JP2005315747A - Rev蛋白核外移行制御物質の新規アッセイ法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 HIV由来DNAを細胞にトランスフェクションさせ、その結果として発現する構成タンパク質p24をELISA法により定量することで、被検物質のRev核外移行阻害活性を評価する。その際、阻害率0%の細胞試料および阻害率100%の細胞試料を対照に使用して、両者との比較により被検物質のRev核外移行阻害活性を定量的に評価する。また、ルシフェラーゼ遺伝子をHIV由来DNAと同時に各細胞にトランスフェクションさせ、ルシフェラーゼ活性を基準に各細胞から抽出した粗タンパク液を希釈し、各希釈液においてp24の生成量を測定する。このようなアッセイ方法により、被検物質のRev核外移行阻害活性について良好な定量性と再現性を示す結果が得られた。
【選択図】 なし
Description
A) HIV由来DNAをトランスフェクション後、被検物質を投与した細胞について、所定のHIV構成タンパク質の発現量を測定し、この測定結果をもとに被検物質のRev核外移行阻害活性を定量的に評価することを特徴とする、Rev核外移行制御物質のアッセイ法。
B) 所定のHIV構成タンパク質として、p24の発現量を測定することを特徴とする、上記A)記載のアッセイ法。
C) ELISA法によってp24の発現量を測定することを特徴とする、上記B)記載のアッセイ法。
D) 宿主細胞においてRRE領域がRNAに転写され、かつ、Rev蛋白を発現させるHIV由来DNAがトランスフェクションされた第1群の細胞、宿主細胞においてRev蛋白を発現させないか、又は本来の機能を失ったRev蛋白を発現させるHIV由来DNAがトランスフェクションされた第2群の細胞、および、第1群の細胞と同じHIV由来DNAがトランスフェクションされた後、被検物質が投与された第3群の細胞、のそれぞれについて、所定のHIV構成タンパク質の発現量を測定し、この測定結果をもとに被検物質のRev核外移行阻害活性を定量的に評価することを特徴とする、Rev核外移行制御物質のアッセイ法。
E) 所定のHIV構成タンパク質として、p24の発現量を測定することを特徴とする、上記D)記載のアッセイ法。
F) ELISA法によってp24の発現量を測定することを特徴とする、上記E)記載のアッセイ法。
G) 第1群の細胞を阻害率0%、第2群の細胞を阻害率100%として、両者との比較により被検物質のRev核外移行阻害活性を定量的に評価することを特徴とする、上記D)記載のアッセイ法。
H) 各群の細胞に対して、HIV由来DNAに加えて外来遺伝子を導入し、この外来遺伝子の発現量に応じて各群の細胞からのタンパク質抽出液を希釈し、これら希釈液における所定のHIV構成タンパク質の発現量を測定することを特徴とする、上記G)記載のアッセイ法。
I) 外来遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を導入することを特徴とする、上記H)記載のアッセイ法。
J) HIV由来DNAおよび外来遺伝子をプラスミドにより細胞内導入し、さらにトランスフェクション量調整用のプラスミドを各群の細胞に導入することを特徴とする、上記H)又はI)記載のアッセイ法。
K) 上記A)〜J)のいずれかに記載のアッセイ法に使用されるアッセイ用キット。
L) 上記A)〜J)のいずれかに記載のアッセイ法に使用されるアッセイ用装置。
本発明は、前述のように、HIV由来DNAをトランスフェクション後、被検物質を投与した細胞について、所定のHIV構成タンパク質の発現量を測定し、この測定結果をもとに被検物質のRev核外移行阻害活性を定量的に評価する方法である。
以上説明した本発明のアッセイ法の具体例(実施例)として、次のようなアッセイ系を組み立てた。
HIV遺伝子(HIV由来DNA)を細胞にトランスフェクションさせ、その結果として発現する構成タンパク質p24をELISA法により定量することで、被検物質のRev核外移行阻害活性を評価する。その際、トランスフェクション効率をノーマライズする目的、および本アッセイ系のほかに一般的な転写、翻訳などのシステムを阻害していないことを確認する目的で、ルシフェラーゼ遺伝子をコードしたプラスミドを同時にトランスフェクションする。このようなアッセイ系により、Rev核外移行阻害物質として、ルシフェラーゼ活性を抑制せず、p24の産生を抑制する化合物を探索する。
具体的には以下の手順1〜7に従って、Rev核外移行阻害物質のアッセイを行った。
手順1: 培養HeLa細胞を、6ウエルプレート(well plate)に4×104 cells/3mL/well で播種し、37℃、5%CO2で培養し、21時間後に培地を新鮮なものに入れ替えた。
(1)pcRRE: HIV遺伝子よりpol領域を欠落(又は不活化)させたHIV由来DNAを導入したプラスミド
(2)pcRRE/Δrev: 上記プラスミドpcRREからRev蛋白をコードするrev遺伝子領域を欠落(又は不活化)させたプラスミド
(3)luc: ルシフェラーゼ遺伝子をコードし、その上流にRSVプロモーターを組み込んだプラスミド
(4)PUC12: トランスフェクションするDNA総量を調節するために使用されるプラスミド。一般的なクローニングベクターである。
