JP2005320298A5 - - Google Patents
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Description
本発明は、癌の抗体療法において抗体医薬の細胞傷害活性を増強する薬剤に関する。 The present invention relates to a drug that enhances the cytotoxic activity of an antibody drug in antibody therapy for cancer.
抗体による悪性腫瘍の治療に関する医薬の開発は、分子標的治療の分野で、近年、目覚ましい発展を遂げてきた。日本では承認された抗体医薬は未だ２品目のみではあるが、現在知られているだけでも、悪性リンパ腫（CD20, HLA-DR, CD5）、急性骨髄性白血病（CD33, CD66）、慢性リンパ球性白血病（CD52, CD20）、急性リンパ球性白血病（CD19, CD20,
CD22）、多発性骨髄腫（Id-idiotype, HM1.24）、乳癌（HER2/neu）、上皮性癌（EGF-R,
VEGF）、大腸癌（17-1A, CEA）、卵巣癌（CA125）などに対する抗体医薬がある。（例えば、非特許文献１）。
In recent years, the development of drugs related to the treatment of malignant tumors by antibodies has made remarkable progress in the field of molecular targeted therapy. Although there are only two approved antibody drugs in Japan, malignant lymphoma (CD20, HLA-DR, CD5), acute myeloid leukemia (CD33, CD66), chronic lymphocytic Leukemia (CD52, CD20), acute lymphocytic leukemia (CD19, CD20,
CD22), multiple myeloma (Id-idiotype, HM1.24), breast cancer (HER2 / neu), epithelial cancer (EGF-R,
There are antibody drugs against VEGF), colon cancer (17-1A, CEA), ovarian cancer (CA125) and the like. (For example, Non-Patent Document 1).
抗体医薬の作用機序としては、１：アポトーシス誘導、２：ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害）の誘導、３：ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）の誘導などが考えられている。これらのうち、ＣＤＣは、生体内の補体成分が、抗原抗体反応で腫瘍細胞に取りついた抗体を認識して、補体系の活性化経路のうちの、古典経路によって細胞傷害作用を引き起こし、腫瘍細胞を殺すというものである。 As an action mechanism of an antibody drug, 1: induction of apoptosis, 2: induction of ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity), 3: induction of CDC (complement-dependent cytotoxicity), and the like are considered. Among these, CDC recognizes an antibody that a complement component in a living body has attached to a tumor cell by an antigen-antibody reaction, and causes a cytotoxic action by a classical pathway of activation pathways of the complement system, It kills tumor cells.
上記のように、抗体医薬は作用機序が化学療法剤とは異なることから、これまで難治性と分類された腫瘍に対する有力な治療法として期待されている。また、毒性も化学療法剤とは異なることから、化学療法剤との併用による相乗効果についても多数の検討が行なわれている（例えば、非特許文献２）。しかしながら、治療を行なう過程で、抗体医薬に抵抗性を持った悪性腫瘍が再発し、抗体医薬での治療が困難な患者も多数報告されるようになった。 As described above, antibody drugs are expected to be effective treatments for tumors that have been classified as refractory, since their action mechanism is different from that of chemotherapeutic agents. In addition, since toxicity is also different from that of chemotherapeutic agents, many studies have been conducted on synergistic effects by combined use with chemotherapeutic agents (for example, Non-Patent Document 2). However, in the course of treatment, malignant tumors resistant to antibody drugs have recurred, and many patients who are difficult to treat with antibody drugs have been reported.
腫瘍細胞は、様々なメカニズムで、抗体医薬に対する抵抗性を獲得することが報告されているが、中でも補体制御因子と呼ばれる分子（ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９）の腫瘍細胞表面での発現量が増加して、前記の３番目の作用機序における補体の古典経路を不活性化することで、抵抗性を獲得しているケースが多数報告されている（例えば、非特許文献３）。また、血液学的悪性腫瘍細胞または固形細胞の化学療法剤および抗ＣＤ２０または抗ＣＤ２２抗体に対する抵抗性を回避又は低下させるのに有用な方法が開示されている（例えば、特許文献１）。このように、抗体医薬に対する耐性機序を明らかにし、耐性を克服する方法を開発することが、抗体医薬の効果を高めるために重要であり、多くの研究者が注力するところとなっている（例えば、非特許文献４）。 Tumor cells have been reported to acquire resistance to antibody drugs by various mechanisms. Among them, the expression level of molecules called complement regulators (CD46, CD55, CD59) on the tumor cell surface is increased. Many cases have been reported in which resistance is acquired by inactivating the classical pathway of complement in the third mechanism of action (for example, Non-Patent Document 3). In addition, a method useful for avoiding or reducing the resistance of hematological malignant tumor cells or solid cells to chemotherapeutic agents and anti-CD20 or anti-CD22 antibodies is disclosed (for example, Patent Document 1). Thus, it is important to elucidate the mechanism of resistance to antibody drugs and to develop a method for overcoming resistance, in order to enhance the effects of antibody drugs, and many researchers are focusing on ( For example, Non-Patent Document 4).
ＣＤ５５［ＤＡＦ：decay-accerelating factor（崩壊促進因子）とも呼ばれる。］分子は、補体活性を調節する蛋白質群のひとつで、Ｃ３変換酵素であるＣ３ｂＢｂ、Ｃ４ｂ２ａを解離、失活させることで、補体の作用を抑制することが知られている（特許文献２）。ＣＤＣの実験系に、このＣＤ５５分子の作用を中和する能力のある抗体を添加すると、腫瘍細胞のＣＤＣ感受性が向上することが、報告されている（例えば、非特許文献５）。また、抗ＣＤ５５抗体について、ＣＤ５５の作用の中和が目的ではないが、癌の治療及び診断のための抗体としての技術が開示されている（例えば、特許文献３）。しかしながら、実際に医療に用いることが可能な中和抗体を製造するためには、実用性を確認するまでに多くの時間と労力を要するのが現状であった。
哺乳動物細胞において、二本鎖ＲＮＡ（長鎖）による遺伝子発現抑制は、インターフェロンのシグナル経路の活性化によって細胞毒性を示すため、手段としては否定的であったが、２１塩基の短鎖二本鎖ＲＮＡによってＲＮＡｉ（RNA interference）が生じることが
報告されて以来、合成のｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）による特異的な遺伝子の発現抑制に関する技術が革新的に進歩した（例えば、非特許文献６、非特許文献７、特許文献４、又は特許文献５）。現在この技術は、遺伝子発現の抑制研究に止まらず、ウイルス感染症への応用など多方面への応用に期待が寄せられている（例えば、非特許文献８）。
しかしながら、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制技術を利用した、抗体医薬に抵抗性（耐性）を獲得した難治性の悪性腫瘍の治療剤については、従来より知られていなかった。
In mammalian cells, suppression of gene expression by double-stranded RNA (long chain) was cytotoxic as a result of activation of the signal pathway of interferon, and was therefore negative as a means. Since it has been reported that RNA interference (RNA interference) is caused by strand RNA, technology relating to specific gene expression suppression by synthetic siRNA (short interfering RNA) has been innovatively advanced (for example, Non-Patent Document 6, Non-Patent Document 6, Patent Document 7, Patent Document 4, or Patent Document 5). At present, this technology is not limited to gene expression suppression research, but is expected to be applied in various fields such as application to viral infections (for example, Non-Patent Document 8).
However, a therapeutic agent for an intractable malignant tumor that has acquired resistance (resistance) to an antibody drug using a gene expression suppression technique using siRNA has not been known.
