JP2005287302A - Method for crosslinking polypeptide - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for crosslinking polypeptides. <P>SOLUTION: Polypeptides can be crosslinked by treating polypeptides containing tyrosine surrounded by uncharged amino acids having low-molecular side chains with a phenol oxidase. This crosslinking is catalyzed by phenol oxidases such as tyrosinase and this catalysis is specific for tyrosine surrounded by uncharged amino acids having low-molecular side chains. This process is useful in crosslinking desirable polypeptides. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

【００１７】
本発明の方法により、標的チロシンを含むポリペプチドはフェノール基に架橋される。例えば本発明により、標的チロシンを含むポリペプチドは、該ポリペプチド同士が分子間架橋されホモポリマーとなる。また、標的チロシンを含む複数種のポリペプチドを用いれば、ヘテロポリメリックな分子間架橋が生じる。分子内に標的チロシンを複数含むポリペプチドであれば、それらのチロシンのフェノール基同士が架橋され分子内架橋が生じ得る。また本発明の方法を用いて、標的チロシンを含むポリペプチドを非ペプチド性化合物のフェノール基と架橋させることができる。すなわち本発明は、フェノールオキシダーゼの存在下、（ａ）アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチド、および（ｂ）フェノール基を含む化合物を接触させる工程を含む、該ポリペプチドと該フェノール基を含む化合物を架橋する方法を提供する。該フェノール基を含む化合物としては、（ａ）のポリペプチド自身（分子内架橋のため）、（ａ）のポリペプチドと同一の構造または別の構造を持つ標的チロシン含有ポリペプチド（分子間架橋のため）、およびフェノール基を持つ非ペプチド性化合物（例えばフェノール基を介したポリペプチドの修飾または担体への固定などのため）などが挙げられる。なお、本発明において“ポリペプチド”は、2アミノ酸以上のペプチド重合体を言い、オリゴペプチドと呼ばれるような短い鎖長のポリペプチドから、蛋白質と呼ばれるような鎖長の長いものまでを含む。また本発明においてポリペプチドは、直鎖状、分枝状、または環状であってよい。また、本発明においてポリペプチドには、その塩も含まれる。
【００１８】
チロシンに隣接する非電荷アミノ酸としては、分子量の小さいアミノ酸が好ましく、具体的には分子量132未満（すなわちアミノ酸の側鎖の分子量が58未満）の非荷電アミノ酸が特に好適である。好ましい非荷電アミノ酸としては、具体的にはアラニン（Ala）、バリン（Val）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、プロリン（Pro）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、システイン（Cys）、およびスレオニン（Thr）などが挙げられる。より好ましくは、分子量が120未満の非電荷アミノ酸であり、具体的にはアラニン（Ala）、バリン（Val）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、プロリン（Pro）、およびスレオニン（Thr）が挙げられる。中でも分子量110未満のグリシン、アラニン、およびセリンは特に好ましい。また、極性アミノ酸は水との親和性を高めることから好ましい。最も好ましいアミノ酸は分子量110未満の非電荷・極性アミノ酸であり、具体的にはグリシンおよびセリンが挙げられる。本発明において標的チロシンを含むアミノ酸配列を“GGYモチーフ”と称すが、このモチーフは“GGY”配列自体を持つものに限られず、本発明における標的チロシンを構成するアミノ酸配列のモチーフを総称するものである。
ポリペプチドに含まれるアミノ酸は修飾されていてもよい。修飾は制限されず、例えば糖鎖の付加、メチル化、アセチル化、リン酸化、ヒドロキシル化などが挙げられる。例えば、チロシン残基はドーパ（3,4-dihydroxyphenylalanine）であってもよい。またドーパキノンであってもよい。これらの修飾されたチロシンも本発明においてチロシンと総称する。
【００１９】
より好ましくは、標的チロシンを含むポリペプチドは、[G/S]_1-2GY[G/S]_1-2Gのアミノ酸配列をとるチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドである。ここで[G/S]はそれぞれ独立にグリシンまたはセリンのどちらかであることを意味する。[G/S]_1-2は、それぞれ独立にグリシンまたはセリンのどちらかの残基が1または2残基あることを意味し、具体的には G、S、GG、GS、SG、または SSのいずれかであることを意味する。上記と同様に、ポリペプチド中のアミノ酸残基は修飾されていてもよい。さらに好ましくは、上記ポリペプチドは、GGYGG（配列番号：５１）または GGYSG（配列番号：５２）のアミノ酸配列をとるチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドである。最も好ましくは、上記ポリペプチドは GGYGG のアミノ酸配列をとるチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドである。
【００２０】
また本発明の標的チロシンを含むポリペプチドは、一分子の中に好ましくは標的チロシンを2つ以上、より好ましくは3つ以上、より好ましくは4つ以上、より好ましくは5つ以上含んでいる。ポリペプチドに含まれる複数のチロシンが架橋の標的となることにより、より確実にあるいは多重的にポリペプチドを架橋させることが可能となる。特に多分子間で架橋が生ずることによるマルチメリックな蛋白質複合体の形成を期待する場合には、ポリペプチド中に標的チロシンを3つ以上、より好ましくは4つ以上、さらに好ましくは5つ以上、さらに好ましくは6つ以上含むことが好ましい。標的チロシンを含む2つ以上のポリペプチドを架橋させる場合は、これらのポリペプチドの少なくとも1つに3つ以上の標的チロシンが含まれていることが好ましく、架橋させたい全てのポリペプチドに3つ以上の標的チロシンが含まれていることがより好ましい。
【００２１】
標的チロシンを複数含む場合は、それらのチロシンは隣接してクラスターを形成していることが好ましい。例えば、2、3、4、または5アミノ酸を介して、標的チロシンを2、3、4、または5残基以上含むポリペプチドは、本発明の架橋に好適に用いられる。標的チロシン間のアミノ酸としては、好ましくは非電荷アミノ酸、より好ましくは分子量の小さい非電荷アミノ酸であり、上記と同様に、例えばアラニン（Ala）、バリン（Val）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、プロリン（Pro）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、システイン（Cys）、およびスレオニン（Thr）などが挙げられ、中でも分子量の小さいグリシン、アラニン、およびセリンは好ましい。例えば好ましいポリペプチドとして、[G/S]_1-2GY[G/S]_1-2GY[G/S]_1-2GY[G/S]_1-2G を含むポリペプチドが挙げられる。より好ましくは GGY[G/S][G]_1-2Y[G/S][G]_1-2Y[G/S][G]_1-2を含むポリペプチドが挙げられる。ここで[G]_1-2はグリシンが1または2残基であることを示す。特に好ましいポリペプチドとしては、GGYGGYGGGYGG、GGYGGYSGGYGG、GGYSGGYGGYGG、GGYGGGYGGYGG、GGYGGYGGYSG、GGYGGYSGGYSG、GGYSGGYSGGYSG、または GGYSGGYSGGYGG（順に配列番号：５３〜６０）などを含むポリペプチドが挙げられる。より好ましくは、GGYGGYSGGYGGYGG、GGYSGGYGGYGGGYGG、GGYGGYGGGYGGYGG、GGYGGYGGYSGGYSG、GGYGGYSGGYSGGYSG、または GGYSGGYSGGYSGGYGG（順に配列番号：６１〜６６）を含むポリペプチドであり、例えば GGYGGYSGGYGGYGGGYGG、GGYSGGYGGYGGGYGGYGG、GGYGGYSGGYGGYGGGYGGYGG、GGYGGYGGYSGGYSGGYGG、GGYGGYSGGYSGGYSGGYGG、または GGYGGYGGYSGGYSGGYSGGYGG（順に配列番号：６７〜７２）を含むポリペプチドである。このような標的チロシンのクラスターは、１つのポリペプチド内に複数箇所含まれていてよい。例えばN末端およびC末端にこのような標的チロシンのクラスターを持つポリペプチドは、本発明において好適に用いられる。
【００２２】
フェノールオキシダーゼとしては、ポリペプチド中の標的チロシンを基質として該ポリペプチドを架橋する活性を有する限り所望の酵素を用いることができる。また、本発明においてフェノールオキシダーゼはさらに他の活性を有していてもよい。本発明に用いることができる酵素としては、具体的にはカテコール・オキシダーゼ（EC 1.10.3.1）およびモノフェノール・モノオキシゲナーゼ（EC 1.14.18.1）などが含まれる。具体的には、チロシナーゼ、フェノラーゼ、モノフェノール・オキシダーゼ、クレソラーゼ、カテコール・オキシダーゼ、ポリフェノラーゼ、DOPAオキシダーゼ、ポリフェノール・オキシダーゼ、チロシン−DOPAオキシダーゼ、ラッカーゼ（laccase）などが挙げられる（Dawson, C.R. and Tarpley, W.B. The copper oxidases. In: Sumner, J.B. and Myrback, K. (Eds.), The Enzymes, 1st ed., vol. 2, Academic Press, New York, 1951, p. 454-598; Lerch, K., Proc. Natl Acad. Sci. USA 75 (1978) 3605-3609; Malmstrom, B.G. et al., Copper-containing oxidases and superoxide dismutase. In: Boyer, P.D. (Ed.), The Enzymes, 3rd ed., vol. 12, Academic Press, New York, 1975, p. 507-579; McIntyre, R.J. and Vaughan, P.F.T., Biochem. J. 149 (1975) 447-461; Patil, S.S. and Zucker, M., J. Biol. Chem. 240 (1965) 3938-3943; Pomerantz, S.H., J. Biol. Chem. 238 (1963) 2351-2357; Robb, D.A. Tyrosinase. In: Lontie, R. (Ed.), Copper Proteins and Copper Enzymes, vol. 2, C.R.C. Press, Boca Raton, FL, 1984, 207-240; Brown, F.C. and Ward, D.N., J. Am. Chem. Soc. 79 (1957) 2647-2648; Dawson, C.R. and Tarpley, W.B. The copper oxidases. In: Sumner, J.B. and Myrback, K. (Eds.), The Enzymes, 1st ed., vol. 2, Academic Press, New York, 1951, p. 454-498; Gregory, R.P.F. and Bendall, D.S., Biochem. J. 101 (1966) 569-581; Mason, H.S., Nature (Lond.) 177 (1956) 79-81; Mayer, A.M. and Harel, E., Phytochemistry 18 (1979) 193-215; Patil, S.S. and Zucker, M., J. Biol. Chem. 240 (1965) 3938-3943; Pomerantz, S.H., J. Biol. Chem. 242 (1967) 5308-5314; Robb, D.A. "Tyrosinase". In: Lontie, R. (Ed.), Copper Proteins and Copper Enzymes, vol. 2, CRC Press, Boca Raton, FL, 1984, p. 207-240）。また、ペルオキシダーゼ（E.C. 1.11.1.7）も好適に利用することができる（Lee, B.P. et al., Polymer Preprints, 2001, 42, 151-152）。ポリペプチド中の標的チロシンを基質として該ポリペプチドを架橋させる活性は、例えば実施例に記載したように、本発明の標的チロシンを有するポリペプチドを基質として反応させ、反応産物の吸光度測定または電気泳動などにより検出することができる。
【００２３】
本発明においては、特にチロシナーゼを好適に用いることができる。例えば、原核生物、真菌類、または高等真核生物由来のチロシナーゼを好適に用いることができる。キノコチロシナーゼは商業的に入手可能である（例えばSigma社）。また、哺乳動物由来のチロシナーゼも好適である。チロシナーゼは組み換え体であってもよい。チロシナーゼ遺伝子は、様々な生物において既にクローニングされている（J. Gen. Microbiol. 129, 2703-2714 (1983); Gene 37, 101-110 (1985); 米国特許第 4,898,814号）。また、昆虫等が持つ種々のフェノールオキシダーゼを好適に用いることができる。特に本発明においては昆虫のヘモリンフ（体液）中に存在するフェノールオキシダーゼを好適に用いることができる。昆虫の体液に含まれるプロ-フェノールオキシダーゼは、生体内では微生物感染または創傷により活性化されると考えられている（Asano, T. & Ashida, M., J. Biol. Chem. 276, 11100-11112 (2001)）が、採取した体液を放置したり、あるいは有機溶媒で処理することによって活性化することができる（大西英爾他編, 昆虫の生化学・分子生物学, 名古屋大学出版, 1995, pp. 447-468）。また、ラッカーゼ（laccase）タイプのフェノールオキシダーゼ（Sugumaran M. et al., Arch. Insect Biochem. Physiol. 19, 271-281 (1992)）も本発明において使用することができる。本発明に用いるフェノールオキシダーゼは精製されていてもされていなくてもよい。例えば生物の体液、体腔液、血液、リンパ液、分泌液、あるいは生物試料の溶解液または抽出物でフェノールオキシダーゼが含まれている所望の試料を用いることができる。
【００２４】
標的チロシンを含むポリペプチドにフェノールオキシダーゼを接触させる工程により、このポリペプチドの架橋が生ずる。架橋は分子間、または一分子内に複数のチロシン残基を有するポリペプチドは分子内で生じ得る。該ポリペプチドとフェノールオキシダーゼとの接触は、フェノールオキシダーゼによる反応が阻害されない条件下、通常は適当な水溶液中で行う。pHは通常5〜10、好ましくは pH6〜9で行う。水溶液は、所望のpH緩衝剤を含んでいてよい。この場合、例えばリン酸バッファーまたはTrisバッファー等を用いることができる。フェノールオキシダーゼは反応溶液中に溶解してもよく、あるいは支持体に固定化されていてもよい。反応温度は特に制限されず、用いるフェノールオキシダーゼの温度特性に従って適宜調整することができる。反応は、例えば2℃〜70℃の間、好ましくは12℃〜60℃の間、より好ましくは15℃〜40℃、例えば室温で行われる。反応時間は通常5分〜50時間である。反応を停止させるには、例えば酵素とポリペプチドを分離したり、あるいはSDSの添加または反応系を過熱するなどして酵素を失活させればよい。本発明の方法により、架橋されたポリペプチドが産生される。本発明の架橋方法は、架橋されたポリペプチドの製造方法でもある。
【００２５】
また本発明は、本発明の標的チロシンを有するポリペプチドを含むクロスリンカー試薬を提供する。すなわち本発明の標的チロシンを有するポリペプチドは、フェノールオキシダーゼによる架橋用基質となる。本発明のクロスリンカー試薬は、該ポリペプチドを様々なポリペプチドに対して架橋させるために、あるいはクロスリンカー試薬に含まれるポリペプチド自身を重合させるために、あるいは該クロスリンカー試薬に含まれるポリペプチドを媒介物として用いて、標的チロシンを含む2つ以上のポリペプチドを間接的に架橋させるために有用である。このようなリンカーポリペプチドとしては、例えば“N末端-Y-[X]_n-Y-C末端”の構造を持つポリペプチドが含まれる。ここでXは分子量132未満の非荷電アミノ酸であり、nは2以上である。Xのアミノ酸としては、1つ1つ独立に例えばグリシンまたはセリンが好ましく、例えば全てのXがグリシンであるポリペプチド（ホモグリシンの両端にチロシンを有するポリペプチド）などが好適である。あるいは本明細書に記載した標的チロシンを含む任意のポリペプチドなどが挙げられる。クロスリンカー試薬は、上記ポリペプチド以外に所望の溶媒および/または溶質を含む組成物とすることができる。例えば水、アルコール等の有機溶媒、塩化ナトリウム等の塩、所望の保存剤、懸濁剤、または安定剤などを含むことができる。あるいはクロスリンカー試薬は乾燥した状態であってもよい。クロスリンカー試薬中のポリペプチドは自由な（遊離した）状態であっても、支持体または担体に固定化されていてもよい。本発明のクロスリンカー試薬は、例えば新たなペプチド性重合体の製造のための原料として有用である。重合反応は酵素的に行われるため、毒性のある添加剤や架橋剤を用いる必要がない。またこのような重合体はペプチド性であるため微生物により分解される新たな生分解性プラスチックとしても期待できる。本発明は新たなバイオマテリアルの製造に有用である。
【００２６】
また本発明は、本発明の標的チロシンを有するポリペプチドが固定化された支持体を提供する。固定化されたとは、共有結合または非共有結合により、該ポリペプチドが支持体に結合していることを言う。非共有結合としては、例えば水素結合、配位結合、イオン結合、疎水相互作用（疎水結合）、および分子間力（ファンデルワールス力）などが挙げられる。上記ポリペプチドと支持体は、好ましくは共有結合で結合している。該ポリペプチドは、所望の固定化方法により支持体に固定化することができる。ポリペプチドは、例えば支持体に存在する官能基を用いて共有結合させることができる。官能基としては、例えば、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、サクシニルイミド基、フェノール基等が挙げられるが、これらに制限されない。共有結合の例としてエステル結合、エーテル結合、アミノ結合、アミド結合、スルフィド結合、イミノ結合、ジスルフィド結合等が挙げられる。共有結合法としては、臭化シアン活性化法、酸アジド誘導体法、縮合試薬法、ジアゾ法、およびアルキル化法などが挙げられる。例えば支持体表面はアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有する各種シランカップリング剤で処理することができる。エポキシはアミン及びチオール基と共有結合を形成する。またカルボニルジイミダゾールはアミンと共有結合する。また、例えばポリペプチドのN末端もしくはC末端にシステインを含むようにしておき、その部位とマレイミド基を介して支持体に共有結合させる方法が知られている。また、p-フェニレンジイソチオシアネート（DITC）を含む支持体を用いれば、ポリペプチドのN末端部位のαアミノ基またはリジン残基のεアミノ基がDITCに共有結合で固定化される。N-ヒドロキシルスクシンイニドエステル（N-hydroxyl succinimide ester）により修飾された架橋アガロースなどの担体、およびエポキシコートされた担体などは公知である。また、担体表面のフェノール基を利用してフェノールオキシダーゼにより上記ポリペプチドを固定化させることもできる。このような担体には、フェノール基を導入したアガロースまたはアガロース誘導体、およびチロシンまたはDOPAなどにより修飾したポリエチレングリコールヒドロゲルなどが挙げられる（Lee, B.P. et al., "Enzymatic and non-enztmatic pathways to formation od DOPA-modified PEG hydrogels" Trans. Soc. Biomat., 24, 2001; Lee, B.P. et al., Polymer Preprints, 2001, 42, 151-152; Deming, T. J. Curr. Op. Chem. Biol. 1999, 3, 100）。
【００２７】
また、比較的短いポリペプチドの固定化を目的とする場合は、支持体に結合したアミノ基等から、化学合成により本発明の標的チロシンを含むポリペプチドを合成することもできる。ポリペプチドの合成法は様々な方法が知られている。例えば、α-アミノ基および側鎖の官能基の保護として、α-アミノ基をt-ブトキシカルボニルで、側鎖の官能基をベンジルアルコール系保護基で保護するBoc法、およびα-アミノ基を9-フルオレニルメトキシカルボニルで、側鎖官能基をt-ブチルアルコール系保護基で保護するFmoc法などが挙げられる。酸アミド結合の形成反応は、脱水剤により保護アミノ酸無水物を作り、これを縮合反応に利用する対称型無水物法、保護アミノ基にアルキルクロロホルメートを作用させ、混合酸無水物を作り縮合反応に用いる混合酸無水物法、p-ニトロフェノール（HONp）、ペンタフルオロフェノール（HOPfp）、N-ヒドロキシスクシンイミド（HOSu）、またはN-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）などの活性エステルを用いて縮合させる活性エステル法などの他、アジド法、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）にHOBtのような添加剤を組み合わせるDCC-添加剤法、酸ハロゲン化物法、その他が知られている（E. Gross, J. Meienhofer ed., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Academic Press, New York, 1979; 新生化学実験講座１, 日本生化学会編, 東京化学同人, 東京, 1992, pp.3-44）。ポリペプチドの合成は液相および固相で可能であるが、固相法を用いて支持体上に直接ポリペプチドを合成することができる（S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem., 57, 957, 1988; E. Atherton, R.C. Sheppard, "Solid Phase Peptide Synthesis, a Practical Approach", IRL Press, Oxford, 1989）。マイクロタイタープレート、小型のポリエチレンのピン、またはガラス上でポリペプチドを合成する技術が既に開発されている（A.M. Bray et al., Tetrahedon Lett., 31, 5811, 1990; G. Schnorrenberg, H. Gerhard, Tetrahedon, 45, 7759, 1989; S.P.A. Fodor et al., Science, 251, 767, 1991）。例えば光感受性保護基と光リソグラフィーを利用してガラスまたはシリコンなどの基板上に所望のポリペプチドを合成することができる。
【００２８】
支持体に固定化されるポリペプチドとしては、本発明の標的チロシンを含む限り制限されず、生理活性を持つポリペプチド、例えば酵素または受容体などであってよく、あるいはスペーサーまたはタグなどの特別な活性を持たないポリペプチドであってもよい。支持体に固定化されたスペーサーポリペプチドは、標的チロシンを含有する他の所望のポリペプチドと架橋することを通して、該所望のポリペプチドを支持体に固定化するための媒介物として有用である。例えば、後述する標的チロシン含有ポリペプチドと他のポリペプチドとの融合蛋白質を、このチロシンを介して支持体に固定化することにより、所望の蛋白質を支持体に固定化することが可能である。例えば酵素を支持体に固定化することは生物工学的に重要な意味を持っており、工業、研究、および臨床場面において、支持体に固定化された様々な酵素が用いられている。本発明の方法によれば、フェノールオキシダーゼにより所望の酵素または補酵素を支持体に固定化することが可能である。あるいは、抗菌または抗カビ活性を有する蛋白質を固定化することにより、所望の素材に抗菌・抗カビ機能を付加することができる。またセンサーとして機能する蛋白質を固定化したバイオセンサーを製造することも考えられる。架橋反応は本発明の標的チロシンに特異性を持つことから、固定化したいポリペプチドを含む試料中に他のポリペプチドが混合していても、架橋により標的チロシンを有するポリペプチドが優先的に固定化される。従って、目的のポリペプチドを高度に精製することなく固定化の工程を行うことができる点でも優れている。また後述する標的チロシンを含むポリペプチドを細胞表面に発現する細胞を用いれば、支持体に該細胞を固定化することも可能である。細胞としては制限されず、原核細胞および真核細胞が用いられ得る。またオルガネラなども本方法を用いて固定化することができる。例えば固定化微生物を用いて、種々の生体物質を合成させることができる。
【００２９】
本発明において支持体は、水溶液に不溶性の固体または半固体であれば制限はない。支持体は、化学的に安定であり有意な生物毒性を示さないものが好ましい。例えば、合成または天然の有機高分子化合物、ガラス、シリカゲル、アルミナ、および活性炭などの無機材料、ならびにセルロースおよびキチン等の多糖類を含む所望の素材を支持体として用いることができる。支持体は所望の形態であってよく、例えば膜状、繊維状、粉末状、ビーズ状、中空糸状、または多孔形状などであってよい。
【００３０】
高分子化合物からなる支持体としては、例えば、ポリメチルメタクリレート系重合体、ポリアクリロニトリル系重合体、ポリスルフォン系重合体、ビニル系重合体、ポリオレフィン系重合体、フッ素系重合体、ポリエステル系重合体、ポリアミド系重合体、ポリイミド系重合体、ポリウレタン系重合体、ポリアクリル系重合体、ポリスチレン系重合体、ポリケトン系重合体、ポリフェノール系重合体、シリコン系重合体、セルロース系重合体、キトサン系重合体などが挙げられる。具体的には、アガロース、セルロース、キチン、キトサン、セファロース、デキストラン等の多糖類およびそれらの誘導体、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリアリルエーテルスルフォン、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリカーボネート、アセチル化セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド、シリコン樹脂、フッ素樹脂、フェノール樹脂、ポリウレタン、ポリエーテルウレタン、ポリアクリルアミド、それらの誘導体などが挙げられる。これらの高分子材料は単独、あるいは２種以上を組み合わせて使用され得る。
【００３１】
本発明の標的チロシンを含むポリペプチドが結合した支持体としては、該ポリペプチドが固定化されたカラム担体が挙げられる。例えば、セファロースビーズに該ポリペプチドを固定化し、各種クロマトグラフィーに用いることができる。このようなカラム担体に抗体、受容体蛋白質、またはリガンドなどを本発明の標的チロシンを介して固定化し、アフィニティークロマトグラフィーを実施することにより、これらの蛋白質に結合する因子をスクリーニングすることが可能である。
【００３２】
