JP2005333889A - Method for necrocytosis and device therefor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、培養される細胞のうち不必要な特定細胞をレーザによって壊死させる方法及び装置に関し、より詳しくは細胞画像データを用いてより効率的に特定細胞を壊死させる方法及び装置に関する。 The present invention relates to a method and an apparatus for necrosing unnecessary specific cells among cultured cells by a laser, and more particularly to a method and an apparatus for more efficiently necrosing specific cells using cell image data.
近年の医学の発展により、様々な場面で細胞治療が施されるようになってきた。例えば、悪性リンパ腫や白血病などの造血器腫瘍に対して大量化学療法や放射線照射を行い、造血器腫瘍に対する治療を行う一方で、その副作用として生ずる骨髄障害を治療するために造血幹細胞を移植するといった手段が用いられる。このほかにも、軟骨欠損に対して軟骨細胞を移植する軟骨細胞治療や、神経変性疾患に対して神経細胞を移植する神経細胞治療などの幹細胞治療が行われている。このような幹細胞治療においては、移植される細胞から好ましくない細胞が移植前に除去される必要がある。 With the recent development of medicine, cell therapy has been applied in various situations. For example, hematopoietic tumors such as malignant lymphoma and leukemia are treated with high-dose chemotherapy and radiation to treat hematopoietic tumors, while hematopoietic stem cells are transplanted to treat bone marrow damage that occurs as a side effect. Means are used. In addition, stem cell therapy such as chondrocyte treatment for transplanting chondrocytes for cartilage defects and nerve cell therapy for transplanting nerve cells for neurodegenerative diseases has been performed. In such stem cell therapy, it is necessary to remove unwanted cells from the transplanted cells before transplantation.
例えば、上述の造血器腫瘍における造血幹細胞治療においては、移植片対宿主病を防止する観点から、患者自身の幹細胞を採取培養し、その培養された幹細胞を移植することが好ましい。このような場合採取された幹細胞の中には癌細胞を含有した細胞も含まれている可能性があり、癌細胞を除去せず移植すれば造血器腫瘍を再発させることになる。 For example, in the above-described hematopoietic stem cell treatment in hematopoietic organ tumors, it is preferable to collect and culture the patient's own stem cells and transplant the cultured stem cells from the viewpoint of preventing graft-versus-host disease. In such a case, the collected stem cells may also contain cells containing cancer cells. If transplanted without removing the cancer cells, the hematopoietic tumor will recur.
特許文献１には、このような不要な細胞にラベル付けし、ラベル付けされた細胞にレーザ光を照射することによって細胞を壊死させる方法が開示されている。
レーザ光照射によって細胞を壊死させるには、確実にレーザ光を細胞の細胞核に照射させ細胞核を破壊させなければならない。しかしながらレーザ光が細胞に照射される領域（以下、スポットと呼ぶ）は一定であるが、細胞はその大きさにばらつきがある。したがって、細胞の大きさが大きくなればレーザ光がその細胞核に当る確率が低減し、細胞の壊死率が低くなるという問題があった。また、人間の細胞は植物細胞と異なり、細胞壁を有さず柔らかな細胞膜で覆われるものであるので、その形状は多様であり、例え細胞の中心部分にレーザ光を照射したとしても、レーザ光が細胞核に当るとは限らなかった。
よって、従来において細胞を確実に壊死させる方法は皆無であった。
本発明は上記実情を鑑みてなされたものであって、対象とする細胞を効率よく確実に壊死させることが可能な細胞壊死方法及び細胞壊死装置を提供することを目的とする。
In order to necrotize cells by laser beam irradiation, it is necessary to reliably irradiate the cell nucleus of the cell with the laser beam to destroy the cell nucleus. However, the area (hereinafter referred to as spot) where the laser beam is irradiated onto the cells is constant, but the size of the cells varies. Therefore, there is a problem that if the size of the cell is increased, the probability that the laser beam hits the cell nucleus is reduced and the necrosis rate of the cell is lowered. In addition, unlike plant cells, human cells do not have cell walls and are covered with a soft cell membrane, so their shapes vary, and even if the central part of a cell is irradiated with laser light, Did not always hit the cell nucleus.
Therefore, there has been no method for reliably necrotizing cells in the past.
This invention is made | formed in view of the said situation, Comprising: It aims at providing the cell necrosis method and cell necrosis apparatus which can make the target cell necrosis efficiently and reliably.