本発明は、癌の抗体療法、特に耐性を有する癌（悪性腫瘍）の抗体療法において、補体制御因子の機能をコントロールし、抗体医薬の細胞傷害活性における感受性を高める効果を有する、安全性が高い薬剤を提供することを目的としている。 The present invention has the effect of controlling the function of a complement regulator and enhancing the sensitivity in the cytotoxic activity of an antibody drug in antibody therapy for cancer, particularly antibody therapy for cancer (malignant tumor) having resistance. The purpose is to provide high drugs.
本発明者らは、悪性腫瘍の患者において抗体医薬に対する耐性が確認された状態であっても、標的腫瘍細胞への抗体医薬に対する感受性が高められれば、補体系の細胞傷害活性を十分に発揮させることが可能ではないかと考え、鋭意研究開発を重ねた。その結果、抗体医薬に対して耐性を有する腫瘍細胞に、補体制御因子をコードする遺伝子に対する２本鎖ＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡ、を導入したところ、標的腫瘍細胞中での補体制御因子の発現が顕著に抑制され、抗体医薬と補体による細胞傷害作用の感受性が高められることが判明し、本発明を完成するに至った。 The present inventors sufficiently exert the cytotoxic activity of the complement system if the sensitivity to the antibody drug to the target tumor cell is increased even in a state where resistance to the antibody drug is confirmed in a patient with a malignant tumor I thought that it might be possible, and repeated research and development. As a result, when a double-stranded RNA, particularly siRNA, for a gene encoding a complement regulator is introduced into a tumor cell resistant to an antibody drug, the expression of the complement regulator in the target tumor cell It was found that it was remarkably suppressed and the sensitivity of the cytotoxic action by the antibody drug and complement was enhanced, and the present invention was completed.
前記課題を解決する本発明は、以下のとおりである。
（１）補体制御因子をコードする遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡを有効成分とする、癌の抗体療法における抗体医薬の細胞傷害活性を増強するための薬剤。
（２）前記２本鎖ＲＮＡが、補体制御因子をコードする遺伝子の一部の配列に相補的な配列を有するｓｉＲＮＡである前記薬剤。
（３）前記補体制御因子が、ＣＤ５５、ＣＤ４６、及びＣＤ５９から選ばれる前記薬剤。（４）前記補体制御因子がＣＤ５５である前記薬剤。
（５）前記ｓｉＲＮＡが、ＣＤ５５をコードする遺伝子のコード領域の５'末端側の一部配列に相補的な配列を有する前記薬剤。
（６）前記ｓｉＲＮＡが、ＣＤ５５をコードする遺伝子のコード領域の５'末端側の配列に相補的な配列を有する２本鎖ＲＮＡをＤｉｃｅｒ酵素で切断して得られる２０〜２５塩基の２本鎖ＲＮＡ又はそれらの混合物である前記薬剤。
（７）前記癌が、乳癌、Ｂ細胞リンパ腫、白血病、大腸癌から選ばれる前記薬剤。
（８）前記癌が、抗体医薬に対する耐性を有する癌である前記薬剤。
（９）前記抗体医薬が、抗ＨＥＲ２抗体又は抗ＣＤ２０抗体である前記薬剤。
The present invention for solving the above problems is as follows.
(1) A drug for enhancing the cytotoxic activity of an antibody drug in antibody therapy for cancer, comprising as an active ingredient a double-stranded RNA that suppresses the expression of a gene encoding a complement regulatory factor.
(2) The drug, wherein the double-stranded RNA is an siRNA having a sequence complementary to a partial sequence of a gene encoding a complement regulatory factor.
(3) The drug, wherein the complement regulator is selected from CD55, CD46, and CD59. (4) The drug, wherein the complement regulator is CD55.
(5) The drug, wherein the siRNA has a sequence complementary to a partial sequence on the 5 ′ end side of a coding region of a gene encoding CD55.
(6) A double strand of 20 to 25 bases obtained by cleaving a double stranded RNA having a sequence complementary to the 5 ′ terminal sequence of the coding region of the gene encoding CD55 with a Dicer enzyme The drug, which is RNA or a mixture thereof.
(7) The drug, wherein the cancer is selected from breast cancer, B cell lymphoma, leukemia, and colon cancer.
(8) The drug, wherein the cancer is cancer having resistance to an antibody drug.
(9) The drug, wherein the antibody drug is an anti-HER2 antibody or an anti-CD20 antibody.
本発明の抗体医薬の細胞傷害活性増強剤は、癌（特に悪性腫瘍）の抗体療法において、補体と抗体医薬による細胞傷害活性を増強することで、標的になる癌（悪性腫瘍）細胞を効率よく殺傷することが可能である。また、特に抗体医薬に耐性を有する癌（悪性腫瘍）細胞に対して、補体と抗体医薬による細胞傷害活性をリカバリーする効果も兼ね備えている。 The antibody drug cytotoxicity enhancer of the present invention enhances the cytotoxic activity of a complement and an antibody drug in antibody therapy for cancer (particularly malignant tumor), thereby efficiently targeting cancer (malignant tumor) cells. It is possible to kill well. In addition, it also has an effect of recovering the cytotoxic activity of complement and antibody drug against cancer (malignant tumor) cells particularly resistant to antibody drug.
また、本発明の抗体医薬の細胞傷害活性を増強する方法によって、抗体医薬に耐性を持った悪性腫瘍が再発し、抗体医薬での治療が困難であると判断された患者に対しても、継続して抗体医薬での治療を行っていくことが可能である。 In addition, by the method for enhancing the cytotoxic activity of the antibody drug of the present invention, a malignant tumor resistant to the antibody drug has recurred and is continued even for patients judged to be difficult to treat with the antibody drug. Then, it is possible to perform treatment with an antibody drug.
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。 Next, a preferred embodiment of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the following preferred embodiments, and can be freely changed within the scope of the present invention. In the present specification, percentages are expressed by mass unless otherwise specified.
本発明の癌の抗体療法における抗体医薬の細胞傷害活性を増強するための薬剤（以下、単に「本発明の薬剤」と記載することがある。）の有効成分は、補体制御因子をコードする遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡである。 The active ingredient of a drug for enhancing the cytotoxic activity of an antibody drug in the antibody therapy for cancer of the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as “the drug of the present invention”) encodes a complement regulatory factor. It is a double-stranded RNA that suppresses gene expression.
本発明において、「抗体医薬」とは、癌（悪性腫瘍）細胞で発現する癌細胞表面分子又は増殖因子などの可溶性分子を標的抗原とし、この標的抗原に結合する抗体を有効成分とし、前記抗体が癌細胞に結合することによって癌細胞を殺傷する医薬をいう。抗体医薬の作用としては、癌細胞が増殖するシグナルを阻害すること、細胞死シグナルを活性化することにより癌細胞を殺傷すること、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）により癌細胞を殺傷すること等を含む。 In the present invention, the “antibody drug” refers to a cancer cell surface molecule expressed in cancer (malignant tumor) cells or a soluble molecule such as a growth factor as a target antigen, and an antibody that binds to the target antigen as an active ingredient. Refers to a drug that kills cancer cells by binding to the cancer cells. The action of antibody drugs is to inhibit cancer cell growth signals, kill cancer cells by activating cell death signals, and kill cancer cells by complement-dependent cytotoxic activity (CDC) Including things.
