al., 1999）。
【００７８】
MMP-9の４−ビニルピリジンアルキル化
MMP-9の濃縮・脱塩を、Poros^TMＲ２カラム（２．１×１５０ｍｍ）を用い、アセトニトリルの直線グラジエント（０．１％トリフルオロ酢酸溶液、１５分間で３〜１００％）で溶出する逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で行った。クロマトグラフィーは流速１ｍｌ／分で行い、MMP-9の溶出を２１４ｎｍにおける紫外線吸収度でモニターした。溶出したMMP-9は真空乾燥し、以下のアルキル化に付した。MMP-9 試料を６Ｍグアジン塩酸と２ｍＭＥＤＴＡを含む０．５Ｍトリス（ｐＨ７．５）溶液８０μｌに溶解し、５μｌの０．６ＭＤＴＴを添加して還元し、室温で２０分間インキュベートした。還元後、１μｌの４−ビニルピリジンを加え、続いて室温で１５分間アルキル化反応を行った。反応は５μｌの０．６ＭＤＴＴを添加することで停止し、アルキル化したMMP-9を得た。得られたアルキル化したMMP-9は上述のようにＲＰ−ＨＰＬＣで直ちに脱塩した。
【００７９】
トリプシン消化
２．５μｌ（１００ｐｍｏｌ）のアルキル化MMP-9を真空乾燥し、４０μｌの１．６６ｎｇ／μｌトリプシン（シークエンシング用グレード、Promega社製）含有５０ｍＭ二炭酸アンモニウム緩衝液に溶解した。消化は３７℃で一晩行った。
【００８０】
質量分析法
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳは、波長が３３７ｎｍの窒素レーザーを備えたBiflex飛行時間型装置（ドイツ国、Bruker Franzen Analytik社製）で行った。総MMP-9 Ｎ−グリカンのみならず、ＮＤＶシアリダーゼ反応産物も、リニア型の陽イオン遅延引き出しモード（linear positive ion delayed extraction mode）において、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（Fluka Chemie AG社製、３ｍｇ／ｍｌ、溶媒はアセトニトリル／２０ｍＭクエン酸ジアンモニウム水溶液（容量比は１：１））をマトリックスとして分析した。C. perfringensのシアリダーゼおよびフコシダーゼ処理で得たグリカンは、リフレクター型の陽イオン遅延引き出しモード（reflector positive ion delayed extraction mode）において、２，５−ジヒドロ安息香酸（１０ｍｇ／ｍｌ）をマトリックスとして分析した。スペクトルは、デキストラン５０００（Fluka Chemie AG社製）を用いて外部補整した。
【００８１】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量スペクトルは、ハイブリッド四重極型飛行時間型質量分析計 Micromass Q-TOF（英国、Micromass社製）を用いて得た。イオン化は、シリカキャピラリー針（内径：２０μｍ、先端開口部：１０μｍ、もう一方の末端から金で被覆されている）（New Objective Inc.社製）を備えたナノスプレーイオン源（２．２ｋＶで作動）を通すことで達成した。
【００８２】
ナノフローＬＣ／ＭＳによるグリコシル化部位の決定
MMP-9をトリプシン処理して得たペプチド試料（１ｐｍｏｌ）を、PepMapカラム（０．０７５×１５０ｍｍ、NAN75-15-03-C18-PM、LC Packings社製）を用い、アセトニトリルの直線グラジエント（０．１％ギ酸溶液、３０分間で４〜４０％）で溶出するマイクロボア逆相クロマトグラフィーによって分離した。クロマトグラフィーは流速２５０ｎｌ／分で行い、２１４ｎｍにおける紫外線吸収度を記録した。ＬＣは、Micromass Q-TOF質量分析計に直接つないだ。質量分析計は、グリコシル化成分の同定を促進するために、低コーン電圧条件および高コーン電圧条件の両方でＨＰＬＣ溶出液をスキャンするように、Carr et al. (1993)の報告に従って設定した。低コーン電圧のスキャンは、コーン電圧が３５Ｖの条件でｍ／ｚ１００〜２５００の質量数範囲をスキャンし、溶出成分の質量分析スペクトルを得た。高コーン電圧のスキャンは、コーン電圧が１２０Ｖの条件、具体的には、質量分析計へ導入する全てのイオンに高衝突励起ポテンシャルを適用する条件下で得た。これは、質量に基づく分離を行う前に、導入イオンの衝突によって誘導されるフラグメント化を生じる。高コーン電位のスキャンの際には、質量分析計はｍ／ｚ１００〜１０００をスキャンするように設定した。次に、ｍ／ｚ２０４．１（HexNAcのオキソニウムイオン）、ｍ／ｚ２９２．１５（Neu5Acのオキソニウムイオン）およびｍ／ｚ３６６．１（Hex-HexNAcのオキソニウムイオン）について再構成したクロマトグラムを作成することで、溶出した糖ペプチドに選択的なクロマトグラムを得た。
【００８３】
白血病細胞から得た LacdiNAc 構造の分析
癌細胞上のLacdiNAc配列の異常発現を示すために、メタロプロテアーゼ−９（MMP-9）を白血病細胞（U-937）から単離し、Ｎ−グリコシド結合グリカンをＮ−グリコシダーゼＦで遊離させた。グリカン画分をトリヒドロキシアセトフェノンマトリックス中でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いて分析したところ（図１Ａ）、無視できるほど少量のシアル酸残基の開裂が見られた。帰属された単糖組成を、以下のグリコシダーゼ処理で推定された構造と共に表１に示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによるオリゴ糖の分析は、比較的計量的であることが示されているので、各成分の相対的な存在量も示す。最も多量に存在するグリカン種を、(Hex)₅(HexNAc)₄(Fuc)₃の[M+Na]⁺に帰属した。典型的なＮ−グリカン構造はわかっているので、仮にこの構造をトリフコシル化ジアンテナリー複合体型グリカンとして帰属した。他の主要なグリカン種は、シアリル化、ジフコシル化ジアンテナリー複合体型グリカン、および１つのアンテナに末端単糖としてGalの代わりにGalNAcを有する（いわゆるLacdiNAc構造を有する）トリフコシル化ジアンテナリー複合体型グリカンとして同定した。一連のグリコシダーゼ処理によって示されるように、これらの帰属は正しいことが判った。比較のために、非悪性白血球細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼMMP-9の構造も決定したところ、このタンパク質にはlacdiNAc配列が含まれていなかった（Rudd et al., 1999）。
【００８４】
グリカンの構造的特徴づけを、一連のグリコシダーゼ処理をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳでモニターすることで行った。二種の妥当なNeu5Ac結合（α2-3対α2-6）を見分けるために、グリカン混合物をＮＤＶノイラミニダーゼ、即ち、α2-3ノイラミン酸に非常に特異的な酵素で処理した。その結果、部分開裂が観察され（図１Ｂ）、これはＮＤＶシアリダーゼ活性に対して耐性であることが知られているＳＡのα2-3GalNAc結合から生じたものであると考えられる。他の可能性としては、α2-3結合ＳＡおよびα2-6結合ＳＡの両方が混在していると考えられる。特異性の緩やかなノイラミニダーゼ（Clostridium perfringens）でＮ−グリカン画分を処理したところ、次のような変化が観察された（図１Ｃ）：ｍ／ｚ２２４７．３、２２８７．９および２３９２．３のシグナルが消失し、ｍ／ｚ１８０９．７０、１８５０．７８、１８９１．７５、１９５５．７７および１９９６．７９のシグナルが現れた。これらの結果は、正常なバイアンテナリーＮ−グリカンの異なるフコシル化体、アンテナの一つにLacdiNAc構造（GalNAcβ1-4GlcNAc）を有するバイアンテナリーＮ−グリカンおよびアンテナの両方にLacdiNAc構造を有する少量のＮ−グリカンの存在を示す。アーモンドの実由来のα1-3(4)フコシダーゼ（アンテナからα1-3(4)結合フコース残基を除くが、Ｎ−グリカンコアからα1-6結合フコース残基を開裂しない酵素）で試料を処理したところ、１８０９．８０、１８５０．７８および１８９１．８４のシグナル（強度：６７％、２７％および６％）が出現した。これらの結果は、およそ３０％のグリカンが一つまたは両方のアンテナのいずれかにLacdiNAc配列を有することを示す。この結果は、下記のＬＣ−ＥＳＩＭＳのデータとよく符合する。
【００８５】
U-937細胞からMMP-9を単離し、アルキル化し、さらにトリプシンで消化した。糖ペプチドを同定するために、MMP-9のトリプシン処理ペプチドのＬＣ／ＭＳ分析を段階的なコーン電圧を用いて行い、総イオンのクロマトグラム（図２Ａ）および糖ペプチドと考えられるものを示すクロマトグラム（図２Ｂ、ＣおよびＤ）の両方を得た。本研究で用いたクロマトグラフィーの条件（即ち、PepMap媒体を０．１％ギ酸−アセトニトリルで溶出する条件）においては、糖ペプチドの分離はペプチド部位とグリカン部位の両方の影響を受ける。より一般的に用いられるトリフルオロ酢酸−アセトニトリル系においては、糖ペプチドの分離は、ペプチド部位の特性にのみ支配される。その結果、糖ペプチドは２３．１分および２４．３分に溶出する二種の主要なピークとして得られた。
【００８６】
２３．１分に溶出したものの質量スペクトルを図３Ａに示し、図中のシグナルは全て複合型グリカン（表１参照）を有するグリコシル化ペプチドTrp¹¹⁶-Arg¹³⁴に帰属することができる。このスペクトルの中で最も強度の高いｍ／ｚ１１４３．４９のイオンを、(Hex)₅(HexNAc)₄(Fuc)₃を有するTrp¹¹⁶-Arg¹³⁴の[M+4H]⁴⁺に帰属する。２４．３分に溶出したものの質量スペクトルを図３Ｂに示す。このスペクトルの中で最も強度の高いｍ／ｚ１１７９．５４のイオンを、(Hex)₅(HexNAc)₄(Fuc)₂(SA)₁を有するTrp¹¹⁶-Arg¹³⁴の[M+4H]⁴⁺に帰属する。
【００８７】
本発明は、U-937細胞誘導MMP-9が、そのＮ−グリカンの大きな画分（およそ３０％）にLacdiNAc構造を有することを示す。LacdiNAc構造の存在は、二種の独立した方法、すなわち完全糖ペプチドのＬＣ−ＥＳＩＭＳだけでなく、遊離したＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析でも証明された。構造の帰属は、さらに一連のグリコシダーゼ処理によって確認した。本研究で用いた方法の有効性は、合成オリゴ糖と公知の天然の構造体の両方を用いたいくつかのアプローチで立証されている。
【００８８】
以下のグリカンを用いた同様の実験については、実施例２に記載した：
喉頭癌由来のLacdiNAc配列含有シアリル化Ｎ−グリカン、および
LacdiNAc配列、シアリル−LacdiNAc配列およびフコシル−LacdiNAc配列を有するヒトメラノーマ細胞（ＲＰＭＩ−７９３２およびＲＰＭＩ−７９５１）の膜タンパク質Ｎ−グリカン。
【００８９】
実施例２
固形腫瘍およびメラノーマ細胞膜の分析
癌試料の出発材料
喉頭癌試料としては、外科的手術の際に集めた腫瘍試料をホルマリン固定したものを用いた。グリカンを単離する前には、タンパク質をManzi et al. (2000)の記載と実質的に同様のクロロホルム−メタノール抽出を行うことで濃縮した。糖タンパク質の定量的抽出は、標準放射性標識糖タンパク質によって確認した（データは示さない）。
【００９０】
クロロホルム−メタノール抽出タンパク質からのグリカンの単離
グリカンは、試料糖タンパク質から非還元的β−脱離法によって分離し、クロマトグラフィーによって精製した。
【００９１】
ヒトメラノーマ細胞膜タンパク質の単離
ヒトメラノーマ細胞（ＲＰＭＩ−７９３２およびＲＰＭＩ−７９５１）を室温でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞培養皿から細胞をかきとり、遠心分離によって細胞を回収した。以下の精製工程は０℃〜＋４℃で行った。細胞を低浸透圧緩衝液（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５））でインキュベートした後にホモジナイザーで破砕し、そこに終濃度が１５０ｍＭとなるようにＮａＣｌを添加して等浸透圧緩衝液に戻した。細胞膜の塊から細胞核を低速遠心分離によって分離するが、分離は顕微鏡検査でモニターした。膜および細胞質ゾル材料を含む上清を、更に４０，０００ｇで遠心分離した。得られたペレット（膜調製物）を、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１５０ｍＭＮａＣｌおよび１％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００を含む界面活性剤緩衝液中でホモジナイズした。インキュベートした後、調製物を１００，０００ｇで遠心分離し、界面活性剤抽出膜タンパク質を含む上清を回収した。緩衝塩および界面活性剤を、Verostek et al. (2000)に従った寒冷アセトン沈殿法（cold acetone precipitation）によって除去した。
【００９２】
膜タンパク質Ｎ−グリカンの単離
Nyman et al. (1998)の記載と実質的に同様の方法に従って、Chryseobacterium meningosepticum Ｎ−グリコシダーゼＦ（米国、Calbiochem社製）を用いて膜糖タンパク質からＮ−グリカンを分離し、次いでVerostek et al. (2000)とPacker et al. (1998)の記載と実質的に同様に精製した。ＲＰＭＩ−７９５１細胞から得たＮ−グリカンは、さらに１）ＡＧ−５０Ｗ強カチオン交換材料カラムおよび２）水で膨潤させたＣ₁₈シリカのカラムを通したが、ＲＰＭＩ−７９３２細胞から得たＮ−グリカンに対しては、このような処理は行わなかった。いずれのＮ−グリカンも、Packer et al. (1998)の記載と実質的に同様に、黒鉛化炭素のカラム（graphitised carbon column）によってシアリル化画分と非シアリル化画分に分離した。
【００９３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、Voyager-DE STR BioSpectrometry Workstationを用い、Saarinen et al. (1999)、Papac et al. (1996)およびHarvey(1993)の記載と実質的に同様に行った。
【００９４】
エキソグリコシダーゼ消化
全てのエキソグリコシダーゼ反応をNyman et al. (1998)およびSaarinen et al. (1999)の記載と実質的に同様に行い、結果はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで分析した。使用した酵素とそれによって特徴付けられるオリゴ糖を用いた特異的な対照反応を以下に示す：Arthrobacter ureafaciensのシアリダーゼ（E. coli組換え体；英国、Glyko社製）は、オリゴ糖中のNeu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAc-RおよびNeu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc-Rの両方を消化した；β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Streptococcus pneumoniae由来、E. coli組換え体；米国、Calbiochem社製）は、GlcNAcβ1-6Gal-Rを消化したが、GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3/6Gal-Rは消化しなかった；β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ナタマメ由来；米国、Calbiochem社製）はGlcNAcβ1-6Gal-RおよびGalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3/6Gal-Rの両方を消化した；およびα1,3/4−フコシダーゼ（Xanthomonas sp.由来；米国、Calbiochem社製）は、Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc-Rを消化したが、Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc-Rは消化しなかった。対照の消化反応も分析用のエキソグリコシダーゼ反応と並行して行い、その結果も同様に分析した。
【００９５】
結果
喉頭癌試料のLacdiNAc含有シアリル化Ｎ−グリカン
喉頭癌試料のシアリル化グリカンは、Arthrobacter ureafaciens シアリダーゼによって効率的に脱シアリル化された。脱シアリル化はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳでモニターした（データは示さない）。脱シアリル化したグリカンは、はじめに、末端β−GlcNAc残基を特異的に加水分解するがβ−GalNAc残基は加水分解しない濃度のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを用いて消化した。更にβ−アセチルヘキソサミニダーゼを添加すると、一つのＮ−グリカンから二つのHexNAc残基が除去された。この結果は、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの作用には耐性であるが、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼで完全に消化されるGalNAcβ1-4GlcNAc配列の存在を示した。β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化の際には、ｍ／ｚ１８５０．３８とｍ／ｚ１８５０．１６に観測される、[Hex₄HexNAc₅Fuc₁+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ：１８５０．６７）に対応するピークの相対シグナル強度は有意に減少した。同時に、ｍ／ｚ１４４４．３０とｍ／ｚ１４４４．１５に観測される、[Hex₄HexNAc₃Fuc₁+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ：１４４４．５１）に対応するピークの相対シグナル強度は増加し、ｍ／ｚ１６４７．３４とｍ／ｚ１６４７．１９に観測される、[Hex₄HexNAc₄Fuc₁+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ１６４７．５９）に対応する不完全消化産物の相対シグナル強度は増加しなかった。検討中のLacdiNAc含有Ｎ−グリカンのシアリル化体に対応する一つの観測されたピーク、具体的には、ｍ／ｚ２１１８．０９のイオン（[NeuAc₁Hex₄HexNAc₅Fuc₁-H]^-; 計算値：ｍ／ｚ２１１８．９３）は、シアル酸残基を一つしか有していない。しかしながら、本願のデータは、もとの試料中に異なるシアリル化体が存在している可能性を排除することはできない。ここで重要なのは、多くの健康な組織から得た試料を同様に分析した場合には、LacdiNAc含有グリカンの形跡が見つからなかったことである。
【００９６】
ヒトメラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２およびＲＰＭＩ−７９５１の膜タンパク質由来脱シアリル化Ｎ−グリカン
膜結合シアリル化Ｎ−グリカンを包含するシアリル化Ｎ−グリカンは、Arthrobacter ureafaciens シアリダーゼで効率的に脱シアリル化された。脱シアリル化は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳでモニターした（データは示さない）。脱シアリル化したＮ−グリカンは、はじめに、末端β−GlcNAc残基を特異的に加水分解するがβ−GalNAc残基は加水分解しない濃度のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを用いて消化した。更にβ−アセチルヘキソサミニダーゼを添加すると、いくつかのＮ−グリカンからHexNAc残基が除去された。以下にβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ感受性であるが、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ非感受性の構造（構造Ａ〜Ｅ）を例示するが、上述の酵素はこれらの構造から同時に二つまたは四つのHexNAc残基のみを除去した。これらの結果をまとめると、下記の構造は、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの作用には耐性であるが、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼで完全に消化されるGalNAcβ1-4GlcNAc配列を含むことが示された。
【００９７】
ヒトメラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２の膜タンパク質由来LacdiNAc含有Ｎ−グリカン（図５〜７）：
構造Ａ． β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化の際には、ｍ／ｚ１７０４．７１に観測される、[Hex₄HexNAc₅+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ１７０４．６１）に対応するピークは、ｍ／ｚ１２９８．５３に観測される、[Hex₄HexNAc₃+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ１２９８．４５）に対応するピークに変化した。一方、ｍ／ｚ１５０１．６２に観測される、[Hex₄HexNAc₄+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ１５０１．５３）に対応する不完全消化産物の相対シグナル強度は増加しなかった。
構造Ｂ． β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化の際には、ｍ／ｚ１８５０．７３とｍ／ｚ１８５０．７２に観測される、[Hex₄HexNAc₅Fuc₁+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ１８５０．６７）に対応するピークの相対シグナル強度は有意に減少した。同時に、ｍ／ｚ１４４４．５９とｍ／ｚ１４４４．５８に観測される、[Hex₄HexNAc₃Fuc₁+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ１４４４．５１）に対応するピークの相対シグナル強度も有意に増加した。一方、ｍ／ｚ１６４７．６６に観測される、[Hex₄HexNAc₄Fuc₁+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ１６４７．５９）に対応する不完全消化産物の相対シグナル強度の増加は見られなかった。
構造Ｃ． β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化の際には、ｍ／ｚ１８９１．７８に観測される、[Hex₃HexNAc₆Fuc₁+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ１８９１．６９）に対応するピークは、ｍ／ｚ１０７９．４７に観測される、[Hex₃HexNAc₂Fuc₁+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ１０７９．３８）に対応するピークおよびｍ／ｚ１４８５．６５とｍ／ｚ１４８５．６１に観測される、[Hex₃HexNAc₄Fuc₁+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ１４８５．５３）に対応するピークに完全に変化した。一方、計算値がｍ／ｚ１６８８．６１の[Hex₃HexNAc₅Fuc₁+Na]⁺または計算値がｍ／ｚ１２８２．４５の[Hex₃HexNAc₃Fuc₁+Na]⁺であると考えられる不完全消化産物の形跡は見られなかった。α1,3/4-フコシダーゼ消化の際には、ｍ／ｚ１４８５．６１に観測されるピークの一部は、ｍ／ｚ１３３９．５２に観測される、[Hex₃HexNAc₄+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ１３３９．４８）に対応するピークに変化した。
構造Ｄ． β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化の際には、ｍ／ｚ２２１５．８５とｍ／ｚ２２１５．８４に観測される、[Hex₅HexNAc₆Fuc₁+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ２２１５．８０）に対応するピークの相対シグナル強度は有意に減少した。同時に、ｍ／ｚ１８０９．７１とｍ／ｚ１８０９．６７に観測される、[Hex₅HexNAc₄Fuc₁+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ１８０９．６４）に対応するピークの相対シグナル強度も有意に増加した。一方、不完全消化産物と考えられるｍ／ｚ２０１２．７６に観測される、[Hex₅HexNAc₅Fuc₁+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ２０１２．７２）に対応するピークの相対シグナル強度の増加は見られなかった。
【００９８】
ヒトメラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２の膜タンパク質由来LacdiNAc含有Ｎ−グリカン（図８〜９）：
構造Ｅ． β−ヘキソサミニダーゼ消化の際には、ｍ／ｚ１５０１．５２に観測される、[Hex₄HexNAc₄+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ１５０１．５３）に対応するピークは、ｍ／ｚ１０９５．３６に観測される、[Hex₄HexNAc₂+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ１０９５．３７）に対応するピークに変化した。一方、ｍ／ｚ１２９８．４８とｍ／ｚ１２９８．４６に観測される、[Hex₄HexNAc₃+Na]⁺イオン（計算値：ｍ／ｚ１２９８．４５）に対応する不完全消化産物の相対シグナル強度の有意な増加は見られなかった。
【００９９】
結論
本実施例の結果は、ヒト癌化組織はLacdiNAc配列を有する糖タンパク質を含有することを示す。より具体的には、本実施例の結果は、LacdiNAc含有シアリル化Ｎ−グリカンであるNeuAc₁Hex₄HexNAc₅Fuc₁は喉頭癌腫瘍試料の糖タンパク質として発現されていることを示す。さらに、本実施例の結果は、メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２の膜タンパク質由来シアリル化Ｎ−グリカンの中には、LacdiNAc、シアリル−LacdiNAcおよび／またはフコシル−LacdiNAcを含有する構造がいくつも存在し、メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９５１の膜タンパク質由来シアリル化Ｎ−グリカンの中には、シアリル−LacdiNAc含有Ｎ−グリカンが存在することを示唆している。メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２の膜タンパク質由来脱シアリル化Ｎ−グリカンである構造Ｃ（即ちHex₃HexNAc₆Fuc₁）においては、単離したシアリル化Ｎ−グリカンをArthrobacter ureafaciens シアリダーゼで消化してＮ−グリカンを得ているので、少なくとも一つのLacdiNAc単位はもともとシアリル化されていた。同様に、メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２の膜タンパク質由来シアリル化Ｎ−グリカンである構造Ｃにおいては、二つのLacdiNAc配列の少なくとも一つはＮ−グリカンコアのα−マンノースの一つにβ−結合していなければならない。さらに、α1,3/4-フコシダーゼ消化によって、メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２の膜タンパク質由来シアリル化Ｎ−グリカンである構造Ｃには、α1,3-フコシル化LacdiNAc配列が存在することが明らかになった。他の構造においては、Hex-HexNAc配列の存在によって、上述の構造的特徴の帰属が妨げられた。メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９５１の膜タンパク質由来脱シアリル化Ｎ−グリカンである構造Ｅ（即ちHex₄HexNAc₄）の単糖組成は、Man₄GlcNAc₂Ｎ−グリカンコアにシアリル−LacdiNAc配列を有するハイブリッドＮ−グリカンの存在を示唆する。
【０１００】
実施例３
癌細胞および糖結合体上の GalNAc β 1-4GlcNAc 配列を認識する抗− LacdiNAc 抗体、ならびにその製造と特徴付けに用いる免疫原性オリゴ糖結合体
抗体
抗−LacdiNAc抗体は、免疫原性LacdiNAc結合体を用い、実験動物免疫学における標準的な方法、ファージディスプレイ法で行う抗体ライブラリーのスクリーニング、または他の公知の方法で製造する。モノクローナル抗体と考えられる使用した抗体は、LacdiNAcに対して特異的であり、これは特異的なオリゴ糖またはオリゴ糖結合体で被覆したＥＬＩＳＡプレートを用いたＥＬＩＳＡ、あるいは特異的なオリゴ糖またはその結合体の認識を利用した他の適当な方法によって示される。LacdiNAc抗原に結合するが、対応するLacNAc類似体には結合しない抗体は、目的とする用途に適している。LacdiNAc抗原とLacNAc対照抗原とからなる特定のペアは、ネオ糖タンパク質または他の免疫原性結合体などの結合体の調製に適している。このようなペアの具体例としては、以下のペアが挙げられる。
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-R と Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-R、
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-6Galβ1-R と Galβ1-4GlcNAcβ1-6Galβ1-R、
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAcα1-R と Galβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAcα1-R、
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-6GalNAcα1-R と Galβ1-4GlcNAcβ1-6GalNAcα1-R、
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-R と Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-R、
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-6Manα1-R と Galβ1-4GlcNAcβ1-6Manα1-R、
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-4Manα1-R と Galβ1-4GlcNAcβ1-4Manα1-R、そして
上記の本発明のエピトープに対応するシアリル化類似体および／またはフコシル化類似体。
（式中、Ｒは、例えば、ラクトース、全てのＯ−グリカン、全てのＮ−グリカン、全ての糖脂質のコア構造、および公知の方法によってオリゴ糖をネオ糖タンパク質または他の免疫原性担体に結合するために用いるスペーサーから選ばれるものである。）
【０１０１】
組織片におけるLacdiNAc配列のin situの製造
対照組織をin situ LacdiNAc合成に付して、免疫組織化学または他の診断分野において正の対照（positive control）として用いることができる。例えばRamakrishnan と Qasba（2002）に記載されているウシ乳酵素Ｙ２８９Ｌ変異体に類似した変異型β−ガラクトシルトランスフェラーゼを使用し、且つこの引例に記載の反応条件と実質的に同様の反応条件を用いることで、反応を促進することができる。GalNAc転移反応の前に、組織片を５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）中で、０．５Ｕ／ｍｌのナタマメβ−ガラクトシダーゼ（英国、Glyko社製）と共に３７℃で一晩インキュベートしてもよく、その後にはグリコシダーゼ反応溶液を組織片から洗い流す。こうすることによって、GalNAc転移酵素に対するさらなる受容部位を作ることができる。
【０１０２】
免疫学的診断の分野における抗体の使用
LacdiNAc特異的抗体は、免疫組織化学、免疫学的診断、および標準的な免疫学的方法に基づく他の診断分野に用いることができる。
【０１０３】
実施例４
本発明の lacdiNAc 構造を認識する抗体に対する細胞溶解活性を検出するための in vitro
溶解アッセイ
細胞表面にlacdiNAc構造を有するモデル癌細胞を８０％集密的密度となるように回収し、ＨＢＳＳ（ハンクスの平衡塩類溶液）で４回洗浄する。細胞の生存率はトレパンブルー染色で確認する。約２００，０００個の細胞を、その細胞表面に提示されている本発明のlacdiNAc構造に結合する抗体と共にインキュベートする。一方の細胞のセットには、ウサギ補体を最終希釈度が１：５になるように加え、他方の細胞のセットは、培地を添加して体積が同じになるように調整する。さらに細胞を３７℃で１時間インキュベートする。最後に、ヨウ化プロピウム（propium iodide）を終濃度が２０μｇ／ｍｌになるように加え、細胞の色素取り込みを分析した。細胞はlacdiNAc結合抗体によって溶解するが、癌非結合性対照抗体では溶解しない。lacdiNAc構造は、抗体の認識および細胞溶解に利用できるように細胞表面に存在する。
【０１０４】
実施例５