また、本発明の標的チロシンを含むポリペプチドが結合した支持体としては、基板状の支持体の上に該ポリペプチドが高密度で多数結合したポリペプチドアレイ（プロテインチップとも言う）を特に挙げることができる。近年、ゲノムサイエンスの進展により膨大な種類の遺伝子およびそれらがコードする蛋白質が同定され、それらの蛋白質の発現や機能を解析するためにプロテインチップの開発が進められている。高密度ポリペプチドアレイ（プロテインチップ）とは、小面積に多数のポリペプチドが固定化された基板を言う。基板上に固定化したいポリペプチドに標的チロシンを含むタグを付加しておき、これを本発明の方法に従って基板上のフェノール基に固定化することができる。基板は、予め標的チロシンを含むオリゴペプチドでコーティングしてアンカーとして用いることもできる。コーティングに用いるポリペプチドの親水性を高くすることにより、基板を水和性に保ち、後で固定化する蛋白質が変性するのを防止することができる（MacBeath, G. & Schreiber, S.L., Science, 289, 1760-1763, 2000）。プロテインチップを製造するには、例えば上記のようなアンカーペプチドでコーティングしたスライドガラスやシリコンなどの基板上に、標的チロシンを含むポリペプチドをスポット法により固定することができる。この場合、ポリペプチドを含む溶液をスポッターまたはアレイヤーという装置で数nlから数plの微小体積で基板上に並べ、基板上の特定領域に固定する。スポット法としては、例えばピン先端の固相への機械的な接触によるピン（あるいはペン）方式、インクジェットプリンターの原理を利用したインクジェット方式、スポッター内に加熱によって泡（バブル）を生じさせてその圧を利用してサンプルを噴出させるバブル噴出方式、および毛細管によるキャピラリー方式などが知られている。スポット処理した後は、フェノールオキシダーゼによる架橋形成、基板表面のブロッキング、および洗浄等の後処理を行う。
【００３３】
高密度ポリペプチドアレイの基質は通常ガラスが用いられるが、ポリスチレン、シリコン、ナイロン、ニトロセルロース、またはその他の重合体などであってもよい。高密度ポリペプチドアレイは、その密度は1 cm² 当り一般に約60より多い、より好ましくは約100より多い、さらに好ましくは約600より多い、さらに好ましくは約1,000、約5,000、約10,000、または約40,000より多い、最も好ましくは約100,000より多い密度でポリペプチド分子が結合されたアレイを言う（ペプチドが固定されている総面積は1 cm² より小さくてもよい）。ポリペプチド分子の鎖長は特に限定されず、天然に存在する蛋白質またはその断片などの比較的長いポリペプチドであってもよく、あるいは数アミノ酸から数十アミノ酸の長さのオリゴペプチドなどであってもよい。アレイの表面積は小さいため、各プローブ（アレイ上のポリペプチド）間の環境は極めて均一になり、しかも非常に大量のプローブの反応を同時に行うことができる。このポリペプチドアレイを用いることにより、例えば種々の蛋白質リン酸化アッセイや、蛋白質が標的とする低分子化合物の解析等を行うことができる。本発明の高密度ポリペプチドアレイは、プロテーム解析において好適に用いられる。
【００３４】
また本発明は、上記標的チロシンを含むポリペプチドと他のポリペプチドとの融合蛋白質に関する。このような融合蛋白質は、ペプチド合成または組み換えDNAの発現等により製造することができる。このような融合蛋白質において、上記標的チロシンを含むポリペプチド部分は架橋のためのペプチドタグとして機能する。融合蛋白質は、2つまたは3つ以上のポリペプチドが融合したものであってよい。融合する他のポリペプチドとしては特に制限はない。架橋させたい所望のポリペプチドを用いることができる。具体的には、例えば、所望の酵素、細胞膜蛋白質、抗体またはその断片、受容体、受容体のリガンド結合部位を含む断片、リガンド、ホルモン、その他の生理活性ペプチドなどが挙げられる。例えば抗体断片の定常領域側末端に標的チロシンを含むポリペプチドを融合させ、これを介して抗体同士を架橋させることにより、機能を増強させた抗体分子を構築することができる。また、異なる機能的蛋白質にそれぞれ標的チロシンを導入し、これらを相互に架橋することにより、多機能の蛋白質複合体をデザインすることができる。このような蛋白質複合体はナノマシーンの創成に応用可能である。融合蛋白質中の標的チロシンを含むポリペプチドの位置は、融合ポリペプチドのN末端、C末端、および/または内部であってよいが、好適にはN末端またはC末端に位置する。例えば、細胞表面に発現する蛋白質の細胞外ドメインに標的チロシンを含むポリペプチドを融合させることにより、標的チロシンを細胞表面に発現する細胞を得ることができる（後述）。このような細胞は、本発明の方法を利用して、標的チロシンを含む所望のポリペプチドを細胞表面に付加することが可能であり、これを通して細胞に新規な機能を与えることが可能となる。また、機能蛋白質を支持体等に固定化する場合には、標的チロシンを適当な長さのスペーサーペプチドを介してその蛋白質に融合させることにより、元々の蛋白質の活性に有意な影響を与えずに支持体等に固定化することができる。
【００３５】
例えば本発明の融合蛋白質には、所望の蛋白質のN末端、C末端、または蛋白質の鎖中に GGYGG（配列番号：５１）またはGGYSG（配列番号：５２）、あるいはそれらの繰り返し配列が付加された蛋白質が含まれる。また本発明の融合蛋白質には、例えば所望の蛋白質の任意の位置に [G/S]_1-2GY[G/S]_1-2GY[G/S]_1-2GY[G/S]_1-2G を含むポリペプチドを付加した蛋白質が挙げられる。より具体的には、該付加させるポリペプチドとしては、GGY[G/S][G]_1-2Y[G/S][G]_1-2Y[G/S][G]_1-2を含むポリペプチドが挙げられ、例えば GGYGGYGGGYGG、GGYGGYSGGYGG、GGYSGGYGGYGG、GGYGGGYGGYGG、GGYGGYGGYSG、GGYGGYSGGYSG、GGYSGGYSGGYSG、または GGYSGGYSGGYGG（順に配列番号：５３〜６０）などを含むポリペプチドが例示できる。融合蛋白質中の標的チロシンを介して、表面にフェノール基を持つ所望の支持体にこの融合蛋白質を酵素的に固定化することが可能である。
【００３６】
また本発明は、上記融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドはDNAであってもRNAであってもよい。このポリヌクレオチドは、適当な発現ベクターに組み込んで融合蛋白質を発現させるために有用である。発現ベクターとしては、プラスミドベクター、PCR増幅断片、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等が挙げられるがこれらに制限されない。非ウイルス性のベクターは、naked DNAとしてそのまま細胞または組織等に投与することができるし、あるいはLipofectAMINE（Gibco/Life Technologies）またはFugene、DOTAP、もしくはDOSPER（Roche）等のトランスフェクション試薬と混合して投与してもよい。本発明は、上記ポリヌクレオチドを細胞に導入して発現させる工程、および該細胞またはその培養上清から発現した融合蛋白質を回収する工程を含む、本発明の融合蛋白質の製造方法を提供する。
【００３７】
また、上記融合蛋白質を発現させることができるように、標的チロシンを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを構築することができる。このベクターは、標的チロシンを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、該ポリペプチドと他のポリペプチドとの融合ポリペプチドを発現できるように、該他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入することができるクローニング部位を備えたベクターである。このようなベクターは、標的チロシンを含むポリペプチドのコード領域の5'隣接および/または3'隣接に、外来遺伝子を挿入するためのクローニング部位を備えている。ここに所望の蛋白質をコードする外来遺伝子をインフレームで挿入することにより、外来遺伝子がコードする蛋白質と標的チロシンを含むポリペプチドとの融合蛋白質を発現させることができる。クローニング部位は、例えば制限酵素認識配列を含む。複数の制限酵素認識配列を含むいわゆるマルチクローニング部位としてもよい。発現ベクターはプラスミド、ファージ、ウイルスベクターなどいずれの発現ベクターでもよい。本発明の発現ベクターは、具体的にはプロモーター−転写開始点−標的チロシンを含むポリペプチドのコード配列−外来遺伝子クローニング部位−転写終結配列を含むベクターであってよい。あるいは、プロモーター−転写開始点−外来遺伝子クローニング部位−標的チロシンを含むポリペプチドのコード配列−ストップコドン−転写終結配列を含むベクターであってよい。蛋白質コード配列の先頭に翻訳開始コドンがない場合には、適宜翻訳開始コドンを挿入する。翻訳開始コドン周辺の塩基配列は、翻訳開始に適した配列にすることができる（Kozak, M. Cell, 1986, 44:283-92）。プロモーターとしては、宿主細胞で機能する所望のものを用いることができる。例えばバクテリアであれば、lacプロモーター、trpプロモーター、またはtrp-lacハイブリッド（tac）プロモーターなどが例示できる。またT7 RNAポリメラーゼまたはT4 RNAポリメラーゼなどの認識配列をプロモーター配列として用いて、宿主細胞内で各RNAポリメラーゼを誘導的に発現させることにより強力な転写を誘導することができる。高等真核生物を宿主細胞にする場合は、例えばactinプロモーターなどの内在遺伝子由来のプロモーター、または宿主で機能するウイルス由来プロモーター等を用いることができる。哺乳動物細胞には、例えばSV40プロモーター、CMVプロモーター、MLV-LTRプロモーター、EF1（Elongation Factor-1）プロモーター、β-actinプロモーターなどが挙げられる。発現ベクターには、ベクターが導入された細胞を選択するためのマーカー遺伝子などの他の遺伝子を含んでいてもよい。
【００３８】
また本発明は、標的チロシンを含むポリペプチドと他のポリペプチドとの融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを発現するベクターが導入された細胞に関する。このような形質転換細胞は、本発明の融合蛋白質を製造するために有用である。あるいは、該融合蛋白質を発現する細胞そのものを新たな機能が付加された細胞として用いることもできる。本発明の形質転換細胞は、原核細胞および真核細胞が含まれる。具体的には、大腸菌、枯草菌、放線菌、コリネ菌、シアノバクテリア、ラクトバチルス、ラクトコッカス、リステリア、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、ビブリオ、アグロバクテリウム、および酵母などの微生物、シロイヌナズナ、タバコ、イネ、トマト、ジャガイモ、コムギ、スギ、およびヒノキ等由来の植物細胞、ショウジョウバエ、カイコ、マウス、ラット、サル、およびヒト等由来の動物細胞が含まれる。発現ベクターは、対象とする宿主細胞に合わせて適宜選択することができる。
【００３９】
本発明の形質転換細胞としては、例えば該融合蛋白質を分泌する細胞が挙げられる。本発明は、分泌シグナルの下流に本発明の標的チロシンを含むポリペプチドを結合させた融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを発現するベクターを細胞に導入し発現させる工程、および発現した融合蛋白質をこの細胞の培養上清から回収する工程、を含む、該融合蛋白質の製造方法を提供する。得られた融合蛋白質は、本発明の架橋方法の基質として用いられる。例えば上記融合蛋白質は、本発明のクロスリンカー試薬として有用である。
【００４０】
また本発明の形質転換細胞としては、特に該融合蛋白質を細胞表面に発現する細胞が挙げられる。このような細胞は、例えば標的チロシンを含むポリペプチドを膜貫通蛋白質との融合蛋白質として発現するベクターを細胞に導入することにより製造することができる。例えば、膜に移行した成熟蛋白質のN末端が細胞外に位置する膜貫通蛋白質の場合は、シグナルペプチドと該成熟蛋白質との間に本発明の標的チロシンを含むポリペプチドが挿入された融合蛋白質を細胞で発現させることにより、標的チロシンが細胞外に提示された細胞を作り出すことができる。この細胞に、標的チロシンを含む別のポリペプチドを外から添加し、フェノールオキシダーゼで処理することにより、このポリペプチドをこの細胞の表面に固定化することができる。例えば腫瘍マーカーに対する抗体またはその抗原結合断片に本発明の標的チロシンを付加した融合ポリペプチドを作製し、これを細胞表面に架橋することにより、該腫瘍を特異的に認識する細胞を作り出すことができる。例えば、この細胞に細胞毒性効果を与える別の遺伝子を発現させておくことにより、腫瘍細胞を特異的に攻撃することが可能である。また、標的チロシンを含むポリペプチドを細胞表面に発現する細胞は、このチロシンを介して支持体などに固定化することができる。固定化細胞は、生化学物質の工業的生産、あるいは疾患治療または再生医学等における臨床に応用することができる。また標的チロシンを含むポリペプチドを細胞表面に発現する細胞は、これらのポリペプチドを介して細胞同士を接着させることが可能である。
【００４１】
また本発明は、フェノールオキシダーゼの量または活性を上昇または低下させる工程を含む、本発明の標的チロシンを含むポリペプチドの架橋を促進または抑制する方法に関する。この方法により、上記ポリペプチドを含む架橋した複合体の硬度を上昇または低下させることができる。複合体の硬度とは、該複合体に加わる力に対する該複合体の変形または破壊のしにくさを意味し、複合遺体に押し、引っぱり、またはせん断等の力を加えた時の変形の度合い、または一定の変形または破壊に至るまでの力を測定することにより決定することができる。また本発明は、フェノールオキシダーゼの量または活性を上昇または低下させる化合物を有効成分として含む、本発明における標的チロシンを含むポリペプチドの架橋を促進または抑制する組成物に関する。フェノールオキシダーゼの量または活性を上昇させるには、フェノールオキシダーゼを添加したり、フェノールオキシダーゼをコードする遺伝子を発現させることにより実施することができる。また、フェノールオキシダーゼを活性化するトランスアクチベーターを添加することによりフェノールオキシダーゼを活性化することもできる（Lee, et al., Gene 65, 71 (1988); Bernan, et al., Gene 37, 101 (1985); Chen, et al., J. Biol. Chem. 268, 18710 (1993); WO95/13386）。また、ミノキシジル（minoxidil）などのピリミジン-3-オキシド誘導体が、チロシナーゼ活性を促進することが知られている（Rushton, D. H. et al., Clin. Exp. Dermatol., 14, 40-46 (1989); 日本国特許第2999163号）。また、イカ墨汁中の複合糖質ペプチドグリカンに、チロシナーゼ活性を増強する作用が報告されている（Naraoka T. et al., Food Sci. Technol. Res., 6, 171-175 (2000); 内沢ら, 生化学, 67, 734 (1995)）。これらの活性化剤の存在下、本発明に従ってポリペプチドを架橋させることにより、該ポリペプチドを強固に固定または重合させることができる。
【００４２】
フェノールオキシダーゼの量または活性を低下させるには、フェノールオキシダーゼを反応系から取り除いたり、フェノールオキシダーゼの発現を抑制したり、あるいはフェノールオキシダーゼの阻害剤を添加することにより実施することができる。フェノールオキシダーゼの発現の抑制は、例えばフェノールオキシダーゼ遺伝子のアンチセンス核酸の導入、またはフェノールオキシダーゼ遺伝子のジーンターゲッティング等により実施することができる。フェノールオキシダーゼの阻害剤としては、例えばビタミンＣ、プロアントシアニジン、またはそれらの誘導体などの酸化防止剤を用いることができる。また、フェノールオキシダーゼはCOまたはフェニルチオウレア等により阻害される。また、ペルオキシダーゼなどは、パラアミノ安息香酸（p-aminobenzoic acid）、アジド（azide）、シアン化合物（cyanide）、cyclopropanone、L-システイン、ニクロム酸（dichromate）、エチレンチオ尿素（ethylenethiourea）、ヒドロキシルアミン（hydroxylamine）、硫化物（sulfide）、バナジン酸（vanadate）、およびCd, Co, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb等の2価金属イオンにより阻害される（Handbook of Enzyme Inhibitors, Part A, 2nd Ed, Helmward Zollner, Ed, VCH, Weinheim, Germany (1993)）。また、チロシナーゼ阻害剤としては、種々の化合物および組成物が報告されている。代表的なチロシナーゼ阻害剤としては、コケモモ、梨、および高山植物の葉などに含まれるアルブチン（arbutin）、コウジ菌からつくられるコウジ酸（Kojic acid）の他、エラグ酸（ellagic acid）、およびレゾルシン（resorcin）誘導体（例えば 4-n-ブチルレゾルシノール (4-n-butylresorcinol)）等が挙げられる。また、銅メタロチオネイン（Copper metallothionein）等の銅と複合体を形成する化合物（銅キレート剤等）、安息香酸 (benzoic acid)、およびシアン化合物（cyanide）によっても阻害される（Duckworth, H.W. and Colman, J.E., J. Biol. Chem., 245, 1613-1625 (1970)）。また桂皮酸（cinnamic acid）または微生物のエステラーゼ抽出物にフェノールオキシダーゼの阻害効果が報告されている（Kermasha, S. et al., J. Agric. Food Chem. 41, 526-531, 1993; Walker, J.R.L. 1969, Phytochem. 8, 561-566; 2nd Inertnational Electronic Conference on Synthetic Organic Chemistry (ECSOC-2), 1998, dp138-139）。また、シャクヤク（paeoniae）、ユキノシタ（saxifrage）、カンゾウ（glycyrrhiza）などの植物エキスに、チロシナーゼ活性の阻害効果が報告されている。4位置換レゾルシノール骨格を有する樹木抽出物にも強力なチロシナーゼ阻害効果が報告されている（清水邦良, 木材学会誌付録, 47, 5 (2001)）。これらの阻害剤の存在下、本発明に従ってポリペプチドを架橋させることにより、該ポリペプチドの架橋のレベルを低下させることができる。
【００４３】
フェノールオキシダーゼの量または活性を上昇または低下させる化合物を有効成分として含む、本発明の架橋促進組成物または抑制組成物は、その標的チロシンを含むポリペプチドが架橋した複合体の硬度を上昇または低下させるための組成物（すなわち硬化剤または硬化防止剤）となる。これらの組成物は、ポリペプチド含有重合体製造における工業用試薬として、また組織硬化を促進または抑制する医薬または化粧品等として有用である。
【００４４】
本発明の組成物は、有効成分それ自体であってもよいし、必要に応じて水、またはエタノールなどのアルコール系溶媒を加えてもよい。剤形に制限はなく、液状、粉末状、顆粒状、錠剤状、乳液、クリーム、パック、軟膏等の任意の剤形を採用することができる。製剤化に当たっては、有効成分を単独で配合する以外に、必要に応じて任意の助剤を使用することができ、例えば他のフェノールオキシダーゼまたはフェノールオキシダーゼ阻害剤などの生理活性物質、またはその他の有用物質と混合して製剤化してよい。その場合は、併用された他の有効成分との間の相乗作用が、通常期待される以上の優れた使用効果をもたらすことがある。具体的には、例えばクエン酸、酒石酸、乳酸、あるいはそれらの塩などの収斂剤、安息香酸、塩化ジステアリルメチルアンモニウム、またはソルビン酸などの殺菌・抗菌剤、植物または動物抽出物、紫外線吸収剤、コラーゲン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンなどの保湿剤、リボフラビン、ピリドキシン、ニコチン酸、またはパントテン酸などの賦活剤等を適宜組み合わせることができる。本発明の組成物の製造においては、一般的な諸原料を用いて行う組成物の製造工程の任意の段階で有効成分であるフェノールオキシダーゼ、あるいはその量または活性を促進または抑制する化合物を添加すればよい。該有効成分の配合率は適宜変更することができるが、好ましくは約0.01〜30重量％、好ましくは約0.05〜10重量％である。本発明の組成物は、化粧品、あるいは皮膚または毛髪等に適用される医薬部外品もしくは医薬品等に組織硬化の促進作用または予防作用を付与する目的で配合するほか、所望の製品中の蛋白質架橋を促進または防止するための添加物または表面処理剤として使用することができる。
【００４５】
また本発明は、ポリペプチドにおける標的チロシンの含有量を上昇または低下させる工程を含む、フェノールオキシダーゼ処理による該ポリペプチドの架橋量を上昇または低下させる方法を提供する。例えば、天然のポリペプチドに標的チロシンが含まれる場合に、そのアミノ酸配列を除去したり、他のアミノ酸配列に置換するなどして標的チロシンの数を低下または完全に喪失させることにより、フェノールオキシダーゼによるこのポリペプチドの架橋を抑制または阻害することができる。また、天然のポリペプチドに標的チロシンを付加することにより、このポリペプチドのフェノールオキシダーゼによる架橋を上昇させることができる。標的チロシン含量を改変したこのようなポリペプチドは、本発明の架橋反応において架橋の程度を制御するために重要である。また、標的チロシンを含む非天然の構造を持つポリペプチドを化学的または生物的に新規に合成することもできる。このようなポリペプチドを用いて架橋反応を行うことにより、該ポリペプチドを含む架橋した複合体の硬度を制御することが可能である。
【００４６】
例えば天然蛋白質において標的チロシンを挿入したり、あるいはこの位置または数を変更することにより、より強度が高いあるいはより柔らかいバイオポリマーを開発することが可能である。改変対象となる蛋白質に制限はないが、クモまたはカイコの絹糸などの成分となる蛋白質（フィブロイン (fibroin)、セリシン (sericin)、およびスピドロイン (spidroin)、およびその他のシルク蛋白質など）、脊椎動物および無脊椎動物の皮膚、毛、および角質蛋白質、卵殻蛋白質、細胞外マトリクス（ECM）蛋白質、ならびに植物の細胞壁などが挙げられるが、これらに制限されない。例えばシルク蛋白質に標的チロシンを多数導入することにより、これまでにない強度を持つ蛋白質繊維を開発することも可能と考えられる。逆に、ポリペプチド中の標的チロシン含量を減らすことにより架橋度を下げ、より柔らかい素材を新規に開発することもできる。
【００４７】
改変の対象となるポリペプチドは、例えば綿花、麻、羊毛、カシミヤ、ラクダ、兎毛などのその他の獣毛、絹、石綿、紙などの天然繊維に含まれるポリペプチド成分が挙げられる。また、牛乳蛋白質、大豆蛋白質、落花生蛋白質などの蛋白質を原料とする再生蛋白質系ポリマーに含まれる蛋白質、プロミックス（Promix）等の蛋白質と合成化合物との共重合体などにおける蛋白質も改変の対象となる。生物が持つ蛋白質のアミノ酸を改変するには、相同組み換えを利用して内因性の遺伝子を改変遺伝子と入れ替える方法、および新たに改変遺伝子を導入する方法がある。これらは公知のトランスジェニック法およびジーンターゲティング法に従って行うことができる。
【００４８】
また本発明は、本発明における標的チロシンを含むポリペプチドを用いたフェノールオキシダーゼのアッセイ方法を提供する。この方法は、標的チロシンを含むポリペプチドと被検試料を接触させる工程、該ポリペプチドの架橋を検出する工程、および該架橋のレベルをフェノールオキシダーゼのレベルと関連付ける工程、を含む方法である。架橋のレベルはフェノールオキシダーゼ活性のレベルを反映する。従って、架橋反応が高いレベルで検出されるほど、試料中に高いレベルのフェノールオキシダーゼ活性が存在することが分かる。架橋の検出は、例えば実施例に記載したような吸光度測定、または反応生成物の電気泳動により実施することができる。また、標的チロシンを含むポリペプチドを固定化したマイクロプレートと、標的チロシンを含む蛍光標識した遊離ポリペプチドを組み合わせて被検試料と接触させれば、架橋反応により特異的にマイクロプレートに標識ポリペプチドが結合するため、洗浄後に蛍光を検出することにより容易にアッセイを行うこともできる。また、酸素消費をオキシグラフ等により測定したり、あるいはマススペクトロメトリーにより質量を測定することにより架橋を検出することができる（Jee, J.-G. et al., 2000, Rapid Commun. Mass Spectrom., 14, 1563-1567）。フェノールオキシダーゼのアッセイは、特にヒトチロシナーゼ阻害剤のスクリーニングにおいてしばしば用いられている。本発明のアッセイ方法を用いれば、チロシナーゼ阻害剤の新たなスクリーニングが方法として有用である。また、本発明の標的チロシンを効率的に架橋する酵素の開発等において有用である。
【００４９】
本発明のフェノールオキシダーゼのアッセイキットは、標的チロシンを含むポリペプチドを含む。キットのポリペプチドは、乾燥していても水溶液に溶解していてもよい。ポリペプチドは、蛍光物質等により標識されていてもよい。また上記に記載したアッセイ方法で用いられるような、（ａ）標的チロシンを含むポリペプチドが固定化された支持体、および（ｂ）標識された標的チロシンを含むポリペプチドを含むキットも本発明に含まれる。キットには上記アッセイ方法の手順を記載した説明書を添付することができる。
【００５０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。なお、本明細書に引用された文献は全て本明細書の一部として組み込まれる。
【００５１】
[実施例１] カイコの新規なキューティクル蛋白質遺伝子の単離
１．カイコ表皮からのRNAの単離
脱皮において、JHの存在下の20Eの鋭いピークが表皮において多くの遺伝子の逐次的な発現を協調させる。脱皮におけるごく限られた期間に発現する、20Eにより制御されるこれらの遺伝子をスクリーニングするため、カイコの４回目の脱皮および５齢の発生ステージにおける遺伝子の発現を比較する実験を行った。
【００５２】
まずカイコBombyx moriのストックであるp^Sm788（mottled striped strain）（Fujiwara, H. et al., 1991, Genetical Research 57, 11-16）を、16:8 h（明:暗）の光周期条件下、25℃で、人工飼料（Nihon Nosan Kogyo, Yokohama, Japan）で育てた。
4回目の幼虫脱皮における発生時期を正確に定義するため、新しい気門の形成の特長的な序列を表す気門インデックス（spiracle index）を用いてカイコ発生ステージを定義した（Kiguchi, K., Agui, N., 1981, Journal of Insect Physiology 27, 805-812）。可視的な特徴を基に、脱皮期における10の形態学的な幼虫ステージ（A, B, C1, C2, D1, D2, D3, E1, E2 [A〜E, 4齢幼虫] および F [5齢幼虫]）を区別することが可能であった。これらのステージを気門インデックス（spiracle index）と称す。
新たに脱皮した4齢および5齢幼虫を明期の開始直後に分離した（この日を day 0 とした）。p^Sm788 株のほとんどの幼虫は 5齢幼虫の day 8 の明期初期に遊走（wandering）し始め（この日を W0 とした）、day 12 に蛹化した。
【００５３】
4回目の脱皮の3つの異なるステージ（C1、D1、およびE1）および5齢初期のステージ（F）におけるmRNA集団を、mRNAディファレンシャルディスプレイ技術を用いて比較するため、これらの4ステージにおいて p^Sm788 株のカイコ幼虫表皮から全RNAを調製した。具体的には、グアニジウムイソチオシアネート−フェノール−クロロホルム法（Chomczynski, P., Sacchi, N., 1987, Analytical Biochemistry 162, 156-159）を改変した方法により全RNAを単離し、エタノール沈殿によりさらに精製した。RNA濃度を分光光度計測定により決定した。
【００５４】
２．ディファレンシャルcDNAディスプレイ
