【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は血管新生療法および抗血管新生療法に有効な血管新生剤および抗血管新生剤を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アクチビン（activin）に結合性を有するタンパク質であるフォリスタチン（follistatin）は、下垂体培養細胞の濾胞刺激ホルモン（FSH）産生促進活性を指標に発見された（Esch, F.S. et al., Mol. Endocrinol.; 1(11):849-55 (1987)）。当初は、フォリスタチンがFSHの分泌を抑制したことから、FSHの分泌促進作用を有するアクチビンと逆作用を有するものと考えられていた。その後の研究により、アクチビンの特異的結合蛋白質であり、アクチビンに結合してアクチビン活性を抑制することが明らかとなっている（Nakamura, T. et.al., Science, 247(4944):836-8 (1990)）。生体内にはアクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢなど数種類のアクチビンが存在するが、フォリスタチンはこれらいずれのアクチビンに対しても阻害活性を示すことが知られている（Fukui, A. et al., Dev. Biol.; 159 (1): 131-139 (1993)、Sugino, H. et al., Seikagaku; 68(8): 1405-1428 (1996)）。
【０００３】
また、フォリスタチンは、それをコードする遺伝子が単離されており、アミノ酸配列も報告されている（WO89/01945、Shimasaki, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 85(12):4218-22 (1988)）。
【０００４】
アクチビンの薬理効果としては、前述のFSH分泌促進作用の他に、赤血球造血を促進すること、骨形成を促進すること、創傷治癒を促進することなどが報告されている。また、アクチビン阻害剤が、腎疾患治療効果を有することが知られている（特開2001-288111）。しかし、アクチビンが血管新生を促進する作用を有すること、すなわち血管新生剤として血管新生療法に対して有効であることについては知られていないばかりか、むしろ、血管新生を阻害する活性を有することが報告されている。
【０００５】
一方、フォリスタチンの薬理効果としては、前述のFSH分泌抑制作用の他に、局所投与によって肝臓の細胞増殖を促進することが知られている（Kogure, K. et al., Hepatology; 24(2):361-6 (1996)、Kojima, I., BIO Clonica; 883(12), 43-46 (1997)）。また、フォリスタチンの拮抗物質が、創傷および線維性障害に対して瘢痕形成が少ない治癒を促進すること（WO97/15321）、フォリスタチンが全身投与で赤血球造血を阻害することなどが報告されている。しかし、フォリスタチンが血管新生を抑制する作用（抗血管新生作用）を有すること、すなわち抗血管新生療法に対して有効であることについては知られていないばかりか、むしろ、血管新生を促進する活性を有することが報告されている。
【０００６】
血管新生療法に適用可能な血管新生剤としては、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、ＥＧＦ（上皮細胞成長因子）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）などに期待が寄せられているが、臨床治療効果には至っていない。一方の、抗血管新生療法に適用可能な抗血管新生剤としては、トロンボスポンジン、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロンα、βなどに期待が寄せられているが、やはり臨床治療効果には至っていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アクチビンの血管新生における作用の有無を詳細に検討し、さらにそのアクチビン作用に及ぼすフォリスタチンの作用の有無を詳細に検討し、血管新生療法および抗血管新生療法に有効な薬剤を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために検討を行った結果、アクチビンが血管内皮細胞の生存を維持し、増殖を促進する作用があることを見出した。更に、血管内皮細胞をコラーゲンゲル内で培養する血管新生（管腔形成）をアクチビンが促進することを見出した。そして、アクチビンが血管新生促進に関わっていることに着目し、その作用を抑制することによって血管新生を抑制させることができることを、フォリスタチンを用いて実証し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、アクチビン促進剤を有効成分として含有する血管新生剤である。
さらに本発明は、アクチビン促進剤がアクチビンである前記血管新生剤を提供する。
また本発明は、血管内皮増殖因子とともに投与される前記血管新生剤を提供する。
さらに本発明は、アクチビン阻害剤を有効成分として含有する抗血管新生剤を提供する。
また本発明は、アクチビン作用が関与する血管新生病の治療に用いられる前記抗血管新生剤を提供する。
さらに本発明は、アクチビン阻害剤がフォリスタチンである前記抗血管新生剤を提供する。
また本発明は、前記血管新生剤及び抗血管新生剤からなる血管新生調節剤を提供する。
【００１０】
血管新生は、促進因子と抑制因子とが相互にバランスよく作用することによって調節されていると考えられている。血管新生にはいくつかの因子の関与が明らかになっており、促進因子としては血管内皮増殖因子（VEGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（b-FGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、上皮細胞増殖因子（EGF）、アンジオポエチンなどが、抑制因子としてはトロンボスポンジン、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロンα、βなどが知られている。またケモカインの中では、促進作用を示すものと、抑制作用を示すものとが存在すること、などが明らかになっている。
【００１１】
血管は全身組織に血液を輸送するための重要な構造体であり、血管系の異常は様々な病変に密接に関わり、その発症と進展の原因となっている。多くの場合、成長後の生体では血管新生は病態の進展、増悪時に関わるといわれる。例えば、慢性関節リウマチ、癌、尋常性乾癬などの病態には血管新生の促進が関与していると考えられており、血管新生抑制（抗血管新生）が上記血管新生病の病態改善につながると期待される。
【００１２】
他方、下肢血管閉塞症などの虚血性疾患などでは逆に血管新生促進が病態改善につながると期待されている。特に、糖尿病に関しては血管新生がしばしば問題となり、糖尿病性網膜症は過剰な血管新生が原因の一つと考えられるが、逆に、糖尿病患者の四肢などの虚血部位では血管新生が低下していることが指摘されている。以上のように、血管新生の異常は多くに疾患の発症や進展に関わっていることから、その抑制剤もしくは促進剤が有効な治療法として有望視されている。
【００１３】
血管新生剤は、血管新生を促進するための血管新生療法として、虚血性疾患、粥状動脈硬化症、閉塞性動脈硬化症、下肢血管閉塞症、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、難治性皮膚潰瘍など、血管新生の促進が病態の改善につながる疾患の予防や治療や、膵島再生を介した糖尿病の予防や治療などに用いることができる。一方、抗血管新生剤は、過剰な血管新生を阻止するための抗血管新生療法として、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、慢性関節リウマチ、癌、尋常性乾癬などの血管新生の亢進が病態の発症や進展に関わっている疾患、いわゆる血管新生病の予防や治療に用いることができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
血管新生の評価方法としてよく用いられているウシ血管内皮細胞をコラーゲンゲル内で培養する実験系にアクチビンを添加したところ、明瞭なキャピラリーネットワーク（管腔形成）が観察された。すなわちアクチビンが血管新生作用を有することが明らかになったわけであるが、発明者が知る限り初めての発見である。この実験系にＶＥＧＦを添加すると、アクチビンと同等の血管新生作用が観察され、今までに報告されているＶＥＧＦ作用が確認された。アクチビンとＶＥＧＦとを同時に添加すると、驚くことに、それぞれを単独で添加した場合よりも更に顕著な血管新生作用を示すことがわかった。
【００１５】
アクチビンとＶＥＧＦの作用は相互に影響を及ぼすことが考えられたことから、この点に関して更に詳細に検討を加えた。血管内皮細胞におけるＶＥＧＦとＶＥＧＦレセプター遺伝子（Ｆｌｔ−１遺伝子、Ｆｌｋ−１遺伝子）の発現を調べたところ、その発現量がアクチビンを添加した後で増加することがわかった。つまり、アクチビンは血管内皮細胞のＶＥＧＦとＶＥＧＦレセプター発現を増加させる。次に、血管内皮細胞におけるアクチビン遺伝子（インヒビンβＡ遺伝子）の発現を調べたところ、その発現量がＶＥＧＦを添加した後で増加することがわかった。つまり、ＶＥＧＦは血管内皮細胞のアクチビン発現を増加させる。以上のことから、血管内皮細胞におけるＶＥＧＦの血管新生作用は、内因性アクチビンがオートクリン因子として関わることによって引き起こされていることが明らかとなった。
【００１６】
そこで、血管内皮細胞で内因性に発現しているアクチビンの作用を抑制する目的で、アクチビンの特異的結合蛋白質であり、アクチビン活性を阻害することが知られているフォリスタチンを用いて更に検討した。血管内皮細胞の管腔形成を観察する実験系で、ＶＥＧＦの血管新生促進作用はフォリスタチンを同時に添加することで著しく減弱することがわかった。当然ながら、アクチビンの血管新生作用はフォリスタチンで抑制された。
