JP2005315688A - Tag for oxidation-damaged protein analysis and detection method of oxidation-damaged protein using the tag - Google Patents

Tag for oxidation-damaged protein analysis and detection method of oxidation-damaged protein using the tag Download PDF

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JP2005315688A JP2004133054A JP2004133054A JP2005315688A JP 2005315688 A JP2005315688 A JP 2005315688A JP 2004133054 A JP2004133054 A JP 2004133054A JP 2004133054 A JP2004133054 A JP 2004133054A JP 2005315688 A JP2005315688 A JP 2005315688A
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Yoshio Kodera
義男 小寺
Tadakazu Maeda
忠計 前田
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an inexpensive and easily-manufacturable tag for oxidation-damaged protein analysis which is effective to detection and quantification of the oxidation-damaged protein in a living body and determination of an oxidation-damaged portion, and an analysis method of the oxidation-damaged protein using the tag for analysis. <P>SOLUTION: This tag for oxidation-damaged protein analysis comprising an affinity peptide tag and at least one residue Z having a reaction group Z is shown by the following expression (1): (His)l-(X-His)m-(X)n-(Y)p-Z (1) (In the expression, X is an optional amino acid excluding histidine or an amino acid derivative, Y is a linker, l is 0 or 1, m is an integer in the range of 4-100, n is 0 or 1, and p is 0 or 1). <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、生体内で酸化傷害を受けたタンパク質の検出、定量、精製、及び酸化傷害部位の確定に用いる酸化傷害タンパク質解析用タグ、及び該タグを用いる解析方法に関するものである。   The present invention relates to a tag for oxidative damage protein analysis used for detection, quantification, purification, and determination of an oxidative damage site in a living body, and an analysis method using the tag.

日本人の死因のトップを占めるガン、心臓病、脳卒中、糖尿病、及び老人性痴呆症などの疾病に、活性酸素が何らかの形で関与しているといわれている。特に、タンパク質のアルギニン残基、リジン残基、プロリン残基、及びスレオニン残基が活性酸素により酸化傷害を受け、様々な疾病を引き起こす原因となることが報告されているが、その分子的機序は明らかにされていない部分が多い。その理由は、酸化傷害タンパク質を検出し、定量、及び酸化傷害部位の確定を行うための有効な方法がないためである。   It is said that active oxygen is somehow involved in diseases such as cancer, heart disease, stroke, diabetes, and senile dementia, which are the leading cause of death in Japan. In particular, it has been reported that arginine, lysine, proline, and threonine residues of proteins are oxidatively damaged by active oxygen and cause various diseases. There are many unexplained parts. This is because there is no effective method for detecting oxidatively damaged proteins, quantifying, and determining oxidatively damaged sites.

従来、生体組織・細胞中に存在する微量のタンパク質の収集は、標的タンパク質をビオチン化し、そのビオチンとアビジンとの親和性を利用する方法により行われてきた (特許文献1、及び特許文献2)。しかし、タンパク質の可溶化剤、変性剤などが存在すると、ビオチンとアビジンとの親和性がなくなるため、該方法は酸化傷害タンパク質の解析には使用できないという問題があった。また、この方法は未反応ビオチンの除去が困難であり、標的タンパク質との分離が難しいという問題もあった。   Conventionally, collection of a trace amount of protein present in a living tissue / cell has been performed by a method of biotinylating a target protein and utilizing the affinity between the biotin and avidin (Patent Documents 1 and 2) . However, in the presence of protein solubilizers, denaturants, etc., the affinity between biotin and avidin is lost, and this method cannot be used for analysis of oxidatively damaged proteins. In addition, this method has a problem that it is difficult to remove unreacted biotin and it is difficult to separate it from the target protein.

また、従来標的タンパク質の検出、同定、又は定量は、ヒスチジンタグ (His-Tag) を利用する方法により行われてきた。例えば、安定同位体で標識されたヒスチジンタグに、チオール基と結合する2,2-ジピリジルジスルフィド基を導入することにより、システインを含むペプチドの検出、同定、及び定量する方法である (非特許文献1)。また、該ヒスチジンタグは、疾病組織と健常組織とに含まれるシステイン残基を網羅的に定量比較するためにも使用できる。しかし、細胞外でヒスチジンタグを合成する場合、HisとHisとをペプチド結合させる反応の効率が非常に低く、その製造が困難、かつコストが高いという問題があった。   Conventionally, detection, identification or quantification of a target protein has been performed by a method using a histidine tag (His-Tag). For example, a method for detecting, identifying, and quantifying peptides containing cysteine by introducing a 2,2-dipyridyl disulfide group that binds to a thiol group into a histidine tag labeled with a stable isotope (Non-Patent Document) 1). The histidine tag can also be used for comprehensive quantitative comparison of cysteine residues contained in diseased tissues and healthy tissues. However, when synthesizing a histidine tag outside the cell, there is a problem that the efficiency of the reaction of peptide bonding between His and His is very low, the production thereof is difficult, and the cost is high.

このように、前記方法により、生体組織・細胞中のタンパク質を検出、定量、又は同定することができるが、タグの製造や使用対象には制限があり、酸化傷害タンパク質を検出、精製、及び酸化傷害部位の確定を行う有効な方法にはなり得なかった。このため、酸化傷害タンパク質を効果的に解析ができる方法、及び機能性タグが求められていた。
特表平０９−５０５７９９ 特開平０９−５４０９４ Josper V. Olsenらの論文, Mol. Cell Proteomics. 2004, Jan;3(1):82-92. Epub, 2003 As described above, proteins in living tissues / cells can be detected, quantified, or identified by the above-described method. However, there are limitations on the manufacture and use of tags, and oxidative damage proteins are detected, purified, and oxidized It could not be an effective method for determining the site of injury. For this reason, the method and functional tag which can analyze an oxidative damage protein effectively were calculated | required.
Special table 09-505799 JP 09-54094 A Josper V. Olsen et al., Mol. Cell Proteomics. 2004, Jan; 3 (1): 82-92. Epub, 2003

本発明は、生体内で酸化傷害を受けたタンパク質の検出、精製、定量、及び酸化傷害部位の確定に効果的であり、かつ製造が容易で、価格が安い、酸化傷害タンパク質解析用タグ (TOP; Tags for Oxidized Proteins)、及び該タグを用いる酸化傷害タンパク質の解析方法を提供することを目的とする。   INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is effective for detection, purification, quantification, and determination of oxidative damage sites in vivo, and is easy to manufacture and inexpensive. Tags for Oxidized Proteins) and an object of the present invention is to provide a method for analyzing oxidatively damaged proteins using the tag.

前記課題を解決するため、本発明者らは研究を行った。その結果、ヒスチジンとアミノ酸とを組み合わせて形成したタグが、キレート化されたNi2+などの金属イオンと高い親和性を有し、従来知られているヒスチジンタグと同様、親和性ペプチドタグとして、用いることができることを見出した。そして、タンパク質中の酸化傷害部位と結合する反応基と、酸化傷害タンパク質を精製・濃縮するための親和性ペプチドタグとをリンカーでつないだ酸化傷害タンパク質解析用タグ (TOP; Tags for Oxidized Proteins) を用いることにより、酸化傷害タンパク質の検出、精製、定量、及び酸化傷害部位の確定が効果的に行えるという知見を得た。本発明は、かかる知見に基づきなされたものである。 In order to solve the above problems, the present inventors have conducted research. As a result, a tag formed by combining histidine and an amino acid has a high affinity with a chelated metal ion such as Ni 2+, and as a conventionally known histidine tag, as an affinity peptide tag, It was found that it can be used. Tags for Oxidized Proteins (TOP) that connect reactive groups that bind to oxidative damage sites in proteins and affinity peptide tags to purify and concentrate oxidative damage proteins with a linker As a result, it was found that the use of oxidative damage protein enables effective detection, purification, quantification, and determination of oxidative damage site. The present invention has been made based on such findings.

したがって、本発明は、親和性ペプチドタグ、リンカー、及び反応基を有する少なくとも１つの残基Zからなる酸化傷害タンパク質解析用タグであって、該親和性ペプチドが少なくとも３個、好ましくは４又は５個以上の(X-His)単位を有し、かつXは任意のアミノ酸、またはアミノ酸誘導体である酸化傷害タンパク質解析用タグを提供する。   Therefore, the present invention is an oxidative damage protein analysis tag comprising at least one residue Z having an affinity peptide tag, a linker, and a reactive group, wherein the affinity peptide is at least 3, preferably 4 or 5 Provided is an oxidatively damaged protein analysis tag having at least one (X-His) unit, and X is any amino acid or amino acid derivative.

また、本発明は、親和性ペプチドタグ、及び反応基を有する少なくとも１つの残基Zを含み、かつ下記式(1)で表される酸化傷害タンパク質解析用タグを提供する。
(His)l-(X-His)m-(X)n-(Y)p-Z (1)
(式中、Xはヒスチジンをのぞく任意のアミノ酸、又はアミノ酸誘導体であり、Yはリンカーであり、lは0又は1、mは4〜100の整数、nは0、又は1かつpは0、または1である。)
さらに、本発明は、前記解析用タグを含む、酸化傷害タンパク質解析用キット、及び酸化傷害タンパク質精製用キットを含む。 The present invention also provides an affinity peptide tag and a tag for analyzing oxidative damage protein, which includes at least one residue Z having a reactive group and represented by the following formula (1).
(His) l- (X-His) m- (X) n- (Y) pZ (1)
(Wherein X is any amino acid except histidine, or an amino acid derivative, Y is a linker, l is 0 or 1, m is an integer of 4 to 100, n is 0, or 1 and p is 0. Or 1.
Furthermore, the present invention includes a kit for analyzing oxidative damage protein and a kit for purifying oxidative damage protein including the analysis tag.

さらに、本発明は、前記解析用タグを、酸化傷害タンパク質を含む試料と混合し、該混合物を、該解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属イオンを保持する担体と接触させ、次いで、該担体から該酸化傷害タンパク質、または酸化傷害タンパク質と該解析用タグとの複合体を回収することを特徴とする、酸化傷害タンパク質の検出方法を提供する。   Furthermore, the present invention comprises mixing the analytical tag with a sample containing an oxidative damage protein, contacting the mixture with a carrier holding a metal ion that binds to the affinity peptide tag of the analytical tag, Provided is a method for detecting an oxidatively damaged protein, comprising recovering the oxidatively damaged protein or a complex of the oxidatively damaged protein and the tag for analysis from the carrier.

さらに、本発明は、親和性タグ、又はリンカーYに蛍光試薬、RI試薬などの検出部位を付加した解析用タグを、酸化傷害タンパク質を含む試料と混合し、該混合物を、該親和性ペプチドタグと結合する金属イオンを保持する担体と接触させ、次いで、該担体から該解析用タグを回収することにより、試料中に存在する微量酸化傷害タンパク質を濃縮し、高感度に検出する方法を提供する。   Furthermore, the present invention mixes an affinity tag or an analysis tag in which a detection site such as a fluorescent reagent or RI reagent is added to the linker Y with a sample containing an oxidative damage protein, and the mixture is mixed with the affinity peptide tag. Provided is a method for concentrating a small amount of oxidative damage protein present in a sample and detecting it with high sensitivity by contacting with a carrier holding a metal ion that binds to the carrier and then collecting the analytical tag from the carrier. .

さらに、本発明は、前記解析用タグを、酸化傷害タンパク質を含む試料と混合し、該混合物を、該解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、次いで、該担体から該酸化傷害タンパク質、又は酸化傷害タンパク質と該解析用タグとの複合体を回収することを特徴とする、酸化傷害タンパク質の精製方法を提供する。   Furthermore, the present invention comprises mixing the analytical tag with a sample containing an oxidative damage protein, contacting the mixture with a carrier holding a metal atom that binds to the affinity peptide tag of the analytical tag, Provided is a method for purifying an oxidative damage protein, comprising recovering the oxidative damage protein or a complex of the oxidative damage protein and the analysis tag from the carrier.

さらに、本発明は、前記解析用タグを、酸化傷害タンパク質を含む試料と混合し、該混合物を、該解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、次いで、該担体から酸化傷害タンパク質と結合した該解析用タグを回収し、さらに抗体を用いた、ウエスタンブロッティング法と組み合わせた、二段タンパク質精製方法を提供する。   Furthermore, the present invention comprises mixing the analytical tag with a sample containing an oxidative damage protein, contacting the mixture with a carrier holding a metal atom that binds to the affinity peptide tag of the analytical tag, Provided is a two-stage protein purification method in which the analytical tag bound to an oxidatively damaged protein is recovered from the carrier and further combined with a Western blotting method using an antibody.

さらに、本発明は、酸化傷害タンパク質の解析方法であって、これまで記載した酸化傷害タンパク質解析用タグ（以下、解析用タグ１という。）、及び該解析用タグ１を安定同位体標識した解析用タグ２とを、解析対象の試料と混合し、該混合物を、該解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、該担体から該酸化傷害タンパク質と解析用タグ１又は２とリンカーYとの複合体、或いは酸化傷害タンパク質と該解析用タグ１又は２との複合体を回収し、質量分析により分子量の相違によるダブレットピークを検出することを含む、該酸化傷害タンパク質の解析方法を提供する。   Furthermore, the present invention relates to a method for analyzing oxidative damage protein, the oxidative damage protein analysis tag described so far (hereinafter referred to as analysis tag 1), and an analysis in which the analysis tag 1 is labeled with a stable isotope. The tag 2 for use is mixed with the sample to be analyzed, and the mixture is brought into contact with a carrier that holds a metal atom that binds to the affinity peptide tag of the tag for analysis, and the oxidatively damaged protein and the analytical protein are analyzed from the carrier. Recovering the complex of tag 1 or 2 and linker Y, or the complex of oxidative damage protein and tag 1 or 2 for analysis, and detecting the doublet peak due to the difference in molecular weight by mass spectrometry. A method for analyzing damaged proteins is provided.