上記で調製した、カイコp^Sm788株の4回目の脱皮期の幼虫のステージ C1、D1、およびE1、および5齢幼虫のステージ Fの表皮からの全RNAをDNase Iで処理した（MessageClean Kit, GenHunter Corp.）。これらのサンプルを Superscript^TM II (GIBCO BRL) および 3'アンカーオリゴdTプライマー（H-T₁₁A: 5'-AAGCTTT TTTTTTTTA-3' (配列番号：１) または H-T₁₁C: 5'-AAGCTTTTTTTTTT TC-3' (配列番号：２)）を用いて逆転写した。逆転写は 0.5μgの熱変性した全RNA, 0.25μgの1つのプライマー, 0.5 mM dNTP, 10 mM dithiothreitol および 1× RTバッファーを含む10μlの反応液中で行った。42℃で2分インキュベートした後、100 Uの逆転写酵素を添加し、すばやく混和し、さらに42℃で50分インキュベートした。その後サンプルを70℃、15分で熱変性させ、40μlの蒸留水で希釈し、PCRに用いるまで-20℃で保存した。
【００５５】
PCRは10μlの反応液中、最終濃度1×のPCRバッファー[10 mM Tris-HCl, pH 8.3/50 mM KCl/0.001% (w/v) gelatin], 2μM dNTP, 2 mM MgCl₂, 0.4μM 5'アービトラリープライマー（下記参照）および3'アンカーオリゴdTプライマー, 0.25 U Taq DNA polymerase (AmpliTaq^TM, Perkin-Elmer) および 37 kBq の [α-³²P] dCTP (3000 Ci/mmol, ICN) の組成にて行った。
各cDNAサンプルについて40のアービトラリープライマー（OPM01〜20およびOPI01〜20, Operon Inc.）を用いてディファレンシャルディスプレイを解析した。サイクル条件は 94℃30秒, 40℃2分, 72℃1分を40サイクル行い、その後72℃で10分インキュベートとした。PCRサンプル（3.5μl）を2μlのDNAローディングダイ [95% formamide, 10 mM EDTA (pH 8.0), 0.09% xylene cyanole, および 0.09% bromophenol blue] と共に80℃2分で変性させ、7 M尿素を含む6％ポリアクリルアミドシークエンシングゲルで電気泳動的に分離した。ゲルは濾紙上で乾燥させX線フィルムに露光した。
【００５６】
ほとんどのcDNAバンドは上記に記載した4ステージの全てのRNAサンプルで等しく可視であったが、幾つかはステージにより異なるレベルで発現していた。1つのcDNAバンド（4'-1, 149 bp）は、E1ステージ（これは後期脱皮期の間である）でのみ発現し、他のどのステージでも発現していなかった（データ省略）。この高度にステージ特異的な遺伝子の構造的特徴を同定するため、オートラジオグラフィーにより可視化した目的のcDNAバンドをゲルから切り出した。各ゲル切片は100μlのH₂Oに浸し、80℃で15分インキュベートした。溶出したcDNAは、ディファレンシャルディスプレイで用いたのと同じプライマーセットでPCRにより再度増幅した。そのcDNAはpGEM-T Easy Vector（Promega）にクローニングした。プラスミドクローン中の挿入配列は、自動DNAシークエンサー（ABI PRISM310, PE Applied Biosystems）を用いて解析した。挿入配列は未同定のmRNAの3'領域に相当しており（図１のボックスで示した領域）、この配列を基に、5'および3'RACE（rapid amplification of cDNA ends）技術を用いて全長cDNAクローンを単離した。5'および3'RACEは、Marathon cDNA Amplification Kitを用いて行った。
【００５７】
３．新規キューティクル蛋白質遺伝子BMCPG1の構造的特徴
単離したE1ステージ特異的cDNAの完全な配列の長さは595 bp（配列番号：３）であり、165アミノ酸の配列（配列番号：４）をコードする495 bpのオープンリーディングフレーム（ORF）を含んでいる（図１）。そのORFから導出されるアミノ酸配列には、顕著な数のグリシン残基（55/165, 33.3%）が含まれている。GGYまたはその関連配列（GGGYおよびSGGY）が何回もタンデムにリピートしている。その特徴的な構造から、本発明者はこの遺伝子をB. mori cuticle protein GGY-repeat 1、すなわちBMCPG1と名付けた。SignalP V1.1プログラム（H. Nielsen et al., Protein Engineering 10, 1-6 (1997); H. Nielsen et al., Protein Engineering 12, 3-9 (1999); H. Nielsen et al., Int. J. Neural Sys. 8, 581-599 (1997)）により、BMCPG1の推定シグナルペプチドが予想された。
【００５８】
これまで報告されているカイコのキューティクル蛋白質と比較すると、BMCPG1と他のBombyxのキューティクル蛋白質との間に構造的類似性は見出されなかった。カイコの幼虫キューティクル蛋白質（LCP17, 18, 23, 32）および蛹キューティクル蛋白質（PCP1）（Nakato, H. et al., 1992, Biochimica et Biophysica Acta 1132, 161-167; Nakato, H. et al., 1994, Biochimica et Biophysica Acta 1218, 64-74; Shofuda, K. et al., 1999, Comparative Biochemistry and Physiology 122, 105-109）は、全てエンドキューティクル領域を形成するようであり、多くのAla、Val、またはPro残基を有している（データ省略）。これに対し、BMCPG1の主要なアミノ酸はGly、Val、およびTyrである。アミノ酸組成および配列の類似性（データ省略）に基づき、本発明者はBMCPG1はカイコの新規なキューティクル蛋白質であると考えた。
【００５９】
BLASTPプログラム（Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410; Altschul, S.F. et al. (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L. et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) Genome Res. 7:649-656）を用いたホモロジーサーチにより、幾つかの蛋白質がBMCPG1と高い構造的類似性を有することが示された。それらはDrosophilaの推定されるキューティクル蛋白質 EDG91（Apple, R.T., Fristrom, J.W., 1991, Developmental Biology 146, 569-582）、ヒトサイトケラチン、Bombyxコリオン蛋白質、軟体動物ラバー蛋白質、および幾つかの他の蛋白質で、それらのほとんどは構造蛋白質であり、GGYリピートを含んでいる。これらの蛋白質の中で、EDG91はBMCPG1と顕著な構造的類似性を示した（図２）。EDG91およびBMCPG1はGGYリピートの長いストレッチを2つ、そして推定シグナルペプチドを含んでいる。BLASTPによっては、GGY構造を持つ昆虫のキューティクル蛋白質で高いスコアを持つものはEDG91以外に見出すことはできなかった。そこで本発明者は、ENTREZプログラム（National Center for Biotechnology Information (NCBI)）により、キーワード「cuticle」と共にリストされた遺伝子の中から、1つ1つ類似した蛋白質を探すことを試みた。本発明者は、Manduca sextaの推定キューティクル蛋白質 MsmaA16（Robertson, H.M. et al., 1999, Insect Molecular Biology vol. 8, 501-518）、およびC. elegansの仮想蛋白質CeT27E4.4（The C. elegans Sequencing Consortium, 1998, Science 282, 2012-2018）もまた、類似したGGYストレッチを持つことを見出した（図２）。しかしながら、今のところ、CeT27E4.4がキューティクル蛋白質であるのかは不明である。さらに、Locustのキューティクル蛋白質 LM-ACP 63、64、および 65（Hojrup, P. et al., 1986, Biochemical Journal 236, 713-720）が、N末およびC末に短いGGYリピートを含んでいることを見出した（データ省略）。これらの推定キューティクル蛋白質は、CeT27E4.4に1つあるのを除きCys残基を含まないことは特筆に値する。これらの蛋白質に含まれる、Gly、Ala、およびLeuなどの小さな非電荷アミノ酸に囲まれたTyr残基が、ジスルフィド結合に代わって蛋白質の架橋に使われる可能性がある。卵殻を構成するコリオンもまた、昆虫における硬い構造蛋白質である。カイコのほとんどのコリオン蛋白質はGGYリピートを持たないようであるが、幾つかのコリオン、すなわちL-11およびL-12のミドルクラスAおよびBは、GGY様モチーフを含んでいる（図２(B)）。GGYリピートを含むコリオン蛋白質は、多くのCys残基も含んでいる。
【００６０】
４．脱皮および変態におけるBMCPG1のステージ特異的および組織特異的発現
4回目の脱皮におけるBMCPG1の発現の正確な発生的プロファイルを調べるため、ステージ C1、D1、D3、E1、E2、および F の表皮cDNAにおいて、LightCycler (Roche) を用いた定量的RT-PCRを行った（図３）。また、いずれも脱皮ステージにおいて特異的に転写される遺伝子であるBMCPG1、DDC、およびFTZF1遺伝子の発現パターンを比較した。
【００６１】
定量的逆転写PCRのために、First-Strand cDNA Synthesis Kit (Pharmacia) を用いて全RNAをcDNAに逆転写した。1μgの全RNAおよび0.1μgのランダムヘキサデオキシヌクレオチドを含む7.5μlの反応液を37℃で60分インキュベートし、90℃で5分加熱し、素早く氷上で冷やし、180μlのRNase-freeの水で希釈した。定量的逆転写PCR（quantitative RT-PCR）は SYBR Green Kit（LightCycler-DNA Master SYBR Green I, Roche）を用いて、LightCycler（Roche）により行った。細胞で恒常的に発現するリボソーム蛋白質L3（rpL3）の遺伝子を内部標準として用い、mRNAの相対的発現を評価した。定量的RT-PCRで用いたオリゴヌクレオチドプライマーセットを以下に示す。rpL3（GenBank accession no. AB024901）については 5'-AGCACC CCGTCATGGGTCTA-3'（配列番号：５）および 5'-TGCGTCCAAG CTCATCCTGC-3'（配列番号：６）; FTZF1 (D10953) については 5'-AAACTTGAAGCGGTTCGAGC-3'（配列番号：７）および 5'-GCATAACAGACCATGAGTCC-3'（配列番号：８）; DDCについては 5'-GGCACGGCTAGCGAAGCTAC-3'（配列番号：９）および 5'-GATCCAGCGTAGGCGGCATC-3'（配列番号：１０）; BMCPG1については 5'-GGCATCATGAGAGCATTCGT-3'（配列番号：１１）および 5'-TAGTTCACCACCA TCCGTTG-3'（配列番号：１２）。これらのプライマーを用いることで、RT-PCR反応後のアガロースゲル電気泳動では単一のバンドのみ観察された。rpL3、FTZF1、DDC、およびBMCPG1の各バンドは、それぞれ 409, 679, 395 および 508 bp であった。
【００６２】
BMCPG1、DDC、およびFTZF1の3つの遺伝子は類似した発現パターンを示した。各遺伝子から転写されるmRNAは、エクジステロイドのタイターが上昇しているか、またはピークにあるCおよびDステージでは低く、エクジステロイドレベルが下降するステージEでより高かった。しかしながら、E1およびE2ステージに発現のピークがあるFTZF1と比べ、BMCPG1およびDDCの発現は遅れてE2ステージにピークがある。4回目の幼虫脱皮の後のFステージでは、BMCPG1およびFTZF1 mRNAレベルは完全に抑制されていたが、DDCの発現は脱皮後でさえ持続した（図３および４）。
【００６３】
さらに、4回目の脱皮および前蛹ステージの両者の間のBMCPG1のステージ特異的な発現をノーザンブロット解析により調べた（図４）。ノーザン解析のために、10μgの全RNAをホルムアルデヒド−アガロース（1%）ゲルで分離し、Hybond-Nナイロンメンブレン（Amersham）に転写した。ハイブリダイゼーションを、50% ホルムアミド, 5× SSC, 10× Denhardt's液 (各0.2%のBSA, Ficoll, および polyvinylpyrrolidone), 25μg/ml sonicated salmon sperm DNA, および 50 mM sodium phosphate (pH 7.0) 中、42℃で18時間行った。DNAプローブはBcaBEST^TM Labeling Kit (TaKaRa) を用いて[α-³²P]dCTPで標識した。メンブレンは、0.1% SDSを含む2× SSC中、室温で20分の洗浄を2回行った。その後、メンブレンは65℃30分の洗浄を段階的に1% SDSを含む2× SSC、1% SDSを含む1× SSC、1% SDSを含む0.1× SSC中で行った。
【００６４】
BMCPG1は、第4脱皮における E1およびE2ステージ、およびエクジステロイドのタイターが低下する時期である、前蛹期における遊走開始後の day 3（W3）および day 3.5（W3.5）で発現していた。FTZF1およびDDCもまた、報告（Sun, G. et al., 1994, Developmental Biology 162, 426-437; Hiruma, K. et al., 1995, Developmental Biology 169, 195-209）されているように、脱皮の直前に発現のピークがある類似したパターンを示した。脱皮および前蛹期におけるステージ特異的発現は、BMCPG1遺伝子がエクジステロイドタイターの低下に応答することを示唆している。
【００６５】
BMCPG1の組織特異的な発現を調べるため、E2およびW3.5ステージの表皮以外の組織におけるBMCPG1 mRNAレベルをノーザン解析により調べた（図５）。BMCPG1は表皮でのみ強く発現しており、他の組織（脂肪体、精巣、絹糸腺、および翅原基）ではいずれのステージでも発現していなかった。しかしながら、X線フィルムの露光と現像を長くすると、精巣および脂肪体の両方でごく少量のBMCPG1 mRNAが検出された（データ省略）。これに対し、FTZF1およびDDCは、様々な組織およびステージにより発現レベルは異なるものの、ほとんどの組織で発現していた。この結果は、BMCPG1遺伝子はキューティクル蛋白質をコードしていることを強く示唆する。
【００６６】
５．培養表皮のBMCPG1 発現に及ぼす20-hydroxyecdysoneの効果
上記の結果は、20-hydroxyecdysone（20E）のパルスは表皮においてBMCPG1の転写を誘導することを示唆する。この仮説を検証するため、培養表皮のBMCPG1発現に及ぼす20Eの効果を調べた。具体的には、day 2の4齢幼虫から表皮を切り出した。表皮は背側からキューティクルと共にハサミで5から8つのセグメントに切り分けた。phosphate-buffered saline (pH 7.0) 中で、付着する脂肪体、筋肉、および気管を注意深く、できるかぎり取り除き、表皮をGrace's medium (GIBCO BRL) 中で1時間25℃で培養した（前培養）。前培養の後、表皮の小片を4枚のマルチウェルディッシュ (Nunc, 直径16 mm) に移し、1% antibiotic reagents (GIBCO BRL, Antibiotic-Antimycotic) を含むGrace's medium 1 ml中でインキュベートした。エクダイソン刺激は、20-hydroxyecdysone (20E, SIGMA) を10% isopropyl alcohol中に溶解し、培地中に2μg/mlで添加して行った。その後表皮を6〜42時間培養した。
【００６７】
LightCyclerを用いた定量的RT-PCRにより、培地中に20Eがない場合でも、培地中に2μg/mlの濃度の20Eが存在する場合でも、42時間までの期間にBMCPG1の転写は誘導できないことが示された（図６）。2μg/mlの20Eで6時間インキュベート後に培地から20Eを取り除くと、BMCPG1 mRNAレベルの増加がはっきりと誘導された。このような20Eのパルス処理は、FTZF1の発現も誘導した。しかしながら、BMCPG1とFTZF1の誘導パターンは異なっていた。FTZF1の誘導は培地から20Eを取り除いた直後に始まったが、BMCPG1の発現は20Eの除去の後、約12時間遅れた。これは、BMCPG1の発現は、エクジステロイド誘導遺伝子活性化経路の転写因子であるFTZF1の機能により制御されている可能性を示唆する。
【００６８】
[実施例２] GGYモチーフを含むペプチドの架橋
GGYモチーフが実際に蛋白質の架橋に関与する確証を得るため、BMCPG1配列を基にGGYモチーフを含むペプチドを合成した。そして酵素的酸化によるこれらのペプチドの架橋を調べた。ペプチドが架橋すると、UV-可視光のレンジの吸収は有意に変化することから（Burzio, L. A. & Waite, J. H., Protein Sci. 10, 735-740 (2001)）、まず分光光度計によるスキャニングを用いて架橋反応を測定した（図７）。20 mer のGGYpep（GGYGGYSGGYGGYGGGYGGY; BMCPG1の残基51〜70に相当、表１参照）（配列番号：１３）をキノコチロシナーゼにより酸化すると、波長210〜600 nm における吸収のパターンは、反応時間を0から60分まで増加させるに従い上昇した（図７a）。しかし、GGYpepをチロシナーゼではなくウシ血清アルブミン（BSA）と混合した場合は、そのような変化は起こらなかった（図７b）。チロシン残基がないペプチド（BHRpep）（配列番号：１４）にチロシナーゼを添加した場合は、吸収パターンの変化は観察されなかった（図７c）。これらの結果は、GGYpepのチロシン残基の間で、チロシナーゼ依存的な様式でdi-DOPAクロスリンクが形成することを示唆している。この反応において、キノコチロシナーゼを昆虫のフェノールオキシダーゼ（PO）で代替することができ、キューティクル形成において観察されるBMCPG1のin vivoの架橋を模倣することを調べるため、カイコから得たPO活性化ヘモリンフを用いた（Ashida, M. & Brey, P. T. (1998) Molecular Mechanisms of Immune Responses in Insects (Brey, P. T. and Hultmark, D. eds). pp. 135-172. Chapman & Hall, London）。GGYpepをPO活性化ヘモリンフと混合したところ、吸収パターンはチロシナーゼ反応で観察されたのと同様に上昇した（図７d）。
【００６９】
[実施例３] 架橋反応のアミノ酸配列特異性
それぞれ1つまたは2つのチロシン残基を含む3つの異なるペプチド、アンギオテンシン II（angiotensin II）（配列番号：１５）、副腎皮質刺激ホルモン（adrenocorticotropic hormone; ACTH）（配列番号：１６）、および血管作用性小腸ペプチド（vasoactive intestinal peptide; VIP）（配列番号：１７）をチロシナーゼと反応させ、2分および10分後にサンプルのUV吸収を波長210〜320 nm でスキャンした。GGYpepの反応で観察された上昇パターン（図８a）に比べ、アンギオテンシン II（図８b）またはACTH（図８c）ではUV吸収の変化は見られなかった。しかしVIPの10分の反応時間の後では、UV吸収の僅かな上昇が観察された（図８d）。これらの結果は、チロシナーゼにより触媒されるdi-DOPAの架橋はGGYモチーフに特異的な様式で起こり、幾つかのチロシン残基（VIPのNYTまたはKYL）で低効率で起こる架橋に比べ有意に高い効率で反応することを示している。なお最近、2つの神経内分泌ペプチド、ニューロテンシン（neurotensin）（ELYENK／配列番号：１８）およびプロクトリン（proctolin）（RYPT／配列番号：１９）が、di-DOPAクロスリンクを受けることが報告された（Burzio, L. A. & Waite, J. H., Protein Sci. 10, 735-740 (2001)）。
【００７０】
[実施例４] GGYモチーフを含むポリペプチドの架橋反応の解析
GGYモチーフを含むポリペプチドで起こる構造変化をより明確に理解するため、BMCPG1の異なる部分に相当する配列（残基128〜145, FITC-CKKNGGYGGYSGGYSGGYSGGY／配列番号：２０）を用いてFITCラベルしたオリゴペプチド（FITC-GGYpep）を合成し、このペプチドを酸化反応後、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で解析した。FITC-GGYpepをキノコチロシナーゼで5分または30分インキュベートすると（図９A, レーン3, 4, および8）、FITC-GGYpepのもともと（単量体）のバンド（2.7 kDa）の上に、約30 kDaまでスメアなバンドが観察された。このようなスメアなバンドは、チロシナーゼ反応を省略したり（図９A, レーン1および2）、あるいはチロシナーゼをBSAに代えた（レーン9）場合には生じなかった。これらの結果は、GGYペプチドはチロシナーゼ酸化により架橋し、約10 merまでの多量体を形成できることを強く示唆している。スメアなバンドは、おそらくFITC-GGYpepのチロシン残基間のランダムな共有結合の形成に起因している。これらの架橋は反応混合液にSDSを添加すると妨害された（レーン6）が、反応後のローディングバッファーにβ-メルカプトエタノールを添加しても妨害されなかった（レーン5）。S-S結合とは違い、GGYモチーフを含むペプチド間の架橋はβ-メルカプトエタノールにより開裂されなかった。
【００７１】
[実施例５] フェノールオキシダーゼによるGGYモチーフを含むポリペプチドの架橋
カイコヘモリンフで反応させたFITC-GGYpep間の架橋をさらに調べた（図９B）。架橋産物のスメアなバンドは、FITC-GGYpepをPO活性化ヘモリンフと反応させた場合にも観察された（レーン2および4）が、ポリメライゼーションの程度はチロシナーゼ反応における観察に比べ小さいように見えた（レーン7）。特異的フェノールオキシダーゼ阻害剤であるフェニルチオウレア（phenylthiourea; PTU）をヘモリンフに添加すると、バンドシフトは完全に遮断された（レーン3および5）ことから、カイコヘモリンフ中のフェノールオキシダーゼ活性が、GGYペプチドの架橋に責任を持つことが示唆された。この知見は、キューティクル蛋白質BMCPG1は、カイコにおいて実際に架橋されることを示唆する。
【００７２】
[実施例６] GGYモチーフを有する蛋白質
BMCPG1はGGYモチーフ（主にGGYGG）のリピートからなる2つのドメインを、1つはN末端付近に、他方はC末端付近に含んでおり（表１）、それらは全長165アミノ酸の配列の半分を構成している。GGY様のリピートは軟体動物の接着蛋白質にも存在し、蛋白質の架橋に関与すると考えられている; A. ater 蛋白質中の AGY*GG（Y* はDOPAを表す）（Burzio, L. A. et al., Biochim. Biophys. Acta 1479, 315-320 (2000)）。さらに、多毛類のセメント蛋白質のGGY*GGまたはGGY*GY（Waite, J. H. et al., Biochemistry 31, 5733-5738 (1992)）、および吸虫の卵殻蛋白質のGGY*GGY*G（Waite, J. H. & Rice-ficht, A. C., Biochemistry, 26, 7819-7825 (1987)）という、ペプチジルDOPA（Y*）を含む他のGGY様配列も報告されている。これらの蛋白質に共通するGGYモチーフが、di-DOPAの共有結合を介する蛋白質の架橋に関与していると考えられる。
【００７３】
上記の蛋白質は全て、硬い細胞外蛋白質であることは興味深い。従って、GGYモチーフのリピートは、強力な蛋白質構造の形成を特定する保存された一般的モチーフである可能性がある。この可能性を検証するため、BMCPG1の全体の配列とホモロガスな配列を、再度BLASTP2.0プログラムを用いて検索した。最も高いホモロジーの値はBMCPG1自身でその期待値は6e-97であり、Drosophilaのエクダイソン誘導性のGGYリッチキューティクル蛋白質であるEDG91の3e-21（Apple, R. T. & Fristrom, J. W., Dev. Biol. 146, 569-582 (1991)）がそれに続いた（表１）。残りの配列（2e-17よりもホモロジー値が小さい）の多くはGGYリッチな蛋白質をコードしており、それらの大半は硬い蛋白質である。これらの蛋白質の典型的な例を表１にまとめた。上記した蛋白質に加え、昆虫の幾つかのコリオン蛋白質（Sporel, N. et al., J. Mol. Biol. 190, 23-35 (1986)）、クモのシルク蛋白質（Hayashi, C. Y. & Lewis, R. V., BioEssays 23, 750-756 (2001); Ac no. AAK30596）、植物の細胞壁蛋白質（Rhode, W. et al., Plant Mol. Biol. 14, 1057-1059 (1990)）、および哺乳動物の幾つかのタイプのサイトケラチン（CK9およびCK10）（Langbein, L. et al., Differentiation 55, 57-71(1993）が、GGYモチーフ配列に富んでいる。その役割は明らかではないが、GGYリッチモチーフはRNA結合蛋白質およびRNAヘリカーゼAにも見られる（Lee, C. G. & Horwitz, J., J. Biol. Chem. 268, 16822-16830 (1993)）。
【００７４】
BMCPG1とホモロガスな配列をBLASTP2.0で検索し、さらに目視によりGGYリッチな配列を調べた結果を表１にまとめた。表中、各蛋白質におけるGGYまたはGGY関連配列の総数（#1）および典型的なGGYリッチ領域（#2）が4番目のカラムに示されている。典型的な領域のGGYモチーフ配列は中抜き文字で示されている。チロシン残基の直近を取り囲むGlyリッチ領域の5残基に下線を引いた。Y* はペプチジルDOPAとして同定されたチロシン残基を示す（#3）。各蛋白質中のGGYリッチ領域の位置は5番目のカラムに示されている。
【００７５】
【表１】 広範で様々な蛋白質中に見出されるGGYGGモチーフ

【００７６】
軟体動物蛋白質のAGY*GGXK配列（配列番号：３４）またはGY*GAK配列（配列番号：３５）が酸化の標的として作用する（Burzio, L. A. et al., Biochim. Biophys. Acta 1479, 315-320 (2000)）ことから、“GGY”それ自体のリピートが唯一の厳格な架橋部位ではありそうにない。表１に示した配列の多くにおいて、“GGY”は常に直接（GGYGGYとして）繰り返している訳ではなく、しばしばグリシンのような非電荷の小さなアミノ酸に富む領域に隣接している（表１の下線部）。従って、効率的な架橋のためには、チロシンは、GGYGGまたはAGYGGのように、グリシンのような非電荷の小さなアミノ酸に富む配列に囲まれている必要があると考えられる。この条件が満足されることにより、“GGY”様配列（SGY、AGY、および表１に示した幾つかの他の配列を含む）も架橋の標的として作用する。チロシン残基を囲むグリシン、セリン、およびアラニン残基は比較的小さなアミノ酸であり、チロシンが酸化酵素に露出されるのを助けると考えられる。
【００７７】
【発明の効果】
本発明により、ポリペプチドを架橋するための新たな方法が提供された。本発明は例えば高強度のペプチド性繊維、または強固な構造を持つ蛋白質の製造に有用である。また、所望の蛋白質を支持体または他の蛋白質と共有結合させるために有用である。本発明は、例えば組織の接着剤として用いることができる。本発明の架橋反応は水溶液中で進行することから、本発明の方法を水中の蛋白質および生体などにおいて組織を接合させるために用いることができる。このように本発明の方法は、工業および医療において様々な応用が可能である。
