JP2005304371A - コエンザイムｑの測定法 - Google Patents
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Abstract
【課題】抗酸化マーカーとして期待される生体試料中のコエンザイムＱを簡便、高精度な測定法の提供。
【解決手段】コエンザイムＱを含有する被検液にコエンザイムＱに作用する酵素を作用せしめ、次いで反応によって消費された成分又は生成された成分を測定することを特徴とする被検液中のコエンザイムＱの測定法に関する。
【選択図】 選択図なし
【解決手段】コエンザイムＱを含有する被検液にコエンザイムＱに作用する酵素を作用せしめ、次いで反応によって消費された成分又は生成された成分を測定することを特徴とする被検液中のコエンザイムＱの測定法に関する。
【選択図】 選択図なし
Description
本発明は被検液中のコエンザイムＱの簡便かつ正確な測定方法に関する。さらに詳細には、コエンザイムＱを含有する被検液に、コエンザイムＱに作用する酵素を作用せしめ、次いで反応によって消費された成分又は生成された成分を測定することを特徴とする被検液中のコエンザイムＱの測定法に関する。また、この方法を用いて生体試料中のコエンザイムＱ１０を測定するための測定用組成物及びこの方法を用いて酸化ストレス度を測定する方法に関する。
コエンザイムＱはベンゾキノン誘導体であり、広く生物界に分布していることからユビキノン（酸化型コエンザイムＱ）と命名された。これを２電子還元したヒドロキノン体がユビキノール（還元型コエンザイムＱ）である。イソプレノイド側鎖の長さ（ｎ）の違いにより多数の同族体が存在するが（ｎ＝１〜１２）、生合成されるため、主たる同族体は種によって決まっている。哺乳類ではｎ＝９，１０が主であり、例えばマウス、ラットではｎ＝９が多く、ウサギでｎ＝１０が多い。ヒトはｎ＝１０である。
コエンザイムＱは、生体内の細胞中におけるミトコンドリアの電子伝達系構成成分として存在する生理学的成分であり、生体内において酸化と還元を繰り返すことで電子伝達系における伝達成分としての機能を担っている。コエンザイムＱは生体内において、エネルギー生産及び抗酸化活性を示すことから、その有用性は広く知られている。コエンザイムＱ１０はヒトの体内で生合成される分子であるが、加齢と共に生合成量が低下すること、あるいはさまざまな疾患における生体中のコエンザイムＱ１０の量の減少が報告されている。このような疾患では外部からのコエンザイムＱ１０の供給が良好な結果をもたらしている。更に、罹患時だけでなく老人あるいは肉体的に疲労したときなど、平常時でもコエンザイムＱの補給が必要であると考えられている。
酸化型コエンザイムＱ１０は、鬱血性心不全薬として医薬用途に用いられている。医薬用途以外では、ビタミン類同様、栄養剤、栄養補助剤、更に、痴呆症などの老人性の疾患、アレルギー疾患に対する有用性、あるいは運動能力の増加等も報告されており、また、その安全性が高いことから有用な栄養補給の手段といえる。
一方、コエンザイムＱ１０の生体内濃度は肝硬変患者、インスリン非依存性糖尿病患者、パーキンソン病患者、フェニルケトン尿症患者、完全静脈栄養施行者、スタチン系薬剤（高脂血漿治療剤）服用者らにおいて低下していることが報告され、また、コエンザイムＱ１０の吸収性には個人差が非常に大きいと言われている。このような患者において、生体内のコエンザイムＱ１０濃度を簡便に測定して、患者の症状を把握することができれば、適切な処置をすることができる。すなわち、測定の結果、コエンザイムＱ１０濃度が通常濃度に達していない場合は、疲れやすい、かぜをひきやすいなどの体調不良を感じやすい状況にあるため、そのような場合にはコエンザイムＱ１０を含有するサプリメント等を服用させることにより生体内コエンザイムＱ１０濃度を正常域に維持することによって体調不良を低減させることが期待される。
このような背景から実際に摂取したコエンザイムＱの生体内への吸収性に関する試験のため、あるいは生体試料中のコエンザイムＱは抗酸化マーカー、抗酸化ストレス度のマーカー又は抗疲労マーカーとしても有用性が報告（非特許文献１参照）されていることなどからコエンザイムＱの簡便かつ精度の高い測定法が検討されてきた。
生体内の酸化型又は還元型コエンザイムＱの測定法としては、差スペクトル法や蛍光法があったが、いずれも他の物質の影響を受けやすく操作が煩雑なので現在では利用されていない。近年では高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）（例えば非特許文献２参照）が広く用いられているが、やはり操作性が煩雑で多くの検体を短時間に処理できないことから、より簡便で高精度の測定法が強く望まれていた。
吉川敏一著、「抗酸化物質のすべて」先端医学社出版、１０２−１０７（１９９８） Ｙｏｒｉｈｉｒｏ Ｙａｍａｍｏｔｏ、ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ２５０、６６−７３、（１９９７）