さらに、本発明は、酸化傷害タンパク質の解析方法であって、これまで記載した酸化傷害タンパク質解析用タグ（以下、解析用タグ１という。）と標準試料とを反応させ、次いで該解析用タグ１を安定同位体標識した解析用タグ２と解析対象の試料とを反応させ、双方の反応液を混合し、該混合物を、これら解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、該担体から該酸化傷害タンパク質と解析用タグ１又は２とリンカーYとの複合体、或いは酸化傷害タンパク質と該解析用タグ１又は２との複合体を回収し、質量分析により標準試料中の酸化傷害タンパク質と、解析対象の試料中の酸化傷害タンパク質との量を比較する、酸化傷害タンパク質の解析方法を提供する。   The present invention further relates to a method for analyzing oxidative damage protein, wherein the oxidative damage protein analysis tag described so far (hereinafter referred to as analysis tag 1) is reacted with a standard sample, and then the analysis tag 1 The analysis tag 2 labeled with a stable isotope and the sample to be analyzed are reacted, both reaction solutions are mixed, and the mixture is a carrier that holds a metal atom that binds to the affinity peptide tag of these analysis tags. And the complex of the oxidatively damaged protein, the analytical tag 1 or 2 and the linker Y, or the complex of the oxidatively damaged protein and the analytical tag 1 or 2 is recovered from the carrier and standardized by mass spectrometry. Provided is a method for analyzing oxidative damage protein, which compares the amount of oxidative damage protein in a sample and the amount of oxidative damage protein in a sample to be analyzed.

さらに、本発明は、酸化傷害タンパク質の解析方法であって、これまで記載した酸化傷害タンパク質解析用タグ（以下、解析用タグ１という。）、該解析用タグ１を安定同位体標識した解析用タグ２、及び該解析用タグ１を安定同位体標識し、かつ解析用タグ２と分子量が異なる解析用タグ３とを準備し、解析用タグ１及び２と標準試料とを反応させ、次いで解析用タグ１及び３と解析対象の試料とを反応させ、双方の反応液を混合し、該混合物を、これら解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、該担体から、解析用タグ１〜３と酸化傷害タンパク質との複合体、又は解析用タグ１〜３のリンカーYと酸化傷害タンパク質との複合体を回収し、質量分析により標準試料中の酸化傷害タンパク質と、解析対象の試料中の酸化傷害タンパク質との量を比較する、酸化傷害タンパク質の解析方法を提供する。   Furthermore, the present invention relates to a method for analyzing oxidative damage protein, the oxidative damage protein analysis tag described so far (hereinafter referred to as “analysis tag 1”), and the analysis tag in which the analysis tag 1 is labeled with a stable isotope. The tag 2 and the analysis tag 1 are labeled with stable isotopes, the analysis tag 2 and the analysis tag 3 having a different molecular weight are prepared, the analysis tags 1 and 2 are reacted with the standard sample, and then analyzed. The tags 1 and 3 for analysis are reacted with the sample to be analyzed, both reaction solutions are mixed, and the mixture is contacted with a carrier that holds a metal atom that binds to the affinity peptide tag of these tags for analysis. A complex of the analysis tags 1 to 3 and the oxidative damage protein is recovered from the carrier, or a complex of the linker Y of the analysis tags 1 to 3 and the oxidative damage protein, and the oxidative damage protein in the standard sample is obtained by mass spectrometry. And analysis Provided is a method for analyzing oxidative damage protein, which compares the amount of oxidative damage protein in a subject sample.

本明細書において「親和性ペプチドタグ」とは、キレート化した遷移金属イオン、特にNi2+ に親和性を有するペプチドのタグをいう。本明細書において「リンカーY」とは、親和性ペプチドタグと反応基をつなぐ部分をいい、前記親和性ペプチドタグのN末端、又はC末端のいずれにか結合し、かつ反応基を導入する化合物の非反応基と結合することができるものをいう。また、本明細書の「反応基を有する残基Z」とは、酸化傷害タンパク質と選択的に結合する官能基、酸化傷害タンパク質と選択的に結合できる基を有する原子団、又は酸化傷害タンパク質と選択的に結合できる分子をいう。なお、本発明の解析用タグにおいては、「リンカーY」及び／又は「残基Z」は、親和性ペプチドタグのN末端、又はC末端のいずれに配置されていてもよい。 As used herein, the term “affinity peptide tag” refers to a peptide tag having an affinity for a chelated transition metal ion, particularly Ni 2+ . In this specification, “linker Y” refers to a portion that connects an affinity peptide tag and a reactive group, and is a compound that binds to either the N-terminus or C-terminus of the affinity peptide tag and introduces a reactive group Those capable of binding to the non-reactive group. In addition, the “residue Z having a reactive group” in the present specification refers to a functional group that selectively binds to an oxidative damage protein, an atomic group having a group that can selectively bind to an oxidative damage protein, or an oxidative damage protein. A molecule that can selectively bind. In the analysis tag of the present invention, “linker Y” and / or “residue Z” may be arranged at either the N-terminus or C-terminus of the affinity peptide tag.

本発明の標的物質である酸化傷害タンパク質とは、酸化傷害部位を含むタンパク質、及び酸化傷害部位を含むタンパク質の断片ペプチドをいう。また、残基Zの反応基とは、酸化傷害部位と結合する基、又は原子団のことをいう。   The oxidative damage protein which is a target substance of the present invention refers to a protein containing an oxidative damage site and a fragment peptide of a protein containing an oxidative damage site. The reactive group of residue Z means a group or atomic group that binds to an oxidative damage site.

本発明の酸化傷害タンパク質解析用タグの利点を挙げると、人工的に大量生産が可能であり、プロテアーゼ消化部位、安定同位体、蛍光試薬、及びRI試薬の導入が容易であるという利点がある。
また、本発明の解析用タグの利点を挙げると、生体内で酸化傷害を受けたタンパク質のみを分取することができ、酸化傷害部位を特定することができ、逆相カラムへの親和性が弱いため、未反応の解析用タグの除去が容易であるという利点がある。
さらに、本発明の解析用タグの利点を挙げると、変性剤存在下で反応させることができるため、反応中の消化酵素による影響を受けず、膜タンパクなどの不溶性酸化傷害タンパク質にも適応できるという利点がある。
さらに、該解析用タグの利点を挙げると、市販の安定同位体標識F-MOC誘導体アミノ酸を使って任意の安定同位体標識が可能であり、疾病にともなう酸化傷害タンパク質を質量分析計で直接定量分析を行うことができるという利点がある。
したがって、本発明の解析用タグを使用することにより、酸化傷害を受けたタンパク質の検出、精製、定量、及び酸化傷害部位の確定を容易に行うことができる。 The advantages of the oxidatively damaged protein analysis tag of the present invention include the advantage that it can be artificially mass-produced and the introduction of a protease digestion site, stable isotope, fluorescent reagent, and RI reagent is easy.
In addition, when the advantages of the analysis tag of the present invention are given, only proteins that have undergone oxidative damage in vivo can be separated, oxidative damage sites can be identified, and the affinity for the reverse-phase column is improved. Since it is weak, there is an advantage that unreacted analysis tags can be easily removed.
Furthermore, the advantages of the analysis tag of the present invention are that it can be reacted in the presence of a denaturing agent, so that it is not affected by digestive enzymes during the reaction and can be applied to insoluble oxidative damage proteins such as membrane proteins. There are advantages.
Furthermore, the advantages of this analytical tag are that any stable isotope labeling is possible using commercially available stable isotope-labeled F-MOC derivative amino acids, and oxidative damage proteins associated with diseases can be directly quantified with a mass spectrometer. There is an advantage that analysis can be performed.
Therefore, by using the analysis tag of the present invention, it is possible to easily detect, purify, quantify, and determine the oxidative damage site of a protein that has undergone oxidative damage.

次に本発明を、その実施形態に基づき詳細に説明する。
本発明の酸化傷害タンパク質解析用タグは、親和性ペプチドタグ、及びタンパク質の酸化傷害部位と結合する反応基を有する少なくとも１つの残基Zを有し、かつ下記式(1)で表される酸化傷害タンパク質解析用タグである。
(His)l-(X-His)m-(X)n-(Y)p-Z (1)
式中、Xはヒスチジンをのぞく任意のアミノ酸、又はアミノ酸誘導体であり、Yはリンカーであり、lは0、又は1、nは0、又は1、かつpは0、又は1である。また式中、mは4〜100、好ましくは５〜２５、さらに好ましくは６〜１５の整数である。また、式中(1)は、該リンカーY、及び残基Z、該親和性ペプチドタグのC末端、又はN末端のいずれかに結合していることを示している。なお、式中の「His」は、ヒスチジン、又はキレート化したNi2+などのイオンに親和性を示すヒスチジンの誘導体を示す。また、残基Zは、酸化傷害タンパク質と結合する反応基そのものでもよい。 Next, this invention is demonstrated in detail based on the embodiment.
The oxidative damage protein analysis tag of the present invention has an affinity peptide tag and at least one residue Z having a reactive group that binds to the oxidative damage site of the protein and is represented by the following formula (1) It is a tag for damaged protein analysis.
(His) l- (X-His) m- (X) n- (Y) pZ (1)
In the formula, X is any amino acid or amino acid derivative except histidine, Y is a linker, l is 0 or 1, n is 0 or 1, and p is 0 or 1. In the formula, m is an integer of 4 to 100, preferably 5 to 25, and more preferably 6 to 15. In the formula, (1) indicates that the linker Y and the residue Z are bonded to either the C-terminus or the N-terminus of the affinity peptide tag. “His” in the formula represents histidine or a derivative of histidine having affinity for chelated ions such as Ni 2+ . Residue Z may be a reactive group itself that binds to an oxidatively damaged protein.

本発明の標的物質は、酸化傷害部位を有するタンパク質、及び該タンパク質の断片ペプチドである。本発明の解析用タグは、生体中に存在する酸化傷害タンパク質を標的物質として、検出、精製、定量、及び酸化傷害部位の確定する場合、優れた効果を発揮する。また、酸化傷害タンパク質とは、活性酸素などにより、酸化傷害部位を有するタンパク質であり、例えば、アルギニン残基、リジン残基、プロリン残基、及びスレオニン残基がアルデヒド化したものである。   The target substance of the present invention is a protein having an oxidative damage site and a fragment peptide of the protein. The analysis tag of the present invention exhibits an excellent effect when detection, purification, quantification, and determination of an oxidative damage site are performed using an oxidative damage protein present in a living body as a target substance. The oxidative damage protein is a protein having an oxidative damage site by active oxygen or the like. For example, an arginine residue, a lysine residue, a proline residue, and a threonine residue are aldehyded.

本発明の親和性ペプチドタグとは、式(1)の(His)l-(X-His)m-(X)nで表されるペプチド断片をいう。式中、Xは、任意のアミノ酸、又はアミノ酸誘導体である。該アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸、及び非天然のアミノ酸の双方を含み、本発明の親和性ペプチドタグで利用できるものであれば特に制限はない。   The affinity peptide tag of the present invention refers to a peptide fragment represented by (His) 1- (X-His) m- (X) n in formula (1). In the formula, X is any amino acid or amino acid derivative. The amino acid is not particularly limited as long as it includes both naturally occurring amino acids and non-natural amino acids and can be used in the affinity peptide tag of the present invention.

該アミノ酸の例を挙げると、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンなどがある。本発明の親和性ペプチドタグと、キレート化Ni2+イオンと親和性を強くする場合、Xとして該イオンと親和性を有するシステイン、又はトリプトファンを用いるのが好ましい。また、精製に用いるアフィニティーカラムの性質に応じて、非極性側アミノ酸、極性無電荷側アミノ酸、又は極性電荷アミノ酸からXを選択することにより、高い純度で酸化傷害タンパク質を精製することができる。 Examples of such amino acids include alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, isoleucine, lysine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, arginine, serine, threonine, valine, tryptophan, and tyrosine. . In the case where the affinity peptide tag of the present invention and chelated Ni 2+ ion have a strong affinity, it is preferable to use cysteine having affinity for the ion or tryptophan as X. Further, by selecting X from a nonpolar amino acid, a polar uncharged amino acid, or a polar charged amino acid according to the property of the affinity column used for purification, the oxidatively damaged protein can be purified with high purity.

また、該アミノ酸誘導体には、これらに限定されるものではないが、前記アミノ酸に対応する下記化合物がある。式中、Ｒは各アミノ酸固有の基である。
RCH(NH2)CO-［アシル基］
RCH(NH2)CO2 1−［アニオン］
RCH(NH2)CONH2［アミド］
RCH(NH2)CH2OH［アルコール］
RCH(NH2)CHO［アルデヒド］
RCH(CO2H)NH-［N-置換基］
これら誘導体のうち、ヒスチジンの誘導体の例を挙げると、ヒスチジル、ヒスチジナート、ヒスチジンアミド、ヒスチジノール、ヒスチジナール及びN-ヒスチジノなどがあり、アラニンの誘導体には、アラニル、アラニナート、アラニンアミド、アラニノール、アラニナール及びアラニノがあり、また、グリシンの誘導体には、グリシル、グリシナート、グリシンアミド、グリシノール、グリシナール、及びグリシノがある。 The amino acid derivatives include, but are not limited to, the following compounds corresponding to the amino acids. In the formula, R is a group specific to each amino acid.
RCH (NH 2 ) CO- [acyl group]
RCH (NH 2 ) CO 2 1− [Anion]
RCH (NH 2 ) CONH 2 [amide]
RCH (NH 2 ) CH 2 OH [alcohol]
RCH (NH 2 ) CHO [aldehyde]
RCH (CO 2 H) NH- [N-Substituent]
Among these derivatives, examples of histidine derivatives include histidyl, histidinate, histidine amide, histidinol, histidinal, and N-histidino. The alanine derivatives include alanyl, alaninate, alaninamide, alaninol, alaninal and alanino. In addition, derivatives of glycine include glycyl, glycinate, glycinamide, glycinol, glycinal, and glycino.

