JP2005298492A - ヘムオキシゲナーゼ−１誘導剤、培地製造方法、移植用臓器の保存液製造方法および実験動物生産方法 - Google Patents

Abstract

【課題】既存のHO-1誘導物質の問題点の１つであったNO放出作用が無く、持続時間の長い新たなヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤、それを用いた培地製造方法、移植用臓器の保存液製造方法および実験動物生産方法を提供する。
【解決手段】ヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤が、ポリアミン誘導体又はその塩酸塩その他の製剤学的に許容される塩の１種又は２種以上を有効成分として含有することを特徴とする。ポリアミン誘導体としては、例えば、スペルミン又はスペルミジンを使用できる。培地製造方法では、そのヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤を細胞又は生体組織を用いた培地に添加する。移植用臓器の保存液製造方法では、そのヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤を移植用臓器の保存液に添加する。実験動物生産方法では、そのヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤を実験動物に投与する。それにより、ヘムオキシゲナーゼ-1高発現状態を惹起する。
【選択図】なし

Description

本発明は、種々の疾患に関連する生体防御因子であるヘムオキシゲナーゼ-1 (HO-1)の発現を誘導するヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤、それを用いた培地製造方法、移植用臓器の保存液製造方法および実験動物生産方法に関する。

ヘムオキシゲナーゼ (HO)はほ乳類の体内におけるヘム分解の律速酵素であり、基質であるヘムを鉄、一酸化炭素（CO）、ビリベルジンに分解する。生じたビリベルジンは速やかにビリルビンへと変換される。酵素活性を持つHOのアイソザイムとして、誘導型のHO-1と構成型のHO-2の２種類が知られており、HO-1は基質であるヘム（その中心鉄が３価の塩はヘミンと呼ばれる）や、重金属、紫外線、一酸化窒素（NO）供与体、活性酸素、その他種々の酸化的ストレスなどにより、転写レベルで強く誘導される（例えば、特許文献１および非特許文献１，２参照）。

過剰の遊離ヘムはラジカル発生源で毒性が強く、HOによるヘム分解系で生じるビリルビンおよびビリベルジンは抗酸化作用を発揮する。そのためHO-1の誘導は酸化的ストレスに対する重要な生体防御系である。ヒトHO-1遺伝子には多型があり、個体により誘導能が異なる。多型によるHO-1の低誘導個体由来の細胞は、酸化的ストレスで細胞死が起きやすいことが報告されている。またHO-1の誘導は、種々の組織・細胞での炎症、心筋や神経を含む種々の組織・細胞での虚血や再還流による障害、紫外線、放射線、酸化的ストレスなど、種々の侵害刺激に対して防御作用を発揮し、組織・細胞の保護、アポトーシス抑制などに働く（例えば、非特許文献３乃至６参照）。

HO-1の誘導や高発現が、様々な疾患の治療や予防に有用あるいは有利であることが報告されている。例えば循環器系では、HO-1の高発現による血管拡張・降圧作用や、HO-1高誘導個体が大動脈瘤、血管形成術後の再狭窄、動脈硬化などの血管病変といった種々の循環器疾患のリスクが低いことが挙げられる。HOによる産物COが、NOと並んで血管弛緩作用を持つ（例えば、非特許文献７乃至１０参照）。

HO-1高誘導型の個体は、肺気腫に罹患する危険率が低い。HO-1の誘導は、肺高血圧症を引き起こす肺血管のリモデリングを阻止する作用があることや、肺高血圧症の機序の１つである低酸素によるカリウムチャネルの遮断を抑制することが示されている。CO供与体によるヒト肺動脈平滑筋でのエンドセリン放出阻害作用も示されている。HO-1は肺線維症、肺炎、喘息（気道過敏）、アレルギーの抑制にも働くことが報告されている。また、COPDではHO-1の発現が低下することも報告されており、HO-1誘導による改善が期待できる（例えば、非特許文献１１乃至１８参照）。

HOによる、心臓、腎臓、肝臓を含む移植臓器の保護・生着作用、免疫抑制作用も報告されている（例えば、非特許文献１９乃至２１参照）。

多くの疾患ではHO-1の誘導あるいは高発現が生体に有利であるが、癌ではHO-1低誘導あるいはHOの活性を阻害した方が癌細胞の増殖が抑制され、また、癌細胞死が誘導され、生体に有利に働く。例えばHOの阻害物質の抗癌作用が報告されている。一方、抗癌剤を目的として N₁, N₁₁-Diethylnorspermine など多くのポリアミン誘導体が合成され開発中であるが、臨床で充分な効果を発揮しない例もある（例えば、非特許文献２２および２３参照）。

