JP2005270036A - Bioactivation method and bioactivation composition - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生物活性化方法及び生物活性化組成物に関する。 The present invention relates to a bioactivation method and a bioactivation composition.
導電性高分子は、化学ドーピングによりホールあるいは電子による伝導キャリヤーを生成し、電気伝導性を発現する。導電性高分子はこのように外部環境と電子をやり取り（酸化−還元反応）を行い、電導度を変貌させると共に自身の発色も変化させることができ、この性質を応用したものにセンサー、電極材料やエレクトロクロミック素子がある。このように導電性高分子化合物の利用分野は多岐にわたっている。また有用な導電性高分子についても種々開発が進められている（例えば、特許文献１）。
一方、微生物は、水中及び土中の成分を有機的に分解するために利用されている。このうち特に、廃水処理施設では、古くから微生物の脱窒活性を廃水処理に利用している（例えば、特許文献２及び３）。
On the other hand, microorganisms are used for organically decomposing components in water and soil. Among these, in particular, wastewater treatment facilities have long utilized the denitrification activity of microorganisms for wastewater treatment (for example, Patent Documents 2 and 3).
しかしながら、微生物による化合物の分解活性は、微生物種の能力に依るところが大きく、処理能力を向上させるに、有用な微生物の新種を探索することが行われているが、新種の探索には限界がある。また処理能力活性を高めるために遺伝子組換え技術を利用することもあるが、工業的な要請に応える程度まで能力を向上させることは困難である。
また動物細胞や植物細胞に対しても遺伝子組換えなどによって特定の活性を高めて工業的に利用することが行われているが、人為的に変異を起こさせた遺伝子組換え体では、利用に向かない分野もあり、生物のもつ活性を効果的にまた確実に高めて広く利用するという観点から、万能とはいえない。
更に導電性高分子のドーピングには、ヨウ素や五フッ化ヒ素などの無機系のドーパントが用いられてきたが、自然環境の中では直接の使用に難しいという問題がある。
従って、本発明の目的は、導電性高分子化合物の新しい利用分野を提供することである。
また本発明の目的は、微生物又は細胞の活性を効率よく且つ確実に高めることである。
However, the activity of decomposing compounds by microorganisms largely depends on the ability of the microorganism species, and searching for new species of useful microorganisms has been carried out to improve the processing ability, but there are limits to the search for new species. . In addition, genetic recombination techniques may be used to increase the processing capacity activity, but it is difficult to improve the capacity to the extent that industrial demands are met.
In addition, animal cells and plant cells are also industrially used with specific activity increased by genetic recombination, etc., but artificially mutated gene recombinants are not suitable for use. There are some fields that are not suitable, and it is not a universal one from the viewpoint of effectively and reliably enhancing the activities of organisms.
Furthermore, inorganic dopants such as iodine and arsenic pentafluoride have been used for doping conductive polymers, but there is a problem that they are difficult to use directly in the natural environment.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a new field of application of conductive polymer compounds.
Another object of the present invention is to efficiently and reliably increase the activity of microorganisms or cells.
本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、微生物や細胞における電子の受け渡し作用に着目し、これらの生物と導電性高分子との電子的相互作用から、導電性高分子化合物によって微生物又は細胞の活性を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of intensive studies on the above problems, the present inventors have paid attention to the electron transfer action in microorganisms and cells, and from the electronic interaction between these organisms and the conductive polymer, The present inventors have found that the activity of cells can be improved and completed the present invention.
すなわち、本発明の生物活性化方法は、導電性高分子化合物の存在下で微生物又は細胞を成育・維持することを特徴としている。
ここで、生物活性化方法は、導電性高分子化合物及び担体を含む生物活性化組成物の存在下で微生物又は細胞を成育・維持することを特徴としてもよく、前記導電性高分子化合物で構成された活性化部材を、微生物又は細胞の成育・維持環境下に配置することを特徴としてもよい。
また本発明の生物活性化組成物は、導電性高分子化合物及び担体を含むことを特徴としている。
前記導電性高分子化合物は、下記のものであることが好ましい。
That is, the bioactivation method of the present invention is characterized by growing and maintaining microorganisms or cells in the presence of a conductive polymer compound.
Here, the bioactivation method may be characterized in that a microorganism or a cell is grown and maintained in the presence of a bioactivation composition including a conductive polymer compound and a carrier, and the bioactivation method includes the conductive polymer compound. The activated member may be placed in a growth / maintenance environment for microorganisms or cells.