【００７８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】 cDNA配列から導出されるBMCPG1のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸残基を塩基配列を下に示し、第１Met残基（position 1）からの番号を示した。GGY、GGGY、およびSGGY配列に下線を引いた。GGY関連配列は括弧で示した。アスタリスクはストップコドンを表す。推定シグナルペプチドは、World Wide Web prediction server (CBS) の SignalP V1.1プログラムにより予測し、イタリックの文字で示した。ディファレンシャルディスプレイで得られた元々の産物はボックスで示した。5'RACE（5'-1 および 5'-2）および3'RACE（3'-1 および 3'-2）のためのプライマーセットは矢印で示した。5'RACEおよび3'RACEの結果に基づき、BMCPG1の全配列を決定した。
【図２】 GGYリッチキューティクル蛋白質およびカイココリオン蛋白質中のアミノ酸配列の比較を示す図である。(A) BMCPG1の導出アミノ酸配列（配列番号：４）を、他の種の3つのキューティクル蛋白質のそれと整列させた。DmDG91, D. melanogaster ecdysteroid dependent gene 91 (accession no. AAF55440)（配列番号：４６）。MsmaA16, Manduca sexta putative cuticle protein (accession no. AF117571, Robertson, H.M. et al., 1999, Insect Molecular Biology vol. 8, 501-518)（配列番号：４７）。CeT27E4, C. elegans hypothetical protein T27E4.4 (accession no. AAB04835, The C. elegans Sequencing Consortium, 1998, Science 282, 2012-2018)（配列番号：４８）。(B) GGYリピートモチーフを含むカイココリオン蛋白質。コリオン蛋白質 A-L11 (accession no. CAB01210)（配列番号：４９）および B-L12 (accession no. CAA31323)（配列番号：５０）は、それぞれミドルAクラスおよびミドルBクラスのコリオンに分類される（Tsitilou, S.G. et al., 1983, EMBO Journal 2, 1845-1852）。GGYおよびGGY関連配列に下線を引いた。推定シグナルペプチドは、World Wide Web prediction server (CBS) の SignalP V1.1プログラムにより予測し、イタリックの文字で示した。各蛋白質におけるシグナルペプチドを除いた推定分子量を計算し、図中に示した。
【図３】 4回目の幼虫脱皮における、BMCPG1、DDC、およびFTZF1の3遺伝子の発生的プロファイルを示す図である。各遺伝子のmRNAの相対的発現を定量的RT-PCRにより測定し、最大のデータを100として示した。バーは平均±SD（n=4-14）を示す。
【図４】 4回目の脱皮および前蛹ステージにおける、BMCPG1、DDC、およびFTZF1のノーザンブロット解析を示す図である。定量的RT-PCR解析で用いたそれぞれのPCR断片（BMCPG1, 508 bp; DDC, 395 bp; FTZF1, 679 bp）を³²Pラベルし、全RNA（5μg）とハイブリダイズさせた（実施例参照）。BmN, エクジステロイドパルスで処理したBmN4培養細胞株（図６参照）。なお、BmN4はカイコ卵巣から樹立された細胞株で、Nihon Nosan Kogyoより入手した。脱皮ステージは気門インデックスに基づいて決定した。W0〜W3.5, 遊走開始の0〜3.5日後。幼虫はW4で蛹化する。等量ロードしたことを示すコントロールとして、rRNAのエチジウムブロマイド染色を示した。
【図５】様々な組織におけるBMCPG1、DDC、およびFTZF1のノーザンブロット解析を示す図である。E2（脱皮）およびW3.5（変態）における様々な組織からの全RNA（10μg）を、³²Pラベルしたプローブとハイブリダイズさせた（図４参照）。Ep, 表皮; FB, 脂肪体; T, 精巣; PSG, 後部絹糸腺; WD, 翅原基。等量ロードしたことを示すコントロールとして、rRNAのエチジウムブロマイド染色を示した。
【図６】エクジステロイドパルスによるBMCPG1発現の誘導を示す図である。4齢 day 2 の表皮を図の下のダイアグラムに示したようにインキュベートした。ダイアグラム中の黒いボックスは 2μg/mlの20E処理を示す。白いボックスは20E非添加を示す。サンプルはインキュベーションの 6、18、30、および42時間後に回収した。BMCPG1の相対的発現をLightCyclerを用いたRT-PCRにより測定し、FTZF1の発現パターンと比較した。mRNAの相対的発現は、最大データを100として示した。バーは平均±SD（n=3）を示す。
【図７】チロシナーゼによるGGYモチーフ含有ペプチドの架橋を示す図である。チロシナーゼまたはヘモリンフのフェノールオキシダーゼによりGGYモチーフ含有ペプチドが酸化されると、UV-可視光のレンジの吸収が有意に変化することを示す。
(a) チロシナーゼで酸化したGGYリッチペプチド（GGYpep）；(b) BSAと混合したGGYpep；(c) チロシナーゼにより酸化したチロシンを欠損するBHRpep；(d) カイコ幼虫からのヘモリンフフェノールオキシダーゼにより酸化したGGYpep。
GGYpepの20 merの配列 GGYGGYSGGYGGYGGGYGGY（配列番号：１３）は、BMCPG1 (accession number AB055661) のアミノ酸残基51〜70に相当する。33 merのBHRpep（MPKNLLLFKKIIPEINFAKRNLTSPLGRNIFIS／配列番号：１４）をネガティブコントロールとして用いた。両ペプチドはSAWADAY Tech. Corp.（Tokyo）で合成しHPLCで精製した。ペプチドは50 mM Tris-HCl（pH 7.9）中に 1 mg/ml で懸濁した。キノコチロシナーゼ（6050 unit/mg, Sigma, product No. T7755）およびBSAは、50 mM Tris-HCl（pH 7.9）中に 1 mg/ml で懸濁した。架橋反応は110μlの5 mM Tris-HCl（pH 7.9）中、ペプチド：酵素重量比を1：1で、0.01 mgのキノコチロシナーゼ（またはBSA）を添加することにより開始した。反応液を室温で0〜60分（0, 1, 2, 5, 10, および 60分, または d においては 0, 5, および 15分）インキュベートした。各反応は、20μlの 1 N HCl を添加することにより停止させた。UV-可視光吸収は、Hitachi分光光度計を用いてスキャンした。カイコヘモリンフは5齢初期の幼虫からガラスプレート上に回収し、室温で10分保持してフェノールオキシダーゼを活性化させた。ヘモリンフは50 mM Tris-HCl（pH 7.9）中に1/10に希釈し軽く遠心した。上清（10μl）を架橋反応に用いた。
【図８】チロシナーゼによる架橋の基質特異性を示す図である。
GGYpep、アンギオテンシン II（Bachem, CA）（配列番号：１５）、ACTH（Peninsula Laboratories Europe Ltd, UK）（配列番号：１６）、およびVIP（Peninsula Laboratories Inc, CA）（配列番号：１７）を、図７に記載の条件下でキノコチロシナーゼと 0、2、および10分間架橋させた。
【図９】 FITCラベルしたGGYペプチドの架橋のSDS-PAGE解析を示す図である。
FITCラベルしたGGYペプチドをキノコチロシナーゼ（A）またはフェノールオキシダーゼ（PO）活性化ヘモリンフ（B）で架橋させ、SDS-PAGEで分離した。架橋したペプチドをゲル上で効率的に検出するため、FITCラベルしたGGYペプチドであるFITC-GGYpep（FITC-CKKNGGYGGYSGGYSGGYSGGY, MW: 2737ダルトン）（配列番号：２０）を合成した。配列 GGYGGYSGGYSGGYSGGY はBMCPG1の残基128〜145に相当し、GGYpepとは異なっている（図７参照）。FITC-GGYpep（4μl）を 1μlのキノコチロシナーゼ（A）または 0.25μlのPO活性化ヘモリンフ（B）と混合し、室温で図中ゲルの下に示した時間インキュベートした。反応は、20μlの1％SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 20% (v/v) glycerol,および 0.01% CBB を添加し、75〜80℃で5分インキュベートして停止させた。その後、サンプルを15％SDSポリアクリルアミドゲルで分離し、UVイルミネーションにより可視化した。
A. (1) キノコチロシナーゼ未添加；(2-4) 0.2 mg/ml チロシナーゼによる反応；(5) 65 mM βメルカプトエタノールを反応後に加えた；(6) 1.7% SDSを反応の間加えた；(7) 0.05 mg/ml チロシナーゼを反応に加えた；(8) 0.8 mg/ml チロシナーゼを反応に加えた；(9) 0.2 mg/ml BSA をチロシナーゼの代わりに加えた。
B. カイコ幼虫からヘモリンフを回収し、フェノールオキシダーゼ阻害剤であるフェニルチオウレア（phenythiourea; PTU）の存在下または非存在下、室温で30分おいた。(1) ヘモリンフ非添加；(2-3) PTUの非存在下または存在下で 1μlのヘモリンフを加えた；(4-6) PTUの非存在下または存在下で 0.25μlのヘモリンフを加えた；1μlのチロシナーゼを加えた。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method of cross-linking polypeptides.
[0002]
[Prior art]
Secreted proteins or cell surface proteins often form additional covalent bonds. Formation of disulfide (S-S) bonds between two -SH groups of adjacent cysteine residues has been considered the only way that polypeptides can be covalently linked. However, in cases 2 and 3, the tyrosine residue of the protein is hydroxylated to peptidyl DOPA (3, 4-dihydroxyphenylalanine), which is thought to be involved in peptide cross-linking (Burzio, LA & Waite, JH Biochemistry 39, 11147-11153 (2000)). In mollusc adhesive polyphenol proteins, many tyrosine residues exist as DOPA, suggesting that they are involved in cross-linking during fibrosis in paw specific cells (Burzio, LA et al., Biochim. Biophys. Acta 1479, 315-320 (2000); Burzio, LA & Waite, JH, Protein Sci. 10, 735-740 (2001)). Peptidyl DOPA is a polychaetePhragmatopoma californicaCement precursor protein (Waite, J. H. et al., Biochemistry 31, 5733-5738 (1992)), and flukeFasciola hepatica In the egg shell protein (Waite, J. H. & Rice-ficht, A. C., Biochemistry, 26, 7819-7825 (1987)), but the involvement of these DOPA molecules in crosslinking is not shown.
[0003]
Cuticles, which are exoskeletons of insects, are complex extracellular structures composed mainly of chitin filaments secreted from epidermal cells and many proteins. It is well known that insect cuticles formed during molting exhibit unusual types of protein cross-linking. The complex process of solidifying the cuticle is known as sclerotization (Hopkins, TL & Kramer, KJ, Ann. Rev. Entomol. 37, 273-302 (1992); Andersen, SO et al., Insect Biochem. Molec. Biol. 25, 153-176 (1995)). It is noteworthy that all known insect cuticle proteins have no cysteine residues. The main process of protein cross-linking in sclerotization is thought to be due to the direct binding of protein molecules by quinones produced from certain catecholamines by phenol oxidase. Peptidyl DOPAManduca sexta (Okot-Kotber, BM et al., Insect Biochem. Molec. Biol. 24, 787-802 (1994)), but information on di-DOPA binding that directly crosslinks proteins Almost does not exist.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides a method of cross-linking polypeptides.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
Insect cuticles generally consist of three highly organized layers: epicuticles, exocuticles, and endocuticles, which differ in protein components, structural characteristics, and physiological functions (Hillerton, JE, 1984, Cuticle: mechanical properties. In: Bereiter-Hahn, J., Matoltsy, AG, Richards, KS (Eds.), Biology of Integument, vol. 1. Invertebrates. Springer, Berlin, pp. 627-637; Willis, JH, 1987, Archives of Insect Biochemistry and Physiology 6, 203-215). When an insect molts, the exoskeleton is renewed through the biosynthesis and degradation of the cuticle protein under the control of insect hormones. Based on developmental timing of synthesis and secretion, cuticle proteins are classified into two groups (Andersen, S.O. et al., 1995, Insect Biochemistry and Molecular Biology 25, 153-176). One group is a protein called pre-ecdysial protein, which accumulates during the pharate period before molting. Another group is post-ecdysial protein, which accumulates after molting. Some pre- molting cuticles are stabilized and solidified by cross-linking (Hopkins, T.L. et al., 2000, Insect Biochemistry and Molecular Biology 27, 701-709), but the mechanism of this process is not yet well known. Recent studies have revealed that there are sequence similarities among several classes of insect cuticle proteins from distant species (Nakato, H. et al., 1997, Insect Biochemistry and Molecular Biology 27 , 701-709; Rondot, I. et al., 1998, European Journal of Biochemistry 254, 304-312; Andersen, SO, 2000, Insect Biochemistry and Molecular Biology 30, 569-577). Other, non-conservative cuticle proteins are characterized by repetitive structures consisting primarily of hydrophobic amino acid residues that appear to be derived from rigid cuticles. However, epicuticle protein information is still very limited.
[0006]
To form the highly organized layered structure described above, the synthesis of cuticle proteins must be controlled in a highly stage specific manner. Most cuticle proteins are synthesized under the control of two insect hormones, ecdysteroid (20-hydroxyecdysone, 20E) and juvenile hormone (JH) in principle (Riddiford, LM, 1985. Hormone In :. Kerkut, GA, Gilbert, LI (Eds.), Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology, 8. Pergamon Press, New York, pp. 37-84). In larval molting, ecdysteroid pulses in the presence of JH coordinate the timing of protein synthesis. Ecdysteroids interact with receptor proteins (EcR / USP) and differentially induce transcription of a few early genes, resulting in activation of many late genes (Ashburner, M. et al. al., 1974, Cold Spring Harbor Symposium Quantitative Biology 38, 655-662; Talbot, WS et al., 1993, Cell 73, 1323-1337; Fujiwara, H. et al., 1995, Insect Biochemistry and Molecular Biology 25, 845-856; Matsuoka, T., Fujiwara, H., 2000, Development Genes and Evolution 210, 120-128). Many cuticle protein genes can be classified as late genes that are specifically expressed in epidermal cells. Cuticle protein synthesis in insects is of great interest to illustrate tissue-specific and stage-specific gene expression induced by insect hormones.
[0007]
In the process of analyzing the hormonal action of cuticle formation in larval molting, the present inventor searches for an ecdysteroid-dependent cuticle gene using a differential mRNA display method,Bombyx mori Cuticle Protein GlyGlyTyr-repeat 1 （BMCPG1) Was identified as a novel cuticle protein gene. This gene has a large number of Gly-Gly-Tyr (GGY) repeats in the coding sequence and was found to be expressed only in the epidermis in a very limited period after the ecdysteroid pulse.BMCPG1Is a member of the nuclear receptor superfamily and the expression of the other two proteinsFTZF1And dopa decarboxylase (DDCThe expression of these genes was consistent, suggesting that these genes are regulated by cascades activated by ecdysteroids (Hiruma, K., Riddiford, LM, 1990, Developmental Biology 138, 214-224). Sun, G. et al., 1994, Developmental Biology 162, 426-437; Hiruma, K. et al., 1995, Developmental Biology 169, 195-209). Unusual amino acid sequences including epidermis-specific expression, stage-specific expression in late molting, and GGY repeats,BMCPG1From the three unique features ofBMCPG1Suggests that it encodes a cuticle protein synthesized in molting. The inventor alsoBombyx An ecdysteroid-dependent expression pattern and GGY-containing structure similar to BMCPG1DrosophilaEDG91 (Apple, R.T., Fristrom, J.W., 1991, Developmental Biology 146, 569-582).BMCPG1andEDG91 Belong to the same group of epicuticle proteins and may be involved in the solidification of insect cuticles by cross-linking through their GGY structure.BMCPG1In contrast, most larval cuticle protein (LCP) genes are expressed primarily in the post-ecdysial stage (Nakato, H. et al., 1994, Biochimica et Biophysica Acta 1218, 64-74; Hiruma, K. et al., 1997, General and Comparative Endocrinology 107, 84-97).
[0008]
The inventorBMCPG1andEDG91In addition, similar cuticle proteins containing characteristic GGY repeats were searched. as a result,ManducaPutative cuticle protein andC.elegansWas found to have long stretches of GGY or GGY-related (LGY, SGY, AGY, and VGY) repeats. In addition,LocustThe adult cuticle protein LM-ACP 63, 64, and 65 also contained short GGY repeats. The present inventor has also found a GGY motif not only in the cuticle protein but also in the corion protein. The present inventor has found that the amino acids surrounding tyrosine in these proteins are uncharged and relatively low molecular weight amino acids in common. The inventor named the tyrosine motif surrounded by uncharged small molecule amino acids represented by glycine for convenience as the “GGY motif”. In cuticle proteins, it is interesting that most GGY motifs are located near the amino (N) and carboxyl (C) terminal regions in each mature cuticle protein after the signal peptide. A similar structure in which there is a GGY motif in both the N and C terminal regions is also conserved in some silkworm corion proteins (FIG. 2 (B)). Corion forms a hard coat around the egg, reminiscent of an insect cuticle epicuticle. Thus, in insect eggshells and cuticles, these proteins may play an important role in creating stiff structures via the conserved GGY motif.