請求項１記載の発明は、対象細胞が蛍光発色するように標識化処理をされた試料を収容する試料セルを顕微鏡に載置する試料載置工程と、前記試料セルに収容された試料のデジタル画像を取得する細胞画像取得工程と、前記デジタル画像からレーザ照射位置を定める細胞画像処理工程と、前記細胞画像処理工程にて定められたレーザ照射位置にレーザ光を照射するレーザ照射工程からなり、前記細胞画像処理工程が、前記デジタル画像の画素ごとに画素の蛍光輝度に応じて細胞の有無を識別し、該デジタル画像データを２値化する段階と、前記２値化されたデジタル画像データにおいて、異なる値が隣接する境界を見極め、孤立閉曲線を見出す段階と、前記孤立閉曲線内部を全て細胞があるものとして、前記２値化された画像データを加工する段階と、前記加工された２値化された画像データを所定の大きさの領域に区分し、該区分領域において細胞が存するものと認識されている領域の重心座標を算出し、該重心位置を前記レーザ照射位置とすることを特徴とする細胞壊死方法である。
請求項２記載の発明は、前記２値化された画像データを加工する段階の後、該加工された画像データの孤立閉曲線内部の画素数をカウントし、該孤立閉曲線内部面積を算出する段階と、所定値以下の孤立閉曲線内部面積を有する孤立閉曲線を除去する段階とを更に備えることを特徴とする請求項１記載の細胞壊死方法である。
請求項３記載の発明は、前記区分領域が、前記レーザ光のスポットを外接円とする矩形領域以上且つ前記レーザ光のスポットを内接円とする矩形領域以下の大きさに定められることを特徴とする請求項１又は２記載の細胞壊死方法である。
According to the first aspect of the present invention, there is provided a sample placing step of placing a sample cell containing a sample that has been labeled so that the target cell emits a fluorescent color on a microscope, and a digital of the sample contained in the sample cell. A cell image acquisition step of acquiring an image, a cell image processing step of determining a laser irradiation position from the digital image, and a laser irradiation step of irradiating a laser beam to the laser irradiation position determined in the cell image processing step, In the cell image processing step, for each pixel of the digital image, identifying the presence or absence of cells according to the fluorescence luminance of the pixel, binarizing the digital image data, and in the binarized digital image data Determining the boundary where different values are adjacent to each other, finding an isolated closed curve, and processing the binarized image data by assuming that there are cells inside the isolated closed curve. Dividing the processed binarized image data into regions of a predetermined size, calculating barycentric coordinates of regions recognized as having cells in the segmented regions, and calculating the barycentric position The cell necrosis method is characterized in that the laser irradiation position is used.
According to a second aspect of the present invention, after the step of processing the binarized image data, the step of counting the number of pixels inside the isolated closed curve of the processed image data and calculating the inner area of the isolated closed curve; The cell necrosis method according to
The invention according to
請求項４記載の発明は、レーザ光源と、対象細胞が蛍光発色するように標識化された細胞試料を観察可能な顕微鏡と、前記顕微鏡で観察される細胞試料の像を撮像する撮像装置と、前記撮像装置により得られたデジタル画像データを取り込むコンピュータと、前記レーザ光源から照射されるレーザ光を前記顕微鏡内に案内するとともに、光軸調整可能とされる電子制御ミラーを備えるミラー群からなり、前記コンピュータが、前記デジタル画像データの各画素の蛍光輝度に応じて、各画素における細胞の有無を識別し、該デジタル画像データを２値化し、該２値化されたデジタル画像データにおいて、異なる値が隣接する境界を見極め、孤立閉曲線を見出し、該見出された孤立閉曲線内部を全て細胞が存在するものとして、前記２値化されたデジタル画像データを加工し、該加工されたデジタル画像データを所定の大きさの領域に区分し、該区分領域において細胞が存するものと認識されている領域の重心座標を算出する手段と、前記電子制御ミラーの光軸を前記重心座標に前記レーザが照射されるように調整する手段を備え、前記レーザ光源からのレーザ光が前記重心座標に照射されることを特徴とする細胞壊死装置である。
請求項５記載の発明は、前記コンピュータが前記２値化された画像データを加工の後であって該加工されたデジタル画像データを区分する前に、該加工された画像データの孤立閉曲線内部の画素数をカウントし、該孤立閉曲線内部面積を算出し、所定値以下の孤立閉曲線内部面積を有する孤立閉曲線を除去することを特徴とする請求項４記載の細胞壊死装置である。
請求項６記載の発明は、前記区分領域が、前記レーザ光のスポットを外接円とする矩形領域以上且つ前記レーザ光のスポットを内接円とする矩形領域以下の大きさに定められることを特徴とする請求項４又は５記載の細胞壊死装置である。
The invention according to
According to a fifth aspect of the present invention, the computer processes the binarized image data after processing the binarized image data and before dividing the processed digital image data. 5. The cell necrosis device according to
The invention according to
請求項１及び４記載の発明によれば、細胞の大きさや形状によらず、細胞の略全域にレーザ光を照射できるので、細胞を確実に壊死させることが可能となる。
請求項２及び５記載の発明によれば、レーザ光を不必要な部分に照射することが防止され、壊死させる必要のない細胞を損傷させることが防止される。
請求項３及び６記載の発明によれば、区分領域がレーザ光のスポットの大きさと略等しいため、細胞輪郭をはみ出して照射されるレーザ光を最小限にでき、壊死させる必要のない細胞を損傷させる危険性を更に低減可能となる。また、レーザ光が細胞全域に確実に照射されるともに、細胞全域にレーザ光を照射するための区分割り数が最小となるので効率的に且つ確実に細胞を壊死させることが可能となる。
According to the first and fourth aspects of the invention, since the laser beam can be irradiated to almost the entire area of the cell regardless of the size and shape of the cell, the cell can be surely necrotized.
