【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、糖付加卵黄抗体およびその製造方法ならびにその使用方法に関し、更に詳細には、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）および／またはアレルギー疾患によるIgE抗体産生を抑制する糖付加卵黄抗体およびその製造方法ならびにそれを用いての自己免疫疾患とアレルギー疾患との治療ならびに予防などに使用する使用方法に関するものである。
なお、本明細書に記載されている「糖類もしくは糖鎖含有」という用語は、天然状態で糖類もしくは糖鎖を含んでいる卵抗体を意味し、「糖類もしくは糖鎖付加卵抗体」という用語は、産卵動物に処理を施した結果、新たな糖類もしくは糖鎖または新たに糖類もしくは糖鎖を付加された卵抗体のことを意味している。
【０００２】
【従来の技術】
生体には、細菌やウイルス、あるいは様々な異物（抗原）が侵入すると、免疫細胞が抗体を認識して、抗体を産生し抗原の侵入を防御する免疫反応による防御システムが備わっている。この免疫細胞は自己と非自己とを識別し、自己抗原に対しては免疫寛容（トレランス）が作用して免疫反応を抑制するのに対して、非自己抗原に対しては免疫反応を誘導する。つまり、一般には、同一個体内では、自己抗原に対する免疫寛容のバランスは制御されているが、自己・非自己の識別機構が障害されると（この免疫寛容のバランスが一旦破綻してしまうと）、自己抗原に対しても自己抗体（イムノグロブリン）が産生され、自己組織などの自己抗原に対しても攻撃するという問題が起こってくる。こうした現象を自己免疫反応といい、この自己免疫反応により種々の自己免疫疾患が引き起こされる。
【０００３】
自己免疫疾患は、自己抗原に対する免疫応答が原因となって起こる疾患であり、その成因については不明な点が多い。また、その症例は多岐に亘っていて、主たる疾患例としては、例えば、甲状腺の自己免疫疾患、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、リウマチ様関節炎、糸球体腎炎、自己免疫性血液疾患（自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血等）などが知られている。
【０００４】
これら疾患に対する治療法としては、例えば、上述した重篤な症状をもたらすＳＬＥなどに対しては免疫抑制療法が施されている。また、慢性関節リウマチなどでは、自己免疫により自己の器官が完全に失われていることから、人工臓器や同種臓器移植が行われている。また、症状として代謝異常を引き起こすものについては欠損している代謝酵素、ホルモンなどを投与することが行われている。しかしながら、こうした治療は対処療法にすぎず、根本的な自己免疫疾患の治療が図れていないのが現状である。
【０００５】
上述したように、免疫反応は、生体が生存するためには不可欠で有益な反応であるが、この免疫反応が生体に対して不都合をもたらすことがあり、このような不利益になる免疫反応がアレルギー反応と言われている。抗体は、その分子構造の違いからいくつかのクラスに分けられるが、アレルギー反応を起こす抗体は主にIgE抗体である。
【０００６】
一般にアトピーといわれるのはIgE抗体が関与するアレルギー反応をいい、このIgE抗体が関与するアレルギー反応は、肥満細胞と結合しているIgE抗体に抗原が再結合して、肥満細胞に連鎖反応が起こり化学伝達物質が放出されて組織障害を起こすタイプであり、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎などの一般的アレルギー疾患の大部分がこのアレルギー反応で起こるものである。
【０００７】
アレルギー疾患の予防には環境から抗原を除去するのが重要であるが、環境から抗原を完全に除去することは至難である。また、アレルギー疾患治療薬としてよく使用されるのは、抗ヒスタミン薬、β−交感神経刺激剤、テオフィリン製剤、ステロイド剤などである。一般に、アレルギー疾患の治療は長い期間を要し、医薬品の長期服用による副作用も懸念される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）とアレルギー疾患の際、IgE抗体の産生を抑制する抗体産生抑制物質そのものを開発することは、自己免疫疾患やアレルギー疾患の原因物質の産生を抑制することから、自己免疫疾患やアレルギー疾患を原因から絶つことができ、極めて有用であり、かかる抗体産生抑制物質の開発が強く要望され続けている。
【０００９】
この発明者は、このような観点から、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）とアレルギー疾患の際、IgE抗体の産生を抑制する抗体産生抑制物質について鋭意研究をした結果、アジュヴァント単独又は混合して産卵動物に接種することにより得られた卵黄抗体がノーマル卵黄抗体よりガラクトースまたはN-アセチルガラクトサミンがより多く付加されていることを見出した。さらには、この糖付加卵抗体が免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）および／またはアレルギー疾患の際、IgE抗体の産生を抑制することを見出して、この発明を完成するに至った。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
したがって、この発明は、糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質を提供することを目的としている。また、好ましい態様として、糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質が、自己の臓器または自己の臓器が生産した物質に対する自己抗体の過剰産生を抑制する物質であることからなる過剰自己抗体産生抑制物質を提供することである。別の好ましい態様としては、過剰自己抗体産生抑制物質が、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生抑制作用および／またはアレルギー疾患に関与するイムノグロブリン、特にIgE抗体の産生を抑制する抗体産生抑制作用を有している過剰自己抗体産生抑制物質を提供することである。なお、本明細書において、単に糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体のいずれか１方を使用する場合があるが、いずれの場合にもその用語に限定する意図は一切なく、特段の定めがない限り、いずれの意味をも有する意図で使用しているものと理解さるべきである。また、糖類もしくは糖鎖含有卵抗体ならびに糖類もしくは糖鎖付加卵抗体として使用している含有および付加ならびにこれらと関連とする用語にしても、糖類もしくは糖鎖と卵抗体との共存状態を限定する意図で一切使用しているものではなく、あらゆる併存状態、例えば結合などの状態を包含する意図で使用しているものと理解さるべきである。
【００１１】
更に、この発明の好ましい態様として、糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質における糖類もしくは糖鎖がガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、もしくはシアル酸またはこれら糖類を含む糖鎖である過剰自己抗体産生抑制物質を提供することである。この発明の更に好ましい態様として、糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質における抗体が卵黄抗体である過剰自己抗体産生抑制物質を提供することである。この発明の更に好ましい態様として、免疫卵、免疫卵黄または免疫卵黄抗体分画に存在している過剰自己抗体産生抑制物質を提供することである。
【００１２】
また、この発明は、免疫増進効果がある物質を産卵動物に接種することにより糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質を産生させることからなる過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法を提供することを別の目的としている。この発明の好ましい態様として、アジュヴァントとの混合物として使用することからなる過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法を提供することである。
【００１３】
この発明の別の好ましい態様として、過剰自己抗体産生抑制物質が自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）および／またはアレルギー疾患の際、IgE抗体の産生を抑制する作用を有する過剰自己抗体産生抑制物質を製造する製造方法を提供することを別の目的としている。また、この発明の別の好ましい態様として、糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質における糖類もしくは糖鎖がガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、もしくはシアル酸またはこれら糖類を含む糖鎖である過剰自己抗体産生抑制物質を製造する製造方法を提供することである。この発明の特に好ましい態様としては、アジュヴァントを産卵動物に接種することによって卵黄抗体にガラクトースまたはN-アセチルガラクトサミンが付加されたガラクトース等付加卵黄抗体を製造することからなる過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法を提供することである。また、この発明の別の好ましい態様としては、糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質における抗体が卵黄抗体である過剰自己抗体産生抑制物質を製造する製造方法を提供することである。この発明の更に好ましい態様として、免疫卵、免疫卵黄または免疫卵卵黄抗体分画として過剰自己抗体産生抑制物質を製造する製造方法を提供することである。