吉川敏一著、「抗酸化物質のすべて」先端医学社出版、１０２−１０７（１９９８） Ｙｏｒｉｈｉｒｏ Ｙａｍａｍｏｔｏ、ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ２５０、６６−７３、（１９９７）
本発明の目的は、コエンザイムＱを含有する被検液中にコエンザイムＱに作用する酵素を用いたコエンザイムＱの測定法に関し、簡便、正確、安価に測定する方法及び測定用組成物を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、コエンザイムＱを含有する被検液にコエンザイムＱに作用する酵素を作用せしめ、次いで反応によって消費された成分又は生成された成分を測定することによって被検液中のコエンザイムＱを簡便、高精度、安価に測定できることを見出して本発明を完成するにいたった。
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）コエンザイムＱを含有する被検液に、コエンザイムＱに作用する酵素を作用せしめ、次いで反応によって消費された成分又は生成された成分を測定することを特徴とする被検液中のコエンザイムＱの測定法。
（２）コエンザイムＱを含有する被検液に、下記反応式を触媒する酵素及び補酵素を作用せしめ、次いで反応によって消費された成分又は生成された成分を測定することを特徴とする被検液中のコエンザイムＱの測定法。
酸化型コエンザイムＱ ＋ 還元型補酵素ＮＡＤ（Ｐ） ＋Ｈ+ ＝
還元型コエンザイムＱ ＋ 酸化型補酵素ＮＡＤ（Ｐ）+
（３）補酵素が、酸化型又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類である前記（２）に記載のコエンザイムＱの測定法。
（４）酸化型又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類が、酸化型又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）、酸化型又は還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）である前記（３）に記載のコエンザイムＱの測定法。
（５）消費された成分又は生成された成分が、酸化型又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）、酸化型又は還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）である前記（１）〜（４）のいずれかに記載のコエンザイムＱの測定法。
（６）コエンザイムＱがコエンザイムＱ１０である前記（１）〜（５）のいずれかに記載のコエンザイムＱの測定法。
（７）コエンザイムＱ１０が酸化型及び／又は還元型コエンザイムＱ１０である前記（６）に記載のコエンザイムＱの測定法。
（８）被検液が生体試料液又は食品試料液である前記（１）〜（７）のいずれかに記載のコエンザイムＱの測定法。
（９）被検液が界面活性化剤により処理された液であること、若しくは界面活性化剤を含む前記（１）〜（８）のいずれかに記載のコエンザイムＱの測定方法。
（１０）コエンザイムＱに作用する酵素を含む被検液中のコエンザイムＱ測定用組成物。
（１１）酵素がリポアミドデヒドロゲナーゼである前記（１０）に記載のコエンザイムＱ測定用組成物。
（１１）前記（１）〜（９）のいずれかに記載のコエンザイムＱの測定方法を用いて生体試料中のコエンザイムＱ１０を測定することによる酸化ストレス度を測定する方法。
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）コエンザイムＱを含有する被検液に、コエンザイムＱに作用する酵素を作用せしめ、次いで反応によって消費された成分又は生成された成分を測定することを特徴とする被検液中のコエンザイムＱの測定法。
（２）コエンザイムＱを含有する被検液に、下記反応式を触媒する酵素及び補酵素を作用せしめ、次いで反応によって消費された成分又は生成された成分を測定することを特徴とする被検液中のコエンザイムＱの測定法。
酸化型コエンザイムＱ ＋ 還元型補酵素ＮＡＤ（Ｐ） ＋Ｈ+ ＝
還元型コエンザイムＱ ＋ 酸化型補酵素ＮＡＤ（Ｐ）+
（３）補酵素が、酸化型又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類である前記（２）に記載のコエンザイムＱの測定法。
（４）酸化型又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類が、酸化型又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）、酸化型又は還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）である前記（３）に記載のコエンザイムＱの測定法。