本発明において、「細胞傷害活性を増強する」とは、癌の抗体療法において抗体医薬の細胞傷害活性を高める効果、すなわち、抗体医薬の標的になる腫瘍細胞を補体及び／又は抗体医薬が殺傷する作用を増強することに加えて、抗体医薬に耐性を有する腫瘍細胞に対して、抗体医薬に対する感受性を高めること、すなわち補体及び／又は抗体医薬による細胞傷害活性をリカバリーすることを含む。また、「抗体医薬に耐性を有する」とは、抗体医薬及び／又は補体が腫瘍細胞を殺傷する作用（細胞傷害活性）に耐性であること、言い換えれば、前記作用が弱いか又は同作用を受けないことをいう。 In the present invention, “enhance cytotoxic activity” means the effect of increasing the cytotoxic activity of an antibody drug in cancer antibody therapy, that is, the complement and / or antibody drug kills tumor cells that are the target of the antibody drug. In addition to enhancing the action of the antibody drug, it includes increasing the sensitivity to the antibody drug against tumor cells resistant to the antibody drug, that is, recovering the cytotoxic activity of the complement and / or antibody drug. Further, “resistant to an antibody drug” means that the antibody drug and / or complement is resistant to the action of killing tumor cells (cytotoxic activity), in other words, the action is weak or the same action. It means not receiving.
次に、本発明の薬剤の有効成分である補体制御因子をコードする遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡについて説明する。
前記補体制御因子としては、その発現を抑制することによって、癌の抗体療法における抗体医薬の細胞傷害活性が増強するものであれば特に制限されないが、例えば、ＣＤ５５、ＣＤ４６、及びＣＤ５９が挙げられる。
Next, double-stranded RNA that suppresses the expression of a gene encoding a complement regulatory factor that is an active ingredient of the drug of the present invention will be described.
The complement regulator is not particularly limited as long as it suppresses its expression and enhances the cytotoxic activity of the antibody drug in antibody therapy for cancer. Examples thereof include CD55, CD46, and CD59. .
前記２本鎖ＲＮＡとしては、補体制御因子をコードする遺伝子の全体又はその一部に相補的な配列を有する２本鎖ＲＮＡが挙げられる。ここで、遺伝子の配列に対して「相補的な配列を有する２本鎖ＲＮＡ」とは、前記遺伝子のセンス鎖又はその一部に相補的な配列を有するＲＮＡと、センス鎖又はその一部と相同な配列を有するＲＮＡ又はＤＮＡからなる２本鎖を意味する。尚、ＤＮＡの配列に「相同な」配列を有するＲＮＡとは、ＤＮＡの塩基配列におけるチミンをウラシルに置換えた配列を有するＲＮＡを意味する。尚、「相補的」又は「相同」は、必ずしも完全に相補的又は相同であることを意味するものではなく、後述するｓｉＲＮＡが取込まれたＲＩＳＣ複合体によって、標的遺伝子のｍＲＮＡの切断が起こり得る限り、１又は数塩基のミスマッチがあってもよい。 Examples of the double-stranded RNA include double-stranded RNA having a sequence complementary to the whole or a part of a gene encoding a complement regulatory factor. Here, “double-stranded RNA having a complementary sequence” with respect to a gene sequence means an RNA having a sequence complementary to the sense strand of the gene or a part thereof, and the sense strand or a part thereof. It means a double strand consisting of RNA or DNA having a homologous sequence. The RNA having a sequence “homologous” to the DNA sequence means an RNA having a sequence in which thymine in the DNA base sequence is replaced with uracil. Note that “complementary” or “homologous” does not necessarily mean that they are completely complementary or homologous, and cleavage of the target gene mRNA occurs by the RISC complex incorporating siRNA described later. There may be one or several base mismatches as long as possible.
２本鎖ＲＮＡのセンス鎖は、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよいが、ＲＮＡであることが好ましい。本明細書においては、２本鎖ＲＮＡの配列は、センス鎖のＲＮＡ配列として示す。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドによる遺伝子発現阻害については、特開２００３−２１９８９３に記載されている。 The sense strand of double-stranded RNA may be RNA or DNA, but is preferably RNA. In the present specification, the sequence of double-stranded RNA is shown as the RNA sequence of the sense strand. Gene expression inhibition by RNA-DNA hybrids is described in JP2003-219893.
前記２本鎖ＲＮＡとしては、例えば、ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）が挙げられる。ｓｉＲＮＡは、２０〜２５塩基、通常は２１〜２３塩基からなる２本鎖ＲＮＡであり、細胞がｓｉＲＮＡを取込むと、標的遺伝子のｍＲＮＡが特異的に分解され、同遺伝子の発現が抑制される。この技術は、ＲＮＡ干渉（RNA interferenc：RNAi）と呼ばれる。ｓｉＲＮＡは、細胞内で一本鎖に解離し、それぞれＲＮＡ分解酵素活性を有するタンパク質と結合してＲＩＳＣ（RNA-induced silencing complex） と呼ばれる複合体を形成する。標的ｍＲＮＡと相補的な配列を有する鎖が取込まれたＲＩＳＣが標的ｍＲＮＡに結合すると、ｍＲＮＡが切断され、その結果、標的遺伝子の発現が抑制されると考えられている（Molecular Medicine, 41(1), 10-29, 2004等参照）。 Examples of the double-stranded RNA include siRNA (short interfering RNA). siRNA is a double-stranded RNA consisting of 20 to 25 bases, usually 21 to 23 bases. When a cell incorporates siRNA, the mRNA of the target gene is specifically decomposed and the expression of the gene is suppressed. . This technique is called RNA interferenc (RNAi). siRNA dissociates into single strands in cells and binds to proteins each having RNase activity to form a complex called RISC (RNA-induced silencing complex). When RISC in which a strand having a sequence complementary to the target mRNA is incorporated binds to the target mRNA, it is considered that the mRNA is cleaved and, as a result, the expression of the target gene is suppressed (Molecular Medicine, 41 ( 1), 10-29, 2004 etc.).
ｓｉＲＮＡは、例えば、補体制御因子をコードする遺伝子又はその一部に相補的な配列を有する２本鎖ＲＮＡを調製し、これをＤｉｃｅｒ酵素で切断することによって得ることができる。Ｄｉｃｅｒ酵素は、市販されているものを使用することができる。前記２本鎖ＲＮＡは、例えば、補体制御因子をコードする遺伝子のコード領域又はその一部の配列を有する２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡポリメラーゼ反応によって調製することができる。また、２本鎖ＤＮＡは、前記遺伝子の配列に基づいて設計されたプライマーを用いてＰＣＲにより増幅することによって、調製することができる。 The siRNA can be obtained, for example, by preparing a double-stranded RNA having a sequence complementary to a gene encoding a complement regulatory factor or a part thereof, and cleaving it with a Dicer enzyme. A commercially available Dicer enzyme can be used. The double-stranded RNA can be prepared, for example, by an RNA polymerase reaction using a double-stranded DNA having a coding region of a gene encoding a complement regulatory factor or a partial sequence thereof as a template. Double-stranded DNA can be prepared by amplifying by PCR using primers designed based on the gene sequence.
前記２本鎖ＲＮＡは、補体制御因子としてＣＤ５５に対するｓｉＲＮＡの製造に際しては、ＣＤ５５遺伝子のコード領域の５'末端側部分を含むものであることが好ましい。また、前記２本鎖ＲＮＡは、ＣＤ５５遺伝子のコード領域の５'末端側部分のみを含むことがより好ましい。５'末端側部分として具体的には、ＣＤ５５遺伝子のコード領域の５'末端から全長の１／２〜１／１まで、好ましくは１／３〜１／２まで、特に好ましくは１／３程度までの領域が挙げられる。 In the production of siRNA against CD55 as a complement regulatory factor, the double-stranded RNA preferably contains a 5 ′ terminal portion of the CD55 gene coding region. More preferably, the double-stranded RNA includes only the 5 ′ end portion of the coding region of the CD55 gene. Specifically, as the 5 ′ end side portion, from the 5 ′ end of the coding region of CD55 gene to 1/2 to 1/1, preferably from 1 to 3 to 1/2, particularly preferably about 1/3 from the full length. The area up to is mentioned.