【００１４】
更に、この発明は、糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質を、神経系、呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿生殖器系、血液系、眼系、耳鼻咽喉系または皮膚系疾患の抗体の過剰産生を抑制するために使用することからなる過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法を提供することである。この発明の好ましい態様においては、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）および／またはアレルギー疾患の際、IgE抗体の産生を抑制する作用を有する過剰自己抗体産生抑制物質を、自己免疫疾患および／またはアレルギー疾患の際に生じる過剰抗体の産生を抑制することによって、自己免疫疾患および／またはアレルギー疾患の治療もしくは予防の為に使用する使用方法を提供することである。この発明の好ましい態様として、過剰自己抗体産生抑制物質が免疫卵、免疫卵黄もしくは免疫卵黄抗体分画としてまたは免疫卵から抽出したもしくは精製した状態で、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生および／またはアレルギー疾患のIgE抗体産生を抑制するために過剰自己抗体産生抑制物質を使用する方法を提供することである。
【００１５】
この発明の更なる目的、特長ならびに利点は、本明細書の下記記載と添付図面から明らかになるであろう。
【００１６】
【発明の実施の形態】
この発明に係る過剰自己抗体産生抑制物質は、糖含有卵抗体または糖付加卵抗体、つまり、糖含有または糖付加卵黄抗体である。また糖類もしくは糖鎖としては、ガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、またはシアル酸などが挙げられるが、ガラクト−スおよびN-アセチルガラクトサミンが特に好ましい。この過剰自己抗体産生抑制物質は、特に、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生および／またはアレルギー疾患の際、IgE抗体産生を抑制する作用があることを特徴とする。
【００１７】
この発明に係る過剰自己抗体産生抑制物質は、免疫増進効果を有する物質を産卵動物に接種することによって製造することができる。かかる免疫増進効果を有する物質は、単独あるいは他の同様な効果をもつ物質との組み合わせで使用される
【００１８】
かかる免疫増進物質はアジュヴァントと総称され、死活牛酪菌、死活牛型結核菌、死活人型結核菌、アスカリス、死活百日咳菌、カリミョウバン、エンドトキシン、Muramyl dipeptide(MDP)、トキシン類、Heat-labile enterotoxin、Heat-killed Mycobacterium butyricum、あるいはプリスタン、アジュバンドペプチド、カリミョウバン、クロムミョウバン、水酸化アルミニウム、フロインドのコンプリートアジュバンド、インコンプリートアジュバンド等が挙げられる。 アジュヴァントの効果は、１）抗原を難溶化することで組織に長く留まって抗原を徐々に長期間遊離させること、２）抗原をマクロファージに貪食されやすい状態にすること，３）免疫に関する細胞を非特異的に活性化することで、上記の物質は少なくともいずれか一つの性質を持つものである。
【００１９】
これらの免疫増進物質は、１種もしくは異なる種類を２種以上混合して同時にもしくは別個に産卵動物に対して接種することができる。なお、産卵動物に対して接種することが可能であれば、いずれの形態でも適用することができ、例えば、溶液、エマルジョンなどの形態で接種するのが好都合である。産卵動物に対するかかる免疫増進物質の接種は、毎月または1ヶ月ないし２ヶ月に１回程度の割合で行なうことができる。一般には、産卵動物に対する接種は、免疫賦活剤の量を所定の間隔をおいて、例えば、２週間ないし４週間の間隔で注射などによって行うのが普通である。注射期間は、所定の間隔をおいて卵を採取後、卵黄成分中の糖付加卵黄抗体が、自己免疫疾患および／またはアレルギーモデル動物に対して抗体産生抑制効果を発現するまで接種を継続する。更に、免疫増進物質の接種量は、免疫増進物質の種類、産卵動物の種類などによって変わるが、一般には、０．０１ないし２０ｍｇ、好ましくは０．５ないし５ｍｇであるのがよい。なお、免疫増進物質の接種量は、免疫増進物質を、例えばフロインドの完全アジュバンドとして接種する場合には、一般には、０．１ｍｌないし１０ｍｌ／回／羽、好ましくは０．５ｍｌないし２ｍｌ／回／羽の範囲であればよい。
【００２０】
この発明において、接種できる産卵動物としては、産卵動物であればいずれも利用することができるが、通常産卵動物といわれているニワトリ、アヒル、ダチョウ、ガチョウ、七面鳥等などの鳥類が好ましい。これら産卵動物のうち、飼育数、産卵数などの点からしても、糖付加卵黄抗体を安定してかつ安価に供給できることから、ニワトリが特に好ましい。次ぎに、この発明に従ってアジュバンドを接種した産卵動物は、通常の飼育場で常法に従って飼育することができる。上記のようにして飼育した産卵動物から採卵した卵は、回収して、全免疫卵、免疫卵黄または免疫卵黄抗体分画に必要に応じて常法に従って精製分離することができる。
【００２１】
接種した産卵動物から採卵をする時期は、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生抑制効果および／またはアレルギー疾患のIgE抗体産生抑制効果を、所定の評価方法で、この発明の過剰免疫産生抑制物質が卵中に所定濃度に達していることを確認して採卵を開始することになる。なお、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生抑制効果の評価方法は、自己免疫疾患マウス（MRL/lpr）に一定量の糖付加卵黄抗体を経口投与し、MRL/lprマウスの血清中のリウマチ因子濃度を、非経口投与群と比較して抑制効果を確認することによって行うことができる。同様に、IgE抗体産生抑制効果の評価方法も、MRL/lprマウス血清中のIgE抗体濃度を非経口投与群と比較してIgE抗体産生抑制効果を確認することによって行うことができる。
【００２２】
上記したように、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質は、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生抑制作用およびアレルギー疾患のIgE抗体産生抑制作用を有している。したがって、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質は、自己免疫疾患および／またはアレルギー疾患の治療ならびに予防のために使用することができる。この目的のために、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質は、上記のようにして常法により精製分離した免疫卵黄または免疫卵黄抗体分画は、必要に応じて加工して、それぞれの用途に使用することができる。なお、アレルギー疾患の治療ならびに予防のためにこの発明の過剰抗体産生抑制物質を使用する場合には、免疫卵黄抗体分画のみを使用するのがよい。また、この発明により得られた過剰抗体産生抑制物質は、例えば、必要に応じて他の物質と混合して、液状、粉状、粒状、クリーム状、コロイド状、固形状などの形態で使用することができる。また、この発明の過剰抗体産生抑制物質は、例えば、医薬品、例えば治療薬、予防薬など、食品、例えば機能性食品、化粧品等に使用することができる。同様に、競走馬、家畜、ペット等の餌等に含有して使用することも可能である。この態様における特に好ましい具体的な実施例としては、食品が挙げられる。この発明に係る糖付加卵黄抗体を食品に使用する場合には、例えば成人１日卵換算量として０．１個から２個程度、好ましくは０．５個から１個程度飲用すればよい。
【００２３】