α３−シアリルトランスフェラーゼ反応の例
過剰モル量（２０μｍｏｌ）のCMP-NeuNAcおよび１Ｕのα３−シアリルトランスフェラーゼ（ST3Gal III、ラット肝臓由来、Calbiochem社製）を、２．１ｍｌの２ｍｇ／ｍｌＢＳＡ含有５０ｍＭＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）中で、GalNβ4GlcNAcβ3Lac（５μｍｏｌ）と共に３７℃で一晩インキュベートする。生成物であるNeuNAcα3GalNβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcは量的に生成され、それをゲルろ過ＨＰＬＣ−クロマトグラフィーによって精製する。質量分析およびＮＭＲ分析によって、予想した構造が確認される。リニア型の陰イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析においては、生成物のピークがｍ／ｚ９９８．３６に観測される。この生成物を所望により、α３−シアリル化LacdiNAcの類似体にＮ−アルキル化または誘導することもできる。α３−シアリル化lacdiNAcは、８μｌの無水酢酸を含む２００μｌの１ＭＮＨ₄ＨＣＯ₃中でGalNをGalNAcへＮ−アセチル化することで得られる。
【０１０５】
α３−ガラクトシルトランスフェラーゼ反応の例
GalNβ4GlcNAcβ3LacからのGalα3GalNβ4GlcNAcβ3Lacの合成
UDP-Gal（３μｍｏｌ）、GalNβ4GlcNAcβ3Lac（１．５μｍｏｌ）およびα３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（０．１Ｕ、Calbiochem社製）を、５００μｌの２０ｍＭＭｇＣｌ₂含有１００ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で３７℃でインキュベートする。生成物であるGalα3GalNβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcは、ゲルろ過ＨＰＬＣ−クロマトグラフィーによって精製した。反応混合物は３７℃で４日間インキュベートした。陽イオンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析においては、予想された生成物のピークがｍ／ｚ８９１．２１０２に観測された。この生成物の構造は、ＮＭＲ分光測定によって確認する。
【０１０６】
実施例６

二種のガラクトシルトランスフェラーゼによる GlcNAc β 3Lac からの GalN α 3GalN β 4GlcNAc β 3Lac の合成および in situ 供与体合成
５μｍｏｌ GlcNAcβ3Lac、１０ｍＭ GalN-1P（Sigma社製）、２０ｍＭ UDP-Glc、２．５Ｕガラクトース−１−リン酸−ウリジルトランスフェラーゼ、０．５Ｕ β1-4−ガラクトシルトランスフェラーゼおよび０．５Ｕ α1-3−ガラクトシルトランスフェラーゼ（米国、カリフォルニア州、Calbiochem社製）を含む反応混合物を、５ｍＭＭｇＣｌ₂および５ｍＭ β−メルカプトエタノールを含有する０．１ＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）１．０ｍｌ中でインキュベートする。反応混合物は３７℃で４日間インキュベートした。反応生成物を陽イオンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に付したところ、主要な生成物のピークがｍ／ｚ８９０．２３４９に観測された。生成物の構造はＮＭＲ分光測定によって確認する。
【０１０７】
【表１】