According to invention of
According to the third and sixth aspects of the present invention, since the segmented area is substantially equal to the spot size of the laser beam, the laser beam that protrudes from the cell outline can be minimized, and the cells that do not need to be necrotized are damaged. It is possible to further reduce the risk of occurrence. In addition, the laser beam is reliably irradiated to the entire cell area, and the divisional number for irradiating the entire area of the cell with the laser beam is minimized, so that the cell can be necrotized efficiently and reliably.
以下、本発明に係る細胞壊死方法の実施形態について、図を参照しつつ説明する。図１は本発明に係る細胞壊死装置の概略図である。
細胞壊死装置（１）は、レーザ光源（２）、顕微鏡（３）、レーザ光源（２）から照射されたレーザ光を複数のミラーで反射させ、顕微鏡（３）内まで導入するミラー群（４）、顕微鏡（２）により拡大された細胞画像を撮像する撮像装置（５）及び撮像装置（５）により得られた画像データを処理するコンピュータ（６）からなる。
Hereinafter, an embodiment of a cell necrosis method according to the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is a schematic view of a cell necrosis device according to the present invention.
The cell necrosis device (1) includes a mirror group (4) that reflects laser light emitted from a laser light source (2), a microscope (3), and a laser light source (2) by a plurality of mirrors and introduces the laser light into the microscope (3). ), An imaging device (5) for capturing an enlarged cell image by the microscope (2), and a computer (6) for processing image data obtained by the imaging device (5).
レーザ光源（２）は細胞を壊死させることが可能なものならば特に限定されず、Ｎｄ：ＹＡＧレーザやフェムト秒チタンサファイアレーザ、フェムト秒ファイバレーザ、ナノ秒ＹＡＧレーザ、ナノ秒・ピコ秒ＶＹＯ４レーザ、エキシマレーザなどのパルスレーザが例示できる。 The laser light source (2) is not particularly limited as long as it can cause necrosis of cells. Nd: YAG laser, femtosecond titanium sapphire laser, femtosecond fiber laser, nanosecond YAG laser, nanosecond / picosecond VYO 4 Examples thereof include pulse lasers such as lasers and excimer lasers.
レーザ光源（２）から照射された光は、まずミラー群（４）を構成するハーフミラー（４２）により、２つの光路に分光される。ここで、図１中実線で示す光路を第１光路（４３）とし、点線で示す光路を第２光路（４４）とする。第１光路（４３）及び第２光路（４４）を通るレーザ光はともに電子制御ミラー（４１）を通過する。電子制御ミラー（４１）はコンピュータ（６）と接続され、各電子制御ミラー（４１）は独立して光軸を制御される。
電子制御ミラー（４１）としては、ミラーに備えられた軸を中心に回転可能とされるガルバノミラーや、電圧に応じて比例的変位するピエゾ素子を用いたピエゾアクチュエータに取り付けられた反射鏡などが適宜使用可能である。
このようにして、レーザ光源（２）からのレーザ光は分光され、分光された両レーザ光ともに顕微鏡（３）内部へ案内される。
The light emitted from the laser light source (2) is first split into two optical paths by the half mirror (42) constituting the mirror group (4). Here, an optical path indicated by a solid line in FIG. 1 is a first optical path (43), and an optical path indicated by a dotted line is a second optical path (44). Both the laser beams passing through the first optical path (43) and the second optical path (44) pass through the electronic control mirror (41). The electronic control mirror (41) is connected to the computer (6), and each electronic control mirror (41) is independently controlled in optical axis.
Examples of the electronically controlled mirror (41) include a galvanometer mirror that can be rotated around an axis provided in the mirror, and a reflecting mirror attached to a piezo actuator using a piezo element that is proportionally displaced according to voltage. It can be used as appropriate.
In this way, the laser light from the laser light source (2) is split and both the split laser lights are guided into the microscope (3).