また、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質は、神経系、呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿生殖器系、血液系、眼系、耳鼻咽喉系または皮膚系疾患の自己抗体の過剰産生を抑制するためまたはアレルゲン、例えば、動物性物質、植物性物質または化学物質により外部から刺激されることによって自己において過剰に産生される抗体の過剰産生を抑制するために使用することができる。上記したように、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質は、上記のような抗体の過剰産生を抑制する作用、特に自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生抑制作用ならびにアレルギー疾患のIgE抗体産生抑制作用を有しているので、神経系、呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿生殖器系、血液系、眼系、耳鼻咽喉系または皮膚系疾患、特に自己免疫疾患ならびにアレルギー疾患の治療ならびに予防のために使用することができる。したがって、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質が適用できる疾患の例としては、例えば、リウマチ並びにアレルギー症状である関節の痛み、鼻汁、くしょみ、鼻のかゆみ、咳、喘鳴、呼吸器困難、喉頭浮腫、嗄声、チアノーゼ、紅班、紫班、そう痒、蕁麻疹、湿疹、アトピー性皮膚炎、血管性浮腫、目のかゆみ、流涙、眼球結膜充血、眼臉浮腫、悪心、嘔吐、下痢、血便、腹痛、便秘、吸収不良、体重増加不良、蛋白尿、血尿、浮腫、亀頭炎、夜尿、頭痛、めまい、行動異常、貧血、血小板減少、ショック、アレルギ−性緊張（allergic tension）、疲労シンドローム（fatigue syndrome）、糖尿病などがあげられ、かかる症状の改善もしくは完治に有用である。更に、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質は、自己免疫疾患ならびにアレルギー疾患の検査薬としても応用可能であり、例えば、各種の自己免疫疾患ならびにアレルギー疾患の検査に使用することができる。かかる検査としては、例えば、自己免疫疾患検査、アレルギー検査、抗膵島細胞抗体検査などが挙げられる。
【００２４】
以下、この発明を実施例により更に詳細に説明する。
（実施例１）
接種アジュヴァント：
メーカー名：株式会社ヤトロン
製品名：コンプリートアジュヴァント(Freund)
組成： 界面活性剤： 1.5ml/10ml
流動パラフイン： 8.5ml/10ml
免疫賦活剤： BCG死菌（加熱死菌）
コントロール：注射用生理食塩水（大塚製薬製）
産卵動物：ニワトリ（白色レグホン）
雌雄： 雄
体重： 平均２Kg
餌： くみあい配合飼料セレクトハイ（成鶏飼育配合飼料）、全農（JA）供給給水： 水道水
接種：
エマルジュン作製方法：
エマルジョン量：アジュヴァント 1ml/羽 ＋ 生理食塩水 1ml/羽
接種部位： 皮下
接種量： １回／月、２回接種
接種期間： ２ヶ月
採卵期間：１３日間
採卵数（鶏数 各群N＝２の平均値,単位は個）
A)アジュヴァント接種群（アジュヴァントのみを接種した）
採卵数: 計１１個（１−８日目、１０−１２日目）
B)アジュヴァント＋免疫賦活剤量を増量群
採卵数: 計５個（８−１０日目、１２−１３日目）
C)注射用生理食塩水接種群
採卵数: 計１３個（１−１３日目まで連続）
採卵した卵は、全採卵が終了するまで家庭用冷蔵庫に保管した。
実施例１の試験結果より経済的に産卵率を落とさず回収可能な上記アジュヴァント接種群の卵を以下の試験に使用した。
【００２５】
（実施例２）
実施例１のアジュヴァント接種群の卵を次のようにして分画した。
分離精製工程：
全卵（ノーマル卵）（以下、ニワトリにアジュヴァントを接種後、回収した卵を免疫卵と言う。）を割って卵黄を分離した。次いで、卵黄をデキストラン（シグマ社製；添加量：最終濃度0.1%）で吸着して脱脂し、この脱脂した卵黄を遠心分離してその上清を回収した。この回収した上清をゲルろ過カラムクロマトグラフィに付した。ゲルろ過カラムクロマトグラフィの条件は次のとおりである。
カラム： Sephacryl S-300 クロマトグラフィ(アマシャム・ファルマシア社製)
バッファ： 10mM リン酸バッファ：pＨ7.2；0.15M NaＣl
フローレート： 0.7ml/min
波長： 254ｎｍ、280ｎｍ
測定機器： AKTA explorer(アマシャム・ファルマシア社製)
ゲルろ過カラムクロマトグラフィの測定結果は図１に示すとおりである。
【００２６】
（実施例３）
実施例２で得られたゲルろ過カラムクロマトグラムから免疫卵の分画１、２、３および４を回収した。
つぎに、この免疫卵分画１をゲルろ過カラムクロマトグラフィによって処理した。ゲルろ過カラムクロマトグラフィの条件は次のとおりである。
カラム： Sephadex G-75 クロマトグラフィ(アマシャム・ファルマシア社製)
バッファ： 10mM リン酸バッファ；pＨ7.2、0.15M NaＣl
フローレート： 0.7ml/min
波長： 254ｎｍ、280ｎｍ
測定機器： AKTA explorer(アマシャム・ファルマシア社製)
上記ゲルろ過カラムクロマトグラフィで得られたメインピークを回収して、イオン交換カラムクロマトグラフィによって処理した。イオン交換カラムクロマトグラフィの条件は次のとおりである。
カラム： Resource S クロマトグラフィ(アマシャム・ファルマシア社製)
バッファA： 10mM Tris-HCl, pH8.0
バッファB： 10mM Tris-HCl, pH8.0, 0.3M NaCl
バッファA→バッファB： Linear gradient
フローレート： 0.7ml/min
波長： 254ｎｍ、280ｎｍ
測定機器： AKTA explorer(アマシャム・ファルマシア社製)
【００２７】
上記ゲルろ過カラムクロマトグラフィで得られた免疫分画１をイオン交換カラムクロマトグラフィに掛けた結果は図３に示す通りである。同様に、上記ゲルろ過カラムクロマトグラフィで得られたノーマル卵分画１をイオン交換カラムクロマトグラフィに掛けた結果は図４に示す通りである。
【００２８】
次ぎに、上記イオン交換カラムクロマトグラフィで得られたメインピークを回収した。さらに、回収したメインピークをSDS-PAGE試験によって処理した。SDS-PAGE試験条件は次のとおりである。
電気泳動装置： テフコ社製 SDS-PAGE電気泳動装置
電気泳動条件： １８mA定電流,６０分
サンプル量： 非還元処理 １μg/lane
染色条件
銀染色: 2D-銀染色試薬II（第一化学薬品製）
試験結果：
ノーマル卵黄ならびに免疫卵黄を、上記のようにゲル濾過カラムクロマトグラフィを２回とイオン交換カラムクロマトグラフィを１回行うことによって精製分離した結果、卵黄抗体の分子量に相当する１８万の部分にバンドが１本確認された。このバンドは明らかに精製された卵黄抗体であることが確認できた（図５参照）。
図５において、レーン２はHyE F-1(GGI)（ゲル濾過カラムクロマトグラフィを２回、イオン交換クロマトグラフィを1回行なって精製した免疫卵分画１）を示す。レーン３はNE F-1(GGI)（ゲル濾過クロマトグラフィを２回、イオン交換カラムカラムクロマトグラフィを1回行なって精製したノーマル卵分画１）を示す。レーン４はHyE F-1(GG)（ゲル濾過クロマトグラフィを２回行なって精製した免疫卵分画１）を示す。レーン５はNE F-1(GG)（ゲル濾過カラムクロマトグラフィを２回行なって精製したノーマル卵分画１）を示す。
【００２９】
つぎに、上記で確認された卵黄抗体をイムノドット試験によって判定した。
イムノドット作業工程
Zeta-Probe Blotting メンブレン(BIO-RAD社製)（1μl/Dot）を風乾した後、室温で１時間ブロッティング(10% Block Ace/10mM PBS)した。ブロッティングした後、３回洗浄をして抗ニワトリIgYヤギ血清（ロットIC-003：SYC社製）を10mM PBSで3000倍希釈して、室温で１時間反応した。反応後、洗浄液で３回洗浄し、抗ヤギIgG-HRPO標識（Cappel社製）を10mM PBSで5000倍希釈液を加えて室温で１時間更に反応した。洗浄液で３回更に洗浄して、発色液(BIO-RAD社製)を用いて発色して判定した。
試験結果：
上記の試験結果から、ノーマル卵黄抗体並びに免疫卵黄抗体をそれぞれ、上記のようにゲル濾過カラムクロマトグラフィを２回とイオン交換カラムクロマトグラフィを１回行なって精製分離した結果、卵黄抗体、全卵中卵黄抗体、卵黄中の卵黄抗体と、卵黄抗体の特異抗体とは抗原抗体反応はするが、ＰＢＳとは反応していないことが判明した。
また、ゲル濾過カラム２回とイオン交換カラム１回を通して精製分離した結果、ノーマル卵黄抗体と免疫卵黄抗体であることが確認された（図６参照）。
【００３０】
（実施例４）
自然発症自己免疫疾患マウスによる自己抗体産生抑制効果試験
使用マウス：
自然発症免疫疾患マウス：MRL/lpr（深町知博他：MRL/lprマウス自然発症関節炎；炎症と免疫、
Vol.2, No. 2, pp. 104-114, 1994）
８週令で入荷後、1週間予備飼育した。
ブリーダー名：日本エスエルシー製
雌雄：雄
投与試験：
週令：９週令より投与試験開始
N数：各群７匹
餌： CE-2（日本クレア製：ロットNo.E2119−ｋ３）
給水：滅菌水道水
照度：午前７時から午後７時まで
投与量：全卵 ３５μl/匹／日。
免疫卵分画 全卵の７０μl相当量/匹／日。
投与方法：経口ゾンデを使用して直接投与
投与回数：３回／週
投与期間：８週間