そして、細胞をA群とB群とに分け、上記(1)〜(4)のプラスミドを適宜組み合わせて、各群の細胞に対してトランスフェクションを行った。具体的には、A群の細胞に対して、pcRRE、lucおよびPUC12を、また、B群の細胞に対してはコントロールとして、pcRRE/Δrev、lucおよびPUC12をトランスフェクションさせた。
次に、新鮮な培地に入れ替え、A群を被検物質投与群と非投与群とに分け、投与群の細胞に対して、DMSO終濃度1%となるように被検物質のDMSO溶液を添加した。他方、A群の非投与群およびB群の細胞に対してはDMSOのみを添加した。
また、各群の粗タンパク液の希釈は、ルシフェラーゼ活性が各群一定の値になるように、次のように行った。例えば、ルシフェラーゼ活性10,000 RLU/10μLに合わせて希釈する場合、A群の活性:25,000 RLU/10μL、B群の活性:500,000 RLU/10μL、C群の活性:125,000 RLU/10μLであれば、それぞれA群:2.5倍、B群:50倍、C群:12.5倍に希釈した粗タンパク液を用いてp24の発現量を評価した。
本発明のアッセイ法をキット化し、あるいはアッセイ用装置とすることが可能である。キット化する場合、上記実施例で使用した各プラスミドのほか、各種試薬、酵素、バッファー、抗体、培地成分などをキットに含めることができ、さらにプレートなどの器具と組み合わせてアッセイ用装置とすることができる。
Claims (12)
- HIV由来DNAをトランスフェクション後、被検物質を投与した細胞について、所定のHIV構成タンパク質の発現量を測定し、この測定結果をもとに被検物質のRev核外移行阻害活性を定量的に評価することを特徴とする、Rev核外移行制御物質のアッセイ法。
- 所定のHIV構成タンパク質として、p24の発現量を測定することを特徴とする、請求項1記載のアッセイ法。
- ELISA法によってp24の発現量を測定することを特徴とする、請求項2記載のアッセイ法。
- 宿主細胞においてRRE領域がRNAに転写され、かつ、Rev蛋白を発現させるHIV由来DNAがトランスフェクションされた第1群の細胞、
宿主細胞においてRev蛋白を発現させないか、又は本来の機能を失ったRev蛋白を発現させるHIV由来DNAがトランスフェクションされた第2群の細胞、および、
第1群の細胞と同じHIV由来DNAがトランスフェクションされた後、被検物質が投与された第3群の細胞、のそれぞれについて、所定のHIV構成タンパク質の発現量を測定し、この測定結果をもとに被検物質のRev核外移行阻害活性を定量的に評価することを特徴とする、Rev核外移行制御物質のアッセイ法。 - 所定のHIV構成タンパク質として、p24の発現量を測定することを特徴とする、請求項4記載のアッセイ法。
- ELISA法によってp24の発現量を測定することを特徴とする、請求項5記載のアッセイ法。
- 第1群の細胞を阻害率0%、第2群の細胞を阻害率100%として、両者との比較により被検物質のRev核外移行阻害活性を定量的に評価することを特徴とする、請求項4記載のアッセイ法。
- 各群の細胞に対して、HIV由来DNAに加えて外来遺伝子を導入し、この外来遺伝子の発現量に応じて各群の細胞からのタンパク質抽出液を希釈し、これら希釈液における所定のHIV構成タンパク質の発現量を測定することを特徴とする、請求項7記載のアッセイ法。
- 外来遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を導入することを特徴とする、請求項8記載のアッセイ法。
- HIV由来DNAおよび外来遺伝子をプラスミドにより細胞内導入し、さらにトランスフェクション量調整用のプラスミドを各群の細胞に導入することを特徴とする、請求項8又は9記載のアッセイ法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のアッセイ法に使用されるアッセイ用キット。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のアッセイ法に使用されるアッセイ用装置。
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JP2004134589A JP2005315747A (ja) | 2004-04-28 | 2004-04-28 | Rev蛋白核外移行制御物質の新規アッセイ法 |
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US8706049B2 (en) | 2008-12-31 | 2014-04-22 | Intel Corporation | Platform integrated phased array transmit/receive module |
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2004
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US8706049B2 (en) | 2008-12-31 | 2014-04-22 | Intel Corporation | Platform integrated phased array transmit/receive module |
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