JP2005323565A - Method for detecting presence of monobasic mutational polymorphism in target dna sequence, and kit - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はＤＮＡ（deoxyribonucleic acid）、例えば遺伝子ＤＮＡの一塩基変異多型（single nucleotide polymorphisms: SNPs）を検出するための方法に関し、より具体的には改良されたＰＣＲ法を採用した一塩基変異多型を検出する方法に関する。本発明はさらに、そのような方法に使用できるキットに関する。 The present invention relates to a method for detecting DNA (deoxyribonucleic acid), for example, single nucleotide polymorphisms (SNPs) of gene DNA, and more specifically, single nucleotide polymorphism employing an improved PCR method. The present invention relates to a method for detecting a type. The invention further relates to kits that can be used in such methods.
近年、遺伝子における一塩基変異多型が注目され、一塩基変異多型の分析が、疾患遺伝子の探索、疾患や薬剤感受性と一塩基変異多型との関連などの研究に進み、さらには、テーラーメード医療を可能とすることが期待されている。
このような注目の中、遺伝子ＤＮＡの一塩基変異多型を検出する方法が種々検討され、提案されている。
ＰＣＲ法（Polymerase Chain Reaction）を用いた遺伝子診断法の中で、点突然変異の遺伝子異常を検出する方法は２種類に分類される。一つは既知の点変異を検出する方法、他の一つは未知の点変異をスクリーニングする方法である。前者の既知の点変異を感度よく検出する方法の一つとして、アレル特異的ＰＣＲ法（Allele Specific PCR、略称ＡＳ−ＰＣＲ）が提案されていて、これはまたＭＡＳＡ法（Mutant Allele Specific Amplification）とも呼ばれている（例えば非特許文献１参照）。ＭＡＳＡ法はＰＣＲ機械と電気泳動装置ならびに反応試薬があれば比較的簡単で、適切なＰＣＲプライマー設計とＰＣＲ条件の基礎検討を充分に行うことで、再現性のよい精度の高い結果が得られるとされている。
「アレル」とは対立遺伝子のことで、倍数体のゲノムを持つ生物において、相同染色体の相同な場所に位置して機能的にも相同な遺伝子をいう。受精、接合などによって配偶子から一つずつ受け継がれるものである。
In recent years, single nucleotide polymorphisms in genes have attracted attention, and analysis of single nucleotide polymorphisms has progressed to research on disease genes, the relationship between diseases and drug susceptibility and single nucleotide polymorphisms, and tailor-made It is expected to enable medical care.
Under such attention, various methods for detecting single nucleotide polymorphisms of gene DNA have been studied and proposed.
Among gene diagnostic methods using PCR (Polymerase Chain Reaction), methods for detecting point mutation gene abnormalities are classified into two types. One is a method for detecting a known point mutation, and the other is a method for screening an unknown point mutation. As one of the methods for detecting the former known point mutation with high sensitivity, an allele specific PCR method (Allele Specific PCR, abbreviated AS-PCR) has been proposed, which is also called MASA method (Mutant Allele Specific Amplification). It is called (for example, refer nonpatent literature 1). The MASA method is relatively simple if you have a PCR machine, an electrophoresis device, and a reaction reagent, and if sufficient PCR primer design and basic examination of PCR conditions are performed sufficiently, reproducible and accurate results can be obtained. Has been.
An “allele” is an allele, and refers to a functionally homologous gene that is located at a homologous site on a homologous chromosome in an organism having a polyploid genome. It is inherited from a gamete one by one by fertilization and joining.
ＡＳ−ＰＣＲ法は、約２０塩基程度からなる変異ＤＮＡ特異的オリゴヌクレオチドを合成し、鋳型（テンプレート）となるＤＮＡと耐熱性ポリメラーゼとともにＰＣＲ反応させて、変異アレルを特異的に増幅して、ゲル電気泳動によってバンドとして検出することからなる。増幅方法は、前半で変異アレルの一塩基置換配列と相補性を持つプライマーを用いてＰＣＲ反応をさせることで変異アレルが特異的に増幅される。ＡＳ−ＰＣＲ法の応用例は複数の文献に紹介されている（例えば非特許文献２参照）。 The AS-PCR method synthesizes a mutant DNA-specific oligonucleotide consisting of about 20 bases, causes a PCR reaction with DNA serving as a template (template) and a heat-resistant polymerase, specifically amplifies the mutant allele, and gels. It consists of detecting as a band by electrophoresis. In the amplification method, the mutant allele is specifically amplified by causing a PCR reaction using a primer complementary to the single nucleotide substitution sequence of the mutant allele in the first half. Application examples of the AS-PCR method are introduced in a plurality of documents (for example, see Non-Patent Document 2).
ＡＳ−ＰＣＲ法の具体的手法としては次のような例がある：まず変異部分を含むＤＮＡ断片を増幅させるように、変異部分を挟むように１組のプライマーを用意する；この１組において、アンチセンス鎖の基になるプライマー（ロワープライマー）は変異部分とは別の通常ある塩基配列に相当するように設計し、及び、センス鎖の基になるプライマー（アッパープライマー）は変異型塩基に相当する塩基が３′末端になるように設計する（すなわち変異型特異プライマーとする。）；そしてＰＣＲの条件が、変異アレルは効率よく増幅するが正常アレルの増幅効率は悪いように厳密に設計する；こうしてＰＣＲ反応を実施することにより、試料中に変異アレルＤＮＡが含まれるときに、所定の長さの断片が増幅され、電気泳動の結果として陽性バンドとして検出され、増幅産物の長さを確認することで変異アレルＤＮＡを同定することができる。ここでもし試料中に正常アレルＤＮＡが含まれるときには、上記アッパープライマー（変異型特異プライマー）の３′末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ため伸長反応が起きず、核酸の増幅が起きない。一方、試料中の遺伝子が変異アレルのときに、正常型特異プライマー（正常型塩基に相当する塩基が３′末端になるように設計されたプライマー）を用いた場合には増幅が起きないことになる。
上述にあるプライマーセットの一方である、変異型特異プライマー又は正常型特異プライマーをアレル特異的プライマー（Allele Specific primer）と呼ぶ。
このように正常型特異プライマーと変異型特異プライマーの各々のプライマーを用いた場合に、所定の長さのＤＮＡ断片の増幅が起きるか否かを調べることにより、試料遺伝子ＤＮＡが正常型か変異型かを判別することができる。
ここに添付する図１は、標的ＤＮＡ配列とプライマーセットの関係を示し、ＡＳ−ＰＣＲ法の原理を概略して説明するものである。図１はアッパープライマーがアレル特異的プライマーとなっている例を示している。
Specific examples of the AS-PCR method include the following examples: First, a set of primers is prepared so as to sandwich a mutated portion so as to amplify a DNA fragment containing the mutated portion; The primer that serves as the base of the antisense strand (lower primer) is designed to correspond to a normal base sequence that is different from the mutated portion, and the primer that serves as the base of the sense strand (upper primer) corresponds to the mutant base. Design so that the base to be 3 'ends (that is, a mutation-specific primer); and the PCR conditions are designed so that the mutant allele is efficiently amplified but the amplification efficiency of the normal allele is poor. By carrying out the PCR reaction in this way, when the mutant allele DNA is contained in the sample, a fragment of a predetermined length is amplified and positively amplified as a result of electrophoresis. Is detected as a band, it is possible to identify a mutant allele DNA by checking the length of the amplified product. If normal allelic DNA is contained in the sample, the 3 'end of the upper primer (mutant specific primer) is not complementary to the corresponding nucleotide of the sample gene (mismatch), so that no extension reaction occurs, and the nucleic acid Amplification does not occur. On the other hand, when the gene in the sample is a mutant allele, amplification does not occur when a normal specific primer (a primer designed so that the base corresponding to the normal base is at the 3 ′ end) is used. Become.
A mutant-type specific primer or a normal-type specific primer, which is one of the primer sets described above, is referred to as an allele-specific primer.
Thus, when each normal-type primer and mutant-type primer are used, whether or not the sample gene DNA is normal type or mutant type by examining whether or not amplification of a DNA fragment of a predetermined length occurs. Can be determined.
FIG. 1 attached here shows the relationship between the target DNA sequence and the primer set, and outlines the principle of the AS-PCR method. FIG. 1 shows an example in which the upper primer is an allele-specific primer.
従来技術として、例えば塩基多型を検出するために用いるプライマーの配列に工夫が提案されている（特許文献１参照。）。
ＡＳ−ＰＣＲ法はアレル特異的プライマーを用いて一塩基変異多型の存在を検出する方法であるが、実際には一塩基の違いによるプライマーのアニール効率の変動によってなされている。しかし、ＤＮＡの塩基対によってはこの差が僅かなため、正常型及び変異型の両者においてＰＣＲ産物が増幅する又は出現しないという同じ結果となり、正確な判定が困難となる場合が少なくない。また、用いる機器やその他の条件の違いによっても結果に大きな影響を与える。そのため、ＡＳ−ＰＣＲ法の実施には、その環境に合わせ、アレル特異的なプライマーの配列設計や反応温度などを注意深く設定する必要がある。
ＰＣＲ法は、目的となるＤＮＡ断片を飛躍的に増加させる方法であるため、ごく僅かな非特異的反応によっても、増幅を確認できるまでになる。ＡＳ−ＰＣＲ法において、上記のような厳密な条件設定を行っても、鋳型となるＤＮＡコピー数がある一定の濃度を超えた場合には、正常型および変異型の両者において増幅が起こり、一塩基変異多型の識別ができないという問題を残す。ＰＣＲ法のサイクルが一定以上の数を過ぎた場合も同様の結果が生じる。
As a conventional technique, for example, a device has been proposed for the sequence of a primer used for detecting a base polymorphism (see Patent Document 1).
The AS-PCR method is a method for detecting the presence of a single nucleotide polymorphism using an allele-specific primer. In practice, the AS-PCR method is performed by changing the annealing efficiency of a primer due to a difference in one base. However, since this difference is slight depending on the DNA base pair, the PCR product is amplified or does not appear in both the normal type and the mutant type, and accurate determination is often difficult. In addition, the results are greatly affected by differences in the equipment used and other conditions. Therefore, in order to carry out the AS-PCR method, it is necessary to carefully set the sequence design of the allele-specific primer, the reaction temperature, etc. according to the environment.
Since the PCR method is a method of dramatically increasing the target DNA fragment, amplification can be confirmed even with a very small amount of non-specific reaction. In the AS-PCR method, even when the above-described strict conditions are set, if the number of DNA copies used as a template exceeds a certain concentration, amplification occurs in both the normal type and the mutant type. The problem remains that the nucleotide polymorphism cannot be identified. Similar results occur when the number of cycles of the PCR method exceeds a certain number.