【０１０８】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１Ａ】遊離MMP-9 Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析。Ｎ-グリカンは完全なＮ−グリカンである。
【図１Ｂ】遊離MMP-9 Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析。Ｎ-グリカンはＮＤＶノイラミニダーゼと共にインキュベートしたものである。
【図１Ｃ】遊離MMP-9 Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析。Ｎ-グリカンは、ＮＤＶノイラミニダーゼと共にインキュベートした後に、C. perfringens ノイラミニダーゼで処理したものである。
【図１Ｄ】遊離MMP-9 Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析。Ｎ-グリカンはＮＤＶノイラミニダーゼと共にインキュベートした後に、C. perfringens ノイラミニダーゼ、次いでアーモンドの実由来のフコシダーゼで処理したものである。
【図２】トリプシン消化したMMP-9のＬＣ−ＥＳＩＭＳ分析。Ａは溶出したペプチドの全イオンを示すクロマトグラムであり、Ｂはｍ／ｚ２０４．１(Hexのオキソニウムイオン)の抽出イオンのクロマトグラムであり、Ｃはｍ／ｚ２９２．１(ＳＡのオキソニウムイオン)の抽出イオンのクロマトグラムであり、Ｄはｍ／ｚ３６６．１(Hex-HexNAcのオキソニウムイオン)の抽出イオンのクロマトグラムである。Ｂ、ＣおよびＤは糖ペプチドと推定される消化産物を示す。
【図３Ａ】MMP-9のトリプシン処理ペプチドのＬＣ／ＭＳ分析。２３．１分に溶出した糖ペプチドに対応するマススペクトルである。
【図３Ｂ】MMP-9のトリプシン処理ペプチドのＬＣ／ＭＳ分析。２４．３分に溶出した糖ペプチドに対応するマススペクトルである。
【図４Ａ】喉頭癌試料由来シアリル化グリカンのリニア型の陰イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図４Ｂ】喉頭癌試料由来シアリル化グリカンをA. ureafaciens シアリダーゼ消化およびS. pneumoniae β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化に付したものの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図４Ｃ】喉頭癌試料由来シアリル化グリカンをA. ureafaciens シアリダーゼ消化、S. pneumoniae β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化およびナタマメ β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化に付したものの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図５】メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２の膜タンパク質由来シアリル化Ｎ−グリカンをA. ureafaciens シアリダーゼ消化およびS. pneumoniae β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化に付したものの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図６】メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２の膜タンパク質由来シアリル化Ｎ−グリカンをA. ureafaciens シアリダーゼ消化、S. pneumoniae β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化およびナタマメ β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化に付したものの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図７】メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２の膜タンパク質由来シアリル化Ｎ−グリカンをA. ureafaciens シアリダーゼ消化、ナタマメ β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化およびXanthomonas種 α1,3/4−フコシダーゼ消化に付したものの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図８】メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９５１の膜タンパク質由来シアリル化Ｎ−グリカンをA. ureafaciens シアリダーゼ消化およびS. pneumoniae β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化に付したものの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図９】メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９５１の膜タンパク質由来シアリル化Ｎ−グリカンをA. ureafaciens シアリダーゼ消化、S. pneumoniae β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化およびナタマメ β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化に付したものの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。【Technical field】
[0001]
The present invention relates to oligosaccharide sequences that are specifically expressed by certain cancer cells, tumors and other malignant tissues. The present invention discloses not only a method for producing a reagent that binds to a cancer-specific oligosaccharide sequence, but also a method for detecting a cancer-specific oligosaccharide sequence. The present invention also relates to a method for diagnosing cancer and malignant tumor using the oligosaccharide sequence and a reagent binding thereto. The present invention further relates to a method for treating cancer and malignant tumors using an oligosaccharide sequence and a reagent binding thereto.
[Background]
[0002]
Various cancer cells or cancerous tissues express oligosaccharide sequences that differ from the non-malignant glycosylation products of the same type of cells and tissues. Examples of known or suspected cancer-related oligosaccharide structures include the following oligosaccharide structures: glycolipid structures such as globo-H (Fucα2Galβ3GalNAcβ3Galα4LacβCer), ganglioside GM1 (Galβ3GalNAcβ3 (NeuNAcα3) LacβCer) or GD2Cer (GalNAcβ4 (NeuNAcα8NeuNAcα3) LacβCer); Lewis fucosylated structures such as Lewis a and x (Galβ3 / 4 (Fucα4 / 3) GlcNAc), Lewis y (Fucα2Galβ4 (Fucα3) GlcNAc), sialyl Lewis x (NeuNAclcNAcGc3Galβ) And combinations thereof in polylactosamine chains; and O-glycan core structures such as T-antigen (Galβ3GalNAcαSer / Thr-protein), Tn-antigen (GalNAcαSer / Thr-protein) or sialylTn-antigen (NeuNAcα6GalNAcαSer / Thr- protein). It has also been shown that non-human structures, such as N-glycolylneuraminic acid, are present in cancer. In cancer, there are only a few well-established cases of related oligosaccharide structures and their specificity, and some of these structures are present in normal cells and tissues. Is considered to exist only at high concentrations. However, for use for therapeutic purposes, complete cancer specificity may not be necessary.
[0003]
LacdiNAc (GalNAcβ4GlcNAc) -type glycosylation products are not generally presented in human tissues, however, LacdiNAc-type glycosequences are found in many non-human animals, bovine glycoproteins, human glycoprotein hormones (Manzellaet al., 1997) and human glycodelin protein (van den Eijndenet al, 1997). In general, this structure is thought to be related to invertebrates and early development. Several variants of LacdiNAc have been found in proteins expressed by human fetal kidney 293 cells (Doet al., 1997). Recently, the inventors have published a structure based on LacdiNAc obtained from transfected fibroblasts (Saarinenet al., 1999). This study does not show whether glycosylation is associated with cancer or transfection of fibroblast adenovirus-derived EIA-promoter sequences, and EIA-promoter does not show gene expression of glycosyltransferases. It may be modulated to modify glycosylation. LacdiNAc-type saccharides were found along with other structures in tissue-type plasminogen activators of Bowes melanoma cells, but these were considered to be “nervous system-related” structures (Jaqueset al., 1996). These previous studies also described the detection of similar oligosaccharide structures from cell lines derived from solid tumors (Doet al., 1997; Jaqueset al., 1996; Saarinenet al., 1999). However, carbohydrate and other surface antigens usually change when cell-cell contact changes (eg, separating a solid tumor into single cells). Furthermore, the cells of the cell line are probably genetically modified and can therefore be cultured as single cells. Cell surface glycosylation is highly specific to the differentiation state of the cell line or tissue and is also specific to the cell or tissue type. Thus, the prior art described herein does not describe the natural glycosylation status of single cancer cells or solid tumor tissues. However, the potential correlation between cell type or differentiation status and glycosylation allows cancer antigens to be used for typing cancer cells and tumors.
[0004]
The following patents describe a cancer antigen, a method for producing therapeutic and diagnostic antibodies using the same, and a method for producing a cancer vaccine. However, the structure of the antigen is not related to the saccharides disclosed herein.
Cancer Vaccines: US Pat. No. 5,102,663 discloses a composition comprising 9-OAc GD3 for stimulating or enhancing the production of antibodies against 9-OAc NeuNAcα8NeuNAcα3Lac-Cer (GD3).
US Pat. No. 5,660,834 describes a pharmaceutical composition containing a mucin-type glycoprotein consisting essentially of Tn (GalNAcα-Ser / Thr) antigen or sialyl-Tn (NeuNAcα6GalNAcα-Ser / Thr) antigen and uses it with adjuvant A method for reducing the growth rate of cancer cells is disclosed. Inventions relating to this same mucin sequence are also disclosed in other patents: US Pat. No. 5,747,048 (adjuvant therapy for humans) and US Pat. No. 5,229,289.
US Pat. No. 6,083,929 discloses an extended type 1 chain sphingolipid (Galβ3GlcNAc) as a tumor-related composition, and further discloses a pharmaceutical composition using it with adjuvant.
Therapeutic Antibodies: US Pat. No. 4,851,511 is a monoclonal antibody, diagnostic test kit, antibody-producing hybridoma, marker molecule and antibody that binds to the dicialosyl Lewis a-structure (NeuNAcα3Galβ3 (Fucα4) [NeuNAcα6] GlcNAc) Disclosed antitumor agents.
US Patent No. 4,904,596 discloses NeuNAcα3Galβ4 (Fucα3) GlcNAcβ3Galβ4 (Fucα3) GlcNAcβ3LacCer-binding monoclonal antibodies, hybridomas, diagnostic methods and antibodies coupled to antitumor agents, immunomodulators or differentiation inducers To do.
US Pat. No. 5,874,060 discloses an antibody adapted to the human body that recognizes the Lewis y-antigen (Fucα2Galβ4 (Fucα3) GlcNAc).
US Pat. No. 6,025,481 discloses a nucleic acid molecule encoding an antibody adapted to the human body that recognizes the Lewis b-antigen. The expression of the Lewis b-structure (Fucα2Galβ3 (Fucα4) GlcNAc-) is increased in cancer cells. US Pat. No. 5,795,961 further discloses anti-Lewis b antibodies.
[0005]
Diagnostic Methods: US Pat. No. 4,725,557 discloses protein binding antigens Fucα3Gal-, Fucα4Gal- and Fucα6Gal-, antibodies that recognize these structures, methods for detecting binding of cancer-related carbohydrates and diagnostic kits. The antibody binds to cancer cells of the human digestive system.
US Pat. No. 5,059,520 discloses several monoclonal antibodies that recognize blood group A-antigen (GalNAcα3 (Fucα2) Galβ-) that can be used in the diagnosis of cancer.
US Patent No. 5,171,667 discloses an antibody against fucosylated type 2 lactosamine (-Galβ4 (Fucα3) GlcNAcβ-) and a method for diagnosing cancer using the same.
US Pat. No. 5,173,292 discloses a monoclonal antibody that binds to a cancer-specific structure, Gal-globoside (Galβ3GalNAcβ3Galα4LacCer).
US Pat. Nos. 6,090,789 and 5,708,163 disclose the synthesis of Fucα2Galβ3GalNAcβ3Galα4LacCer (globo H, MBr1, breast tumor associated antigen) conjugates and analogs thereof, and pharmaceutical compositions comprising them. US Pat. No. 5,679,769 discloses the synthesis of asparagine linked to a glycopeptide. US Pat. No. 5,543,505 is a bacteriumHelicobacter pyloriSynthetic compounds that bind to are disclosed.
US Pat. Nos. 5,902,725 and 6,203,999 disclose detection of prostate specific cancer by analysis of at least triantennary oligosaccharides on prostate specific antigen. Antibody or lectin PHA-L is used for detection. These patents chromatographically characterize triantennary N-glycans present in cancer-type PSA obtained from cell lines.
[0006]
The prior art includes a pharmaceutical composition comprising a fucosylated lacdiNAc containing a relatively large N-glycan structure (EP Patent 0565241) and a pharmaceutical composition comprising a core type 2 O-glycan structure (EP Patent 0919563). ). These compositions are aimed at inhibiting selectin-mediated cell adhesion, and EP 0919563 also aims at inhibiting metastasis by inhibiting selectin-mediated cell adhesion. However, the present invention relates to a method for targeting the oligosaccharide epitope of the present invention to specific recognition molecules including antibodies. Specifically, the present invention relates to conjugates and compositions having antigenicity suitable for inducing antibodies for use in diagnosis and therapy. The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising an oligosaccharide sequence of optimal size for recognition by a specific antibody. Optimal oligosaccharide epitopes are those that contain only terminal lacdiNAc structures, or that contain terminal oligosaccharide sequences and one or two monosaccharide residues.
[0007]
Summary of the Invention
The present invention discloses oligosaccharide sequences that are specifically expressed by cancer cells. The present invention relates to the following formula (I):
(Sac1)_xGalNAcβ4 (Fucα3)_yGlcNAc (I)
(In the formula, x and y are each independently an integer of 0 or 1, and Sac1 is NeuNAcα3 or NeuNAcα6.)
The present invention relates to a method for detecting the presence of an oligosaccharide chain containing a cancer-specific sequence represented by the formula (1) in a biological sample and detecting cancer and / or determining the type of cancer using the presence of the sequence as an index. The present invention provides an antigenic substance containing the oligosaccharide chain in a multivalent form, and further includes a diagnostic agent, a pharmaceutical composition and a cancer vaccine comprising the oligosaccharide chain or a binding substance that binds to the oligosaccharide chain I will provide a. The present invention also relates to a method for treating cancer.
Detailed description of the invention
Several lacdiNAc (GalNAcβ4GlcNAc) type structures have been found from secreted proteins such as glycoprotein hormones. In human glycoprotein hormones, lacdiNAc is usually modified with a 4sulfo-GalNAcβ4GlcNAc-sequence that is thought to be important for hormone function, but several variants exist in the secreted lacdiNAc structure. Glycoprotein hormones are rare soluble proteins and are generally relatively small and have few glycosylation sites, so the lacdiNAc structures that can be taken are very limited. Although many structural studies on human glycosylation have been conducted over the last 30 years, the structure of the lacdiNAc sequence in human membrane-bound non-secreted proteins has not been characterized.
[0008]
The role of lacdiNAc structure as a cell endocrine marker has been reported, and the same report clearly describes that lacdiNAc structure is not presented on the membrane protein of MDCK cells (Ohkura,et al2001). The association of lacdiNAc structures characterized in secreted proteins with human cancer has not been shown. The lacdiNAc structure, which is an abnormally expressed product of cancer, and its rare variants, fucosylated and sialylated, are not expressed in normal tissues, so cancer treatment and therapy based on recognition of such structure is effective. The possibility is very high. Methods using carbohydrates that are presented only in a limited amount of normal tissue or present in normal tissue and / or serum at low density have been successful as diagnostic and therapeutic methods.
[0009]
How to combine diagnosis and therapy for effective cancer treatment
The data obtained in the present invention shows that the lacdiNAc structure disclosed in the present application is useful for diagnostic methods and therapeutic methods that recognize carbohydrate structures presented in cancer cells. Since glycosylation patterns vary between tissues, between tumors, and even between individual patients, the present invention specifically screens for abnormal carbohydrate structures from tumors and glycosylates that are specifically expressed by cancers of specific patients. The present invention relates to a method for providing an individual treatment corresponding to a form of crystallization. Specifically, the present invention screens glycosylated products of the lacdiNAc structure disclosed herein, particularly present in tumor or cancer samples, and uses the lacdiNAc targeted therapy of the present invention (especially tumor, malignant It relates to a method for treating a patient having a particular cancer-related glycosylation product (specifically presented to a tissue or cell).
[0010]
The inventors screened multiple normal tissues with effective mass spectrometry to prove that lacdiNAc is not a cell surface marker on normal tissues. In the research process of the present invention, the following matters were found.
(I) lacdiNAc sequences are present in both single cell carcinomas (eg leukemias) and solid tumors;
(Ii) lacdiNAc sequences were not observed in large numbers on normal tissues;
(Iii) The lacdiNAc sequence is present in both the plasma membrane or membrane-bound protein of cancer cells and secreted proteins, and the lacdiNAc sequence incorporated on the cell surface is based on cancer diagnosis, immunotherapy and recognition of lacdiNAc sequences in cancer Become a target for other treatments; and
(Iv) The lacdiNAc sequence presented on the cancer cell surface can be recognized by specific antibodies for therapeutic and diagnostic purposes. These structures exist in effective form on the cell surface and are not covered by other cell surface components.
[0011]
Leukemia cells were chosen as a model for single cell carcinoma cells. Leukemia cells are a representative example of single cell cancer cells in blood cancer. Soluble target proteins were chosen for which there was structural comparison data for non-malignant tumor cells. To show abnormal expression of LacdiNAc sequences on cancer cells, metalloprotease-9 (MMP-9) was isolated from leukemia cells (U-937) and N-glycosidically linked glycans were released with N-glycosidase F. Analysis of the glycan fraction using MALDI-TOF MS in a trihydroxyacetophenone matrix (FIG. 1A) showed negligible cleavage of sialic acid residues. The assigned monosaccharide composition is shown in Table 1 together with the structure estimated by the subsequent glycosidase treatment. Since the analysis of oligosaccharides by MALDI-TOF MS has been shown to be relatively quantitative, it also shows the relative abundance of each component. The most abundant glycan species is (Hex)_Five(HexNAc)_Four(Fuc)_Three[M + Na]⁺Belonged to. Since the typical N-glycan structure is known, this structure was temporarily assigned as a trifucosylated diantennary complex type glycan. Other major glycan species are sialylated, difucosylated diantennary complex type glycans, and one antenna has GalNAc as terminal monosaccharide instead of Gal (having so-called LacdiNAc structure) trifucosylated diantennary complex type Identified as a glycan. These assignments were found to be correct, as shown by a series of glycosidase treatments. For comparison, the structure of the matrix metalloprotease MMP-9 in non-malignant white blood cells was also determined and the protein did not contain the lacdiNAc sequence (Rudd Pet al., 1999).
[0012]
The present invention shows that U-937 cell derived MMP-9 has a LacdiNAc structure in a large fraction (approximately 30%) of its N-glycans. The presence of the LacdiNAc structure was demonstrated by two independent methods, namely LC-ESI MS of the complete glycopeptide, as well as MALDI-TOF MS analysis of the free N-glycans. Structure assignment was further confirmed by a series of glycosidase treatments. The effectiveness of the method used in this study has been demonstrated in several approaches using both synthetic oligosaccharides and known natural structures.
[0013]
Obtained from normal tissue lacdiNAc Structure screening by mass spectrometry
Several non-malignant tissue membrane protein samples, including human stomach, lung and colon, were analyzed by mass spectrometry as described above. N-linked or O-linked lacdiNAc sequences were not observed. There is no report on lacdiNAc presented in either the normal human membrane protein or the cancer membrane protein in the prior art.
[0014]
On solid tumors lacdiNAc Structural analysis
The present invention also shows for the first time that the lacdiNAc-sequence is presented in human solid tumors. One example of the present application shows the characterization of the lacdiNAc structure obtained from a sample of human laryngeal cancer.
[0015]
Obtained from plasma membrane samples lacdiNAc Structural characterization
The present invention also relates to a plasma membrane type lacdiNAc-expressing protein in cancer. Matrix metalloprotease MMP-9 is also known to exist in a membrane-bound form (Koivunenet al, 1999), this forms an ideal target for cancer diagnosis and immunotherapy in the present invention. As another example, the glycosylation products of two different samples of melanoma associated membranes were analyzed. A large variety of lacdiNAc-type oligosaccharide sequences containing unique N-glycan structures have been found in membrane-bound glycoproteins. Glycosylated membrane proteins are known to be displayed on the surface of cells and tissues.
[0016]
Defects specific to cancer shown in the present invention
The present invention discloses a novel defect in cancer cells. Rare structures associated with secreted proteins are usually expressed on proteins that do not express lacdiNAc structures. Furthermore, glycosylation deficiencies induce more abnormal sialylated, fucosylated, and variants that lack normal sulfation at position 4 of GalNac. According to general knowledge about cancer, intracellular mechanisms are disturbed in cancer cells. Such deficiencies in the Golgi apparatus result in very specific glycosylation in various cell types, and the result clearly induces the problems as described above. The presence of an abnormal glycosylation product indicative of cancer in the soluble protein is clearly useful for cancer diagnosis, and the presence of the cancer glycosylation product bound to the membrane makes the soluble protein itself useful for therapy.
[0017]
As described above, secreted MMP-9 protein, solid tumors and membrane preparations of leukemia cell line U-937 cells were examined for the presence of cancer antigens. Single cells of the leukemia cell line are also considered to be a model that shows a reasonable association with single cell cancer leukemia. The finding that the LacdiNAc-structure is obtained from a solid tumor and it is membrane bound indicates that cancer glycosylation products are useful in the treatment of solid tumors that express glycosylated products.
[0018]
The present invention shows that the LacdiNAc structure represented by the following formula (I) is a cancer-specific antigen.
(Sac1)_xGalNAcβ4 (Fucα3)_yGlcNAc (I)
(In the formula, x and y are each independently an integer of 0 or 1, and Sac1 is NeuNAcα3 or NeuNAcα6.)
Because cell-bound MMP-9 is known (Koivunenet al, 1999), the present invention relates to a method for directly detecting cancer antigens from cancer cells and tumor tissue. However, in addition to being detected from cancer cells and tumor tissue, cancer antigens may be detected from secreted glycoproteins derived from cancer cells or tissues, as described herein. Such cancer-specific proteins include proteases, hormones or secreted mucin-type glycoproteins.
[0019]
The present invention shows that cancer antigens can be detected from glycoproteins, and this phenomenon is known to be up-regulated during malignant transformation. The finding that cancer antigens are present in presumed cancer-associated glycoproteins is thought to provide a more reliable diagnostic approach to early cancers. Examples of such preferred cancer-related proteins include proteins belonging to the matrix metallopoptase protein family (eg MMP-9), prostate specific antigen, kallikrein 2, human chorionic gonadotropin and fetal cancer antigen. However, it is not limited to these.
[0020]
LacdiNAc-type cancer-specific oligosaccharides contain the GalNAcβ4GlcNAc-oligosaccharide sequence. This sequence is part of the oligosaccharide conjugate of cancer cells. Oligosaccharide sequences can be substituted as shown below and are also known to be presented to cancer cells: GalNAcβ4 (Fucα3) GlcNAc-, NeuNAcα3GalNAcβ4GlcNAc-, NeuNAcα6GalNAcβ4GlcNAc-, NeuNAcα3GalNAc3 (4) GlcNAc- or NeuNAcα6GalNAcβ4 (Fucα3) GlcNAc-. If the cancer oligosaccharide epitope alone contains both sialic acid and fucose, the structure is NeuNAcα3GalNAcβ4 (Fucα3) GlcNAc-. When the cancer cell has a sulfotransferase necessary for sulfation, the LacdiNAc sequence may be sulfated, for example, GalNAc at position 4. The LacdiNAc type sequence may be part of a cancer cell or tissue glycoprotein sequence, for example, the LacdiNAc type sequence is β2-, β4- or β6-linked to a mannose residue in an N-linked glycan of the glycoprotein. Or the LacdiNAc type sequence is β2-linked to a mannose residue in the N-linked glycan of the glycoprotein.
[0021]
Fucosylated LacdiNAc saccharides show similarity to Lewis type cancer-related oligosaccharides. Although Lewis-type cancer-related oligosaccharides are present in large amounts in normal tissues, the promising reason for the production of human antibodies with weak recognition of Lewis-type cancer-related oligosaccharides is that Lewis-type cancer-related oligosaccharides and fucosylated LacdiNAc saccharides Potential weak cross-reactivity with.
[0022]
The present invention relates to a method for detecting malignant transformation of a cell or tissue using a cancer-specific glycosylation product as an indicator. Such detection can be performed by molecules that specifically bind to the cancer-specific oligosaccharide sequences disclosed herein. Preferred molecules include aptamers, lectins, genetically engineered lectins, antibodies, monoclonal antibodies, antibody fragments, LacdiNAc-structure-recognizing enzymes (eg glycosidases and glycosyltransferases) and genetically engineered those It is atypical. A labeled bacterium, virus or cell, or polymer surface that has a molecule that recognizes the LacdiNAc structure can be used for detection. Oligosaccharide sequences can be released from cancer cells by endoglycosidase enzymes. Alternatively, oligosaccharide sequences can be released as glycolipids by protease enzymes. Specific examples of chemical methods for releasing oligosaccharides or derivatives thereof include sonication of glycolipids (otsonolysis) and beta-elimination for releasing oligosaccharides from glycoproteins. Or a hydrazinolysis method. Other methods include isolation of glycolipid fractions. A binding substance that specifically binds to a cancer-specific oligosaccharide sequence can also be used to analyze the sequence on the cell surface. The sequence can be detected, for example, as a glycoconjugate or free and / or isolated oligosaccharide fraction. Methods that can be used to analyze the various forms of the sequence include NMR spectroscopy, mass spectrometry, and glycosidase degradation. In particular, when using a method with limited specificity, it is preferable to use at least two types of analysis methods.
[0023]
Mass spectrometry is a preferred method for detecting at least one cancer-specific oligosaccharide sequence of the present invention present in a sample. It is particularly preferred to use a mass spectrometric scanning method to detect HexNAc-HexNAc-fragments from the fraction containing the oligosaccharide sequence represented by formula (I).
[0024]
The present invention relates to a method for producing a polyclonal or monoclonal antibody that recognizes an oligosaccharide structure using a cancer-specific oligosaccharide sequence or an analog or derivative thereof, and the antibody is produced according to the following steps:
1) A conjugate containing the oligosaccharide sequence disclosed in the present application or an analog or derivative thereof in a polyvalent form is chemically or biochemically synthesized. The multivalent conjugate is, for example, an oligosaccharide chain (OS) containing a cancer-specific terminal oligosaccharide sequence disclosed in the present application, if desired, via a spacer group (Y) from the reducing end of the C1 position. Alternatively, a structure represented by the following formula (II), which is bonded to the oligovalent or polyvalent carrier (Z) by an atom (L) via an oligosaccharide residue (X), is formed:
[OS- (X)_n-L-Y]_m-Z (II)
(Where
m is an integer greater than 1,
each n is independently 0 or 1,
L is an oxygen atom, a nitrogen atom, a sulfur atom or a carbon atom,
X is preferably a lactosyl residue, galactosyl residue, poly-N-acetyllactosaminyl residue, or part of an O-glycan or N-glycan oligosaccharide sequence;
Y is a spacer group or terminal conjugate, such as a ceramide lipid moiety or a linkage to Z;
The preferred structure represented by the above formula (II) satisfies any one of the following characteristics: the oligosaccharide chain (OS) is sialylated, X is at least one mannose residue or N-acetyl Including galactosamine residues, and Z includes carbohydrate materials such as polysaccharides); and
2) Immunize an animal or human with a multivalent conjugate together with an immune response activator.
The oligosaccharide chain is preferably bound to the immune response activator in a multivalent form, and the conjugate is used for immunization alone or together with a further immune response activator. In a more preferred embodiment, the oligosaccharide conjugate is injected or mucosally administered to the antibody-producing organism with at least one adjuvant molecule. For the production of antibodies, oligosaccharide sequences or analogs or derivatives thereof may be converted to proteins such as BSA, keyhole limpet hemocyanin, lipopeptides, peptides, bacterial toxins, peptidoglycans or parts of immunoactive polysaccharides, or other It binds to the antibody-producing activation molecule in a multivalent form. Multivalent conjugates can be injected into animals with adjuvant molecules to induce antibodies by conventional antibody production methods known in the art. The antigenic substance of the present invention is a polyvalent form obtained by chemically or biochemically synthesizing the terminal oligosaccharide sequence represented by the formula (I) described above in relation to a substance for immunizing humans. It is preferable to contain. More preferably, the antigenic substance comprises terminal NeuNAcα3 or terminal NeuNAcα6 (ie, X is 1 in formula (I)) or the sugar sequence binds to mannose or N-acetylgalactosamine (eg, formula (II ), X is Man or GalNAc).
[0025]
The invention also relates to monovalent and / or oligovalent antigenic conjugates comprising the oligosaccharide sequences of the invention. The monovalent antigenic conjugate may include an antigenic lipid structure, for example, a ceramide, a synthetic lipid or a bacterial lipid capable of inducing antibody production by the methods described herein or by known methods.
[0026]
In particular, the present invention relates to the use of optimally sized antigenic epitopes and pharmaceutical compositions comprising them. Antibodies usually only recognize epitopes consisting of a small number of monosaccharide residues. In addition, since a small epitope can be synthesized with higher economic efficiency, it is preferable to use such a structure.
[0027]
A preferred optimal antigenic epitope comprises a structure represented by the following formula (II):