なお、本発明の解析用タグが酸化傷害タンパク質を含む試料に多量に存在することで、酸化傷害部位と該解析用タグとの反応効率が向上する。したがって、未反応の解析用タグを容易に除去することは、非常に大きな利点である。この特性は、親和性ペプチドタグの特性に依存している。(His-X)mのXの選択によりこうした特性を持たせることが可能である。   In addition, since the analysis tag of the present invention is present in a large amount in a sample containing an oxidative damage protein, the reaction efficiency between the oxidative damage site and the analysis tag is improved. Therefore, it is a very great advantage to easily remove unreacted analysis tags. This property depends on the properties of the affinity peptide tag. Such a characteristic can be obtained by selecting X of (His-X) m.

本発明のリンカーYは、親和性ペプチドタグと反応基を有する残基Zを連結させるものであれば、特に制限はされない。例えば、親和性ペプチドタグのC末端、又はN末端に結合し、かつ残基Zの反応基以外の基に結合する分子である。本発明で、好ましいリンカーは、アミノ酸、またはアミノ酸誘導体３〜３０個、好ましくは３〜１５個、さらに好ましくは３〜９個を含むペプチドである。また、単体のアミノ酸、又はアミノ酸誘導体を用いることもできる。該リンカーで用いるアミノ酸、及びアミノ酸誘導体は、前記親和性ペプチドで用いるものと同じでよい。   The linker Y of the present invention is not particularly limited as long as it links the affinity peptide tag and the residue Z having a reactive group. For example, a molecule that binds to the C-terminus or N-terminus of an affinity peptide tag and binds to a group other than the reactive group at residue Z. In the present invention, a preferable linker is an amino acid or a peptide containing 3 to 30, preferably 3 to 15, more preferably 3 to 9 amino acid derivatives. A single amino acid or amino acid derivative can also be used. The amino acid and amino acid derivative used in the linker may be the same as those used in the affinity peptide.

また、ペプチド以外のリンカーYの例を挙げると、単独のアミノ酸、又はアミノ酸誘導体、脂肪酸、又は脂肪酸エステルなどがあり、必要に応じてスペーサーとして、長炭素鎖を有するリンカーYを、本発明の解析用タグに導入できる。さらに、本発明では、リンカーYを付与せず、親和性ペプチドタグに反応基を有する残基Zを直接付加してもよい。この場合、親和性ペプチドタグのC又はN末端に前記アミノ酸誘導体を付加することにより、容易に残基Zを形成する化合物と結合させることができる。   Examples of the linker Y other than the peptide include a single amino acid, an amino acid derivative, a fatty acid, or a fatty acid ester, and the linker Y having a long carbon chain as a spacer as necessary is analyzed according to the present invention. Can be introduced into the tag. Furthermore, in the present invention, the residue Z having a reactive group may be directly added to the affinity peptide tag without providing the linker Y. In this case, by adding the amino acid derivative to the C or N terminus of the affinity peptide tag, it can be easily combined with the compound that forms the residue Z.

また、本発明では、該リンカーYに標識分子を付加してもよい。該標識分子を導入することで、標的物質を高感度、かつ容易に検出することができる。該標識分子として、蛍光物質、安定同位体、及び放射性同位体を用いることができる。本発明で用いる蛍光物質は特に制限されないが、例を挙げると、フルオレセイン、ローダミン、又はロドールなどのキサンテン色素、シアニン色素、クマリン色素、ポルフィリン色素、及びこれらの複合色素などがある。また、該標識分子として同位体元素、重水素、三重水素、15N、13C又は14Ｃの炭素同位体を挙げることができる。例えば、重水素などの同位体元素を含むアミノ酸を付加することで、該リンカーＹに標識分子を容易に導入することができる。また、必要に応じて、親和性ペプチドタグ部分をこれらの標識分子で標識してもよい。   In the present invention, a label molecule may be added to the linker Y. By introducing the label molecule, the target substance can be easily detected with high sensitivity. As the labeling molecule, a fluorescent substance, a stable isotope, and a radioisotope can be used. The fluorescent substance used in the present invention is not particularly limited, but examples include xanthene dyes such as fluorescein, rhodamine, or rhodol, cyanine dyes, coumarin dyes, porphyrin dyes, and complex dyes thereof. Examples of the labeling molecule include isotope elements, deuterium, tritium, 15N, 13C, and 14C carbon isotopes. For example, a labeled molecule can be easily introduced into the linker Y by adding an amino acid containing an isotope element such as deuterium. If necessary, the affinity peptide tag portion may be labeled with these label molecules.

また、リンカーYとして、アミノ酸、又はペプチドを用いることにより、酸化傷害タンパク質と親和性タグとを切り離すためのプロテアーゼ認識部位を容易に導入することができる。該認識部位を認識するプロテアーゼにより、酸化傷害タンパク質と結合した解析用タグを、親和性ペプチドタグと酸化傷害タンパク質とに分け、該タンパク質を濃縮することができる。本発明で用いるプロテアーゼは、リンカーＹ、又はリンカーＹと反応基Ｚ間のアミノ酸のペプチド結合を選択的に切断するものであれば特に制限されない。   In addition, by using an amino acid or a peptide as the linker Y, a protease recognition site for separating the oxidatively damaged protein and the affinity tag can be easily introduced. By the protease that recognizes the recognition site, the analysis tag bound to the oxidative damage protein can be divided into an affinity peptide tag and an oxidative damage protein, and the protein can be concentrated. The protease used in the present invention is not particularly limited as long as it selectively cleaves the peptide bond of the amino acid between linker Y or linker Y and reactive group Z.

本発明で用いるプロテアーゼの例を挙げると、キモトリプシンA（芳香族アミノ酸残基のC端側）、エンドプロテイナーゼ Glu-C (プロテアーゼV8)、エンドプロテイナーゼ Lys-C、ファクターXa（Arg残基のC端側）、プラスミン（Arg, Lys残基のC端側）、スロンビン（Arg残基のC端側）及びトリプシン（Arg, Lys残基のC端側）などのセリンプロテアーゼ、セルモリシン（疎水性L-アミノ酸（特にIle, Leu, Val, Phe, Met, Ala）残基のC端側）、ディスパーズ（Leu-Phe結合）、エンドプロテイナーゼ Arg-C、アミノペプチダーゼM（遊離α-アミノ基やα-イミノ基をもつL-アミノ酸のN未端側）、カルボキシペプチダーゼB（C未端のArg, Lys）、及びカルボキシペプチダーゼY（タンパク質・ペプチドのC未端のL-アミノ酸を加水分解する。Proを分解）などがある。     Examples of proteases used in the present invention include chymotrypsin A (C-terminal side of aromatic amino acid residue), endoproteinase Glu-C (protease V8), endoproteinase Lys-C, factor Xa (C-terminal of Arg residue) Serine proteases such as plasmin (C-terminal side of Arg, Lys residue), thrombin (C-terminal side of Arg residue) and trypsin (C-terminal side of Arg, Lys residue), sermolysin (hydrophobic L- Amino acids (especially C-terminal side of Ile, Leu, Val, Phe, Met, Ala) residue, Disperse (Leu-Phe bond), Endoproteinase Arg-C, Aminopeptidase M (Free α-amino group and α- Hydrolyzes N-terminal L-amino acid with imino group), carboxypeptidase B (C-terminal Arg, Lys), and carboxypeptidase Y (protein-peptide C-terminal L-amino acid. Pro) Decomposition).

本発明の残基Zの反応基（化学基）とは、酸化傷害タンパク質の酸化傷害部位と結合することができるものをいい、かかる反応性の基であれば、特に制限されない。例えば、酸化傷害部位と結合する反応基の例を挙げると、ヒドラジノ基（-NHNH2）、ヒドラジノカルボニル基（ヒドラジド基、-CONHNH2）、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、および第二級アミンなどがある。これらの基の中で特にヒドラジノ基、及びヒドラジノカルボニル基が好ましい。また、該第２級アミンの例を挙げると、下記式化合物がある。 The reactive group (chemical group) of the residue Z of the present invention means a group capable of binding to an oxidative injury site of an oxidative injury protein, and is not particularly limited as long as it is such a reactive group. Examples of reactive groups that bind to oxidative damage sites include hydrazino group (—NHNH 2 ), hydrazino carbonyl group (hydrazide group, —CONHNH 2 ), hydroxyl group, thiol group, amino group, and secondary There are amines. Of these groups, a hydrazino group and a hydrazinocarbonyl group are particularly preferable. Examples of the secondary amine include the following formula compounds.

R1-NH-R2 (第２級アミン)
ここで、R1はリンカーと結合する基であり、R2はアルキル基、アリール基などである。また、R2に電子吸引基、電子供与基などを導入することにより、第２級アミンの反応性を制御することが可能である。該第２級アミンの例を挙げると、ピロール、ピロリン、ピロリジン、及びピペリジンなどがある。 R1-NH-R2 (secondary amine)
Here, R1 is a group bonded to a linker, and R2 is an alkyl group, an aryl group, or the like. In addition, the reactivity of the secondary amine can be controlled by introducing an electron-withdrawing group, an electron-donating group, or the like into R2. Examples of the secondary amine include pyrrole, pyrroline, pyrrolidine, and piperidine.

なお、残基Zは、同じ反応基、又は異なる反応基を少なくとも１個以上、好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個有するものである。
該反応基 (化学基) を付与するため、残基ZをリンカーY、又は親和性ペプチドタグのC末端、又はN末端に結合することができ、かつ該反応基を有する残基Zを、直接親和性ペプチドタグに結合させることもできる。該残基Zの形成に用いることができる化合物の例を挙げると下記のものがある。 The residue Z has at least one, preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 3, the same reactive group or different reactive groups.
In order to give the reactive group (chemical group), the residue Z can be linked to the linker Y or the C-terminus or N-terminus of the affinity peptide tag, and the residue Z having the reactive group is directly attached. It can also be bound to an affinity peptide tag. Examples of compounds that can be used to form the residue Z include the following.

NH2(CH2)n-CHNH2-CONHNH2
H2N-(CH2)n-CONHNH2
H2N-(CH2)n-NH2
ここで、nは、３〜１００、好ましくは、３〜３０、さらに好ましくは３〜１０の整数である。 NH 2 (CH 2 ) n -CHNH 2 -CONHNH 2
H 2 N- (CH 2 ) n -CONHNH 2
H 2 N- (CH 2 ) n -NH 2
Here, n is an integer of 3 to 100, preferably 3 to 30, and more preferably 3 to 10.

次に本発明の解析用タグを複数組み合わせて利用する方法について説明する。
すなわち、本発明の好ましい実施態様を挙げると、これまで記載した酸化傷害タンパク質解析用タグ（以下、解析用タグ１という。）、及び該解析用タグ１を安定同位体標識した解析用タグ２とを、解析対象の試料と混合し、該混合物を、該解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、該担体から該酸化傷害タンパク質と解析用タグ１又は２とリンカーYとの複合体、或いは酸化傷害タンパク質と該解析用タグ１又は２との複合体を回収し、質量分析により分子量の相違によるダブレットピークを検出することを含む、該酸化傷害タンパク質の解析方法がある。 Next, a method of using a plurality of analysis tags of the present invention in combination will be described.
That is, in a preferred embodiment of the present invention, the oxidative damage protein analysis tag (hereinafter referred to as analysis tag 1) described so far, and the analysis tag 2 in which the analysis tag 1 is labeled with a stable isotope, Is mixed with a sample to be analyzed, the mixture is brought into contact with a carrier holding a metal atom that binds to the affinity peptide tag of the analytical tag, and the oxidatively damaged protein and the analytical tag 1 or 2 from the carrier. Of the oxidatively damaged protein, which comprises recovering a complex of the oxidatively damaged protein and the tag 1 or 2 for analysis and a doublet peak due to a difference in molecular weight by mass spectrometry. There is a way.

該酸化傷害タンパク質の解析方法では、酸化傷害タンパク質と未標識解析用タグとの複合体と、酸化傷害タンパク質と安定同位体解析用タグとの分子量の相違から、ダブレットピークの質量分析スペクトルが得られる。したがって、酸化傷害タンパク質を示すスペクトルの特定が容易、かつ確実になるという利点がある。   In the method for analyzing oxidative damage protein, a mass spectrometric spectrum of a doublet peak can be obtained from the difference in molecular weight between the complex of oxidative damage protein and an unlabeled analysis tag, and the oxidation damage protein and the stable isotope analysis tag. . Therefore, there is an advantage that the spectrum indicating the oxidatively damaged protein can be easily and reliably specified.