コントロール群（対象群）：滅菌水だけを投与。
評価方法：
MRL/lprマウスが加齢とともに自の血清中に自己抗体であるIgG型リウマチ因子を大量に産生すると同時に手足関節の膨らみが観察できた。したがって、抗体投与群（ガラクトース付加卵黄抗体をMRL/lprマウスに経口投与した）と、ガラクトース等付加卵黄抗体未投与群（コントロール群）（MRL/lprマウスに滅菌水のみを投与した）とのIgG型リウマチ因子濃度を比較することにより効果判定が可能である。
測定方法：
試薬：IgG型マウスリウマチ因子測定法（市川厚編：関節炎（３）MRL/ｌマウス関節炎、炎症とアレルギー（Ｉ-2）、廣川生物薬科学実験講座１２巻、廣川書店、1993）に従って調製した。
操作方法：96 wellに固相化した抗原（IgG型マウスリウマチ因子と反応する蛋白）wellに検体（ガラクトース等付加卵黄抗体投与群MRL/lprマウスから採血した血清）を希釈後、100μl/wellを添加して室温で２時間反応させた。反応後、未反応部分を洗浄液で洗浄して、POD標識マウスIgG抗体を100μl/wellの割合で添加して室温でさらに２時間反応させた。反応後、未反応部分を洗浄液で洗浄して、発色液（TMB）を100μl/wellの割合で添加して室温で２０分間反応させた後、反応停止液を100μl/wellの割合で添加して反応を停止させた。次いで、各ウェルをイムノリーダー（450nm）で測定した。
評価結果
滅菌水投与群と、免疫卵分画３と免疫卵分画４とをそれぞれ投与した免疫卵分画投与群のMRL/lprマウスは、飼育加齢と共に、自己抗体濃度が上昇した。これに対して、免疫卵分画１投与群のMRL/lprマウスの自己抗体濃度は上昇しないので、自己免疫疾患の自己抗体産生を抑制する作用があることが証明された。また、免疫卵分画２投与群のMRL/lprマウスの自己抗体濃度は、僅かに上昇した後、減少し、自己免疫疾患の自己抗体産生を抑制する作用があることが証明された（図２参照）。更に、免疫卵全体も、MRL/lprマウスの自己抗体濃度は、対象群に比較して低く、自己免疫疾患の自己抗体産生を抑制する作用を有していると言える。
したがって、ガラクトース等付加卵黄抗体は、自己免疫疾患である関節リウマチの治療並びに予防効果があることが証明された。
【００３１】
（実施例５）
IgE抗体産生抑制効果試験：
使用マウスならびに検体：
実施例３のガラクトース付加卵黄抗体をMRL/lprマウスに経口投与した投与群と、滅菌水のみをMRL/lprマウスに投与した未投与群（コントロール群）のIgE抗体濃度を比較することにより効果を判定した。
コントロール群：滅菌水 ２匹（１５週令）
免疫卵分画１を投与したMRL/lprマウス群：２匹（１５週令）
評価方法
測定キット：森永生科学研究所製：モリナガ ELISA マウス
IgE抗体キット
測定範囲：０．５ｎｇ／ｍｌ〜３２ｎｇ／ｍｌ
評価結果
MRL/lprマウス血中IgE抗体濃度測定結果（単位：ｎｇ／ｍｌ）
上記の結果から、コントロール投与群（滅菌水投与群）のMRL/lprマウス１５週令のIgE抗体濃度は１６１．１ｎｇ／ｍｌであって加齢とともに上昇したが、免疫卵分画１（ガラクトース等付加卵黄抗体投与群のMRL/lprマウス１５週令のIgE抗体濃度は感度以下の０．４０６ｎｇ／ｍｌであった。この結果から、免疫卵分画１（ガラクトース等付加卵黄抗体）はMRL/lprマウスのIgE抗体産生を抑制したことを確認した。従って、ガラクトース付加卵黄抗体はアレルギー疾患の治療並びに予防に効果があることが証明された。
【００３２】
（実施例６）
実施例２で示した免疫卵並びにノーマル卵を卵黄分離して脱脂した後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィを２回とイオン交換カラムクロマトグラフィを１回行って精製をして回収した免疫卵由来卵黄抗体中のガラクトース、N-アセチルガラクトサミン（以下、NAGAと略す）結合量と、ノーマル卵由来卵黄抗体のガラクトース、NAGA結合量を比較した。
測定方法：
各卵黄抗体3μg/mlを0.1M 炭酸バッファ、pH 9.5に溶解した溶液を100オl/wellの割合で96well（ヌンク社製）の各ウエルに添加して、25℃で２時間コーティングした。コーティング後、３回洗浄液（10mM リン酸バッファ、pH7.2；150mM NaCl；0.05% Tween 20）で洗浄した後、各ウェルにコーティング液（25% Block Ace；10mM リン酸バッファ、pH 7.2；150mM NaCl；0.05% Tween 20）を250μl/wellの割合で添加し、25℃で２時間コーティングした。次いで、洗浄液（10mM リン酸バッファ、pH7.2；150mM NaCl；0.05% Tween 20）で３回洗浄した後、反応液（Biotin conjugated RCA120*；*RCA120：ガラクトース、およびN-アセチルガラクトサミン残基特異結合レクチン）を100μl/wellの割合で各ウェルに添加し、25℃で１時間反応させた。次に、各ウェルにAvidin conjugated HRPを100mμl/wellの割合で添加し、25℃で1時間反応させた。反応後、各ウェルを洗浄液（10mM リン酸バッファ、pH 7.2；150mM NaCl; 0.05% Tween 20）で３回洗浄した。洗浄後、発色液（TMB）を100μl/wellの割合で添加して室温で１０分間反応させた後、反応停止液（1M H2SO4）を100μl/wellの割合で添加して反応を停止させた。次いで、各ウェルをイムノリーダーで吸光度（450nm/620nm）を測定した。
測定結果：
上記のようにしてノーマル卵と免疫卵の各３個より精製した卵黄抗体結合ガラクトース・NAGA量を測定した結果、ノーマル卵由来卵黄抗体結合ガラクトース・NAGA量のAbs.値(吸光度)を１００％としたときに、免疫卵由来卵黄抗体結合ガラクトース・NAGA量は１５４％であったことが判明した。
この測定結果より、ノーマル卵と比較して、アジュヴァント接種によりガラクトース・NAGA量が１．５倍も多くなっていたことが判る（図７参照）。
【００３３】
発明の効果
この発明によって、アジュヴァントを接種して得た糖付加卵黄抗体は、関節リウマチ疾患の自己抗体（イムノグロブリン）並びにアレルギー疾患（花粉症、アトピー性皮膚炎、喘息等）のIgE抗体産生を抑制することが判明した。このことから、この発明に係る糖付加卵黄抗体は、自己免疫疾患および／またはアレルギー疾患の治療ならびに／もしくは予防に有効である。従って、この発明に係る糖付加卵黄抗体は、自己免疫疾患および／またはアレルギー疾患の治療もしくは予防に対して効果を付与する飲食品、医薬品,化粧品、飼料等の素材として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ゲル濾過カラムクロマトグラフィ（Sephacryl S-300クロマトグラフィ）での免疫卵分画１、２、３、４の分画パターンを示すパターン図である。
【図２】自己免疫疾患モデルマウス（MRL/lprマウス）に免疫卵全体を投与した免疫卵投与実験（マウスＩｇＧ型リウマチ因子測定）によるMRL/RF-IgG抗体価を示すグラフ。
【図３】自己免疫疾患モデルマウスに免疫卵分画１と２を投与した免疫卵分画投与実験（マウスＩｇＧ型リウマチ因子測定）によるMRL/RF-IgG抗体価を示すグラフ。
【図４】自己免疫疾患モデルマウスに免疫卵分画３と４を投与した免疫卵分画投与実験（マウスＩｇＧ型リウマチ因子測定）によるMRL/RF-IgG抗体価を示すグラフ。
【図５】イオン交換カラムクロマトグラフィ（Resource S クロマトグラフィ）で免疫卵分画１をさらに精製したパターンを示すパターン図である。
【図６】イオン交換カラムクロマトグラフィ（Resource S クロマトグラフィ）でノーマル卵分画１をさらに精製したパターンを示すパターン図である。
【図７】ノーマル卵分画１と免疫卵分画１に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験結果を示す電気泳動図である。
【図８】イムノドット試験結果を示す写真である。
【図９】免疫卵由来ＩｇＹ結合ガラクトース等量とノーマル卵由来ＩｇＹ結合ガラクトース量の比較を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a sugar-added egg yolk antibody, a method for producing the same, and a method for using the same, and more specifically, a sugar-added egg yolk antibody that suppresses autoantibody of an autoimmune disease (immunoglobulin) and / or IgE antibody caused by allergic disease, and The present invention relates to a production method thereof and a method of use used for treatment and prevention of autoimmune diseases and allergic diseases using the same.