[0009]
To examine whether the GGY motif is involved in protein cross-linking, peptides containing this motif were synthesized and oxidized with phenol oxidase in tyrosinase or silkworm hemolymph (body fluid). As a result, a significant change in UV absorption indicating the cross-linking of the peptide was observed only in the peptide containing the GGY motif, but not in other peptides not having this motif. As more direct evidence, it was shown by SDS-PAGE that FITC-labeled GGY motif-containing peptides multimerize with tyrosinase or hemolymph. These results indicate that specific crosslinks are formed in the GGY motif upon oxidation. The above results reconstruct in vitro the process in which new cuticles synthesized in molting are first solidified by cross-linking with coexisting phenol oxidase. GGY motifs such as GGYGG are widely found in hard proteins such as eggshell protein, cement protein, silk protein, cell wall protein, and cytokeratin. The present invention indicates that the GGY motif is a conserved motif conserved as a potential target for protein cross-linking by phenol oxidase.
[0010]
The similarities between cuticle formation and eggshell formation are interesting. In silkworm cuticle formation, in each molting, a cuticle protein BMCPG1 having a repeating structure of GGY motif is newly synthesized in the epidermis and secreted under the old cuticle. It is thought that phenol oxidase preexisting in the old cuticle or phenol oxidase coexisting with BMCPG1 crosslinks the protein to form an outer region (epicuticle) of the new cuticle. In silkworm corion formation, a corion protein (Table 1) containing a GGY motif such as AL11 is secreted from follicle cells. Recently, Ashida's group found that hemolymph PO is present in the ovaries of moths and on the surface of eggs after laying (Horii, A. et al., Zool. Sci. 15, 43 (1998)). That is, a hard eggshell may be formed through cross-linking of GGY-containing proteins by phenol oxidase coexisting in the eggshell.
[0011]
In the formation of peptidyl crosslinks between polypeptides containing a GGY motif, it is thought that tyrosine hydroxylation occurs first by tyrosinase or phenol oxidase. Further oxidation of the phenolic ring generates active radicals and forms a covalent bond between 5-5 'DOPA residues. In addition to such peptidyl di-DOPA based bridges, other types of di- or tri-tyrosine linkages can also be formed (Edens, WA et al., J. Cell. Biol. 154, 879). -891 (2001)). In these reactions, a specific sequence containing tyrosine surrounded by small uncharged amino acids as shown in the present invention is essential for forming an open structure where this tyrosine residue is exposed to the enzyme as a target substrate. It is thought that.
[0012]
Similar GGY motifs were found not only in insects but also in various vertebrate and plant proteins. In addition to the cuticle protein, the GGY motif is a coronary protein of several insects, oothecin (Pau, R., 1984, Biochimica et Biophysica Acta 782, 422-428), a JH-dependent protein, and vertebrate epidermal keratin (Steinert , PM et al., 1983, Nature 302, 794-800), barley glycine-rich RNA binding protein (Molina, A. et al., 1997, Plant Molecular Biology 33, 803-810). One of the proteins containing the GGY motif is the adhesion protein found in several byssus (McDowell, LM et al., 1999, The Journal of Biological Chemistry 274, 20293- 20295; Burzio, LA, Waite, JH, 2000, Biochemistry 39, 11147-11153; Burzio, LA et al., 2000, Biochimica et Biophysica Acta 1479, 315-320; Waite, JH, Ann. New York Sc., 1999 875, 301). Most of these proteins are Pro-rich or Gly-rich polyphenol proteins. For example, bivalvesAulacomya ater The major peptides include the tandem array of AGY * GGXK. Here Y * is always found as 3,4-dihydroxyphenylalanine (dopa) (Burzio, L.A. et al., 2000, Biochimica et Biophysica Acta 1479, 315-320). Recent studies have shown that these peptides can be oxidized to form multimers through dopa-dopa (di-dopa) cross-linking (McDowell, LM et al., 1999, The Journal of Biological Chemistry 274). 20293-20295; Burzio, LA, Waite, JH, 2000, Biochemistry 39, 11147-11153; Yu, M. and Deming, TJ, J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 5825). Thus, the fact that the GGY motif is conserved in proteins of various organisms indicates that the present invention can be applied to a wide variety of organisms in vivo. For example, it may be possible to crosslink a polypeptide using endogenous phenol oxidase in vivo by locally administering a protein having a GGY motif in vivo or expressing it in the body using a gene expression vector. It is done.
[0013]
The present invention is particularly preferably used for in vitro polypeptide cross-linking. Unlike S-S bonds, protein cross-linking based on the GGY motif can be easily manipulated. If a GGY motif is added to the N-terminal or C-terminal region of any protein, this protein can be cross-linked by phenol oxidase. For example, an arbitrary polypeptide can be immobilized on a support using such a GGY tag. The GGY motif also provides a new strategy in protein engineering to create proteins with new functions or proteins with extremely hard structures.
[0014]
That is, the present invention relates to a method of crosslinking a polypeptide, and more specifically,
(1) Phenol oxidase in a polypeptide containing one or more tyrosine residues having no charged amino acid and no more than 132 amino acids in the range of 2 or more amino-terminal residues and 2 or more carboxyl-terminal residues A method of crosslinking the polypeptide comprising the step of contacting
(2) The method according to (1), wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of amino terminus-YXX, amino terminus-XYXX, XXYXX, XXYX-carboxyl terminus, and XXY-carboxyl terminus. Wherein “Y” is tyrosine and “X” is an amino acid selected from the group consisting of glycine, alanine, and serine,
(3) The polypeptide is amino-terminal-Y [G / S] G, amino-terminal-GY [G / S] G, [G / S] GY [G / S] G, [G / S] GY [G The method according to (2), comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: / S] -carboxyl terminus and [G / S] GY-carboxyl terminus, wherein “G”, “S”, and “Y ”Are each glycine, serine, and tyrosine, and [G / S] is each independently either glycine or serine,
(4) The polypeptide is [G / S] GY [G / S]_1-2GY [G / S]_1-2GY [G / S]_1-2 (G), “S”, and “Y” are glycine, serine, and tyrosine, respectively, [G / S]_1-2Each independently is a method wherein either glycine or serine is 1 or 2 residues,
(5) A cross comprising a polypeptide containing one or more tyrosine residues having no charged amino acid and no amino acid having a molecular weight of 132 or more in the range of 2 or more residues on the amino terminal side and 2 or more residues on the carboxyl terminal side Linker reagent,
(6) A method for producing a support having a linker for cross-linking of a polypeptide, wherein an amino acid having a molecular weight of 132 or more in the range of 2 or more residues on the amino terminal side and 2 or more residues on the carboxyl terminal side Immobilizing or synthesizing on a support a polypeptide comprising one or more tyrosine residues without acid;
(7) A polypeptide containing one or more tyrosine residues having no charged amino acid and no more than 132 amino acids in the range of two or more amino-terminal residues and two or more carboxyl-terminal residues A fusion protein to which a polypeptide is bound,
(8) a polynucleotide encoding the fusion protein according to (7),
(9) Encodes a polypeptide containing one or more tyrosine residues having no charged amino acid and no amino acid with a molecular weight of 132 or more in the range of two or more residues on the amino terminal side and two or more residues on the carboxyl terminal side An expression vector comprising a polynucleotide, comprising a cloning site into which a polynucleotide encoding the other polypeptide can be inserted so that a fusion protein in which the other polypeptide is bound to the polypeptide can be expressed vector,
(10) A polypeptide containing one or more tyrosine residues having no charged amino acid and no amino acid having a molecular weight of 132 or more in the range of 2 or more residues on the amino-terminal side and 2 or more residues on the carboxyl-terminal side; A cell into which a vector expressing a polynucleotide encoding a fusion protein to which the polypeptide of is bound is introduced,
(11) Neither charged amino acid nor amino acid having a molecular weight of 132 or more is included in the range of 2 or more residues on the amino terminal side and 2 or more residues on the carboxyl terminal side, including a step of increasing or decreasing the amount or activity of phenol oxidase A method of promoting or inhibiting cross-linking of a polypeptide comprising one or more tyrosine residues;
(12) A complex comprising a polypeptide containing one or more tyrosine residues having no charged amino acid and no aminic acid having a molecular weight of 132 or more in the range of two or more amino-terminal residues and two or more carboxyl-terminal residues The method according to (11), wherein the body hardness is increased or decreased;
(13) Aminic acid containing a compound that increases or decreases the amount or activity of phenol oxidase as an active ingredient and having a charged amino acid within a range of 2 residues or more on the amino terminal side and 2 residues or more on the carboxyl terminal side and having a molecular weight of 132 or more A reagent that promotes or inhibits cross-linking of a polypeptide comprising one or more tyrosine residues having no
(14) A complex comprising a polypeptide containing one or more tyrosine residues having no charged amino acid and no amino acid having a molecular weight of 132 or more in the range of two or more residues on the amino terminal side and two or more residues on the carboxyl terminal side The reagent according to (13), which increases or decreases the hardness of the body,
(15) A step of increasing or decreasing the content of tyrosine residues having no charged amino acid and no amino acid having a molecular weight of 132 or more in the range of two or more amino-terminal residues and two or more carboxyl-terminal residues in the polypeptide. A method of promoting or inhibiting cross-linking of the polypeptide by phenol oxidase,
(16) The method according to (15), wherein the hardness of the complex containing the polypeptide is increased or decreased.
(17) Phenol oxidase that increases or decreases the content of tyrosine residues having no charged amino acid and no amino acid having a molecular weight of 132 or more in the range of two or more residues on the amino terminal side and two or more residues on the carboxyl terminal side A modified polypeptide that increases or decreases cross-linking of the polypeptide,
(18) A method for assaying phenol oxidase, comprising:
(A) a polypeptide comprising one or more tyrosine residues having no charged amino acid and no amino acid having a molecular weight of 132 or more in the range of two or more residues on the amino terminal side and two or more residues on the carboxyl terminal side; Contacting the sample;
(B) detecting the cross-linking of the polypeptide,
(C) associating the level of crosslinking with the level of phenol oxidase,
(19) A phenol oxidase assay kit comprising one tyrosine residue having no charged amino acid and no more than 132 molecular weight amino acids in the range of 2 or more amino-terminal residues and 2 or more carboxyl-terminal residues Or a kit comprising a polypeptide comprising more.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention relates to a polypeptide comprising one or more tyrosine residues having no charged amino acid and no amino acid having a molecular weight of 132 or more in the range of two or more residues on the amino terminal side and two or more residues on the carboxyl terminal side. The present invention relates to a method for cross-linking the polypeptide, which comprises a step of contacting with an oxidase. In the present invention, the tyrosine is referred to as “target tyrosine”. “There is no charged amino acid or amino acid with a molecular weight of 132 or more in the range of 2 or more residues on the amino terminal side and 2 or more residues on the carboxyl terminal side” means that 2 on both the amino terminal side and the carboxyl terminal side. This includes the case where there is an uncharged amino acid having a molecular weight of less than 132 above the residue and the case where there is no amino acid in that range. That is, in a polypeptide having a tyrosine terminal, when two or more residues inside the tyrosine are uncharged amino acids having a molecular weight of less than 132, this tyrosine is a target tyrosine in the present invention. In addition, when tyrosine is present within one amino acid from the end of the polypeptide, when the amino acid at the end and two or more amino acids inside tyrosine are uncharged amino acids having a molecular weight of less than 132, the tyrosine is present in the present invention. Is a target tyrosine. When tyrosine is located two or more amino acids from the end of the polypeptide, if two or more amino acids on both sides of the tyrosine are uncharged amino acids with a molecular weight of less than 132, the tyrosine is a target tyrosine in the present invention. is there.
[0016]
Specifically, examples of the polypeptide containing the target tyrosine in the present invention include polypeptides containing the following amino acid sequences. Here, “Y” represents tyrosine and “X” represents an uncharged amino acid having a molecular weight of less than 132. The “amino terminus” and “carboxyl terminus” are described to indicate the direction of the polypeptide, and these ends may be modified by, for example, acetylation, etc., even if they are not amino groups and carboxyl groups themselves. Alternatively, it may be substituted with a protecting group or the like.

[0017]
According to the method of the present invention, a polypeptide comprising a target tyrosine is cross-linked to a phenol group. For example, according to the present invention, a polypeptide containing a target tyrosine is homopolymerized by intermolecular crosslinking between the polypeptides. In addition, when a plurality of types of polypeptides containing the target tyrosine are used, heteropolymeric intermolecular crosslinking occurs. In the case of a polypeptide containing a plurality of target tyrosines in the molecule, the phenol groups of those tyrosines may be cross-linked to cause intramolecular cross-linking. The method of the present invention can also be used to crosslink a polypeptide containing a target tyrosine with a phenol group of a non-peptidic compound. That is, in the present invention, in the presence of phenol oxidase, (a) a tyrosine residue having neither a charged amino acid nor a molecular weight of 132 or more in the range of 2 or more amino-terminal residues and 2 or more carboxyl-terminal residues. Provided is a method of cross-linking a polypeptide comprising a phenol group and the polypeptide comprising one or more and (b) a compound comprising a phenol group. Examples of the compound containing the phenol group include (a) the polypeptide itself (for intramolecular crosslinking), (a) the target tyrosine-containing polypeptide having the same structure as that of the polypeptide or a different structure (for intermolecular crosslinking). And non-peptidic compounds having a phenol group (for example, for modification of a polypeptide via a phenol group or immobilization to a carrier). In the present invention, “polypeptide” refers to a peptide polymer of 2 or more amino acids, and includes a short chain polypeptide such as an oligopeptide to a long chain protein such as a protein. In the present invention, the polypeptide may be linear, branched, or cyclic. In the present invention, the polypeptide includes a salt thereof.
[0018]
As the uncharged amino acid adjacent to tyrosine, an amino acid having a small molecular weight is preferable, and specifically, an uncharged amino acid having a molecular weight of less than 132 (that is, an amino acid has a side chain of less than 58) is particularly suitable. Preferable uncharged amino acids are specifically alanine (Ala), valine (Val), glycine (Gly), serine (Ser), proline (Pro), leucine (Leu), isoleucine (Ile), cysteine (Cys). , And threonine (Thr). More preferably, it is an uncharged amino acid having a molecular weight of less than 120, specifically alanine (Ala), valine (Val), glycine (Gly), serine (Ser), proline (Pro), and threonine (Thr). Can be mentioned. Among them, glycine, alanine, and serine having a molecular weight of less than 110 are particularly preferable. Also, polar amino acids are preferred because they increase the affinity for water. Most preferred amino acids are uncharged and polar amino acids having a molecular weight of less than 110, and specific examples include glycine and serine. In the present invention, an amino acid sequence containing a target tyrosine is referred to as a “GGY motif”. However, this motif is not limited to the one having the “GGY” sequence itself, and is a generic term for the motifs of amino acid sequences constituting the target tyrosine in the present invention. is there.
The amino acid contained in the polypeptide may be modified. Modification is not limited, and examples include addition of a sugar chain, methylation, acetylation, phosphorylation, and hydroxylation. For example, the tyrosine residue may be dopa (3,4-dihydroxyphenylalanine). Moreover, dopaquinone may be sufficient. These modified tyrosine are also collectively referred to as tyrosine in the present invention.
[0019]
More preferably, the polypeptide comprising the target tyrosine is [G / S]_1-2GY [G / S]_1-2A polypeptide comprising one or more tyrosine residues having the amino acid sequence of G. Here, [G / S] means each independently either glycine or serine. [G / S]_1-2Means that there are 1 or 2 residues of either glycine or serine independently, specifically G, S, GG, GS, SG, or SS To do. As above, amino acid residues in the polypeptide may be modified. More preferably, the polypeptide is a polypeptide comprising one or more tyrosine residues having the amino acid sequence of GGYGG (SEQ ID NO: 51) or GGYSG (SEQ ID NO: 52). Most preferably, the polypeptide is a polypeptide comprising one or more tyrosine residues having the amino acid sequence of GGYGG.
[0020]
The polypeptide containing the target tyrosine of the present invention preferably contains two or more target tyrosine, more preferably three or more, more preferably four or more, more preferably five or more in one molecule. Since a plurality of tyrosine contained in a polypeptide becomes a cross-linking target, the polypeptide can be cross-linked more reliably or in a multiple manner. In particular, when the formation of a multimeric protein complex due to cross-linking between multiple molecules is expected, 3 or more target tyrosine in the polypeptide, more preferably 4 or more, more preferably 5 or more, More preferably, 6 or more are included. When two or more polypeptides containing a target tyrosine are cross-linked, it is preferred that at least one of these polypeptides contains three or more target tyrosines, and three for all polypeptides to be cross-linked More preferably, the above target tyrosine is included.
[0021]
When two or more target tyrosines are included, it is preferable that those tyrosines form the cluster adjacently. For example, a polypeptide containing 2, 3, 4, or 5 residues of target tyrosine via 2, 3, 4, or 5 amino acids is preferably used for the cross-linking of the present invention. The amino acid between the target tyrosine is preferably an uncharged amino acid, more preferably an uncharged amino acid having a low molecular weight. For example, alanine (Ala), valine (Val), glycine (Gly), serine (Ser ), Proline (Pro), leucine (Leu), isoleucine (Ile), cysteine (Cys), and threonine (Thr). Among them, glycine, alanine, and serine having a small molecular weight are preferable. For example, as a preferred polypeptide, [G / S]_1-2GY [G / S]_1-2GY [G / S]_1-2GY [G / S]_1-2Polypeptides containing G are mentioned. More preferably GGY [G / S] [G]_1-2Y [G / S] [G]_1-2Y [G / S] [G]_1-2A polypeptide comprising Where [G]_1-2Indicates that glycine is 1 or 2 residues. Particularly preferred polypeptides include GGYGGYGGGYGG, GGYGGYSGGYGG, GGYSGGYGGYGG, GGYGGGYGGYGG, GGYGGYGGYSG, GGYGGYSGGYSG, GGYSGGYSGGYSG, or GGYSGGYSGGYGG (SEQ ID NOs: 53 to 60 in order). More preferably, GGYGGYSGGYGGYGG, GGYSGGYGGYGGGYGG, GGYGGYGGGYGGYGG, GGYGGYGGYSGGYSG, GGYGGYSGGYSGGYSG or GGYSGGYSGGYSGGYGG (SEQ ID NO sequentially: 61-66), a polypeptide comprising a, for example GGYGGYSGGYGGYGGGYGG, GGYSGGYGGYGGGYGGYGG, GGYGGYSGGYGGYGGGYGGYGG, GGYGGYGGYSGGYSGGYGG, GGYGGYSGGYSGGYSGGYGG or GGYGGYGGYSGGYSGGYSGGYGG (SEQ ID NO: in sequence: 67-72). Such a cluster of target tyrosines may be contained at a plurality of positions in one polypeptide. For example, polypeptides having such target tyrosine clusters at the N-terminus and C-terminus are preferably used in the present invention.
[0022]
As the phenol oxidase, a desired enzyme can be used as long as it has an activity of crosslinking the polypeptide using the target tyrosine in the polypeptide as a substrate. In the present invention, the phenol oxidase may further have other activities. Specific examples of enzymes that can be used in the present invention include catechol oxidase (EC 1.10.3.1) and monophenol monooxygenase (EC 1.14.18.1). Specific examples include tyrosinase, phenolase, monophenol oxidase, cresolase, catechol oxidase, polyphenolase, DOPA oxidase, polyphenol oxidase, tyrosine-DOPA oxidase, laccase, and the like (Dawson, CR and Tarpley, WB The copper oxidases.In: Sumner, JB and Myrback, K. (Eds.), The Enzymes, 1st ed., Vol. 2, Academic Press, New York, 1951, p. 454-598; Lerch, K., Proc. Natl Acad. Sci. USA 75 (1978) 3605-3609; Malmstrom, BG et al., Copper-containing oxidases and superoxide dismutase.In: Boyer, PD (Ed.), The Enzymes, 3rd ed., Vol. 12, Academic Press, New York, 1975, p. 507-579; McIntyre, RJ and Vaughan, PFT, Biochem. J. 149 (1975) 447-461; Patil, SS and Zucker, M., J. Biol. Chem 240 (1965) 3938-3943; Pomerantz, SH, J. Biol. Chem. 238 (1963) 2351-2357; Robb, DA Tyrosinase. In: Lontie, R. (Ed.), Copper Prot eins and Copper Enzymes, vol. 2, CRC Press, Boca Raton, FL, 1984, 207-240; Brown, FC and Ward, DN, J. Am. Chem. Soc. 79 (1957) 2647-2648; Dawson, CR and Tarpley, WB The copper oxidases.In: Sumner, JB and Myrback, K. (Eds.), The Enzymes, 1st ed., vol. 2, Academic Press, New York, 1951, p. 454-498; Gregory, RPF and Bendall, DS, Biochem.J. 101 (1966) 569-581; Mason, HS, Nature (Lond.) 177 (1956) 79-81; Mayer, AM and Harel, E., Phytochemistry 18 (1979) 193 -215; Patil, SS and Zucker, M., J. Biol. Chem. 240 (1965) 3938-3943; Pomerantz, SH, J. Biol. Chem. 242 (1967) 5308-5314; Robb, DA "Tyrosinase" In: Lontie, R. (Ed.), Copper Proteins and Copper Enzymes, vol. 2, CRC Press, Boca Raton, FL, 1984, p. 207-240). Peroxidase (E.C. 1.11.1.7) can also be suitably used (Lee, B.P. et al., Polymer Preprints, 2001, 42, 151-152). The activity of crosslinking the polypeptide using the target tyrosine in the polypeptide as a substrate is, for example, as described in the Examples, by reacting the polypeptide having the target tyrosine of the present invention as a substrate and measuring the absorbance of the reaction product or electrophoresis. It can be detected by such as.
[0023]
In the present invention, tyrosinase can be particularly preferably used. For example, tyrosinase derived from prokaryotes, fungi, or higher eukaryotes can be preferably used. Mushroom tyrosinase is commercially available (eg, Sigma). Also suitable are tyrosinases derived from mammals. The tyrosinase may be a recombinant. The tyrosinase gene has already been cloned in various organisms (J. Gen. Microbiol. 129, 2703-2714 (1983); Gene 37, 101-110 (1985); US Pat. No. 4,898,814). In addition, various phenol oxidases possessed by insects and the like can be suitably used. In particular, in the present invention, phenol oxidase present in insect haemolymph (body fluid) can be preferably used. Pro-phenol oxidase contained in insect body fluid is thought to be activated in vivo by microbial infection or wounding (Asano, T. & Ashida, M., J. Biol. Chem. 276, 11100- 11112 (2001)) can be activated by leaving the collected bodily fluid or treating it with an organic solvent (Hideki Onishi et al., Insect Biochemistry and Molecular Biology, Nagoya University Press, 1995) , pp. 447-468). In addition, a laccase type phenol oxidase (Sugumaran M. et al., Arch. Insect Biochem. Physiol. 19, 271-281 (1992)) can also be used in the present invention. The phenol oxidase used in the present invention may or may not be purified. For example, a desired sample containing phenol oxidase in a biological fluid, body cavity fluid, blood, lymph, secretion, or a biological sample lysate or extract can be used.
[0024]
The step of bringing phenol oxidase into contact with the polypeptide containing the target tyrosine causes cross-linking of the polypeptide. Crosslinking can occur within a molecule, with polypeptides having multiple tyrosine residues between molecules or within one molecule. Contact between the polypeptide and phenol oxidase is usually carried out in a suitable aqueous solution under conditions that do not inhibit the reaction by phenol oxidase. The pH is usually 5 to 10, preferably 6 to 9. The aqueous solution may contain a desired pH buffer. In this case, for example, a phosphate buffer or a Tris buffer can be used. Phenol oxidase may be dissolved in the reaction solution, or may be immobilized on a support. The reaction temperature is not particularly limited and can be appropriately adjusted according to the temperature characteristics of the phenol oxidase used. The reaction is carried out, for example, between 2 ° C. and 70 ° C., preferably between 12 ° C. and 60 ° C., more preferably between 15 ° C. and 40 ° C., for example at room temperature. The reaction time is usually 5 minutes to 50 hours. In order to stop the reaction, for example, the enzyme and the polypeptide may be separated, or the enzyme may be deactivated by adding SDS or heating the reaction system. The method of the invention produces a cross-linked polypeptide. The crosslinking method of the present invention is also a method for producing a crosslinked polypeptide.