また、鋳型となるＤＮＡのコピー数がごく少ない場合には、２段階のＰＣＲによって増幅する場合がある。具体的には、１段階目のＰＣＲにおいて、目的のＤＮＡ断片を含むように広い領域をＰＣＲ法で増幅し、２段階目のＰＣＲにおいてはこの産物を鋳型とし、ＡＳ−ＰＣＲ法を用いて一塩基変異多型の存在を検出する場合がある。この際に、１段階目のＰＣＲにおいて得られるＤＮＡ断片の量が一定の濃度を超える場合が生じ、２段階目に行うＡＳ−ＰＣＲによる一塩基変異多型の識別ができないという問題が生じる。
このような状況下、ＡＳ−ＰＣＲ法を効率よく実施し、且つ高感度で判定を正確に行うことが求められている。
In addition, when the number of copies of DNA as a template is very small, it may be amplified by two-step PCR. Specifically, in the first-stage PCR, a wide region so as to contain the target DNA fragment is amplified by the PCR method, and in the second-stage PCR, this product is used as a template, and the AS-PCR method is used. The presence of a base mutation polymorphism may be detected. At this time, the amount of the DNA fragment obtained in the first stage PCR exceeds a certain concentration, and there arises a problem that the single nucleotide polymorphism cannot be identified by AS-PCR performed in the second stage.
Under such circumstances, it is required to perform the AS-PCR method efficiently and to perform the determination accurately with high sensitivity.
本発明の目的は、標的ＤＮＡ配列において一塩基変異多型の存在を検出する方法において、ＰＣＲ法、とりわけＡＳ-ＰＣＲ法の実施にあたり、一塩基多型の識別効果を充分に発揮させ、高感度で判定をより正確に行うことができる改良された方法を提供することである。 The object of the present invention is to provide a method for detecting the presence of a single nucleotide polymorphism in a target DNA sequence, exhibiting the effect of discriminating single nucleotide polymorphism sufficiently in carrying out the PCR method, particularly the AS-PCR method. It is an object of the present invention to provide an improved method capable of making a determination more accurately.
本発明者らは上記課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、従来ＰＣＲ法が、ＰＣＲ反応液中に一組のプライマーセット（アッパープライマーとロワープライマー）を添加して実施するのに対し、更なるプライマーを加えてＰＣＲ法を実施することにより、検体が高濃度の遺伝子を含有するときにも一塩基多型の識別効果を充分に発揮させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明の方法によれば、一塩基多型の識別効果を充分に発揮させることから、上記プライマーセットによって増幅されることが意図されるタイプの遺伝子断片が、検体中における当該タイプの遺伝子の存在又は非存在に応じて正確に、増幅する又は出現しないという結果をもって判定することができる。 As a result of intensive studies to achieve the above-mentioned problems, the present inventors have performed the conventional PCR method by adding a set of primer sets (upper primer and lower primer) to the PCR reaction solution. In addition, by carrying out the PCR method with the addition of additional primers, it has been found that even when the specimen contains a high concentration of gene, the single nucleotide polymorphism discrimination effect can be sufficiently exerted, and the present invention is completed. It came to. According to the method of the present invention, the gene fragment of the type that is intended to be amplified by the primer set is present in the sample because it sufficiently exhibits the discrimination effect of the single nucleotide polymorphism. Alternatively, the determination can be made with the result of amplifying or not appearing accurately, depending on the absence.
従って本発明は、標的ＤＮＡ配列において一塩基変異多型の存在を検出する方法であって、該標的ＤＮＡ配列に対するプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）を用い、該アッパープライマー及び該ロワープライマーのいずれか一方が、その配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されていて、及び、上記のようにそのの５′末端側に位置する更なるプライマーを用いてＰＣＲ法を実施し、次いでＰＣＲ産物を検出することを含む方法である。
本発明の上記方法において具体的に、配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている該アッパープライマー又は該ロワープライマーが、アレル特異的プライマーであって、変異型特異プライマー又は正常型特異プライマーとなる。
Therefore, the present invention is a method for detecting the presence of a single nucleotide polymorphism in a target DNA sequence, using a primer set (upper primer and lower primer) for the target DNA sequence, and any of the upper primer and the lower primer. Either one is designed in such a position that there is a base corresponding to the single nucleotide polymorphism site in the sequence, and using a further primer located on the 5 'end side as described above Performing a PCR method and then detecting the PCR product.
In the above method of the present invention, specifically, the upper primer or the lower primer designed at a position where there is a base corresponding to the single nucleotide polymorphism site in the sequence is an allele-specific primer, It becomes a mutation type specific primer or a normal type specific primer.
本発明の方法を適用することができる標的ＤＮＡ配列は、特に制限されるものではなく、例えば遺伝子ＤＮＡ配列などである。
本明細書中で、正常型と変異型とは、標的ＤＮＡ配列における一塩基変異多型が正常型と変異型とに分類できる場合には前者と後者をそれぞれ表し、標的ＤＮＡ配列の一塩基変異多型が正常型と変異型とに分類して呼称できないときには、一塩基変異多型の一方と他方をそれぞれ表すものとする。正常型と変異型は、例えば正常型と疾病型、あるいは野生型と変異型、に置き換えることもできる。
The target DNA sequence to which the method of the present invention can be applied is not particularly limited, and is, for example, a gene DNA sequence.
In this specification, the normal type and the mutant type represent the former and the latter, respectively, when the single nucleotide polymorphism in the target DNA sequence can be classified into the normal type and the mutant type. When polymorphisms cannot be classified and referred to as normal types and mutant types, they represent one and the other of single nucleotide mutation polymorphisms, respectively. The normal type and the mutant type can be replaced with, for example, a normal type and a disease type, or a wild type and a mutant type.
また、本発明の方法を実施するにあたって、２組のプライマーセットを同時に用いることもできる。具体的には、該２組のプライマーセットによるＰＣＲ産物の長さが各々異なり、以下の（Ａ）又は（Ｂ）の態様で実施することができる：（Ａ)第１のプライマーセットにおいて、ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されているであって、及び第２のプライマーセットにおいて、アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーである、又は、(Ｂ)第１のプライマーセットにおいて、ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーであって、第２のプライマーセットにおいて、アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーである。
上記（Ａ）又は（Ｂ）の態様において、第１のプライマーセットに関する更なるプライマーは、第２のプライマーセットのロワープライマーとなり、第２のプライマーセットに関する更なるプライマーは、第１のプライマーセットのアッパープライマーとなる。
In carrying out the method of the present invention, two primer sets can be used simultaneously. Specifically, the PCR product lengths of the two primer sets are different from each other, and can be carried out in the following modes (A) or (B): (A) In the first primer set, the lower The primer is designed at a position where there is a base corresponding to the single nucleotide polymorphism site in the sequence, and in the second primer set, the upper primer is a single nucleotide polymorphism in the sequence. It is a normal type specific primer designed at a position where a base corresponding to the site is present, or (B) in the first primer set, the lower primer corresponds to a single nucleotide polymorphism site in the sequence A normal-type specific primer designed at a position where a base is present, and in the second primer set, the upper primer has a single nucleotide variation in the sequence. And variant-specific primers are designed to position where there is a base that corresponds to the site.
In the above aspect (A) or (B), the further primer related to the first primer set is the lower primer of the second primer set, and the further primer related to the second primer set is the first primer set It becomes the upper primer.
本発明の実施態様において、配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている上記アッパープライマー又はロワープライマーの配列において、一塩基変異多型部位に相当する塩基が３′末端にあるように設計することができる。
本発明の別の実施態様において、配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている上記アッパープライマー又はロワープライマーの配列において、一塩基変異多型部位に相当する塩基が３′末端から２番目にあるように設計することができる。
In an embodiment of the present invention, the base corresponding to the single nucleotide polymorphism site in the sequence of the upper primer or the lower primer designed in such a position that the nucleotide corresponding to the single nucleotide polymorphism site is present in the sequence. Can be designed to be at the 3 'end.
In another embodiment of the present invention, in the sequence of the above upper primer or lower primer designed at a position where there is a base corresponding to the single nucleotide polymorphism site in the sequence, it corresponds to the single nucleotide polymorphism site. It is possible to design the base to be second from the 3 'end.
本発明はさらに、標的ＤＮＡ配列において一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲ法の実施に使用するキットであって、
(a)標的ＤＮＡ配列に対するプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該アッパープライマー及び該ロワープライマーのいずれか一方が、その配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている；及び
(b)配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている上記(a)の該アッパープライマー又は該ロワープライマーの５′末端側に位置する更なるプライマー
を含むキットに向けられている。
The present invention further provides a kit for use in performing a PCR method for detecting the presence of a single nucleotide polymorphism in a target DNA sequence,
(a) Primer set for target DNA sequence (upper primer and lower primer): Either one of the upper primer or the lower primer is located at a position where a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site is present in the sequence. Designed; and
(b) a further primer located on the 5 ′ end side of the upper primer or the lower primer of the above (a), which is designed at a position where there is a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site in the sequence Is directed to a kit containing.
本発明はまた、標的ＤＮＡ配列において一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲ法の実施に使用するキットであって、
(a)標的ＤＮＡ配列に対する第１のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーである；及び
(b)標的ＤＮＡ配列に対する第２のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーである
を含み、第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットの各々によるＰＣＲ産物の長さが異なるキット、又は
(a)標的ＤＮＡ配列に対する第１のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーである；及び
(b)標的ＤＮＡ配列に対する第２のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーである
を含み、第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットの各々によるＰＣＲ産物の長さが異なるキット
に向けられている。
The present invention also provides a kit for use in carrying out a PCR method for detecting the presence of a single nucleotide polymorphism in a target DNA sequence,
(a) First primer set (upper primer and lower primer) for a target DNA sequence: a variant in which the lower primer is designed at a position where a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site is present in the sequence A specific primer; and
(b) Second primer set for target DNA sequence (upper primer and lower primer): normal type designed such that the upper primer has a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site in the sequence A kit comprising different primer lengths, each comprising a first primer set and a second primer set, or
(a) First primer set for target DNA sequence (upper primer and lower primer): normal type designed such that the lower primer has a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site in the sequence A specific primer; and
(b) Second primer set (upper primer and lower primer) for the target DNA sequence: a variant in which the upper primer is designed at a position where a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site is present in the sequence The PCR product by each of the first primer set and the second primer set is directed to a kit including different specific primers.
本明細書中において一塩基変異多型とは、一塩基のみが変異している多型のほかに、一塩基変異が２ヶ所以上存在する、すなわち２塩基以上で数塩基までの変異による多型や、一塩基以上で数塩基までの挿入や欠損による多型を包含する。従って本明細書中で一塩基変異多型部位とは、一塩基のみが変異している部位、一塩基変異が２ヶ所以上存在する部位、一塩基以上数塩基までの挿入や欠損がある部位を包含して意味する。 In this specification, the single nucleotide mutation polymorphism is a polymorphism in which there are two or more single nucleotide mutations in addition to a polymorphism in which only one nucleotide is mutated, that is, mutations in two or more nucleotides to several nucleotides In addition, polymorphisms due to insertion or deletion of one or more bases up to several bases are included. Therefore, in this specification, the single nucleotide mutation polymorphic site means a site where only one base is mutated, a site where two or more single nucleotide mutations are present, and a site where insertion or deletion of one or more bases is present. Include and mean.