HO-1の発現誘導は、上記を含む種々の疾患の予防や治療に有用と考えられているが、ヒトでは他のほ乳類の細胞とは逆に、低酸素でHO-1の発現が減少するという特徴もある。従ってHO-1誘導物質は、（先に挙げた疾患群や）酸素関連を含む種々の疾患の予防薬や治療薬として有用と考えられる。HO-1誘導物質は、ホルボールエステル、ヘミンやNO供与体など、いくつも知られているが、例えば、ホルボールエステルは変異原性がある、ヘミンはラジカル発生作用が強く誘導時間が短い、NO供与体はNOの作用が好ましくない場合にもその作用を発揮してしまう、など種々の問題点がある（例えば、非特許文献２４および２５参照）。

スペルミンNONOateによるHO-1誘導は多数報告されているが、これらはNOあるいはNO供与体による誘導としており、スペルミンによるHO-1誘導は報告されていない（例えば、非特許文献２６参照）。

特開2000-119182号公報 Shibahara, Tohoku J. Exp. Med., 200, 167-186 (2003) Hirai et al., Blood, 102, 1619-1621 (2003) Hartsfield et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 287, H2009-H2015 (2004) Otterbein et al., Nature Med., 6, 422-428 (2000) Panahian et al., J. Neurochem., 72, 1187-1203 (1999) Lu et al., Int. J. Cardiol., 82, 133-140 (2002) Johnson et al., Am. J. Hypertens., 17, 25-30 (2004) Perrella and Yet, Curr. Pharm. Des., 9, 2479-2487 (2003) Kaneda et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 22, 1680-1685 (2002) Schillinger et al., Thromb. Res., 106, 131-136 (2002) Yamada et al., Am. J. Hum. Genet., 66, 187-195 (2000) Yun et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 306, 523-529 (2003) Stanford et al., Eur. J. Pharmacol., 486, 349-352 (2004) Tsuburai et al., Hum. Gene. Ther., 13, 1945-1960 (2002) Goto et al., Antioxid. Redox Signal., 4, 563-568 (2002) Hashiba et al., Gene Ther., 8, 1499-1507 (2001) Maestrelli et al., Eur. Respir. J., 21, 971-976 (2003) COPD Almolki et al., Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 287, L26-L34 (2004) Soares et al., Immunol. Rev., 275-285 (2001) Araujo et al., J. Immunol., 171, 1572-1580 (2003) Ke et al., Transplant Proc., 34, 1465-1466 (2002) Fang et al., Cancer Res., 63, 3567-3574 (2003) Seiler, Curr. Drug Targets, 4, 565-585 (2003) Nakayama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 271, 665-671 (2000) Kitamuro et al., J. Biol. Chem., 9125-9133 (2003) Buckley et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 307, 973-979 (2003)