【００１７】
以上の結果、アクチビンは単独で血管新生を促進すること、また、アクチビンとＶＥＧＦの併用により更に強力な血管新生が促進されることがはじめて明らかになった。さらに、フォリスタチンが血管新生を強力に抑制することがはじめて明らかになった。このことは、アクチビンもしくはフォリスタチンをそのまま用いて血管新生剤もしくは抗血管新生剤として応用可能なこと、アクチビン促進剤もしくはアクチビン阻害剤を用いても同様に血管新生剤もしくは抗血管新生剤として応用可能なこと、さらにこれらの血管新生剤及び抗血管新生剤を用いて血管新生を調節することが可能なことを示している。
【００１８】
本発明の血管新生剤は、アクチビン促進剤を有効成分として含有する。本発明において「アクチビン促進剤」とは、アクチビンが持つ生理的機能を亢進させるもの意味し、アクチビンの生理的機能を促進するものであってもよいし、アクチビン自体の産生を促進するものであってもよい。また、アクチビンがアクチビン受容体に結合することによって生じるシグナル伝達を促進するものであってもよい。
【００１９】
本発明の抗血管新生剤は、アクチビン阻害剤を有効成分として含有する。本発明において「アクチビン阻害剤」とは、アクチビンが持つ生理的機能を低下又は消失させるもの意味し、アクチビンに直接結合してアクチビンの生理的機能を阻害するものであってもよいし、アクチビン自体の産生を阻害するものであってもよい。また、アクチビンがアクチビン受容体に結合することによって生じるシグナル伝達を阻害するものであってもよい。
【００２０】
アクチビン阻害剤として具体的には、フォリスタチン、抗アクチビン抗体、アクチビン受容体の阻害剤もしくは抗アクチビン受容体抗体、アクチビン受容体に関連するシグナル伝達系の阻害剤、アクチビン産生阻害剤等が挙げられる。アクチビン受容体の阻害剤としては、アクチビン受容体をブロックし、アクチビンとフォリスタチンとの結合を阻害するフォリスタチンと類似の構造を有するタンパク質又は化合物が挙げられる。また、アクチビン産生阻害剤としては、アクチビン遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム等が挙げられる。
【００２１】
アクチビン促進剤の作用は、アクチビンの存在下及び非存在下でアクチビンの活性を測定することによって調べることができる。アクチビンの活性は、赤芽球細胞に対する分化誘導作用（ＥＤＦアッセイ：Eto,Y.et.al., Biochem. Biophys. Res. Commun.; 142(3):1095-103(1987)）あるいは下垂体細胞に対する卵胞刺激ホルモン分泌促進作用などを指標としたインビトロ試験で測定できる。
【００２２】
同様に、アクチビン阻害剤の作用は、アクチビン阻害剤の存在下及び非存在下でアクチビンの活性を測定することによって調べることができる。アクチビンの活性は、赤芽球細胞に対する分化誘導作用（ＥＤＦアッセイ）あるいは下垂体細胞に対する卵胞刺激ホルモン分泌促進作用などを指標としたインビトロ試験で測定できる。
【００２３】
次に、アクチビン阻害剤の例として、フォリスタチンについて説明する。本発明においては、フォリスタチンの種類や起源の如何にかかわらず、アクチビン阻害作用を有する限りは本発明の効果が得られる。例えば、アクチビン阻害作用を有する限り、ヒト−フォリスタチンのみならず、ブタ等の動物由来のフォリスタチンであってもよく、また、天然型フォリスタチンであっても、組換え型フォリスタチンであってもよい。
【００２４】
フォリスタチンは、ペプチド部分の分子量が３〜４万の糖蛋白質で、アミノ酸残基数が３１５個、３０３個、２８８個など異なること、及び、糖鎖付加の部位や数が異なることが知られている。また、それ以外の構造変化を有する場合でも、アクチビンとの結合能を有し、アクチビン結合蛋白質として同等のアクチビン阻害活性が保持されている限り、本発明の効果が得られる。
【００２５】
天然型のフォリスタチンは、動物の臓器、たとえば卵巣から抽出した後、精製工程を経て調製される。また、組換え型のフォリスタチンは、ヒトもしくは動物のフォリスタチンcDNAを適当な発現ベクターに組み込んで適当な動物細胞に遺伝子導入し、この細胞の培養液から精製工程を経て調製される。
【００２６】
組換えフォリスタチンは、フォリスタチンをコードするＤＮＡを用いて、通常の組換え技術による異種タンパク質の製造法にしたがって調製することができる。フォリスタチンをコードするＤＮＡ及び同ＤＮＡを用いて組換えフォリスタチンを製造する方法は、WO89/01945に開示されている。後記実施例では、３１５アミノ酸からなるヒトフォリスタチンに対応するcDNAを組み込んだＣＨＯ細胞の培養液より精製したものを使用した。
【００２７】
本発明の血管新生剤は、アクチビン等のアクチビン促進剤単独又はアクチビン促進剤と製剤用添加物とを含む医薬用組成物の形態の医薬として提供される。アクチビン促進剤は単独で用いてもよく、また、複数種のアクチビン促進剤を併用してもよい。また、アクチビン促進剤とともに、ＶＥＧＦのような他の血管新生剤を配合してもよい。
【００２８】
本発明の抗血管新生剤は、フォリスタチン等のアクチビン阻害剤単独又はアクチビン阻害剤と製剤用添加物とを含む医薬用組成物の形態の医薬として提供される。アクチビン阻害剤は単独で用いてもよく、また、複数種のアクチビン阻害剤を併用してもよい。また、アクチビン阻害剤とともに、抗ＶＥＧＦ抗体のような他の抗血管新生剤を配合してもよい。
【００２９】
上記血管新生剤と抗血管新生剤を組み合わせることにより、血管新生調節剤が構成される。
本発明の血管新生剤および抗血管新生剤の剤型としては、注射剤、舌下剤、経皮パップ剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、シロップ剤、座薬、軟膏剤、点眼剤等が挙げられる。これらのうちでは、注射剤、舌下剤、経皮パップ剤が好ましい。また、剤型に応じて、製剤上許容される賦形剤、例えば、乳糖、バレイショデンプン、炭酸カルシウム、又はアルギン酸ナトリウム等を配剤してもよい。さらに、通常製剤に用いるその他の材料、例えば血清アルブミン等の蛋白質、緩衝作用、浸透圧調整のための塩、担体、賦型剤等の成分を配合しても良い。注射剤の場合には、溶媒として注射用蒸留水、生理食塩水、リンゲル液等が使用され、これに分散剤を添加してもよい。本発明の血管新生剤の投与量としては、アクチビンを用いる場合においては、患者の年齢、症状等により異なるが、一般には静脈投与では成人１人１日当り、アクチビンの量として、０．１μg／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、好ましくは、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲が挙げられる。また、本発明の抗血管新生剤の投与量としては、アクチビン阻害剤としてフォリスタチンを用いる場合においては、患者の年齢、症状等により異なるが、一般には静脈投与では成人１人１日当り、フォリスタチンの量として、０．１μg／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、好ましくは、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲が挙げられる。
【００３０】
本発明の血管新生剤は、虚血性疾患の治療、予防に有用であるが、このような疾患としては、例えば、下肢血管閉塞症、などを挙げることができるが、これらに限定されることはなく、広く適用される。本発明の抗血管新生剤は、血管新生病の治療、予防に有用であるが、このような疾患としてはアクチビン作用が関与すると考えられる糖尿病性網膜症や癌などを挙げることができるが、これらに限定されることはなく、広く適用される。
【００３１】
また、糖尿病のように、症状に応じて血管新生の促進又は抑制が必要となることがあるが、このような疾患には本発明の血管新生調節剤が有用である。すなわち、血管新生を促進させる必要がある場合には血管新生促進剤を、血管新生を抑制させる必要がある場合には血管新生抑制剤を投与する。また、一方を全身投与し、他方を局所投与することもできる。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３３】
【実施例１】 組換えフォリスタチンの製造
文献（Onomichi,K.et.al., J Biochem (Tokyo); 2(1):123-31(1987)）記載の方法を用いて、文献（Shimasaki,S. et.al., Proc Natl Acad Sci U S A;85(12):4218-22(1988)）記載のヒトフォリスタチンcDNAを動物細胞発現ベクターに組み込み、図１に示すプラスミドpSD(X)/Folを作製した。pSD(X)/Folを、文献（Murata,et.al., Biochem. Biophys. Res. Commun.; 151(1):230-5(1988)）の方法でCHO-DHFR欠損細胞（チャイニーズハムスターオバリー細胞ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株）にリン酸カルシウム法を用いて遺伝子導入した。０．１μＭのMTX（メソトレキセート）を含有する選択培地中で２週間培養した後、新鮮培地に交換して更に１週間培養を継続して耐性細胞を取得した。この細胞を０．５μＭのMTXを含有する選択培地中に移し、耐性細胞を取得し、以下MTX濃度を段階的に増加させて同様な操作を繰り返し、最終的に４０μＭのMTX耐性細胞を得た。
【００３４】