本発明の、標的ＤＮＡ配列において一塩基変異多型の存在を検出する方法によれば、たとえ検体中にテンプレートＤＮＡが比較的高濃度で存在したとしても、又はＰＣＲ法のサイクルが一定以上の数を過ぎた場合でも、一塩基多型の識別効果を充分に発揮させることができ、その結果、標的ＤＮＡ配列における一塩基変異多型の存在を、高感度でより正確な判定をもって検出することができる。より詳しくは、本発明の方法によれば、アレル特異的プライマーを一方とするプライマーセットによって増幅されることが意図されるタイプのＤＮＡ断片が、検体中における当該タイプの一塩基多型の存在又は非存在に応じて正確に、増幅する又は出現しないという結果をもって判定することができる。
本発明の、標的ＤＮＡ配列において一塩基変異多型の存在を検出する方法は、一塩基変異多型の解析や、更に遺伝病の診断などにも有用である。
According to the method of the present invention for detecting the presence of a single nucleotide polymorphism in a target DNA sequence, even if the template DNA is present at a relatively high concentration in the sample, the number of cycles of the PCR method is a certain number or more. Even if it has passed, the effect of discriminating single nucleotide polymorphism can be sufficiently exerted, and as a result, the presence of single nucleotide polymorphism in the target DNA sequence can be detected with high sensitivity and more accurate judgment. it can. More specifically, according to the method of the present invention, a DNA fragment of a type that is intended to be amplified by a primer set having one allele-specific primer is present in the sample as a single nucleotide polymorphism of the type or It can be determined with the result that it amplifies or does not appear exactly depending on its absence.
The method for detecting the presence of a single nucleotide polymorphism in a target DNA sequence according to the present invention is useful for analysis of a single nucleotide polymorphism and for diagnosis of a genetic disease.
以下に本発明を詳細に説明する。
先ず、従来のＡＳ−ＰＣＲ法（アレル特異的ＰＣＲ法）における一般的なプライマーセットのデザインの一例を図２に示す。図２は、アルデヒドデヒドロゲナーゼII（ALDH2）のエクソン１２にある一塩基変異多型（Ｇ又はＡ）を想定し、一塩基変異多型部位を○又は□で示している。図２では、一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されるプライマー、すなわちアレル特異的プライマー（変異型特異プライマー又は正常型特異プライマー）はロワープライマーとして設計されている。該アレル特異的プライマーは“ALDH2R Normal”、“ALDH2R Mutant”と示され、ここで RはReverseの略であって、ロワープライマーであることを意味する。一方アッパープライマーはALDH2に通常ある配列位置に設計されている。
図２の例では、ＰＣＲ反応により１５７塩基対（157bp）のＤＮＡ断片の増幅の有無が意図される。図２の上図は正常型ALDH2に対して変異型特異プライマーがミスマッチであることを示していて、検体中に正常型ALDH2があるときに変異型特異プライマーの使用によれば１５７bpのＤＮＡ断片の増幅がなく、一方正常型特異プライマーの使用によれば１５７bpのＤＮＡ断片の増幅が観察されるはずである。図２の下図では異常型ALDH2に対して正常型特異プライマーがミスマッチであることを示していて、検体中に異常型ALDH2があるときに正常型特異プライマーの使用によれば１５７bpのＤＮＡ断片の増幅がなく、一方変異型特異プライマーの使用によれば、１５７bpのＤＮＡ断片の増幅が観察されるはずである。
The present invention is described in detail below.
First, an example of a general primer set design in the conventional AS-PCR method (allele-specific PCR method) is shown in FIG. FIG. 2 assumes a single nucleotide polymorphism (G or A) in
In the example of FIG. 2, the presence or absence of amplification of a DNA fragment of 157 base pairs (157 bp) by PCR reaction is intended. The upper diagram in FIG. 2 shows that the mutant-type specific primer is mismatched with respect to normal ALDH2, and when the normal-type ALDH2 is present in the sample, the use of the mutant-specific primer results in a 157 bp DNA fragment. There is no amplification, while amplification of a 157 bp DNA fragment should be observed with the use of normal specific primers. The lower figure of FIG. 2 shows that the normal type specific primer is mismatched with the abnormal type ALDH2, and when the normal type specific primer is used when the sample has the abnormal type ALDH2, amplification of a 157 bp DNA fragment On the other hand, with the use of the mutant-specific primer, amplification of a 157 bp DNA fragment should be observed.
ところが、検体中に例えば正常型ALDH2遺伝子が比較的多量に存在するとき、すなわち図２の上図の場合、変異型特異プライマーを使用したプライマーセットによって実際、正常型 ALDH2の遺伝子断片の増幅が起きてしまう。このような状況から、ＰＣＲ反応の結果として157bpの遺伝子断片の増幅が電気泳動によるバンドとして確認されたからといって、検出に使用したアレル特異的プライマーに対応した型の遺伝子が検体中に必ずしも存在すると判定することができない。結局、正常型ALDH2遺伝子が存在するのか、又は、変異型ALDH2遺伝子が存在するのか判別がつかないことになり、検体における所定の遺伝子型の存在、不存在が判定できない。 However, for example, when a normal ALDH2 gene is present in a relatively large amount in a sample, that is, in the case of the upper diagram in FIG. End up. From this situation, just because the amplification of the 157 bp gene fragment was confirmed as a band by electrophoresis as a result of the PCR reaction, the type of gene corresponding to the allele-specific primer used for detection was not necessarily present in the sample. Then it cannot be determined. Eventually, it cannot be determined whether the normal ALDH2 gene is present or the mutant ALDH2 gene is present, and the presence or absence of the predetermined genotype in the specimen cannot be determined.
本発明では従来のＡＳ−ＰＣＲ法に更なる追加のプライマーを用いてＰＣＲ法を実施する。本発明の方法で使用するプライマーセット及び更なるプライマーのデザインの一例を、図３に概略的に示す。図３も、アルデヒドデヒドロゲナーゼII（ALDH2）のエクソン１２にある一塩基変異多型（Ｇ又はＡ）を想定し、一塩基変異多型部位を○又は□で示している。図３でもまた、一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されるプライマー、すなわちアレル特異的プライマー（変異型特異プライマー又は正常型特異プライマー）がロワープライマー（lower primer）として設計されている。該アレル特異的プライマーは“ALDH2R Normal”、“ALDH2R Mutant”と示され、ここで RはReverseの略であって、ロワープライマーであることを意味する。一方アッパープライマー（upper primer）はALDH2に通常ある配列位置に設計されている。
図３の例では、ＰＣＲ反応によりアレル特異的プライマーを一方とするプライマーセットによって、１５７塩基対（157bp）のＤＮＡ断片の増幅の有無が意図される。本発明の方法では、上記アレル特異的プライマーの５′末端側に位置する更なるプライマーを用いる。図３中、該更なるプライマーを“ALDH2 outer”と示しており、以下、本発明で使用する該更なるプライマーを“アウタープライマー”（outer primer）とも呼ぶ。
図３の例において、アッパープライマーとアウタープライマーにより３９４塩基対（394bp）の断片の増幅があり得る。
In the present invention, the PCR method is carried out using additional primers in addition to the conventional AS-PCR method. An example of the primer set and further primer design used in the method of the present invention is shown schematically in FIG. FIG. 3 also assumes the single nucleotide polymorphism (G or A) in
In the example of FIG. 3, the presence or absence of amplification of a DNA fragment of 157 base pairs (157 bp) is intended by a primer set with one allele-specific primer by PCR reaction. In the method of the present invention, a further primer located on the 5 ′ end side of the allele-specific primer is used. In FIG. 3, the further primer is indicated as “ALDH2 outer”, and hereinafter, the further primer used in the present invention is also referred to as “outer primer”.
In the example of FIG. 3, there can be amplification of a 394 base pair (394 bp) fragment with the upper and outer primers.
本発明によれば、アウタープライマーを用いることで、アレル特異的プライマーによる一塩基多型の識別効果を向上させることができる。従って、図３でいえば、ＰＣＲ反応の結果、３９４ｂｐの断片の増幅が起こったとしても、１５７ｂｐの断片の増幅の有無が、検体における所定の遺伝子型の存在、不存在の正確な判定につながる。
例えば、標的遺伝子ＤＮＡがＡＬＤＨ２であるとき、変異型特異プライマーの使用により157bpのＤＮＡ断片の増幅がなければ、正常型ＡＬＤＨ２が存在すると判定でき、増幅があれば変異型ＡＬＤＨ２が存在すると判定できる。ＰＣＲ反応により、たとえ３９４ｂｐの断片の増幅があったとしても、電気泳動といった手段により３９４ｂｐの断片とは明らかに識別することができる、アレル特異的プライマーを一方とするプライマーセットにより増幅が意図される特定の長さの断片、すなわち１５７ｂｐ断片の増幅の有無をもって検体における所定の遺伝子型の存在、不存在が判定できることは、たいへんに有利である。
According to the present invention, by using an outer primer, the single nucleotide polymorphism discrimination effect by an allele-specific primer can be improved. Accordingly, in FIG. 3, even if a 394 bp fragment is amplified as a result of the PCR reaction, the presence or absence of the amplification of the 157 bp fragment leads to an accurate determination of the presence or absence of the predetermined genotype in the sample. .
For example, when the target gene DNA is ALDH2, it can be determined that normal ALDH2 is present if there is no amplification of a 157 bp DNA fragment by the use of a mutant specific primer, and if there is amplification, it can be determined that mutant ALDH2 is present. Even if a 394 bp fragment is amplified by the PCR reaction, amplification is intended by a primer set that can be clearly distinguished from the 394 bp fragment by means of electrophoresis, such as an allele-specific primer. It is very advantageous to be able to determine the presence or absence of a predetermined genotype in a specimen based on the presence or absence of amplification of a fragment of a specific length, that is, a 157 bp fragment.
本発明の方法はさらに、２組のプライマーセットを用いて実施することもできる。すなわち以下の（Ａ）又は（Ｂ）の態様で実施することができる：（Ａ)第１のプライマーセットにおいて、ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーであって、及び第２のプライマーセットにおいて、アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーである、又は、(Ｂ)第１のプライマーセットにおいて、ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーであって、第２のプライマーセットにおいて、アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーである。ここで、第１のプライマーセットと第２のプライマーセットとによるＰＣＲ産物の長さが各々異なるものである。 The method of the present invention can also be carried out using two primer sets. That is, it can be carried out in the following modes (A) or (B): (A) In the first primer set, the lower primer has a base corresponding to the single nucleotide polymorphism site in its sequence. A mutation-specific primer designed at the position, and in the second primer set, the upper primer is designed at a position where the base has a base corresponding to the single nucleotide polymorphism site in the sequence It is a type-specific primer, or (B) a normal-type specific primer designed in a position where the lower primer in the first primer set has a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site in its sequence. In the second primer set, the upper primer is designed at a position where there is a base corresponding to the single nucleotide polymorphism site in the sequence. And it has a variant-specific primers. Here, the PCR product lengths of the first primer set and the second primer set are different from each other.