上記のようにして得られる２本鎖ＲＮＡをＤｉｃｅｒ酵素で切断することによって、ｓｉＲＮＡが得られる。こうして得られるｓｉＲＮＡは複数種のＲＮＡ分子の混合物である。本発明においては、ｓｉＲＮＡは、このような混合物であってもよいし、この混合物か
ら精製された均一なＲＮＡ分子であってもよい。
SiRNA is obtained by cleaving the double-stranded RNA obtained as described above with a Dicer enzyme. The siRNA thus obtained is a mixture of multiple types of RNA molecules. In the present invention, the siRNA may be such a mixture or a uniform RNA molecule purified from this mixture.
また、ｓｉＲＮＡは、化学合成によっても製造することができる。すなわち、標的配列に相当するセンス鎖とアンチセンス鎖を合成し、それらをアニールさせることによって、ｓｉＲＮＡが得られる。さらに、標的遺伝子配列に応じて設計した合成ＤＮＡを、市販のｓｉＲＮＡ発現ベクターに挿入し、適当な宿主で発現させることによっても、ｓｉＲＮＡを得ることができる。 SiRNA can also be produced by chemical synthesis. That is, siRNA is obtained by synthesizing a sense strand and an antisense strand corresponding to the target sequence and annealing them. Furthermore, siRNA can also be obtained by inserting synthetic DNA designed according to the target gene sequence into a commercially available siRNA expression vector and expressing it in an appropriate host.
本発明においては、本発明の薬剤の有効成分として、標的細胞中の内在性Ｄｉｃｅｒ酵素によって目的のｓｉＲＮＡが生成するような２本鎖ＲＮＡを用いることもできる。 In the present invention, as an active ingredient of the drug of the present invention, a double-stranded RNA capable of generating a target siRNA by an endogenous Dicer enzyme in a target cell can also be used.
本発明に用いる２本鎖ＲＮＡは、癌の抗体療法において抗体医薬の細胞傷害活性を増強する作用を有する。該作用はPropidium iodide（PI：Dojindo社製：カタログ番号 P378）を用いた方法〔サイトメトリー（Cytometry）第８巻、第４号、１９８７年、第４２１〜４２６頁〕、又はCalcein-AM（Dojindo社製：カタログ番号 341-07901）を用いた方法〔アポトーシス（Apoptosis）、第３巻、第３号、１９９８年、第１９５〜２０２頁〕に準じて測定することができる。後述する実施例において、該測定方法について詳細に記載する。 The double-stranded RNA used in the present invention has the effect of enhancing the cytotoxic activity of antibody drugs in cancer antibody therapy. The effect is determined by the method using Propidium iodide (PI: Dojindo, catalog number P378) [Cytometry Vol. 8, No. 4, 1987, 421-426], or Calcein-AM (Dojindo It can be measured in accordance with a method [Apoptosis, Vol. 3, No. 3, 1998, pp. 195-202] using a company number: catalog number 341-07901). The measurement method will be described in detail in Examples described later.
上記２本鎖ＲＮＡは、抗体療法における抗体医薬の細胞傷害活性を増強するための薬剤の有効成分とすることができる。同薬剤は、抗体療法を施すヒト等の動物に投与することにより、癌の抗体療法における抗体医薬の細胞傷害活性が増強される。すなわち、本発明の一態様は、癌の抗体療法における抗体医薬の細胞傷害活性を増強するための薬剤の製造における、補体制御因子をコードする遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡの使用である。また、本発明の他の態様は、本発明の薬剤を、抗体療法を施すヒト等の動物に投与することを含む、癌の抗体療法における抗体医薬の細胞傷害活性を増強する方法である。 The double-stranded RNA can be used as an active ingredient of a drug for enhancing the cytotoxic activity of an antibody drug in antibody therapy. When this drug is administered to an animal such as a human subjected to antibody therapy, the cytotoxic activity of the antibody drug in cancer antibody therapy is enhanced. That is, one embodiment of the present invention is the use of double-stranded RNA that suppresses the expression of a gene encoding a complement regulator in the manufacture of a drug for enhancing the cytotoxic activity of an antibody drug in cancer antibody therapy. is there. Another aspect of the present invention is a method for enhancing the cytotoxic activity of an antibody drug in antibody therapy for cancer, which comprises administering the agent of the present invention to an animal such as a human undergoing antibody therapy.
本発明の薬剤は、通常は、製剤学的に許容される製剤担体と組合わせて、経口的、又は非経口的にヒトを含む哺乳動物に投与することができる。本発明の薬剤の製剤形態は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択でき、具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤、点鼻剤等を例示できる。製剤化にあたっては製剤担体として通常の薬剤に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。 The agent of the present invention can be orally or parenterally administered to mammals including humans usually in combination with a pharmaceutically acceptable pharmaceutical carrier. The preparation form of the drug of the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose of treatment. Specifically, tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules, syrups Suppositories, injections, ointments, patches, eye drops, nasal drops and the like. Additives such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents, diluents, surfactants, solvents for injections, etc. that are commonly used as pharmaceutical carriers for pharmaceutical preparations. Can be used.
本発明の薬剤中に含まれる２本鎖ＲＮＡの量は、特に限定されず適宜選択すればよいが、例えば、ｓｉＲＮＡの場合は、製剤中に１００μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５００μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌとするのがよい。 The amount of double-stranded RNA contained in the drug of the present invention is not particularly limited and may be appropriately selected. For example, in the case of siRNA, 100 μg / ml to 10 mg / ml, preferably 500 μg / ml in the preparation. It should be ˜5 mg / ml.
本発明の薬剤の投与時期は特に限定されず、抗体医薬の投与前、投与後、又は抗体医薬と同時のいずれであっても可能であり、対象となる癌種の治療方法に従って、適宜投与時期を選択することが可能である。また、投与形態は製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、患者の症状の程度等に応じて決定される。 The administration time of the drug of the present invention is not particularly limited, and can be any time before administration, after administration of the antibody drug, or at the same time as the antibody drug. Can be selected. Further, the dosage form is determined according to the preparation form, the patient's age, sex, other conditions, the degree of symptoms of the patient, and the like.
本発明の製剤の有効成分の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件等により適宜選択される。通常有効成分としての２本鎖ＲＮＡの量は、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ／日〜５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となる量を目安とするのが良く、１日１回又は複数回に分けて投与することができる。 The dosage of the active ingredient in the preparation of the present invention is appropriately selected depending on the usage, patient age, sex, disease severity, other conditions, and the like. Usually, the amount of double-stranded RNA as an active ingredient is 0.1 mg / kg / day to 10 mg / kg / day, preferably 1 mg / kg / day to 5 mg / kg / day. It can be administered once or a plurality of times a day.