本発明は、既存のHO-1誘導物質の問題点の１つであったNO放出作用が無く、持続時間の長い新たなヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤、それを用いた培地製造方法、移植用臓器の保存液製造方法および実験動物生産方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明に係るヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤は、ポリアミン誘導体又はその塩酸塩その他の製剤学的に許容される塩の１種又は２種以上を有効成分として含有することを特徴とする。
本発明に係るヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤は、スペルミン又はその塩酸塩その他の製剤学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴としてもよい。
本発明に係るヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤は、スペルミジン又はその塩酸塩その他の製剤学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴としてもよい。
本発明に係るヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤は、スペルミン又はその塩酸塩その他の製剤学的に許容される塩と、ヘミンとを有効成分として含有してもよい。この場合、スペルミン又はその塩酸塩その他の製剤学的に許容される塩と、ヘミンとの含有比は、例えば、１対１を選択することができる。
本発明に係るヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤は、カプセル剤、錠剤、糖剤、丸剤、細粒剤、座薬、液剤、アンプル剤、その他、いかなる態様のものであってもよい。本発明に係るヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤は、充填剤、増量剤、結合剤、含湿剤、膨化剤、溶解遅延剤、表面活性剤、吸着剤、潤滑剤、着色剤、香料、防腐剤などを含んでいてもよい。そのような製剤は、通常の一般的な方法に従って製造することができる。また、本発明に係るヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤は、他の薬学的有効成分を含んでいてもよい。
本発明に係るヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤は、慢性期治療剤、予防剤、急性期治療剤のいずれで用いられてもよい。
本発明に係るヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤は、その態様に応じて、経口投与、肛門投与、静脈投与、皮下投与、筋肉内投与などの投与方法があり得るが、経口投与が好ましい。
本発明に係る培地製造方法は、前述のいずれかのヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤を細胞又は生体組織を用いた培地に添加し、ヘムオキシゲナーゼ-1高発現状態を惹起することを特徴とする。本発明に係る培地製造方法により、前述のいずれかのヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤が添加され、ヘムオキシゲナーゼ-1高発現状態が惹起された、細胞又は生体組織を用いた培地を製造することができる。
本発明に係る移植用臓器の保存液製造方法は、前述のいずれかのヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤を移植用臓器の保存液に添加し、ヘムオキシゲナーゼ-1高発現状態を惹起することを特徴とする。本発明に係る移植用臓器の保存液製造方法により、前述のいずれかのヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤が添加され、ヘムオキシゲナーゼ-1高発現状態が惹起された、移植用臓器の保存液を製造することができる。本発明に係る移植用臓器の保存液製造方法は、例えば、心臓、腎臓、肝臓などの移植用臓器の保存液を製造するために用いることができる。ヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤を添加する保存液は、移植用臓器の保存液として一般に用いられる保存液でよい。
本発明に係る実験動物生産方法は、前述のいずれかのヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤を実験動物に投与し、ヘムオキシゲナーゼ-1高発現状態を惹起することを特徴とする。
本発明に係るヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤は、1 μM乃至1000μMの範囲で使用でき、3 μM乃至1000μMの範囲で使用することが好ましく、10 μM乃至1000μMの範囲で使用することがより好ましい。本発明に係る培地製造方法、移植用臓器の保存液製造方法および実験動物生産方法での使用範囲も同様である。
本発明に係るヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤は、単独あるいは他のHO-1誘導物質と共に、生体あるいは細胞や生体組織、臓器の培養液中に添加することで、HO-1を誘導する。また、抗癌剤を目的としたポリアミン誘導体のHO-1誘導活性をスクリーニングに取り入れる。
本発明に係るポリアミン系HO-1誘導剤は、次のような利点を持つ。
NO放出性でないためNOの作用が好ましくない、あるいは不必要な場合に使用可能である。短時間で誘導効果が消失するヘミンよりも持続時間が長い。スペルミンNONOateより安定で保存が容易であり、安価である。また、新たなHO-1誘導剤としての選択の幅を広げ、他剤との組み合わせ方を豊富にする。スペルミンやスペルミジンは生体内物質であり、生体内の酵素で分解されるため、蓄積による毒性発現の危険が小さいと考えられる。
ポリアミン誘導体にHO-1誘導活性評価を取り入れることにより、抗癌作用を減弱させる作用を早期に簡便に評価できるようになる。
本発明に係るヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤を用いたヘムオキシゲナーゼ-1誘導評価法は、抗癌剤、細胞死誘導剤、細胞増殖抑制剤を目的とした場合の、ポリアミン系化合物の不適な作用（例えば、細胞死抑制作用）の指標として用いることができる。

本発明によれば、既存のHO-1誘導物質の問題点の１つであったNO放出作用が無く、持続時間の長い新たなヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤、それを用いた培地製造方法および実験動物生産方法を提供することができる。

上述のポリアミン系化合物を、細胞であれば1000 μM以下の最終濃度として培地に加え、ヘムオキシゲナーゼ-1（HO-1）を誘導することができる。なお、明らかなHO-1 mRNA誘導を示すのに、スペルミンでは10 μMの濃度で充分である。スペルミジンでも10 μMの濃度で充分である。ヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤は、少なくとも10 μM乃至1000μMの範囲で使用できる。
ヘムオキシゲナーゼ-1 (HO-1)の発現誘導は種々の疾患の予防や治療に重要であり、HO-1発現誘導物質は予防薬や治療薬として期待されている。従来のHO-1誘導物質は、変異原性がある、誘導時間が短い、一酸化窒素（NO）など目的外の作用が強い物質を発生する、など種々の問題点があるため、これらの問題点を克服した多様な誘導物質の発見が望まれている。また抗癌剤を目的としたポリアミン系化合物の、抗癌作用を減弱する作用を早期に簡便に検出することが望まれている。
本発明者は、ポリアミン系化合物であるスペルミンやスペルミジンがHO-1誘導作用を持つこと、また他のHO-1誘導物質による誘導作用を増強することを見い出した。これらの化合物はNOを放出せず、低濃度で誘導作用が持続する、などという利点があるため、HO-1誘導作用を持つ治療薬や予防薬として有用と考えられる。また抗癌剤を目的としたポリアミン系化合物の評価にHO-1誘導活性評価を用いることで、抗癌作用を減弱する作用を早期に簡便に検出できる。