上記（Ａ）及び（Ｂ）の態様で使用するプライマーの関係を図４に概略して示す。
上記（Ａ）又は（Ｂ）の態様において、第１のプライマーセットに関する更なるプライマーは、第２のプライマーセットのロワープライマーとなり、第２のプライマーセットに関する更なるプライマーは、第１のプライマーセットのアッパープライマーとなる。
図４で説明すると、本発明の方法によればＺ(bp）の断片の増幅が起こり得るが、Ｘ(bp）断片の増幅の有無、Ｙ(bp）断片の増幅の有無、さらにはＸ(bp）とＹ(bp）の断片の増幅を検出することよって、検体における所定の一塩基多型の存在、不存在が判定できる。
このように２組のプライマーセットを用いて実施する本発明の方法により、ヒトの診断等においては正常型、あるいは変異型というホモ型の検出のみならず、ヘテロ型の検出も可能となる。
The relationship of the primers used in the above aspects (A) and (B) is schematically shown in FIG.
In the above aspect (A) or (B), the further primer related to the first primer set is the lower primer of the second primer set, and the further primer related to the second primer set is the first primer set It becomes the upper primer.
Referring to FIG. 4, according to the method of the present invention, amplification of a Z (bp) fragment can occur. However, the presence or absence of amplification of an X (bp) fragment, the presence or absence of amplification of a Y (bp) fragment, and further X ( By detecting the amplification of the fragments of bp) and Y (bp), the presence or absence of the predetermined single nucleotide polymorphism in the specimen can be determined.
Thus, by the method of the present invention carried out using two primer sets, it is possible to detect not only a normal type or a mutant type but also a hetero type in human diagnosis and the like.
本発明の方法の実施にあたり使用するプライマーセット及び更なるプライマーについて、以下の具体的態様がある。
（１）標的ＤＮＡ配列の変異型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマーと、該ロワープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するアッパープライマーとのプライマーセット、及び変異型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む上記部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるプライマーを用いる；
（２）標的ＤＮＡ配列の変異型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマーと、該アッパープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するロワープライマーとのプライマーセット、及び変異型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む上記部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるプライマーを用いる；
（３）標的ＤＮＡ配列の正常型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマーと、該ロワープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するアッパープライマーとのプライマーセット、及び正常型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む上記部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるプライマーを用いる；又は
（４）標的ＤＮＡ配列の正常型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマーと、該アッパープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するロワープライマーとのプライマーセット、及び正常型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む上記部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるプライマーを用いる；
The primer set and further primers used for carrying out the method of the present invention have the following specific embodiments.
(1) A lower primer having a reverse complementary strand sequence of a partial sequence including a single nucleotide polymorphism site in the sense strand of the mutant type of the target DNA sequence, and the single nucleotide polymorphism site together with the lower primer. A primer set with an upper primer, and a further primer having a reverse complementary strand sequence of a
(2) An upper primer having a reverse complementary strand sequence of a partial sequence including a single nucleotide polymorphism site in the antisense strand of the target DNA sequence, and a position so as to sandwich the single nucleotide polymorphism site together with the upper primer A primer set with a lower primer, and a further primer having a reverse complementary strand sequence of the
(3) A lower primer having a reverse complementary strand sequence of a partial sequence including a single nucleotide polymorphism site in the normal sense strand of the target DNA sequence, and the single primer polymorphism site together with the lower primer A primer set with an upper primer, and a further primer having a reverse complementary strand sequence of the partial sequence 3 'of the partial sequence containing the single nucleotide polymorphism site in the normal sense strand; or (4 ) An upper primer having a reverse complementary strand sequence of a partial sequence including a single nucleotide polymorphism site in the normal antisense strand of the target DNA sequence, and a lower positioned so as to sandwich the single nucleotide polymorphism site together with the upper primer The above-mentioned partial partition comprising the primer set with the primer and the single nucleotide polymorphism site in the normal antisense strand Using a further primer with a reverse complement sequence of the 3 'portion sequence in;
（５）標的ＤＮＡ配列の変異型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマーと、該ロワープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するアッパープライマーとのプライマーセット、及び標的ＤＮＡ配列の正常型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマーと、該アッパープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するロワープライマーとのプライマーセットを用い、上記２組のプライマーセットによるＰＣＲ産物の長さが異なる；又は
（６）標的ＤＮＡ配列の正常型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマーと、該ロワープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するアッパープライマーとのプライマーセット、及び標的ＤＮＡ配列の変異型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマーと、該アッパープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するロワープライマーとのプライマーセットを用い、上記２組のプライマーセットによるＰＣＲ産物の長さが異なる。
なお、上記（５）の態様において、前者のプライマーセットに関するアウタープライマーの役目をするのが後者のプライマーセットのロワープライマーであり、後者のプライマーセットに関するアウタープライマーの役目をするのが前者のアッパープライマーである。
上記（６）の態様においても、前者のプライマーセットに関するアウタープライマーの役目をするのが後者のプライマーセットのロワープライマーであり、後者のプライマーセットに関するアウタープライマーの役目をするのが前者のアッパープライマーである。
(5) A lower primer having a reverse complementary strand sequence of a partial sequence including a single nucleotide polymorphism site in the mutant sense strand of the target DNA sequence, and the single nucleotide polymorphism site together with the lower primer. A primer set with an upper primer, an upper primer having a reverse complementary strand sequence of a partial sequence including a single nucleotide polymorphism site in the normal antisense strand of the target DNA sequence, and a single nucleotide mutation polymorphism site together with the upper primer Or a primer set with a lower primer positioned so as to sandwich the PCR product, and the PCR product lengths of the two primer sets are different; or (6) a single nucleotide polymorphic site in the normal sense strand of the target DNA sequence A lower primer having a reverse complementary strand sequence of a partial sequence containing An upper primer having a primer set with an upper primer located so as to sandwich a single nucleotide polymorphism site, and a reverse complementary strand sequence of a partial sequence including the single nucleotide polymorphism site in the mutant antisense strand of the target DNA sequence And the primer set of the lower primer positioned so as to sandwich the single nucleotide polymorphism site together with the upper primer, and the PCR product lengths of the two primer sets are different.
In the above aspect (5), the lower primer of the latter primer set serves as the outer primer for the former primer set, and the former upper primer serves as the outer primer for the latter primer set. It is.
In the above aspect (6), the lower primer of the latter primer set serves as the outer primer for the former primer set, and the former upper primer serves as the outer primer for the latter primer set. is there.
本発明のキットは、(a)標的ＤＮＡ配列に対するプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該アッパープライマー及び該ロワープライマーのいずれか一方が、その配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている；及び(b)配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている上記(a)の該アッパープライマー又は該ロワープライマーの５′末端側に位置する更なるプライマーを含む。
本発明のキットの別の態様は、２組のプライマーセットを含むキットであり、具体的には、
(a)標的ＤＮＡ配列に対する第１のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーである；及び
(b)標的ＤＮＡ配列に対する第２のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーである
を含み、第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットの各々によるＰＣＲ産物の長さが異なるキット、又は
(a)標的ＤＮＡ配列に対する第１のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーである；及び
(b)標的ＤＮＡ配列に対する第２のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーである
を含み、第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットの各々によるＰＣＲ産物の長さが異なるキット
である。
The kit of the present invention comprises: (a) a primer set for a target DNA sequence (upper primer and lower primer): any one of the upper primer and the lower primer is a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site in the sequence And (b) the upper primer or the lower primer of the above (a) designed at a position where there is a base corresponding to the single nucleotide polymorphism site in the sequence. A further primer located at the 5 'end of
Another aspect of the kit of the present invention is a kit comprising two primer sets, specifically,
(a) First primer set (upper primer and lower primer) for a target DNA sequence: a variant in which the lower primer is designed at a position where a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site is present in the sequence A specific primer; and
(b) Second primer set for target DNA sequence (upper primer and lower primer): normal type designed such that the upper primer has a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site in the sequence A kit comprising different primer lengths, each comprising a first primer set and a second primer set, or
(a) First primer set for target DNA sequence (upper primer and lower primer): normal type designed such that the lower primer has a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site in the sequence A specific primer; and
(b) Second primer set (upper primer and lower primer) for the target DNA sequence: a variant in which the upper primer is designed at a position where a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site is present in the sequence The kit includes specific primers, and the PCR product lengths of each of the first primer set and the second primer set are different.
本発明のキットには具体的に、上記の各態様(1)〜(6)に記載されているプライマーを含ませることができる。
本発明のキットには更に、ＰＣＲ法の実施に使用する試薬（例えば耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、塩類など）、及び上記の一塩基多型部位を増幅させる領域以外に設計したプライマー、例えば標的遺伝子以外の遺伝子の配列にアニールするように設計したプライマーなどから選ばれる少なくとも一種を含ませることができる。また、プライマーとなり得ないが標的ＤＮＡ配列にアニールすることができる核酸類（ＰＮＡなど）も含ませることができる。
Specifically, the kit of the present invention can contain the primers described in the above embodiments (1) to (6).
The kit of the present invention further includes reagents (eg, heat-resistant DNA polymerase, buffer solution, salts, etc.) used for carrying out the PCR method, and primers designed other than the region for amplifying the single nucleotide polymorphism site, such as a target. At least one selected from primers designed to anneal to the sequence of genes other than genes can be included. In addition, nucleic acids (such as PNA) that cannot be primers but can be annealed to the target DNA sequence can also be included.
本発明で用いるプライマーは通常、核酸であって、中でもＤＮＡが好ましく用いられる。
このプライマーは標的ＤＮＡ配列にアニールでき、且つＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応できる範囲であれば、修飾した構造を有する核酸であってもよい。また、本発明で用いるプライマーは例えば酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質、抗原、抗体、放射性物質などで標識されていてもよく、これらの標識位置はプライマーの３′末端以外であればかまわない。
The primer used in the present invention is usually a nucleic acid, and DNA is preferably used among them.
The primer may be a nucleic acid having a modified structure as long as it can anneal to the target DNA sequence and can be extended by DNA polymerase. The primer used in the present invention may be labeled with, for example, an enzyme, biotin, digoxigenin, fluorescent substance, luminescent substance, antigen, antibody, radioactive substance, and the like, as long as the labeling position is other than the 3 ′ end of the primer. It doesn't matter.
本発明で用いるプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマーであって、そのいずれか一方がその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている。）におけるプライマーは、その長さが１０〜４０塩基が適当であり、好ましくはそれらのＴｍ値が５０〜７５℃のものである。
該プライマーセットによって増幅が意図される断片の長さは１００〜２０００塩基対の範囲が適当であり、好ましくは１００〜６００塩基対の範囲が適当である。
上記プライマーセットのうち、配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されるアッパープライマー又はロワープライマー（アレル特異的プライマー）において、好ましくは該一塩基変異多型部位に相当する塩基が３′末端にあるように設計される。あるいは、該一塩基変異多型部位に相当する塩基が３′末端から２番目の位置から５′末端までにあるように設計することができ、特に該一塩基変異多型部位に相当する塩基が３′末端から２番目から１０番目までにあるように設計することが適当であって、中でも該一塩基変異多型部位に相当する塩基が３′末端から２番目にあるように設計することが適当である。
また、上記アレル特異的プライマーの３′末端より５′末端までの配列において、標的ＤＮＡ配列に対して相補的でない塩基に１ヶ所以上置換することもできる。
Primers in the primer set used in the present invention (an upper primer and a lower primer, one of which is designed at a position where a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site is present in the sequence) The length is suitably 10 to 40 bases, preferably those having a Tm value of 50 to 75 ° C.