本発明の薬剤は、癌、例えば乳癌、Ｂ細胞リンパ腫（非ホジキンリンパ腫、バーキット
リンパ腫等）、白血病又は大腸癌等において、抗体医薬を用いた治療における治療剤、治療効果増強剤、治療補助剤として有用である。本発明の薬剤は、特に、前記癌の中でも、抗体医薬に耐性を有する癌に極めて著効を示す。尚、本発明に使用することが可能な抗体医薬としては、抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ：rituximab）、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（トラスツズマブ：trastuzumab）、抗１７−１Ａ（ヒト腫瘍関連上皮細胞接着因子）抗体（edrecolomab）等を例示することができ、その他、癌治療における抗体療法で使用できる抗体医薬も使用することができる。また、現在知られている抗体医薬に限られず、今後開発される抗体医薬も使用することができる。
The drug of the present invention is a therapeutic agent, therapeutic effect enhancer, therapeutic auxiliary agent in the treatment using an antibody drug in cancer such as breast cancer, B cell lymphoma (non-Hodgkin lymphoma, Burkitt lymphoma, etc.), leukemia, or colon cancer. As useful. The drug of the present invention is extremely effective particularly for cancers resistant to antibody drugs among the above cancers. Examples of antibody drugs that can be used in the present invention include anti-CD20 antibody (rituximab), anti-HER2 monoclonal antibody (trastuzumab), anti-17-1A (human tumor-related epithelial cell adhesion factor) antibody ( edrecolomab) and the like, and antibody drugs that can be used in antibody therapy in cancer treatment can also be used. Moreover, it is not restricted to the antibody drug currently known, The antibody drug developed in the future can also be used.
本発明の薬剤は、抗体療法において抗体医薬とともに使用することが好ましく（但し、投与の時期が同時であるか否かは問わない）、公知の前記癌疾患の予防・治療剤（増強剤・補助剤も含まれる）と併用して使用することも可能である。併用することによって、前記癌疾患の予防・治療効果を高めることができ、また、併用する前記予防・治療剤の投与量を減らすことも可能である。さらに、併用する前記癌疾患の予防・治療剤を、本発明の薬剤の組成物中に有効成分として含有させても良いし、本発明の薬剤の組成物中には含有させずに別個の薬剤として組合わせて商品化し、使用時に組み合わせても良い。 The drug of the present invention is preferably used together with an antibody drug in antibody therapy (however, it does not matter whether or not the administration is performed at the same time). (Including agents). By using in combination, it is possible to enhance the preventive / therapeutic effect of the cancer disease, and it is also possible to reduce the dose of the prophylactic / therapeutic agent used in combination. Furthermore, the preventive / therapeutic agent for cancer diseases to be used in combination may be contained as an active ingredient in the composition of the drug of the present invention, or a separate drug without being contained in the composition of the drug of the present invention. May be combined and commercialized, and may be combined at the time of use.
次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
本発明の抗体医薬の細胞傷害活性増強剤の有効成分であるｓｉＲＮＡ（２１〜２３塩基対２本鎖ｓｉＲＮＡ）を製造した。
すなわち、ヒトＣＤ５５をコードする配列番号１に記載の塩基配列を有するｃＤＮＡ（ベクトン・ディッキンソン社製）を鋳型とし、配列番号２及び配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマーを用いて、公知のＰＣＲ法によりＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物（ＣＤ５５のＮ末端領域をコードする遺伝子配列を有するｃＤＮＡ）の両端にＴ７プロモーター配列を含むリンカーを、Ｔ４リガーゼ（Block itTM、インビトロジェン社製）を用いて結合させた。次に、これを鋳型にしてＲＮＡポリメラーゼ（Block itTM T7 Enzyme Mix、インビトロジェン社製）を用いてそれぞれの２本鎖ＲＮＡ（この２本鎖ＲＮＡを、ＣＤ５５−Ｎと記載することがある。）を調製した。配列番号８に、ＣＤ５５−Ｎのアンチセンス鎖の塩基配列を示す。次いで、該２本鎖ＲＮＡを、RNaseIII活性を有するＤｉｃｅｒ酵素（ＲＮＡ切断酵素：BLOCK-iT Dicer RNAi kit、インビトロジェン社製）によって切断し、２１〜２３塩基対２本鎖ｓｉＲＮＡを製造した。
EXAMPLES Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
[Example 1]
SiRNA (21-23 base pair double-stranded siRNA) which is an active ingredient of the cytotoxic activity enhancer of the antibody drug of the present invention was produced.
That is, using a cDNA having a nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 encoding human CD55 (manufactured by Becton Dickinson) as a template and using primers having nucleotide sequences described in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, PCR was performed by the PCR method. A linker containing a T7 promoter sequence was bound to both ends of the obtained PCR product (cDNA having a gene sequence encoding the N-terminal region of CD55) using T4 ligase (Block it ™ , manufactured by Invitrogen). Next, using this as a template, RNA polymerase (Block it ™ T7 Enzyme Mix, manufactured by Invitrogen) is used to make each double-stranded RNA (this double-stranded RNA may be described as CD55-N). Was prepared. SEQ ID NO: 8 shows the nucleotide sequence of the antisense strand of CD55-N. Next, the double-stranded RNA was cleaved with a Dicer enzyme having RNase III activity (RNA cleaving enzyme: BLOCK-iT Dicer RNAi kit, manufactured by Invitrogen) to produce a 21-23 base pair double-stranded siRNA.
〔実施例２〕
ｓｉＲＮＡによる悪性腫瘍細胞での補体制御因子の発現への影響と、抗体医薬による細胞傷害活性への効果を、リンパ腫患者から採取したＢリンパ腫（臨床検体）細胞を用いて試験検討した。
[Example 2]
The effect of siRNA on the expression of complement regulatory factors in malignant tumor cells and the effect of antibody drugs on cytotoxic activity were examined using B lymphoma (clinical specimen) cells collected from lymphoma patients.
（１）試料の調製
実施例１で製造したｓｉＲＮＡ（ＣＤ５５のＮ末端領域をコードする遺伝子配列に相当する配列を有する２本鎖ＲＮＡをＤｉｃｅｒ酵素で切断したもの）を試験試料１とした。また、プライマーに配列番号４及び配列番号５のオリゴヌクレオチドを使用した以外は実施例１と同様にして、ｓｉＲＮＡ（ＣＤ５５の中間領域をコードする遺伝子配列に相当する配列を有する２本鎖ＲＮＡ（ＣＤ５５−Ｍと記載することがある）をＤｉｃｅｒ酵素で切断したもの）を対照試料１とした。ＣＤ５５−Ｍのアンチセンス鎖の塩基配列を配列番号９に示す。さらに、同様に、配列番号６及び配列番号７のプライマーを使用して製造したｓｉＲＮＡ（ＣＤ５５のＣ末端領域をコードする遺伝子配列に相当する配列を有する２本鎖ＲＮＡ（ＣＤ５５−Ｃと記載することがある）をＤｉｃｅｒ酵素で切断したもの）を対照試料２とした。ＣＤ５５−Ｃのアンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１０に示す。
(1) Preparation of Sample The siRNA produced in Example 1 (a double-stranded RNA having a sequence corresponding to the gene sequence encoding the N-terminal region of CD55 cut with Dicer enzyme) was used as test sample 1. Moreover, siRNA (double-stranded RNA having a sequence corresponding to the gene sequence encoding the intermediate region of CD55 (CD55) was used in the same manner as in Example 1 except that the oligonucleotides of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 were used as primers. (Which may be described as -M) was cut with Dicer enzyme) was used as control sample 1. The nucleotide sequence of the antisense strand of CD55-M is shown in SEQ ID NO: 9. Similarly, siRNA produced using the primers of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 (double-stranded RNA having a sequence corresponding to the gene sequence encoding the C-terminal region of CD55 (denoted as CD55-C) The control sample 2 was obtained by cleaving with Dicer enzyme. The nucleotide sequence of the antisense strand of CD55-C is shown in SEQ ID NO: 10.