この細胞よりシングルセル分離法を用いてクローン分離を行った後、アクチビン中和活性を指標にフォリスタチン産生量を測定した。アクチビン活性はEDFアッセイを用いて行い、文献（Eto,Y.et.al., Biochem. Biophys. Res. Commun.; 142(3):1095-103(1987)）記載の方法で調製した５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（ＥＤＦ）の活性に対する阻害活性を判定した。最も高い産生量を示したクローンを選別し、ローラーボトルを用いて培養し、培養液約１０Ｌを得た。限外ろ過膜（ミリポア社製ＭＷ５０００cut-off）で５倍濃縮した後、５０％ ＰＢＳで平衡化したヘパリンカラム（７０ｍｌベッド容積）にチャージした。５０％ ＰＢＳで洗浄した後、１．５ＭのＮａＣｌを含有する５０％ ＰＢＳで溶出し、ＵＶモニターで蛋白溶出部分を分取した。このうち１／５量をＨＰＬＣ（YMC Pack S-10 834/20mm）を用いて、アセトニトリル濃度勾配で分離溶出した。図２に溶出パターンを示した。矢印で示した部分を分取し、凍結乾燥した後、少量の蒸留水に溶解し、精製フォリスタチンを得た。精製フォリスタチンの蛋白量はＨＰＬＣ吸光度より算出した。図３に精製フォリスタチンのアクチビン阻害活性を示した。
【００３５】
【実施例２】 血管新生の評価
＜１＞方法
細胞培養は以下のように行った。ウシ大動脈血管内皮細胞（大日本製薬製）を１０％ウシ胎児血清（ギブコ／ＢＲＬ製）を含有するＤ−ＭＥＭ培地（ギブコ／ＢＲＬ製）を用いて、５％ＣＯ2存在下３７Ｃで、３〜４日間毎に培地交換を行いながら培養した。
【００３６】
血管新生アッセイは以下のように行った。ウシ大動脈血管内皮細胞を１ｘ１０6／ｍｌの細胞密度で中性コラーゲン溶液（コーケン製）に懸濁して２４ウェルプレートに播種し、３７Ｃ保温にした。コラーゲンがゲル状になったのを確認してから、上記培地を添加し、試験物質も同時に添加した。３〜４日間毎に培地交換を行いながら培養し、顕微鏡写真を撮像した。
【００３７】
ＲＴ−ＰＣＲは以下のように行った。ウシ大動脈血管内皮細胞の全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社製）を用いて抽出した。全ＲＮＡよりＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ製）を用いて１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡを作製し、染色体ＤＮＡをＤＮａｓｅで除去した。この全ＲＮＡのうち５μを１μｌのｏｌｉｇｏ ｄＴと７０Ｃで１０分間反応させ、２μｌの１０倍ＰＣＲ緩衝液、１μｌのＤＴＴ（０．１Ｍ）、２μｌのｄＮＴＰ混合液（１０ｍＭ）、２μｌのＭｇＣｌ2（２５ｍＭ）を加え、４２Ｃで５分間反応させ、１μｌのリバーストランスクリプターゼを加えた。この混合物を４２Ｃで５０分間、続いて７０Ｃで１５分間反応させ、１μｌのＲＮａｓｅ Ｈを加えて３７Ｃで２０分間反応させた。ＰＣＲは添付プロトコール（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）に従い、後述のプライマーを用いて行った。反応液は５μｌの１０倍ＰＣＲ緩衝液、２μｌのＭｇＣｌ2（５０ｍＭ）、１μｌのｄＮＴＰ混合液、１μｌの３’プライマー、１μｌの５’プライマー、０．５μｌのＴａｑポリメラーゼ、１μｌのｃＤＮＡを混合し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、９４Ｃで５分間の後、後述するサイクル数について、９４Ｃで３０秒間、５３Ｃもしくは５４Ｃもしくは５６Ｃもしくは６３Ｃで３０秒間、７２Ｃで９０秒間、最終回は７２Ｃで１０分間反応させた。ＧＡＰＤＨの遺伝子発現レベルが一定であることを確認し、ｃＤＮＡを含まない反応を陰性対照とした。
【００３８】
ウェスタンブロット解析は以下のように行った。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に懸濁し、１００Ｃで１０分間加熱した。遠心分離して得た上清について蛋白測定キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて蛋白濃度を測定し、２０μｇの蛋白を含む上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に用いた。電気泳動後のゲルをＰＶＤＦ膜（日本ミリポア社）に電気ブロットした後、５％ＢＳＡと０．１％ＮａＮ3を含むトリス生理食塩緩衝液中に３７Ｃで１時間保温した。引き続き、一次抗体と一夜反応させ、トリス生理食塩リン酸緩衝液で洗浄した後、ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ標識した二次抗体と室温で１時間反応させ、トリス生理食塩リン酸緩衝液で洗浄してからＥＣＬTM Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ社）を用いてＸ線フィルムに露光した。
【００３９】
複製欠如組換えアデノウィルスベクターは以下のものを用いた。Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｔｙｐｅ II アクチビン受容体（ｔＡＲII）ｃＤＮＡを組込んだアデノウィルスベクターであるＡｄｅｘｔＡＲII（Ichikawa,T.,et.al., Hepatology; 34: 918-925 (2001)）、Ｅ．ｃｏｌｉ βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）ｃＤＮＡを組込んだアデノウィルスベクターであるＡｄｅｘＬａｃＺ（Ichikawa,T.,et.al., Hepatology; 34: 918-925 (2001)）。
【００４０】
インビトロトランスフェクションは以下のように行った。血清欠乏状態に単層培養したウシ大動脈血管内皮細胞に後述する比率（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）のＡｄｅｘｔＡＲIIもしくはＡｄｅｘＬａｃＺを３７Ｃ、２時間で感染させ、血清不含培地で２４時間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、トリプシン処理で細胞を回収し、コラーゲンゲルの血管新生アッセイに用いた。
【００４１】
βガラクトシダーゼ活性の検出は以下のように行った。前述のようにウシ大動脈血管内皮細胞にＡｄｅｘＬａｃＺを感染させて３日間培養し、０．２５％ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅで５分間、ＰＢＳで３回洗浄した後、染色溶液で３７Ｃ、３時間反応させた。染色溶液として、１ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）、１ｍＭのＭｇＣｌ2、３ｍＭのＫ3Ｆｅ（ＣＮ）、３ｍＭのＫ4Ｆｅ（ＣＮ）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭのＫＣｌを含有する１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を用いた。βガラクトシダーゼ活性は青色色素の形成で判定した。
【００４２】
コラーゲンゲルの切片の作製は以下のように行った。血管新生アッセイに用いたコラーゲンゲルを４％のホルマリンＰＢＳ溶液で固定し、エタノールで洗浄した後、パラフィン抱埋した。４μｍの厚さの切片を作製し、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色した。
【００４３】
キャピラリーネットワーク形成の測定は以下のように行った。５日間培養後のキャピラリー構造を位相差顕微鏡を用いて観察し、更に、５０コロニーについてチューブの長さを画像解析ソフトウェア（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ）を用いて計測し、定量的に評価した。
統計学的有意性はスチューデントのｔ検定を用いて検定し、Ｐ値が０．０５未満を有意と判断した。
実験結果を以下に述べる。
【００４４】
＜２＞アクチビンの血管新生作用及びフォリスタチンの抗血管新生作用
ウシ大動脈血管内皮細胞のコラーゲンゲルを用いた血管新生アッセイにおいてアクチビンは単独で血管新生促進作用を示し、また、ＶＥＧＦと共存下でその作用が増強されることが明らかとなった。図４は培養７日目の顕微鏡写真であるが、無添加（Ａ）に対し。１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ単独添加（Ｂ）では明瞭なキャピラリーネットワークが確認され、ＶＥＧＦの血管新生活性が確認された。４ｎＭのアクチビン単独添加（Ｃ）ではＶＥＧＦ単独添加と同等の活性が認められ、両者同時添加（Ｄ）ではより強い活性が認められた。また、４ｎＭアクチビン添加実験でコラーゲンゲルの切片を作製してＨＥ染色を施したところ管腔構造の形成（Ｅ）が確かめられた。更に、図５に示すように、画像解析ソフトウェアを用いて定量的に評価したところ、顕微鏡観察を支持する結果が得られた。
【００４５】
次に、ＶＥＧＦとアクチビンとの相互作用を調べるために、アクチビンに対する中和活性を有するフォリスタチンを用いて検討した。コラーゲンゲル培養７日目の顕微鏡写真を図６に示すように、無添加（Ａ）に対して、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ添加（Ｂ）で認められる血管新生活性が、１０ｎＭのフォリスタチン同時添加（Ｃ）で消失することがわかった。以上より、アクチビンは単独で血管新生を促進すること、アクチビンとＶＥＧＦとの相乗作用もしくは相加作用があること、ＶＥＧＦの血管新生促進作用はフォリスタチンによって抑制されることがわかった。すなわちＶＥＧＦの作用にはアクチビンが必須であることが示された。
【００４６】
ＶＥＧＦとアクチビンとの相互作用については、Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ａｃｔｉｖｉｎ ｔｙｐｅ II ｒｅｃｅｐｔｏｒを用いた実験でも確認された。はじめに、ウシ大動脈血管内皮細胞に対するアデノウィルスベクターのＭ．Ｏ．Ｉ．をＡｄｅｘＬａｃＺを用いてＬａｃＺの発現を指標に調べたところ、至適Ｍ．Ｏ．Ｉ．が１０と求まった。この条件で、ＡｄｅｘｔＡＲIIをウシ大動脈血管内皮細に感染させ、血管新生アッセイを行った結果を図７に示した。コントロールのＡｄｅｘＬａｃＺ感染細胞では、無添加（Ａ）に対して１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ添加（Ｂ）でキャピラリーネットワークが確認された。一方、ＡｄｅｘｔＡＲII感染細胞では、無添加（Ｃ）、ＶＥＧＦ添加（Ｄ）ともキャピラリーネットワークは確認されなかった。Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ａｃｔｉｖｉｎ ｔｙｐｅ II ｒｅｃｅｐｔｏｒの強制発現は内因性アクチビン作用を打ち消す効果があることから、フォリスタチンを用いた検討結果と同様に、ＶＥＧＦの血管新生作用にはアクチビンが必須であることが示された。