The length of the fragment intended to be amplified by the primer set is suitably in the range of 100 to 2000 base pairs, preferably in the range of 100 to 600 base pairs.
Among the above primer sets, the upper primer or lower primer (allele-specific primer) designed at a position where there is a base corresponding to the single nucleotide polymorphic site in the sequence, preferably the single nucleotide polymorphic site Is designed to be at the 3 'end. Alternatively, it can be designed such that the base corresponding to the single nucleotide polymorphism site is located from the second position from the 3 ′ end to the 5 ′ end, and in particular the base corresponding to the single nucleotide polymorphism site is It is appropriate to design from the 2nd to the 10th from the 3 'end, and above all, it is possible to design so that the base corresponding to the single nucleotide polymorphism site is the second from the 3' end. Is appropriate.
In the sequence from the 3 'end to the 5' end of the allele-specific primer, one or more bases that are not complementary to the target DNA sequence can be substituted.
一方、本発明で使用するアウタープライマーは、その長さが１０〜４０塩基が適当であり、好ましくはそれらのＴｍ値が５０〜７５℃のものである。
アウタープライマーをセッティングする位置は、後に用いる電気泳動法やその他の分析法によって識別することができる産物長に応じて変動させることができるが、上記のアレル特異的プライマーのセッティング位置から一般的に１０〜１５００塩基の範囲で離れていてよく、好ましくは２００〜８００塩基の範囲で離れているものである。
On the other hand, the outer primer used in the present invention has an appropriate length of 10 to 40 bases, and preferably has a Tm value of 50 to 75 ° C.
The position where the outer primer is set can be varied depending on the product length which can be discriminated by the electrophoresis method or other analysis method used later, but it is generally 10 from the setting position of the allele-specific primer. It may be separated in the range of ˜1500 bases, and preferably is separated in the range of 200 to 800 bases.
本発明の方法を２組のプライマーセットを同時に用いて実施するとき、すなわち上記（５）又は（６）の態様で実施するとき、各プライマーセットは上記の条件を満たすべきであり、且つアレル特異的プライマー以外のプライマーは上記のアウタープライマーの条件を満たすべきであり、それをセッティングする位置は、他方のプライマーセットにおけるアレル特異的プライマーのセッティング位置から一般的に１０〜１５００塩基の範囲で離れるように、好ましくは２００〜８００塩基の範囲で離れているようにする。
上記（５）又は（６）の態様で実施するときはまた、２組のプライマーセットによるＰＣＲ産物の長さが異なるようにプライマーセットを設計し、２組のプライマーセットのＰＣＲ産物の長さの差は後に用いる電気泳動法やその他の分析法によって充分に識別することができるものであればよい。それらのＰＣＲ産物の長さの差は一般に１塩基以上あればよい。
When the method of the present invention is carried out using two primer sets at the same time, that is, when the method of the above (5) or (6) is carried out, each primer set should satisfy the above-mentioned conditions, and allele specific Primers other than the target primer should satisfy the conditions of the outer primer described above, and the position where the primer is set is generally 10 to 1500 bases away from the setting position of the allele-specific primer in the other primer set. The distance is preferably within the range of 200 to 800 bases.
When implemented in the above aspect (5) or (6), the primer sets are designed so that the PCR product lengths of the two primer sets are different, and the PCR product lengths of the two primer sets are Any difference can be used as long as it can be sufficiently discriminated by an electrophoresis method or other analysis method used later. The difference in length of these PCR products generally only needs to be 1 base or more.
本発明の方法におけるＰＣＲ反応は、常法に従ったものでよい。例えば変性ステップ、アニーリング反応及び伸長反応の３工程からなり、又は、変性ステップと、アニーリング反応及び伸長反応を同一温度で行う工程との２工程からなる。各工程の条件、使用する試薬などは常法に従って適宜選択することができる。
ＰＣＲ反応に使用するＤＮＡポリメラーゼとして、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであれば特に制限されず、Taq ＤＮＡポリメラーゼや ExTaq ＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。一般に、突然変異の導入を防ぎ最終産物の収量を増加させるために、ExTaq ＤＮＡポリメラーゼを使用するのが好ましい。その他の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能であって、例えば Pfu turbo（Stratagene製）などを使用することができる。
ＰＣＲ反応溶液の組成は常法に従うことができる。例えば、反応時 0.2〜0.3mM のデオキシヌクレオチド３リン酸、0.1〜10 pmol/μl、好ましくは0.5〜２pmol/μlの各プライマー、0.1〜10 unit/μlのＤＮＡポリメラーゼ、酵素に添付されているバッファー 1/10量程度である。
The PCR reaction in the method of the present invention may be according to a conventional method. For example, it comprises three steps of a denaturation step, an annealing reaction and an extension reaction, or consists of two steps of a denaturation step and a step of performing the annealing reaction and the extension reaction at the same temperature. Conditions for each step, reagents to be used, and the like can be appropriately selected according to conventional methods.
The DNA polymerase used in the PCR reaction is not particularly limited as long as it is a heat-resistant DNA polymerase, and Taq DNA polymerase or ExTaq DNA polymerase can be used. In general, it is preferred to use ExTaq DNA polymerase to prevent the introduction of mutations and increase the yield of the final product. Other thermostable DNA polymerases can also be used. For example, Pfu turbo (manufactured by Stratagene) can be used.
The composition of the PCR reaction solution can follow a conventional method. For example, 0.2-0.3 mM deoxynucleotide triphosphate at the time of reaction, 0.1-10 pmol / μl, preferably 0.5-2 pmol / μl of each primer, 0.1-10 unit / μl DNA polymerase, buffer attached to the enzyme About 1/10 amount.
テンプレートＤＮＡとしては、例えば一塩基変異多型部位を含むＤＮＡ配列を有するプラスミドを用いることができ、該プラスミドは適当なものを選択することができ、市販のプラスミド調製キットを用いることが可能である。クローニングした大腸菌を増菌培養し、集菌後、溶菌操作によりプラスミドを含むＤＮＡを抽出する。逆相担体にそのＤＮＡ抽出液を保持させ、各溶出バッファーを用いてプラスミドＤＮＡを選択的に分離精製する。
また、検体中に含まれる一塩基変異多型部位を含むＤＮＡ配列を予め増幅しておくこともできる。このとき採用する核酸増幅法としては、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification Method; Nature, 1991, Vol. 350, p.91）、ＬＣＲ法（Ligase Chain Reaction; 国際公開第89/12696号パンフレット）、ＳＤＡ法（Strand Displacement Amplification Method; Nucleic Acid Research, 1992, Vol. 20, p.1691）、ＲＣＲ法（Recombinatorial Chain Reaction）、ＴＭＡ法（Transcription mediated Amplification Method; J. Clin. Microbiol, 1993, Vol. 31, p.3270）などから選択することができる。
As the template DNA, for example, a plasmid having a DNA sequence containing a single nucleotide polymorphism site can be used. An appropriate plasmid can be selected, and a commercially available plasmid preparation kit can be used. . The cloned Escherichia coli is enriched and cultured, and after collection, DNA containing the plasmid is extracted by lysis. The DNA extract is held on a reverse phase carrier, and plasmid DNA is selectively separated and purified using each elution buffer.
In addition, a DNA sequence containing a single nucleotide polymorphism site contained in a sample can be amplified in advance. As the nucleic acid amplification method employed at this time, PCR method, NASBA method (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification Method; Nature, 1991, Vol. 350, p.91), LCR method (Ligase Chain Reaction; International Publication No. 89/12696) Pamphlet), SDA method (Strand Displacement Amplification Method; Nucleic Acid Research, 1992, Vol. 20, p.1691), RCR method (Recombinatorial Chain Reaction), TMA method (Transcription mediated Amplification Method; J. Clin. Microbiol, 1993) , Vol. 31, p.3270).
ＰＣＲ産物をテンプレートとする場合、市販のＰＣＲ産物精製キットを用いることが可能である。ＰＣＲ反応液をバッファーで平衡化した逆相担体に保持させ、各溶出バッファーを用いてＰＣＲ産物を選択的に分離精製する。
また、ゲノムＤＮＡをテンプレートとすることもでき、市販のＤＮＡ抽出キットを用いることが可能である。培養細胞、血液、口内膜、髪の毛、爪などからその組織や細胞を回収し細胞膜を溶解してＤＮＡを抽出する。逆相担体にそのＤＮＡ抽出液を保持させ、各溶出バッファーを用いてゲノムＤＮＡを選択的に分離精製する。
反応溶液におけるテンプレートＤＮＡ溶液は、1/20〜1/10量ほどが適当である。また、検体中におけるテンプレートＤＮＡ濃度は、コピー数１０3以上が適当であり、少なくとも１０9程度まで問題ない。
When using a PCR product as a template, a commercially available PCR product purification kit can be used. The PCR reaction solution is held on a reverse phase carrier equilibrated with a buffer, and PCR products are selectively separated and purified using each elution buffer.
Further, genomic DNA can be used as a template, and a commercially available DNA extraction kit can be used. The tissue and cells are collected from cultured cells, blood, mouth membrane, hair, nails and the like, and the cell membrane is dissolved to extract DNA. The DNA extract is held on a reverse phase carrier, and genomic DNA is selectively separated and purified using each elution buffer.
The amount of the template DNA solution in the reaction solution is about 1/20 to 1/10. Further, the template DNA concentration in the sample is suitably a copy number of 10 3 or more, and there is no problem up to at least about 10 9 .
本発明のＰＣＲ反応における各ステップの反応時間、温度、サイクル数は適宜選択できる。変性ステップは、２本鎖ＤＮＡを１本鎖へと変性させるのに充分な条件を適宜選択し実施すればよい。一般に変性ステップは、９０〜１００℃、１０〜９０秒の範囲で実施され、さらに９４〜９８℃、２０〜４０秒がより好ましい。変性のステップに続きアニーリングステップは、ＤＮＡプライマーのＴｍ値±１０℃程度の温度で実施され、一般的に４５〜６５℃の範囲で３０〜９０秒である。さらに伸長ステップは一般的に６８〜７２℃、３０〜１５０秒である。サイクル数は一般に２５〜５０の範囲である。
ＤＮＡプライマーのＴｍ値が比較的高い場合、アニーリングの温度が伸長反応の温度に近づくために、アニーリングと伸長反応を同一温度で行うことがある。このときは、変性ステップと、アニーリング及び伸長反応ステップの２工程でＰＣＲ反応を実施することになる。
The reaction time, temperature, and cycle number of each step in the PCR reaction of the present invention can be appropriately selected. The denaturation step may be performed by appropriately selecting conditions sufficient to denature the double-stranded DNA into a single strand. Generally, the denaturation step is carried out in the range of 90 to 100 ° C. and 10 to 90 seconds, more preferably 94 to 98 ° C. and 20 to 40 seconds. Following the denaturation step, the annealing step is performed at a temperature of about 10 ° C. Tm value of the DNA primer, and is generally 30 to 90 seconds in the range of 45 to 65 ° C. Further, the extension step is generally 68 to 72 ° C. and 30 to 150 seconds. The number of cycles is generally in the range of 25-50.