The bioactivation composition of the present invention is characterized by containing a conductive polymer compound and a carrier.
The conductive polymer compound is preferably the following.
これを詳細に説明すれば、本発明は、微生物又は細胞（以下、本発明において適宜単に「生物」という）を導電性高分子化合物の存在下で培養することによって、導電性高分子化合物の酸化−還元特性を、微生物における酸化−還元現象に利用すること、即ち、生物学的ドーピング現象を発見したことに基づく。
生物の活動において酸化−還元の現象は、成育のためのエネルギー生産（ＡＴＰ合成）、酸素による生体物質の酸化とこれを還元する生体の作用や、Ｆｅ（III）からＦｅ（II）への還元に基づく生体内の反応などに見られ、多くの微生物が、酸化−還元現象を生命維持に利用していることが知られている。このとき導電性高分子化合物が存在すると、導電性高分子化合物から電子が生物に受け渡され、生物における酸化−還元反応が効率よく進行することが見出された。
Explaining this in detail, the present invention oxidizes a conductive polymer compound by culturing microorganisms or cells (hereinafter simply referred to as “organism” as appropriate in the present invention) in the presence of the conductive polymer compound. -Based on the use of the reduction properties for oxidation-reduction phenomena in microorganisms, i.e. the discovery of biological doping phenomena.
Oxidation-reduction phenomena in biological activities include energy production for growth (ATP synthesis), oxidation of biological substances by oxygen and the action of the living body to reduce this, and reduction from Fe (III) to Fe (II) It is known that many microorganisms utilize oxidation-reduction phenomenon for life support, such as in vivo reactions based on the above. At this time, it was found that if a conductive polymer compound is present, electrons are transferred from the conductive polymer compound to the organism, and the oxidation-reduction reaction in the organism proceeds efficiently.
これを微生物による窒素呼吸系で説明すれば、以下の脱窒素反応が微生物によって行われている。
ＮＯ3 -→ＮＯ2 -→ＮＯ→Ｎ2Ｏ
導電性高分子化合物は、微生物における脱窒酵素の電子の受け渡しを活発化して、脱窒素反応を促進すると考えられる。生物内における反応は、種々の酵素反応の活性化に基づくものであるので、導電性高分子化合物による活性化は、微生物における脱窒素反応に限られない。
If this is explained by the nitrogen respiration system by microorganisms, the following denitrification reaction is performed by microorganisms.
NO 3 - → NO 2 - → NO → N 2 O
It is considered that the conductive polymer compound promotes the denitrification reaction by activating the transfer of electrons of the denitrification enzyme in the microorganism. Since reactions in living organisms are based on activation of various enzyme reactions, activation with conductive polymer compounds is not limited to denitrification reactions in microorganisms.
本発明によれば、導電性高分子化合物が生物における電子の受け渡しに寄与して、電子の受け渡し作用に基づく生物の活性を効率よく高めることができる。これにより、導電性高分子化合物の新しい利用分野を提供することができると共に、生物を効率よく且つ確実に活性化することができる。 According to the present invention, the conductive polymer compound contributes to the transfer of electrons in the living organism, and the activity of the living organism based on the electron transfer action can be efficiently increased. As a result, a new field of use of the conductive polymer compound can be provided, and a living organism can be activated efficiently and reliably.
本発明の生物活性化方法は、導電性高分子化合物の存在下で微生物又は細胞を成育・維持するものである。 The bioactivation method of the present invention grows and maintains microorganisms or cells in the presence of a conductive polymer compound.