【００４７】
＜３＞アクチビンとＶＥＧＦの血管新生相互作用
アクチビンとＶＥＧＦの血管新生相互作用の分子機構を推測する目的で以下の検討を行った。ウシ大動脈血管内皮細胞に４ｎＭのアクチビンを作用させ、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体であるＦｌｔ−１、Ｆｌｋ−１の発現量変化をウェスタンブロット法を用いて調べた。図８に示すように、アクチビン作用によってウシ大動脈血管内皮細胞のＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体の蛋白発現が亢進していることがわかった。この時、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体の遺伝子発現が亢進していることも、ＲＴ−ＰＣＲ法により確かめられた。ＲＴ−ＰＣＲは、下記のプライマーを用い、実施例２に記述した方法に従い、３０サイクル行った。同様に、ウシ大動脈血管内皮細胞に１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを作用させ、アクチビンの発現量変化をウェスタンブロット法を用いて調べた。図９に示すように、ＶＥＧＦ作用によってウシ大動脈血管内皮細胞のアクチビン（アクチビンβＡサブユニット）の蛋白発現が亢進していることがわかった。この時、アクチビン遺伝子（インヒビンβＡ遺伝子）発現が亢進していることも、ＲＴ−ＰＣＲ法により確かめられた。ＲＴ−ＰＣＲは、下記のプライマーを用い、実施例２に記述した方法に従い、３０サイクル行った。以上の結果、血管内皮細胞にいて、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、アクチビンは相互に影響を及ぼし、血管新生を促進していることが推測された。
【００４８】
（βA用プライマー）
5'-TATCGGAGAAGGTGGTGGATGC-3'（配列番号１）
5'-GTCATTCCAGCCAAATGTCCTTG-3'（配列番号２）
【００４９】
（VEGF用プライマー）
5'-TGAGTTCATTTTCAAGCCGTCC-3'（配列番号３）
5'-TGTCACAGTTCCCACAGGACTAATC-3'（配列番号４）
【００５０】
（Flt-1用プライマー）
5'-TATAGCACCAAGAGCGACGTGTG-3'（配列番号５）
5'-ATGGCGTTGAGCGGAATGTAGTC-3'（配列番号６）
【００５１】
（Flk-1用プライマー）
5'-TGGCGTCTTCTGTTAAGATGCTCAC-3'（配列番号７）
5'-GGAAATTCTGTTACCATCAGGTGC-3'（配列番号８）
【００５２】
（GAPDH用プライマー）
5'-AACAACACCCTCAAGATTGTCAGC-3'（配列番号９）
5'-TCGAAGGTAGAAGAGTTGAGTATCGC-3'（配列番号１０）
【００５３】
【発明の効果】
本発明により、新規な血管新生剤および抗血管新生剤が提供される。
【００５４】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.）
<120> 血管新生剤および抗血管新生剤
<130> P-9896
<141> 2002-05-10
<160> 10
<170> PatentIn Ver. 2.0
【００５５】
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for beta A
<400> 1
tatcggagaa ggtggtggat gc 22
【００５６】
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for beta A
<400> 2
gtcattccag ccaaatgtcc ttg 23
【００５７】
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for VEGF
<400> 3
tgagttcatt ttcaagccgt cc 22
【００５８】
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for VEGF
<400> 4
tgtcacagtt cccacaggac taatc 25
【００５９】
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for Flt-1
<400> 5
tatagcacca agagcgacgt gtg 23
【００６０】
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for Flt-1
<400> 6
atggcgttga gcggaatgta gtc 23
【００６１】
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for Flk-1
<400> 7
tggcgtcttc tgttaagatg ctcac 25
【００６２】
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for Flk-1
<400> 8
ggaaattctg ttaccatcag gtgc 24
【００６３】
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for GAPDH
<400> 9
aacaacaccc tcaagattgt cagc 24
【００６４】
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for GAPDH
<400> 10
tcgaaggtag aagagttgag tatcgc 26
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトフォリスタチンｃDNA発現ベクターの構造を示す図。
【図２】 ＨＰＬＣを用いたフォリスタチンの精製を示す図。縦軸は吸光度（ＯＤ280）、横軸は溶出時間（分）を示す。矢印で示す部分に組換え型ヒトフォリスタチンが溶出された。
【図３】 精製フォリスタチンによるアクチビン阻害活性を示す図。ＥＤＦアッセイを用いて、５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡに対する阻害活性を測定した。縦軸はＥＤＦ活性を、横軸はフォリスタチン濃度を示す。各群ｎ＝６。
【図４】 アクチビンによる血管新生促進を示す図。ウシ大動脈血管内皮細胞をコラーゲンゲルで培養し、７日目に顕微鏡観察した。無添加（Ａ）、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ添加（Ｂ）、４ｎＭのアクチビン添加（Ｃ）、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦおよび４ｎＭのアクチビン添加（Ｄ）。４ｎＭのアクチビン添加実験のパラフィン抱埋切片をＨＥ染色した（Ｅ）。
【図５】 アクチビンによる血管新生促進を定量的に示す図。ウシ大動脈血管内皮細胞をコラーゲンゲルで培養し、５日目に５０コロニーについて顕微鏡観察観察し画像解析ソフトウェアを用いて計測した。縦軸は、Ｔｕｂｅ ｌｅｎｇｔｈ（Ａ）、Ｔｕｂｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｂ）。＊はコントロールに対してＰ＜０．０５で有意。
【図６】 ＶＥＧＦによる血管新生促進に及ぼすフォリスタチンの抑制作用を示す図。ウシ大動脈血管内皮細胞をコラーゲンゲルで培養し、７日目に顕微鏡観察した。無添加（Ａ）、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ添加（Ｂ）、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦおよび１０ｎＭのフォリスタチン添加（Ｃ）。
【図７】 ＶＥＧＦによる血管新生促進に及ぼすＴｒｕｎｃａｔｅｄ ａｃｔｉｖｉｎ ｔｙｐｅ II ｒｅｃｅｐｔｏｒの抑制作用を示す図。ＡｄｅｘＬａｃＺ（Ａ、Ｂ）及びＡｄｅｘｔＡＲII（Ｃ、Ｄ）をトランスフェクションしたウシ大動脈血管内皮細胞をコラーゲンゲルで培養し、７日目に顕微鏡観察した。無添加（Ａ、Ｃ）、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ添加（Ｂ、Ｄ）。
【図８】 血管内皮細胞のＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体の発現に及ぼすアクチビンの影響を示す図。ウシ大動脈血管内皮細胞を４ｎＭのアクチビン存在下で０〜３６時間培養し、ウェスタンブロット法でＶＥＧＦ（Ａ）、Ｆｌｔ−１（Ｂ）、Ｆｌｋ−１（Ｂ）を測定した。
【図９】 血管内皮細胞のアクチビンの発現に及ぼすＶＥＧＦの影響を示す図。ウシ大動脈血管内皮細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ存在下で０〜３６時間培養し、ウェスタンブロット法でアクチビン量（βＡサブユニット）を測定した。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention provides an angiogenic agent and an anti-angiogenic agent effective for angiogenic therapy and anti-angiogenic therapy.