顕微鏡（３）は顕微鏡光源（３１）、試料ステージ（３２）、対物レンズ（３３）及び特定波長の光を反射させるダイクロイックミラー（３４）を備える。また対物レンズ（３３）の直上に撮像装置（５）が備えられている。試料ステージ（３２）上には試料セル（７）が載置され、試料セル（７）内には細胞試料が収容されている。試料ステージ（３２）は水平方向に移動可能とされ、試料ステージ（３２）を移動させることによって所望の試料セル（７）の領域を観察可能とされる。
上述の如く顕微鏡（３）内部へ案内されたレーザ光はダイクロイックミラー（３４）によって下方に反射され、対物レンズ（３３）を介して試料ステージ（３２）上の試料セル（７）に集光される。
The microscope (3) includes a microscope light source (31), a sample stage (32), an objective lens (33), and a dichroic mirror (34) that reflects light of a specific wavelength. An imaging device (5) is provided immediately above the objective lens (33). A sample cell (7) is placed on the sample stage (32), and a cell sample is accommodated in the sample cell (7). The sample stage (32) can be moved in the horizontal direction, and the desired region of the sample cell (7) can be observed by moving the sample stage (32).
As described above, the laser beam guided into the microscope (3) is reflected downward by the dichroic mirror (34), and is condensed to the sample cell (7) on the sample stage (32) through the objective lens (33). The
顕微鏡光源（３１）から照射された白色光は、試料セル（７）に入射され、その透過像は対物レンズ（３３）及びダイクロイックミラー（３４）を介して撮像装置（５）に至る。透過像がダイクロイックミラー（３４）を通過した直後にはフィルタ（５１）が配設され顕微鏡（３）内部のレーザ光や顕微鏡（３）外部の外乱光の除去がなされる。
撮像装置（５）としては、ＣＣＤカメラやＣＭＯＳカメラを用いることができ、これにより透過像はデジタル処理可能となる。
撮像装置（５）によりデジタル化された画像はコンピュータ（６）に送られ、後述のように画像処理が施される。
The white light emitted from the microscope light source (31) is incident on the sample cell (7), and the transmitted image reaches the imaging device (5) via the objective lens (33) and the dichroic mirror (34). Immediately after the transmitted image passes through the dichroic mirror (34), a filter (51) is provided to remove laser light inside the microscope (3) and disturbance light outside the microscope (3).
As the imaging device (5), a CCD camera or a CMOS camera can be used, whereby the transmission image can be digitally processed.
The image digitized by the imaging device (5) is sent to the computer (6) and subjected to image processing as will be described later.
試料セル（７）内部には、壊死させようとする細胞を識別可能とするために標識化された細胞試料が収納されている。本実施例においては、癌細胞を対象細胞とする。
まず標識化するために、細胞試料に癌細胞表層に発現している物質と親和性を有する標識抗体を導入する。標識抗体としては、抗インテグリン抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＭＵＣ−１抗体、抗サイトケラチン抗体、抗上皮細胞増殖因子抗体、抗インシュリン様増殖因子抗体、抗インシュリン様増殖因子レセプタ抗体などの抗体或いは抗原認識部位を含む抗体の一部、コラーゲンなどのポリペプチド或いはオリゴペプチド、ＲＧＤ配列を含むオリゴペプチド、フィブロネクチンなどの糖たんぱく質、ヒアルロン酸、ホスホマンナンなどの多糖、マンノース−６−リン酸五量体などのオリゴ糖、マンノース−６−リン酸などの単糖、レチノイン酸などのビタミン酸などが挙げられる。白血球や赤血球などの正常細胞と相互作用しないという観点において、抗インシュリン様増殖因子レセプタ抗体、マンノース−６−リン酸五量体が好適である。
標識抗体は癌細胞にのみ付着し、癌細胞周囲を覆うこととなる。
標識抗体が癌細胞に付着した状態で、更に試料にペルオキシダーゼ、アリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光試薬を加える。蛍光試薬は標識抗体に付着し、結果として癌細胞を蛍光発色させ、癌細胞は標識化される。
In the sample cell (7), a labeled cell sample is stored so that cells to be necrotized can be identified. In this example, cancer cells are the target cells.
First, for labeling, a labeled antibody having an affinity for a substance expressed on the surface of cancer cells is introduced into a cell sample. Examples of labeled antibodies include antibodies or antigens such as anti-integrin antibodies, anti-CD44 antibodies, anti-MUC-1 antibodies, anti-cytokeratin antibodies, anti-epithelial cell growth factor antibodies, anti-insulin-like growth factor antibodies, anti-insulin-like growth factor receptor antibodies. Part of antibody including recognition site, polypeptide or oligopeptide such as collagen, oligopeptide including RGD sequence, glycoprotein such as fibronectin, polysaccharide such as hyaluronic acid, phosphomannan, mannose-6-phosphate pentamer, etc. Oligosaccharides, monosaccharides such as mannose-6-phosphate, and vitamin acids such as retinoic acid. In view of not interacting with normal cells such as leukocytes and erythrocytes, anti-insulin-like growth factor receptor antibodies and mannose-6-phosphate pentamers are preferred.