When the Tm value of the DNA primer is relatively high, the annealing and the extension reaction may be performed at the same temperature because the annealing temperature approaches the temperature of the extension reaction. At this time, the PCR reaction is carried out in two steps: a denaturation step, and an annealing and extension reaction step.
こうして増幅されたＰＣＲ産物は、常法に従って検出することができる。例えば電気泳動（アガロースゲル電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動など）、質量分析、液体クロマトグラフィーなどの手段により、ＰＣＲ産物のサイズ（長さや分子量）を検出することができる。これらの操作は常法に従って実施することができる。例えば、電気泳動後、適当な色素などでＤＮＡを染色し、ＵＶで写真撮影などを行うことができる。
また、プライマーとして、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質、抗原、抗体、放射性物質などで標識した標識プライマーを用いた場合に、各標識を使い分けることによって、増幅されたそれぞれのＰＣＲ産物について、そのサイズ及び量を同時に又は別々に検出、測定することができる。
The PCR product thus amplified can be detected according to a conventional method. For example, the size (length or molecular weight) of the PCR product can be detected by means such as electrophoresis (such as agarose gel electrophoresis or polyacrylamide gel electrophoresis), mass spectrometry, or liquid chromatography. These operations can be performed according to a conventional method. For example, after electrophoresis, DNA can be stained with an appropriate dye or the like and photographed with UV.
In addition, when using a labeled primer labeled with an enzyme, biotin, digoxigenin, fluorescent substance, luminescent substance, antigen, antibody, radioactive substance, etc. as a primer, each PCR product amplified by properly using each label The size and amount can be detected and measured simultaneously or separately.
以下に参考例、及び実施例をもって本発明を詳細に説明する。本発明はこれらの記載に限定されるものではない。
〔参考例１〕
アルデヒドデヒドロゲナーゼII（ALDH2）の一塩基変異多型の検出を、従来のＰＣＲ法で実施した。
ALDH2の一塩基変異多型部位（変異点）：114（Ｇ又はＡ）
ALDH2の一塩基変異多型部位を含む部分的な配列は、以下のとおりである。下線部が変異点である。
Ｇ型テンプレート部分配列：
5′tgcaggcata cactgaagtg aaaactgtga 3′
Ａ型テンプレート部分配列：
5′tgcaggcata cactaaagtg aaaactgtga 3′
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference examples and examples. The present invention is not limited to these descriptions.
[Reference Example 1]
Detection of single nucleotide polymorphism of aldehyde dehydrogenase II (ALDH2) was performed by a conventional PCR method.
Single nucleotide mutation polymorphic site of ALDH2 (mutation point): 114 (G or A)
A partial sequence including a single nucleotide polymorphism site of ALDH2 is as follows. The underlined part is the mutation point.
G template partial sequence:
5′tgcaggcata cact
Type A template partial sequence:
5′tgcaggcata cact a aagtg aaaactgtga 3 ′
[材料の調製]
以下のＤＮＡプライマーセットを用意した。なお、ロワープライマーをアレル特異的プライマーとした。
アッパープライマー
5′caaattacag ggtcaactgc t 3′(21mer)（配列番号１）
ロワープライマー
正常型 5′ccacactcac agttttctct tc 3′(22mer)（配列番号２）
変異型 5′ccacactcac agttttctct tt 3′(22mer)（配列番号３）
これらのプライマーセットで増幅される断片の長さは１５７塩基対である。
これらのプライマーのデザインの概略は、図２に示されるとおりである。
[Preparation of materials]
The following DNA primer sets were prepared. The lower primer was an allele specific primer.
Upper primer
5′caaattacag ggtcaactgc
Lower primer
Mutant 5′ccacactcac agttttctct
The length of the fragment amplified with these primer sets is 157 base pairs.
The outline of the design of these primers is as shown in FIG.
テンプレートＤＮＡには、pGEM（登録商標）-T Easy Vector(3015bp)プラスミドを用いて、ALDH2のＧ型及びＡ型のそれぞれの配列をインサートしたものを用意した。ここで用いたpGEM-T Easy Vectorを図５に示し、及びＧ型（正常型）及びＡ型（変異型）の各々のインサート配列を図６及び図７に示す（それぞれ配列番号４及び５参照）。図６及び図７で四角で囲んだ箇所が一塩基変異多型部位である。 As template DNA, pGEM (registered trademark) -T Easy Vector (3015 bp) plasmid was used to insert ALDH2 G-type and A-type sequences. The pGEM-T Easy Vector used here is shown in FIG. 5, and the insert sequences of G type (normal type) and A type (mutant type) are shown in FIGS. 6 and 7 (see SEQ ID NOs: 4 and 5, respectively). ). In FIG. 6 and FIG. 7, a portion surrounded by a square is a single nucleotide mutation polymorphism site.
［ＰＣＲ法の実施］
以下のＰＣＲ条件を採用した。
PCR反応溶液の組成
10× Ex Taq バッファー(TaKaRa) 2μl
2.5mM dNTP ミックス 2μl
10pmol/μl アッパープライマー 2μl
10pmol/μl ロワープライマー 2μl
Ex Taq DNA ポリメラーゼ(TaKaRa) 0.2μl
（プラスミド）DNA溶液 2μl
滅菌水 9.8μl
計 20μl
なお、この反応系においてテンプレートが１０3、１０4、１０5、１０6、１０7コピー存在するように調製する。
[Execution of PCR method]
The following PCR conditions were employed.
Composition of PCR reaction solution
10 × Ex Taq buffer (TaKaRa) 2μl
2.5
10 pmol/μl Upper primer 2μl
10 pmol/μl Lower primer 2μl
Ex Taq DNA polymerase (TaKaRa) 0.2μl
(Plasmid) DNA solution 2μl
Sterile water 9.8μl
20 μl total
In this reaction system, the template is prepared so that 10 3 , 10 4 , 10 5 , 10 6 and 10 7 copies exist.
ＰＣＲサイクル条件は以下のとおり行う。
98℃ １分
↓
(1)98℃ ２０秒
(2)63℃ ２０秒
(3)72℃ ４５秒
（上記(1)〜(3)を３５回繰り返す。）
↓
72℃ ５分
上記の条件でPCR反応を行い、反応液５μlを３％アガロースゲル電気泳動に供する。そしてエチジウムブロマイドによりDNAを染色し、UVで写真撮影する。
PCR cycle conditions are as follows.
98
(1) 98 ℃ 20 seconds
(2) 63 ℃ 20 seconds
(3) 72 ° C. 45 seconds (Repeat (1) to (3) 35 times)
↓
72 ° C. for 5 minutes PCR is performed under the above conditions, and 5 μl of the reaction solution is subjected to 3% agarose gel electrophoresis. The DNA is stained with ethidium bromide and photographed with UV.
上記の系及び操作に従って、使用するテンプレートのタイプ及びロワープライマー（アレル特異的プライマー）のタイプの組合せを４種類とし、各組合せにおいて、反応溶液におけるテンプレートのコピー数を１０3〜１０7コピーの範囲で変動させた条件で、ＰＣＲ反応を実施した。以下の表１に各試験の条件をまとめる。
According to the above system and operation, there are four combinations of template type and lower primer (allele specific primer) type used, and in each combination, the number of template copies in the reaction solution is in the range of 10 3 to 10 7 copies. The PCR reaction was carried out under the conditions changed in (1). Table 1 below summarizes the conditions for each test.
ＵＶで写真撮影した結果を図８に示す。図８中、レーンＭはマーカーを表し、レーン１〜１０はそれぞれ上記試験No.１〜１０に相当する。
この結果から、ＡＳ−ＰＣＲ法の原理によれば電気泳動による陽性バンドが現われるはずのない試験No.６〜１０において、反応溶液におけるテンプレートコピー濃度が比較的高い１０7〜１０4コピー（試験No.６〜９）で陽性バンドが観察された。同じく陽性バンドが現われるはずのない試験No.１１〜１５において、反応溶液におけるテンプレートコピー濃度が比較的高い１０7〜１０5コピー（試験No.１１〜１３）で陽性バンドが観察された。
FIG. 8 shows the result of photographing with UV. In FIG. 8, lane M represents a marker, and
From this result, according to the principle of the AS-PCR method, in test Nos. 6 to 10 in which a positive band by electrophoresis should not appear, the template copy concentration in the reaction solution is relatively high 10 7 to 10 4 copies (test No. A positive band was observed in 6-9). Similarly, in Test Nos. 11 to 15 where a positive band should not appear, positive bands were observed at 10 7 to 10 5 copies (Test Nos. 11 to 13) having a relatively high template copy concentration in the reaction solution.
〔実施例１〕
参考例１で使用したテンプレートＤＮＡ、及び上記参考例１で使用したプライマーセットに加えて、以下の配列のアウタープライマーを用い、アルデヒドデヒドロゲナーゼII（ALDH2）の一塩基変異多型の検出を、ＰＣＲ反応にて行った。
ALDH2 アウタープライマー
5' ctactaattt cccattttaa gcct 3'(24mer)（配列番号６）
実施例１で使用するプライマーのデザインの概略は、図３に示されるとおりである。
アッパープライマーとアウタープライマーにより増幅される断片の長さは３９４塩基対である。
[Example 1]
In addition to the template DNA used in Reference Example 1 and the primer set used in Reference Example 1 above, an outer primer having the following sequence was used to detect single nucleotide polymorphism of aldehyde dehydrogenase II (ALDH2) in a PCR reaction. I went there.
ALDH2 outer primer
5 'ctactaattt cccattttaa gcct 3' (24mer) (SEQ ID NO: 6)
The outline of the design of the primer used in Example 1 is as shown in FIG.
The length of the fragment amplified by the upper primer and the outer primer is 394 base pairs.
［ＰＣＲ法の実施］
以下のＰＣＲ条件を採用した。
PCR反応溶液の組成
10× Ex Taq バッファー(TaKaRa) 2μl
2.5mM dNTP ミックス 2μl
10pmol/μl アッパープライマー 2μl
10pmol/μl ロワープライマー 2μl
10pmol/μl アウタープライマー 2μl
Ex Taq DNA ポリメラーゼ(TaKaRa) 0.2μl
（プラスミド）DNA溶液 2μl
滅菌水 7.8μl
計 20μl
なお、この反応系においてテンプレートが１０3、１０4、１０5、１０6、１０7コピー存在するように調製する。
[Execution of PCR method]
The following PCR conditions were employed.