該解析方法において、解析用タグ１と２を使用割合は任意に決めることができるが、通常、解析用タグ１と２を等モル量用いるのが好ましい。
さらに、本発明の好ましい実施態様を挙げると、これまで記載した酸化傷害タンパク質解析用タグ（以下、解析用タグ１という）、と標準試料とを反応させ、該解析用タグ１を安定同位体標識した解析用タグ２と解析対象の試料とを反応させ、双方の反応液を混合し、該混合物を、これら解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、該担体から該酸化傷害タンパク質と解析用タグ１又は２とリンカーYとの複合体、或いは酸化傷害タンパク質と該解析用タグ１又は２との複合体を回収し、質量分析により標準試料中の酸化傷害タンパク質と、解析対象の試料中の酸化傷害タンパク質との量を比較する、酸化傷害タンパク質の解析方法がある。 In the analysis method, the usage ratio of the analysis tags 1 and 2 can be arbitrarily determined, but it is usually preferable to use the analysis tags 1 and 2 in equimolar amounts.
Further, according to a preferred embodiment of the present invention, the oxidative damage protein analysis tag (hereinafter referred to as analysis tag 1) described above is reacted with a standard sample, and the analysis tag 1 is labeled with a stable isotope. The analysis tag 2 and the sample to be analyzed are reacted, both reaction solutions are mixed, and the mixture is contacted with a carrier holding a metal atom that binds to the affinity peptide tag of these analysis tags, The complex of the oxidative damage protein, the analysis tag 1 or 2 and the linker Y, or the complex of the oxidative damage protein and the analysis tag 1 or 2 is recovered from the carrier, and the oxidative damage in the standard sample by mass spectrometry. There is an oxidative damage protein analysis method that compares the amount of protein and the oxidative damage protein in the sample to be analyzed.

該酸化傷害タンパク質の解析方法では、標準試料由来の酸化傷害タンパク質と未標識解析用タグとの複合体と、解析対象試料の酸化傷害タンパク質と安定同位体解析用タグの複合体との分子量の相違から、標準試料中の酸化傷害タンパク質と、解析対象の試料中の酸化傷害タンパク質との量を比較することができる。したがって、標準試料由来の酸化傷害タンパク質の量と、解析対象試料中の酸化傷害タンパク質の量を比較し、検出された酸化傷害タンパク質の疾病などとの関係を判断できるという利点がある。   In the method for analyzing oxidative damage protein, the molecular weight difference between the oxidative damage protein derived from the standard sample and the unlabeled analysis tag complex, and the oxidative damage protein and stable isotope analysis tag complex of the sample to be analyzed is different. Thus, the amount of oxidative damage protein in the standard sample and the amount of oxidative damage protein in the sample to be analyzed can be compared. Therefore, there is an advantage that the amount of the oxidative damage protein derived from the standard sample and the amount of the oxidative damage protein in the sample to be analyzed can be compared to determine the relationship with the disease of the detected oxidative damage protein.

なお、該解析方法では未標識の解析用タグ１と該解析対象の試料とを反応させ、かつ標識した解析用タグ２と該標準試料とを反応させてもよい。
また、該解析方法において、解析用タグ１と２を使用割合は任意に決めることができるが、通常、解析用タグ１と２を等モル量用いるのが好ましい。
さらに、本発明の好ましい実施態様を挙げると、これまで記載した酸化傷害タンパク質解析用タグ（以下、解析用タグ１という。）、該解析用タグ１を安定同位体標識した解析用タグ２、及び該解析用タグ１を安定同位体標識し、かつ解析用タグ２と分子量が異なる解析用タグ３とを準備し、解析用タグ１及び２と標準試料とを反応させ、次いで解析用タグ１及び３と解析対象の試料とを反応させ、双方の反応液を混合し、該混合物を、これら解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、該担体から、解析用タグ１〜３と酸化傷害タンパク質との複合体、又は解析用タグ１〜３のリンカーYと酸化傷害タンパク質との複合体を回収し、質量分析により標準試料中の酸化傷害タンパク質と、解析対象の試料中の酸化傷害タンパク質との量を比較する、酸化傷害タンパク質の解析方法がある。 In the analysis method, the unlabeled analysis tag 1 and the sample to be analyzed may be reacted, and the labeled analysis tag 2 and the standard sample may be reacted.
In the analysis method, the usage ratio of the analysis tags 1 and 2 can be arbitrarily determined, but it is usually preferable to use the analysis tags 1 and 2 in equimolar amounts.
Furthermore, preferred embodiments of the present invention include the oxidative damage protein analysis tag (hereinafter referred to as analysis tag 1), the analysis tag 2 obtained by labeling the analysis tag 1 with a stable isotope, and The analysis tag 1 is labeled with a stable isotope, the analysis tag 2 and an analysis tag 3 having a different molecular weight are prepared, the analysis tags 1 and 2 are reacted with a standard sample, and then the analysis tag 1 and 3 and the sample to be analyzed are reacted, both reaction liquids are mixed, and the mixture is brought into contact with a carrier holding a metal atom that binds to the affinity peptide tag of these analytical tags, and analysis is performed from the carrier. The complex of tag 1 to 3 and oxidatively damaged protein, or the complex of linker Y of analytical tag 1 to 3 and oxidatively damaged protein are collected, and the oxidatively damaged protein in the standard sample is analyzed by mass spectrometry. Of samples There is a method for analyzing an oxidative damage protein in which the amount of the oxidative damage protein is compared.

該酸化傷害タンパク質の解析方法では、標準試料由来の酸化傷害タンパク質と未標識解析用タグとの複合体と、解析対象試料の酸化傷害タンパク質と安定同位体解析用タグの複合体との分子量の相違から、標準試料中の酸化傷害タンパク質と、解析対象の試料中の酸化傷害タンパク質との量を比較することができる。さらに、本実施態様では、標準試料、又は解析対象試料のいずれか一方に、検出すべき酸化傷害タンパク質が含まれていない場合、含まれていないことを容易に検出することができる。したがって、本実施態様により、例え、検出すべき酸化傷害タンパク質が含まれていない場合であっても、標準試料由来の酸化傷害タンパク質の量と、解析対象試料中の酸化傷害タンパク質の量を比較し、検出された酸化傷害タンパク質の疾病などとの関係を判断できるという利点がある。   In the method for analyzing oxidative damage protein, the molecular weight difference between the complex of the oxidative damage protein derived from the standard sample and the unlabeled analysis tag, and the complex of the oxidative damage protein of the analysis target sample and the tag for stable isotope analysis Thus, the amount of oxidative damage protein in the standard sample and the amount of oxidative damage protein in the sample to be analyzed can be compared. Furthermore, in this embodiment, when the oxidative damage protein to be detected is not included in either the standard sample or the analysis target sample, it can be easily detected that it is not included. Therefore, according to this embodiment, even when the oxidative damage protein to be detected is not included, the amount of the oxidative damage protein derived from the standard sample is compared with the amount of the oxidative damage protein in the sample to be analyzed. There is an advantage that the relationship between the detected oxidatively damaged protein and the disease can be determined.

該実施態様を、図６に基づき説明する。図６（１）に示されている解析用タグ１は未標識、解析用タグ２は解析用タグ１を安定同位体で標識した解析用タグ、かつ解析用タグ３は、解析用タグ１を解析用タグ２の２倍量の同一安定同位体で標識した解析用タグである。これら解析用タグはそれぞれ等モル量使用する。解析用タグ１と２とを標準試料に加え、次いで解析用タグ１と３とを解析対象の試料に加え反応後、生成された解析用タグ複合体を回収して質量分析によりスペクトルを得る。   This embodiment will be described with reference to FIG. The analysis tag 1 shown in FIG. 6 (1) is unlabeled, the analysis tag 2 is an analysis tag in which the analysis tag 1 is labeled with a stable isotope, and the analysis tag 3 is an analysis tag 1 This is an analysis tag labeled with the same stable isotope twice as much as the analysis tag 2. These analytical tags are used in equimolar amounts. The analysis tags 1 and 2 are added to the standard sample, and then the analysis tags 1 and 3 are added to the sample to be analyzed. After the reaction, the generated analysis tag complex is recovered and a spectrum is obtained by mass spectrometry.

標準試料と解析対象の試料が同量の特定酸化傷害タンパク質を含む場合、図６の（２）に示すように、解析用タグ１〜３のスペクトルが検出され、解析用タグ２及び３のスペクトルは同じ強度、解析用タグ１のスペクトルは、解析用タグ２及び３の２倍の強度になる。標準試料が解析対象試料の２倍の特定酸化傷害タンパク質を含む場合、図６の（３）に示すように、解析用タグ２のスペクトル強度は解析用タグ３の２倍となり、解析用タグ１のスペクトル強度は解析用タグ３の３倍になる。また、解析対象試料が特定酸化傷害タンパク質を含まない場合、図６の（４）に示すように、解析用タグ３のスペクトルは現れず、解析用タグ１及び２のスペクトルは同じ強度になる。さらに、標準試料が特定酸化傷害タンパク質を含まない場合、図６の（５）に示すように、解析用タグ２のスペクトルは現れず、解析用タグ１及び３のスペクトルは同じ強度になる。なお、図６の（４）及び（５）を比較すると分かるように、解析用タグ１のスペクトルに対し、解析用タグ２及び３のスペクトルは現れる距離が異なるので、標準試料と解析対象試料のいずれに特定酸化傷害タンパク質が含まれていないか判断することができる。   When the standard sample and the sample to be analyzed contain the same amount of the specific oxidative damage protein, as shown in (2) of FIG. 6, the spectra of the analysis tags 1 to 3 are detected, and the spectra of the analysis tags 2 and 3 Have the same intensity, and the spectrum of the analysis tag 1 has twice the intensity of the analysis tags 2 and 3. When the standard sample contains twice the specific oxidative damage protein of the analysis target sample, as shown in FIG. 6 (3), the spectrum intensity of the analysis tag 2 is twice that of the analysis tag 3, and the analysis tag 1 The spectral intensity is three times that of the analysis tag 3. Further, when the analysis target sample does not contain the specific oxidative damage protein, the spectrum of the analysis tag 3 does not appear as shown in (4) of FIG. 6, and the spectra of the analysis tags 1 and 2 have the same intensity. Further, when the standard sample does not contain the specific oxidative damage protein, the spectrum of the analysis tag 2 does not appear as shown in (5) of FIG. 6, and the spectra of the analysis tags 1 and 3 have the same intensity. As can be seen by comparing (4) and (5) in FIG. 6, the spectrums of the analysis tags 2 and 3 appear different from the spectrum of the analysis tag 1, so the standard sample and the sample to be analyzed are different. It can be determined which does not contain the specific oxidative damage protein.

なお、本発明の解析用タグのリンカーYは、ペプチドとして形成することができるので、任意の数の安定同位体標識アミノ酸を容易に導入することができる。したがって、本実施態様、及び図６に示したのと同様の方法により、準備した異分子量安定同位体標識解析用タグの数（n）に対し、（n-1）種類の検体を一度に定量比較することができる。   Since the linker Y of the analysis tag of the present invention can be formed as a peptide, any number of stable isotope-labeled amino acids can be easily introduced. Therefore, by the same method as that shown in this embodiment and FIG. 6, (n-1) types of specimens are quantified at a time with respect to the number (n) of prepared tags for different molecular weight stable isotope labeling analysis. Can be compared.

また、該解析方法において、解析用タグ１と２を使用割合は任意に決めることができるが、通常、解析用タグ１と２を等モル量用いるのが好ましい。
なお、これらの実施態様では、標準試料と解析対象試料は特に制限されないが、例を挙げると、標準試料として健常人の血液、血清、臓器などの組織から得た試料を、また解析対象の試料として疾患を有する人の血液、血清、臓器などの組織から得た試料がある。
次に本発明の酸化傷害タンパク質解析用タグの製造方法について説明する。
本発明の親和性ペプチドタグは、該ペプチドタグをコードする核酸分子を適当なベクターに組み込んで発現させるか、又は化学的な合成方法により製造することができる。化学的に合成する場合、合成用担体にアミノ酸を順次結合させ、続いて、リンカーY及び残基Zを結合させる方法と、適当な担体に残基ZとリンカーYを結合させ、そこにアミノ酸を順次結合させていく方法のいずれで製造してもよい。 In the analysis method, the usage ratio of the analysis tags 1 and 2 can be arbitrarily determined, but it is usually preferable to use the analysis tags 1 and 2 in equimolar amounts.
In these embodiments, the standard sample and the sample to be analyzed are not particularly limited. For example, as a standard sample, a sample obtained from a tissue such as blood, serum, or organ of a healthy person, or a sample to be analyzed is used. There are samples obtained from tissues such as blood, serum, and organs of persons with diseases.
Next, the manufacturing method of the tag for oxidative damage protein analysis of this invention is demonstrated.
The affinity peptide tag of the present invention can be produced by incorporating a nucleic acid molecule encoding the peptide tag into an appropriate vector for expression, or by a chemical synthesis method. In the case of chemical synthesis, amino acids are sequentially bound to a carrier for synthesis, followed by linker Y and residue Z, and residues Z and linker Y are bound to an appropriate carrier, and amino acids are bound thereto. You may manufacture by any method of combining sequentially.

本発明の親和性ペプチドタグの製造には、通常、市販のペプチド・タンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、4-ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、4-メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、4-ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、4-（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、4-（2',4'-ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。   For the production of the affinity peptide tag of the present invention, commercially available resins for peptide / protein synthesis can usually be used. Examples of such resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethyl. Examples include phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. it can.

このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする前記ペプチドタグの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。また、リンカーYがアミノ酸、又はその誘導体からなる場合、該ペプチドタグに続いて、自体公知の各種縮合方法に従い、該リンカーYを樹脂上で縮合させ、続いて、リンカーY最後のアミノ酸に所定の化合物を反応させ残基Zを導入する。該反応の最後に樹脂から本発明の解析用タグを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに必要な場合、高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の解析用タグ得る。   Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the desired sequence of the peptide tag according to various known condensation methods. Further, when the linker Y is composed of an amino acid or a derivative thereof, following the peptide tag, the linker Y is condensed on a resin according to various condensation methods known per se. The compound is reacted to introduce residue Z. At the end of the reaction, the analytical tag of the present invention is cut out from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed. If necessary, an intramolecular disulfide bond forming reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target analytical tag. .

上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ペプチド・タンパク質合成に使用する各種活性化試薬を用いることができ、特に、カルボジイミド類が好ましい。該カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-（3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどがある。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行った後に樹脂に添加することができる。   With respect to the condensation of the above-mentioned protected amino acids, various activating reagents used for peptide / protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferred. Examples of the carbodiimides include DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like. For activation by these, a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (for example, HOBt, HOBt), or the protected amino acid is activated in advance as a symmetric acid anhydride, HOBt ester or HOBt ester. It can later be added to the resin.

前記保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、ペプチド・タンパク質縮合反応に使用できる溶媒から適宜選択する。例を挙げると、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、又はこれらの混合物を用いることができる。   The solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin is appropriately selected from solvents that can be used for the peptide / protein condensation reaction. For example, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, acid amides such as N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, dimethyl Sulfoxides such as sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or a mixture thereof can be used.

反応温度は、タンパク質結合形成反応に適している範囲から適宜選択するが、通常−２０℃〜５０℃の範囲である。活性化されたアミノ酸誘導体は、通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストを行い、縮合が不十分な場合には、保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことで十分な縮合を行うことができる。該反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸、又はアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。   Although reaction temperature is suitably selected from the range suitable for protein bond formation reaction, it is the range of -20 degreeC-50 degreeC normally. The activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times. When a test using the ninhydrin reaction is performed and the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. If sufficient condensation is not obtained even after repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole.

原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、4-メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、2-ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。   Examples of the protecting group for the amino group of the raw material include Z, Boc, tertiary pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, and trifluoroacetyl. , Phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc, and the like.

該アミノ酸のカルボキシル基の保護は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、2-アダマンチルなどの直鎖状、分枝状、又は環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、4-ニトロベンジルエステル、4-メトキシベンジルエステル、4-クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって行う。   The protection of the carboxyl group of the amino acid is, for example, alkyl esterification (eg, linear, branched, such as methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl). Or cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonyl It is carried out by hydrazide, tertiary butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.

また、セリンの水酸基の保護は、例えば、エステル化、又はエーテル化によって行うことができる。該エステル化に適したる基を挙げると、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などがある。また、該エーテル化に適した基を挙げると、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチル基などがある。   Moreover, protection of the hydroxyl group of serine can be performed by, for example, esterification or etherification. Examples of groups suitable for esterification include groups derived from carbonic acid such as lower alkanoyl groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, benzyloxycarbonyl groups, and ethoxycarbonyl groups. Examples of groups suitable for etherification include benzyl, tetrahydropyranyl, and t-butyl groups.

また、チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどがあり、ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどを挙げることができる。   Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl2-Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, and tertiary butyl. Examples of the protecting group for imidazole of histidine include Tos, 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like can be mentioned.

保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒、又はＰｄ−炭素などの触媒の存在下における水素気流中での接触還元や、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、又はこれらの混合液による酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また、液体アンモニア中ナトリウムによる還元などがある。前記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は、前記1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理により除去することができる。前記縮合反応に関与すべきでない官能基の保護、保護基、及びその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択することができる。   Examples of the method for removing (eliminating) the protecting group include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfone. There are acid treatment with acid, trifluoroacetic acid, or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like. The elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of about −20 ° C. to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethyl sulfide, 1,4 -Addition of a cation scavenger such as butanedithiol or 1,2-ethanedithiol is effective. The 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is the 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it can be removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like. Protection of a functional group that should not participate in the condensation reaction, protection group, elimination of the protective group, activation of a functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.

前記担体上に形成された本発明の解析用タグを、公知の溶媒、及び離脱剤を用いて処理することにより、該担体から除去し、凍結乾燥法などにより固体、又は粉末の状態で得ることができる。
本発明の解析用タグを用いた、酸化傷害タンパク質の解析方法について説明する。
また、本発明の解析用タグの捕獲に用いる金属イオンは、前記ペプチドタグと親和性を有する限り特に制限されない。該金属イオンの例を挙げると、Cu2＋、Zn2＋、Ni2＋、Ca2＋、Co2＋、Mg2＋などの２価金属イオン、特にNi2＋イオンが好ましい。通常、これらの金属イオンを担持する担体は、特に限定する必要はないが、各種ゲル、特にアガロースゲルが好ましい。親和性ペプチドタグを捕獲する金属イオン−担体は、ゲル上で所望の金属イオンを配位したキレート形成を行うことにより調製することができる。該ゲルを固定する支持体として、ガラス板、プラスチック板、96ウェルプレートなどを用いることができる。特に該キレート化金属イオン−ゲルを、ウェル底部に形成した96ウェルプレートを用いることにより、酸化傷害タンパク質検出の自動化を容易に行うことができる。 The analysis tag of the present invention formed on the carrier is removed from the carrier by treatment with a known solvent and a releasing agent, and obtained in a solid or powder state by a freeze drying method or the like. Can do.
A method for analyzing an oxidatively damaged protein using the analysis tag of the present invention will be described.
Further, the metal ion used for capturing the analysis tag of the present invention is not particularly limited as long as it has an affinity for the peptide tag. As examples of the metal ions, divalent metal ions such as Cu 2+ , Zn 2+ , Ni 2+ , Ca 2+ , Co 2+ , and Mg 2+ , particularly Ni 2+ ions are preferable. Usually, the carrier supporting these metal ions is not particularly limited, but various gels, particularly agarose gels are preferable. The metal ion-carrier that captures the affinity peptide tag can be prepared by chelating with the desired metal ion coordinated on the gel. As the support for fixing the gel, a glass plate, a plastic plate, a 96-well plate, or the like can be used. In particular, by using a 96-well plate in which the chelated metal ion-gel is formed at the bottom of the well, the detection of oxidative damage protein can be easily performed.

なお、金属イオン固定化担体と親和性ペプチドタグの結合力は、配位した金属イオンの種類、及び溶液の pHに依存する。本発明においては、該溶液のｐHは通常６〜９，特に7.5〜8.5が好ましい。一方、金属イオン固定化担体と親和性ペプチドタグの結合力は、界面活性剤や高塩濃度バッファーには影響され難いので、これらを必要とする膜タンパク質の精製にも用いることができる。なお、該担体に捕獲された、本発明の解析用タグ−酸化傷害タンパク質複合体は、キレート剤、酸、又はアルカリを加えて、該親和性ペプチドタグと金属イオンとの結合を切り離して回収することができる。また、該複合体は、リンカーYに設けたプロテアーゼ切断部位に、所定のプロテアーゼを作用させることで、担体−解析用タグ複合体から切り離して回収することができる。   The binding force between the metal ion-immobilized carrier and the affinity peptide tag depends on the type of coordinated metal ion and the pH of the solution. In the present invention, the pH of the solution is usually 6 to 9, particularly preferably 7.5 to 8.5. On the other hand, since the binding force between the metal ion-immobilized carrier and the affinity peptide tag is hardly affected by the surfactant or the high salt concentration buffer, it can be used for purification of membrane proteins that require them. The analysis tag-oxidative damage protein complex of the present invention captured on the carrier is recovered by adding a chelating agent, acid, or alkali to separate the bond between the affinity peptide tag and the metal ion. be able to. The complex can be separated from the carrier-analysis tag complex and recovered by allowing a predetermined protease to act on the protease cleavage site provided in the linker Y.

回収された酸化傷害タンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー質量分析計、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、逆相クロマトグラフィー、イオン対クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーなどを使って同定、及び定量することができる。   Recovered oxidatively damaged proteins are subjected to ion exchange chromatography, high performance liquid chromatography, liquid chromatography mass spectrometry, column chromatography, polyacrylamide gel electrophoresis, reverse phase chromatography, ion pair chromatography, affinity chromatography, etc. Can be used for identification and quantification.

本発明の解析用タグを用いて得られた酸化傷害タンパク質は、さらにカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、逆相クロマトグラフィー、イオン対クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーなどにより、さらに二次精製することができる。   The oxidatively damaged protein obtained using the analysis tag of the present invention is further subjected to secondary purification by column chromatography, polyacrylamide gel electrophoresis, reverse phase chromatography, ion pair chromatography, affinity chromatography, and the like. be able to.

生体内の活性酸素によって導かれるタンパク質の非生理的な翻訳後修飾（酸化傷害）、特にアルギニン残基、リジン残基、プロリン残基、及びスレオニン残基のアルデヒド化は老化にとどまらず多くの疾病と関連していることが報告されている。本実施例では、親和性タグのC末端側にアルデヒド基と共有結合するヒドラジドを付加した酸化傷害タンパク質解析用タグを調製し、これによってアルデヒド化されたタンパク質を精製して同定した。   Non-physiological post-translational modification (oxidative damage) of proteins induced by reactive oxygen in the body, especially aldehyde formation of arginine, lysine, proline, and threonine residues is not limited to aging. Has been reported to be related. In this example, an oxidative damage protein analysis tag was prepared by adding a hydrazide covalently bonded to an aldehyde group to the C-terminal side of the affinity tag, and the aldehyded protein was purified and identified.

（実施例１）酸化傷害タンパク質を標的物質とする酸化傷害タンパク質解析用タグ（I）の製造
本実施例では、下記解析用タグ(I)を製造した。
HGHAHGHAHGHAHGHGHAHG-EGAGA-ヒドラジド
親和性ペプチドタグ HGHAHGHAHGHAHGHGHAHG （配列番号：１）
リンカーY EGAGA （配列番号：２）
ヒドラジド -NH(CH(CH3))CO(NH(NH2))
該解析用タグ(I)の製造を次のように行った。まず、ポリスチレンクロロトリチルクロライド 樹脂(BeadTech社、3.0 g、1.3 mmol/g、3.9 mmol)をヒドラジン(10 eq.)を含む無水N-メチル-2-ピリロリドン(NMP)(15 mL)溶液中、室温で10時間振とうした。この樹脂をフィルターにかけてろ過し、NMP 20mLで3回洗って、減圧下で乾燥しトリヒドラジン樹脂1を得た。親和性ペプチドタグの合成はこのトリヒドラジン樹脂1を用いて手動で行った。 Example 1 Production of Oxidation Damage Protein Analysis Tag (I) Using Oxidation Damage Protein as a Target Substance In this example, the following analysis tag (I) was produced.
HGHAHGHAHGHAHGHGHAHG-EGAGA-hydrazide affinity peptide tag HGHAHGHAHGHAHGHGHAHG (SEQ ID NO: 1)
Linker Y EGAGA (SEQ ID NO: 2)
Hydrazide -NH (CH (CH 3 )) CO (NH (NH 2 ))
The analysis tag (I) was produced as follows. First, polystyrene chlorotrityl chloride resin (BeadTech, 3.0 g, 1.3 mmol / g, 3.9 mmol) in a solution of anhydrous hydrazine (10 eq.) In N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) (15 mL) at room temperature Shake for 10 hours. The resin was filtered through a filter, washed with 20 mL of NMP three times, and dried under reduced pressure to obtain trihydrazine resin 1. The synthesis of the affinity peptide tag was performed manually using this trihydrazine resin 1.

合成に使用したFmocアミノ酸は0.5 MのNMP溶液として使用した。カップリング試薬はあらかじめNMP(0.5 M)溶液として調製し、活性剤N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)は2Mの濃度に調製した。全工程において、アミノ酸とカップリング試薬をトリヒドラジン樹脂１に対して10等量使用し、１回のカップリング反応は2時間行った。Fmoc 脱保護化は20%ピペリジン-NMP溶液を用いて行った。また、樹脂からのペプチド切断、並びにアミノ酸側鎖の脱保護を行うためTFA/H2O(95:5 v/v)中で、該樹脂を3時間処理した。該樹脂をTFAで洗って、ろ液を減圧蒸留により濃縮した。この溶液にジエチルエーテルを加えて粗ペプチドを沈殿させて、遠心によって集め、H2Oに溶かして凍結乾燥した。該ペプチドの収量を、Shimadzu Shim-pack C-18カラム(250×4.6 mm, 5 μm, 100 Å、HPLC流量 1 mL/min)を用いて、高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製HPLC SCL-10A (UV (230 nm)検出器)）で決定した。収率は 7.4%（MALDI-TOF [M+H]+ calcd 2415.8, found 2416.3）であった。 The Fmoc amino acid used for the synthesis was used as a 0.5 M NMP solution. The coupling reagent was prepared in advance as an NMP (0.5 M) solution, and the activator N, N′-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) were prepared at a concentration of 2M. In all the steps, 10 equivalents of an amino acid and a coupling reagent were used with respect to trihydrazine resin 1, and one coupling reaction was performed for 2 hours. Fmoc deprotection was performed using a 20% piperidine-NMP solution. The resin was treated with TFA / H 2 O (95: 5 v / v) for 3 hours in order to cleave the peptide from the resin and deprotect the amino acid side chain. The resin was washed with TFA and the filtrate was concentrated by vacuum distillation. Diethyl ether was added to this solution to precipitate the crude peptide, collected by centrifugation, dissolved in H 2 O and lyophilized. The yield of the peptide was measured by high performance liquid chromatography (HPLC SCL-10A (Shimadzu Corporation) using a Shimadzu Shim-pack C-18 column (250 × 4.6 mm, 5 μm, 100 μm, HPLC flow rate 1 mL / min). UV (230 nm) detector)). The yield was 7.4% (MALDI-TOF [M + H] + calcd 2415.8, found 2416.3).