As used herein, the term “containing a saccharide or sugar chain” means an egg antibody containing a saccharide or sugar chain in the natural state, and the term “sugar or sugar chain-added egg antibody” is As a result of treatment of an egg-laying animal, it means a new saccharide or sugar chain or an egg antibody to which a saccharide or sugar chain is newly added.
[0002]
[Prior art]
When a living body is invaded by bacteria, viruses, or various foreign substances (antigens), immune cells recognize the antibody, and are equipped with a defense system based on an immune reaction that produces the antibody and protects the antigen from entering. These immune cells discriminate between self and non-self, and immune tolerance (tolerance) acts on self-antigens to suppress immune responses, whereas it induces immune responses to non-self antigens . In other words, in general, the balance of immune tolerance against self-antigens is controlled within the same individual, but when the self-non-self discrimination mechanism is impaired (if this balance of tolerance is once broken) However, autoantibodies (immunoglobulins) are also produced against self-antigens, and the problem of attacking self-antigens such as self-tissues arises. Such a phenomenon is called an autoimmune reaction, and this autoimmune reaction causes various autoimmune diseases.
[0003]
An autoimmune disease is a disease caused by an immune response to a self-antigen, and there are many unclear points about its cause. In addition, there are a wide variety of cases. Examples of main diseases include thyroid autoimmune diseases, SLE (systemic lupus erythematosus), rheumatoid arthritis, glomerulonephritis, autoimmune blood diseases (autoimmune hemolysis). Anemia, pernicious anemia, etc.) are known.
[0004]
As a treatment method for these diseases, for example, immunosuppressive therapy is applied to the above-mentioned SLE that causes serious symptoms. In rheumatoid arthritis and the like, an autologous organ or allogeneic organ transplantation is performed because the self organ is completely lost due to autoimmunity. In addition, as for symptoms that cause metabolic abnormalities, deficient metabolic enzymes, hormones, etc. are administered. However, such treatment is only coping therapy, and the current situation is that treatment of the underlying autoimmune disease has not been achieved.
[0005]
As described above, an immune response is an indispensable and useful reaction for the living body to survive, but this immune reaction may cause inconvenience to the living body, and such an adverse immune reaction may be caused. It is said to be an allergic reaction. Antibodies are divided into several classes based on their molecular structure, but antibodies that cause allergic reactions are mainly IgE antibodies.
[0006]
In general, atopy refers to an allergic reaction involving IgE antibody, and this allergic reaction involving IgE antibody causes a chain reaction in mast cells due to antigen rebinding to IgE antibody bound to mast cells. This is a type in which chemical transmitters are released and cause tissue damage. Most allergic diseases such as hay fever, bronchial asthma, atopic dermatitis, and allergic rhinitis are caused by this allergic reaction.
[0007]
In order to prevent allergic diseases, it is important to remove the antigen from the environment, but it is difficult to completely remove the antigen from the environment. Moreover, antihistamines, β-sympathomimetic agents, theophylline preparations, steroids and the like are often used as therapeutic agents for allergic diseases. In general, treatment of allergic diseases requires a long period of time, and there are concerns about side effects due to long-term use of pharmaceuticals.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, developing autoantibodies (immunoglobulins) for autoimmune diseases and antibody production inhibitors that suppress the production of IgE antibodies during allergic diseases suppress the production of causative agents for autoimmune diseases and allergic diseases. Therefore, there is a strong demand for the development of such antibody production-suppressing substances that can be eliminated from the causes of autoimmune diseases and allergic diseases and are extremely useful.
[0009]
From this point of view, the inventor has conducted extensive research on autoantibodies (immunoglobulins) of autoimmune diseases and antibody production inhibitors that suppress the production of IgE antibodies in the case of allergic diseases. The egg yolk antibody obtained by inoculating the egg-laying animal was found to have more galactose or N-acetylgalactosamine added than the normal egg yolk antibody. Furthermore, the present inventors have found that this glycosylated egg antibody suppresses the production of IgE antibody in the case of autoantibodies (immunoglobulins) of immune diseases and / or allergic diseases, and completed the present invention.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
Accordingly, an object of the present invention is to provide an excessive autoantibody production inhibitor comprising a saccharide or sugar chain-containing egg antibody or a saccharide or sugar chain-added egg antibody. In a preferred embodiment, an excessive autoantibody production inhibitor comprising a saccharide or sugar chain-containing egg antibody or a saccharide or sugar chain-added egg antibody suppresses overproduction of autoantibodies to a self organ or a substance produced by the self organ. It is to provide an excessive autoantibody production inhibitory substance consisting of a substance to be treated. According to another preferred embodiment, the excessive autoantibody production inhibitory substance suppresses the production of an autoimmune disease autoimmune antibody (immunoglobulin) and / or suppresses the production of an immunoglobulin involved in allergic disease, particularly an IgE antibody. It is to provide an excessive autoantibody production inhibitor having an action. In this specification, either one of a saccharide or sugar chain-containing egg antibody or a saccharide or sugar chain-added egg antibody may be used, but in any case there is no intention to limit to that term. Unless otherwise specified, it should be understood that any meaning is used. In addition, saccharides or sugar chain-containing egg antibodies and inclusion and addition used as saccharides or sugar chain-added egg antibodies, and terms related thereto, limit the coexistence state of saccharides or sugar chains and egg antibodies. It should be understood that it is not intended to be used in any way, but is intended to encompass any co-existing state, such as a combined state.
[0011]
Furthermore, as a preferred embodiment of this invention, the saccharide or sugar chain in the excessive autoantibody production inhibitor comprising a saccharide or sugar chain-containing egg antibody or a saccharide or sugar chain-added egg antibody is galactose, glucose, mannose, fucose, N-acetylglucosamine. , N-acetylgalactosamine, or sialic acid or an excessive autoantibody production inhibitor that is a sugar chain containing these saccharides. As a further preferred embodiment of the present invention, there is provided an excessive autoantibody production-suppressing substance in which an antibody in an excessive autoantibody production-suppressing substance comprising a saccharide or sugar chain-containing egg antibody or a saccharide or sugar chain-added egg antibody is an egg yolk antibody. . As a further preferred embodiment of the present invention, there is provided an excessive autoantibody production inhibitor that is present in immune eggs, immune yolks or immune yolk antibody fractions.
[0012]
In addition, the present invention provides an excess of an autoantibody production inhibitor comprising a saccharide or sugar chain-containing egg antibody or a saccharide or sugar chain-added egg antibody by inoculating a spawning animal with a substance having an immune enhancing effect. Another object is to provide a method for producing an autoantibody production inhibitor. A preferred embodiment of the present invention is to provide a method for producing an excessive autoantibody production inhibitor comprising use as a mixture with adjuvant.
[0013]
As another preferred embodiment of the present invention, the excessive autoantibody production inhibitory substance has an action of suppressing the production of IgE antibodies in the case of an autoimmune disease autoantibody (immunoglobulin) and / or allergic disease. Another object of the present invention is to provide a manufacturing method for manufacturing the above. As another preferred embodiment of the present invention, the saccharide or sugar chain in the excessive autoantibody production inhibitor comprising a saccharide or sugar chain-containing egg antibody or a saccharide or sugar chain-added egg antibody is galactose, glucose, mannose, fucose, N- An object of the present invention is to provide a production method for producing an excessive autoantibody production inhibitor that is acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialic acid, or a sugar chain containing these saccharides. As a particularly preferred embodiment of the present invention, an excessive autoantibody production inhibitor comprising producing an added egg yolk antibody such as galactose in which galactose or N-acetylgalactosamine is added to an egg yolk antibody by inoculating an adjuvant with an adjuvant. It is to provide a manufacturing method. Further, as another preferred embodiment of the present invention, an excessive autoantibody production inhibitory substance in which an antibody in an excessive autoantibody production inhibitory substance comprising a saccharide or sugar chain-containing egg antibody or a saccharide or sugar chain-added egg antibody is an egg yolk antibody is produced. It is to provide a manufacturing method. A further preferred embodiment of the present invention is to provide a production method for producing an excess autoantibody production inhibitor as an immune egg, immune egg yolk or immune egg yolk antibody fraction.