本発明により活性化される微生物としては、電子の受け渡しによって生物活性を向上させることができるものであれば特に限定されないが、工業的な利用性の観点から物質分解能を有する微生物が好ましく、脱窒菌が特に好ましい。このような微生物には、アルカリゲネス・キシロゾキシダンス・キシロゾキシダンス（Alcaligenes xylosoxidans subsp. xylosoxidans）、アルカリゲネシス・キシロゾキシダン・デニトリフィカンス（Alcaligenes xylosoxidans subsp. Denitrificans）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、マグネトスピリラム・マグネトタクチカム（Magnetospirillum magnetotacticum）、アクロバクター・クリアロフィラス（Arcobacter cryaerophilus）、ロゼオバクター・デニトリフィカンス（Roseobacter denitrificans）、ハロモナス・ハロデニトリフィカンス（Halomonas halodenitrificans）、アシドボラクス・アベネア・アベネア（Acidovorax avenae subsp. Avenae）、ザバルジニア・コンプランゾリス（Zavarzinia compransoris）、ブルクホルデリア属（Burkholderia sp.）、シュードモナス・スツトゼリ（Pseudomonas stutzeri）、シュードモナス・エアロジノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、ハイドロゲノモナス・シュードフラバ（Hydrogenomonas pseudoflava）、シェワネラ属（Shewanella sp.）、シノリゾビウム・メリロッティ（Sinorhizobium meliloti）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドバクター・カプシュラタス（Rhodobacter capsulatus）、パラコッカス・ベルスタス（Paracoccus versutus）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）、ウォリネラ・スクシノゲネス（Wolinella succinogenes）、ハロアルキュラ・デニトリフィカンス（Haloarcula denitrificans）、ハロアルキュラ・マリスモルタイ（Haloarcula marismortui）、ハロアルキュラ・バリスモルタイ（Haloarcula vallismortui）などを挙げることができる。 The microorganism activated by the present invention is not particularly limited as long as the biological activity can be improved by the transfer of electrons, but a microorganism having a substance resolution is preferable from the viewpoint of industrial availability, and denitrifying bacteria Is particularly preferred. These microorganisms include Alcaligenes xylosoxidans subsp. Xylosoxidans, Alcaligenes xylosoxidans subsp. Denitrificans, Ralstonia eutropha , Magnetospirillum magnetotacticum, Arcobacter cryaerophilus, Roseobacter denitrificans, Halomonas halodenitrificans, Halomonas halodenitrificans Avenae Avenea (Acidovorax avenae subsp. Avenae), Zavarzinia compransoris, Burkholderia sp., Pseudomonas stutzer i), Pseudomonas aeruginosa, Hydrogenomonas pseudoflava, Shewanella sp., Sinorhizobium meliloti, Rhodobacter, Rhodobacter, Rhodobacter Rhodobacter capsulatus, Paracoccus versutus, Paracoccus denitrificans, Wolinella succinogenes, Haloarcula denitrificans, haloarcula denitrificans, haloarcula denitrificans Examples include Haloarcula vallismortui.
本発明における微生物には、上記の他に、種々の物質の分解菌を含むことができ、このような物質分解菌としては、多環芳香族、トリクロロエチレン等の種々環境汚染物質を分解するアルカリゲネス属（Alcaligenes sp.）、ラルストニア属（Ralstonia sp.）、アシドボラクス属（Acidovorax sp.）、ブルクホルデリア属（Burkholderia sp.）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）、シノリゾビウム属（Sinorhizobium sp.）、ゴルドニア属(Gordonia sp.）、さらにメタン酸化細菌群を挙げることができる。
なおこの他に、本発明における活性化組成物又は活性化方法の対象となりうる微生物には、所定の活性が利用可能となり得る如何なる微生物が包含され、特に制限されない。
In addition to the above, the microorganisms in the present invention can include degrading bacteria of various substances. Examples of such substance degrading bacteria include the genus Alkagenes which degrades various environmental pollutants such as polycyclic aromatics and trichlorethylene. (Alcaligenes sp.), Ralstonia sp., Acidbororax sp., Burkholderia sp., Pseudomonas sp., Sinorhizobium sp., Gordonia (Gordonia sp.), And methane oxidizing bacteria group.
In addition to this, the microorganism that can be the target of the activation composition or the activation method in the present invention includes any microorganism that can use the predetermined activity, and is not particularly limited.
また本発明における細胞には動物細胞及び植物細胞のいずれもが含まれ、特に細胞自体に活性を有するものや、特定のサイトカインを産生する細胞であることが好ましい。しかし、本発明においては特に制限されず、いずれの細胞に対しても活性化効果を得ることができる。 The cells in the present invention include both animal cells and plant cells, and cells having activity in the cells themselves or cells that produce specific cytokines are preferred. However, the present invention is not particularly limited, and an activation effect can be obtained for any cell.
なお本発明において「微生物又は細胞の成育（生育）・維持」とは、対象となる微生物又は細胞が、活性化の対象となるその生物活性を維持した状態にあることを意味し、微生物又は細胞が増殖する場合及び増殖しない場合のいずれも含まれる。また微生物又は細胞が、それ自体の作用に基づいて物質分解活性などの特定の活性を行っていれば、如何なる場合も、本発明における「成育（生育）・維持」に含まれる。 In the present invention, “growth (maintenance) / maintenance of microorganism or cell” means that the target microorganism or cell is in a state of maintaining its biological activity to be activated. Both the case where it grows and the case where it does not grow are included. In addition, any growth or growth in the present invention is included in any case as long as the microorganism or cell performs a specific activity such as a substance decomposing activity based on its own action.