（実施例２） 酸化傷害タンパク質解析用タグ（II）の製造
本実施例では、下記解析用タグ(II)を製造した。
HGHAHGHGHAHGEGAGA-ヒドラジド
親和性ペプチドタグ HGHAHGHGHAHG （配列番号：３）
リンカーY EGAGA （配列番号：２）
ヒドラジド -NH(CH(CH3))CO(NH(NH2))
配列番号１の親和性ペプチドタグから、配列番号３でヒスチジン数６の親和性ペプチドタグにした他は、実施例１を同様な方法で、該解析用タグを製造し、回収した。 (Example 2) Production of tag for oxidative damage protein analysis (II) In this example, the following analysis tag (II) was produced.
HGHAHGHGHAHGEGAGA-hydrazide affinity peptide tag HGHAHGHGHAHG (SEQ ID NO: 3)
Linker Y EGAGA (SEQ ID NO: 2)
Hydrazide -NH (CH (CH 3 )) CO (NH (NH 2 ))
The analysis tag was produced and recovered in the same manner as in Example 1 except that the affinity peptide tag of SEQ ID NO: 1 was changed to the affinity peptide tag of SEQ ID NO: 3 and having 6 histidines.

（実施例３） 酸化状態のペプチドの分離及び精製
下記配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドである、アンジオテンシン（以下、AngIIと略す）に、人工的に酸化傷害を与え、アルデヒド化されたAngIIを生成し、その精製を試みた。 Example 3 Separation and Purification of Oxidized Peptide Angiotensin (hereinafter abbreviated as “AngII”), which is a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO. And attempted to purify it.

AngII：DRVYIHPF （配列番号：４）
まず、AngII濃度200Mの水溶液を調製した。次いで該AngII溶液10lに、NaOCl 濃度60Mの溶液を加えて、37℃で30分間静置することにより、酸化されたAngII（以下OxAngIIと略す。）の溶液(2)を調製した。次にOxAngII溶液(2) 10lに、実施例２で得た解析用タグ(II)の４ｍM溶液10lを加え、67℃で、10分間反応させることで、酸化傷害タンパク質解析用タグ(II)を付加したOxAngII溶液(3)を調製した。その後、1Mトリス緩衝液(pH9)を用いて溶液(3)のpHを7.5以上とし、該溶液(3)をキレート化されたNi2+イオンを担持した磁気ビーズ（商品名Ni-NTA Magnetic Agarose Beads, QIAGEN社 米国）に4℃で30分間接触させ、トリス緩衝液(pH 8.0)で3回洗浄した後、0.1% TFAを含むH2Oを用いて該解析用タグ(II)を除去し、精製、濃縮されたOxAngIIを含む溶液(4)を調製した。続いて、各状態のAngIIを液体クロマトグラフィー質量分析計（LC-MS, 質量分析: LCQDECA (Thermo Electron 社製, ドイツ), HPLC: ナノスペース SI-2(資生堂製)）で測定した。 AngII: DRVYIHPF (SEQ ID NO: 4)
First, an aqueous solution with an Ang II concentration of 200M was prepared. Next, a solution (2) of oxidized AngII (hereinafter abbreviated as OxAngII) was prepared by adding a solution having a NaOCl concentration of 60 M to 10 l of the AngII solution and allowing to stand at 37 ° C. for 30 minutes. Next, 10 l of the OxAngII solution (2) 10 l of the analysis tag (II) 4 mM solution obtained in Example 2 was added and reacted at 67 ° C. for 10 minutes, whereby the oxidative damage protein analysis tag (II) was added. An added OxAngII solution (3) was prepared. Thereafter, the pH of the solution (3) is adjusted to 7.5 or higher using 1 M Tris buffer (pH 9), and the solution (3) is magnetically loaded with chelated Ni 2+ ions (trade name: Ni-NTA Magnetic Agarose Contacted Beads, QIAGEN USA) for 30 minutes at 4 ° C, washed 3 times with Tris buffer (pH 8.0), and then removed the analysis tag (II) using H 2 O containing 0.1% TFA. A solution (4) containing purified, concentrated OxAngII was prepared. Subsequently, AngII in each state was measured with a liquid chromatography mass spectrometer (LC-MS, mass spectrometry: LCQ DECA (manufactured by Thermo Electron, Germany), HPLC: Nanospace SI-2 (manufactured by Shiseido)).

該測定結果を図１及び２に基づき説明する。図１及び２は各状態のAngII溶液(1)〜(4)を液体クロマトグラフィー質量分析計（LC-MS）で測定した結果である。図１は,MSクロマトグラムであり、図２(1)〜(4)は、図１の(1)〜(4)それぞれの滞留時間19.5〜22.5 分（点線四角領域）で検出されたペプチドの MS スペクトルである。   The measurement results will be described with reference to FIGS. 1 and 2 show the results of measuring the Ang II solutions (1) to (4) in each state with a liquid chromatography mass spectrometer (LC-MS). Fig. 1 is an MS chromatogram, and Figs. 2 (1) to (4) show the peptides detected at the residence times of 19.5 to 22.5 minutes (dotted square area) in Fig. 1 (1) to (4), respectively. MS spectrum.

図１の(1)は未処理のAngIIを含む、一つの状態であるためシャープなクロマトグラムが1本検出されている。AngIIの分子量は約1045.5であり、これを反映して図２のMSスペクトル(1)では、分子量／イオン価価(m/z) 約1046.5 (a1+)に1価にイオン化されたスペクトルが、m/z 約524.7 (a2+)に2価にイオン化されたスペクトルが観測されている。   Since (1) in FIG. 1 is a single state containing untreated AngII, one sharp chromatogram is detected. Reflecting this, AngII has a molecular weight of about 1045.5. In the MS spectrum (1) of FIG. 2, the spectrum obtained by ionizing the univalent ion to the molecular weight / ion valence (m / z) of about 1046.5 (a1 +) is m / z A divalent ionized spectrum is observed at about 524.7 (a2 +).

AngII溶液(2) は、人為的に酸化された AngII（OxAngII）を含み、この状態の変化にともない、図１のMSクロマトグラム(2)が滞留時間の遅い方向にシフトし、数本に分裂している。図２のMSスペクトル(2)もm/z 980〜1140までの様々な酸化状態を反映している。該MSスペクトル(2)の▼b1+ 部分が1価イオン、▼b2+ 部分が2価イオンに対応している。   The AngII solution (2) contains artificially oxidized AngII (OxAngII). As this state changes, the MS chromatogram (2) in Fig. 1 shifts toward a slower residence time and splits into several. doing. The MS spectrum (2) in FIG. 2 also reflects various oxidation states from m / z 980 to 1140. In the MS spectrum (2), the ▼ b1 + portion corresponds to a monovalent ion and the ▼ b2 + portion corresponds to a divalent ion.

AngII溶液(3)は、溶液(2)に、実施例２で調製した本発明の解析用タグ(II)を加えて反応させたものであり、図１(3)のクロマトグラムには、滞留時間約20〜21分の間に新たなピークが示されている。また、図２(3)のMS スペクトルの▼c2+ 〜 ▼c6+ で示した部分にそれぞれ2価〜6価のイオンが観測されている。分子量約980〜1140のOxAngIIに本発明の解析用タグ(II)（分子量約1640）が付加することによって分子量は約2620〜2780となり、該分子の2価イオンはm/zは約1310〜1390，3価イオンは約870〜930となる。図１(2)で観測されたOxAngIIの全てがアルデヒド化されているわけではないので、図２(3)で新たに観測された前記解析用タグ(II)付加物のスペクトルの数は減少しているが、概算値と観測されたスペクトルのm/zは一致していた。   The AngII solution (3) is obtained by adding the analysis tag (II) of the present invention prepared in Example 2 to the solution (2) and causing the reaction, and in the chromatogram of FIG. A new peak is shown between about 20-21 minutes of time. In addition, divalent to hexavalent ions are observed in the portions indicated by ▼ c2 + to ▼ c6 + in the MS spectrum of FIG. By adding the analysis tag (II) of the present invention (molecular weight about 1640) to OxAngII having a molecular weight of about 980 to 1140, the molecular weight becomes about 2620 to 2780, and the divalent ion of the molecule has an m / z of about 1310 to 1390. , Trivalent ions are about 870-930. Since not all of OxAngII observed in FIG. 1 (2) is aldehyded, the number of spectra of the analytical tag (II) adduct newly observed in FIG. 2 (3) decreases. However, the approximate value and the m / z of the observed spectrum were in agreement.

AngII溶液(4)は、AngII溶液(3)の試料の中から解析用タグ(II)が付加したOxAngIIをNiカラムで精製したものである。図２(3)で観測されていたOxAngII由来のスペクトル（▼b1+、及び▼b2+）は消失し、図２(3)で新たに観測された解析用タグ(I)-OxAngII由来のスペクトル（▼c2+〜▼c6+）だけが観測された。したがって、本発明の解析用タグ(II)を使うことによって、該解析用タグ(II)と結合する、様々な酸化状態のアルデヒド化されたペプチドが精製されたことが分かる。   The AngII solution (4) is obtained by purifying OxAngII, to which the analysis tag (II) is added, from the sample of the AngII solution (3) using a Ni column. The spectrum derived from OxAngII (▼ b1 + and ▼ b2 +) observed in Fig. 2 (3) disappears, and the spectrum derived from the new analytical tag (I) -OxAngII observed in Fig. 2 (3) (▼ Only c2 + ~ ▼ c6 +) were observed. Therefore, it can be seen that by using the analysis tag (II) of the present invention, aldehyde-ized peptides in various oxidation states that bind to the analysis tag (II) were purified.

(実施例４) 酸化状態ペプチドへの解析用タグ(I)の付加、及び分離
実施例３と同様にAngIIに人工的に酸化傷害を与え、アルデヒド化されたOxAngIIを生成し、該OxAngIIへの解析用タグ(I)の付加、及び分離を試みた。
AngII：DRVYIHPF （配列番号：４）
解析用タグ(I)：HGHAHGHAHGHAHGHGHAHG-EGAGA-ヒドラジド
まず、AngII濃度200Mの溶液を調製し、該AngII溶液10lに、NaOCl 濃度60Mの溶液を加えて、37℃で30分間静置することにより、OxAngIIの溶液を調製した。次に該OxAngII溶液10lに、実施例１で得た解析用タグ(I)の４ｍM溶液10lを加え、67℃で、10分間反応させることで、該解析用タグ(I)を付加したOxAngII溶液(1)を調製した。その後、1Mトリス緩衝液(pH9)を用いて溶液(1)のpHを7.5以上とし、該溶液(1)をキレート化されたNi2+イオンを担持した磁気ビーズ（商品名Ni-NTA Magnetic Agarose Beads, QIAGEN社 米国）に4℃で30分間接触させ、トリス緩衝液(pH 8.0)で3回洗浄した。 (Example 4) Addition and separation of analytical tag (I) to oxidized state peptide As in Example 3, AngII was artificially damaged by oxidization to produce aldehyded OxAngII. An attempt was made to add and separate the tag (I) for analysis.
AngII: DRVYIHPF (SEQ ID NO: 4)
Tag for analysis (I): HGHAHGHAHGHAHGHGHAHG-EGAGA-hydrazide First, prepare a solution with an AngII concentration of 200M, add a solution with a NaOCl concentration of 60M to 10l of the AngII solution, and leave it at 37 ° C for 30 minutes to obtain OxAngII. A solution of was prepared. Next, 10 l of the analysis tag (I) 4 mM solution obtained in Example 1 was added to 10 l of the OxAngII solution and reacted at 67 ° C. for 10 minutes to thereby add the analysis tag (I) to the OxAngII solution. (1) was prepared. Thereafter, the pH of the solution (1) is adjusted to 7.5 or higher using 1 M Tris buffer (pH 9), and the solution (1) is magnetic beads carrying a chelated Ni 2+ ion (trade name: Ni-NTA Magnetic Agarose Beads, QIAGEN USA) was contacted at 4 ° C. for 30 minutes, and washed 3 times with Tris buffer (pH 8.0).

この磁気ビーズに100mM酢酸アンモニウム溶液20lを加え、さらにV8プロテアーゼ(エンドプロテイナーゼ Glu-C )溶液10lを加えて、25℃で約18時間切断反応を行い、該解析用タグ(I)を除去し、精製、濃縮されたOxAngIIを含む溶液(2)を調製した。続いて、該溶液(1)及び(2)中のAngIIを液体クロマトグラフィー質量分析計（LC-MS, 質量分析: LCQDECA (Thermo Electron 社製, ドイツ), HPLC: ナノスペース SI-2(資生堂製)）で測定した。なお、Ｖ８プロテアーゼの切断部位は、該解析用タグ(I)のリンカー（ＥGAGA）左端、親和性ペプチドタグとの境にあるグルタミン酸残基(E)である。 To this magnetic bead, 20 l of a 100 mM ammonium acetate solution is added, and further 10 l of a V8 protease (endoproteinase Glu-C) solution is added, and a cleavage reaction is performed at 25 ° C. for about 18 hours to remove the analysis tag (I), A solution (2) containing purified and concentrated OxAngII was prepared. Subsequently, AngII in the solutions (1) and (2) was subjected to liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS, mass spectrometry: LCQ DECA (manufactured by Thermo Electron, Germany), HPLC: Nanospace SI-2 (Shiseido) ))). The cleavage site of V8 protease is the glutamic acid residue (E) at the border between the linker (EGAGA) left end of the analysis tag (I) and the affinity peptide tag.