The labeled antibody adheres only to the cancer cells and covers the periphery of the cancer cells.
With the labeled antibody attached to the cancer cells, an enzyme such as peroxidase or aliphosphatase, or a fluorescent reagent such as fluorescein isothiocyanate or tetramethylrhodamine isothiocyanate is added to the sample. The fluorescent reagent adheres to the labeled antibody, and as a result, the cancer cells are fluorescently colored, and the cancer cells are labeled.
図２は本発明に係る細胞壊死方法の２値化工程を示す図である。図２（ａ）は撮像装置（５）を介してコンピュータ（６）に取り込まれた細胞の画像を示し、図２（ｂ）は２値化工程の第１段階を示し、図２（ｃ）は２値化工程の第２段階を示し、図２（ｄ）は２値化工程の第３段階を示す。
上述の如く細胞試料には標識化処理が施され、対象細胞（本実施例においては癌細胞）が蛍光発色する。したがって、コンピュータ（６）内には蛍光発色した癌細胞のみが画像データとして取り込まれる（図２（ａ）参照）。
コンピュータ（６）内では、画像は画素ごとにメッシュ化されている。そして、予め定められた蛍光輝度を閾値として、その蛍光輝度より低い輝度を有する画素に相当するメッシュには「０」が、高い輝度を有する画素に相当するメッシュには「１」が割り当てられる（図２（ｂ）参照）。尚、図２（ｂ）において、「１」が割り当てられたメッシュは黒で塗りつぶされ、「０」が割り当てられたメッシュは白で塗りつぶされている。
図２（ｂ）に示された状態において、「０」が割り当てられたメッシュと「１」が割り当てられたメッシュとの境界が認識される。この境界を結んで孤立閉曲線が認識される。尚、標識化工程において標識抗体或いは標識抗体に付着する蛍光試薬の付着が十分でなかったとき、一の閉曲線の内部に他の閉曲線が形成される場合があるが、この場合には最外輪郭を形成する閉曲線が孤立閉曲線として認識される。
孤立閉曲線認識後、孤立閉曲線内部のメッシュには「１」が割り当てられる（図２（ｃ）参照）。この後、孤立閉曲線内部の「１」が割り当てられたメッシュ数がカウントされ、孤立閉曲線内部面積が算出される。尚、この孤立閉曲線内部面積が所定の設定値以下である場合には、レーザ照射対象から除外される。このようにして、対象細胞以外の部分にレーザが照射されることを防止する。
FIG. 2 is a diagram showing a binarization process of the cell necrosis method according to the present invention. FIG. 2 (a) shows an image of cells taken into the computer (6) via the imaging device (5), FIG. 2 (b) shows the first stage of the binarization process, and FIG. Shows the second stage of the binarization process, and FIG. 2D shows the third stage of the binarization process.
As described above, the cell sample is subjected to a labeling process, and the target cell (cancer cell in this embodiment) develops fluorescence. Therefore, only the cancer cells that are fluorescently colored are captured as image data in the computer (6) (see FIG. 2A).
In the computer (6), the image is meshed for each pixel. Then, with a predetermined fluorescence brightness as a threshold, “0” is assigned to a mesh corresponding to a pixel having a brightness lower than the fluorescence brightness, and “1” is assigned to a mesh corresponding to a pixel having a higher brightness ( (Refer FIG.2 (b)). In FIG. 2B, the mesh assigned “1” is painted black, and the mesh assigned “0” is painted white.
In the state shown in FIG. 2B, the boundary between the mesh assigned “0” and the mesh assigned “1” is recognized. An isolated closed curve is recognized by connecting this boundary. In the labeling process, when the labeled antibody or the fluorescent reagent adhering to the labeled antibody is not sufficiently attached, another closed curve may be formed inside one closed curve. Are recognized as isolated closed curves.
After the isolated closed curve is recognized, “1” is assigned to the mesh inside the isolated closed curve (see FIG. 2C). Thereafter, the number of meshes to which “1” in the isolated closed curve is assigned is counted, and the area inside the isolated closed curve is calculated. In addition, when this isolated closed curve internal area is below a predetermined set value, it is excluded from laser irradiation objects. In this way, it is possible to prevent the laser beam from being irradiated on a portion other than the target cell.