（５）消費された成分又は生成された成分が、酸化型又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）、酸化型又は還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）である前記（１）〜（４）のいずれかに記載のコエンザイムＱの測定法。
（６）コエンザイムＱがコエンザイムＱ１０である前記（１）〜（５）のいずれかに記載のコエンザイムＱの測定法。
（７）コエンザイムＱ１０が酸化型及び／又は還元型コエンザイムＱ１０である前記（６）に記載のコエンザイムＱの測定法。
（８）被検液が生体試料液又は食品試料液である前記（１）〜（７）のいずれかに記載のコエンザイムＱの測定法。
（９）被検液が界面活性化剤により処理された液であること、若しくは界面活性化剤を含む前記（１）〜（８）のいずれかに記載のコエンザイムＱの測定方法。
（１０）コエンザイムＱに作用する酵素を含む被検液中のコエンザイムＱ測定用組成物。
（１１）酵素がリポアミドデヒドロゲナーゼである前記（１０）に記載のコエンザイムＱ測定用組成物。
（１１）前記（１）〜（９）のいずれかに記載のコエンザイムＱの測定方法を用いて生体試料中のコエンザイムＱ１０を測定することによる酸化ストレス度を測定する方法。
コエンザイムＱを含有する被検液にコエンザイムＱに作用する酵素を作用せしめ、次いで反応によって消費された成分又は生成された成分を測定することによって被検液中のコエンザイムＱを測定するため、測定が簡便、高精度かつ安価に行うことができる。
本発明について、以下具体的に説明する。
本発明に用いるコエンザイムＱに作用する酵素はコエンザイムＱに作用しうる酵素であれば何ら限定されるものではないが、好ましくは下記反応式を触媒する酵素であれば良い。
酸化型コエンザイムＱ ＋ 還元型ＮＡＤ（Ｐ） ＋Ｈ+ ＝
還元型コエンザイムＱ ＋ 酸化型ＮＡＤ（Ｐ）+
コエンザイムＱに作用する酵素としては、例えばユビキノン リダクターゼ（ＥＣ１．６．５．３）、ユビキノン−チトクロームＣ オキシドリダクターゼ（ＥＣ１．１０．２．２）、ハイドロジェン−ユビキノン オキシドリダクターゼ（ＥＣ１．１２．５．１）又はリポアミドデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。これらの中でも下記反応式を触媒する酵素としては特にリポアミドデヒドロゲナーゼが挙げられる。
酸化型コエンザイムＱ ＋ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ＋Ｈ+ ＝
還元型コエンザイムＱ ＋ ＮＡＤ（Ｐ）+
本発明に求められるリポアミドデヒドロゲナーゼはジャーカーらの方法（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ、４４８巻、１９０〜１９２ページ、１９９９年）によりブタの心臓由来酵素を入手することができる。
本発明に用いるコエンザイムＱに作用する酵素はコエンザイムＱに作用しうる酵素であれば何ら限定されるものではないが、好ましくは下記反応式を触媒する酵素であれば良い。
酸化型コエンザイムＱ ＋ 還元型ＮＡＤ（Ｐ） ＋Ｈ+ ＝
還元型コエンザイムＱ ＋ 酸化型ＮＡＤ（Ｐ）+
コエンザイムＱに作用する酵素としては、例えばユビキノン リダクターゼ（ＥＣ１．６．５．３）、ユビキノン−チトクロームＣ オキシドリダクターゼ（ＥＣ１．１０．２．２）、ハイドロジェン−ユビキノン オキシドリダクターゼ（ＥＣ１．１２．５．１）又はリポアミドデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。これらの中でも下記反応式を触媒する酵素としては特にリポアミドデヒドロゲナーゼが挙げられる。
酸化型コエンザイムＱ ＋ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ＋Ｈ+ ＝
還元型コエンザイムＱ ＋ ＮＡＤ（Ｐ）+
本発明に求められるリポアミドデヒドロゲナーゼはジャーカーらの方法（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ、４４８巻、１９０〜１９２ページ、１９９９年）によりブタの心臓由来酵素を入手することができる。