ついで、前記試験試料１、対照試料１又は２について、それぞれの細胞導入用試料をBLOCK-iT Dicer RNAi kit（インビトロジェン社製）を使用して調製した。すなわち、試験試料１、対照試料１又は２それぞれについて、ａ液（LipofectamineTM 2000（インビトロジェン社製）：５μｌとOpti-MEM I（登録商標、ギブコ社製）２５０μｌの混合溶液）とｂ液（試験試料又は対照試料：０．７５μｌとOpti-MEM I（登録商標）２５０μｌの混合溶液）を調製した。ａ液、ｂ液それぞれを室温で５分間保温した後、ａ液とｂ液を混合して室温で２０分間保温して、試験試料１及び対照試料２、３それぞれについて、細胞導入用試験試料１、細胞導入用対照試料１及び２を調製した。また、試験試料の代わりに滅菌水（陰性試料）を用いて、細胞導入用陰性試料を調製した。 Subsequently, for the test sample 1 and the control sample 1 or 2, each cell introduction sample was prepared using a BLOCK-iT Dicer RNAi kit (manufactured by Invitrogen). That is, for each of test sample 1 and control sample 1 or 2, solution a (Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen): 5 μl and Opti-MEM I (registered trademark, manufactured by Gibco) 250 μl) and solution b (test) Sample or control sample: 0.75 μl and Opti-MEM I (registered trademark) 250 μl mixed solution) were prepared. After each of the liquid a and liquid b was incubated at room temperature for 5 minutes, the liquid a and liquid b were mixed and incubated at room temperature for 20 minutes. For each of the test sample 1 and the control samples 2 and 3, test sample 1 for cell introduction Control samples 1 and 2 for cell introduction were prepared. Further, a negative sample for cell introduction was prepared using sterilized water (negative sample) instead of the test sample.
（２）試験方法
ａ）ｓｉＲＮＡを導入した悪性腫瘍細胞におけるＣＤ５５発現の検討
Ｂリンパ腫患者から採取したＢリンパ腫（臨床検体）細胞を、７．５％ウシ胎児血清並びにペニシリン及びストレプトマイシン（各１％）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を用いて懸濁した。グラスボトムマイクロウェルディッシュ（Glass Bottom Microwell Dishes、品番：P35G-0-14-C、MatTec Co.製）４枚に、それぞれ２×１０5個／ディッシュとなるように細胞懸濁液を添加し、２４〜４８時間培養した後、前記細胞導入用試験試料１、細胞導入用対照試料１又は２、及び細胞導入用陰性試料の全量を培養液に添加し、トランスフェクションを行った。２４時間、３７℃で保温した後、新鮮な培地に置換して、さらに４８時間、３７℃で培養した。各細胞は、ＦＩＴＣ（Fluorescein-4-isothiocyanate）標識の抗ＣＤ５５抗体（PharMingen社製、品番：555693）を用いて染色した。さらに、観察の３０分前にＰＩ（ヨウ化プロピジウム）染色液（Cellstein-PI solution、同仁化学社製、品番：P378）５００μｇ／ｍｌを５μｌずつ各々細胞培養液に添加して保温した後、各細胞を、共焦点レーザー顕微鏡（バイオラッド社製、Radiance 2100MP）を用いて観察した。
(2) Test method a) Examination of CD55 expression in malignant tumor cells introduced with siRNA B lymphoma (clinical specimen) cells collected from B lymphoma patients were treated with 7.5% fetal bovine serum, penicillin and streptomycin (1% each) Suspended using RPMI 1640 medium containing To 4 glass bottom microwell dishes (product number: P35G-0-14-C, manufactured by MatTec Co.), add the cell suspension to 2 × 10 5 cells / dish, After culturing for 24-48 hours, the whole amount of the test sample 1 for cell introduction, the control sample 1 or 2 for cell introduction, and the negative sample for cell introduction was added to the culture solution, and transfection was performed. After incubating at 37 ° C. for 24 hours, the medium was replaced with fresh medium, and the cells were further cultured at 37 ° C. for 48 hours. Each cell was stained with a FITC (Fluorescein-4-isothiocyanate) -labeled anti-CD55 antibody (PharMingen, product number: 556993). Further, after 30 minutes of observation, 500 μg / ml of PI (propidium iodide) staining solution (Cellstein-PI solution, manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd., product number: P378) was added to each cell culture solution and kept warm. The cells were observed using a confocal laser microscope (Biorad, Radiance 2100MP).
ｂ）ｓｉＲＮＡが導入された悪性腫瘍細胞の補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）の感受性の検討
前記ａ）で観察した細胞の培養液に、５００μｌのHuman Serum AB（コスモバイオ社製、品番：832000027）と、抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ、中外製薬社製、製品名：Rituxan）を最終濃度で４０μｇ／ｍｌとなるように添加し、２４時間培養した。次いで、観察の３０分前に５００μｇ／ｍｌのCellstein-PI solutionを５μｌずつ各々細胞に添加して保温した。ＣＤＣによる細胞の生死は、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、核がＰＩで染まっている（死細胞を示す）ことを指標に観察した。
b) Examination of the sensitivity of complement-dependent cytotoxic activity (CDC) of malignant tumor cells into which siRNA has been introduced 500 μl of Human Serum AB (manufactured by Cosmo Bio, product number: 832000027) and an anti-CD20 antibody (Rituximab, manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., product name: Rituxan) were added to a final concentration of 40 μg / ml and cultured for 24 hours. Next, 5 μl of 500 μg / ml Cellstein-PI solution was added to each cell 30 minutes before observation and incubated. Cell viability due to CDC was observed using a confocal laser microscope with the nucleus being stained with PI (indicating dead cells).
（３）試験結果
本試験の結果を、図１及び図２に示す。図１は、各試料について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ５５抗体を用いた免疫染色（Ｂリンパ腫臨床検体細胞中のＣＤ５５の発現を示す）、ＰＩによる染色像、及び抗ＣＤ２０抗体処理後のＰＩ染色（抗体医薬と補体による細胞傷害活性を示す）の結果について示した図である。図２に、ＣＤＣの実施前（−）、及び実施後（＋）のＰＩ染色細胞の割合を測定した結果を示す。
(3) Test result The result of this test is shown in FIG.1 and FIG.2. FIG. 1 shows immunostaining using FITC-labeled anti-CD55 antibody (indicating CD55 expression in B lymphoma clinical specimen cells), PI-stained image, and PI staining after anti-CD20 antibody treatment (antibody drug) for each sample. And shows the cytotoxic activity by complement). FIG. 2 shows the results of measuring the proportion of PI-stained cells before (−) and after (+) CDC.
その結果、ＣＤ５５のＮ末端領域をコードする遺伝子配列に相補的な配列を有する２本鎖ＲＮＡから調製したｓｉＲＮＡを含む試験試料１をトランスフェクションしたＢリンパ腫細胞では、他の試料でトランスフェクションしたＢリンパ腫細胞に比して、ＣＤ５５の発現が抑制されていることが確認された（図１）。また、図２より、ＣＤＣを実施した後（＋）、ＰＩによる染色を行った場合、試験試料１をトランスフェクションしたＢリンパ腫細胞は、他の試料でトランスフェクションしたＢリンパ腫細胞におけるＰＩで染色された細胞（死細胞の割合：約１０％）に比して、顕著に多い（死細胞の割合：約７０％）こ
とが確認され、抗体医薬のＢリンパ腫細胞に対する感受性が増加したことが明らかとなった。すなわち、抗体医薬である抗ＣＤ２０抗体による細胞傷害活性が、試験試料１によって増強されることが明らかとなった。
As a result, in B lymphoma cells transfected with test sample 1 containing siRNA prepared from double-stranded RNA having a sequence complementary to the gene sequence encoding the N-terminal region of CD55, B transfected with another sample was used. It was confirmed that the expression of CD55 was suppressed as compared with lymphoma cells (FIG. 1). Further, as shown in FIG. 2, when CDC was performed (+) and staining with PI was performed, B lymphoma cells transfected with test sample 1 were stained with PI in B lymphoma cells transfected with other samples. It was confirmed that the sensitivity of the antibody drug to B lymphoma cells was increased, which was confirmed to be significantly higher (ratio of dead cells: about 70%) than the number of dead cells (ratio of dead cells: about 10%). became. That is, it was revealed that the cytotoxic activity of the anti-CD20 antibody that is an antibody drug is enhanced by the test sample 1.