次に、図２（ｃ）で示す画像データの「０」と「１」を反転させる（図２（ｄ）に示す例では白黒反転させている）。そしてこの画像データを所定の大きさで区分する。
図３に区分領域の大きさの設定の一例を示す。
図３に示すように、細胞上のレーザ光円（即ち、スポット）を外接円とする矩形領域を最小区分領域とし、スポットを内接円とする矩形領域を最大区分領域とし、この領域範囲内で区分領域の大きさを定めることが好ましい。この大きさ以下であるとレーザ照射領域が小さくなり、細胞の壊死率が低減する可能性が増大し、この大きさ以上であると細胞輪郭からはみ出して照射されるレーザ光が多くなり、壊死させる必要のない細胞をも損傷させる可能性が増大するからである。
区分された領域内の「０」が割り当てられた画素数がカウントされ、各区分領域における細胞が存する部分の面積及び重心座標が算出される（図２（ｃ）中、重心位置は三角の記号で示されている）。尚、このとき所定の面積以下の区分領域がレーザ照射対象から除外されてもよい。
Next, “0” and “1” of the image data shown in FIG. 2C are reversed (in the example shown in FIG. 2D, black and white are reversed). Then, the image data is divided into a predetermined size.
FIG. 3 shows an example of setting the size of the segmented area.
As shown in FIG. 3, a rectangular region having a laser light circle (that is, a spot) on a cell as a circumscribed circle is defined as a minimum segmented region, and a rectangular region having a spot as an inscribed circle is defined as a maximum segmented region. It is preferable to determine the size of the segmented area by. If it is less than this size, the laser irradiation area will be smaller, increasing the possibility that the necrosis rate of the cells will be reduced, and if it is more than this size, the amount of laser light that radiates out of the cell outline will increase, causing necrosis. This is because the possibility of damaging unnecessary cells is increased.
The number of pixels assigned with “0” in the divided area is counted, and the area and the barycentric coordinates of the portion where the cell exists in each divided area are calculated (in FIG. 2C, the barycentric position is a triangular symbol). Is shown). At this time, a segmented area having a predetermined area or less may be excluded from the laser irradiation target.
このように重心座標が求められた後、レーザ光源（２）からレーザ光が照射される。コンピュータ（６）は算出された重心座標に応じて電子制御ミラー（４１）の光軸調整を行い、レーザ光は電子制御ミラー（４１）によって、照射位置を制御され、上述の重心座標位置に向かって照射される。
上記のようにレーザ光の照射位置が定められるので、レーザ光は細胞の形状や大きさに関わらず細胞全体に光エネルギをもたらし、確実に細胞を壊死させる。また、各区分領域の重心にレーザ光が照射されるので、対象細胞をはみ出るレーザ光は僅かであり、対象細胞に近接する対象細胞外の細胞への損傷を抑制できる。
After the barycentric coordinates are obtained in this way, laser light is emitted from the laser light source (2). The computer (6) adjusts the optical axis of the electronic control mirror (41) according to the calculated center-of-gravity coordinates, and the irradiation position of the laser light is controlled by the electronic control mirror (41) so that the laser light is directed toward the above-described center-of-gravity coordinates. Is irradiated.
Since the irradiation position of the laser beam is determined as described above, the laser beam brings light energy to the entire cell regardless of the shape and size of the cell, and necrotically kills the cell. In addition, since the center of gravity of each segmented region is irradiated with laser light, the amount of laser light that protrudes from the target cell is small, and damage to cells outside the target cell that are close to the target cell can be suppressed.
図４は本発明に係る細胞壊死方法の一連の工程を示すフローチャートである。
細胞壊死方法は、試料載置工程、試料ステージ動作設定工程、細胞画像取得工程、細胞画像処理工程及びレーザ照射工程からなる。
まず、試料載置工程において、レーザ照射位置と画像データの座標を一致させるため、試料ステージ（３２）上に乳白色板を座標校正用被検体として載置する。レーザ光が撮像装置（５）によって得られる画像の中心に照射されるように、コンピュータ（６）の電子ミラー（４１）の光軸制御パラメータに数値入力を行う。そして、被検体上にレーザ光を照射し、その状態を撮像装置（５）で撮像する。撮像装置（５）により得られる画像にはレーザ光のスポットが写り、コンピュータ（６）により該スポットの中心座標が求められ、画像の中心座標とスポットの中心座標とが比較され、座標校正のための補正値が算出される。このようにして、レーザ光の照射座標と画像処理上の座標とが一致する。
そして、上述の如く標識化処理された細胞試料を収納する試料セル（７）を試料ステージ（３２）上に載置する。
次に、試料ステージ動作設定工程にて試料ステージの動作を定める。
図５は試料セル（７）を上方から見た図である。尚、図５中対物レンズ（３３）で観察可能な領域（７２）を点線で示している。
まず、試料セルの試料が収容された試料収容部（７１）の一端を始点領域（Ｓ）として設定する。そして他端を終点領域（Ｅ）として設定する。始点領域（Ｓ）と終点領域（Ｅ）との間で試料ステージ（３２）の送りピッチを設定する。この送りピッチの設定において各対物レンズ観察可能領域（７２）が重なるように定める方が好ましい。このように設定すると、試料セル（７）に収容された試料が全て観察可能となるからである。
この後、細胞画像取得工程において、対物レンズ観察可能領域（７２）の像が撮像装置（５）によりデジタル化して撮られ、その画像データがコンピュータ（６）へと送られる。
そして細胞画像処理工程において、上述の如く、画像データは２値化処理を施され、細胞の画像は区分され、該区分領域の重心座標が算出される。
次にレーザ照射工程において、レーザ光が算出された重心座標に照射されるように電子制御ミラー（４１）の光軸設定が適宜調整されレーザが照射される。対物レンズ観察可能領域（７２）内の全ての算出された重心座標にレーザ光が照射された後、試料ステージ（３２）は移動し、隣接する対物レンズ観察可能領域（７２）に対して細胞画像取得工程からレーザ照射工程までの一連の工程を繰り返す。そして試料セル内の壊死させるべき細胞は全てレーザ光によって確実に壊死されるものとなる。
尚、レーザ光の照射時間、出力或いはパルス数などの設定は対象細胞の種類に応じて適宜定めればよい。
FIG. 4 is a flowchart showing a series of steps of the cell necrosis method according to the present invention.