[0002]
[Prior art]
Follistatin, a protein that binds to activin, was discovered based on the activity of promoting follicle-stimulating hormone (FSH) production in cultured pituitary cells (Esch, FS et al., Mol. Endocrinol) .; 1 (11): 849-55 (1987)). Initially, follistatin inhibited FSH secretion, and was thought to have an opposite effect to activin, which has FSH secretion promoting action. Subsequent studies have revealed that it is a specific binding protein of activin and binds to activin to suppress activin activity (Nakamura, T. et.al., Science, 247 (4944): 836- 8 (1990)). There are several types of activins such as activin A, activin AB, and activin B in vivo, and follistatin is known to exhibit inhibitory activity against any of these activins (Fukui, A. et al. , Dev. Biol .; 159 (1): 131-139 (1993), Sugino, H. et al., Seikagaku; 68 (8): 1405-1428 (1996)).
[0003]
In addition, for follistatin, the gene encoding it has been isolated and the amino acid sequence has been reported (WO89 / 01945, Shimazaki, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 85 (12): 4218-22 (1988)).
[0004]
As a pharmacological effect of activin, in addition to the aforementioned FSH secretion promoting action, it has been reported that erythropoiesis is promoted, bone formation is promoted, wound healing is promoted, and the like. In addition, activin inhibitors are known to have a therapeutic effect on renal diseases (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-288111). However, it is not known that activin has an action to promote angiogenesis, that is, it is effective as an angiogenesis agent for angiogenesis therapy, but rather has an activity to inhibit angiogenesis. It has been reported.
[0005]
On the other hand, the pharmacological effect of follistatin is known to promote liver cell proliferation by local administration in addition to the aforementioned FSH secretion inhibitory action (Kogure, K. et al., Hepatology; 24 (2 ): 361-6 (1996), Kojima, I., BIO Clonica; 883 (12), 43-46 (1997)). It has also been reported that follistatin antagonists promote healing with less scar formation for wounds and fibrotic disorders (WO97 / 15321), and follistatin inhibits erythropoiesis with systemic administration . However, it is not known that follistatin has an angiogenesis-inhibiting action (anti-angiogenic action), that is, it is effective for anti-angiogenic therapy, but rather an activity that promotes angiogenesis. It has been reported to have
[0006]
Angiogenic agents applicable to angiogenesis therapy include vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (b-FGF), EGF (epidermal growth factor), platelet derived growth factor (PDGF), Expectations are expected for hepatocyte growth factor (HGF), but it has not achieved clinical therapeutic effects. On the other hand, thrombospondin, angiostatin, endostatin, interferon α, β, etc. are expected as anti-angiogenic agents applicable to anti-angiogenic therapy, but they are still not clinically effective. .
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention examines in detail whether activin has an effect on angiogenesis, further examines in detail the effect of follistatin on activin action, and provides a drug effective for angiogenesis therapy and anti-angiogenesis therapy. The task is to do.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of investigations to solve the above problems, the present inventor has found that activin has an action of maintaining the survival of vascular endothelial cells and promoting proliferation. Furthermore, it was found that activin promotes angiogenesis (luminal formation) in which vascular endothelial cells are cultured in collagen gel. Then, focusing on the fact that activin is involved in promoting angiogenesis, it was demonstrated using follistatin that angiogenesis can be suppressed by suppressing its action, and the present invention has been completed.
[0009]
That is, the present invention is an angiogenic agent containing an activin promoter as an active ingredient.
Furthermore, the present invention provides the angiogenic agent, wherein the activin promoter is activin.
The present invention also provides the angiogenic agent administered together with vascular endothelial growth factor.
Furthermore, the present invention provides an anti-angiogenic agent containing an activin inhibitor as an active ingredient.
The present invention also provides the anti-angiogenic agent used in the treatment of angiogenic diseases involving activin action.
Furthermore, the present invention provides the anti-angiogenic agent, wherein the activin inhibitor is follistatin.
The present invention also provides an angiogenesis regulator comprising the angiogenesis agent and the anti-angiogenesis agent.
[0010]
It is thought that angiogenesis is regulated by promoting factors and inhibitory factors acting in a balanced manner. Several factors have been shown to be involved in angiogenesis, including vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (b-FGF), platelet-derived growth factor (PDGF), Hepatocyte growth factor (HGF), epidermal growth factor (EGF), angiopoietin and the like are known, and thrombospondin, angiostatin, endostatin, interferon α, β and the like are known as suppressors. In addition, it has been clarified that chemokines have a promoting action and a suppressing action.
[0011]
Blood vessels are important structures for transporting blood to whole body tissues, and abnormalities in the vasculature are closely related to various lesions, causing their onset and progression. In many cases, it is said that angiogenesis is involved in the progress or worsening of a disease state in a living organism after growth. For example, the pathogenesis of rheumatoid arthritis, cancer, psoriasis vulgaris is considered to be related to the promotion of angiogenesis, and the suppression of angiogenesis (anti-angiogenesis) leads to the improvement of the above angiogenic diseases Be expected.
[0012]
On the other hand, in an ischemic disease such as vascular occlusion of the lower limb, it is expected that the promotion of angiogenesis leads to improvement of the pathological condition. In particular, angiogenesis is often a problem for diabetes, and diabetic retinopathy is thought to be caused by excessive angiogenesis, but conversely, angiogenesis is reduced at ischemic sites such as the extremities of diabetic patients. It has been pointed out. As described above, abnormalities in angiogenesis are mostly related to the onset and progression of diseases, and therefore their inhibitors or promoters are promising as effective treatments.