[OS- (X)_n-L-Y]_m-Z (II)
(Where
Y is a non-carbohydrate spacer or non-glycosidically linked end conjugate
each n is independently 0 or 1,
X is a lactosyl residue, a galactosyl residue, an N-acetyllactosaminyl residue, a mannosyl residue, Man₂Residue, Man_ThreeResidue, Man_ThreeGlcNAc residue, Man_FourGlcNAc residue, N-acetylglucosaminyl residue or N-acetylgalactosaminyl residue, preferably X is a lactosyl residue, galactosyl residue, mannosyl residue or N-acetylgalactosaminyl residue is there).
In a preferred embodiment, X is a mannosyl residue and OS is β2-, β4- or β6-linked, more preferably β2-linked to X. In other preferred embodiments, X is a lactosyl residue or N-acetyllactosaminyl residue, OS is β3- or β6-linked to the Gal residue of X, or X is a galactosyl residue or N- An acetylgalactosaminyl residue, OS is β3- or β6-linked to X; more preferably, X is a Gal residue or a GalNAc residue, and OS is β3- or β6-linked to X. Or X is a lactosyl residue and OS is β3- or β6-linked to the Gal residue of X; most preferably, X is a Gal residue and OS is β3-linked to X Or X is a lactosyl residue, OS is β3-linked to the Gal residue of X, X is a GalNAc residue, and OS is β6-linked to X. In a more preferred embodiment, the oligosaccharide sequence in the optimal antigenic epitope does not contain fucose.
[0028]
Man₂Residue, Man_ThreeResidue, Man_ThreeGlcNAc residue and Man_FourThe GlcNAc residue represents a preferred part of the N-glycan core structure including oligosaccharide sequences Manα3Man, Manα6Man, Manα3 (Manα6) Man, Manα3 (Manα6) Man or Manα3 (Manα6) Manβ4GlcNAc or a hybrid structure thereof. The added Man residue binds to any non-reducing terminal Man residue, preferably the Manα6 branch, and the oligosaccharide sequences of the invention bind to the other branch of the molecule.
[0029]
In a preferred embodiment, an optimal antigenic epitope comprising the following structure is used: OSβ2Man, OSβ2Manα3Man or OSβ2Manα6Man. These are partial epitopes of the N-glycan lacdiNAc found at the beginning of this study. In another embodiment, due to the deficiency in glycosylation of cancer cells, O-glycan-type lacdiNAc and partial lactosamine-type lacdiNAc containing OSβ3Gal and OSβ3GalNAc similar to those described above, in particular OSβ6Gal and OSβ6GalNAc, It is useful for immunity and other uses disclosed in this application against tumors having these structures. Such tumors are characterized by a combination of lacdiNAc type oligosaccharide secretion function and lactosamine and / or mucin production.
[0030]
Cancer specific oligosaccharide sequences or analogs or derivatives thereof can be immobilized to purify antibodies from serum, preferably human serum. Detection and / or quantification of an antibody binding to a cancer-specific oligosaccharide sequence, preferably a multivalent conjugate of the cancer-specific oligosaccharide sequence, for example, an enzyme immunoassay (ELISA) or affinity for cancer diagnosis It can also be used for chromatographic analysis.
[0031]
Antibody production or vaccination can also be achieved by analogs or derivatives of cancer specific oligosaccharide sequences. Simple analogs of oligosaccharide sequences containing an N-acetyl group include compounds containing a modified N-acetyl group, such as an N-acyl group such as an N-propanoyl group. The invention also relates to the production of specific analogs for the cancer specific oligosaccharide sequences of the invention.
[0032]
Furthermore, human antibodies against cancer-specific oligosaccharide sequences or antibodies adapted to the human body can be used to destroy tumors or cancers or reduce their proliferative ability. Human antibodies may be analogs that increase the resistance of natural human antibodies to cancer-specific oligosaccharide sequences. Such analogs can be produced by recombinant genetic engineering and / or biotechnology, including human antibody fragments or optimized derivatives. Purified natural anti-tumor antibodies can be administered to humans without causing any anticipated side effects, and such antibodies are implanted during standard blood transfusions. This is certain under conditions where the cancer-specific structure is not presented to normal tissues or cells, and unlike blood group antigens, there is no individual difference, and the cancer-specific oligosaccharide of the present invention There is no known blood group diversity. In another embodiment of the present application, species-specific animal antibodies are used against a particular animal tumor or cancer. Specific human-adapted antibodies can be produced by genetic engineering and biotechnology, and methods for producing antibodies adapted to the human body are described, for example, in US Pat. Nos. 5,874,060 and 6,025,481. Antibodies adapted to the human body are designed to mimic the sequence of human antibodies and are therefore not rejected by the immune system like animal antibodies when administered to human patients. It is known that methods for reducing the ability of cancer to grow and destroying cancer are generally applicable to both solid tumors and cancer cells. It is also known that purified natural human antibodies that recognize any human cancer-specific antigen, preferably an antigen consisting of oligosaccharides, can be used to reduce or destroy the growth potential of a tumor or cancer. It has been. In another preferred embodiment, species-specific animal antibodies are used against a particular animal tumor or cancer.
[0033]
According to the present invention, human antibodies against cancer-specific oligosaccharides or antibodies adapted to the human body, or other biologically acceptable substances that bind to cancer-specific oligosaccharides, target tumors or cancer cells as toxic substances. Useful for. Toxic substances include, for example, cell killing chemotherapeutics medicine (eg, doxorubicin (Arapet al, 1998)), and substances effective in tumor destruction such as toxic proteins or radiochemicals. Such therapies have been published in the industry and are also patented. Toxic substances can also cause cancer cells or tumors to undergo apoptosis, induce their differentiation, or enhance the protective response to cancer cells or tumors. In another embodiment of the present application, species-specific animal antibodies are used against a particular animal tumor or cancer. The cancer-binding antibody of the present invention is, for example, a so-called “ADEPT-approach” in which a prodrug that exhibits activity against cancer, an enzyme that converts a prodrug into an activated toxic substance that destroys or suppresses cancer, or the like It can also be used to target other substances.
[0034]
The above therapeutic antibody can be used in a pharmaceutical composition for the purpose of treating or preventing cancer. The treatment method of the present invention can also be used when a patient is receiving immunosuppressant therapy or is immunocompromised.
[0035]
Immunosuppressant therapy is performed with organ transplantation, for example, to suppress rejection during kidney, heart, liver or lung transplantation. Tumors that appear during such therapy are usually benign, but often cause loss of valuable transplant organs. The ability to produce antibodies against antigens specific to tumors or cancers may vary depending on individual differences found in the immune system. Humans who have survived cancer may have particularly large amounts of natural anti-cancer antibodies.
[0036]
Other methods for therapeutic targeting against cancer
As in the case of diagnostic substances, it is known that many drugs can be used as substances used for therapeutic targeting against cancer, in addition to antibodies, antibody fragments and antibodies adapted to the human body. For targeting to cancer, it is particularly preferable to use a non-immunogenic acceptable substance. Examples of targeting agents that bind to cancer also include specific toxic, cytolytic or cell-modulating agents that destroy or inhibit cancer. The non-antibody molecule used for therapeutic targeting against cancer preferably includes a molecule that specifically binds to the cancer-specific oligosaccharide sequence of the present invention. Such a binding molecule (ie, oligosaccharide chain binding substance) ) Include aptamers, lectins, genetically engineered lectins, LacdiNAc-structure-recognizing enzymes (eg, glycosidases and glycosyltransferases) and genetically engineered variants thereof. Labeled bacteria, viruses or cells, or polymer surfaces with molecules that recognize the structure can also be used for therapeutic targeting against cancer. The cancer-binding non-antibody substance disclosed in the present application is a prodrug that is active against cancer, targeting cancer, or an enzyme or other enzyme that converts prodrug into an activated toxic substance that destroys or suppresses cancer It can also be used to target substances.
[0037]
The present invention particularly relates to a method for treating gastrointestinal diseases in patients, preferably human patients, using substances and antibodies that bind to the cancer-specific oligosaccharide sequences of the present invention. Therapeutic antibodies used in the human gastrointestinal system include antibodies produced by animals, for example, antibodies contained in the milk of livestock (specifically cattle, sheep, goats or buffalos that are domestic ruminants) Antibodies produced from chicken eggs may also be used. Animals can be immunized with cancer-specific carbohydrate conjugates according to known methods. The invention also relates to other acceptable substances, preferably food-acceptable proteins, that can be used for the suppression or destruction of human gastrointestinal cancers, specific examples of such substances include: Plant lectins specific for cancer-specific oligosaccharide sequences are included. The present invention relates to a functional food and a food additive comprising an antibody that recognizes the cancer-specific oligosaccharide sequence of the present invention present in the gastrointestinal system, and the present invention further relates to other substances acceptable as food (especially It also relates to a functional food or food additive using a lectin that binds to a cancer-specific oligosaccharide sequence present in the gastrointestinal system.
[0038]
Furthermore, according to the present invention, cancer-specific oligosaccharide sequences or analogs or derivatives thereof can be used as human cancer vaccines to stimulate an immune response to suppress or eliminate cancer cells. Such treatment may not necessarily cure the cancer, but it can reduce the burden caused by the tumor, stabilize the pathology of cancer patients, and reduce the ability of cancer to metastasize. For use as a vaccine, oligosaccharide sequences or analogs or derivatives thereof can be converted to proteins (eg BSA or keyhole limpet hemocyanin), lipids or lipopeptides, bacterial toxins (eg cholera toxin or heat labile toxin), peptidoglycans , Immunoactive polysaccharides, or other molecules, cells or cell preparations that activate an immune response to the vaccine molecule. The cancer vaccine may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier and optionally an adjuvant. Suitable carriers or adjuvants are, for example, lipids that are known to stimulate immune responses. The saccharide or derivative or analog thereof, preferably a conjugate of the saccharide, can be injected or mucosally (eg, orally or nasally) to a cancer patient with at least one acceptable adjuvant molecule. Cancer vaccines can be used as drugs in methods of treatment for cancer. Such methods are preferably used for the treatment of human patients. In addition, this method of treatment is preferably used for the treatment of cancer in patients who have undergone immunosuppressant therapy or who are immunocompromised.
[0039]
Furthermore, a cancer therapeutic pharmaceutical composition comprising a cancer-specific oligosaccharide sequence or an analog or derivative thereof can be produced. The pharmaceutical composition is preferably used for the treatment of human patients. It is preferred to use the pharmaceutical composition for the treatment of cancer in patients who are receiving immunosuppressant therapy or who are immunocompromised. The therapeutic method or pharmaceutical composition described above is particularly preferably used for the treatment of cancer diagnosed as expressing the cancer-specific oligosaccharide sequence of the present invention. The therapeutic methods or pharmaceutical compositions can be used with other therapeutic methods or pharmaceutical compositions for the treatment of cancer. Other therapeutic methods and pharmaceutical compositions preferably include cell growth inhibitors, anti-angiogenic agents, anti-cancer proteins (eg, interferon or interleukin) or radiation therapy.
[0040]
Methods for using antibodies to diagnose cancer and target drugs to cancer have been disclosed in connection with other antigens and oligosaccharide structures (US Pat. Nos. 4,851,511, 4,904,596, 5,874,060, 6,025,481, 5,795,961, 4,725,557, 5,059,520, 5,171,667, 5,173,292, 6,090,789, 5,708,163, 5,902,725 and 6,203,999). The use of cancer-specific oligosaccharides as cancer vaccines has also been disclosed in connection with other oligosaccharide sequences (5,102,663, 5,660,834, 5,747,048, 5,229,289 and 6,083,929).
[0041]
The antigenic substance of the present invention can be bound to a carrier. Methods for conjugating oligosaccharides to mono- or multivalent carriers are known in the art. It is preferred that the cancer-specific oligosaccharide sequence or analog or derivative thereof is attached to the carrier molecule from its reducing end. When a carrier molecule is used, a large number of antigenic substance molecules can be bound to one carrier, so that stimulation of an immune response and antibody binding efficiency are increased. In order to achieve optimal antibody production, it is preferable to use a conjugate having a molecular weight larger than 10 kDa and generally carrying more than 10 oligosaccharide sequences.
[0042]
The oligosaccharide sequences of the invention can be synthesized enzymatically by glycosyltransferases or by transglycosylation reactions catalyzed by glycosidases or transglycosidases (see Ernst as literature).et al., 2000). The specificity of these enzymes and the need for cofactors can be improved. For example, an enzyme that catalyzes a transglycosylation reaction but does not catalyze a glycosidase reaction can be obtained. Organic synthesis of the saccharides and sugar conjugates disclosed herein or compounds similar to them is also known (Ernstet al., 2000). Carbohydrate material can be isolated from natural sources and chemically or enzymatically modified to the compounds disclosed herein. Natural oligosaccharides can be isolated from the milk of various ruminants. Transgenic organisms expressing glycosylases, such as cattle and microorganisms, can also be used for sugar production. The oligosaccharide sequences of the present invention can be added to a pharmaceutical composition suitable for treating cancer in a patient, optionally with a carrier. Examples of disease states that can be treated by the present invention include cancers consisting of tumors expressing at least one cancer-specific oligosaccharide of the present invention. A treatable cancer case can be found by detecting the presence of a cancer-specific oligosaccharide sequence in a biological sample obtained from the patient. Examples of the sample include a biopsy material or a blood sample.
[0043]
The formation of cancer antigens disclosed herein can be inhibited by specific inhibitors of LacdiNAc biosynthesis. As such an inhibitor, an analog of UDP-GalNAc which is a donor nucleotide can be used. Methods for producing inhibitory analogs to glycosyltransferases are known. The inhibitor is preferably specific for GalNAc-transferase that synthesizes LacdiNAc.
[0044]
Also, chemically and / or enzymatically synthesized oligovalent or polyvalent, cancer-specific oligosaccharide sequence conjugates of the present invention that are substantially non-antigenic can be used for cancer cell adhesion and / or It can be used to prevent proliferation. It is achieved by the disappearance of inhibitory oligomers or polymers from the circulating blood by the antibody because the conjugate is antigenic. Examples of the antigenic substance of the present invention are described above. Non-antigenic polysaccharide conjugates can be constructed according to formula (II), where X, Y and Z are not immunogenic. The molecular weight of the conjugate is preferably less than 50 kilodaltons (kDa), more preferably less than 10 kDa. The oligosaccharide sequences of the present invention can also be bound to non-protein carriers. In that case, it is preferable to bind the cancer specific oligosaccharide sequence to the non-immunogenic polysaccharide, and most preferably the molecular weight of the conjugate is less than 10 kDa.
[0045]
Because the interaction between selectins and carbohydrates mediates cancer metastasis, LacdiNAc-type glycosylation products can result in selectin-containing sites on the vascular endothelium where metastatic cancer cell targets are located, and the structure of such sites is , Known as a strong selectin ligand (Grinnelet al., 1994; Jainet al., 1998). LacdiNAc saccharides are Dellet al(1995) has immunomodulatory activity that can protect itself from immune responses. Terminal GalNAc residues can also target liver asialoglycoprotein receptors in cancer cells (Yanget al., 2000). Inhibiting LacdiNAc biosynthesis in cancer cells reduces the metastatic potential and malignancy of cancer. The invention particularly relates to the inhibition of LacdiNAc biosynthesis to inhibit the metastatic potential of cancer cells. The optimal antigenic epitope has not been designed as a metastasis inhibitor. A very small amount of LacdiNAc structure is used in the vaccine-type approach so as not to inhibit selectin-mediated cell adhesion, which is also required for normal immune system and leukocyte function.
[0046]
The pharmaceutical composition of the present invention may include other substances, for example, known substances such as inert vehicles or pharmaceutically acceptable carriers and preservatives.
[0047]
The antigenic substance or pharmaceutical composition of the present invention may be administered by an appropriate method. Methods for administering therapeutic antibodies or vaccines are known.
[0048]
As used herein, “treatment” means both treatment for curing or ameliorating a disease or condition and treatment for preventing the onset of a disease or condition. Treatment can be acute or chronic.
[0049]
As used herein, “patient” means any mammal in need of treatment according to the present invention.
[0050]
When a cancer-specific oligosaccharide or a compound that specifically recognizes the cancer-specific oligosaccharide of the present invention is used for diagnosis or type identification, for example, the oligosaccharide or compound may be contained in a probe or test stick, If desired, part of the test kit may be configured. When such a probe or test stick comes into contact with a sample containing an antibody obtained from a cancer patient or with a patient's cancer cells or tissue, the components of the cancer positive sample bind to the probe or test stick and are removed from the sample. Further analyzed.
[0051]
In the present application, “cancer” means “tumor” or “cancer cell”. “Tumor” means solid multicellular tumor tissue. Further, in the present application, “tumor” means a tissue in a premalignant state, which differentiates into a solid tumor and has characteristics specific to cancer. In the present application, the term “tumor” does not mean a single cell cancer such as leukemia, a cultured cancer cell, or a cluster of such cells. In the present application, the expression “cancer cell” means a cell in a tumor, a single cancer cell (for example, leukemia cell) or any other kind of malignant cell, and the malignant cell differentiates into cancer or tumor. Or have cancer-specific characteristics.
[0052]
LacdiNAc Structure and fucosylation LacdiNAc Enzymatic synthesis of structures and their analogs
Terminal LacdiNAc epitopes can be synthesized using large amounts of β4-galactosyltransferase (eg, commercially available bovine milk galactosyltransferase) and a molar excess of UDP-GalNAc relative to the receptor. For example, UDP-GalNAc and GlcNAcβ3Galβ4Glc together with a relatively large amount of β4-galactosyltransferaseet alIncubation as described in (2000) yields GalNAcβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc.
[0053]
The above reaction can also be performed by a novel recombinant galactosyltransferase that can efficiently transfer GalNAc from UDP-GalNAc (Ramakrishnanet al., 2001).
[0054]
GalNAcβ4GlcNAc epitope or a sialylated derivative thereof (NeuNAcα3GalNAcβ4GlcNAc) can be fucosylated with several α3-fucosyltransferases, eg, Bergwerffet al(1993) and can be fucosylated with fucosyltransferase obtained from human milk or fucosyltransferase VI.
[0055]
New GalN Derivatives, especially lacdiNAc Production of structures and their derivatives
The invention also relates to a novel pathway for enzymatic synthesis. These pathways are used to produce lacdiNAc structures, related structures and their analogs.in in vitroCan be used. The glycosidase reaction for hexosamine and the hexosamine donor used in the glycosidase reaction are described in the prior art. The present invention uses terminal hexosamine, especially galactosamine and GalNβ4Glc (NAc) terminal structures as receptors for various glycosyltransferases that typically use receptor structures including terminal Gal residues, GalNAc residues, etc. Regarding the method.
[0056]
The above reaction has not been reported so far, and a positively charged amine group present in the vicinity of a negatively charged nucleotide sugar donor was thought to inhibit the reaction. Charged amino groups were also thought to inhibit recognition by enzymes that require the hydroxyl group at the 2-position of the receptor, or to produce unwanted irreversible binding to the active site of the enzyme. The present invention discloses for the first time that novel glycosyltransferase reactions are possible and that such reactions are also possible with mammalian glycosyltransferases. Compared to glycosidase-catalyzed reactions, glycosyltransferase reactions usually exhibit specificity such as the formation of only one product from a pair of donor and acceptor substances, whereas glycosidase-catalyzed transglycosylation The reaction generally yields several products.
[0057]
In the past, lacdiNAc derivatives have been synthesized by forcing GalNAc to be used by enzymes that use the Gal receptor. The yield of such a method is generally very low. Some reactions with certain transferases are less efficient than reactions with terminal GalNAc, but the presence of amine groups is specific to amine derivatives or analogs of the natural Gal / GalNAc sequence. To enable proper synthesis.
[0058]
The novel response also revealed a potential biosynthetic pathway for novel antigenic structures associated with malignancy or disease. Such an antigenic structure cannot be characterized from normal tissue. In particular, new blood group related antigens are produced by natural glycosylation enzymes.
[0059]
Preferable reactions include a transglycosylation reaction for terminal hexosamine (more preferably galactosamine) at position 3, 4 or 6; a reaction for galactosamine at position 3 or 6 is further preferred; a reaction for galactosamine at position 3 Is most preferred. Specific examples of preferable reactions include the following reactions: α3-sialyltransferase reaction, α6-sialyltransferase reaction, α3-galactosyltransferase reaction, α3-N-acetylgalactosaminyltransferase reaction, α3-galactosaminyltransferase. Reaction, β3-N-acetylglucosaminyltransferase reaction, β6-N-acetylglucosaminyltransferase reaction, β3-N-acetylgalactosaminyltransferase reaction and β3-glucuronyltransferase reaction. The most preferred reactions are α3-sialyltransferase reaction, α3-galactosaminyltransferase reaction and α3-galactosyltransferase reaction.
[0060]
A preferred synthesis reaction is a reaction represented by the following formula (III).
SAC-donor + GalNβ3 / 4 → SACyxGalNβ3 / 4 (III)
[Where:
y is an α- or β-bond;
each x independently represents a bonding position at the 3rd, 4th or 6th position;
GalNβ3 / 4 represents a non-reducing terminal GalN that is β3- or β4-linked to a hexose, hexosamine or hexosamine derivative, preferably Gal, GalN, GalNAc, Glc, GlcN or GlcNAc, and in a preferred embodiment GalNβ4 is A part of a non-reducing end structure (GalNβ4GlcNAc or GalNβ4Glc), for example, GalNβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc,
SAC represents sialic acid or a sugar residue represented by the following formula:
Hex (A)_s1[N (Ac)_s2]_s3
(In the formula, Hex is Gal or Glc, and s1, s2, and s3 are each independently 0.
Or an integer of 1 (if s1 is 1, s3 is 0)
When s1 in the above formula is 1, the structure represented by SAC includes a hexuronic acid structure, preferably GlcA; when s3 is 1 and s2 is 1, SAC The structure represented includes GlcNAc or GalNAc; and when s2 is 0, the structure represented by SAC includes GalN or GlcN. ]
[0061]
Furthermore, the present invention relates to a novel carbohydrate represented by the following formula (IV).
Gal [N (Am)_s2]_s3α3GalN (Am)_s2β3 / 4 (IV)
(Where
Am is a residue derived from an amine group, provided that Am is not an acetyl (Ac) group or an imide group, but preferably an amide group that forms a carboxylic acid with a GalN residue, such as formamide, propionic acid amide, etc. An amide group of an aromatic hydrocarbon such as an amide group of benzoic acid, and a cyclic amide such as an amide of a cyclohexane radical containing a carboxylic acid,
s2 and s3 are each independently an integer of 0 or 1. )
Since the acetyl group is present in the natural oligosaccharide sequence, it is not preferable in the analog represented by the above formula. Moreover, a bulky imide group (for example, a phthalimide group) is not preferable because it is a large functional group that changes the steric structure of the analog more than necessary.
[0062]
More preferred carbohydrates include the following terminal oligosaccharide sequences: Gal [N (Am)_s2]_s3α3GalN (Am)_s2β4GlcNAc and Gal [N (Am)_s2]_s3α3GalN (Am)_s2β4Glc. The most preferred terminal oligosaccharide sequences include the following sequence: Galα3GalN (Am)_s2β4GlcNAc, Galα3GalN (Am)_s2β4Glc, Galα3GalNβ4GlcNAc and Galα3GalNβ4Glc.
[0063]
The novel carbohydrate is particularly useful for use as an antigen or for immunization. Rare, mostly non-natural or pathogenic related carbohydrates are useful as immunogens to induce the production of antibodies that also recognize related structures. Amine-containing carbohydrates are used as starting materials for the production of further analogues, as candidates for glycosidase substrates and / or inhibitors, as well as analogues of natural oligosaccharide sequences that bind to animal or plant lectins. It is also useful.
[0064]
In the present invention, UDP-GalN is first transferred to a receptor (eg, GlcNAc, glucose or non-reducing terminal GlcNAc or glucose), and UDP-GalN GalN is transferred to the 3rd and 4th positions of the receptor in the same reaction vessel. Or a combination of two of the reactions that modify the 6-position, preferably the 3-position or 6-position, and most preferably the 3-position. In other reaction combinations, UDP-GalN can be synthesized simultaneously in the main reaction system by using two types of glycosyltransferases. UDP-GalN for use in reactionsin situThe method of manufacturing at has already been reported.
[0065]
In the present invention, a simple method for producing UDP-GalN from GalN1-phosphate and UDP-Glc is preferred. A preferred embodiment relating to the synthesis of the lacdiNAc type structure includes a reaction for obtaining N-acetylhexosamine by N-acetylation of hexosamine (for example, a reaction for obtaining GalNAc from GalN).
[0066]
In a preferred embodiment, it is more preferred that an oligosaccharide analogue containing N-acetylhexosamine or hexose is produced and a lacdiNAc analogue is produced. The present invention also relates to the preparation of amine derivatives of hexosamine, and preferred amine analogs or derivatives of hexosamine include formamide, propionic acid amide, other alkyl amides, cyclic amides such as amides of cyclohexane radicals including carboxylic acids, and Included are aromatic hydrocarbon amide groups such as benzoic acid amide groups.
[0067]
In a preferred embodiment, hexosamine is transferred to hexosamine by a glycosyltransferase, more preferably galactosamine is transferred to galactosamine, more preferably GalNα3GalNβ4GlcNAc is formed. This substance can be further modified by induction of an amino group to GalNAcα3GalNAcβ4GlcNAc or an analog as defined in the present invention.
[0068]
In another embodiment, UDP-GalN is transferred to a receptor with a Galβ-terminus by α-galactosyltransferase or α-GalNAc transferase, preferably α3-galactosyltransferase. Amine groups can be further derivatized to analogs containing N-acetyl groups or derivatized amine groups. Examples of products obtained in this way include GalNAcα3Galβ4GlcNAc, GalNα3Galβ4GlcNAc, GalNAcα3 (Fucα2) Galβ4, GalNα3 (Fucα2) Galβ4, GalNAcα3 (Fucα2Galβ3, GalNα3GF ) Galβ4GlcNAc, which corresponds to the terminal structure and analogs of human A / B blood group antigens.
[0069]
Furthermore, this invention relates to the novel carbohydrate represented by following formula (V).
GalN (Am)_r1α3 (Fucα2)_r2Galβ3 / 4 (V)
(Where
r1 and r2 are each independently an integer of 0 or 1,
Am is a residue derived from an amine group, provided that Am is not an acetyl (Ac) group or an imide group, but preferably an amide group that forms a carboxylic acid with a GalN residue, such as formamide, propionic acid amide, etc. Alkylamides, cyclic amides such as amides of cyclohexane radicals containing carboxylic acids, and amide groups of aromatic hydrocarbons such as amide groups of benzoic acid. )