[0025]
The present invention also provides a crosslinker reagent comprising a polypeptide having the target tyrosine of the present invention. That is, the polypeptide having the target tyrosine of the present invention becomes a substrate for crosslinking with phenol oxidase. The crosslinker reagent of the present invention is used to crosslink the polypeptide to various polypeptides, to polymerize the polypeptide itself contained in the crosslinker reagent, or to include the polypeptide contained in the crosslinker reagent. Is useful for indirectly cross-linking two or more polypeptides containing the target tyrosine. Such linker polypeptides include, for example, “N-terminal-Y- [X]_n-YC-terminal ”polypeptides are included, where X is an uncharged amino acid having a molecular weight of less than 132 and n is 2 or more. As the amino acids of X, one by one, for example, glycine or Serine is preferred, for example, a polypeptide in which all X is glycine (polypeptide having tyrosine at both ends of homoglycine), etc., or any polypeptide containing the target tyrosine described in this specification, etc. The crosslinker reagent can be a composition containing a desired solvent and / or solute in addition to the above polypeptide, such as water, an organic solvent such as alcohol, a salt such as sodium chloride, a desired preservative, a suspension. Agents, stabilizers, etc. Alternatively, the crosslinker reagent may be in a dry state. The crosslinker reagent of the present invention is useful, for example, as a raw material for the production of a new peptide polymer, and may be free (free) or immobilized on a support or carrier. Since the polymerization reaction is carried out enzymatically, there is no need to use toxic additives or cross-linking agents, and since these polymers are peptidic, they are new biodegradable plastics that are degraded by microorganisms. The present invention is useful for the production of new biomaterials.
[0026]
The present invention also provides a support on which a polypeptide having the target tyrosine of the present invention is immobilized. Immobilized means that the polypeptide is bound to a support by covalent or non-covalent bonds. Examples of non-covalent bonds include hydrogen bonds, coordination bonds, ionic bonds, hydrophobic interactions (hydrophobic bonds), and intermolecular forces (van der Waals forces). The polypeptide and support are preferably covalently linked. The polypeptide can be immobilized on a support by a desired immobilization method. Polypeptides can be covalently linked using functional groups present on the support, for example. Examples of the functional group include, but are not limited to, a hydroxyl group, an amino group, an aldehyde group, a carboxyl group, a thiol group, a hydroxyl group, a silanol group, an amide group, an epoxy group, a succinimide group, and a phenol group. Examples of the covalent bond include ester bond, ether bond, amino bond, amide bond, sulfide bond, imino bond, disulfide bond and the like. Examples of the covalent bond method include a cyanogen bromide activation method, an acid azide derivative method, a condensation reagent method, a diazo method, and an alkylation method. For example, the support surface can be treated with various silane coupling agents having an amino group, an aldehyde group, an epoxy group or the like. Epoxies form covalent bonds with amine and thiol groups. Carbonyldiimidazole is covalently bonded to an amine. Further, for example, a method is known in which a cysteine is included at the N-terminal or C-terminal of a polypeptide and covalently bonded to a support via the site and a maleimide group. In addition, if a support containing p-phenylene diisothiocyanate (DITC) is used, the α-amino group at the N-terminal site of the polypeptide or the ε-amino group of the lysine residue is covalently immobilized on DITC. Carriers such as cross-linked agarose modified with N-hydroxyl succinimide ester and epoxy-coated carriers are known. Alternatively, the polypeptide can be immobilized by phenol oxidase using the phenol group on the surface of the carrier. Such carriers include agarose or agarose derivatives into which phenol groups have been introduced, and polyethylene glycol hydrogels modified with tyrosine or DOPA (Lee, BP et al., “Enzymatic and non-enztmatic pathways to formation od DOPA-modified PEG hydrogels "Trans. Soc. Biomat., 24, 2001; Lee, BP et al., Polymer Preprints, 2001, 42, 151-152; Deming, TJ Curr. Op. Chem. Biol. 1999, 3, 100).
[0027]
For the purpose of immobilizing a relatively short polypeptide, a polypeptide containing the target tyrosine of the present invention can be synthesized by chemical synthesis from an amino group or the like bound to a support. Various methods for synthesizing polypeptides are known. For example, as protection of the α-amino group and the side chain functional group, the Boc method in which the α-amino group is protected with t-butoxycarbonyl and the side chain functional group is protected with a benzyl alcohol protecting group, and the α-amino group is Examples include Fmoc method in which 9-fluorenylmethoxycarbonyl is used to protect a side chain functional group with a t-butyl alcohol protecting group. The acid amide bond formation reaction uses a dehydrating agent to create a protected amino acid anhydride, a symmetrical anhydride method that uses this for the condensation reaction, and alkyl alcohol formate to act on the protected amino group to form a mixed acid anhydride and condense Condensation using an active ester such as p-nitrophenol (HONp), pentafluorophenol (HOPfp), N-hydroxysuccinimide (HOSu), or N-hydroxybenzotriazole (HOBt) In addition to the active ester method, the azide method, the DCC-additive method in which an additive such as HOBt is combined with dicyclohexylcarbodiimide (DCC), the acid halide method, and others are known (E. Gross, J. Meienhofer ed ., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Academic Press, New York, 1979; New Chemistry Laboratory 1, Japan Biochemical Society, Tokyo Chemical Doujin, Tokyo, 1992, pp.3-44)Polypeptides can be synthesized in liquid and solid phases, but they can be synthesized directly on a support using solid phase methods (SBH Kent, Annu. Rev. Biochem., 57, 957, 1988; E. Atherton, RC Sheppard, "Solid Phase Peptide Synthesis, a Practical Approach", IRL Press, Oxford, 1989). Techniques for synthesizing polypeptides on microtiter plates, small polyethylene pins, or glass have already been developed (AM Bray et al., Tetrahedon Lett., 31, 5811, 1990; G. Schnorrenberg, H. Gerhard Tetrahedon, 45, 7759, 1989; SPA Fodor et al., Science, 251, 767, 1991). For example, a desired polypeptide can be synthesized on a substrate such as glass or silicon using a light-sensitive protecting group and photolithography.
[0028]
The polypeptide immobilized on the support is not limited as long as it includes the target tyrosine of the present invention, and may be a polypeptide having biological activity, such as an enzyme or a receptor, or a special spacer or tag. It may be a polypeptide having no activity. The spacer polypeptide immobilized on the support is useful as an intermediary for immobilizing the desired polypeptide on the support through cross-linking with other desired polypeptide containing the target tyrosine. For example, a desired protein can be immobilized on a support by immobilizing a fusion protein of a target tyrosine-containing polypeptide described below and another polypeptide on the support via this tyrosine. For example, immobilization of an enzyme on a support has important biotechnological significance, and various enzymes immobilized on a support are used in industrial, research, and clinical situations. According to the method of the present invention, a desired enzyme or coenzyme can be immobilized on a support with phenol oxidase. Alternatively, an antibacterial / antifungal function can be added to a desired material by immobilizing a protein having antibacterial or antifungal activity. It is also possible to manufacture a biosensor in which a protein that functions as a sensor is immobilized. Since the cross-linking reaction has specificity for the target tyrosine of the present invention, even if other polypeptides are mixed in the sample containing the polypeptide to be immobilized, the polypeptide having the target tyrosine is preferentially immobilized by cross-linking. It becomes. Therefore, it is also excellent in that the immobilization step can be performed without highly purifying the target polypeptide. In addition, if a cell expressing a polypeptide containing a target tyrosine described later on the cell surface is used, the cell can be immobilized on a support. The cells are not limited, and prokaryotic cells and eukaryotic cells can be used. Organelles can also be immobilized using this method. For example, various biological substances can be synthesized using immobilized microorganisms.
[0029]
In the present invention, the support is not limited as long as it is a solid or semisolid insoluble in an aqueous solution. The support is preferably chemically stable and does not exhibit significant biotoxicity. For example, a desired material including a synthetic or natural organic polymer compound, inorganic materials such as glass, silica gel, alumina, and activated carbon, and polysaccharides such as cellulose and chitin can be used as the support. The support may be in any desired form, such as a membrane, fiber, powder, bead, hollow fiber, or porous shape.
[0030]
Examples of the support made of a polymer compound include a polymethyl methacrylate polymer, a polyacrylonitrile polymer, a polysulfone polymer, a vinyl polymer, a polyolefin polymer, a fluorine polymer, and a polyester polymer. , Polyamide polymer, polyimide polymer, polyurethane polymer, polyacrylic polymer, polystyrene polymer, polyketone polymer, polyphenol polymer, silicon polymer, cellulose polymer, chitosan heavy polymer Examples include coalescence. Specifically, polysaccharides such as agarose, cellulose, chitin, chitosan, sepharose, dextran and their derivatives, polyester, polyvinyl chloride, polystyrene, polysulfone, polyether sulfone, polypropylene, polyvinyl alcohol, polyallyl ether sulfone, Examples thereof include polyacrylic acid ester, polymethacrylic acid ester, polycarbonate, acetylated cellulose, polyacrylonitrile, polyethylene terephthalate, polyamide, silicon resin, fluororesin, phenol resin, polyurethane, polyether urethane, polyacrylamide, and derivatives thereof. These polymer materials can be used alone or in combination of two or more.
[0031]
Examples of the support to which the polypeptide containing the target tyrosine of the present invention is bound include a column carrier on which the polypeptide is immobilized. For example, the polypeptide can be immobilized on Sepharose beads and used for various chromatography. By immobilizing an antibody, receptor protein, or ligand on such a column carrier via the target tyrosine of the present invention and performing affinity chromatography, it is possible to screen for factors that bind to these proteins. is there.
[0032]
In addition, examples of the support to which the polypeptide containing the target tyrosine of the present invention is bound include a polypeptide array (also referred to as a protein chip) in which a large number of the polypeptides are bound on a substrate-like support at high density. Can do. In recent years, with the progress of genome science, a large number of types of genes and the proteins encoded by them have been identified, and protein chips are being developed to analyze the expression and functions of these proteins. A high-density polypeptide array (protein chip) refers to a substrate on which a large number of polypeptides are immobilized in a small area. A tag containing target tyrosine is added to the polypeptide to be immobilized on the substrate, and this can be immobilized on a phenol group on the substrate according to the method of the present invention. The substrate can also be coated with an oligopeptide containing a target tyrosine and used as an anchor. By increasing the hydrophilicity of the polypeptide used for coating, it is possible to keep the substrate hydrated and prevent the protein to be immobilized later from being denatured (MacBeath, G. & Schreiber, SL, Science, 289, 1760-1763, 2000). In order to produce a protein chip, for example, a polypeptide containing a target tyrosine can be immobilized by a spot method on a glass slide or silicon substrate coated with the anchor peptide as described above. In this case, the solutions containing the polypeptides are arranged on the substrate in a small volume of several nl to several pl with an apparatus called a spotter or an arrayer and fixed to a specific region on the substrate. Examples of the spot method include a pin (or pen) method by mechanical contact with the solid phase of the pin tip, an ink jet method using the principle of an ink jet printer, and bubbles are generated by heating in a spotter. There are known a bubble ejection method in which a sample is ejected using pressure, a capillary method using a capillary tube, and the like. After the spot treatment, post-treatment such as cross-linking with phenol oxidase, blocking of the substrate surface, and washing is performed.
[0033]
Glass is usually used as the substrate of the high-density polypeptide array, but it may be polystyrene, silicon, nylon, nitrocellulose, or other polymers. High density polypeptide arrays have a density of 1 cm² Generally at a density greater than about 60, more preferably greater than about 100, more preferably greater than about 600, more preferably greater than about 1,000, about 5,000, about 10,000, or about 40,000, most preferably greater than about 100,000. An array of polypeptide molecules attached (total area on which peptides are immobilized is 1 cm)² May be smaller). The chain length of the polypeptide molecule is not particularly limited, and may be a relatively long polypeptide such as a naturally occurring protein or a fragment thereof, or an oligopeptide having a length of several amino acids to several tens of amino acids. Also good. Because the surface area of the array is small, the environment between each probe (polypeptide on the array) is extremely uniform, and a very large amount of probes can be reacted simultaneously. By using this polypeptide array, for example, various protein phosphorylation assays, analysis of low molecular compounds targeted by proteins, and the like can be performed. The high-density polypeptide array of the present invention is suitably used in proteome analysis.
[0034]
The present invention also relates to a fusion protein of a polypeptide containing the target tyrosine and another polypeptide. Such a fusion protein can be produced by peptide synthesis or expression of recombinant DNA. In such a fusion protein, the polypeptide portion containing the target tyrosine functions as a peptide tag for crosslinking. A fusion protein may be a fusion of two or more polypeptides. There is no restriction | limiting in particular as another polypeptide to fuse | melt. Any desired polypeptide to be cross-linked can be used. Specific examples include a desired enzyme, a cell membrane protein, an antibody or a fragment thereof, a receptor, a fragment containing a receptor ligand binding site, a ligand, a hormone, and other physiologically active peptides. For example, an antibody molecule having an enhanced function can be constructed by fusing a polypeptide containing a target tyrosine to the end of the constant region of an antibody fragment and crosslinking the antibodies through this. Moreover, a multifunctional protein complex can be designed by introducing target tyrosine into different functional proteins and cross-linking them with each other. Such protein complexes can be applied to the creation of nanomachines. The position of the polypeptide comprising the target tyrosine in the fusion protein may be N-terminal, C-terminal, and / or internal to the fusion polypeptide, but is preferably located at the N-terminal or C-terminal. For example, a cell expressing a target tyrosine on the cell surface can be obtained by fusing a polypeptide containing the target tyrosine to the extracellular domain of a protein expressed on the cell surface (described later). Such a cell can add a desired polypeptide containing a target tyrosine to the cell surface by using the method of the present invention, and can impart a new function to the cell through this. In addition, when immobilizing a functional protein on a support or the like, the target tyrosine is fused to the protein via a spacer peptide of an appropriate length without significantly affecting the activity of the original protein. It can be immobilized on a support or the like.
[0035]
For example, in the fusion protein of the present invention, GGYGG (SEQ ID NO: 51) or GGYSG (SEQ ID NO: 52) or a repetitive sequence thereof is added to the N-terminus, C-terminus, or protein chain of the desired protein. Contains protein. The fusion protein of the present invention includes, for example, [G / S] at an arbitrary position of a desired protein._1-2GY [G / S]_1-2GY [G / S]_1-2GY [G / S]_1-2Examples include proteins to which a polypeptide containing G is added. More specifically, the polypeptide to be added includes GGG [G / S] [G]_1-2Y [G / S] [G]_1-2Y [G / S] [G]_1-2For example, GGYGGYGGGYGG, GGYGGYSGGYGG, GGYSGGYGGYGG, GGYGGGYGGYGG, GGYGGYGGYSG, GGYGGYSGGYSG, GGYSGGYSGGYSG, or GGYSGGYSGGYGG (in which SEQ ID NOs: 53-60) can be exemplified. This fusion protein can be enzymatically immobilized on a desired support having a phenol group on the surface via a target tyrosine in the fusion protein.
[0036]
The present invention also relates to a polynucleotide encoding the above fusion protein. The polynucleotide may be DNA or RNA. This polynucleotide is useful for expression of a fusion protein by being incorporated into an appropriate expression vector. Examples of expression vectors include plasmid vectors, PCR amplified fragments, phage vectors, virus vectors and the like. Examples of virus vectors include, but are not limited to, retrovirus vectors, lentivirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, and the like. Non-viral vectors can be directly administered to cells or tissues as naked DNA, or mixed with transfection reagents such as LipofectAMINE (Gibco / Life Technologies) or Fugene, DOTAP, or DOSPER (Roche). It may be administered. The present invention provides a method for producing the fusion protein of the present invention, comprising the steps of introducing the polynucleotide into a cell for expression, and recovering the fusion protein expressed from the cell or its culture supernatant.
[0037]
In addition, an expression vector containing a polynucleotide encoding a polypeptide containing a target tyrosine can be constructed so that the fusion protein can be expressed. This vector is an expression vector comprising a polynucleotide that encodes a polypeptide comprising a target tyrosine, and encodes the other polypeptide so that a fusion polypeptide of the polypeptide and the other polypeptide can be expressed. A vector having a cloning site into which a polynucleotide can be inserted. Such vectors are provided with cloning sites for inserting foreign genes 5 ′ and / or 3 ′ adjacent to the coding region of the polypeptide containing the target tyrosine. By inserting a foreign gene encoding a desired protein in-frame, a fusion protein between the protein encoded by the foreign gene and a polypeptide containing the target tyrosine can be expressed. The cloning site includes, for example, a restriction enzyme recognition sequence. A so-called multicloning site containing a plurality of restriction enzyme recognition sequences may be used. The expression vector may be any expression vector such as a plasmid, phage, or viral vector. The expression vector of the present invention may specifically be a vector comprising a promoter, a transcription initiation site, a coding sequence of a polypeptide containing a target tyrosine, a foreign gene cloning site, and a transcription termination sequence. Alternatively, it may be a vector comprising a promoter, a transcription initiation point, a foreign gene cloning site, a coding sequence of a polypeptide comprising a target tyrosine, a stop codon, and a transcription termination sequence. If there is no translation initiation codon at the beginning of the protein coding sequence, a translation initiation codon is inserted as appropriate. The base sequence around the translation initiation codon can be a sequence suitable for translation initiation (Kozak, M. Cell, 1986, 44: 283-92). As the promoter, a desired promoter that functions in a host cell can be used. For example, in the case of bacteria, lac promoter, trp promoter, trp-lac hybrid (tac) promoter, etc. can be exemplified. Further, strong transcription can be induced by inducibly expressing each RNA polymerase in a host cell using a recognition sequence such as T7 RNA polymerase or T4 RNA polymerase as a promoter sequence. When a higher eukaryote is used as a host cell, for example, a promoter derived from an endogenous gene such as an actin promoter or a virus-derived promoter that functions in the host can be used. Examples of mammalian cells include SV40 promoter, CMV promoter, MLV-LTR promoter, EF1 (Elongation Factor-1) promoter, β-actin promoter and the like. The expression vector may contain other genes such as a marker gene for selecting cells into which the vector has been introduced.
[0038]
The present invention also relates to a cell into which a vector expressing a polynucleotide encoding a fusion protein of a polypeptide containing a target tyrosine and another polypeptide is introduced. Such transformed cells are useful for producing the fusion protein of the present invention. Alternatively, the cell itself expressing the fusion protein can also be used as a cell with a new function added. The transformed cells of the present invention include prokaryotic cells and eukaryotic cells. Specifically, microorganisms such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Actinomyces, Corynebacterium, Cyanobacteria, Lactobacillus, Lactococcus, Listeria, Salmonella, Staphylococcus aureus, Vibrio, Agrobacterium, and yeast, Arabidopsis thaliana, tobacco, rice Plant cells derived from tomato, potato, wheat, cedar, cypress, etc., and animal cells derived from Drosophila, silkworm, mouse, rat, monkey, human and the like. The expression vector can be appropriately selected according to the target host cell.
[0039]
Examples of the transformed cell of the present invention include cells that secrete the fusion protein. The present invention comprises a step of introducing a vector expressing a polynucleotide encoding a fusion protein in which a polypeptide containing the target tyrosine of the present invention is bound downstream of a secretion signal into a cell, and expressing the expressed fusion protein in the cell. A method for producing the fusion protein, comprising the step of recovering from the culture supernatant. The obtained fusion protein is used as a substrate for the crosslinking method of the present invention. For example, the above fusion protein is useful as a crosslinker reagent of the present invention.
[0040]
The transformed cells of the present invention include cells that express the fusion protein on the cell surface. Such cells can be produced, for example, by introducing into a cell a vector that expresses a polypeptide containing the target tyrosine as a fusion protein with a transmembrane protein. For example, in the case of a transmembrane protein in which the N-terminus of the mature protein transferred to the membrane is located outside the cell, a fusion protein in which the polypeptide containing the target tyrosine of the present invention is inserted between the signal peptide and the mature protein is used. By expressing in cells, cells in which the target tyrosine is presented extracellularly can be created. The polypeptide can be immobilized on the surface of the cell by adding another polypeptide containing the target tyrosine from the outside and treating the cell with phenol oxidase. For example, by producing a fusion polypeptide in which the target tyrosine of the present invention is added to an antibody against a tumor marker or an antigen-binding fragment thereof, and cross-linking this to the cell surface, a cell that specifically recognizes the tumor can be created. . For example, tumor cells can be specifically attacked by expressing another gene that gives the cells a cytotoxic effect. A cell that expresses a polypeptide containing a target tyrosine on the cell surface can be immobilized on a support or the like via this tyrosine. The immobilized cells can be applied to industrial production of biochemical substances, or to clinical practice in disease treatment or regenerative medicine. In addition, cells that express a polypeptide containing the target tyrosine on the cell surface can adhere to each other via these polypeptides.
[0041]
The present invention also relates to a method for promoting or inhibiting cross-linking of a polypeptide containing a target tyrosine of the present invention, which comprises a step of increasing or decreasing the amount or activity of phenol oxidase. By this method, the hardness of the crosslinked complex containing the polypeptide can be increased or decreased. The hardness of the composite means the difficulty of deformation or destruction of the composite with respect to the force applied to the composite, and the degree of deformation when a force such as pushing, pulling, or shearing is applied to the composite body, Alternatively, it can be determined by measuring the force up to a certain deformation or failure. Moreover, this invention relates to the composition which accelerates | stimulates or suppresses bridge | crosslinking of the polypeptide containing the target tyrosine in this invention which contains the compound which raises or reduces the quantity or activity of a phenol oxidase as an active ingredient. The amount or activity of phenol oxidase can be increased by adding phenol oxidase or expressing a gene encoding phenol oxidase. It is also possible to activate phenol oxidase by adding a transactivator that activates phenol oxidase (Lee, et al., Gene 65, 71 (1988); Bernan, et al., Gene 37, 101 (1985); Chen, et al., J. Biol. Chem. 268, 18710 (1993); WO95 / 13386). It is also known that pyrimidine-3-oxide derivatives such as minoxidil promote tyrosinase activity (Rushton, DH et al., Clin. Exp. Dermatol., 14, 40-46 (1989) ; Japanese Patent No. 2999163). In addition, glycoconjugate peptidoglycan in squid ink has been reported to enhance tyrosinase activity (Naraoka T. et al., Food Sci. Technol. Res., 6, 171-175 (2000); Uchizawa et al. , Biochemistry, 67, 734 (1995)). By cross-linking a polypeptide according to the present invention in the presence of these activators, the polypeptide can be firmly fixed or polymerized.