Composition of PCR reaction solution
10 × Ex Taq buffer (TaKaRa) 2μl
2.5
10 pmol/μl Upper primer 2μl
10 pmol/μl Lower primer 2μl
10 pmol/μl outer primer 2μl
Ex Taq DNA polymerase (TaKaRa) 0.2μl
(Plasmid) DNA solution 2μl
Sterile water 7.8μl
20 μl total
In this reaction system, the template is prepared so that 10 3 , 10 4 , 10 5 , 10 6 and 10 7 copies exist.
ＰＣＲサイクル条件は以下のとおり行う。
98℃ １分
↓
(1)98℃ ２０秒
(2)63℃ ２０秒
(3)72℃ ４５秒
（上記(1)〜(3)を３５回繰り返す。）
↓
72℃ ５分
上記の条件でPCR反応を行い、反応液５μlを３％アガロースゲル電気泳動に供する。そしてエチジウムブロマイドによりDNAを染色し、UVで写真撮影する。
PCR cycle conditions are as follows.
98
(1) 98 ℃ 20 seconds
(2) 63 ℃ 20 seconds
(3) 72 ° C. 45 seconds (Repeat (1) to (3) 35 times)
↓
72 ° C. for 5 minutes PCR is performed under the above conditions, and 5 μl of the reaction solution is subjected to 3% agarose gel electrophoresis. The DNA is stained with ethidium bromide and photographed with UV.
上記の系及び操作に従って、使用するテンプレートのタイプ及びロワープライマー（アレル特異的プライマー）のタイプの組合せを４種類とし、各組合せにおいて、反応溶液におけるテンプレートのコピー数を１０3〜１０7コピーの範囲で変動させた条件で、ＰＣＲ反応を実施した。以下の表２に各試験の条件をまとめる。
According to the above system and operation, there are four combinations of template type and lower primer (allele specific primer) type used, and in each combination, the number of template copies in the reaction solution is in the range of 10 3 to 10 7 copies. The PCR reaction was carried out under the conditions changed in (1). Table 2 below summarizes the conditions for each test.
ＵＶで写真撮影した結果を図９に示す。図９中、レーンＭはマーカーを表し、レーン１〜１０はそれぞれ上記試験No.１〜１０に相当する。
この結果から、試験No.６〜１０において、反応溶液のテンプレート コピー数１０3〜１０7のすべてのケースで157bpの陽性バンドは現われておらず、また試験No.１１〜１５においても、反応溶液のテンプレート コピー数１０3〜１０7のすべてのケースで157bpの陽性バンドは現われていなかった。従って本発明によりアウタープライマーを用いることで、検体におけるテンプレートの濃度が比較的高くても、アレル特異的プライマーによる一塩基多型の識別効果が充分に発揮され、ひいては、所定の長さの断片の増幅の有無を確認することで、特定の遺伝子型の存在、不存在の正確な判定ができることが判る。
The result of taking a photo with UV is shown in FIG. In FIG. 9, lane M represents a marker, and
From these results, in Test Nos. 6 to 10, a 157 bp positive band did not appear in all cases where the template copy number of the reaction solution was 10 3 to 10 7 , and also in Test Nos. 11 to 15 In all cases of
〔参考例２〕
チトクロームp-450ファミリー 2D6遺伝子における一塩基変異多型（Cyp2D6*10）の検出を、従来のＰＣＲ法により行った。
Cyp2D6*10の一塩基変異多型部位（変異点）：100（Ｃ又はＴ）
Cyp2D6*10の一塩基変異多型部位を含む部分的な配列は、以下のとおりである。下線部が変異点である。
Ｃ型テンプレート部分配列：
5′tgggctgcac gctaccacca ggccccctgc 3′
Ｔ型テンプレート部分配列：
5′tgggctgcac gctactacca ggccccctgc 3′
[Reference Example 2]
A single nucleotide polymorphism (Cyp2D6 * 10) in the cytochrome p-450 family 2D6 gene was detected by a conventional PCR method.
Cyp2D6 * 10 single nucleotide polymorphism site (mutation point): 100 (C or T)
The partial sequence including the single nucleotide polymorphism site of Cyp2D6 * 10 is as follows. The underlined part is the mutation point.
C-type template partial sequence:
5′tgggctgcac gctac c acca ggccccctgc 3 ′
T template partial sequence:
5′tgggctgcac gctac t acca ggccccctgc 3 ′
[材料の調製]
以下のＤＮＡプライマーセットを用意した。なお、アッパープライマーをアレル特異的プライマーとした。
アッパープライマー
正常型 5′ggctgcacgc taccc 3′(15mer)（配列番号７）
変異型 5′gggctgcacg ctactc 3′(16mer)（配列番号８）
ロワープライマー
5′catgcccact gccaagtc 3′(18mer)（配列番号９）
これらのプライマーセットで増幅される断片の長さは３１３塩基対又は３１４塩基対である。
これらのプライマーのデザインの概略は、図１０に示されるとおりである。図１０中、アレル特異的プライマーは“2D6F Normal”、“2D6F Mutant”と示され、ここで FはForwardの略であって、アッパープライマーであることを意味する。
[Preparation of materials]
The following DNA primer sets were prepared. The upper primer was an allele-specific primer.
Upper primer
Mutant 5′gggctgcacg ctac t c 3 ′ (16mer) (SEQ ID NO: 8)
Lower primer
5′catgcccact gccaagtc 3 ′ (18mer) (SEQ ID NO: 9)
The length of the fragment amplified with these primer sets is 313 base pairs or 314 base pairs.
The outline of the design of these primers is as shown in FIG. In FIG. 10, allele-specific primers are indicated as “2D6F Normal” and “2D6F Mutant”, where F is an abbreviation of Forward and means an upper primer.
テンプレートＤＮＡには、pGEM（登録商標）-T Easy Vector(3015bp)プラスミドを用いて、Cyp2D6*10のＣ型及びＴ型のそれぞれの配列をインサートしたものを用意した。ここで用いたpGEM-T Easy Vectorは図５に示したものである。及びＣ型（正常型）及びＴ型（変異型）の各々のインサート配列を図１１及び図１２に示す（それぞれ配列番号１０及び１１参照）。図１１及び図１２で四角で囲んだ箇所が一塩基変異多型部位である。 As template DNA, pGEM (registered trademark) -T Easy Vector (3015 bp) plasmid was used to insert Cyp2D6 * 10 C-type and T-type sequences. The pGEM-T Easy Vector used here is shown in FIG. The insert sequences of C type (normal type) and T type (mutant type) are shown in FIGS. 11 and 12 (see SEQ ID NOs: 10 and 11, respectively). In FIG. 11 and FIG. 12, the portion surrounded by a square is a single nucleotide mutation polymorphic site.
［ＰＣＲ法の実施］
以下のＰＣＲ条件を採用した。
PCR反応溶液の組成
10× Ex Taq バッファー(TaKaRa) 2μl
2.5mM dNTP ミックス 2μl
10pmol/μl アッパープライマー 2μl
10pmol/μl ロワープライマー 2μl
Ex Taq DNA ポリメラーゼ(TaKaRa) 0.2μl
（プラスミド）DNA溶液 2μl
滅菌水 9.8μl
計 20μl
なお、この反応系においてテンプレートが１０3、１０4、１０5、１０6、１０7コピー存在するように調製する。
[Execution of PCR method]
The following PCR conditions were employed.
Composition of PCR reaction solution
10 × Ex Taq buffer (TaKaRa) 2μl
2.5
10 pmol/μl Upper primer 2μl
10 pmol/μl Lower primer 2μl
Ex Taq DNA polymerase (TaKaRa) 0.2μl
(Plasmid) DNA solution 2μl
Sterile water 9.8μl
20 μl total
In this reaction system, the template is prepared so that 10 3 , 10 4 , 10 5 , 10 6 and 10 7 copies exist.
ＰＣＲサイクル条件は以下のとおり行う。
96℃ ２分
↓
(1)96℃ ３０秒
(2)70℃ ６０秒
（上記(1)〜(2)を３０回繰り返す。）
上記の条件でPCR反応を行い、反応液５μlを３％アガロースゲル電気泳動に供する。そしてエチジウムブロマイドによりDNAを染色し、UVで写真撮影する。
PCR cycle conditions are as follows.
96
(1) 96 ℃ 30 seconds
(2) 70 ° C. 60 seconds (Repeat (1) to (2) 30 times)
PCR reaction is performed under the above conditions, and 5 μl of the reaction solution is subjected to 3% agarose gel electrophoresis. The DNA is stained with ethidium bromide and photographed with UV.
上記の系及び操作に従って、使用するテンプレートのタイプ及びアッパープライマー（アレル特異的プライマー）のタイプの組合せを４種類とし、各組合せにおいて、反応溶液におけるテンプレートのコピー数を１０3〜１０7コピーの範囲で変動させた条件で、ＰＣＲ反応を実施した。以下の表３に各試験の条件をまとめる。
According to the above system and operation, there are four types of combinations of template types and upper primer types (allele specific primers) to be used, and in each combination, the number of template copies in the reaction solution is in the range of 10 3 to 10 7 copies. The PCR reaction was carried out under the conditions changed in (1). Table 3 below summarizes the conditions for each test.
ＵＶで写真撮影した結果を図１３に示す。図１３中、レーンＭはマーカーを表し、レーン１〜１０はそれぞれ上記試験No.１〜１０に相当する。
この結果から、ＡＳ−ＰＣＲ法の原理によれば電気泳動による陽性バンドが現われるはずのない試験No.６〜１０において、反応溶液におけるテンプレートコピー濃度が比較的高い１０7〜１０6コピー（試験No.６、７）で陽性バンドが観察された。同じく陽性バンドが現われるはずのない試験No.１１〜１５において、反応溶液におけるテンプレートコピー濃度が比較的高い１０7〜１０6コピー（試験No.１１、１２）で陽性バンドが観察された。
FIG. 13 shows the result of photographing with UV. In FIG. 13, lane M represents a marker, and
From this result, according to the principle of the AS-PCR method, in test Nos. 6 to 10 in which a positive band by electrophoresis should not appear, the template copy concentration in the reaction solution is relatively high 10 7 to 10 6 copies (test No. A positive band was observed in .6, 7). Similarly, in Test Nos. 11 to 15 where a positive band should not appear, positive bands were observed in 10 7 to 10 6 copies (Test Nos. 11 and 12) having a relatively high template copy concentration in the reaction solution.
〔実施例２〕
参考例２で使用したテンプレートＤＮＡ、及び参考例２で使用したプライマーセットに加えて、以下の配列のアウタープライマーを用い、Cyp2D6*10の一塩基変異多型の検出を、ＰＣＲ反応にて行った。
Cyp2D6*10 アウタープライマー
5' gccgggtcca ctgaaac 3'(17mer)（配列番号１２）
実施例２で使用するプライマーのデザインの概略は、図１４に示されるとおりである。図１４中、アレル特異的プライマーは“2D6F Normal”、“2D6F Mutant”と示され、ここで FはForwardの略であって、アッパープライマーであることを意味する。
ロワープライマーとアウタープライマーにより増幅される断片の長さは７６８塩基対である。
[Example 2]
In addition to the template DNA used in Reference Example 2 and the primer set used in Reference Example 2, the single primer mutation polymorphism of Cyp2D6 * 10 was detected by PCR reaction using an outer primer having the following sequence: .