Since the acetyl group is present in the natural oligosaccharide sequence, it is not preferable in the carbohydrate represented by the above formula. Moreover, a bulky imide group (for example, phthalimide group) is not preferable because it is a large functional group that changes the steric structure of the analog more than necessary.
[0070]
More preferred carbohydrates include the following terminal oligosaccharide sequences:
GalNα3Galβ4GlcNAc and GalNα3Galβ4Glc;
GalNα3 (Fucα2) Galβ4GlcNAc and GalNα3 (Fucα2) Galβ4Glc;
GalNAmα3 (Fucα2) Galβ4GlcNAc and GalNAmα3 (Fucα2) Galβ4Glc; and
GalNAmα3Galβ4GlcNAc and GalNAmα3Galβ4Glc.
Most preferred carbohydrates include the following terminal oligosaccharide sequences:
GalNAmα3 (Fucα2) Galβ4GlcNAc and GalNAmα3 (Fucα2) Galβ4Glc; and
GalNAmα3Galβ4GlcNAc and GalNAmα3Galβ4Glc.
[0071]
The novel carbohydrate is particularly useful for use as an antigen or for immunization. Rare, mostly non-natural or pathogenic related carbohydrates are useful as immunogens to induce the production of antibodies that also recognize related structures. Amine-containing carbohydrates are used as starting materials for the production of further analogues, as candidates for glycosidase substrates and / or inhibitors, as well as analogues of natural oligosaccharide sequences that bind to animal or plant lectins. It is also useful.
[0072]
The present invention particularly relates to an immunization method using the novel substance disclosed in the present invention and a screening method for lectins and antibodies that bind to the substance disclosed in the present invention. Specifically, the present invention relates to screening for determining the specificity of antibodies that bind to blood group antigens and related antibodies.
[0073]
The present invention particularly relates to diagnosis and / or treatment of oral cancer, and the oral cancer is preferably a laryngeal cancer or leukemia type cancer that expresses the oligosaccharide sequence of the present invention. The present invention also relates to the treatment of the present invention, particularly for all types of cancers that express on their surface the lacdiNAc structure disclosed herein. In another preferred embodiment, the present invention relates to the treatment of cancer in tissues that normally express and secrete a protein comprising a lacdiNAc sequence, such tissues include glycoprotein hormone secreting tissues.
[0074]
Glycolipids and carbohydrates are named according to the nomenclature recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Committee (Carbohydrate Res. 1998, 312, 167; Carbohydrate Res. 1997, 297, 1; Eur. J. Biochem. 1998, 257, 29) Followed.
[0075]
Gal, Glc, GlcNAc and NeuNAc are D-type, Fuc is L-type, and all monosaccharide residues are pyranose ring structures. Glucosamine is designated GlcN and galactosamine is designated GalN. The glycosidic bond is indicated by an abbreviation or the formal name, and the α3 and α6 bonds of NeuNAc residues are the same as the α2-3 and α2-6 bonds, respectively. The β1-3, β1-4, and β1-6 bonds can be abbreviated as β3, β4, and β6, respectively. Lactosamine, N-acetyllactosamine or Galβ3 / 4GlcNAc represents either type 1 structural residue Galβ3GlcNAc and type 2 structural residue Galβ1-4GlcNAc, sialic acid is N-acetylneuraminic acid or NeuNAc, Lac is Lactose indicates Cer indicates ceramide. SA stands for sialic acid, eg NeuNAc. GalNAcβ4GlcNAc, which is a cancer-related disaccharide sequence of the present invention, is abbreviated as lacdiNAc or LacdiNAc.
[0076]
The invention is further illustrated by the following examples, which do not limit the scope of the invention.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[0077]
Example 1
MMP-9 Analysis method
Isolation of MMP-9
MMP-9 was isolated from U-937 cells by a series of CM-cellulose (CM-52) chromatography followed by DEAE / RED Sepharose chromatography (Saarinenet al., 1999).
[0078]
4-vinylpyridine alkylation of MMP-9
Concentrate and desalinate MMP-9^TMReverse phase chromatography (RP-HPLC) was performed using an R2 column (2.1 × 150 mm) and eluting with a linear acetonitrile gradient (0.1% trifluoroacetic acid solution, 3-100% over 15 minutes). Chromatography was performed at a flow rate of 1 ml / min, and elution of MMP-9 was monitored by ultraviolet absorbance at 214 nm. The eluted MMP-9 was vacuum-dried and subjected to the following alkylation. The MMP-9 sample was dissolved in 80 μl of 0.5 M Tris (pH 7.5) solution containing 6 M guanidine hydrochloride and 2 mM EDTA, reduced by adding 5 μl of 0.6 M DTT, and incubated at room temperature for 20 minutes. After the reduction, 1 μl of 4-vinylpyridine was added, followed by an alkylation reaction at room temperature for 15 minutes. The reaction was stopped by adding 5 μl of 0.6M DTT to obtain alkylated MMP-9. The resulting alkylated MMP-9 was immediately desalted by RP-HPLC as described above.
[0079]
Trypsin digestion
2.5 μl (100 pmol) of alkylated MMP-9 was vacuum dried and dissolved in 50 mM ammonium dicarbonate buffer containing 40 μl of 1.66 ng / μl trypsin (Sequencing grade, Promega). Digestion was performed overnight at 37 ° C.
[0080]
Mass spectrometry
MALDI-TOF MS was performed with a Biflex time-of-flight apparatus (Bruker Franzen Analytik, Germany) equipped with a nitrogen laser with a wavelength of 337 nm. Not only total MMP-9 N-glycans but also NDV sialidase reaction products were 2,4,6-trihydroxyacetophenone (Fluka Chemie AG) in linear positive ion delayed extraction mode. 3 mg / ml, the solvent was acetonitrile / 20 mM diammonium citrate aqueous solution (volume ratio is 1: 1)) and the matrix was analyzed.C.perfringensThe glycans obtained by treatment with sialidase and fucosidase were analyzed using 2,5-dihydrobenzoic acid (10 mg / ml) as a matrix in a reflector positive ion delayed extraction mode. The spectrum was externally corrected using Dextran 5000 (Fluka Chemie AG).
[0081]
Electrospray ionization (ESI) mass spectra were obtained using a hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometer Micromass Q-TOF (Micromass, UK). Ionization is a nanospray ion source (operating at 2.2 kV) equipped with a silica capillary needle (inner diameter: 20 μm, tip opening: 10 μm, covered with gold from the other end) (New Objective Inc.) ).
[0082]
Determination of glycosylation sites by nanoflow LC / MS
Using a PepMap column (0.075 × 150 mm, NAN75-15-03-C18-PM, manufactured by LC Packings), a peptide sample (1 pmol) obtained by trypsinizing MMP-9 was used to prepare a linear gradient (0 Separation by microbore reverse phase chromatography eluting with 1% formic acid solution, 4-40% over 30 minutes). Chromatography was performed at a flow rate of 250 nl / min and the UV absorbance at 214 nm was recorded. The LC was connected directly to a Micromass Q-TOF mass spectrometer. The mass spectrometer is designed to scan the HPLC eluent at both low and high cone voltage conditions to facilitate identification of glycosylated components.et al(1993) reported. The scan of the low cone voltage was performed by scanning the mass number range of m / z 100 to 2500 under the condition of the cone voltage of 35 V, and obtaining a mass analysis spectrum of the eluted component. The high cone voltage scan was obtained under the condition of a cone voltage of 120 V, specifically, a condition in which a high collision excitation potential was applied to all ions introduced into the mass spectrometer. This results in fragmentation induced by collisions of introduced ions before performing a mass-based separation. During the high cone potential scan, the mass spectrometer was set to scan from m / z 100-1000. Next, reconstructed chromatograms for m / z 204.1 (Oxonium ion of HexNAc), m / z 292.15 (Oxonium ion of Neu5Ac) and m / z 366.1 (Oxonium ion of Hex-HexNAc) A chromatogram selective for the eluted glycopeptide was obtained.
[0083]
Obtained from leukemia cells LacdiNAc Structural analysis
To show abnormal expression of LacdiNAc sequences on cancer cells, metalloprotease-9 (MMP-9) was isolated from leukemia cells (U-937) and N-glycosidically linked glycans were released with N-glycosidase F. Analysis of the glycan fraction using MALDI-TOF MS in a trihydroxyacetophenone matrix (FIG. 1A) showed negligible cleavage of sialic acid residues. The assigned monosaccharide composition is shown in Table 1 together with the structure estimated by the following glycosidase treatment. Since analysis of oligosaccharides by MALDI-TOF MS has been shown to be relatively quantitative, it also shows the relative abundance of each component. The most abundant glycan species is (Hex)_Five(HexNAc)_Four(Fuc)_Three[M + Na]⁺Belonged to. Since the typical N-glycan structure is known, this structure was temporarily assigned as a trifucosylated diantennary complex type glycan. Other major glycan species are sialylated, difucosylated diantennary complex type glycans, and one antenna has GalNAc as terminal monosaccharide instead of Gal (having so-called LacdiNAc structure) trifucosylated diantennary complex type Identified as a glycan. These assignments were found to be correct, as shown by a series of glycosidase treatments. For comparison, the structure of the matrix metalloprotease MMP-9 in non-malignant white blood cells was also determined and the protein did not contain the lacdiNAc sequence (Ruddet al., 1999).
[0084]
The structural characterization of glycans was performed by monitoring a series of glycosidase treatments with MALDI-TOF MS. In order to distinguish between the two valid Neu5Ac linkages (α2-3 versus α2-6), the glycan mixture was treated with NDV neuraminidase, an enzyme highly specific for α2-3 neuraminic acid. As a result, partial cleavage was observed (FIG. 1B), which is thought to arise from α2-3GalNAc binding of SA, which is known to be resistant to NDV sialidase activity. As another possibility, it is considered that both α2-3 bonded SA and α2-6 bonded SA are mixed. A less specific neuraminidase (Clostridium perfringens) Treated the N-glycan fraction, the following changes were observed (FIG. 1C): the signals at m / z 2247.3, 2287.9 and 2392.3 disappeared and m / z 1809.70 , 1850.78, 1891.75, 1955.77 and 1996.79 appeared. These results show that different fucosylated forms of normal biantennary N-glycans, biantennary N-glycans having a LacdiNAc structure (GalNAcβ1-4GlcNAc) in one of the antennas and small amounts of both having a LacdiNAc structure in the antenna Indicates the presence of N-glycans. Samples were treated with almond fruit-derived α1-3 (4) fucosidase (an enzyme that removes α1-3 (4) -linked fucose residues from the antenna but does not cleave α1-6-linked fucose residues from the N-glycan core). However, signals of 1809.80, 1850.78 and 1891.84 (intensities: 67%, 27% and 6%) appeared. These results indicate that approximately 30% of the glycans have LacdiNAc sequences in either one or both antennas. This result agrees well with the following LC-ESI MS data.
[0085]
MMP-9 was isolated from U-937 cells, alkylated and further digested with trypsin. To identify glycopeptides, LC / MS analysis of tryptic peptides of MMP-9 was performed using a stepped cone voltage, and a chromatogram of total ions (FIG. 2A) and a chromatogram showing what is thought to be a glycopeptide. Both grams (Figure 2B, C and D) were obtained. In the chromatographic conditions used in this study (i.e., the conditions in which the PepMap medium is eluted with 0.1% formic acid-acetonitrile), glycopeptide separation is affected by both peptide and glycan sites. In the more commonly used trifluoroacetic acid-acetonitrile system, glycopeptide separation is governed only by the properties of the peptide site. As a result, the glycopeptide was obtained as two major peaks eluting at 23.1 minutes and 24.3 minutes.
[0086]
The mass spectrum of what eluted at 23.1 minutes is shown in FIG. 3A, where all signals in the figure are glycosylated peptide Trp with complex glycans (see Table 1).¹¹⁶-Arg¹³⁴Can be attributed to The most intense ion of m / z 1143.49 in this spectrum is expressed as (Hex)_Five(HexNAc)_Four(Fuc)_ThreeTrp with¹¹⁶-Arg¹³⁴[M + 4H]⁴⁺Belonging to. A mass spectrum of the fraction eluted at 24.3 minutes is shown in FIG. 3B. The most intense ion of m / z 1179.54 in this spectrum is expressed as (Hex)_Five(HexNAc)_Four(Fuc)₂(SA)₁Trp with¹¹⁶-Arg¹³⁴[M + 4H]⁴⁺Belonging to.
[0087]
The present invention shows that U-937 cell-derived MMP-9 has a LacdiNAc structure in a large fraction (approximately 30%) of its N-glycans. The presence of the LacdiNAc structure was demonstrated by two independent methods, namely LC-ESI MS of the complete glycopeptide, as well as MALDI-TOF MS analysis of the free N-glycans. Structure assignment was further confirmed by a series of glycosidase treatments. The effectiveness of the method used in this study has been demonstrated in several approaches using both synthetic oligosaccharides and known natural structures.
[0088]
A similar experiment using the following glycans was described in Example 2:
A sialylated N-glycan containing a LacdiNAc sequence from laryngeal cancer, and
Membrane protein N-glycan of human melanoma cells (RPMI-7932 and RPMI-7951) having LacdiNAc, sialyl-LacdiNAc and fucosyl-LacdiNAc sequences.
[0089]
Example 2
Analysis of solid tumor and melanoma cell membranes
Starting material for cancer samples
As a laryngeal cancer sample, a formalin-fixed tumor sample collected during a surgical operation was used. Before isolating glycans, proteinet alConcentrated by carrying out chloroform-methanol extraction substantially the same as described in (2000). Quantitative extraction of glycoprotein was confirmed by standard radiolabeled glycoprotein (data not shown).
[0090]
Isolation of glycans from chloroform-methanol extracted proteins
Glycans were separated from sample glycoproteins by non-reductive β-elimination and purified by chromatography.
[0091]
Isolation of human melanoma cell membrane proteins
Human melanoma cells (RPMI-7932 and RPMI-7951) were washed with phosphate buffered saline (PBS) at room temperature, the cells were scraped from the cell culture dish, and the cells were collected by centrifugation. The following purification steps were performed at 0 ° C to + 4 ° C. After incubating the cells with a low osmotic pressure buffer (25 mM Tris-HCl (pH 8.5)), the cells were disrupted with a homogenizer, and NaCl was added thereto so that the final concentration was 150 mM to return to the isotonic pressure buffer. . Cell nuclei were separated from the cell membrane mass by low speed centrifugation, which was monitored by microscopy. The supernatant containing the membrane and cytosolic material was further centrifuged at 40,000 g. The resulting pellet (membrane preparation) was homogenized in a surfactant buffer containing 25 mM Tris-HCl (pH 8.5), 150 mM NaCl and 1% (w / v) Triton X-100. After incubation, the preparation was centrifuged at 100,000 g and the supernatant containing the surfactant extracted membrane protein was collected. Buffer salts and surfactants, Verosteket alRemoved by cold acetone precipitation according to (2000).
[0092]
Isolation of membrane protein N-glycan
Nymanet alAccording to a method substantially similar to that described in (1998),Chryseobacterium meningosepticum N-glycans were separated from membrane glycoproteins using N-glycosidase F (Calbiochem, USA) and then Verosteket al(2000) and Packeret alPurified substantially as described in (1998). N-glycans obtained from RPMI-7951 cells were further divided into 1) AG-50W strong cation exchange material column and 2) C swollen with water.₁₈A silica column was passed through, but no such treatment was performed on N-glycans obtained from RPMI-7932 cells. All N-glycans are packedet alSubstantially as described in (1998), the sialylated and non-sialylated fractions were separated by a graphitized carbon column.
[0093]
MALDI-TOF MS
MALDI-TOF mass spectrometry was performed using a Voyager-DE STR BioSpectrometry Workstation and Saarinenet al(1999), Papacet al(1996) and Harvey (1993).
[0094]
Exoglycosidase digestion
Nyman for all exoglycosidase reactionset al(1998) and Saarinenet al(1999), and the results were analyzed by MALDI-TOF MS. Specific control reactions with the enzymes used and the oligosaccharides characterized thereby are shown below:Arthrobacter ureafaciensSialidase (E.coliRecombinant; Glyko, UK) digested both Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAc-R and Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc-R in the oligosaccharide; β-N-acetylglucosaminidase (Streptococcus pneumoniaeOrigin,E.coliRecombinant; US, Calbiochem) digested GlcNAcβ1-6Gal-R, but not GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3 / 6Gal-R; β-N-acetylhexosaminidase (derived from jujube; (Calbiochem, USA) digested both GlcNAcβ1-6Gal-R and GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3 / 6Gal-R; and α1,3 / 4-fucosidase (Xanthomonas sp. origin; Calbiochem, USA) digested Galβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAc-R but not Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc-R. A control digestion reaction was also performed in parallel with the analytical exoglycosidase reaction, and the results were similarly analyzed.
[0095]
result
LacdiNAc-containing sialylated N-glycans from laryngeal cancer samples
Sialylated glycans in laryngeal cancer samples areArthrobacter ureafaciens Efficiently desialylated by sialidase. Desialylation was monitored by MALDI-TOF MS (data not shown). The desialylated glycans were first digested with a concentration of β-N-acetylglucosaminidase that specifically hydrolyzed the terminal β-GlcNAc residue but not the β-GalNAc residue. Further addition of β-acetylhexosaminidase removed two HexNAc residues from one N-glycan. This result indicated the presence of a GalNAcβ1-4GlcNAc sequence that is resistant to the action of β-N-acetylglucosaminidase but is completely digested with β-N-acetylhexosaminidase. [beta] -N-acetylhexosaminidase digestion is observed at m / z 1850.38 and m / z 1850.16, [Hex_FourHexNAc_FiveFuc₁+ Na]⁺The relative signal intensity of the peak corresponding to the ion (calculated value: m / z: 1850.67) was significantly reduced. At the same time, observed at m / z 1444.30 and m / z 1444.15, [Hex_FourHexNAc_ThreeFuc₁+ Na]⁺The relative signal intensity of the peak corresponding to the ion (calculated value: m / z: 1444.51) increases and is observed at m / z 1647.34 and m / z 1647.19, [Hex_FourHexNAc_FourFuc₁+ Na]⁺The relative signal intensity of the incompletely digested product corresponding to the ion (calculated value: m / z 1647.59) did not increase. One observed peak corresponding to the sialylated form of the LacdiNAc-containing N-glycan under investigation, specifically the ion at m / z 2118.09 ([NeuAc₁Hex_FourHexNAc_FiveFuc₁-H]^-Calculated value: m / z 211183) has only one sialic acid residue. However, the data of the present application cannot exclude the possibility that different sialylated products are present in the original sample. Importantly, when samples from many healthy tissues were similarly analyzed, no evidence of LacdiNAc-containing glycans was found.
[0096]
Desialylated N-glycans derived from membrane proteins of human melanoma cell lines RPMI-7932 and RPMI-7951
Sialylated N-glycans, including membrane-bound sialylated N-glycans,Arthrobacter ureafaciens Efficiently desialylated with sialidase. Desialylation was monitored by MALDI-TOF MS (data not shown). The desialylated N-glycan was first digested with β-N-acetylglucosaminidase at a concentration that specifically hydrolyzes the terminal β-GlcNAc residue but not the β-GalNAc residue. Further addition of β-acetylhexosaminidase removed HexNAc residues from some N-glycans. The following are examples of structures that are sensitive to β-N-acetylhexosaminidase but insensitive to β-N-acetylglucosaminidase (Structures A to E). Only one HexNAc residue was removed. To summarize these results, the following structure may contain a GalNAc β1-4GlcNAc sequence that is resistant to the action of β-N-acetylglucosaminidase but is completely digested with β-N-acetylhexosaminidase. Indicated.
[0097]
LacdiNAc-containing N-glycans derived from membrane proteins of human melanoma cell line RPMI-7932 (FIGS. 5-7):
Structure A. Upon digestion with β-N-acetylhexosaminidase, [Hex observed at m / z 1704.71_FourHexNAc_Five+ Na]⁺The peak corresponding to the ion (calculated value: m / z 1704.61) is observed at m / z 1298.53, [Hex_FourHexNAc_Three+ Na]⁺It changed to a peak corresponding to the ion (calculated value: m / z 1298.45). On the other hand, observed at m / z 1501.62, [Hex_FourHexNAc_Four+ Na]⁺The relative signal intensity of the incompletely digested product corresponding to the ion (calculated value: m / z 1501.53) did not increase.
Structure B. Upon digestion with β-N-acetylhexosaminidase, observed at m / z 1850.73 and m / z 1850.72, [Hex_FourHexNAc_FiveFuc₁+ Na]⁺The relative signal intensity of the peak corresponding to the ion (calculated value: m / z 1850.67) was significantly reduced. At the same time, observed at m / z 1444.59 and m / z 1444.58, [Hex_FourHexNAc_ThreeFuc₁+ Na]⁺The relative signal intensity of the peak corresponding to the ion (calculated value: m / z 1444.51) also increased significantly. On the other hand, observed at m / z 1647.66, [Hex_FourHexNAc_FourFuc₁+ Na]⁺There was no increase in the relative signal intensity of the incompletely digested product corresponding to the ion (calculated value: m / z 1647.59).
Structure C. Upon digestion with β-N-acetylhexosaminidase, observed at m / z 1891.78, [Hex_ThreeHexNAc₆Fuc₁+ Na]⁺The peak corresponding to the ion (calculated value: m / z 1891.69) is observed at m / z 1079.47, [Hex_ThreeHexNAc₂Fuc₁+ Na]⁺The peak corresponding to the ion (calculated value: m / z 1097.38) and observed at m / z 1485.65 and m / z 1485.61, [Hex_ThreeHexNAc_FourFuc₁+ Na]⁺It completely changed to a peak corresponding to the ion (calculated value: m / z 1485.53). On the other hand, the calculated value is m / z 1688.61 [Hex_ThreeHexNAc_FiveFuc₁+ Na]⁺Or [Hex with a calculated value of m / z 1282.45_ThreeHexNAc_ThreeFuc₁+ Na]⁺There was no evidence of incompletely digested products that were thought to be. During the α1,3 / 4-fucosidase digestion, part of the peak observed at m / z 1485.61 is observed at m / z 1339.52. [Hex_ThreeHexNAc_Four+ Na]⁺It changed to a peak corresponding to the ion (calculated value: m / z 1339.48).
Structure D. [beta] -N-acetylhexosaminidase digestion is observed at m / z 2215.85 and m / z 2215.84, [Hex_FiveHexNAc₆Fuc₁+ Na]⁺The relative signal intensity of the peak corresponding to the ion (calculated value: m / z 2215.80) was significantly reduced. At the same time, observed at m / z 1809.71 and m / z 1809.67, [Hex_FiveHexNAc_FourFuc₁+ Na]⁺The relative signal intensity of the peak corresponding to the ion (calculated value: m / z 1809.64) also increased significantly. On the other hand, observed at m / z 2012.76, which is considered to be an incompletely digested product, [Hex_FiveHexNAc_FiveFuc₁+ Na]⁺No increase in the relative signal intensity of the peak corresponding to the ion (calculated value: m / z 2012.72) was observed.
[0098]
LacdiNAc-containing N-glycans derived from membrane protein of human melanoma cell line RPMI-7932 (FIGS. 8-9):
Structure E. During β-hexosaminidase digestion, the [Hex observed at m / z 1501.52_FourHexNAc_Four+ Na]⁺The peak corresponding to the ion (calculated value: m / z 1501.53) is observed at m / z 1095.36, [Hex_FourHexNAc₂+ Na]⁺It changed to a peak corresponding to the ion (calculated value: m / z 1095.37). On the other hand, observed at m / z 1298.48 and m / z 1298.46, [Hex_FourHexNAc_Three+ Na]⁺There was no significant increase in the relative signal intensity of the incompletely digested product corresponding to the ion (calculated value: m / z 1298.45).
[0099]
Conclusion
The results of this example show that human cancerous tissue contains a glycoprotein having a LacdiNAc sequence. More specifically, the results of this example are NeuAc, a LacdiNAc-containing sialylated N-glycan.₁Hex_FourHexNAc_FiveFuc₁Indicates that it is expressed as a glycoprotein in a laryngeal cancer tumor sample. Furthermore, the results of this example show that there are several structures containing LacdiNAc, sialyl-LacdiNAc and / or fucosyl-LacdiNAc in the membrane protein-derived sialylated N-glycans of the melanoma cell line RPMI-7932, This suggests that sialyl-LacdiNAc-containing N-glycans exist in the membrane protein-derived sialylated N-glycans of the melanoma cell line RPMI-7951. Structure C (ie, Hex) which is a desialylated N-glycan derived from the membrane protein of the melanoma cell line RPMI-7932_ThreeHexNAc₆Fuc₁The isolated sialylated N-glycanArthrobacter ureafaciens Since N-glycans were obtained by digestion with sialidase, at least one LacdiNAc unit was originally sialylated. Similarly, in structure C, which is a sialylated N-glycan derived from the membrane protein of melanoma cell line RPMI-7932, at least one of the two LacdiNAc sequences is β-linked to one of the α-mannoses of the N-glycan core. There must be. Furthermore, α1,3 / 4-fucosidase digestion reveals that α1,3-fucosylated LacdiNAc sequence is present in structure C, which is a sialylated N-glycan derived from membrane protein of melanoma cell line RPMI-7932. It was. In other structures, the presence of the Hex-HexNAc sequence prevented assignment of the structural features described above. Structure E (ie, Hex) which is a desialylated N-glycan derived from the membrane protein of the melanoma cell line RPMI-7951_FourHexNAc_Four) Monosaccharide composition of Man_FourGlcNAc₂The presence of hybrid N-glycans having a sialyl-LacdiNAc sequence in the N-glycan core is suggested.
[0100]
Example 3
On cancer cells and glycoconjugates GalNAc β 1-4GlcNAc Anti-recognition sequence LacdiNAc Antibodies and immunogenic oligosaccharide conjugates used for their production and characterization
antibody
Anti-LacdiNAc antibodies are produced by standard methods in laboratory animal immunology, screening of antibody libraries performed by phage display methods, or other known methods using immunogenic LacdiNAc conjugates. The antibody used, considered a monoclonal antibody, is specific for LacdiNAc, which is an ELISA using an ELISA plate coated with a specific oligosaccharide or oligosaccharide conjugate, or a specific oligosaccharide or binding thereof It is shown by other suitable methods using body recognition. Antibodies that bind to the LacdiNAc antigen but not the corresponding LacNAc analog are suitable for the intended use. Certain pairs of LacdiNAc antigen and LacNAc control antigen are suitable for the preparation of conjugates such as neoglycoprotein or other immunogenic conjugates. Specific examples of such pairs include the following pairs.
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-R and Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-R,
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-6Galβ1-R and Galβ1-4GlcNAcβ1-6Galβ1-R,
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAcα1-R and Galβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAcα1-R,
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-6GalNAcα1-R and Galβ1-4GlcNAcβ1-6GalNAcα1-R,
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-R and Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-R,
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-6Manα1-R and Galβ1-4GlcNAcβ1-6Manα1-R,
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-4Manα1-R, Galβ1-4GlcNAcβ1-4Manα1-R, and
Sialylated analogs and / or fucosylated analogs corresponding to the epitopes of the invention described above.
Where R is, for example, lactose, all O-glycans, all N-glycans, all glycolipid core structures, and oligosaccharides into neoglycoproteins or other immunogenic carriers by known methods. It is selected from spacers used for bonding.)
[0101]
LacdiNAc sequence in tissue piecesin situManufacturing of
Control tissuein situ It can be subjected to LacdiNAc synthesis and used as a positive control in immunohistochemistry or other diagnostic fields. For example, using a mutant β-galactosyltransferase similar to the bovine milk enzyme Y289L variant described in Ramakrishnan and Qasba (2002) and using reaction conditions substantially similar to those described in this reference. Thus, the reaction can be promoted. Prior to the GalNAc transfer reaction, the tissue pieces may be incubated overnight at 37 ° C. with 0.5 U / ml peanut β-galactosidase (Glyko, UK) in 50 mM sodium acetate (pH 4.0), Thereafter, the glycosidase reaction solution is washed away from the tissue piece. In this way, additional receptor sites for GalNAc transferase can be created.
[0102]
Use of antibodies in the field of immunological diagnosis
LacdiNAc specific antibodies can be used in immunohistochemistry, immunodiagnostics, and other diagnostic fields based on standard immunological methods.
[0103]
Example 4
Of the present invention lacdiNAc For detecting cytolytic activity against antibodies that recognize structures in vitro
Dissolution assay
A model cancer cell having a lacdiNAc structure on the cell surface is collected to a density of 80% and washed 4 times with HBSS (Hanks' balanced salt solution). Cell viability is confirmed by trepan blue staining. Approximately 200,000 cells are incubated with an antibody that binds to the lacdiNAc structure of the present invention displayed on the cell surface. To one set of cells, rabbit complement is added to a final dilution of 1: 5, and the other set of cells is adjusted to the same volume by adding medium. The cells are further incubated at 37 ° C. for 1 hour. Finally, propium iodide was added to a final concentration of 20 μg / ml and the cell dye uptake was analyzed. Cells are lysed by lacdiNAc-conjugated antibody but not by non-cancerous control antibody. The lacdiNAc structure is present on the cell surface so that it can be used for antibody recognition and cell lysis.
[0104]
Example 5