本発明における補酵素としての酸化型又は還元型ＮＡＤ（Ｐ）類には、酸化型又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）（以下、酸化型又は還元型ＮＡＤ（Ｐ）ということがある）、酸化型又は還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）（以下、酸化型又は還元型チオＮＡＤ（Ｐ）ということがある）、酸化型又は還元型３−アセチル−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）（以下、酸化型又は還元型３−アセチル−ＮＡＤ（Ｐ）ということがある）、酸化型又は還元型デアミノ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）（以下、酸化型又は還元型デアミノ−ＮＡＤ（Ｐ）ということがある）などが包含されるが、何らこれらに限定されるものではない。
また本発明において、被検液中のコエンザイムＱを測定するにあたってコエンザイムＱに作用する酵素、補酵素としての酸化型又は還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の使用量は、酵素反応が円滑に進行する量であればよく、被検液中の含量、共役させる酵素反応の種類、反応時間および温度などにより適宜調整される。具体的には、コエンザイムＱに作用する酵素の濃度は、０．００１〜１００Ｕ／ｍｌ程度、好ましくは０．００２〜１０Ｕ／ｍｌ程度である。酸化型又は還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の濃度は、酵素反応を行うのに十分な濃度あればよく、０．０１〜５０ｍＭ程度、好ましくは、０．０１〜０．５ｍＭ程度である。
測定対象となる被検液としては、コエンザイムＱが存在又は形成されたコエンザイムＱを含有する食品試料又は生体試料が挙げられ、例えば生体試料であれば、血清、血漿、尿、髄液、唾液、又は爪、毛髪の組織破砕液などが例示される。また、これらの食品試料や生体試料から有機溶媒によってコエンザイムＱを抽出したものを試料としてもよく、そのままの試料に界面活性化剤やプロテアーゼなどを添加して試料中の蛋白との結合を切断させた後に試料としても良い。
このような被検液としては、通常５〜２００μｌを用いて上記反応系によって反応を行うもので、反応温度としては例えば１５〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃の反応温度条件で行えばよく、反応時間としては１〜６０分程度で行えばよい。
本発明の方法は、酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液（例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モノ又はジエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液等）（例えばｐＨ８〜１１、好ましくはｐＨ９〜１０）を用いて行われる。
また、酵素反応を円滑に行わせる効果のある添加物、例えば適当な酵素活性化剤（亜鉛イオン、マグネシウムイオン、ＥＤＴＡ等）や界面活性化剤（Ｔｏｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、デオキシコール酸、コール酸等）等を必要に応じて適宜添加しても良い。また、測定手法は特に限定されず、補酵素を定量する方法などの手法を適宜用いることができる。
＜消費された成分又は生成された成分を定量する方法＞
本発明において、コエンザイムＱに作用する酵素及び補酵素により消費された成分又は生成された成分の測定方法について説明する。
補酵素として例えばＮＡＤ（Ｐ）類を用いた場合、生成又は消費される酸化型又は還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の量は、種々の方法により測定することができるが、通常、簡便かつ高精度で測定することのできる吸光度測定法により行われる。測定波長は酸化型又は還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の種類によって適宜選択され、好適には各還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の極大吸収波長域の波長に基づいて行えばよい。例えば、還元型ＮＡＤ（Ｐ）、還元型３−アセチル−ＮＡＤ（Ｐ）、還元型デアミノ−ＮＡＤ（Ｐ）などの場合には、３４０ｎｍの波長が選択され、還元型チオ−ＮＡＤ（Ｐ）の場合は４０５ｎｍの波長が選択される。
本発明において、コエンザイムＱに作用する酵素及び補酵素により消費された成分又は生成された成分の測定方法について説明する。
補酵素として例えばＮＡＤ（Ｐ）類を用いた場合、生成又は消費される酸化型又は還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の量は、種々の方法により測定することができるが、通常、簡便かつ高精度で測定することのできる吸光度測定法により行われる。測定波長は酸化型又は還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の種類によって適宜選択され、好適には各還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の極大吸収波長域の波長に基づいて行えばよい。例えば、還元型ＮＡＤ（Ｐ）、還元型３−アセチル−ＮＡＤ（Ｐ）、還元型デアミノ−ＮＡＤ（Ｐ）などの場合には、３４０ｎｍの波長が選択され、還元型チオ−ＮＡＤ（Ｐ）の場合は４０５ｎｍの波長が選択される。