[0014]
Furthermore, the present invention relates to an excessive autoantibody production inhibitor comprising a saccharide or sugar chain-containing egg antibody or a saccharide or sugar chain-added egg antibody, a nervous system, a respiratory system, a circulatory system, a digestive system, a urogenital system, It is to provide a method of using an excessive autoantibody production inhibitor comprising using it to suppress the excessive production of antibodies of blood system, eye system, otolaryngology system or skin system disease. In a preferred embodiment of this invention, an autoantibody and / or an autoimmune disease and / or an excessive autoantibody production inhibitor having an action of suppressing the production of IgE antibody in the case of an allergic disease, It is to provide a method of use used for the treatment or prevention of autoimmune diseases and / or allergic diseases by suppressing the production of excess antibodies generated during allergic diseases. In a preferred embodiment of the present invention, production of an autoantibody (immunoglobulin) of an autoimmune disease is performed in a state in which the excessive autoantibody production inhibitor is extracted or purified from an immunized egg, an immunized yolk or an immunized egg yolk antibody fraction, and To provide a method of using an excessive autoantibody production inhibitor to suppress IgE antibody production in allergic diseases.
[0015]
Further objects, features and advantages of the present invention will become apparent from the following description of the present specification and the accompanying drawings.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The excessive autoantibody production inhibitor according to the present invention is a sugar-containing egg antibody or a sugar-added egg antibody, that is, a sugar-containing or sugar-added egg yolk antibody. Examples of the saccharide or sugar chain include galactose, glucose, mannose, fucose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, and sialic acid, and galactose and N-acetylgalactosamine are particularly preferable. This excessive autoantibody production inhibitor is particularly characterized in that it has an action of suppressing IgE antibody production in autoimmune disease autoimmune (immunoglobulin) production and / or allergic disease.
[0017]
The excessive autoantibody production-suppressing substance according to the present invention can be produced by inoculating a spawning animal with a substance having an immune enhancing effect. Substances having such an immune enhancing effect are used alone or in combination with other substances having similar effects
[0018]
Such immuno-enhancing substances are collectively referred to as Adjuvant, dead live cow dairy bacilli, dead live cattle tuberculosis, dead live human tuberculosis, ascaris, dead live pertussis, potash alum, endotoxin, Muramyl dipeptide (MDP), toxins, heat-labile Examples include enterotoxin, heat-killed Mycobacterium butyricum, or pristane, adjuvant peptide, potash alum, chrome alum, aluminum hydroxide, Freund's complete adjuvant, incomplete adjuvant. Advant's effects are: 1) make the antigen difficult to solubilize the tissue and release the antigen gradually for a long period of time; 2) make the antigen susceptible to phagocytosis by macrophages; By non-specific activation, the above substance has at least one property.
[0019]
These immunostimulants can be inoculated to spawning animals at the same time or separately by mixing two or more of one kind or different kinds. In addition, any form can be applied as long as it is possible to inoculate a laying animal. For example, it is convenient to inoculate in the form of a solution, an emulsion or the like. Such inoculations can be inoculated to the laying animals every month or once every one to two months. In general, inoculation of laying animals is usually performed by injection at an interval of 2 to 4 weeks, for example, the amount of the immunostimulant at a predetermined interval. During the injection period, after the eggs are collected at a predetermined interval, the inoculation is continued until the sugar-added egg yolk antibody in the yolk component exhibits an antibody production inhibitory effect on the autoimmune disease and / or allergy model animal. Further, the inoculation amount of the immunopotentiating substance varies depending on the kind of the immunopotentiating substance, the kind of the laying animal, etc., but is generally 0.01 to 20 mg, preferably 0.5 to 5 mg. The inoculation amount of the immunopotentiating substance is generally 0.1 ml to 10 ml / dose, preferably 0.5 ml to 2 ml / dose when the immunopotentiating substance is inoculated as, for example, Freund's complete adjuvant. / It may be in the range of feathers.
[0020]
In the present invention, any egg laying animal that can be inoculated can be any egg laying animal, but birds such as chickens, ducks, ostriches, geese, turkeys and the like, which are usually called laying animals, are preferred. Among these laying animals, chickens are particularly preferable because the sugar-added egg yolk antibody can be supplied stably and inexpensively in terms of the number of bred animals, the number of eggs laid, and the like. Next, the egg-laying animal inoculated with adjuvant according to the present invention can be bred according to a conventional method in a normal breeding ground. Eggs collected from the laying animals bred as described above can be collected and purified and separated according to a conventional method as necessary for whole immune eggs, immune yolks or immune yolk antibody fractions.
[0021]
When the egg is collected from the inoculated egg-laying animal, the autoimmune antibody (immunoglobulin) production inhibitory effect of autoimmune disease and / or the IgE antibody production inhibitory effect of allergic disease is controlled by the predetermined evaluation method according to the present invention. It is confirmed that the substance has reached a predetermined concentration in the egg and egg collection is started. In addition, the evaluation method of the autoantibody (immunoglobulin) production inhibitory effect of an autoimmune disease is a method of orally administering a certain amount of a sugar-added egg yolk antibody to an autoimmune disease mouse (MRL / lpr), and in the serum of the MRL / lpr mouse. The rheumatoid factor concentration can be determined by confirming the inhibitory effect as compared with the parenteral administration group. Similarly, the evaluation method of the IgE antibody production inhibitory effect can also be performed by confirming the IgE antibody production inhibitory effect by comparing the IgE antibody concentration in the serum of MRL / lpr mouse with that of the parenteral administration group.
[0022]
As described above, the excessive antibody production inhibitory substance according to the present invention has an autoimmune disease autoimmune (immunoglobulin) production inhibitory effect and an allergic disease IgE antibody production inhibitory effect. Therefore, the excessive antibody production-suppressing substance according to the present invention can be used for the treatment and prevention of autoimmune diseases and / or allergic diseases. For this purpose, the excessive antibody production-suppressing substance according to the present invention is prepared by subjecting the immune yolk or immune yolk antibody fraction purified and separated by the conventional method as described above to the desired use for each purpose. Can be used. In addition, when using the excessive antibody production inhibitor of this invention for the treatment and prevention of allergic diseases, it is preferable to use only the immune yolk antibody fraction. Moreover, the excessive antibody production inhibitor obtained by this invention is used in the form of liquid, powder, granule, cream, colloid, solid, etc., for example, if necessary, mixed with other substances. be able to. Moreover, the excessive antibody production inhibitory substance of this invention can be used for foodstuffs, such as a functional food, cosmetics, etc., for example, a pharmaceutical, such as a therapeutic agent, a prophylactic agent, etc., for example. Similarly, it can also be used by containing it in the feed of racehorses, livestock, pets and the like. A particularly preferred specific example in this embodiment is food. When the sugar-added egg yolk antibody according to the present invention is used in foods, for example, about 0.1 to 2 adults, preferably about 0.5 to 1 may be drunk as an adult daily egg equivalent.
[0023]
Further, the excessive antibody production-suppressing substance according to the present invention includes an excess of autoantibodies of nervous system, respiratory system, circulatory system, digestive system, urogenital system, blood system, eye system, otolaryngology system or skin system disease. It can be used to suppress production or to suppress overproduction of antibodies that are overproduced in the self by being externally stimulated by allergens such as animal substances, plant substances or chemical substances. As described above, the excessive antibody production-suppressing substance according to the present invention has the effect of suppressing the overproduction of the antibody as described above, in particular, the autoimmune disease autoimmune antibody (immunoglobulin) production inhibitory effect and the allergic disease IgE antibody production. Since it has an inhibitory action, it can cause nervous system, respiratory system, circulatory system, digestive system, urogenital system, blood system, eye system, otolaryngological system or skin system disease, especially autoimmune diseases and allergic diseases. Can be used for treatment as well as prevention. Accordingly, examples of diseases to which the excessive antibody production inhibitor according to the present invention can be applied include, for example, rheumatism and allergic symptoms such as joint pain, nasal discharge, itchiness, nasal itching, cough, wheezing, respiratory problems, Laryngeal edema, hoarseness, cyanosis, erythema, purple, pruritus, hives, eczema, atopic dermatitis, angioedema, itchy eyes, lacrimation, eyeball conjunctival hyperemia, eyelid edema, nausea, vomiting, diarrhea , Bloody stool, abdominal pain, constipation, malabsorption, weight loss, proteinuria, hematuria, edema, balanitis, night urine, headache, dizziness, behavioral abnormalities, anemia, thrombocytopenia, shock, allergic tension, Fatigue syndrome (fatigue syndrome), diabetes, etc. are mentioned, and it is useful for the improvement or complete cure of such symptoms. Furthermore, the excessive antibody production-suppressing substance according to the present invention can also be applied as a test agent for autoimmune diseases and allergic diseases, and can be used, for example, for testing various autoimmune diseases and allergic diseases. Examples of such tests include autoimmune disease tests, allergy tests, and anti-islet cell antibody tests.