Example of α3-sialyltransferase reaction
Excess molar amount (20 μmol) of CMP-NeuNAc and 1 U of α3-sialyltransferase (ST3Gal III, derived from rat liver, Calbiochem) were added in 2.1 ml of 2 mM / ml BSA-containing 50 mM MOPS-NaOH (pH 7.4). Incubate with GalNβ4GlcNAcβ3Lac (5 μmol) at 37 ° C. overnight. The product NeuNAcα3GalNβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc is produced quantitatively and purified by gel filtration HPLC-chromatography. Mass spectrometry and NMR analysis confirm the expected structure. In the linear anion mode MALDI-TOF mass spectrometry, a product peak is observed at m / z 998.36. This product can optionally be N-alkylated or derivatized to an analog of α3-sialylated LacdiNAc. α3-sialylated lacdiNAc is 200 μl of 1M NH containing 8 μl of acetic anhydride._FourHCO_ThreeIt is obtained by N-acetylating GalN to GalNAc.
[0105]
Example of α3-galactosyltransferase reaction
Synthesis of Galα3GalNβ4GlcNAcβ3Lac from GalNβ4GlcNAcβ3Lac
UDP-Gal (3 μmol), GalNβ4GlcNAcβ3Lac (1.5 μmol) and α3-galactosyltransferase (0.1 U, Calbiochem) were added to 500 μl of 20 mM MgCl.₂Incubate at 37 ° C. in 100 mM MES buffer (pH 7.0). The product Galα3GalNβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc was purified by gel filtration HPLC-chromatography. The reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 4 days. In positive mode MALDI-TOF mass spectrometry, the expected product peak was observed at m / z 891.2102. The structure of this product is confirmed by NMR spectroscopy.
[0106]
Example 6