[0013]
Angiogenic agents are angiogenic therapies to promote angiogenesis, including ischemic disease, atherosclerosis, obstructive arteriosclerosis, limb vascular occlusion, myocardial infarction, angina, cerebral infarction, refractory It can be used for the prevention and treatment of diseases such as skin ulcers where the promotion of angiogenesis leads to the improvement of the disease state, and the prevention and treatment of diabetes through islet regeneration. On the other hand, anti-angiogenic agents are used as anti-angiogenic therapies to prevent excessive angiogenesis. It can be used for the prevention and treatment of diseases related to the onset and progression of pathological conditions, so-called angiogenic diseases.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
When activin was added to an experimental system in which bovine vascular endothelial cells, which are often used as a method for evaluating angiogenesis, were cultured in a collagen gel, a clear capillary network (luminal formation) was observed. In other words, it has been clarified that activin has an angiogenic action, but it is the first discovery as far as the inventors know. When VEGF was added to this experimental system, an angiogenic action equivalent to activin was observed, and the VEGF action reported so far was confirmed. Surprisingly, it was found that when activin and VEGF were added at the same time, they exhibited a more prominent angiogenic effect than when each was added alone.
[0015]
Since the actions of activin and VEGF were considered to influence each other, this point was examined in further detail. When the expression of VEGF and VEGF receptor genes (Flt-1 gene, Flk-1 gene) in vascular endothelial cells was examined, it was found that the expression level increased after activin was added. That is, activin increases VEGF and VEGF receptor expression in vascular endothelial cells. Next, when the expression of the activin gene (inhibin βA gene) in vascular endothelial cells was examined, it was found that the expression level increased after VEGF was added. That is, VEGF increases activin expression in vascular endothelial cells. From the above, it has been clarified that the angiogenic action of VEGF in vascular endothelial cells is caused by the involvement of endogenous activin as an autocrine factor.
[0016]
Therefore, for the purpose of suppressing the action of activin endogenously expressed in vascular endothelial cells, we further investigated using follistatin, which is a specific binding protein of activin and known to inhibit activin activity. . In an experimental system for observing the formation of lumens of vascular endothelial cells, it was found that the pro-angiogenic action of VEGF was significantly attenuated by the simultaneous addition of follistatin. Of course, the angiogenic effect of activin was suppressed by follistatin.
[0017]
As a result, it was revealed for the first time that activin alone promotes angiogenesis, and that a combination of activin and VEGF promotes more potent angiogenesis. Furthermore, it has been revealed for the first time that follistatin strongly suppresses angiogenesis. This means that activin or follistatin can be used as is as an angiogenesis agent or anti-angiogenesis agent, and even if an activin promoter or activin inhibitor is used, it can be applied as an angiogenesis agent or anti-angiogenesis agent. Furthermore, it has been shown that angiogenesis can be regulated using these angiogenic agents and anti-angiogenic agents.
[0018]
The angiogenic agent of the present invention contains an activin promoter as an active ingredient. In the present invention, “activin promoter” means a substance that enhances the physiological function of activin, may promote the physiological function of activin, or promotes the production of activin itself. May be. Further, it may be one that promotes signal transduction caused by binding of activin to an activin receptor.
[0019]
The anti-angiogenic agent of the present invention contains an activin inhibitor as an active ingredient. In the present invention, the term “activin inhibitor” means a substance that reduces or eliminates the physiological function of activin, and may be one that directly binds to activin to inhibit the physiological function of activin, or activin itself. It may be one that inhibits the production of. Moreover, the signal transduction produced by activin binding to the activin receptor may be inhibited.
[0020]
Specific examples of the activin inhibitor include follistatin, anti-activin antibody, activin receptor inhibitor or anti-activin receptor antibody, inhibitor of signal transduction system related to activin receptor, activin production inhibitor, etc. . Activin receptor inhibitors include proteins or compounds having a structure similar to follistatin that blocks activin receptor and inhibits the binding of activin to follistatin. Examples of the activin production inhibitor include antisense DNA, RNAi, ribozyme and the like for the activin gene.
[0021]
The action of an activin promoter can be examined by measuring the activity of activin in the presence and absence of activin. The activity of activin is induced by differentiation on erythroblasts (EDF assay: Eto, Y. et.al., Biochem. Biophys. Res. Commun .; 142 (3): 1095-103 (1987)) or pituitary gland. It can be measured by an in vitro test using an index of promoting follicle stimulating hormone secretion on cells.
[0022]
Similarly, the action of an activin inhibitor can be examined by measuring the activity of activin in the presence and absence of an activin inhibitor. The activity of activin can be measured by an in vitro test using as an index the differentiation-inducing action (EDF assay) on erythroblasts or the follicle-stimulating hormone secretion promoting action on pituitary cells.
[0023]
Next, follistatin will be described as an example of an activin inhibitor. In the present invention, the effect of the present invention can be obtained as long as it has an activin inhibitory action regardless of the type and origin of follistatin. For example, as long as it has an activin inhibitory effect, it may be not only human-follistatin but also follistatin derived from animals such as pigs, and it may be natural follistatin or recombinant follistatin. Also good.
[0024]
Follistatin is a glycoprotein having a peptide part with a molecular weight of 30,000 to 40,000. It is known that the number of amino acid residues is 315, 303, 288, etc., and the site and number of glycosylation are different. ing. Moreover, even when it has other structural changes, the effect of the present invention can be obtained as long as it has the ability to bind to activin and retains the same activin inhibitory activity as the activin-binding protein.
[0025]
Natural follistatin is extracted from an animal organ, such as the ovary, and then prepared through a purification process. Recombinant follistatin is prepared by incorporating a human or animal follistatin cDNA into a suitable expression vector, introducing the gene into a suitable animal cell, and purifying it from the cell culture solution.
[0026]
Recombinant follistatin can be prepared using DNA encoding follistatin according to a method for producing a heterologous protein by an ordinary recombinant technique. WO89 / 01945 discloses a DNA encoding follistatin and a method for producing recombinant follistatin using the DNA. In the examples described later, those purified from a culture solution of CHO cells into which cDNA corresponding to human follistatin consisting of 315 amino acids was incorporated were used.
[0027]
The angiogenic agent of the present invention is provided as a medicament in the form of a pharmaceutical composition comprising an activin promoter alone such as activin or an activin promoter and a pharmaceutical additive. Activin promoters may be used alone, or multiple types of activin promoters may be used in combination. Moreover, you may mix | blend other angiogenic agents like VEGF with an activin promoter.
[0028]
The anti-angiogenic agent of the present invention is provided as a medicament in the form of a pharmaceutical composition comprising an activin inhibitor such as follistatin alone or an activin inhibitor and a pharmaceutical additive. Activin inhibitors may be used alone or in combination with a plurality of types of activin inhibitors. Moreover, you may mix | blend other anti-angiogenic agents like an anti- VEGF antibody with an activin inhibitor.
[0029]
An angiogenesis regulator is comprised by combining the said angiogenesis agent and an anti-angiogenesis agent.
Examples of the dosage form of the angiogenic agent and anti-angiogenic agent of the present invention include injections, sublingual agents, transdermal patches, tablets, capsules, fine granules, syrups, suppositories, ointments, eye drops and the like. It is done. Of these, injections, sublingual agents, and transdermal patches are preferred. Depending on the dosage form, a pharmaceutically acceptable excipient such as lactose, potato starch, calcium carbonate, or sodium alginate may be dispensed. Furthermore, other materials usually used for the preparation, for example, proteins such as serum albumin, buffering action, components for adjusting the osmotic pressure, carriers, excipients and the like may be added. In the case of an injection, distilled water for injection, physiological saline, Ringer's solution or the like is used as a solvent, and a dispersant may be added thereto. When activin is used, the dose of the angiogenic agent of the present invention varies depending on the age, symptoms, etc. of the patient, but generally, intravenous administration is 0.1 μg / kg as the amount of activin per day per adult. The range is from 10 mg / kg to 10 mg / kg, preferably from 1 μg / kg to 1 mg / kg. The dose of the anti-angiogenic agent of the present invention varies depending on the age, symptoms, etc. of the patient when follistatin is used as the activin inhibitor. Is in the range of 0.1 μg / kg to 10 mg / kg, preferably in the range of 1 μg / kg to 1 mg / kg.
[0030]
The angiogenic agent of the present invention is useful for the treatment and prevention of ischemic diseases. Examples of such diseases include, but are not limited to, leg vascular occlusion. Not widely applied. The anti-angiogenic agent of the present invention is useful for the treatment and prevention of angiogenic diseases. Examples of such diseases include diabetic retinopathy and cancer which are considered to be associated with activin action. It is not limited to and is widely applied.