〔実施例３〕
ｓｉＲＮＡによるＢリンパ腫細胞での補体制御因子の発現への影響と、抗体医薬による細胞傷害活性への効果を検討した。
Example 3
The effect of siRNA on the expression of complement regulatory factors in B lymphoma cells and the effect on antibody cytotoxic activity were examined.
（１）試料の調製
実施例２と同様の方法により、試験試料１及び陰性試料を用いて細胞導入用試験試料１及び細胞導入用陰性試料を調製した。
(1) Preparation of sample By the method similar to Example 2, the test sample 1 for cell introduction | transduction and the negative sample for cell introduction | transduction were prepared using the test sample 1 and the negative sample.
（２）試験方法
ａ）２本鎖ＲＮＡのＢリンパ腫瘍細胞への導入によるＣＤ５５発現の検討
ヒトバーキットリンパ腫細胞であるＲａｊｉ細胞（ATCC No.：CCL-86）を７．５％ウシ胎児血清並びにペニシリン及びストレプトマイシン（各１％）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を用いて懸濁した。グラスボトムマイクロウェルディッシュ（Glass Bottom Microwell Dishes、品番：P35G-0-14-C、MatTec Co.製）４枚にそれぞれ２×１０5個／ディッシュとなるように細胞懸濁液を添加し、２４〜４８時間培養した後、前記細胞導入用試験試料１および細胞導入用陰性試料の全量を培養液に添加し、トランスフェクションを行った。２４時間、３７℃で保温した後、新鮮な培地に置換して、さらに４８時間、３７℃で培養した。各細胞は、ＦＩＴＣ標識の抗ＣＤ５５抗体（PharMingen社製、品番：555693）を用いて染色した。さらに、観察の３０分前にDAPI染色液（Cellstein-DAPI solution、同仁化学社製、品番：D523）５００μｇ／ｍｌを５μｌずつ各々細胞に添加して保温した後、各細胞を、共焦点レーザー顕微鏡（バイオラッド社製、Radiance 2100MP）を用いて観察した。
(2) Test method a) Examination of CD55 expression by introduction of double-stranded RNA into B lymphoid tumor cells Raji cells (ATCC No .: CCL-86) which are human Burkitt lymphoma cells were treated with 7.5% fetal bovine serum And RPMI1640 medium containing penicillin and streptomycin (1% each). The cell suspension was added to each of 4 glass bottom microwell dishes (product number: P35G-0-14-C, manufactured by MatTec Co.) at 2 × 10 5 cells / dish. After culturing for ˜48 hours, the whole amount of the cell introduction test sample 1 and the cell introduction negative sample was added to the culture solution, and transfection was performed. After incubating at 37 ° C. for 24 hours, the culture medium was replaced with a fresh medium and cultured at 37 ° C. for an additional 48 hours. Each cell was stained with a FITC-labeled anti-CD55 antibody (PharMingen, product number: 556993). Furthermore, after 30 minutes of observation, 500 μg / ml of DAPI staining solution (Cellstein-DAPI solution, manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd., product number: D523) was added to each cell at 5 μl and kept warm, and then each cell was subjected to a confocal laser microscope. (Radio 2100MP, manufactured by Bio-Rad) was used for observation.
ｂ）ｓｉＲＮＡが導入されたＢリンパ腫細胞の補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）の感受性の検討
前記ａ）で観察した細胞培養液に、５００μｌのHuman Serum AB（コスモバイオ社製、品番：832000027）と、抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ、中外製薬社製、製品名：Rituxan）を最終濃度で４０μｇ／ｍｌとなるように添加し、１６時間培養した。次いで、観察の３０分前に５００μｇ／ｍｌのDAPI染色液（Cellstein-DAPI solution、同仁化学社製、品番：D523）を５μｌずつ各々細胞に添加して保温した。ＣＤＣによる細胞の生死は、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、核がＤＡＰＩで染まっている（死細胞を示す）ことを指標に観察した。
b) Examination of the sensitivity of complement-dependent cytotoxic activity (CDC) of B lymphoma cells into which siRNA has been introduced 500 μl of Human Serum AB (manufactured by Cosmo Bio, product number: 832000027) was added to the cell culture medium observed in a). ) And an anti-CD20 antibody (Rituximab, manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., product name: Rituxan) were added to a final concentration of 40 μg / ml and cultured for 16 hours. Next, 500 μg / ml DAPI staining solution (Cellstein-DAPI solution, manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd., product number: D523) was added to each cell 30 minutes before the observation, and the cells were incubated. The life or death of cells by CDC was observed using a confocal laser microscope as an indicator that the nucleus was stained with DAPI (indicating dead cells).
（３）試験結果
本試験の結果を、図３及び図４に示す。図３は、各試料について、バーキットリンパ腫細胞中のＣＤ５５の発現、及び抗体医薬と補体による細胞傷害活性の結果（ＣＤＣ実施後のＤＡＰＩ染色細胞の割合を測定した結果）について示した図である。また図４に、ＣＤＣ実施後のＤＡＰＩ染色細胞の割合を測定した結果を示す。
(3) Test result The result of this test is shown in FIG.3 and FIG.4. FIG. 3 is a diagram showing the expression of CD55 in Burkitt lymphoma cells and the results of cytotoxic activity by antibody drugs and complement (results of measuring the ratio of DAPI-stained cells after CDC) for each sample. is there. FIG. 4 shows the results of measuring the ratio of DAPI-stained cells after CDC.
その結果、ＣＤ５５のＮ末端領域をコードする遺伝子配列に相補的な配列を有する２本鎖ＲＮＡから調製したｓｉＲＮＡを含む試験試料１をトランスフェクションしたバーキットリンパ腫細胞では、ＣＤ５５の発現が抑制されていることが確認された。また、ＣＤＣを実施した後、ＤＡＰＩによる染色を行った場合、試験試料１をトランスフェクションしたバーキットリンパ腫細胞は、ＤＡＰＩで染色される細胞（死細胞）が多い（６８．８％、ただし陰性試料は１１．１％）ことが確認され、抗体医薬のバーキットリンパ腫細胞に対する感受性が増加したことが明らかとなった。すなわち、抗体医薬である抗ＣＤ２０抗
体による細胞傷害活性が、試験試料１によって増強されることが明らかとなった。
As a result, CD55 expression was suppressed in Burkitt lymphoma cells transfected with test sample 1 containing siRNA prepared from double-stranded RNA having a sequence complementary to the gene sequence encoding the N-terminal region of CD55. It was confirmed that In addition, when staining with DAPI is carried out after CDC, Burkitt lymphoma cells transfected with test sample 1 have many cells (dead cells) stained with DAPI (68.8%, but negative samples) (11.1%), it was confirmed that the sensitivity of the antibody drug to Burkitt lymphoma cells was increased. That is, it was revealed that the cytotoxic activity of the anti-CD20 antibody, which is an antibody drug, is enhanced by the test sample 1.
〔実施例４〕
ｓｉＲＮＡによる乳癌細胞での補体制御因子の発現への影響と、抗体医薬による細胞傷害活性への効果を検討した。
Example 4
The effect of siRNA on the expression of complement regulatory factors in breast cancer cells and the effect of antibody drugs on cytotoxic activity were examined.