また、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成又は消費量の測定法として、インドニトロテトラゾニウム（ＩＮＴ）又はニトロブルーテトラゾニウム（ＮＢＴ）等のテトラゾニウム塩を用い、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）又はジアホラーゼ（ＥＣ １．６．４．３）の作用によりホルマザン色素を形成せしめ、このホルマザン色素の呈色を測定する方法を用いてもよい。また、還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの蛍光を測定してもよい（励起波長：３４０ｎｍ、蛍光測定波長：４５０ｎｍ）。
測定対象は、酸化型コエンザイムＱ１０の場合のみの場合、還元型コエンザイムＱ１０のみの場合の他に酸化型及び還元型のコエンザイムＱ１０の両方の場合がある。両方を測定する場合は、同一試料から２回サンプリングして別個の２つの系で測定することができる。２つの測定結果を合計することでトータルのコエンザイムＱ１０の濃度を測定できる。
また、酸化型又は還元型コエンザイムＱ１０の濃度が低い場合は、酵素サイクリング反応を用いて測定することもできる。酵素サイクリング反応は、その内容について例えば特開平１０−２２５３００に記載されているが、本発明において利用する場合を以下に示す。すなわち、下記の反応式
で表される酵素サイクリング反応（式中、Ａ１はチオＮＡＤ（Ｐ）類、ＮＡＤ（Ｐ）類を示し、Ａ２はＡ１の還元生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤ（Ｐ）類のときは還元型ＮＡＤ（Ｐ）を、Ａ１がＮＡＤ（Ｐ）類のときは還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類を示し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）を起こさせて、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の量を測定することで酸化型コエンザイムＱまたは還元型コエンザイムＱのいずれか一方、あるいは酸化型コエンザイムＱまたは還元型コエンザイムＱのトータル量を高感度に定量することができる。
この酵素サイクリングの反応においては、酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液（例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モノ又はジエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液等でｐＨ７〜１１、好ましくはｐＨ９．５〜１０．５）が用いられる。この場合の還元型ＮＡＤ（Ｐ）量は０．０１〜０．１ｍＭ、酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）量は０．５〜５ｍＭ、コエンザイムＱデヒドロゲナーゼ量は０．１〜１００Ｕ／ｍｌ程度であり、適宜ＫＣｌ，ＭｇＣｌ２等の無機塩を０〜１００ｍＭの濃度加えて行ってもよい。なお、還元型ＮＡＤ（Ｐ）は波長３４０ｎｍ、還元型チオＮＡＤ（Ｐ）は波長４０５ｎｍでの吸光度により定量することができ、この特徴に基づいてこれらを定量するものである。
また、反応温度としては例えば１５〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃の反応温度条件で行えばよく、反応時間としては０．５〜６０分程度で行えばよい。
＜コエンザイムＱ測定用組成物＞
上述したコエンザイムＱの測定方法を用いるコエンザイムＱ測定用組成物としては、まず、コエンザイムＱに作用する酵素を含み、所望に応じて補酵素、緩衝液、界面活性化剤等を含み、キット（測定試薬）化することができる。
上述したコエンザイムＱの測定方法を用いるコエンザイムＱ測定用組成物としては、まず、コエンザイムＱに作用する酵素を含み、所望に応じて補酵素、緩衝液、界面活性化剤等を含み、キット（測定試薬）化することができる。
＜酸化ストレス度測定方法＞
上述したコエンザイムＱ１０の測定方法を用いて酸化ストレス度を測定する場合は、例えば、平常時のコエンザイムＱ１０をまず測定しておき、疲れを感じた場合あるいは定期的に同測定を行い、酸化ストレス度を測定することができる。そして、平常時の値と比較してその値が低い場合には、コエンザイムＱ１０を体内に補給することにより症状を和らげる、あるいは症状の悪化を未然に防止することが期待できる。