The cell necrosis method includes a sample placement step, a sample stage operation setting step, a cell image acquisition step, a cell image processing step, and a laser irradiation step.
First, in the sample placement step, a milky white plate is placed on the sample stage (32) as an object for coordinate calibration in order to make the laser irradiation position coincide with the coordinates of the image data. A numerical value is input to the optical axis control parameter of the electronic mirror (41) of the computer (6) so that the laser beam is irradiated to the center of the image obtained by the imaging device (5). Then, the subject is irradiated with laser light, and the state is imaged by the imaging device (5). An image obtained by the imaging device (5) includes a spot of laser light, and the computer (6) obtains the center coordinate of the spot, and the center coordinate of the image is compared with the center coordinate of the spot for coordinate calibration. The correction value is calculated. In this way, the irradiation coordinates of the laser light coincide with the coordinates on the image processing.
Then, the sample cell (7) for storing the cell sample labeled as described above is placed on the sample stage (32).
Next, the operation of the sample stage is determined in the sample stage operation setting step.
FIG. 5 is a view of the sample cell (7) as viewed from above. In FIG. 5, the region (72) that can be observed with the objective lens (33) is indicated by a dotted line.
First, one end of the sample storage part (71) in which the sample of the sample cell is stored is set as the start point region (S). The other end is set as the end point region (E). The feed pitch of the sample stage (32) is set between the start point region (S) and the end point region (E). In setting the feed pitch, it is preferable to set the objective lens observable regions (72) so as to overlap each other. This is because all the samples accommodated in the sample cell (7) can be observed by setting in this way.
Thereafter, in the cell image acquisition step, the image of the objective lens observable region (72) is digitized by the imaging device (5), and the image data is sent to the computer (6).
In the cell image processing step, as described above, the image data is binarized, the cell image is segmented, and the barycentric coordinates of the segmented region are calculated.
Next, in the laser irradiation step, the optical axis setting of the electronic control mirror (41) is appropriately adjusted so that the laser beam is irradiated to the calculated barycentric coordinates, and the laser is irradiated. After the laser beam is irradiated to all the calculated center-of-gravity coordinates in the objective lens observable area (72), the sample stage (32) moves and a cell image is displayed with respect to the adjacent objective lens observable area (72). A series of steps from the acquisition step to the laser irradiation step is repeated. And all the cells to be necrotized in the sample cell are surely necrosed by the laser beam.
Note that settings such as the irradiation time, output, or number of pulses of laser light may be appropriately determined according to the type of target cell.
本発明は、対象とする細胞を効率よく確実に壊死させることが可能な細胞壊死方法及び細胞壊死装置に好適に適用される。 The present invention is preferably applied to a cell necrosis method and a cell necrosis apparatus that can efficiently and reliably necrotize target cells.