Cyp2D6 * 10 Outer primer
5 'gccgggtcca ctgaaac 3' (17mer) (SEQ ID NO: 12)
The outline of the design of the primer used in Example 2 is as shown in FIG. In FIG. 14, allele-specific primers are indicated as “2D6F Normal” and “2D6F Mutant”, where F is an abbreviation of Forward and means an upper primer.
The length of the fragment amplified by the lower primer and the outer primer is 768 base pairs.
［ＰＣＲ法の実施］
以下のＰＣＲ条件を採用した。
PCR反応溶液の組成
10× Ex Taq バッファー(TaKaRa) 2μl
2.5mM dNTP ミックス 2μl
10pmol/μl アッパープライマー 2μl
10pmol/μl ロワープライマー 2μl
10pmol/μl アウタープライマー 2μl
Ex Taq DNA ポリメラーゼ(TaKaRa) 0.2μl
（プラスミド）DNA溶液 2μl
滅菌水 7.8μl
計 20μl
なお、この反応系においてテンプレートが１０3、１０4、１０5、１０6、１０7コピー存在するように調製する。
[Execution of PCR method]
The following PCR conditions were employed.
Composition of PCR reaction solution
10 × Ex Taq buffer (TaKaRa) 2μl
2.5
10 pmol/μl Upper primer 2μl
10 pmol/μl Lower primer 2μl
10 pmol/μl outer primer 2μl
Ex Taq DNA polymerase (TaKaRa) 0.2μl
(Plasmid) DNA solution 2μl
Sterile water 7.8μl
20 μl total
In this reaction system, the template is prepared so that 10 3 , 10 4 , 10 5 , 10 6 and 10 7 copies exist.
ＰＣＲサイクル条件は以下のとおり行う。
96℃ ２分
↓
(1)96℃ ３０秒
(2)70℃ ６０秒
（上記(1)〜(2)を３０回繰り返す。）
上記の条件でPCR反応を行い、反応液５μlを３％アガロースゲル電気泳動に供する。そしてエチジウムブロマイドによりDNAを染色し、UVで写真撮影する。
PCR cycle conditions are as follows.
96
(1) 96 ℃ 30 seconds
(2) 70 ° C. 60 seconds (Repeat (1) to (2) 30 times)
PCR reaction is performed under the above conditions, and 5 μl of the reaction solution is subjected to 3% agarose gel electrophoresis. The DNA is stained with ethidium bromide and photographed with UV.
上記の系及び操作に従って、使用するテンプレートのタイプ及びアッパープライマー（アレル特異的プライマー）のタイプの組合せを４種類とし、各組合せにおいて、反応溶液におけるテンプレートのコピー数を１０3〜１０7コピーの範囲で変動させた条件で、ＰＣＲ反応を実施した。以下の表４に各試験の条件をまとめる。
According to the above system and operation, there are four types of combinations of template types and upper primer types (allele specific primers) to be used, and in each combination, the number of template copies in the reaction solution is in the range of 10 3 to 10 7 copies. The PCR reaction was carried out under the conditions changed in (1). Table 4 below summarizes the conditions for each test.
ＵＶで写真撮影した結果を図１５に示す。図１５中、レーンＭはマーカーを表し、レーン１〜１０はそれぞれ上記試験No.１〜１０に相当する。
この結果から、試験No.６〜１０において、反応溶液のテンプレート コピー数１０3〜１０7のすべてのケースで314bpの陽性バンドは現われておらず、また試験No.１１〜１５においても、反応溶液のテンプレート コピー数１０3〜１０7のすべてのケースで313bpの陽性バンドは現われていなかった。従って、実施例２の結果からも、本発明によりアウタープライマーを用いることで、検体におけるテンプレートの濃度が比較的高くても、アレル特異的プライマーによる一塩基多型の識別効果が充分に発揮され、ひいては、所定の長さの断片の増幅の有無を確認することで、特定の遺伝子型の存在、不存在の正確な判定ができることが判る。
FIG. 15 shows the result of photographing with UV. In FIG. 15, lane M represents a marker, and
From these results, in Test Nos. 6 to 10, a 314 bp positive band did not appear in all cases where the template copy number of the reaction solution was 10 3 to 10 7 , and also in Test Nos. 11 to 15 In all cases of
Claims (17)
（１）標的ＤＮＡ配列の変異型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマーと、該ロワープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するアッパープライマーとのプライマーセット、及び変異型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む上記部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるプライマーを用いる；
（２）標的ＤＮＡ配列の変異型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマーと、該アッパープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するロワープライマーとのプライマーセット、及び変異型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む上記部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるプライマーを用いる；
（３）標的ＤＮＡ配列の正常型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマーと、該ロワープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するアッパープライマーとのプライマーセット、及び正常型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む上記部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるプライマーを用いる；
（４）標的ＤＮＡ配列の正常型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマーと、該アッパープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するロワープライマーとのプライマーセット、及び正常型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む上記部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるプライマーを用いる；
（５）標的ＤＮＡ配列の変異型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマーと、該ロワープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するアッパープライマーとのプライマーセット、及び標的ＤＮＡ配列の正常型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマーと、該アッパープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するロワープライマーとのプライマーセットを用い、上記２組のプライマーセットによるＰＣＲ産物の長さが異なる；又は
（６）標的ＤＮＡ配列の正常型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマーと、該ロワープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するアッパープライマーとのプライマーセット、及び標的ＤＮＡ配列の変異型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマーと、該アッパープライマーとともに一塩基変異多型部位を挟むように位置するロワープライマーとのプライマーセットを用い、上記２組のプライマーセットによるＰＣＲ産物の長さが異なる。 A method for detecting the presence of a single nucleotide polymorphism in a target DNA sequence according to claim 1, wherein the PCR method is carried out in any of the following aspects (1) to (6):
(1) A lower primer having a reverse complementary strand sequence of a partial sequence including a single nucleotide polymorphism site in the sense strand of the mutant type of the target DNA sequence, and the single nucleotide polymorphism site together with the lower primer. A primer set with an upper primer, and a further primer having a reverse complementary strand sequence of a partial sequence 3 ′ of the partial sequence including the single nucleotide polymorphism site in the mutant sense strand;
(2) An upper primer having a reverse complementary strand sequence of a partial sequence including a single nucleotide polymorphism site in the antisense strand of the target DNA sequence, and a position so as to sandwich the single nucleotide polymorphism site together with the upper primer A primer set with a lower primer, and a further primer having a reverse complementary strand sequence of the partial sequence 3 ′ of the partial sequence including the single nucleotide polymorphism site in the mutant antisense strand;
(3) A lower primer having a reverse complementary strand sequence of a partial sequence including a single nucleotide polymorphism site in the normal sense strand of the target DNA sequence, and the single primer polymorphism site together with the lower primer A primer set with an upper primer, and a further primer having a reverse complementary strand sequence of the partial sequence 3 'of the partial sequence including the single nucleotide polymorphism site in the normal sense strand;
(4) An upper primer having a reverse complementary strand sequence of a partial sequence including a single nucleotide polymorphism site in the normal antisense strand of the target DNA sequence, and a position so as to sandwich the single nucleotide polymorphism site together with the upper primer A primer set with a lower primer, and a further primer having a reverse complementary strand sequence of the partial sequence 3 'of the partial sequence including the single nucleotide polymorphism site in the normal antisense strand;
(5) A lower primer having a reverse complementary strand sequence of a partial sequence including a single nucleotide polymorphism site in the mutant sense strand of the target DNA sequence, and the single nucleotide polymorphism site together with the lower primer. A primer set with an upper primer, an upper primer having a reverse complementary strand sequence of a partial sequence including a single nucleotide polymorphism site in the normal antisense strand of the target DNA sequence, and a single nucleotide mutation polymorphism site together with the upper primer Or a primer set with a lower primer positioned so as to sandwich the PCR product, and the PCR product lengths of the two primer sets are different; or (6) a single nucleotide polymorphic site in the normal sense strand of the target DNA sequence A lower primer having a reverse complementary strand sequence of a partial sequence containing An upper primer having a primer set with an upper primer located so as to sandwich a single nucleotide polymorphism site, and a reverse complementary strand sequence of a partial sequence including the single nucleotide polymorphism site in the mutant antisense strand of the target DNA sequence And the primer set of the lower primer positioned so as to sandwich the single nucleotide polymorphism site together with the upper primer, and the PCR product lengths of the two primer sets are different.
(a)標的ＤＮＡ配列に対するプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該アッパープライマー及び該ロワープライマーのいずれか一方が、その配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている；及び
(b)配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている上記(a)の該アッパープライマー又は該ロワープライマーの５′末端側に位置する更なるプライマー
を含むキット。 A kit used to perform a PCR method for detecting the presence of a single nucleotide polymorphism in a target DNA sequence,
(a) Primer set for target DNA sequence (upper primer and lower primer): Either one of the upper primer or the lower primer is located at a position where a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site is present in the sequence. Designed; and
(b) a further primer located on the 5 ′ end side of the upper primer or the lower primer of the above (a), which is designed at a position where there is a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site in the sequence Kit containing.
(a)標的ＤＮＡ配列に対する第１のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーである；及び
(b)標的ＤＮＡ配列に対する第２のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーである
を含み、第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットの各々によるＰＣＲ産物の長さが異なるキット、又は
(a)標的ＤＮＡ配列に対する第１のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該ロワープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている正常型特異プライマーである；及び
(b)標的ＤＮＡ配列に対する第２のプライマーセット（アッパープライマー及びロワープライマー）：該アッパープライマーがその配列中に一塩基変異多型部位に相当する塩基があるような位置に設計されている変異型特異プライマーである
を含み、第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットの各々によるＰＣＲ産物の長さが異なるキット。 A kit used to perform a PCR method for detecting the presence of a single nucleotide polymorphism in a target DNA sequence,
(a) First primer set (upper primer and lower primer) for a target DNA sequence: a variant in which the lower primer is designed at a position where a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site is present in the sequence A specific primer; and
(b) Second primer set for target DNA sequence (upper primer and lower primer): normal type designed such that the upper primer has a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site in the sequence A kit comprising different primer lengths, each comprising a first primer set and a second primer set, or
(a) First primer set for target DNA sequence (upper primer and lower primer): normal type designed such that the lower primer has a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site in the sequence A specific primer; and
(b) Second primer set (upper primer and lower primer) for the target DNA sequence: a variant in which the upper primer is designed at a position where a base corresponding to a single nucleotide polymorphism site is present in the sequence A kit comprising specific primers, wherein the PCR product lengths of each of the first primer set and the second primer set are different.
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