本発明にかかる導電性高分子化合物としては、共役二重結合を有して電子の授受が可能であり、微生物における電子受け渡し（酸化−還元）作用に寄与することができるものであればいずれも用いてもよい。
このような導電性高分子化合物としては、ｎ型導電性高分子化合物及びｐ型導電性高分子化合物のいずれもを挙げることができる。このような導電性高分子化合物には、例えば、以下のものが挙げられる。
As the conductive polymer compound according to the present invention, any compound can be used as long as it has a conjugated double bond and can exchange electrons, and can contribute to the electron transfer (oxidation-reduction) action in microorganisms. It may be used.
As such a conductive polymer compound, both an n-type conductive polymer compound and a p-type conductive polymer compound can be exemplified. Examples of such conductive polymer compounds include the following.
このうち、式ＩＩ及び式ＩＶの化合物はｎ型ｐ型ドープが可能であり、簡便に合成することができるという利点を有しており、式ＩＩＩの化合物は水溶性導電性高分子化合物であって両親媒性を有している。このため、これらの導電性高分子化合物はそれぞれの特性に応じた用途で好ましく使用することができる。また式Ｖの化合物はバンドキャップが低く光学活性部位を有しているため微生物への親和性をより高いものにすることができる。 Among these, the compounds of formula II and formula IV have the advantage that they can be n-type and p-type doped and can be easily synthesized. The compound of formula III is a water-soluble conductive polymer compound. And amphiphilic. For this reason, these electroconductive high molecular compounds can be preferably used for the use according to each characteristic. In addition, since the compound of formula V has a low band cap and an optically active site, it can have a higher affinity for microorganisms.
また上記の他にも、以下のｎ型導電性高分子化合物を挙げることができ、このうち、ポリ（２，５−ピリジン）及びポリ（２，６−ピリジンビニレン）が、合成及び加工性の観点から好ましく、ポリ（２，６−ピリジンビニレン）がｎ型ｐ型ドープの両者が可能であるためにより広範な微生物又は細胞に適用することができるため、好ましい。 In addition to the above, the following n-type conductive polymer compounds can be exemplified, among which poly (2,5-pyridine) and poly (2,6-pyridinevinylene) are synthesized and processable. From the viewpoint, poly (2,6-pyridinevinylene) is preferable because it can be applied to a wider range of microorganisms or cells because both n-type and p-type dopes are possible.
この他にも、本発明では以下の導電性高分子化合物を挙げることができる。 In addition, the following conductive polymer compounds can be exemplified in the present invention.
このうち、ポリアセチレンはｎ型及びｐ型ドーピングが可能でイオン化ポテンシャルが小さく、電子親和性が大きいため、微生物との相互作用が大きいという利点を有し、（ｂ）〜（ｊ）の化合物はｐ型ドープ可能で合成が容易であり、（ｋ）は電子導電性と共にイオン導電性を有するために微生物又は細胞との相互作用が特に大きいという利点を有する。また（ｌ）〜（ｍ）はバンドギャップが低く外部に電子を容易に供給することができ、（ｏ）及び（ｐ）は発光性高分子化合物であって、モノマーユニット上に比較的強く電子が局在するという特性を有し、（ｑ）は光導電性高分子化合物であって外部光によりポリマー内部でキャリアを発生することができるという特性を有する。またこれらの導電性高分子化合物のうち、発光性高分子化合物及び光導電性高分子化合物は、光エネルギーによってより多くの電子がポリマー上に発生するため、より多くの電子を生物に渡すことができるため、特に好ましい。 Among these, polyacetylene can be doped n-type and p-type, has a low ionization potential, and has a high electron affinity, and therefore has the advantage of a large interaction with microorganisms. The compounds (b) to (j) are p Since it is mold-doped and easy to synthesize, (k) has the advantage that the interaction with microorganisms or cells is particularly large because it has ionic conductivity as well as electronic conductivity. In addition, (l) to (m) have a low band gap and can easily supply electrons to the outside, and (o) and (p) are luminescent polymer compounds, which are relatively strong electrons on the monomer unit. (Q) is a photoconductive polymer compound that can generate carriers inside the polymer by external light. Among these conductive polymer compounds, the light-emitting polymer compound and the photoconductive polymer compound generate more electrons on the polymer due to light energy, and thus can pass more electrons to living organisms. This is particularly preferable because it can be performed.