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。
上述したコエンザイムＱ１０の測定方法を用いて酸化ストレス度を測定する場合は、例えば、平常時のコエンザイムＱ１０をまず測定しておき、疲れを感じた場合あるいは定期的に同測定を行い、酸化ストレス度を測定することができる。そして、平常時の値と比較してその値が低い場合には、コエンザイムＱ１０を体内に補給することにより症状を和らげる、あるいは症状の悪化を未然に防止することが期待できる。
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。
補酵素として還元型ＮＡＤを用い、蛍光強度の減少を測定することによる酸化型コエンザイムＱ１０の測定
＜測定試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
０．１ｍＭ 還元型ＮＡＤ
０．１ｍＭ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１０Ｕ／ｍｌ リポアミドデヒドロゲナーゼ
＜測定試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
０．１ｍＭ 還元型ＮＡＤ
０．１ｍＭ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１０Ｕ／ｍｌ リポアミドデヒドロゲナーゼ
＜測定方法＞
酸化型コエンザイムＱ１０を０、２０μＭ、４０μＭ、６０μＭ、８０μＭ、１００μＭとなるようにエタノール溶液に調整し、酸化型コエンザイムＱ１０サンプルを作成した。測定試薬１ｍｌに酸化型コエンザイムＱ１０サンプル２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの蛍光強度（励起波長：３４０ｎｍ、測定波長：４５０ｎｍ）を測定した。対照には、測定試薬１ｍｌにエタノール溶液２０μｌを加えたもの（以下、試薬ブランクという）を用いた。
酸化型コエンザイムＱ１０を０、２０μＭ、４０μＭ、６０μＭ、８０μＭ、１００μＭとなるようにエタノール溶液に調整し、酸化型コエンザイムＱ１０サンプルを作成した。測定試薬１ｍｌに酸化型コエンザイムＱ１０サンプル２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの蛍光強度（励起波長：３４０ｎｍ、測定波長：４５０ｎｍ）を測定した。対照には、測定試薬１ｍｌにエタノール溶液２０μｌを加えたもの（以下、試薬ブランクという）を用いた。
上記測定結果を図１に示す。このように酸化型コエンザイムＱ１０を定量的に測定することができた。
補酵素として酸化型ＮＡＤを用い、蛍光吸収の増加を測定することによる還元型コエンザイムＱ１０の測定
＜測定試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤ
０．１ｍＭ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１０Ｕ／ｍｌ リポアミドデヒドロゲナーゼ
＜測定試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤ
０．１ｍＭ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１０Ｕ／ｍｌ リポアミドデヒドロゲナーゼ
＜測定方法＞
還元型コエンザイムＱ１０を０、２０μＭ、４０μＭ、６０μＭ，８０μＭ、１００μＭとなるようにエタノール溶液に調整し、還元型コエンザイムＱ１０サンプルを作成した。測定試薬１ｍｌに還元型コエンザイムＱ１０サンプル２０μｌ加え、３７℃、５分間加温後の還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの蛍光強度（励起波長：３４０ｎｍ、測定波長：４５０ｎｍ）について試薬ブランクを対照として測定した。
還元型コエンザイムＱ１０を０、２０μＭ、４０μＭ、６０μＭ，８０μＭ、１００μＭとなるようにエタノール溶液に調整し、還元型コエンザイムＱ１０サンプルを作成した。測定試薬１ｍｌに還元型コエンザイムＱ１０サンプル２０μｌ加え、３７℃、５分間加温後の還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの蛍光強度（励起波長：３４０ｎｍ、測定波長：４５０ｎｍ）について試薬ブランクを対照として測定した。
上記測定結果を図２に示す。このように還元型コエンザイムＱ１０を定量的に測定することができた。
補酵素として酸化型ＮＡＤを用いた血漿中の還元型コエンザイムＱ１０の測定
＜測定試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