該測定結果を図３、４及び表１に基づき説明する。図３は、液体クロマトグラフィー質量分析計（LC-MS, 質量分析: LCQDECA (Thermo Electron 社製, ドイツ)、HPLC: ナノスペース SI-2(資生堂製)）で測定した、MS クロマトグラムである。
図３は、各滞留時間における該解析用タグ(I)付加OxAngII（切断前） の MSクロマトグラム 強度(1)、及び該解析用タグ(I)切断後の OxAngII の MSクロマトグラム(2)を示す。また、図４の(1)及び(2)は、それぞれ図３(1)及び(2)の滞留時間9.5〜12分 (破線で囲った部分)で測定されたペプチドの MS スペクトルである。 The measurement results will be described with reference to FIGS. FIG. 3 is an MS chromatogram measured with a liquid chromatography mass spectrometer (LC-MS, mass spectrometry: LCQ DECA (Thermo Electron, Germany), HPLC: Nanospace SI-2 (Shiseido)). .
Figure 3 shows the MS chromatogram intensity (1) of the analysis tag (I) -added OxAngII (before cleavage) and the MS chromatogram (2) of OxAngII after cleavage of the analysis tag (I) at each residence time. Show. Moreover, (1) and (2) of FIG. 4 are the MS spectra of the peptides measured at the residence time of 9.5 to 12 minutes (the part surrounded by a broken line) in FIGS. 3 (1) and (2), respectively.

該解析用タグ(I)の分子量は約2415.8であり、これをV8プロテアーゼで消化すると分子量約2145.65の親和性ペプチドタグと分子量約288.15のリンカーY部分に加水分解される。また、本実施例で生成されてOxAngIIは、アルギニン残基のアルデヒド化を伴ったAngIIで、分子量は約1000.6である。該OxAngIIに該解析用タグ(I)を付加すると、分子量約3398.4 (2415.8+1000.6-18)の該解析用タグ(I)-OxAngIIが生成される。ここで、前記計算式の -18 はアルデヒドと該解析用タグ(I)のヒドラジドが結合する際に、生成、分離される水分子の分子量である。   The molecular weight of the analytical tag (I) is about 2415.8, and when it is digested with V8 protease, it is hydrolyzed into an affinity peptide tag having a molecular weight of about 2145.65 and a linker Y portion having a molecular weight of about 288.15. In addition, OxAngII produced in this example is AngII accompanied by aldehyde formation of an arginine residue and has a molecular weight of about 1000.6. When the analysis tag (I) is added to the OxAngII, the analysis tag (I) -OxAngII having a molecular weight of about 3398.4 (2415.8 + 1000.6-18) is generated. Here, −18 in the above calculation formula is the molecular weight of water molecules generated and separated when the aldehyde and the hydrazide of the analytical tag (I) are combined.

さらに該解析用タグ(I)-OxAngIIをV8プロテアーゼで消化すると分子量約1270.8 (3398.4-2145.7+18)のOxAngIIとなる。前記計算式における+18はV8プロテアーゼにより該解析用タグ(I)のグルタミン酸残基（E）がC末端で加水分解されたときに付加される水分子の分子量である。各反応後の生成物の分子量、及び観測されたMSスペクトルのm/zを表1にまとめた。なお、図４(1)における▼a2＋〜▼a8+ はそれぞれ親和性ペプチドタグ付加-OxAngIIのスペクトル（2価〜8価）を示し、かつ図４(2)における記号 ▼b1+ 〜▼b3+ はそれぞれ、親和性ペプチドタグ付加-OxAngIIを切断した後OxAngIIスペクトル（1価〜3価）を示している。図４(1)及び(2)の双方とも分子量は計算値（表１）に一致している。したがって、V８プロテアーゼによる親和性ペプチドタグ切断処理により、ほぼ全ての該解析用タグ(I)の親和性ペプチドタグが除去されたことがわかる。   Further, when the analysis tag (I) -OxAngII is digested with V8 protease, it becomes OxAngII having a molecular weight of about 1270.8 (3398.4-2145.7 + 18). +18 in the above calculation formula is the molecular weight of a water molecule added when the glutamic acid residue (E) of the analytical tag (I) is hydrolyzed at the C-terminus by V8 protease. Table 1 summarizes the molecular weight of the product after each reaction and the m / z of the observed MS spectrum. In addition, ▼ a2 + to ▼ a8 + in FIG. 4 (1) respectively show the spectrum (2-valent to 8-valent) of affinity peptide tag-added-OxAngII, and symbols ▼ b1 + to ▼ b3 + in FIG. The OxAngII spectrum (monovalent to trivalent) is shown after cleaving affinity peptide tagging-OxAngII. In both FIGS. 4 (1) and 4 (2), the molecular weights agree with the calculated values (Table 1). Therefore, it can be seen that almost all the affinity peptide tags of the analysis tag (I) were removed by the affinity peptide tag cleavage treatment with V8 protease.

(実施例５) 安定同位体標識解析用タグ(I)による酸化傷害タンパク質の検出
未知試料を質量分析計で分析する場合、標的タンパク質を判別することが重要である。本実施例では、酸化傷害タンパク質を標的タンパク質として判別するため、安定同位体標識アミノ酸で標識した解析用タグ(I)を使用して、該タンパク質の検出を行った。 (Example 5) Detection of oxidative damage protein by tag (I) for stable isotope labeling analysis When an unknown sample is analyzed by a mass spectrometer, it is important to discriminate a target protein. In this example, in order to discriminate an oxidatively damaged protein as a target protein, the protein was detected using an analysis tag (I) labeled with a stable isotope-labeled amino acid.

まず、水素核を重水素核で標識したアミノ酸を用いて、リンカーY部分（GAGA）形成した他は、実施例１と同じ手順で酸化傷害タンパク質解析用タグ(I)を製造した。該標識解析用タグ(I)を、解析用タグ(I-d10)と表記する。また、標識されていない解析用タグ(I)を、解析用タグ(I-d0)と、また解析用タグ(I-d10)、及び解析用タグ(I-d0)を等量混合したものを解析用タグ(I-mix)と表記する。次に、AngII濃度200Mの溶液を調製し、該AngII溶液10lにNaOCl 濃度60Mの溶液を加えて、37℃で30分間静置することにより、OxAngIIの溶液を調製した。該溶液に、解析用タグ(I-mix)４ｍM溶液10lを加え、67℃で、10分間反応させて、解析用タグ(I-mix)-OxAngIIを形成した。該解析用タグ(I-mix)-OxAngIIを含む溶液を、液体クロマトグラフィー質量分析計（LC-MS）で分析し、MS クロマトグラムとMSスペクトルを得た。   First, an oxidative damage protein analysis tag (I) was produced by the same procedure as in Example 1 except that a linker Y moiety (GAGA) was formed using an amino acid labeled with a deuterium nucleus. The label analysis tag (I) is referred to as an analysis tag (I-d10). In addition, an analysis tag (I) that is not labeled is mixed with an equal amount of an analysis tag (I-d0), an analysis tag (I-d10), and an analysis tag (I-d0). It is written as an analysis tag (I-mix). Next, a solution with an AngII concentration of 200M was prepared, a solution with a NaOCl concentration of 60M was added to 10 liters of the AngII solution, and the solution was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes to prepare an OxAngII solution. To this solution, 10 l of a 4 mM solution for analysis tag (I-mix) was added and reacted at 67 ° C. for 10 minutes to form analysis tag (I-mix) -OxAngII. The solution containing the analysis tag (I-mix) -OxAngII was analyzed with a liquid chromatography mass spectrometer (LC-MS) to obtain an MS chromatogram and an MS spectrum.

図５は、該解析用タグ(I-mix)-OxAngIIを検出したMSスペクトルを示す。挿入図５A、５B及び５Cはそれぞれ、5価（▼5+）、4価（▼4+）、及び3価（▼3+）のMSスペクトルの拡大図である。本実施例では、前記試料溶液中には、分子量約 1000.6のOxAngIIに、分子量約2415.8の解析用タグ(I-d0)と約2425.8の解析用タグ(I-d0)とが脱水反応で付加された、それぞれ分子量約3398.4の解析用タグ(I-d0)-OxAngIIと約3408.4の解析用タグ(I-d10)-OxAngIIが生成されている。このとき観測されたMSスペクトルの1価〜8価イオンのm/zを表２にまとめた。また図5の挿入図から、3価、4価、及び5価イオンにおいて、分子量の差がそれぞれ約3.3、2.5、2.0のダブレットスペクトルが観測された。   FIG. 5 shows an MS spectrum in which the analysis tag (I-mix) -OxAngII was detected. Insets 5A, 5B, and 5C are enlarged views of the pentavalent (▼ 5 +), tetravalent (▼ 4 +), and trivalent (▼ 3 +) MS spectra, respectively. In this example, in the sample solution, an analysis tag (I-d0) having a molecular weight of about 2415.8 and an analysis tag (I-d0) having a molecular weight of about 2425.8 are added to OxAngII having a molecular weight of about 1000.6 by a dehydration reaction. In addition, an analysis tag (I-d0) -OxAngII having a molecular weight of about 3398.4 and an analysis tag (I-d10) -OxAngII having a molecular weight of about 3408.4 are generated. Table 2 shows the m / z of monovalent to octavalent ions observed in the MS spectrum. From the inset of FIG. 5, doublet spectra having molecular weight differences of about 3.3, 2.5, and 2.0 were observed for trivalent, tetravalent, and pentavalent ions, respectively.

したがって、本実施例における標的タンパク質が、酸化傷害タンパク質であることが明瞭に示されている。本発明では、このように安定同位体標識アミノ酸を使うことによって、容易に標識解析用タグをデザインすることができ、複雑な翻訳後修飾を解析することを可能にする。   Therefore, it is clearly shown that the target protein in this example is an oxidative damage protein. In the present invention, by using stable isotope-labeled amino acids as described above, a tag for label analysis can be easily designed, and complex post-translational modifications can be analyzed.

（配列表の説明）
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
（配列番号１） 実施例１において、酸化傷害タンパク質解析用タグ（I）の製造に用いた親和性ペプチドタグのアミノ酸配列である。
（配列番号２） 実施例１及び２において、酸化傷害タンパク質解析用タグ（I）及び(II)の製造に用いたリンカーYのアミノ酸配列である。
（配列番号３） 実施例２において、酸化傷害タンパク質解析用タグ（II）の製造に用いた親和性ペプチドタグのアミノ酸配列である。
（配列番号４） 実施例３及び４において、酸化傷害ペプチドを作成するために用いられたアンジオテンシン（AngII）のアミノ酸配列である。 (Explanation of sequence listing)
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
(SEQ ID NO: 1) This is the amino acid sequence of the affinity peptide tag used in the production of the oxidative damage protein analysis tag (I) in Example 1.
(SEQ ID NO: 2) This is the amino acid sequence of linker Y used in the production of tags for oxidative damage protein analysis (I) and (II) in Examples 1 and 2.
(SEQ ID NO: 3) This is the amino acid sequence of the affinity peptide tag used in the production of the oxidative damage protein analysis tag (II) in Example 2.
(SEQ ID NO: 4) This is the amino acid sequence of angiotensin (AngII) used in Examples 3 and 4 to create an oxidative damage peptide.

本発明は、活性酸素によって発症する疾病機序の解明、活性酸素が生体に及ぼす分子機序の解明、及び酸化に伴うタンパク質の機能損失機序の解明を行うことに利用可能である。また、本発明は、疾病特異的な酸化傷害タンパク質の検出方法として活用でき、臨床試薬としての可能性を持つ。   INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be used for elucidating a disease mechanism caused by active oxygen, elucidating a molecular mechanism of active oxygen on a living body, and elucidating a functional loss mechanism of a protein accompanying oxidation. In addition, the present invention can be used as a method for detecting disease-specific oxidative damage proteins and has potential as a clinical reagent.