[0031]
In addition, as in diabetes, it may be necessary to promote or suppress angiogenesis depending on the symptoms. The angiogenesis regulator of the present invention is useful for such diseases. That is, when it is necessary to promote angiogenesis, an angiogenesis promoter is administered, and when it is necessary to inhibit angiogenesis, an angiogenesis inhibitor is administered. Alternatively, one can be administered systemically and the other can be administered locally.
[0032]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
[0033]
Example 1 Production of recombinant follistatin
Using the method described in the literature (Onomichi, K. et.al., J Biochem (Tokyo); 2 (1): 123-31 (1987)), the literature (Shimasaki, S. et.al., Proc Natl Acad Sci USA; 85 (12): 4218-22 (1988)) was incorporated into an animal cell expression vector to produce the plasmid pSD (X) / Fol shown in FIG. pSD (X) / Fol was prepared by the method of literature (Murata, et.al., Biochem. Biophys. Res. Commun .; 151 (1): 230-5 (1988)). The gene was introduced into the cell dihydrofolate reductase-deficient strain) using the calcium phosphate method. After culturing in a selective medium containing 0.1 μM MTX (methotrexate) for 2 weeks, the medium was replaced with a fresh medium, and the culture was further continued for 1 week to obtain resistant cells. The cells were transferred into a selective medium containing 0.5 μM MTX to obtain resistant cells, and thereafter the same operation was repeated by gradually increasing the MTX concentration to obtain 40 μM MTX resistant cells. .
[0034]
Clone separation was performed from these cells using a single cell separation method, and then follistatin production was measured using activin neutralizing activity as an index. Activin activity was performed using an EDF assay, and was prepared by the method described in the literature (Eto, Y. et.al., Biochem. Biophys. Res. Commun .; 142 (3): 1095-103 (1987)). The inhibitory activity against the activity of ml of activin A (EDF) was determined. A clone showing the highest production amount was selected and cultured using a roller bottle to obtain about 10 L of a culture solution. The solution was concentrated 5 times with an ultrafiltration membrane (MW5000 cut-off manufactured by Millipore) and then charged to a heparin column (70 ml bed volume) equilibrated with 50% PBS. After washing with 50% PBS, elution was performed with 50% PBS containing 1.5 M NaCl, and the protein elution portion was fractionated with a UV monitor. Of this, 1/5 amount was separated and eluted with an acetonitrile concentration gradient using HPLC (YMC Pack S-10 834/20 mm). The elution pattern is shown in FIG. The portion indicated by the arrow was collected, lyophilized, and then dissolved in a small amount of distilled water to obtain purified follistatin. The protein content of purified follistatin was calculated from the HPLC absorbance. FIG. 3 shows the activin inhibitory activity of purified follistatin.
[0035]
[Example 2] Evaluation of angiogenesis
<1> Method
Cell culture was performed as follows. Bovine aortic vascular endothelial cells (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) were treated with 5% CO using D-MEM medium (Gibco / BRL) containing 10% fetal bovine serum (Gibco / BRL). 2 In the presence of 37C, the cells were cultured while changing the medium every 3 to 4 days.
[0036]
The angiogenesis assay was performed as follows. 1 x 10 bovine aortic vascular endothelial cells 6 The cells were suspended in a neutral collagen solution (manufactured by Koken) at a cell density of / ml and seeded in a 24-well plate, and kept at 37C. After confirming that the collagen was gelled, the medium was added, and the test substance was also added simultaneously. Culture was performed every 3 to 4 days while changing the medium, and micrographs were taken.
[0037]
RT-PCR was performed as follows. Total RNA of bovine aortic vascular endothelial cells was extracted using Trizol Reagent (Gibco / BRL). 1st-strand DNA was prepared from the total RNA using Superscript Preamplification System (Gibco / BRL), and chromosomal DNA was removed with DNase. 5 μ of this total RNA was reacted with 1 μl of oligo dT for 10 minutes at 70 C, 2 μl of 10 × PCR buffer, 1 μl of DTT (0.1 M), 2 μl of dNTP mixture (10 mM), 2 μl of MgCl 2 (25 mM) was added, reacted at 42 C for 5 minutes, and 1 μl of reverse transcriptase was added. This mixture was reacted at 42C for 50 minutes, followed by 70C for 15 minutes, and 1 μl of RNase H was added and reacted at 37C for 20 minutes. PCR was performed according to the attached protocol (Perkin-Elmer) using the primers described below. The reaction was 5 μl 10 × PCR buffer, 2 μl MgCl 2 (50 mM) Mix 1 μl dNTP mix, 1 μl 3 ′ primer, 1 μl 5 ′ primer, 0.5 μl Taq polymerase, 1 μl cDNA and use Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler for 5 minutes at 94C Thereafter, the number of cycles described later was reacted at 94C for 30 seconds, 53C or 54C or 56C or 63C for 30 seconds, 72C for 90 seconds, and finally at 72C for 10 minutes. It was confirmed that the gene expression level of GAPDH was constant, and a reaction without cDNA was used as a negative control.
[0038]
Western blot analysis was performed as follows. The cells were washed 3 times with PBS, then suspended in Laemmli buffer and heated at 100 C for 10 minutes. The protein concentration of the supernatant obtained by centrifugation was measured using a protein measurement kit (Bio-Rad Laboratories), and the supernatant containing 20 μg of protein was used for SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The electrophoretic gel was electroblotted onto a PVDF membrane (Nippon Millipore), then 5% BSA and 0.1% NaN Three Incubated in Tris physiological saline buffer containing for 1 hour at 37C. Subsequently, after reacting overnight with the primary antibody, washing with Tris physiological saline phosphate buffer, reacting with secondary antibody labeled with peroxydase at room temperature for 1 hour, washing with Tris physiological saline phosphate buffer, and then ECL TM The X-ray film was exposed using Western blotting detection reagent (Amersham LIFE SCIENCE).
[0039]
The following replication-deficient recombinant adenovirus vectors were used. Truncated type II Activin Receptor (tARII) Adenoviral vector Integrated ARdex (Ichikawa, T., et.al., Hepatology; 34: 918-925 (2001)), E. dexLacZ (Ichikawa, T., et.al., Hepatology; 34: 918-925 (2001)), which is an adenovirus vector incorporating E. coli β-galactosidase (LacZ) cDNA.
[0040]
In vitro transfection was performed as follows. Bovine aortic vascular endothelial cells cultured in a monolayer in a serum-deficient state were infected with dexARII or dexLacZ at a ratio (MOI) described later at 37C for 2 hours and cultured in a serum-free medium for 24 hours. After washing with PBS, cells were collected by trypsin treatment and used for collagen gel angiogenesis assay.
[0041]
Detection of β-galactosidase activity was performed as follows. As described above, bovine aortic vascular endothelial cells were infected with dexLacZ and cultured for 3 days, washed with 0.25% glutaraldehyde for 5 minutes and with PBS three times, and then reacted with a staining solution at 37C for 3 hours. As a staining solution, 1 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-gal), 1 mM MgCl 2 3 mM K Three Fe (CN), 3 mM K Four A 100 mM sodium phosphate buffer containing Fe (CN), 0.1% Triton X-100, 10 mM KCl was used. β-galactosidase activity was determined by blue pigment formation.
[0042]
A collagen gel slice was prepared as follows. The collagen gel used in the angiogenesis assay was fixed with a 4% formalin PBS solution, washed with ethanol, and embedded in paraffin. Sections having a thickness of 4 μm were prepared and stained with hematoxylin-eosin (HE).
[0043]
The capillary network formation was measured as follows. The capillary structure after culturing for 5 days was observed using a phase-contrast microscope, and the tube length of 50 colonies was measured using image analysis software (NIH Image) and quantitatively evaluated.
Statistical significance was tested using Student's t test, and a P value of less than 0.05 was considered significant.
The experimental results are described below.
[0044]
<2> Angiogenic action of activin and antiangiogenic action of follistatin
In an angiogenesis assay using bovine aortic vascular endothelial cell collagen gel, activin alone showed an angiogenesis-promoting action, and the action was enhanced in the presence of VEGF. FIG. 4 is a photomicrograph on the seventh day of culture, but with no addition (A). When 100 ng / ml VEGF alone was added (B), a clear capillary network was confirmed, and the angiogenic activity of VEGF was confirmed. When 4 nM activin alone was added (C), activity equivalent to that of VEGF alone was observed, and when both were added simultaneously (D), stronger activity was observed. In addition, when a collagen gel slice was prepared in a 4 nM activin addition experiment and subjected to HE staining, formation of a luminal structure (E) was confirmed. Furthermore, as shown in FIG. 5, when quantitative evaluation was performed using image analysis software, a result supporting microscopic observation was obtained.