[0042]
The amount or activity of phenol oxidase can be reduced by removing phenol oxidase from the reaction system, suppressing the expression of phenol oxidase, or adding an inhibitor of phenol oxidase. Suppression of the expression of phenol oxidase can be carried out, for example, by introducing an antisense nucleic acid of a phenol oxidase gene or gene targeting of a phenol oxidase gene. As an inhibitor of phenol oxidase, for example, an antioxidant such as vitamin C, proanthocyanidins, or derivatives thereof can be used. Phenol oxidase is inhibited by CO or phenylthiourea. Peroxidases include para-aminobenzoic acid, azide, cyanide, cyclopropanone, L-cysteine, dichromate, ethylenethiourea, hydroxylamine , Sulfides, vanadate, and divalent metal ions such as Cd, Co, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb (Handbook of Enzyme Inhibitors, Part A, 2nd Ed, Helmward Zollner, Ed, VCH, Weinheim, Germany (1993)). Various compounds and compositions have been reported as tyrosinase inhibitors. Typical tyrosinase inhibitors include arbutin contained in cowberry, pear, and alpine plant leaves, kojic acid made from Koji fungi, ellagic acid, and resorcin. (Resorcin) derivatives (for example, 4-n-butylresorcinol) and the like. It is also inhibited by compounds that form complexes with copper, such as copper metallothionein (copper chelating agents, etc.), benzoic acid, and cyanide (Duckworth, HW and Colman, JE, J. Biol. Chem., 245, 1613-1625 (1970)). Inhibitory effect of phenol oxidase on cinnamic acid or microbial esterase extract has been reported (Kermasha, S. et al., J. Agric. Food Chem. 41, 526-531, 1993; Walker, JRL 1969, Phytochem. 8, 561-566; 2nd Inertnational Electronic Conference on Synthetic Organic Chemistry (ECSOC-2), 1998, dp138-139). Moreover, the inhibitory effect of tyrosinase activity has been reported to plant extracts such as peonies (paeoniae), saxifrage and licorice (glycyrrhiza). A potent tyrosinase inhibitory effect has also been reported on tree extracts having a 4-substituted resorcinol skeleton (Kuniyoshi Shimizu, Journal of the Wood Society, 47, 5 (2001)). By crosslinking a polypeptide according to the present invention in the presence of these inhibitors, the level of crosslinking of the polypeptide can be reduced.
[0043]
The cross-linking promoting or inhibiting composition of the present invention comprising as an active ingredient a compound that increases or decreases the amount or activity of phenol oxidase increases or decreases the hardness of a complex cross-linked with a polypeptide containing the target tyrosine. Composition (ie, a curing agent or a curing inhibitor). These compositions are useful as industrial reagents in the production of polypeptide-containing polymers, and as pharmaceuticals or cosmetics that promote or suppress tissue hardening.
[0044]
The composition of the present invention may be the active ingredient itself, or water or an alcohol solvent such as ethanol may be added as necessary. There is no restriction | limiting in dosage form, Arbitrary dosage forms, such as a liquid form, a powder form, a granular form, a tablet form, an emulsion, a cream, a pack, and an ointment, are employable. In formulating, in addition to blending the active ingredient alone, any auxiliary can be used as necessary. For example, other active substances such as phenol oxidase or phenol oxidase inhibitor, or other useful substances can be used. It may be formulated with a substance. In that case, the synergistic action with the other active ingredients used in combination may lead to a superior use effect than would normally be expected. Specifically, for example, astringents such as citric acid, tartaric acid, lactic acid, or salts thereof, bactericidal / antibacterial agents such as benzoic acid, distearylmethylammonium chloride, or sorbic acid, plant or animal extracts, and ultraviolet absorbers , Moisturizers such as collagen, vitronectin, or fibronectin, activators such as riboflavin, pyridoxine, nicotinic acid, or pantothenic acid, and the like can be appropriately combined. In the production of the composition of the present invention, phenol oxidase, which is an active ingredient, or a compound that promotes or suppresses its amount or activity is added at any stage of the production process of the composition using general raw materials. That's fine. The compounding ratio of the active ingredient can be appropriately changed, but is preferably about 0.01 to 30% by weight, preferably about 0.05 to 10% by weight. The composition of the present invention is added to cosmetics, quasi-drugs or pharmaceuticals applied to the skin or hair, etc. for the purpose of imparting an effect of promoting or preventing tissue hardening, as well as protein cross-linking in a desired product. It can be used as an additive or surface treating agent for promoting or preventing the above.
[0045]
The present invention also provides a method for increasing or decreasing the amount of cross-linking of the polypeptide by treatment with phenol oxidase, comprising the step of increasing or decreasing the content of target tyrosine in the polypeptide. For example, when a natural polypeptide contains a target tyrosine, the number of the target tyrosine is reduced or completely lost by removing the amino acid sequence or substituting it with another amino acid sequence. Cross-linking of this polypeptide can be suppressed or inhibited. In addition, by adding a target tyrosine to a natural polypeptide, the cross-linking of this polypeptide by phenol oxidase can be increased. Such polypeptides with altered target tyrosine content are important for controlling the degree of crosslinking in the crosslinking reaction of the present invention. In addition, a polypeptide having a non-natural structure containing a target tyrosine can be synthesized chemically or biologically. By performing a crosslinking reaction using such a polypeptide, it is possible to control the hardness of the crosslinked complex containing the polypeptide.
[0046]
For example, by inserting a target tyrosine in a natural protein or changing its position or number, it is possible to develop a biopolymer with higher strength or softer. Proteins to be modified are not limited, but may be components of components such as spider or silkworm silk (such as fibroin, sericin, spidroin, and other silk proteins), vertebrates and Examples include, but are not limited to, invertebrate skin, hair, and horny proteins, eggshell proteins, extracellular matrix (ECM) proteins, and plant cell walls. For example, it is considered possible to develop protein fibers with unprecedented strength by introducing many target tyrosines into silk proteins. Conversely, by reducing the target tyrosine content in the polypeptide, the degree of cross-linking can be lowered and a softer material can be newly developed.
[0047]
Examples of the polypeptide to be modified include polypeptide components contained in other animal hair such as cotton, hemp, wool, cashmere, camel and eyelash, and natural fibers such as silk, asbestos and paper. In addition, proteins in regenerated protein-based polymers made from proteins such as milk protein, soybean protein, and peanut protein, and proteins in proteins such as Promix and synthetic compounds are also subject to modification. Become. In order to modify the amino acid of a protein possessed by an organism, there are a method of replacing an endogenous gene with a modified gene using homologous recombination, and a method of newly introducing a modified gene. These can be performed according to known transgenic methods and gene targeting methods.
[0048]
The present invention also provides a method for assaying phenol oxidase using a polypeptide containing a target tyrosine according to the present invention. This method includes a step of contacting a test sample with a polypeptide containing a target tyrosine, a step of detecting cross-linking of the polypeptide, and a step of associating the level of cross-linking with the level of phenol oxidase. The level of cross-linking reflects the level of phenol oxidase activity. Thus, it can be seen that the higher the level of crosslinking reaction detected, the higher the level of phenol oxidase activity present in the sample. The detection of cross-linking can be performed, for example, by measuring the absorbance as described in the Examples or by electrophoresis of the reaction product. In addition, if a microplate on which a polypeptide containing target tyrosine is immobilized and a fluorescently labeled free polypeptide containing target tyrosine are combined and brought into contact with a test sample, the labeled polypeptide is specifically labeled on the microplate by a crosslinking reaction. Can be easily assayed by detecting fluorescence after washing. In addition, cross-linking can be detected by measuring oxygen consumption with an oxygraph or by measuring mass with mass spectrometry (Jee, J.-G. et al., 2000, Rapid Commun. Mass Spectrom ., 14, 1563-1567). Phenol oxidase assays are often used, especially in screening for human tyrosinase inhibitors. When the assay method of the present invention is used, a new screen for a tyrosinase inhibitor is useful as a method. Moreover, it is useful in the development of an enzyme that efficiently crosslinks the target tyrosine of the present invention.
[0049]
The assay kit for phenol oxidase of the present invention includes a polypeptide containing a target tyrosine. The polypeptide of the kit may be dried or dissolved in an aqueous solution. The polypeptide may be labeled with a fluorescent substance or the like. In addition, a kit comprising (a) a support on which a polypeptide containing a target tyrosine is immobilized, and (b) a polypeptide containing a labeled target tyrosine as used in the assay method described above are also included in the present invention. included. The kit can be accompanied by instructions describing the procedure of the assay method.
[0050]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not restrict | limited by these Examples. All documents cited in this specification are incorporated as a part of this specification.
[0051]
[Example 1] Isolation of a novel cuticle protein gene of silkworm
1. Isolation of RNA from silkworm epidermis
In molting, the sharp peak of 20E in the presence of JH coordinates the sequential expression of many genes in the epidermis. In order to screen for these 20E-regulated genes that are expressed during a very limited period of molting, experiments were performed comparing the expression of genes at the 4th molting stage of silkworm and the 5th instar developmental stage.
[0052]
First silkwormBombyx moriStock of p^Sm788 (mottled striped strain) (Fujiwara, H. et al., 1991, Genetical Research 57, 11-16) was applied to artificial feed (Nihon) at 25 ° C under photoperiodic conditions of 16: 8 h (light: dark). Nosan Kogyo, Yokohama, Japan).
In order to accurately define the time of development in the 4th larval molting, the silkworm development stage was defined using the spiracle index that represents the characteristic order of the formation of new air gates (Kiguchi, K., Agui , N., 1981, Journal of Insect Physiology 27, 805-812). Based on the visible characteristics, 10 morphological larval stages (A, B, C1, C2, D1, D2, D3, E1, E2 [A to E, 4th instar larvae] and F [5 It was possible to distinguish instar larvae]). These stages are called the spiracle index.
Freshly molted 4th and 5th instar larvae were isolated immediately after the start of the light period (this day was designated as day 0). p^SmMost of the 788 larvae began to wandering in the early light period of day 8 of the 5th instar larva (this day was designated W0) and hatched on day 12.
[0053]
To compare mRNA populations in three different stages of molting (C1, D1, and E1) and early 5th stage (F) using mRNA differential display technology, p^SmTotal RNA was prepared from 788 strains of silkworm larva epidermis. Specifically, total RNA was isolated by a modification of the guanidinium isothiocyanate-phenol-chloroform method (Chomczynski, P., Sacchi, N., 1987, Analytical Biochemistry 162, 156-159), and ethanol precipitation was performed. Further purified. RNA concentration was determined by spectrophotometer measurement.
[0054]
2. Differential cDNA display
Silkworm p prepared above^SmTotal RNA from stage 4 epidermis stage C1, D1, and E1, and 5th instar larva stage F epidermis of strain 788 was treated with DNase I (MessageClean Kit, GenHunter Corp.). Superscript these samples^TM II (GIBCO BRL) and 3 'anchor oligo dT primer (H-T₁₁A: 5'-AAGCTTT TTTTTTTTA-3 '(SEQ ID NO: 1) or H-T₁₁C: Reverse transcription using 5′-AAGCTTTTTTTTTT TC-3 ′ (SEQ ID NO: 2)). Reverse transcription was performed in 10 μl reaction containing 0.5 μg heat-denatured total RNA, 0.25 μg of one primer, 0.5 mM dNTP, 10 mM dithiothreitol and 1 × RT buffer. After 2 minutes incubation at 42 ° C., 100 U reverse transcriptase was added, mixed rapidly, and further incubated at 42 ° C. for 50 minutes. Samples were then heat denatured at 70 ° C. for 15 minutes, diluted with 40 μl of distilled water and stored at −20 ° C. until used for PCR.
[0055]
PCR is performed in 10 μl of reaction solution, with a final concentration of 1 × PCR buffer [10 mM Tris-HCl, pH 8.3 / 50 mM KCl / 0.001% (w / v) gelatin], 2 μM dNTP, 2 mM MgCl₂, 0.4μM 5 'Arbitrary primer (see below) and 3' anchor oligo dT primer, 0.25 U Taq DNA polymerase (AmpliTaq^TM, Perkin-Elmer) and 37 kBq (α-³²[P] dCTP (3000 Ci / mmol, ICN).
Differential display was analyzed using 40 arbitrage primers (OPM01-20 and OPI01-20, Operon Inc.) for each cDNA sample. The cycle conditions were 94 ° C for 30 seconds, 40 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 1 minute for 40 cycles, followed by incubation at 72 ° C for 10 minutes. PCR sample (3.5 μl) is denatured with 2 μl DNA loading dye [95% formamide, 10 mM EDTA (pH 8.0), 0.09% xylene cyanole, and 0.09% bromophenol blue] at 80 ° C. for 2 minutes and contains 7 M urea Separation electrophoretically on a 6% polyacrylamide sequencing gel. The gel was dried on filter paper and exposed to X-ray film.
[0056]
Most cDNA bands were equally visible in all four stages of RNA samples described above, but some were expressed at different levels depending on the stage. One cDNA band (4'-1, 149 bp) was expressed only at the E1 stage (which is during the late molting phase) and was not expressed at any other stage (data not shown). In order to identify the structural features of this highly stage-specific gene, the cDNA band of interest visualized by autoradiography was excised from the gel. Each gel slice is 100 μl H₂Soaked in O and incubated at 80 ° C. for 15 minutes. The eluted cDNA was amplified again by PCR using the same primer set used in the differential display. The cDNA was cloned into pGEM-T Easy Vector (Promega). The inserted sequence in the plasmid clone was analyzed using an automatic DNA sequencer (ABI PRISM310, PE Applied Biosystems). The inserted sequence corresponds to the 3 ′ region of unidentified mRNA (the region indicated by the box in FIG. 1). Based on this sequence, 5 ′ and 3 ′ RACE (rapid amplification of cDNA ends) technology is used. A full-length cDNA clone was isolated. 5 ′ and 3 ′ RACE were performed using the Marathon cDNA Amplification Kit.
[0057]
3. Structural features of a novel cuticle protein gene BMCPG1
The complete sequence length of the isolated E1 stage-specific cDNA is 595 bp (SEQ ID NO: 3) and a 495 bp open reading frame (ORF) encoding a 165 amino acid sequence (SEQ ID NO: 4). (Fig. 1). The amino acid sequence derived from the ORF contains a significant number of glycine residues (55/165, 33.3%). GGY or its related sequences (GGGY and SGGY) are repeated in tandem many times. Due to its characteristic structure, the present inventor has identified this gene.B.mori cuticle protein GGY-repeat 1, ieBMCPG1I named it. SignalP V1.1 program (H. Nielsen et al., Protein Engineering 10, 1-6 (1997); H. Nielsen et al., Protein Engineering 12, 3-9 (1999); H. Nielsen et al., Int J. Neural Sys. 8, 581-599 (1997)) predicted a putative signal peptide for BMCPG1.
[0058]
Compared to the silkworm cuticle protein reported so far, BMCPG1 and other proteinsBombyxNo structural similarity was found with any cuticle protein. Silkworm larval cuticle protein (LCP17, 18, 23, 32) and silkworm cuticle protein (PCP1) (Nakato, H. et al., 1992, Biochimica et Biophysica Acta 1132, 161-167; Nakato, H. et al., 1994, Biochimica et Biophysica Acta 1218, 64-74; Shofuda, K. et al., 1999, Comparative Biochemistry and Physiology 122, 105-109) all seem to form an endocicle region, and many Ala, Val Or have a Pro residue (data not shown). In contrast, the main amino acids of BMCPG1 are Gly, Val, and Tyr. Based on amino acid composition and sequence similarity (data not shown), the present inventor considered that BMCPG1 is a novel cuticle protein of silkworm.
[0059]
BLASTP program (Altschul, SF et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410; Altschul, SF et al. (1993) Nature Genet. 3: 266-272; Madden, TL et al. (1996 ) Meth. Enzymol. 266: 131-141; Altschul, SF et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; Zhang, J. & Madden, TL (1997) Genome Res. 7: 649-656) Homology search using, showed that some proteins have high structural similarity to BMCPG1. They areDrosophilaPutative cuticle protein EDG91 (Apple, R.T., Fristrom, J.W., 1991, Developmental Biology 146, 569-582), human cytokeratin,BombyxCorion protein, mollusc rubber protein, and some other proteins, most of which are structural proteins and contain GGY repeats. Among these proteins, EDG91 showed remarkable structural similarity with BMCPG1 (FIG. 2). EDG91 and BMCPG1 contain two long stretches of GGY repeats and a putative signal peptide. According to BLASTP, no insect cuticle protein with a GGY structure could be found other than EDG91. Therefore, the present inventor attempted to search for similar proteins one by one from the genes listed together with the keyword “cuticle” by the ENTREZ program (National Center for Biotechnology Information (NCBI)). The inventorManduca sextaThe putative cuticle protein MsmaA16 (Robertson, H.M. et al., 1999, Insect Molecular Biology vol. 8, 501-518), andC.elegansHypothetical protein CeT27E4.4 (TheC.elegans Sequencing Consortium, 1998, Science 282, 2012-2018) also found similar GGY stretches (Figure 2). However, at present, it is unclear whether CeT27E4.4 is a cuticle protein. further,LocustCuticle proteins LM-ACP 63, 64, and 65 (Hojrup, P. et al., 1986, Biochemical Journal 236, 713-720) have been found to contain short GGY repeats at the N- and C-termini (Data omitted). It is worth noting that these putative cuticle proteins do not contain Cys residues except for one in CeT27E4.4. Tyr residues in these proteins surrounded by small uncharged amino acids such as Gly, Ala, and Leu may be used to crosslink proteins instead of disulfide bonds. The corion that makes up the eggshell is also a hard structural protein in insects. Although most silkworm proteins do not appear to have GGY repeats, some corions, namely L-11 and L-12 middle classes A and B, contain a GGY-like motif (FIG. 2 (B )). Corion proteins containing GGY repeats also contain many Cys residues.
[0060]
4). Stage-specific and tissue-specific expression of BMCPG1 in molting and metamorphosis
In the 4th moltingBMCPG1Quantitative RT-PCR using LightCycler (Roche) was performed on stage C1, D1, D3, E1, E2, and F epidermal cDNAs to examine the correct developmental profile of the expression of (Fig. 3). All are genes that are specifically transcribed at the molting stage.BMCPG1,DDC,andFTZF1Gene expression patterns were compared.
[0061]
For quantitative reverse transcription PCR, total RNA was reverse transcribed into cDNA using the First-Strand cDNA Synthesis Kit (Pharmacia). Incubate 7.5 μl reaction containing 1 μg total RNA and 0.1 μg random hexadeoxynucleotide for 60 minutes at 37 ° C, heat at 90 ° C for 5 minutes, quickly cool on ice, and dilute with 180 μl RNase-free water did. Quantitative RT-PCR was performed with LightCycler (Roche) using SYBR Green Kit (LightCycler-DNA Master SYBR Green I, Roche). Ribosomal protein L3 (constantly expressed in cells)rpL3) Was used as an internal standard to evaluate the relative expression of mRNA. The oligonucleotide primer sets used in quantitative RT-PCR are shown below.rpL3(GenBank accession no. AB024901) for 5'-AGCACC CCGTCATGGGTCTA-3 '(SEQ ID NO: 5) and 5'-TGCGTCCAAG CTCATCCTGC-3' (SEQ ID NO: 6);FTZF1 (D10953) for 5'-AAACTTGAAGCGGTTCGAGC-3 '(SEQ ID NO: 7) and 5'-GCATAACAGACCATGAGTCC-3' (SEQ ID NO: 8);DDCFor 5′-GGCACGGCTAGCGAAGCTAC-3 ′ (SEQ ID NO: 9) and 5′-GATCCAGCGTAGGCGGCATC-3 ′ (SEQ ID NO: 10);BMCPG1For 5′-GGCATCATGAGAGCATTCGT-3 ′ (SEQ ID NO: 11) and 5′-TAGTTCACCACCA TCCGTTG-3 ′ (SEQ ID NO: 12). By using these primers, only a single band was observed in agarose gel electrophoresis after RT-PCR reaction.rpL3The FTZF1, DDC, and BMCPG1 bands were 409, 679, 395, and 508 bp, respectively.
[0062]
BMCPG1,DDC,andFTZF1The three genes showed similar expression patterns. The mRNA transcribed from each gene was lower in the ecdysteroid titer or peaked C and D stages, and higher in stage E, where ecdysteroid levels decreased. However, there are peaks in expression at the E1 and E2 stagesFTZF1Compared toBMCPG1andDDCThe onset of E2 is delayed and has a peak in the E2 stage. In the F stage after the 4th larval molting,BMCPG1andFTZF1 mRNA levels were completely suppressed,DDCExpression persisted even after molting (FIGS. 3 and 4).
[0063]
Furthermore, during both the 4th molting and the outpost stageBMCPG1The stage-specific expression was examined by Northern blot analysis (FIG. 4). For Northern analysis, 10 μg of total RNA was separated on a formaldehyde-agarose (1%) gel and transferred to a Hybond-N nylon membrane (Amersham). Hybridization at 42 ° C in 50% formamide, 5x SSC, 10x Denhardt's solution (0.2% each of BSA, Ficoll, and polyvinylpyrrolidone), 25μg / ml sonicated salmon sperm DNA, and 50 mM sodium phosphate (pH 7.0) And went for 18 hours. DNA probe is BcaBEST^TM Using the Labeling Kit (TaKaRa) [α-³²Labeled with P] dCTP. The membrane was washed twice for 20 minutes at room temperature in 2 × SSC containing 0.1% SDS. Thereafter, the membrane was washed at 65 ° C. for 30 minutes stepwise in 2 × SSC containing 1% SDS, 1 × SSC containing 1% SDS, and 0.1 × SSC containing 1% SDS.
[0064]
BMCPG1Was expressed at the E1 and E2 stages in the 4th molting, and at day 3 (W3) and day 3.5 (W3.5) after the start of migration in the prone stage, a time when the ecdysteroid titer decreased .FTZF1andDDCAs reported (Sun, G. et al., 1994, Developmental Biology 162, 426-437; Hiruma, K. et al., 1995, Developmental Biology 169, 195-209). Showed a similar pattern with peak expression. Stage-specific expression during molting and prone stage isBMCPG1It suggests that the gene responds to a decline in ecdysteroid titer.
[0065]
BMCPG1To examine tissue-specific expression of E2 and W3.5 in tissues other than the epidermisBMCPG1 mRNA levels were examined by Northern analysis (Figure 5).BMCPG1Was strongly expressed only in the epidermis, and was not expressed at any stage in other tissues (fatty body, testis, silk gland, and shark primordium). However, prolonged exposure and development of X-ray film results in very small amounts in both the testis and fat pad.BMCPG1 mRNA was detected (data not shown). In contrast,FTZF1andDDCWas expressed in most tissues, although the expression level was different depending on various tissues and stages. The result isBMCPG1It strongly suggests that the gene encodes a cuticle protein.
[0066]
5). Cultured epidermisBMCPG1 Effect of 20-hydroxyecdysone on expression
The above results show that the 20-hydroxyecdysone (20E) pulse is in the epidermisBMCPG1It is suggested to induce the transcription of. To test this hypothesis, the cultured epidermisBMCPG1The effect of 20E on expression was investigated. Specifically, the epidermis was cut out from day 4 4th instar larvae. The epidermis was cut into 5 to 8 segments with scissors along with the cuticle from the back side. In phosphate-buffered saline (pH 7.0), attached fat bodies, muscles, and trachea were carefully removed as much as possible, and the epidermis was cultured in Grace's medium (GIBCO BRL) for 1 hour at 25 ° C. (preculture). After pre-culture, epidermis pieces were transferred to 4 multiwell dishes (Nunc, diameter 16 mm) and incubated in 1 ml of Grace's medium containing 1% antibiotic reagents (GIBCO BRL, Antibiotic-Antimycotic). The ecdysone stimulation was performed by dissolving 20-hydroxyecdysone (20E, SIGMA) in 10% isopropyl alcohol and adding it to the medium at 2 μg / ml. The epidermis was then cultured for 6 to 42 hours.
[0067]
Quantitative RT-PCR using LightCycler shows that even if there is no 20E in the medium or in the presence of 20E at a concentration of 2 μg / ml, the period is up to 42 hours.BMCPG1It was shown that the transcription of can not be induced (FIG. 6). After incubating with 2 μg / ml 20E for 6 hours and removing 20E from the medium,BMCPG1 An increase in mRNA levels was clearly induced. Such 20E pulse processing isFTZF1Was also induced. However,BMCPG1WhenFTZF1The induction pattern of was different.FTZF1Induction began immediately after removing 20E from the medium,BMCPG1The expression of was delayed about 12 hours after removal of 20E. this is,BMCPG1Is a transcription factor of the ecdysteroid-induced gene activation pathwayFTZF1The possibility of being controlled by the function of.