１・・・・・細胞壊死装置
２・・・・・レーザ光源
３・・・・・顕微鏡
４・・・・・ミラー群
４１・・・・電子制御ミラー
５・・・・・撮像装置
６・・・・・コンピュータ
DESCRIPTION OF
Claims (6)
前記試料セルに収容された試料のデジタル画像を取得する細胞画像取得工程と、
前記デジタル画像からレーザ照射位置を定める細胞画像処理工程と、
前記細胞画像処理工程にて定められたレーザ照射位置にレーザ光を照射するレーザ照射工程からなり、
前記細胞画像処理工程が、前記デジタル画像の画素ごとに画素の蛍光輝度に応じて細胞の有無を識別し、該デジタル画像データを２値化する段階と、
前記２値化されたデジタル画像データにおいて、異なる値が隣接する境界を見極め、孤立閉曲線を見出す段階と、
前記孤立閉曲線内部を全て細胞があるものとして、前記２値化された画像データを加工する段階と、
前記加工された２値化された画像データを所定の大きさの領域に区分し、該区分領域において細胞が存するものと認識されている領域の重心座標を算出し、該重心位置を前記レーザ照射位置とすることを特徴とする細胞壊死方法。 A sample placement step of placing on a microscope a sample cell that contains a sample that has been labeled so that the target cell is fluorescently colored;
A cell image acquisition step of acquiring a digital image of the sample contained in the sample cell;
A cell image processing step for determining a laser irradiation position from the digital image;
A laser irradiation step of irradiating a laser beam to a laser irradiation position determined in the cell image processing step;
The cell image processing step, for each pixel of the digital image, identifying the presence or absence of cells according to the fluorescence intensity of the pixel, binarizing the digital image data;
In the binarized digital image data, identifying a boundary where different values are adjacent and finding an isolated closed curve;
Processing the binarized image data by assuming that all the cells inside the isolated closed curve are cells;
The processed binarized image data is divided into regions of a predetermined size, the barycentric coordinates of a region where cells are recognized to be present in the divided region are calculated, and the barycentric position is calculated by the laser irradiation. A method for necrosis of cells, characterized by being located.
所定値以下の孤立閉曲線内部面積を有する孤立閉曲線を除去する段階とを更に備えることを特徴とする請求項１記載の細胞壊死方法。 After the step of processing the binarized image data, counting the number of pixels inside the isolated closed curve of the processed image data, and calculating the area inside the isolated closed curve;
The cell necrosis method according to claim 1, further comprising the step of removing an isolated closed curve having an inner area of the isolated closed curve equal to or less than a predetermined value.
対象細胞が蛍光発色するように標識化された細胞試料を観察可能な顕微鏡と、
前記顕微鏡で観察される細胞試料の像を撮像する撮像装置と、
前記撮像装置により得られたデジタル画像データを取り込むコンピュータと、
前記レーザ光源から照射されるレーザ光を前記顕微鏡内に案内するとともに、光軸調整可能とされる電子制御ミラーを備えるミラー群からなり、
前記コンピュータが、前記デジタル画像データの各画素の蛍光輝度に応じて、各画素における細胞の有無を識別し、該デジタル画像データを２値化し、
該２値化されたデジタル画像データにおいて、異なる値が隣接する境界を見極め、孤立閉曲線を見出し、
該見出された孤立閉曲線内部を全て細胞が存在するものとして、前記２値化されたデジタル画像データを加工し、
該加工されたデジタル画像データを所定の大きさの領域に区分し、該区分領域において細胞が存するものと認識されている領域の重心座標を算出する手段と、
前記電子制御ミラーの光軸を前記重心座標に前記レーザが照射されるように調整する手段を備え、
前記レーザ光源からのレーザ光が前記重心座標に照射されることを特徴とする細胞壊死装置。 A laser light source;
A microscope capable of observing a cell sample labeled so that the target cell is fluorescently colored;
An imaging device for imaging an image of a cell sample observed with the microscope;
A computer for capturing digital image data obtained by the imaging device;
While guiding the laser light emitted from the laser light source into the microscope, and comprising a group of mirrors equipped with an electronically controlled mirror that can adjust the optical axis,
The computer identifies the presence or absence of cells in each pixel according to the fluorescence brightness of each pixel of the digital image data, binarizes the digital image data,
In the binarized digital image data, a boundary where different values are adjacent to each other is identified, an isolated closed curve is found,
The binarized digital image data is processed by assuming that cells exist all within the isolated closed curve,
Means for dividing the processed digital image data into regions of a predetermined size, and calculating center-of-gravity coordinates of regions recognized as having cells in the divided regions;
Means for adjusting the optical axis of the electronic control mirror so that the laser is irradiated to the barycentric coordinates;
A cell necrosis device characterized by irradiating the barycentric coordinates with laser light from the laser light source.
所定値以下の孤立閉曲線内部面積を有する孤立閉曲線を除去することを特徴とする請求項４記載の細胞壊死装置。 After the computer processes the binarized image data and before dividing the processed digital image data, the computer counts the number of pixels inside the isolated closed curve of the processed image data, Calculate the internal area of the closed curve,
5. The cell necrosis device according to claim 4, wherein an isolated closed curve having an inner area of the isolated closed curve equal to or less than a predetermined value is removed.
6. The size of the segmented region is determined to be not less than a rectangular region having a circumscribed circle as the laser beam spot and not larger than a rectangular region having an inscribed circle as the laser beam spot. Cell necrosis device.
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