０．１ｍＭ 酸化型ＮＡＤ
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１０Ｕ／ｍｌ リポアミドデヒドロゲナーゼ
＜測定試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
０．１ｍＭ 酸化型ＮＡＤ
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１０Ｕ／ｍｌ リポアミドデヒドロゲナーゼ
＜血漿試料の調製＞
血漿５０μｌに２５０μｌのメタノール、５００μｌのヘキサンを加え、遠心濃縮機によって溶媒を乾燥させた後、５０μｌのエタノールに溶解させ、血漿試料（サンプル１〜サンプル５）とした。
血漿５０μｌに２５０μｌのメタノール、５００μｌのヘキサンを加え、遠心濃縮機によって溶媒を乾燥させた後、５０μｌのエタノールに溶解させ、血漿試料（サンプル１〜サンプル５）とした。
＜測定方法＞
血漿試料調整後、速やかに血漿試料２０μｌを測定試薬１ｍｌに加え、３７℃、５分間加温後の還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの蛍光強度（励起波長：３４０ｎｍ、測定波長：４５０ｎｍ）について試薬ブランクを対照に測定した。
血漿試料調整後、速やかに血漿試料２０μｌを測定試薬１ｍｌに加え、３７℃、５分間加温後の還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの蛍光強度（励起波長：３４０ｎｍ、測定波長：４５０ｎｍ）について試薬ブランクを対照に測定した。
上記測定結果を表１に示す。これらの値は、通常の血漿中のコエンザイムＱ１０濃度の範囲であった。このように、実際に血漿を用いた場合であっても、血漿中のコエンザイムＱ１０を測定できることが示唆された。
本発明は、コエンザイムＱを含有する被検液にコエンザイムＱに作用する酵素を作用せしめ、次いで反応によって消費された成分又は生成された成分を測定することによって被検液中のコエンザイムＱを測定するため、測定が簡便、高精度かつ安価に行うことができる。また、生体内のコエンザイムＱ１０濃度を簡便に測定できるため、患者の症状を把握することができれば、適切な処置をすることができる。
Claims (12)
- コエンザイムＱを含有する被検液に、コエンザイムＱに作用する酵素を作用せしめ、次いで反応によって消費された成分又は生成された成分を測定することを特徴とする被検液中のコエンザイムＱの測定法。
- コエンザイムＱを含有する被検液に、下記反応式を触媒する酵素及び補酵素を作用せしめ、次いで反応によって消費された成分又は生成された成分を測定することを特徴とする被検液中のコエンザイムＱの測定法。
酸化型コエンザイムＱ ＋ 還元型補酵素ＮＡＤ（Ｐ） ＋Ｈ+ ＝
還元型コエンザイムＱ ＋ 酸化型補酵素ＮＡＤ（Ｐ）+ - 補酵素が、酸化型又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類である請求項２に記載のコエンザイムＱの測定法。
- 酸化型又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類が、酸化型又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）、酸化型又は還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）である請求項３に記載のコエンザイムＱの測定法。
- 消費された成分又は生成された成分が、酸化型又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）、酸化型又は還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）である請求項１〜４のいずれかに記載のコエンザイムＱの測定法。
- コエンザイムＱがコエンザイムＱ１０である請求項１〜５のいずれかに記載のコエンザイムＱの測定法。
- コエンザイムＱ１０が酸化型及び／又は還元型コエンザイムＱ１０である請求項６に記載のコエンザイムＱの測定法。
- 被検液が生体試料液又は食品試料液である請求項１〜７のいずれかに記載のコエンザイムＱの測定法。
- 被検液が界面活性化剤により処理された液であること、若しくは界面活性化剤を含む請求項１〜８のいずれかに記載のコエンザイムＱの測定方法。
- コエンザイムＱに作用する酵素を含む被検液中のコエンザイムＱ測定用組成物。
- 酵素がリポアミドデヒドロゲナーゼである請求項１０に記載のコエンザイムＱ測定用組成物。
- 請求項１〜９のいずれかに記載のコエンザイムＱの測定方法を用いて生体試料中のコエンザイムＱ１０を測定することによる酸化ストレス度を測定する方法。
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