By two galactosyltransferases GlcNAc β 3Lac from GalN α 3GalN β 4GlcNAc β 3Lac Synthesis and in situ Donor synthesis
5 μmol GlcNAcβ3Lac, 10 mM GalN-1P (manufactured by Sigma), 20 mM UDP-Glc, 2.5 U galactose-1-phosphate-uridyltransferase, 0.5 U β1-4-galactosyltransferase and 0.5 U α1-3-galactosyl A reaction mixture containing transferase (Calbiochem, California, USA) was added to 5 mM MgCl.₂And in 1.0 ml of 0.1 M HEPES (pH 8.0) containing 5 mM β-mercaptoethanol. The reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 4 days. When the reaction product was subjected to MALDI-TOF analysis in a positive ion mode, a main product peak was observed at m / z 890.2349. The product structure is confirmed by NMR spectroscopy.
[0107]
[Table 1]

[0108]
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[Brief description of the drawings]
[0109]
FIG. 1A MALDI-TOF analysis of free MMP-9 N-glycans. N-glycans are complete N-glycans.
FIG. 1B: MALDI-TOF analysis of free MMP-9 N-glycans. N-glycans are incubated with NDV neuraminidase.
FIG. 1C. MALDI-TOF analysis of free MMP-9 N-glycans. N-glycans, after incubation with NDV neuraminidase,C.perfringens Treated with neuraminidase.
FIG. 1D: MALDI-TOF analysis of free MMP-9 N-glycans. After incubating N-glycans with NDV neuraminidase,C.perfringens It was treated with neuraminidase and then with fucosidase derived from almond seeds.
FIG. 2 LC-ESI MS analysis of trypsin digested MMP-9. A is a chromatogram showing total ions of the eluted peptide, B is a chromatogram of extracted ions of m / z 204.1 (Hex oxonium ion), and C is m / z 292.1 (SA oxonium (Ion) is a chromatogram of extracted ions, and D is a chromatogram of extracted ions of m / z 366.1 (Oxonium ion of Hex-HexNAc). B, C and D represent digestion products presumed to be glycopeptides.
FIG. 3A: LC / MS analysis of tryptic peptide of MMP-9. It is a mass spectrum corresponding to the glycopeptide eluted at 23.1 minutes.
FIG. 3B: LC / MS analysis of tryptic peptide of MMP-9. It is a mass spectrum corresponding to the glycopeptide eluted at 24.3 minutes.
FIG. 4A is a linear anion mode MALDI-TOF mass spectrum of sialylated glycans from laryngeal cancer samples.
FIG. 4B shows sialylated glycans derived from laryngeal cancer samples.A.ureafaciens Sialidase digestion andS.pneumoniae Reflector-type cation mode MALDI-TOF mass spectrum that was subjected to β-N-acetylglucosaminidase digestion.
FIG. 4C shows sialylated glycans derived from laryngeal cancer samples.A.ureafaciens Sialidase digestion,S.pneumoniae Reflector-type cation mode MALDI-TOF mass spectrum after subjecting to β-N-acetylglucosaminidase digestion and peanut β-N-acetylhexosaminidase digestion.
FIG. 5 shows sialylated N-glycans derived from membrane proteins of melanoma cell line RPMI-7932.A.ureafaciens Sialidase digestion andS.pneumoniae Reflector-type cation mode MALDI-TOF mass spectrum subjected to β-N-acetylglucosaminidase digestion.
FIG. 6 shows sialylated N-glycan derived from membrane protein of melanoma cell line RPMI-7932.A.ureafaciens Sialidase digestion,S.pneumoniae Reflector-type cation mode MALDI-TOF mass spectrum after subjecting to β-N-acetylglucosaminidase digestion and peanut β-N-acetylhexosaminidase digestion.
FIG. 7 shows sialylated N-glycans derived from membrane proteins of melanoma cell line RPMI-7932.A.ureafaciens Sialidase digestion, peanut β-N-acetylhexosaminidase digestion andXanthomonasSpecies-type cation mode MALDI-TOF mass spectrum of species α1,3 / 4-fucosidase digested but with reflector type.
FIG. 8. Membrane protein-derived sialylated N-glycans of melanoma cell line RPMI-7951A.ureafaciens Sialidase digestion andS.pneumoniae Reflector-type cation mode MALDI-TOF mass spectrum subjected to β-N-acetylglucosaminidase digestion.
FIG. 9 shows sialylated N-glycans derived from membrane proteins of melanoma cell line RPMI-7951.A.ureafaciens Sialidase digestion,S.pneumoniae Reflector-type cation mode MALDI-TOF mass spectrum after subjecting to β-N-acetylglucosaminidase digestion and peanut β-N-acetylhexosaminidase digestion.