[0045]
Next, in order to investigate the interaction between VEGF and activin, follistatin having neutralizing activity against activin was examined. As shown in FIG. 6, a micrograph of collagen gel culture on the 7th day shows that the angiogenic activity observed when 100 ng / ml VEGF is added (B) is not added (A), and 10 nM follistatin is added simultaneously. It was found that it disappeared in (C). From the above, it was found that activin alone promotes angiogenesis, synergistic action or additive action of activin and VEGF, and that VEGF promotes angiogenesis is inhibited by follistatin. That is, it was shown that activin is essential for the action of VEGF.
[0046]
The interaction between VEGF and activin was also confirmed by an experiment using a truncated activated type II receptor. First, the adenovirus vector M. for bovine aortic vascular endothelial cells. O. I. Was analyzed using IndexLacZ as an indicator of LacZ expression. O. I. Was determined to be 10. FIG. 7 shows the result of performing angiogenesis assay by infecting bovine aortic vascular endothelium with this condition under the condition of ARRI. In the control dexLacZ-infected cells, a capillary network was confirmed when 100 ng / ml VEGF was added (B) with respect to no addition (A). On the other hand, no capillary network was confirmed in the case of ADDARII-infected cells in both the non-added (C) and VEGF added (D). Since forced expression of the truncated activated type II receptor has the effect of counteracting the endogenous activin action, it was shown that activin is essential for the angiogenic action of VEGF, similar to the results of studies using follistatin.
[0047]
<3> Angiogenic interaction between activin and VEGF
The following studies were conducted for the purpose of inferring the molecular mechanism of the angiogenic interaction between activin and VEGF. 4 nM activin was allowed to act on bovine aortic vascular endothelial cells, and changes in the expression levels of VEGF and VEGF receptors Flt-1 and Flk-1 were examined using Western blotting. As shown in FIG. 8, it was found that the protein expression of VEGF and VEGF receptor in bovine aortic vascular endothelial cells was enhanced by activin action. At this time, it was also confirmed by RT-PCR that gene expression of VEGF and VEGF receptor was enhanced. RT-PCR was performed for 30 cycles according to the method described in Example 2 using the following primers. Similarly, 100 ng / ml of VEGF was allowed to act on bovine aortic vascular endothelial cells, and changes in activin expression were examined using Western blotting. As shown in FIG. 9, it was found that the protein expression of activin (activin βA subunit) in bovine aortic vascular endothelial cells was enhanced by VEGF action. At this time, it was also confirmed by RT-PCR that the activin gene (inhibin βA gene) expression was increased. RT-PCR was performed for 30 cycles according to the method described in Example 2 using the following primers. From the above results, it was speculated that in vascular endothelial cells, VEGF, VEGF receptor, and activin affect each other and promote angiogenesis.
[0048]
(Primer for βA)
5'-TATCGGAGAAGGTGGTGGATGC-3 '(SEQ ID NO: 1)
5'-GTCATTCCAGCCAAATGTCCTTG-3 '(SEQ ID NO: 2)
[0049]
(Primer for VEGF)
5'-TGAGTTCATTTTCAAGCCGTCC-3 '(SEQ ID NO: 3)
5'-TGTCACAGTTCCCACAGGACTAATC-3 '(SEQ ID NO: 4)
[0050]
(Primer for Flt-1)
5'-TATAGCACCAAGAGCGACGTGTG-3 '(SEQ ID NO: 5)
5'-ATGGCGTTGAGCGGAATGTAGTC-3 '(SEQ ID NO: 6)
[0051]
(Primer for Flk-1)
5'-TGGCGTCTTCTGTTAAGATGCTCAC-3 '(SEQ ID NO: 7)
5'-GGAAATTCTGTTACCATCAGGTGC-3 '(SEQ ID NO: 8)
[0052]
(Primer for GAPDH)
5'-AACAACACCCTCAAGATTGTCAGC-3 '(SEQ ID NO: 9)
5'-TCGAAGGTAGAAGAGTTGAGTATCGC-3 '(SEQ ID NO: 10)
[0053]
【The invention's effect】
The present invention provides novel angiogenic and anti-angiogenic agents.
[0054]
[Sequence Listing]
SEQUENCE LISTING
<110> Ajinomoto Co., Inc.
<120> Angiogenic and antiangiogenic agents
<130> P-9896
<141> 2002-05-10
<160> 10
<170> PatentIn Ver. 2.0
[0055]
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for beta A
<400> 1
tatcggagaa ggtggtggat gc 22
[0056]
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for beta A
<400> 2
gtcattccag ccaaatgtcc ttg 23
[0057]
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for VEGF
<400> 3
tgagttcatt ttcaagccgt cc 22
[0058]
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for VEGF
<400> 4
tgtcacagtt cccacaggac taatc 25
[0059]
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for Flt-1
<400> 5
tatagcacca agagcgacgt gtg 23
[0060]
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for Flt-1
<400> 6
atggcgttga gcggaatgta gtc 23
[0061]
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for Flk-1
<400> 7
tggcgtcttc tgttaagatg ctcac 25
[0062]
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for Flk-1
<400> 8
ggaaattctg ttaccatcag gtgc 24
[0063]
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for GAPDH
<400> 9
aacaacaccc tcaagattgt cagc 24
[0064]
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer for GAPDH
<400> 10
tcgaaggtag aagagttgag tatcgc 26
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the structure of a human follistatin cDNA expression vector.
FIG. 2 shows the purification of follistatin using HPLC. The vertical axis represents absorbance (OD 280 ), The horizontal axis indicates the elution time (minutes). Recombinant human follistatin was eluted at the part indicated by the arrow.
FIG. 3 is a diagram showing activin inhibitory activity by purified follistatin. Inhibitory activity against 5 ng / ml of activin A was measured using an EDF assay. The vertical axis represents EDF activity, and the horizontal axis represents follistatin concentration. Each group n = 6.
FIG. 4 is a diagram showing angiogenesis promotion by activin. Bovine aortic vascular endothelial cells were cultured in collagen gel and observed on the 7th day under a microscope. No addition (A), 100 ng / ml VEGF added (B), 4 nM activin added (C), 100 ng / ml VEGF and 4 nM activin added (D). Paraffin-embedded sections from a 4 nM activin addition experiment were HE stained (E).
FIG. 5 is a view quantitatively showing angiogenesis promotion by activin. Bovine aortic vascular endothelial cells were cultured on a collagen gel, and on the fifth day, 50 colonies were observed with a microscope and counted using image analysis software. The vertical axis represents Tube length (A) and Tube structure (B). * Is significant at P <0.05 compared to control.
FIG. 6 is a diagram showing the inhibitory action of follistatin on angiogenesis promotion by VEGF. Bovine aortic vascular endothelial cells were cultured in collagen gel and observed on the 7th day under a microscope. No addition (A), 100 ng / ml VEGF added (B), 100 ng / ml VEGF and 10 nM follistatin added (C).
FIG. 7 is a graph showing the inhibitory action of truncated activated type II receptor on the promotion of angiogenesis by VEGF. Bovine aortic vascular endothelial cells transfected with AdexLacZ (A, B) and AdexARII (C, D) were cultured on a collagen gel and observed under a microscope on the seventh day. No addition (A, C), 100 ng / ml VEGF added (B, D).
FIG. 8 shows the effect of activin on the expression of VEGF and VEGF receptor in vascular endothelial cells. Bovine aortic vascular endothelial cells were cultured in the presence of 4 nM activin for 0 to 36 hours, and VEGF (A), Flt-1 (B), and Flk-1 (B) were measured by Western blotting.
FIG. 9 shows the influence of VEGF on activin expression in vascular endothelial cells. Bovine aortic vascular endothelial cells were cultured for 0 to 36 hours in the presence of 100 ng / ml of VEGF, and the amount of activin (βA subunit) was measured by Western blotting.