以下に、ヒト肺癌由来A549細胞と、ヒト肺動脈平滑筋由来細胞（PASMC）において、ポリアミン系化合物によるHO-1 mRNA誘導を行った実施例を示す。実施例では、ノザン法で解析した例を示す。なお、いずれの細胞も５％CO2、２１％O2下で、A549細胞には１０％ウシ血清を含むRPMI1640を、PASMCには倉敷紡績株式会社製の商品名「HuMedia-SG2」を用いて培養し、ノザン法によりHO-1 mRNAレベルを解析した。
その結果を表１に示す。
表１は、ポリアミン系化合物によるHO-1 mRNAの誘導の結果を示す。その試験では、ヒト由来の細胞を培養し、培地にポリアミン化合物を加えて６から１８時間インキュベートし、total RNAを抽出した。これらのRNAをノザンブロットで解析し、HO-1（ヘムオキシゲナーゼ−１）のmRNAレベルの変化を示した。
表１において、「番号」欄はサンプル番号を表す。「細胞」欄で、A549はヒト肺癌A549細胞、PASMCはヒト肺血管平滑筋細胞を表す。「ポリアミン」欄で、培地に添加したポリアミンの名称と、その後の（ ）内にはそれぞれのポリアミンの最終濃度をマイクロモーラーで表している。「時間」欄で、数字はポリアミン添加後の培養時間を表す。「HO-1誘導率」欄は、HO-1のmRNAレベルの変化を、コントロール（ポリアミン無添加で培養）を１とした比で表している。DENSMNは、N₁, N₁₁-Diethylnorspermine を示す。

実施例１。A549を、スペルミンNONOate（10, 100, 1000 μM）あるいはスペルミン（10, 100, 1000 μM）で６時間処理した時の、HO-1 mRNA誘導を調べた（表１、番号１−６）。いずれの化合物もすべての濃度でHO-1 mRNAを誘導したが、スペルミンは低濃度（10, 100 μM）においてスペルミンNONOateよりも強い誘導を示した。また、100 μMの濃度において、スペルミン塩酸塩はスペルミンと同等のHO-1 mRNA誘導効果を示した（表１、番号7）。

実施例２。前項と同様の実験を、細胞にPASMCを用いて行った。（表１、番号8−１3）。いずれの化合物もすべての濃度でHO-1 mRNAを誘導したが、スペルミンは低濃度（10 μM）においてスペルミンNONOateよりも強い誘導を示した。

実施例３。A549を、スペルミン（10, 100, 1000 μM）で１８時間処理した時の、HO-1 mRNA誘導を調べた（表１、番号14−16）。いずれの濃度においてもスペルミンは明らかにHO-1 mRNAを誘導した。

実施例４。A549を、スペルミジン（100, 1000 μM）で６時間処理すると、HO-1 mRNAを誘導した（表１、番号17, 19）。また、また、100 μMの濃度において、スペルミジンとスペルミジン塩酸塩は、同等のHO-1 mRNA誘導効果を示した（表１、番号17, 18）。

実施例５。A549を、N₁, N₁₁-Diethylnorspermine (100 μM)で６時間処理すると、HO-1 mRNAを誘導した（表１、番号20）。

実施例６。A549を、スペルミジン（10 μM）単独、ヘミン（10 μM）単独、スペルミン（10 μM）およびヘミン（10 μM）併用で６時間処理した時の、HO-1 mRNA誘導を調べたところ、併用により単独よりも強く誘導した。すなわち、スペルミンはヘミンによるHO-1誘導を増強した（表１、番号21−23）。

本発明に係るヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤は、前述の背景技術に記載の疾患を含む、HO-1関連、酸素関連、酸化的ストレス関連、循環器系、呼吸器系、免疫系を含む種々の疾患の治療薬、予防薬として用いることが考えられる。また抗癌剤を目的としたポリアミン系化合物の評価にHO-1誘導活性評価を用いることで、抗癌作用を減弱する作用を早期に簡便に検出できる。この他、HO-1誘導剤として細胞や組織などの培地に添加すること、移植用臓器の保存液に添加すること、あるいは実験動物に投与することで、炎症や癌など、病態でしばしばみられるHO-1高発現状態を惹起して、より病態に近い薬剤スクリーニング系として利用することも可能である。

Claims (6)

1. ポリアミン誘導体又はその塩酸塩その他の製剤学的に許容される塩の１種又は２種以上を有効成分として含有することを特徴とするヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤。
2. スペルミン又はその塩酸塩その他の製剤学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤。
3. スペルミジン又はその塩酸塩その他の製剤学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤。
4. 請求項１,２又は３記載のヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤を細胞又は生体組織を用いた培地に添加し、ヘムオキシゲナーゼ-1高発現状態を惹起することを特徴とする培地製造方法。
5. 請求項１,２又は３記載のヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤を移植用臓器の保存液に添加し、ヘムオキシゲナーゼ-1高発現状態を惹起することを特徴とする移植用臓器の保存液製造方法。
6. 請求項１,２又は３記載のヘムオキシゲナーゼ-1誘導剤を実験動物に投与し、ヘムオキシゲナーゼ-1高発現状態を惹起することを特徴とする実験動物生産方法。