図１は、実施例３における各状態のAngII溶液(１)〜(４)を液体クロマトグラフィー質量分析計で測定して得たMSクロマトグラムである。FIG. 1 is an MS chromatogram obtained by measuring the Ang II solutions (1) to (4) in each state in Example 3 with a liquid chromatography mass spectrometer. 図２は、図１(１)〜(４)それぞれの滞在時間19.5〜22.51分(点線四角領域)で検出されたペプチドのMSスペクトルを示す。FIG. 2 shows the MS spectra of the peptides detected at the residence times of 19.5 to 22.51 minutes (dotted square region) in FIGS. 図３は、実施例４において、液体クロマトグラフィー質量分析計で測定した酸化傷害タンパク質解析用タグ(I)付加OxArgII(切断前)のMSクロマトグラム強度(１)、及び該解析用タグ(I)切断後のOxArgIIのMSクロマトグラム(２)を示す。FIG. 3 shows the MS chromatogram intensity (1) of the oxidatively damaged protein analysis tag (I) -added OxArgII (before cleavage) measured with a liquid chromatography mass spectrometer in Example 4, and the analysis tag (I). An MS chromatogram (2) of OxArgII after cleavage is shown. 図４は、それぞれ図３(１)、及び(２)の滞在時間9.5〜12分(破線で囲った部分)で検出されたペプチドのMSスペクトル(１)、及び(２)である。FIG. 4 shows MS spectra (1) and (2) of the peptides detected at the residence time of 9.5 to 12 minutes (the part surrounded by the broken line) in FIGS. 3 (1) and 3 (2), respectively. 図５は、実施例５における酸化傷害タンパク質解析用タグ(I-mix)-OxArgIIを検出したMSスペクトルを示す。挿入図５A、５B、及び５Cはそれぞれ、５価(▼5+)、４価(▼4+)、及び３価(▼3+)のMSスペクトルの拡大図である。FIG. 5 shows an MS spectrum in which the oxidative damage protein analysis tag (I-mix) -OxArgII in Example 5 was detected. Insets 5A, 5B, and 5C are enlarged views of the MS spectra of pentavalent (▼ 5 +), tetravalent (▼ 4 +), and trivalent (▼ 3 +), respectively. 図６は、解析用タグ１、２及び３を用いる本発明の実施態様を説明するための、質量分析の強度、及び検出位置などを示す。FIG. 6 shows mass analysis intensity, detection position, and the like for explaining an embodiment of the present invention using the analysis tags 1, 2, and 3.

Claims (28)

親和性ペプチドタグ、リンカーY、及び反応基を有する少なくとも１つの残基Zからなる、酸化傷害タンパク質解析用タグあって、該親和性ペプチドタグが少なくとも３個の(X-His)単位を有し、かつXは任意のアミノ酸、又はアミノ酸誘導体である、前記解析用タグ。   An oxidative damage protein analysis tag comprising an affinity peptide tag, a linker Y, and at least one residue Z having a reactive group, wherein the affinity peptide tag has at least three (X-His) units , And X is an arbitrary amino acid or amino acid derivative. 該親和性ペプチドタグが少なくとも４個の(X-His)単位を有する、請求項１記載の解析用タグ。   The analytical tag according to claim 1, wherein the affinity peptide tag has at least four (X-His) units. 親和性ペプチドタグ、及び反応基を有する少なくとも１つの残基Zからなる酸化傷害タンパク質解析用タグであって、該親和性ペプチドタグが少なくとも３個の(X-His)単位を有し、かつXは任意のアミノ酸、又はアミノ酸誘導体である、前記解析用タグ。   A tag for analyzing an oxidative damage protein comprising an affinity peptide tag and at least one residue Z having a reactive group, wherein the affinity peptide tag has at least 3 (X-His) units, and X Is a tag for analysis, which is any amino acid or amino acid derivative. 該親和性ペプチドタグが少なくとも４個の(X-His)単位を有する、請求項３記載の解析用タグ。   The analytical tag according to claim 3, wherein the affinity peptide tag has at least four (X-His) units. 親和性ペプチドタグ、及び反応基Zを有する少なくとも１つの残基Z、かつ下記式(1)で表される、酸化傷害タンパク質解析用タグ：
(His)l-(X-His)m-(X)n-(Y)p-Z (1)
（式中、Xはヒスチジンを除く任意のアミノ酸、又はアミノ酸誘導体であり、Yはリンカーであり、lは０又は１、ｍは４〜１００の整数、ｎは０、又は１、かつpは０、又は１である）。 An affinity peptide tag, at least one residue Z having a reactive group Z, and an oxidative damage protein analysis tag represented by the following formula (1):
(His) l- (X-His) m- (X) n- (Y) pZ (1)
(Wherein, X is any amino acid or amino acid derivative except histidine, Y is a linker, l is 0 or 1, m is an integer of 4 to 100, n is 0 or 1, and p is 0. Or 1). 前記Xが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる群から選ばれたアミノ酸である、請求項５記載の解析用タグ。   Said X is an amino acid selected from the group consisting of alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, isoleucine, lysine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, arginine, serine, threonine, valine, tryptophan and tyrosine. The analysis tag according to claim 5, wherein Xが、システイン、及びトリプトファンからなる群から選ばれたアミノ酸である、請求項５記載の解析用タグ。   The analytical tag according to claim 5, wherein X is an amino acid selected from the group consisting of cysteine and tryptophan. 式(1)中、ｍが５〜２５の整数である、請求項５記載の解析用タグ。   The analysis tag according to claim 5, wherein m is an integer of 5 to 25 in formula (1). 式(1)中、ｍが６〜１５の整数である、請求項５記載の解析用タグ。   The analysis tag according to claim 5, wherein m is an integer of 6 to 15 in the formula (1). リンカーYが、アミノ酸、及び／又はアミノ酸誘導体３〜３０個を含むペプチド配列である、請求項５記載の解析用タグ。   The analytical tag according to claim 5, wherein the linker Y is a peptide sequence containing 3 to 30 amino acids and / or amino acid derivatives. リンカーYが、標識分子を含む請求項１、３又は５のいずれか１項記載の解析用タグ。   The analysis tag according to claim 1, wherein the linker Y includes a label molecule. 残基Zの反応基がヒドラジノ基、又はヒドラジノカルボニル基である、請求項１、３又は５のいずれか１項記載の解析用タグ。   The analytical tag according to claim 1, wherein the reactive group of the residue Z is a hydrazino group or a hydrazinocarbonyl group. 下記式(2)で表される請求項５記載の解析用タグ：
HGHAHGHAHGHAHGHGHAHG-EGAGA-NH(CH(CH3))CO(NH(NH2)) 式(2)。 The analysis tag according to claim 5 represented by the following formula (2):
HGHAHGHAHGHAHGHGHAHG-EGAGA-NH (CH (CH 3 )) CO (NH (NH 2 )) Formula (2). 下記式(3)で表される請求項５記載の解析用タグ。：
HGHAHGHGHAHG-EGAGA-NH(CH(CH3))CO(NH(NH2)) 式(3)。 The analysis tag according to claim 5, which is represented by the following formula (3). :
HGHAHGHGHAHG-EGAGA-NH (CH (CH 3 )) CO (NH (NH 2 )) Formula (3). さらに親和性タグ、及び／又はリンカーYが、蛍光物質、安定同位体元素、又は放射性同位元素で標識されていることを特徴とする、請求項１、３又は５のいずれか１項記載の解析用タグ。   6. The analysis according to claim 1, 3 or 5, wherein the affinity tag and / or the linker Y is labeled with a fluorescent substance, a stable isotope element, or a radioisotope. Tags for. 請求項１、３又は５のいずれか１項記載の解析用タグを含む、酸化傷害タンパク質解析用キット。   A kit for analyzing oxidative damage protein, comprising the analysis tag according to claim 1. 請求項１、３又は５のいずれか１項記載の解析用タグを含む、酸化傷害タンパク質精製用キット。   A kit for purifying oxidative damage protein, comprising the analysis tag according to claim 1. 請求項１、３又は５のいずれか１項記載の酸化傷害タンパク質解析用タグを、試料と混合し、該混合物を、該解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、次いで、該担体から該酸化傷害タンパク質、又は酸化傷害タンパク質と該解析用タグとの複合体を回収することを特徴とする、酸化傷害タンパク質の検出方法。   The oxidative damage protein analysis tag according to any one of claims 1, 3, and 5 is mixed with a sample, and the mixture is supported with a carrier that holds a metal atom that binds to the affinity peptide tag of the analysis tag. A method for detecting an oxidative damage protein, comprising contacting the oxidative damage protein or a complex of the oxidative damage protein and the analysis tag from the carrier. さらにプロテアーゼにより、該解析用タグのリンカーを切断する工程を含む、請求項１８記載の方法。   19. The method according to claim 18, further comprising the step of cleaving the linker of the analytical tag with a protease. 請求項１、３又は５のいずれか１項記載の解析用タグを、試料と混合し、該混合物を、該解析用の親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、次いで、該担体から酸化傷害タンパク質、又は該解析用タグと酸化傷害タンパク質との複合体を回収することを特徴とする、酸化傷害タンパク質の精製方法。   6. The analytical tag according to claim 1, 3 or 5 is mixed with a sample, the mixture is contacted with a carrier holding a metal atom that binds to the analytical affinity peptide tag, and A method for purifying an oxidatively damaged protein comprising recovering an oxidatively damaged protein or a complex of the analytical tag and the oxidatively damaged protein from the carrier. 請求項１、３又は５のいずれか１項記載の解析用タグ１、及び該解析用タグ１を安定同位体標識した解析用タグ２を、試料と混合し、該混合物を、該解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、該担体から該酸化傷害タンパク質と解析用タグ１又は２とリンカーYとの複合体、或いは酸化傷害タンパク質と該解析用タグ１又は２との複合体を回収し、質量分析により分子量の相違によるダブレットピークを検出することを含む、酸化傷害タンパク質の解析方法。   The analysis tag 1 according to any one of claims 1, 3 and 5, and the analysis tag 2 obtained by labeling the analysis tag 1 with a stable isotope are mixed with a sample, and the mixture is mixed with the analysis tag. And a carrier that holds a metal atom that binds to the affinity peptide tag, and a complex of the oxidative damage protein, the analysis tag 1 or 2 and the linker Y, or the oxidative damage protein and the analysis tag 1 from the support. Or a method for analyzing an oxidatively damaged protein, comprising recovering a complex with 2 and detecting a doublet peak due to a difference in molecular weight by mass spectrometry. 請求項１、３又は５のいずれか１項記載の解析用タグ１と標準試料とを反応させ、該解析用タグ１を安定同位体標識した解析用タグ２と解析対象の試料とを反応させ、双方の反応液を混合し、該混合物を、これら解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、該担体から該酸化傷害タンパク質と解析用タグ１又は２とリンカーYとの複合体、或いは酸化傷害タンパク質と該解析用タグ１又は２との複合体を回収し、質量分析により標準試料中の酸化傷害タンパク質と、解析対象の試料中の酸化傷害タンパク質との量を比較する、酸化傷害タンパク質の解析方法。   The analysis tag 1 according to any one of claims 1, 3 and 5 is reacted with a standard sample, and the analysis tag 2 in which the analysis tag 1 is labeled with a stable isotope is reacted with the sample to be analyzed. The reaction solutions are mixed, the mixture is brought into contact with a carrier holding a metal atom that binds to the affinity peptide tag of these analytical tags, and the oxidatively damaged protein and analytical tag 1 or 2 are separated from the carrier. A complex with the linker Y or a complex between the oxidatively damaged protein and the analysis tag 1 or 2 is recovered, and the oxidatively damaged protein in the standard sample and the oxidatively damaged protein in the sample to be analyzed are analyzed by mass spectrometry. A method for analyzing oxidative damage protein, which compares the amounts. 解析用タグ１と該解析対象の試料とを反応させ、かつ解析用タグ２と該標準試料とを反応させる、請求項２２記載の方法。   The method according to claim 22, wherein the analysis tag 1 is reacted with the sample to be analyzed, and the analysis tag 2 is reacted with the standard sample. 解析用タグ１と解析用タグ２とを等モル量用いる、請求項２２記載の方法。   The method according to claim 22, wherein the analysis tag 1 and the analysis tag 2 are used in equimolar amounts. 該標準試料が、健常人の組織から得た試料であり、かつ該解析対象の試料が疾患を有する人から得た試料である、請求項２２記載の方法。   The method according to claim 22, wherein the standard sample is a sample obtained from a tissue of a healthy person, and the sample to be analyzed is a sample obtained from a person having a disease. 請求項１、３又は５のいずれか１項記載の解析用タグ１、該解析用タグ１を安定同位体標識した解析用タグ２、及び該解析用タグ１を安定同位体標識し、かつ解析用タグ２と分子量が異なる解析用タグ３とを準備し、解析用タグ１及び２と標準試料とを反応させ、次いで解析用タグ１及び３と解析対象の試料とを反応させ、双方の反応液を混合し、該混合物を、これら解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、該担体から、解析用タグ１〜３と酸化傷害タンパク質との複合体、又は解析用タグ１〜３のリンカーYと酸化傷害タンパク質との複合体を回収し、質量分析により標準試料中の酸化傷害タンパク質と、解析対象の試料中の酸化傷害タンパク質との量を比較する、酸化傷害タンパク質の解析方法。   The analysis tag 1 according to any one of claims 1, 3, or 5, an analysis tag 2 in which the analysis tag 1 is labeled with a stable isotope, and the analysis tag 1 is labeled with a stable isotope and analyzed. Tag 2 and analysis tag 3 having a different molecular weight are prepared, analysis tags 1 and 2 are reacted with a standard sample, and then analysis tags 1 and 3 are reacted with a sample to be analyzed. Mixing the solution, contacting the mixture with a carrier holding a metal atom that binds to the affinity peptide tag of these analytical tags, and from the carrier, a complex of analytical tags 1-3 and oxidatively damaged protein, Alternatively, a complex of the linker Y of the analysis tags 1 to 3 and the oxidative damage protein is recovered, and the amount of the oxidative damage protein in the standard sample and the oxidative damage protein in the sample to be analyzed is compared by mass spectrometry. Method for analyzing oxidative damage protein. 解析用タグ１、２及び３を等モル量用いる、請求項２６記載の方法。   27. The method of claim 26, wherein the analytical tags 1, 2 and 3 are used in equimolar amounts. 該標準試料が、健常人から得た試料であり、かつ該解析対象の試料が疾患を有する人から得た試料である、請求項２６記載の方法。   27. The method according to claim 26, wherein the standard sample is a sample obtained from a healthy person, and the sample to be analyzed is a sample obtained from a person having a disease.
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