[0068]
[Example 2] Crosslinking of peptide containing GGY motif
In order to obtain confirmation that the GGY motif is actually involved in protein crosslinking, a peptide containing the GGY motif was synthesized based on the BMCPG1 sequence. And the cross-linking of these peptides by enzymatic oxidation was investigated. Since the absorption in the UV-visible light range changes significantly when the peptide is cross-linked (Burzio, LA & Waite, JH, Protein Sci. 10, 735-740 (2001)), scanning with a spectrophotometer is used first. Then, the crosslinking reaction was measured (FIG. 7). When 20-mer GGYpep (GGYGGYSGGYGGYGGGYGGY; corresponding to residues 51 to 70 of BMCPG1, see Table 1) (SEQ ID NO: 13) was oxidized by mushroom tyrosinase, the absorption pattern at wavelengths 210 to 600 nm showed a reaction time from 0 It increased with increasing to 60 minutes (Fig. 7a). However, such changes did not occur when GGYpep was mixed with bovine serum albumin (BSA) rather than tyrosinase (FIG. 7b). When tyrosinase was added to a peptide without a tyrosine residue (BHRpep) (SEQ ID NO: 14), no change in absorption pattern was observed (FIG. 7c). These results suggest that di-DOPA crosslinks are formed between tyrosine residues of GGYpep in a tyrosinase-dependent manner. In this reaction, mushroom tyrosinase can be replaced by insect phenol oxidase (PO), and PO-activated hemolymph obtained from silkworms was used to investigate mimicking the in vivo cross-linking of BMCPG1 observed in cuticle formation. (Ashida, M. & Brey, PT (1998) Molecular Mechanisms of Immune Responses in Insects (Brey, PT and Hultmark, D. eds). Pp. 135-172. Chapman & Hall, London). When GGYpep was mixed with PO-activated haemolymph, the absorption pattern increased as observed for the tyrosinase reaction (FIG. 7d).
[0069]
[Example 3] Amino acid sequence specificity of cross-linking reaction
Three different peptides, each containing one or two tyrosine residues, angiotensin II (SEQ ID NO: 15), adrenocorticotropic hormone (ACTH) (SEQ ID NO: 16), and vasoactive A small intestine peptide (vasoactive intestinal peptide; VIP) (SEQ ID NO: 17) was reacted with tyrosinase, and the UV absorption of the sample was scanned at a wavelength of 210 to 320 nm after 2 minutes and 10 minutes. No change in UV absorption was seen with angiotensin II (FIG. 8b) or ACTH (FIG. 8c) compared to the elevated pattern observed with the GGYpep reaction (FIG. 8a). However, after a 10 minute reaction time of VIP, a slight increase in UV absorption was observed (FIG. 8d). These results indicate that di-DOPA cross-linking catalyzed by tyrosinase occurs in a manner specific to the GGY motif and is significantly higher than cross-linking that occurs with low efficiency at some tyrosine residues (VIP NYT or KYL) It shows that it reacts with efficiency. More recently, two neuroendocrine peptides, neurotensin (ELYENK / SEQ ID NO: 18) and proctolin (RYPT / SEQ ID NO: 19) have been reported to undergo di-DOPA cross-linking ( Burzio, LA & Waite, JH, Protein Sci. 10, 735-740 (2001)).
[0070]
[Example 4] Analysis of crosslinking reaction of polypeptide containing GGY motif
To more clearly understand the structural changes that occur in polypeptides containing the GGY motif, FITC-labeled oligopeptides using sequences corresponding to different parts of BMCPG1 (residues 128 to 145, FITC-CKKNGGYGGYSGGYSGGYSGGY / SEQ ID NO: 20) (FITC-GGYpep) was synthesized, and this peptide was subjected to an oxidation reaction and then analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). When FITC-GGYpep was incubated with mushroom tyrosinase for 5 or 30 minutes (FIG. 9A, lanes 3, 4, and 8), about 30 kDa above the original (monomer) band (2.7 kDa) of FITC-GGYpep. A smeared band was observed. Such a smear band did not occur when the tyrosinase reaction was omitted (FIG. 9A, lanes 1 and 2) or when tyrosinase was replaced with BSA (lane 9). These results strongly suggest that the GGY peptide can be crosslinked by tyrosinase oxidation to form multimers up to about 10 mer. The smear band is probably due to the formation of random covalent bonds between the tyrosine residues of FITC-GGYpep. These crosslinks were hindered by adding SDS to the reaction mixture (lane 6), but were not hindered by adding β-mercaptoethanol to the loading buffer after the reaction (lane 5). Unlike S-S bonds, the cross-links between peptides containing the GGY motif were not cleaved by β-mercaptoethanol.
[0071]
[Example 5] Crosslinking of polypeptide containing GGY motif by phenol oxidase
Cross-linking between FITC-GGYpep reacted with silkworm hemolymph was further investigated (FIG. 9B). A smear band of the cross-linked product was also observed when FITC-GGYpep was reacted with PO-activated haemolymph (lanes 2 and 4), but the degree of polymerization appeared to be smaller than that observed in the tyrosinase reaction. (Lane 7). When the specific phenol oxidase inhibitor phenylthiourea (PTU) was added to haemolymph, the band shift was completely blocked (lanes 3 and 5), indicating that the phenol oxidase activity in silkworm haemolymph was cross-linked to the GGY peptide. It was suggested to be responsible. This finding suggests that the cuticle protein BMCPG1 is actually cross-linked in silkworms.
[0072]
[Example 6] Protein having GGY motif
BMCPG1 contains two domains consisting of repeats of the GGY motif (mainly GGYGG), one near the N-terminus and the other near the C-terminus (Table 1), and they contain half of the 165 amino acid sequence. It is composed. GGY-like repeats are also present in mollusc adhesion proteins and are thought to be involved in protein cross-linking;A.ater AGY * GG in proteins (Y * represents DOPA) (Burzio, LA, et al., Biochim. Biophys. Acta 1479, 315-320 (2000)). In addition, GGY * GG or GGY * GY (Waite, JH et al., Biochemistry 31, 5733-5738 (1992)), and GGY * GGY * G (Waite, JH & G) Rice-ficht, AC, Biochemistry, 26, 7819-7825 (1987)), and other GGY-like sequences including peptidyl DOPA (Y *) have also been reported. The GGY motif common to these proteins is thought to be involved in cross-linking of proteins through covalent bonds of di-DOPA.
[0073]
Interestingly, all of the above proteins are hard extracellular proteins. Thus, GGY motif repeats may be conserved general motifs that specify the formation of strong protein structures. To verify this possibility, the entire sequence of BMCPG1 and homologous sequences were searched again using the BLASTP2.0 program. The highest homology value is BMCPG1 itself and its expected value is 6e-97,DrosophilaFollowed by EDG91 3e-21 (Apple, R. T. & Fristrom, J. W., Dev. Biol. 146, 569-582 (1991)), an ecdysone-inducible GGY-rich cuticle protein (Table 1). Many of the remaining sequences (smaller homology values than 2e-17) encode GGY-rich proteins, most of which are hard proteins. Typical examples of these proteins are summarized in Table 1. In addition to the above-mentioned proteins, several insect corion proteins (Sporel, N. et al., J. Mol. Biol. 190, 23-35 (1986)), spider silk proteins (Hayashi, CY & Lewis, RV) , BioEssays 23, 750-756 (2001); Ac no. AAK30596), plant cell wall proteins (Rhode, W. et al., Plant Mol. Biol. 14, 1057-1059 (1990)), and some of mammals Some types of cytokeratin (CK9 and CK10) (Langbein, L. et al., Differentiation 55, 57-71 (1993) are rich in GGY motif sequences, although the role is not clear, but the GGY rich motif Is also found in RNA binding proteins and RNA helicase A (Lee, CG & Horwitz, J., J. Biol. Chem. 268, 16822-16830 (1993)).
[0074]
Table 1 summarizes the results of a search for homologous sequences with BMCPG1 using BLASTP2.0 and further visual inspection of GGY-rich sequences. In the table, the total number of GGY or GGY related sequences (# 1) and a typical GGY rich region (# 2) in each protein is shown in the fourth column. A typical region GGY motif sequence is shown in outlined letters. Five residues in the Gly-rich region surrounding the immediate tyrosine residue are underlined. Y * indicates a tyrosine residue identified as peptidyl DOPA (# 3). The position of the GGY rich region in each protein is shown in the fifth column.
[0075]
[Table 1] GGYGG motif found in a wide variety of proteins

[0076]
The mollusc protein AGY * GGXK sequence (SEQ ID NO: 34) or GY * GAK sequence (SEQ ID NO: 35) serves as a target for oxidation (Burzio, LA et al., Biochim. Biophys. Acta 1479, 315-320). (2000)) Therefore, it is unlikely that “GGY” repeat itself is the only strict cross-linking site. In many of the sequences shown in Table 1, “GGY” does not always repeat directly (as GGYGGY) and is often adjacent to a region rich in uncharged small amino acids such as glycine (underlined in Table 1). Part). Thus, for efficient cross-linking, tyrosine may need to be surrounded by a sequence rich in uncharged small amino acids such as glycine, such as GGYGG or AGYGG. By satisfying this condition, “GGY” like sequences (including SGY, AGY, and some other sequences shown in Table 1) also serve as targets for cross-linking. The glycine, serine, and alanine residues surrounding tyrosine residues are relatively small amino acids and are thought to help expose tyrosine to oxidase.
[0077]
【The invention's effect】
The present invention provides a new method for cross-linking polypeptides. The present invention is useful, for example, for producing high-strength peptidic fibers or proteins having a strong structure. It is also useful for covalently binding the desired protein to a support or other protein. The present invention can be used, for example, as a tissue adhesive. Since the cross-linking reaction of the present invention proceeds in an aqueous solution, the method of the present invention can be used to join tissues in proteins in water and living bodies. As described above, the method of the present invention can be applied in various fields in industry and medicine.
[0078]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the amino acid sequence of BMCPG1 derived from a cDNA sequence. The amino acid residues are shown in the base sequence below, and the numbers from the first Met residue (position 1) are shown. The GGY, GGGY, and SGGY sequences are underlined. GGY related sequences are shown in parentheses. An asterisk represents a stop codon. Predicted signal peptides were predicted by the SignalP V1.1 program of the World Wide Web prediction server (CBS) and shown in italic letters. The original product obtained with the differential display is shown in a box. Primer sets for 5'RACE (5'-1 and 5'-2) and 3'RACE (3'-1 and 3'-2) are indicated by arrows. Based on the results of 5′RACE and 3′RACE, the entire sequence of BMCPG1 was determined.
FIG. 2 is a diagram showing a comparison of amino acid sequences in GGY rich cuticle protein and silkworm corion protein. (A) The derived amino acid sequence of BMCPG1 (SEQ ID NO: 4) was aligned with that of three cuticle proteins of other species. DmDG91,D.melanogaster ecdysteroid dependent gene 91 (accession no. AAF55440) (SEQ ID NO: 46). MsmaA16,Manduca sexta putative cuticle protein (accession no. AF117571, Robertson, H.M. et al., 1999, Insect Molecular Biology vol. 8, 501-518) (SEQ ID NO: 47). CeT27E4,C.elegans hypothetical protein T27E4.4 (accession no. AAB04835, TheC.elegans Sequencing Consortium, 1998, Science 282, 2012-2018) (SEQ ID NO: 48). (B) A silkworm corion protein containing a GGY repeat motif. Corion proteins A-L11 (accession no. CAB01210) (SEQ ID NO: 49) and B-L12 (accession no. CAA31323) (SEQ ID NO: 50) are classified into middle A class and middle B class corions, respectively ( Tsitilou, SG et al., 1983, EMBO Journal 2, 1845-1852). GGY and GGY related sequences are underlined. Presumed signal peptides were predicted by the SignalP V1.1 program of the World Wide Web prediction server (CBS) and shown in italic letters. The estimated molecular weight of each protein excluding the signal peptide was calculated and shown in the figure.
[Figure 3] In the 4th larva molting,BMCPG1,DDC,andFTZF1It is a figure which shows the developmental profile of 3 genes. The relative expression of mRNA of each gene was measured by quantitative RT-PCR, and the maximum data was shown as 100. Bars represent mean ± SD (n = 4-14).
[Figure 4] In the 4th molting and foraging stage,BMCPG1,DDC,andFTZF1It is a figure which shows the Northern blot analysis of. Each PCR fragment used in quantitative RT-PCR analysis (BMCPG1, 508 bp;DDC, 395 bp;FTZF1, 679 bp)³²P-labeled and hybridized with total RNA (5 μg) (see Examples). BmN, BmN4 cultured cell line treated with ecdysteroid pulse (see FIG. 6). BmN4 is a cell line established from the silkworm ovary and obtained from Nihon Nosan Kogyo. The molting stage was determined based on the airway index. W0 ~ W3.5, 0 ~ 3.5 days after the start of the run. Larvae hatch at W4. As a control indicating that an equal amount was loaded, ethidium bromide staining of rRNA was shown.
FIG. 5 in various organizationsBMCPG1,DDC,andFTZF1It is a figure which shows the Northern blot analysis of. Total RNA (10 μg) from various tissues in E2 (molting) and W3.5 (metamorphosis)³²Hybridization with P-labeled probe (see FIG. 4). Ep, epidermis; FB, fat pad; T, testis; PSG, posterior silk gland; WD, 翅 原基. As a control indicating that an equal amount was loaded, ethidium bromide staining of rRNA was shown.
[Figure 6] By ecdysteroid pulseBMCPG1It is a figure which shows the induction | guidance | derivation of expression. The epidermis of day 4 day 2 was incubated as shown in the diagram below. The black box in the diagram shows 2Eg / ml 20E treatment. White box indicates no 20E added. Samples were collected after 6, 18, 30, and 42 hours of incubation.BMCPG1Relative expression was measured by RT-PCR using LightCycler,FTZF1Was compared with the expression pattern. The relative expression of mRNA is shown with a maximum data of 100. Bars represent mean ± SD (n = 3).
FIG. 7 shows cross-linking of a GGY motif-containing peptide by tyrosinase. It shows that the absorption in the UV-visible range is significantly altered when GGY motif-containing peptides are oxidized by tyrosinase or hemolymph phenol oxidase.
(a) GGY-rich peptide oxidized with tyrosinase (GGYpep); (b) GGYpep mixed with BSA; (c) BHRpep lacking tyrosine oxidized with tyrosinase; (d) oxidized with hemoline phenol oxidase from silkworm larvae GGYpep.
The 20-mer sequence GGYGGYSGGYGGYGGGYGGY (SEQ ID NO: 13) of GGYpep corresponds to amino acid residues 51 to 70 of BMCPG1 (accession number AB055661). 33 mer BHRpep (MPKNLLLFKKIIPEINFAKRNLTSPLGRNIFIS / SEQ ID NO: 14) was used as a negative control. Both peptides were synthesized by SAWADAY Tech. Corp. (Tokyo) and purified by HPLC. The peptide was suspended at 1 mg / ml in 50 mM Tris-HCl (pH 7.9). Mushroom tyrosinase (6050 unit / mg, Sigma, product No. T7755) and BSA were suspended at 1 mg / ml in 50 mM Tris-HCl (pH 7.9). The cross-linking reaction was initiated by adding 0.01 mg mushroom tyrosinase (or BSA) in 110 μl 5 mM Tris-HCl (pH 7.9) at a peptide: enzyme weight ratio of 1: 1. The reaction was incubated at room temperature for 0-60 minutes (0, 1, 2, 5, 10, and 60 minutes, or 0, 5, and 15 minutes for d). Each reaction was stopped by adding 20 μl of 1 N HCl. UV-visible light absorption was scanned using a Hitachi spectrophotometer. Silkworm haemolymph was collected on a glass plate from larvae in the early 5th instar and kept at room temperature for 10 minutes to activate phenol oxidase. Hemolymph was diluted 1/10 in 50 mM Tris-HCl (pH 7.9) and lightly centrifuged. The supernatant (10 μl) was used for the crosslinking reaction.
FIG. 8 is a diagram showing the substrate specificity of crosslinking by tyrosinase.
GGYpep, Angiotensin II (Bachem, CA) (SEQ ID NO: 15), ACTH (Peninsula Laboratories Europe Ltd, UK) (SEQ ID NO: 16), and VIP (Peninsula Laboratories Inc, CA) (SEQ ID NO: 17) Cross-linked with mushroom tyrosinase under the conditions described in 7 for 0, 2, and 10 minutes.
FIG. 9 shows SDS-PAGE analysis of cross-linking of FITC-labeled GGY peptide.
FITC-labeled GGY peptides were cross-linked with mushroom tyrosinase (A) or phenol oxidase (PO) activated hemolymph (B) and separated by SDS-PAGE. In order to efficiently detect the cross-linked peptide on a gel, FITC-GGYpep (FITC-CKKNGGYGGYSGGYSGGYSGGY, MW: 2737 Dalton) (SEQ ID NO: 20), which was a FITC-labeled GGY peptide, was synthesized. The sequence GGYGGYSGGYSGGYSGGY corresponds to residues 128 to 145 of BMCPG1 and is different from GGYpep (see FIG. 7). FITC-GGYpep (4 μl) was mixed with 1 μl mushroom tyrosinase (A) or 0.25 μl PO-activated haemolymph (B) and incubated at room temperature for the times indicated below the gel in the figure. The reaction was stopped by adding 20 μl of 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 20% (v / v) glycerol, and 0.01% CBB and incubating at 75-80 ° C. for 5 minutes. Samples were then separated on a 15% SDS polyacrylamide gel and visualized by UV illumination.
A. (1) No mushroom tyrosinase added; (2-4) Reaction with 0.2 mg / ml tyrosinase; (5) 65 mM β mercaptoethanol added after reaction; (6) 1.7% SDS added during reaction; (7) 0.05 mg / ml tyrosinase was added to the reaction; (8) 0.8 mg / ml tyrosinase was added to the reaction; (9) 0.2 mg / ml BSA was added instead of tyrosinase.
B. Hemolymph was collected from the silkworm larvae and placed in the presence or absence of the phenol oxidase inhibitor phenylthiourea (PTU) for 30 minutes at room temperature. (1) no haemolymph; (2-3) 1 μl of haemolymph was added in the absence or presence of PTU; (4-6) 0.25 μl of haemolymph was added in the absence or presence of PTU; 1 μl tyrosinase was added.

Claims (19)

  Phenol oxidase is contacted with a polypeptide containing one or more tyrosine residues having no charged amino acid or a molecular weight of 132 or more in the range of 2 or more amino-terminal residues and 2 or more carboxyl-terminal residues. A method of cross-linking the polypeptide comprising a step.   The method of claim 1, wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of amino terminus-YXX, amino terminus-XYXX, XXYXX, XXYX-carboxyl terminus, and XXY-carboxyl terminus. A method wherein “is tyrosine and“ X ”is an amino acid selected from the group consisting of glycine, alanine, and serine.   The polypeptide is amino-terminal-Y [G / S] G, amino-terminal-GY [G / S] G, [G / S] GY [G / S] G, [G / S] GY [G / S] The method of claim 2, comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: -carboxyl terminus, and [G / S] GY-carboxyl terminus, wherein "G", "S", and "Y" are each A method wherein glycine, serine, and tyrosine, and [G / S] are each independently either glycine or serine. 4. The method according to claim 3, wherein the polypeptide comprises the amino acid sequence of [G / S] GY [G / S] _1-2 GY [G / S] _1-2 GY [G / S] _1-2. “G”, “S”, and “Y” are glycine, serine, and tyrosine, respectively, and [G / S] _1-2 is independently one or two residues of either glycine or serine. There is a way.   A crosslinker reagent comprising a polypeptide comprising one or more tyrosine residues having no charged amino acid and no amino acid having a molecular weight of 132 or more in the range of two or more amino-terminal residues and two or more carboxyl-terminal residues.   A method for producing a support having a linker for cross-linking of a polypeptide, having both a charged amino acid and an amino acid having a molecular weight of 132 or more in a range of 2 or more residues on the amino terminal side and 2 or more residues on the carboxyl terminal side Immobilizing the polypeptide comprising one or more non-tyrosine residues to the support or synthesizing on the support.   Other polypeptides include one or more tyrosine residues with no charged amino acids and no more than 132 amino acids in the range of 2 or more amino-terminal residues and 2 or more carboxyl-terminal residues. Bound fusion protein.   A polynucleotide encoding the fusion protein according to claim 7.   A polynucleotide encoding a polypeptide comprising one or more tyrosine residues having no amino acid charged and no amino acid having a molecular weight of 132 or more in the range of 2 or more amino-terminal residues and 2 or more carboxyl-terminal residues An expression vector comprising a cloning site into which a polynucleotide encoding the other polypeptide can be inserted so that a fusion protein in which the other polypeptide is bound to the polypeptide can be expressed.   A polypeptide containing one or more tyrosine residues having no charged amino acid and no amino acid with a molecular weight of 132 or more in the range of 2 or more amino-terminal residues and 2 or more carboxyl-terminal residues, and other polypeptides A cell into which a vector expressing a polynucleotide encoding a fusion protein to which is bound is introduced.   A tyrosine residue that has no amino acid charge and no more than 132 amino acids in the range of 2 or more amino-terminal residues and 2 or more carboxyl-terminal residues, including a step of increasing or decreasing the amount or activity of phenol oxidase A method of promoting or inhibiting cross-linking of a polypeptide comprising one or more.   Hardness of a complex comprising a polypeptide containing one or more tyrosine residues with no charged amino acids and no more than 132 amino acids in the range of 2 or more amino-terminal residues and 2 or more carboxyl-terminal residues 12. The method of claim 11, wherein the method increases or decreases.   Contains compounds that increase or decrease the amount or activity of phenol oxidase as active ingredients, and has no charged amino acids or amino acids with a molecular weight of 132 or more in the range of 2 or more amino-terminal residues and 2 or more carboxyl-terminal residues A reagent that promotes or suppresses cross-linking of a polypeptide containing one or more tyrosine residues.   Hardness of a complex comprising a polypeptide containing one or more tyrosine residues with no charged amino acids and no more than 132 amino acids in the range of 2 or more amino-terminal residues and 2 or more carboxyl-terminal residues The reagent according to claim 13, wherein the reagent is increased or decreased.   A step of increasing or decreasing the content of tyrosine residues in the polypeptide having no amino acid with a charged amino acid and a molecular weight of 132 or more in the range of 2 or more amino-terminal residues and 2 or more carboxyl-terminal residues, A method of promoting or inhibiting cross-linking of the polypeptide by phenol oxidase.   16. The method of claim 15, wherein the hardness of the complex comprising the polypeptide is increased or decreased.   The polypeptide by phenol oxidase, which increases or decreases the content of tyrosine residues having no amino acid charged and no amino acid with a molecular weight of 132 or more in the range of 2 or more amino-terminal residues and 2 or more carboxyl-terminal residues A modified polypeptide that increases or decreases cross-linking. A method for assaying phenol oxidase, comprising:
(A) a polypeptide comprising one or more tyrosine residues having no charged amino acid and no amino acid having a molecular weight of 132 or more in the range of two or more residues on the amino terminal side and two or more residues on the carboxyl terminal side; Contacting the sample;
(B) detecting the cross-linking of the polypeptide,
(C) associating the level of crosslinking with the level of phenol oxidase.   Phenol oxidase assay kit comprising one or more tyrosine residues having no charged amino acid and no more than 132 amino acids in the range of 2 or more amino-terminal residues and 2 or more carboxyl-terminal residues A kit comprising a polypeptide comprising.

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