Claims

The following formula (I):
(Sac1) _x GalNAcβ4 (Fucα3) _y GlcNAc (I)
(In the formula, x and y are each independently an integer of 0 or 1, and Sac1 is NeuNAcα3 or NeuNAcα6.)
A method for diagnosing cancer using a biological sample, which comprises detecting the presence of an oligosaccharide sequence represented by the formula in a biological sample.

The diagnostic method according to claim 1, comprising the following step (a) or step (b).
(A) contacting the biological sample with a binding substance that binds to the oligosaccharide sequence, and using the binding between the binding substance and the biological sample via the oligosaccharide sequence as an index, Detecting the presence of cancer in a biological sample, or (b) releasing oligosaccharide structures or oligosaccharide complexes in the biological sample by enzymatic or chemical methods, A fraction containing the released oligosaccharide structure or oligosaccharide complex is generated, and the presence of cancer in the biological sample is detected using the presence of the oligosaccharide sequence in the fraction as an indicator.

The diagnostic method according to claim 2, wherein the binding substance is specific to GalNAcβ4GlcNAc or a derivative thereof which is an oligosaccharide sequence.

The method according to claim 2, wherein the binding substance is specific to at least one oligosaccharide sequence selected from the group consisting of the following formulae.
[NeuNAcα3] _0-1 GalNAcβ4 (Fucα3) _0-1 GlcNAc, and
[NeuNAcα6] _0-1 GalNAcβ4 (Fucα3) _0-1 GlcNAc.

The diagnostic method according to any one of claims 2 to 4, wherein the binding substance is an aptamer, a peptide, or a protein.

The diagnostic method according to claim 5, wherein the protein is an antibody, an enzyme, a lectin, or a fragment thereof.

The diagnostic method according to claim 2, wherein the biological sample is a blood sample or a serum sample.

The diagnostic method according to claim 7, wherein the oligosaccharide sequence is detected from a secreted glycoprotein in a blood sample or a serum sample.

The glycoprotein is a glycoprotein selected from the group consisting of a matrix metalloproteinase protein family, prostate specific antigen, kallikrein 2, human chorionic gonadotropin and carcinoembryonic antigen. The diagnostic method described.

10. The diagnostic method according to claim 2, wherein the presence of the oligosaccharide sequence is detected by mass spectrometry and / or a method using a glycosidase enzyme.

A diagnostic agent used for diagnosis of cancer or cancer type, comprising the binding substance defined in any one of claims 2 to 6.

A method for producing a diagnostic agent for diagnosis of cancer or a type of cancer, using the binding substance defined in any one of claims 1 to 5.

An antigenic substance used for human immunization, comprising a terminal oligosaccharide sequence represented by formula (I) in a polyvalent form chemically or biochemically synthesized.

A method for producing a polyclonal antibody or a monoclonal antibody using the antigenic substance of claim 13 or an analog or derivative thereof.

A method for purifying an antibody from serum, preferably human serum, using the antigenic substance of claim 13 or an analogue or derivative thereof.

A method for detecting and / or quantifying an antibody using the antigenic substance of claim 13 or an analogue or derivative thereof.

A multivalent or oligovalent non-immunogenic conjugate comprising at least one oligosaccharide sequence represented by formula (I).

18. An antibody against at least one oligosaccharide chain comprising a terminal oligosaccharide sequence represented by formula (I), a substance that inhibits LacdiNAc biosynthesis in cancer cells, and the non-immunogenic conjugate of claim 17 A pharmaceutical composition for treating cancer comprising at least one kind.

A pharmaceutical composition for treating cancer comprising an oligosaccharide chain comprising a terminal oligosaccharide sequence represented by formula (I) or an analog or derivative thereof.

20. A pharmaceutical composition according to claim 18 or 19, further comprising a pharmaceutically acceptable carrier and optionally an adjuvant.

21. A method for treating cancer wherein the pharmaceutical composition according to any one of claims 18 to 20 is administered to a human or animal patient in need of treatment to reduce the metastatic or proliferative capacity of cancer cells, or a tumor or cancer A method of treatment, characterized by using an amount of said pharmaceutical composition sufficient to eliminate

Whether a human antibody or an antibody adapted to the human body against an oligosaccharide chain comprising a terminal oligosaccharide sequence represented by formula (I) is administered to a human or animal patient to reduce the metastatic or proliferative ability of cancer cells A method for treating cancer, which comprises eliminating a tumor or cancer.

The method for treating cancer according to claim 22, wherein the antibody is purified from serum.

The method for treating cancer according to claim 22 or 23, wherein the toxic substance targets a tumor or cancer by the antibody.

A therapeutic method characterized by inhibiting LacdiNAc biosynthesis in cancer cells with a specific inhibitor to reduce the metastatic potential and malignancy of cancer cells.

26. A treatment method according to any one of claims 20 to 25 for treating a patient who is receiving immunosuppressant therapy or who is suffering from immunodeficiency.

A cancer vaccine comprising an oligosaccharide chain comprising a terminal oligosaccharide sequence represented by formula (I) or an analog or derivative thereof.

28. The cancer vaccine according to claim 27, further comprising a pharmaceutically acceptable carrier and optionally an adjuvant.

A substance that binds to an oligosaccharide chain containing a terminal oligosaccharide sequence represented by the formula (I), characterized by being an aptamer, an enzyme, an antibody or peptide adapted to the human body, and oligosaccharide chain binding material.

Formula (II) below:
[OS- (X) _n -LY] _m -Z (II)
(Where
Y is a non-carbohydrate spacer or non-glycosidically linked end conjugate
each n is independently 0 or 1,
X is lactosyl residue, galactosyl residue, N-acetyllactosaminyl residue, mannosyl residue, Man ₂ residue, Man ₃ residue, Man ₃ GlcNAc residue, Man ₄ GlcNAc residue, N-acetylglucosa A minyl residue or an N-acetylgalactosaminyl residue, preferably a lactosyl residue, a galactosyl residue, a mannosyl residue or an N-acetylgalactosaminyl residue,
In a preferred embodiment, X is a mannosyl residue and OS is β2-, β4- or β6-linked, preferably β2-linked to X;
In other preferred embodiments, X is a lactosyl residue or N-acetyllactosaminyl residue, OS is β3- or β6-linked to the Gal residue of X, or X is a galactosyl residue or N- It is an acetylgalactosaminyl residue, and OS is β3- or β6-linked to X. )
The pharmaceutical composition for cancer treatment characterized by including the antigenic epitope structure represented by these.

Formula (IV) below:
Gal [N (Am) _s2 ] _s3 α3GalN (Am) _s2 β3 / 4 (IV)
(Where
Am is a residue derived from an amine group, provided that Am is not an acetyl (Ac) group or an imide group, but preferably an amide group that forms a carboxylic acid with a GalN residue, such as formamide, propionic acid amide, etc. Cyclic amides such as amides of cyclohexane radicals containing carboxylic acids, and amide groups of aromatic hydrocarbons such as amide groups of benzoic acid,
s2 and s3 are each independently an integer of 0 or 1. )
Carbohydrate represented by

Following formula:
GalN (Am) _r1 α3 (Fucα2) _r2 Galβ3 / 4 (V)
(Where
r1 and r2 are each independently an integer of 0 or 1,
Am is a residue derived from an amine group, provided that Am is not an acetyl (Ac) group or an imide group, but preferably an amide group that forms a carboxylic acid with a GalN residue, such as formamide, propionic acid amide, etc. Alkylamides, cyclic amides such as amides of cyclohexane radicals containing carboxylic acids, and amide groups of aromatic hydrocarbons such as amide groups of benzoic acid. )
Carbohydrate represented by

A method for producing a GalN derivative, particularly a lacdiNac structure and analogs thereof, comprising carrying out a transglycosylation reaction represented by the following formula (III) using terminal hexosamine as an acceptor.
SAC-donor + GalNβ3 / 4 → SACyxGalNβ3 / 4 (III)
[Where:
y is an α- or β-bond;
each x independently represents a bonding position at the 3rd, 4th or 6th position;
GalNβ3 / 4 represents a non-reducing terminal GalN that is β3- or β4-linked to hexose, hexosamine or a hexosamine derivative, preferably Gal, GalN, GalNAc, Glc, GlcN or GlcNAc,
SAC represents sialic acid or a sugar residue represented by the following formula.
Hex (A) _s1 [N (Ac) _s2 ] _s3
(In the formula, Hex is Gal or Glc, and s1, s2, and s3 are each independently 0.
Or an integer of 1 (if s1 is 1, s3 is 0)
When s1 in the above formula is 1, the structure represented by SAC includes a hexuronic acid structure, preferably GlcA; when s3 is 1 and s2 is 1, SAC is The structure represented includes GlcNAc or GalNAc; and when s2 is 0, the structure represented by SAC includes GalN or GlcN. ]