（１）試料の調製
実施例２と同様の方法により、試験試料１及び陰性試料を用いて細胞導入用試験試料１及び細胞導入用陰性試料を調製した。
(1) Preparation of sample By the method similar to Example 2, the test sample 1 for cell introduction | transduction and the negative sample for cell introduction | transduction were prepared using the test sample 1 and the negative sample.
（２）試験方法
ａ）２本鎖ＲＮＡの癌細胞への導入によるＣＤ５５発現の検討
ヒト乳癌細胞であるＳＫ−Ｂｒ３細胞（ATCC No.：HTB-30）を７．５％ウシ胎児血清並びにペニシリン及びストレプトマイシン（各１％）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を用いて懸濁した。グラスボトムマイクロウェルディッシュ（Glass Bottom Microwell Dishes、品番：P35G-0-14-C、MatTec Co.製）に２×１０5個／ディッシュとなるように細胞懸濁液を添加し、２４〜４８時間培養した後、前記細胞導入用試験試料１および細胞導入用陰性試料の全量を培養液に添加し、トランスフェクションを行った。２４時間、３７℃で保温した後、新鮮な培地に置換して、さらに４８時間、３７℃で培養した。各細胞は、ＦＩＴＣ標識の抗ＣＤ５５抗体（PharMingen社製、品番：555693）を用いて染色した。さらに、観察の３０分前にCellstein-DAPI solution（同仁化学社製、品番：D523）５００μｇ／ｍｌを５μｌずつ各々細胞に添加して保温した。各細胞は、共焦点レーザー顕微鏡（バイオラッド社製、Radiance 2100MP）を用いて観察した。
(2) Test method a) Examination of CD55 expression by introduction of double-stranded RNA into cancer cells Human breast cancer cells, SK-Br3 cells (ATCC No .: HTB-30), were treated with 7.5% fetal bovine serum and penicillin. And RPMI 1640 medium containing streptomycin (1% each). The cell suspension is added to a glass bottom microwell dish (Glass Bottom Microwell Dishes, product number: P35G-0-14-C, manufactured by MatTec Co.) at 2 × 10 5 cells / dish for 24 to 48 hours. After culturing, the whole amount of the cell introduction test sample 1 and the cell introduction negative sample was added to the culture solution, and transfection was performed. After incubating at 37 ° C. for 24 hours, the medium was replaced with fresh medium, and the cells were further cultured at 37 ° C. for 48 hours. Each cell was stained with a FITC-labeled anti-CD55 antibody (PharMingen, product number: 556993). Furthermore, 500 μg / ml of Cellstein-DAPI solution (manufactured by Dojindo Co., Ltd., product number: D523) was added to each cell 30 minutes before the observation, and the cells were incubated. Each cell was observed using a confocal laser microscope (Biorad, Radiance 2100MP).
前記で観察した細胞培養液に、５００μｌのHuman Serum AB（コスモバイオ社製、品番：832000027）と、抗ＨＥＲ２抗体（トラスツズマブ、日本ロシュ社製、製品名：Herceptin）を最終濃度で４０μｇ／ｍｌとなるように添加し、６時間培養した。次いで、観察の３０分前に５００μｇ／ｍｌのCellstein-DAPI solutionを５μｌずつ各々細胞に添加して保温した。ＣＤＣによる細胞の生死は、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、核がＤＡＰＩで染まっている（死細胞を示す）ことを指標に観察した。 To the cell culture medium observed above, 500 μl of Human Serum AB (manufactured by Cosmo Bio, product number: 832000027) and anti-HER2 antibody (trastuzumab, Nippon Roche, product name: Herceptin) at a final concentration of 40 μg / ml And added for 6 hours. Next, 5 μl of 500 μg / ml Cellstein-DAPI solution was added to each cell 30 minutes before observation and incubated. The life or death of cells by CDC was observed using a confocal laser microscope as an indicator that the nucleus was stained with DAPI (indicating dead cells).
（３）試験結果
本試験の結果は、図５に示すとおりである。図５は、各試料について、乳癌細胞中のＣＤ５５の発現、及び抗体医薬と補体による細胞傷害活性の結果（ＣＤＣ実施後のＤＡＰＩ染色細胞の割合を測定した結果）について示した図である。また図６に、ＣＤＣ実施後のＤＡＰＩ染色細胞の割合を測定した結果を示す。図中に示された時間は、各々、観察開始時を０時間としている。
(3) Test result The result of this test is as showing in FIG. FIG. 5 is a diagram showing the expression of CD55 in breast cancer cells and the results of cytotoxic activity by the antibody drug and complement (results of measuring the ratio of DAPI-stained cells after CDC) for each sample. FIG. 6 shows the results of measuring the ratio of DAPI-stained cells after CDC. Each time shown in the figure is 0 hours at the start of observation.
その結果、ＣＤ５５のＮ末端領域をコードする遺伝子配列に相補的な配列を有する２本鎖ＲＮＡから調製したｓｉＲＮＡを含む試験試料１をトランスフェクションした乳癌細胞では、ＣＤ５５の発現が抑制されていることが確認された。また、ＣＤＣを実施した後、ＤＡＰＩによる染色を行った場合、試験試料１をトランスフェクションした乳癌細胞は、ＤＡＰＩで染色される細胞（死細胞）が多い（約３７％）ことが確認され、抗体医薬の乳癌細胞に対する感受性が増加したことが明らかとなった。すなわち、抗体医薬である抗ＨＥＲ２抗体による細胞傷害活性が、試験試料１によって増強されることが明らかとなった。 As a result, CD55 expression is suppressed in breast cancer cells transfected with test sample 1 containing siRNA prepared from double-stranded RNA having a sequence complementary to the gene sequence encoding the N-terminal region of CD55. Was confirmed. In addition, when CDI was performed and staining with DAPI was performed, it was confirmed that breast cancer cells transfected with test sample 1 had many cells (dead cells) stained with DAPI (about 37%). It was revealed that the sensitivity of the drug to breast cancer cells was increased. That is, it was revealed that the cytotoxic activity of the anti-HER2 antibody that is an antibody drug is enhanced by the test sample 1.
本発明の抗体医薬の細胞傷害活性増強剤は、癌（特に悪性腫瘍）の抗体療法において、補体と抗体医薬による細胞傷害活性を増強することで、標的になる癌（悪性腫瘍）細胞を
効率よく殺傷することが可能である。また、特に抗体医薬に耐性を有する癌（悪性腫瘍）細胞に対して、補体と抗体医薬による細胞傷害活性をリカバリーする効果も兼ね備えているので、抗体療法の補助剤として利用することが可能である。
The antibody drug cytotoxicity enhancer of the present invention enhances the cytotoxic activity of a complement and an antibody drug in antibody therapy for cancer (particularly malignant tumor), thereby efficiently targeting cancer (malignant tumor) cells. It is possible to kill well. It also has the effect of recovering the cytotoxic activity of complement and antibody drugs, especially against cancer (malignant tumor) cells resistant to antibody drugs, and can be used as an adjuvant for antibody therapy. is there.
また、本発明の抗体医薬は、抗体医薬に耐性を持った悪性腫瘍が再発し、抗体医薬での治療が困難であると判断された患者に対しても継続して抗体医薬での治療を行いたいという要望に応えるものである。このことは、取りも直さず癌治療における抗体医薬耐性の克服への新規な道標を提供するものである。 In addition, the antibody drug of the present invention continues to be treated with an antibody drug even for patients whose malignant tumors resistant to the antibody drug have recurred and are difficult to treat with the antibody drug. It responds to the desire to want. This provides a new guide to overcoming antibody drug resistance in cancer therapy.
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