[0024]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
(Example 1)
Inoculation Adjuvant:
Manufacturer Name: Yatron
Product name: Complete Adjuvant (Freund)
Composition: Surfactant: 1.5ml / 10ml
Flowing paraffin: 8.5ml / 10ml
Immunostimulator: BCG killed (heat killed)
Control: Saline for injection (Otsuka Pharmaceutical)
Spawning animals: chicken (white leghorn)
Sex: Male
Weight: Average 2Kg
Feed: Kumiai Formula Feed Select High (adult feed breeding feed), Whole Farm (JA) Supply Water: Tap Water
Inoculation:
How to make Emuljun:
Emulsion amount: Adjuvant 1ml / feather + Saline 1ml / feather
Inoculation site: Subcutaneous
Inoculation amount: Once / month, twice inoculation
Inoculation period: 2 months
Egg collection period: 13 days
Number of eggs collected (number of chickens, average for each group N = 2, unit is individual)
A) Adjuvant vaccination group (only Adjuvant was inoculated)
Number of eggs collected: 11 (1-8 days, 10-12 days)
B) Adjuvant + increased amount of immunostimulant
Number of eggs collected: 5 (8-10 days, 12-13 days)
C) Injection saline group
Number of eggs collected: 13 in total (continuous until day 1-13)
The collected eggs were stored in a household refrigerator until all eggs were collected.
From the test results of Example 1, the eggs of the above-mentioned adjuvant group inoculated that can be recovered economically without dropping the egg-laying rate were used in the following tests.
[0025]
(Example 2)
Eggs from the adjuvant group in Example 1 were fractionated as follows.
Separation and purification process:
The egg yolk was separated by breaking the whole egg (normal egg) (hereinafter, the egg recovered after inoculating the chicken with adjuvant). Next, the egg yolk was adsorbed and degreased with dextran (manufactured by Sigma; added amount: final concentration 0.1%). The degreased egg yolk was centrifuged to recover the supernatant. The collected supernatant was subjected to gel filtration column chromatography. The conditions for gel filtration column chromatography are as follows.
Column: Sephacryl S-300 Chromatography (Amersham Pharmacia)
Buffer: 10 mM Phosphate buffer: pH 7.2; 0.15 M NaCl
Flow rate: 0.7ml / min
Wavelength: 254nm, 280nm
Measuring instrument: AKTA explorer (Amersham Pharmacia)
The measurement results of gel filtration column chromatography are as shown in FIG.
[0026]
(Example 3)
From the gel filtration column chromatogram obtained in Example 2, fractions 1, 2, 3 and 4 of immunized eggs were collected.
Next, this immunized egg fraction 1 was processed by gel filtration column chromatography. The conditions for gel filtration column chromatography are as follows.
Column: Sephadex G-75 chromatography (Amersham Pharmacia)
Buffer: 10 mM phosphate buffer; pH 7.2, 0.15 M NaCl
Flow rate: 0.7ml / min
Wavelength: 254nm, 280nm
Measuring instrument: AKTA explorer (Amersham Pharmacia)
The main peak obtained by the gel filtration column chromatography was collected and processed by ion exchange column chromatography. The conditions for ion exchange column chromatography are as follows.
Column: Resource S chromatography (Amersham Pharmacia)
Buffer A: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0
Buffer B: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.3 M NaCl
Buffer A → Buffer B: Linear gradient
Flow rate: 0.7ml / min
Wavelength: 254nm, 280nm
Measuring instrument: AKTA explorer (Amersham Pharmacia)
[0027]
The result obtained by subjecting the immune fraction 1 obtained by the gel filtration column chromatography to ion exchange column chromatography is as shown in FIG. Similarly, the result of subjecting the normal egg fraction 1 obtained by the gel filtration column chromatography to ion exchange column chromatography is as shown in FIG.
[0028]
Next, the main peak obtained by the ion exchange column chromatography was recovered. Furthermore, the collected main peak was processed by SDS-PAGE test. SDS-PAGE test conditions are as follows.
Electrophoresis device: Tefco SDS-PAGE electrophoresis device
Electrophoresis conditions: 18mA constant current, 60 minutes
Sample amount: Non-reducing treatment 1μg / lane
Staining conditions
Silver stain: 2D-silver stain reagent II (Daiichi Chemical)
Test results:
Normal egg yolk and immune egg yolk were purified and separated by performing gel filtration column chromatography twice and ion exchange column chromatography once as described above. As a result, one band was present in the 180,000 portion corresponding to the molecular weight of egg yolk antibody. confirmed. This band was confirmed to be clearly purified yolk antibody (see FIG. 5).
In FIG. 5, lane 2 shows HyE F-1 (GGI) (immune egg fraction 1 purified by performing gel filtration column chromatography twice and ion exchange chromatography once). Lane 3 shows NE F-1 (GGI) (normal egg fraction 1 purified by performing gel filtration chromatography twice and ion exchange column column chromatography once). Lane 4 shows HyE F-1 (GG) (immune egg fraction 1 purified by performing gel filtration chromatography twice). Lane 5 shows NE F-1 (GG) (normal egg fraction 1 purified by performing gel filtration column chromatography twice).
[0029]
Next, the egg yolk antibody confirmed above was determined by an immunodot test.
Immunodot work process
Zeta-Probe Blotting membrane (manufactured by BIO-RAD) (1 μl / Dot) was air-dried and then blotted at room temperature for 1 hour (10% Block Ace / 10 mM PBS). After blotting, it was washed 3 times, and anti-chicken IgY goat serum (Lot IC-003: manufactured by SYC) was diluted 3000 times with 10 mM PBS and reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, the plate was washed three times with a washing solution, an anti-goat IgG-HRPO label (manufactured by Cappel) was diluted 5000 times with 10 mM PBS, and further reacted at room temperature for 1 hour. Further washing was performed 3 times with a washing solution, and coloring was performed using a color developing solution (manufactured by BIO-RAD) to determine.
Test results:
From the above test results, normal egg yolk antibody and immune egg yolk antibody were purified and separated by performing gel filtration column chromatography twice and ion exchange column chromatography once as described above. It was found that the yolk antibody in the yolk and the specific antibody of the yolk antibody reacted with each other but did not react with PBS.
Further, as a result of purification and separation through two gel filtration columns and one ion exchange column, it was confirmed that they were normal yolk antibodies and immune yolk antibodies (see FIG. 6).
[0030]
Example 4
Suppression of autoantibody production in mice with spontaneous autoimmune disease
Use mouse:
Mice with spontaneous immune disease: MRL / lpr (Tomohiro Fukamachi et al .: MRL / lpr mouse spontaneous arthritis; inflammation and immunity,
Vol.2, No. 2, pp. 104-114, 1994)
After arrival at 8 weeks of age, pre-breeding for 1 week.
Breeder name: Made by Nippon SLC
Sex: Male
Administration study:
Week: Administration test started from 9 weeks
N number: 7 per group
Bait: CE-2 (manufactured by Claire Japan: lot No. E2119-k3)
Water supply: sterilized tap water
Illuminance: From 7 am to 7 pm
Dose: Whole egg 35 μl / animal / day.
Immunized egg fraction 70 μl equivalent / animal / day of whole egg.
Administration method: Direct administration using oral sonde
Number of administrations: 3 times / week
Administration period: 8 weeks
Control group (subject group): Sterile water alone was administered.
Evaluation methods:
MRL / lpr mice produced large amounts of IgG-type rheumatoid factor, an autoantibody, in their serum with aging, and at the same time, swelling of the limbs was observed. Therefore, IgG in the antibody-administered group (galactose-added egg yolk antibody was orally administered to MRL / lpr mice) and galactose-added egg yolk antibody non-administered group (control group) (only sterilized water was administered to MRL / lpr mice) The effect can be determined by comparing the concentration of rheumatoid factor.
Measuring method:
Reagent: IgG type mouse rheumatoid factor measurement method (Atsushi Ichikawa: Arthritis (3) MRL / 1 mouse arthritis, inflammation and allergy (I-2), Yodogawa Biopharmaceutical Science Laboratory Vol. 12, Yodogawa Shoten, 1993) .
Operating method: 96-well diluted antigen (protein that reacts with IgG mouse rheumatoid factor) well (serum collected from MRL / lpr mice treated with added yolk antibody such as galactose) well, 100 μl / well The mixture was added and reacted at room temperature for 2 hours. After the reaction, the unreacted portion was washed with a washing solution, POD-labeled mouse IgG antibody was added at a rate of 100 μl / well, and the mixture was further reacted at room temperature for 2 hours. After the reaction, the unreacted part is washed with a washing solution, and a coloring solution (TMB) is added at a rate of 100 μl / well and reacted at room temperature for 20 minutes, and then a reaction stop solution is added at a rate of 100 μl / well. The reaction was stopped. Each well was then measured with an immunoreader (450 nm).
Evaluation results
The MRL / lpr mice in the sterilized water administration group and the immunized egg fraction administration group administered with the immunized egg fraction 3 and the immunized egg fraction 4 respectively increased in the autoantibody concentration with breeding. On the other hand, since the autoantibody concentration of MRL / lpr mice in the immunized egg fraction 1 administration group did not increase, it was proved that it has an action of suppressing autoantibody production in autoimmune diseases. In addition, the autoantibody concentration of MRL / lpr mice in the immunized egg fraction 2 administration group slightly increased and then decreased, and it was proved that there was an action of suppressing autoantibody production of autoimmune disease (FIG. 2). reference). Furthermore, the whole immunized egg also has an action of suppressing autoantibody production of autoimmune diseases because the autoantibody concentration of MRL / lpr mice is lower than that of the subject group.
Therefore, it was proved that the added yolk antibody such as galactose has a therapeutic and preventive effect on rheumatoid arthritis, which is an autoimmune disease.
[0031]
(Example 5)
IgE antibody production inhibitory effect test:
Mouse and specimen used:
By comparing the IgE antibody concentrations of the administration group in which the galactose-added egg yolk antibody of Example 3 was orally administered to MRL / lpr mice and the non-administration group (control group) in which only sterilized water was administered to MRL / lpr mice, the effect was compared. Judged.
Control group: 2 sterilized water (15 weeks old)
MRL / lpr mice administered with immunized egg fraction 1: 2 (15 weeks old)
Evaluation methods
Measurement kit: Morinaga Bioscience Research Institute: Morinaga ELISA mouse
IgE antibody kit
Measurement range: 0.5 ng / ml to 32 ng / ml
Evaluation results
MRL / lpr mouse IgE antibody concentration measurement results (unit: ng / ml)
From the above results, the IgE antibody concentration in the 15-week-old MRL / lpr mouse of the control administration group (sterile water administration group) was 161.1 ng / ml and increased with aging, but the immune egg fraction 1 (galactose etc. The IgE antibody concentration in the 15-week-old MRL / lpr mouse in the supplemented egg yolk antibody administration group was 0.406 ng / ml, which is below the sensitivity.From this result, the immune egg fraction 1 (added egg yolk antibody such as galactose) was MRL / lpr It was confirmed that the production of IgE antibody in mice was suppressed, and it was proved that the galactose-added egg yolk antibody was effective in treating and preventing allergic diseases.
[0032]
(Example 6)
The immunized eggs and normal eggs shown in Example 2 were separated from the yolk and defatted, and then purified by performing gel filtration column chromatography twice and ion-exchange column chromatography once to recover the collected egg yolk antibodies. The binding amount of galactose and N-acetylgalactosamine (hereinafter abbreviated as NAGA) was compared with the binding amount of normal egg-derived egg yolk antibody with galactose and NAGA.
Measuring method:
A solution prepared by dissolving 3 μg / ml of each egg yolk antibody in 0.1 M carbonate buffer and pH 9.5 was added to each well of 96 wells (manufactured by NUNK) at a rate of 100 O / well, and coating was performed at 25 ° C. for 2 hours. After coating, the wells were washed three times with a washing solution (10 mM phosphate buffer, pH 7.2; 150 mM NaCl; 0.05% Tween 20), and then each well was coated with a coating solution (25% Block Ace; 10 mM phosphate buffer, pH 7.2; 150 mM NaCl). 0.05% Tween 20) was added at a rate of 250 μl / well and coated at 25 ° C. for 2 hours. Next, after washing three times with a washing solution (10 mM phosphate buffer, pH 7.2; 150 mM NaCl; 0.05% Tween 20), the reaction solution (Biotin conjugated RCA120 *; * RCA120: galactose and N-acetylgalactosamine residue specific binding) Lectin) was added to each well at a rate of 100 μl / well, and reacted at 25 ° C. for 1 hour. Next, Avidin conjugated HRP was added to each well at a rate of 100 μl / well and reacted at 25 ° C. for 1 hour. After the reaction, each well was washed three times with a washing solution (10 mM phosphate buffer, pH 7.2; 150 mM NaCl; 0.05% Tween 20). After washing, a coloring solution (TMB) was added at a rate of 100 μl / well and allowed to react at room temperature for 10 minutes, and then a reaction stop solution (1M H 2 SO Four ) Was added at a rate of 100 μl / well to stop the reaction. Next, the absorbance (450 nm / 620 nm) of each well was measured with an immunoreader.
Measurement result:
As a result of measuring the amount of egg yolk antibody-bound galactose / NAGA purified from three normal eggs and immunized eggs as described above, the Abs. Value (absorbance) of the amount of egg yolk antibody-bound galactose / NAGA derived from normal egg was 100%. The egg yolk antibody-bound galactose / NAGA content was found to be 154%.
From this measurement result, it can be seen that the amount of galactose and NAGA was 1.5 times higher by Adjuvant inoculation compared to normal eggs (see FIG. 7).
[0033]
The invention's effect
According to the present invention, the sugar-added egg yolk antibody obtained by inoculating Adjuvant suppresses the production of IgE antibodies in rheumatoid arthritis disease autoantibodies (immunoglobulin) and allergic diseases (hay fever, atopic dermatitis, asthma, etc.) It has been found. Therefore, the glycosylated egg yolk antibody according to the present invention is effective for the treatment and / or prevention of autoimmune diseases and / or allergic diseases. Therefore, the sugar-added egg yolk antibody according to the present invention is useful as a material for foods, drinks, pharmaceuticals, cosmetics, feeds, and the like that impart an effect on the treatment or prevention of autoimmune diseases and / or allergic diseases.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a pattern diagram showing fractionation patterns of immune egg fractions 1, 2, 3, and 4 by gel filtration column chromatography (Sephacryl S-300 chromatography).
FIG. 2 is a graph showing MRL / RF-IgG antibody titers in an immunized egg administration experiment (mouse IgG type rheumatoid factor measurement) in which whole immunized eggs were administered to autoimmune disease model mice (MRL / lpr mice).
FIG. 3 is a graph showing MRL / RF-IgG antibody titers in an immune egg fraction administration experiment (mouse IgG type rheumatoid factor measurement) in which immune egg fractions 1 and 2 were administered to an autoimmune disease model mouse.
FIG. 4 is a graph showing MRL / RF-IgG antibody titers in an immune egg fraction administration experiment (mouse IgG type rheumatoid factor measurement) in which immune egg fractions 3 and 4 were administered to autoimmune disease model mice.
FIG. 5 is a pattern diagram showing a pattern obtained by further purifying immune egg fraction 1 by ion exchange column chromatography (Resource S chromatography).
FIG. 6 is a pattern diagram showing a pattern obtained by further purifying normal egg fraction 1 by ion exchange column chromatography (Resource S chromatography).
FIG. 7 is an electrophoretogram showing the results of SDS-PAGE test for normal egg fraction 1 and immune egg fraction 1.
FIG. 8 is a photograph showing immunodot test results.
FIG. 9 is a graph showing a comparison between the equivalent amount of IgY-bound galactose derived from immunized eggs and the amount of IgY-bound galactose derived from normal eggs.