また光学活性を有する導電性高分子化合物では、Ｌ体及びＤ体のいずれであってもよいが、アミノ酸などの生体分子がＬ体の光学活性を有することからＬ体の導電性高分子化合物であることが特に好ましい。Ｌ体の導電性高分子化合物を用いた場合には、微生物又は細胞に対する親和性が高く、微生物又は細胞を引き付ける吸引性を持たせることができる。
このように、これらの導電性高分子化合物は、各特性を考慮して、対象となる種々の微生物及び細胞並びに活性化反応に応じて、適宜選択される。
The conductive polymer compound having optical activity may be either L-form or D-form. However, since biomolecules such as amino acids have L-form optical activity, they are L-form conductive polymer compounds. It is particularly preferred. When the L-type conductive polymer compound is used, it has a high affinity for microorganisms or cells, and can have a suction property that attracts microorganisms or cells.
As described above, these conductive polymer compounds are appropriately selected according to various microorganisms and cells to be targeted and the activation reaction in consideration of each characteristic.
なお、上記の構造式においてｎはいずれも２０〜３００の整数であり、好ましくは５０〜３００の整数であり、特に好ましくは８０〜１５０である。ｎが２０未満では導電性高分子化合物としての作用に期待できず、一方、３００を超えると合成及び加工をすることが難しくなるため、好ましくない。また式中Ｒは置換又は未置換アルキル基、好ましくは１〜１５の置換又は未置換のアルキル基であって、例えばメチル、エチル、ヘキシル、ドデシルや、両親媒性のデシルスルホン酸で置換されたアルキル基等が挙げられる。 In the above structural formula, n is an integer of 20 to 300, preferably an integer of 50 to 300, and particularly preferably 80 to 150. If n is less than 20, it cannot be expected to act as a conductive polymer compound. On the other hand, if it exceeds 300, synthesis and processing become difficult, which is not preferable. In the formula, R is a substituted or unsubstituted alkyl group, preferably a substituted or unsubstituted alkyl group of 1 to 15, which is substituted with, for example, methyl, ethyl, hexyl, dodecyl, or amphiphilic decylsulfonic acid. An alkyl group etc. are mentioned.
導電性高分子化合物は、そのうちの１種類を単独で用いてもよく２種以上を組み合わせて使用してもよいが、異なる特性の各導電性高分子化合物を組み合わせて使用することが、微生物の活性をより効果的に高めることができるため、好ましい。特に、上記式Ｉの化合物と式ＩＩの化合物との組み合わせ、式ＩＩの化合物と式ＩＩＩの化合物との組み合わせ等が好ましい。 Of the conductive polymer compounds, one of them may be used alone, or two or more of them may be used in combination. However, it is possible to use a combination of different conductive polymer compounds having different characteristics. Since activity can be improved more effectively, it is preferable. In particular, a combination of the compound of formula I and the compound of formula II, a combination of the compound of formula II and the compound of formula III, and the like are preferable.
これらの導電性高分子化合物は、導電性高分子化合物の種類に応じた既知の方法に従って合成することができる。また導電性高分子化合物には市販品を含むことができ、このようなものには、例えばアルドリッチ社製のポリアセチレン、ポリアニリン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリフェニレンビニレン及びその誘導体、ポリフルオロエチニレン及びポリフェニレンスルフィドや、ＮＥＳＴＥ社製のポリアニリン、バイエル社製のポリ(３，４−エチレンジオキシチオフェン）−ポリスチレン（ＰＥＤＯＴ）ブレンド品（商品名バイトロンＰ（Baytron P)）を挙げることができる。 These conductive polymer compounds can be synthesized according to a known method according to the type of the conductive polymer compound. In addition, the conductive polymer compound may include commercially available products, such as polyacetylene, polyaniline, polypyrrole, polythiophene, polyphenylene vinylene and its derivatives, polyfluoroethynylene and polyphenylene sulfide manufactured by Aldrich. And polyaniline manufactured by NESTE, and poly (3,4-ethylenedioxythiophene) -polystyrene (PEDOT) blend product (trade name: Baytron P) manufactured by Bayer.
導電性高分子化合物は微生物又は細胞の成育・維持環境下に存在していればよく、導電性高分子化合物を単独で直接添加してもよい。導電性高分子化合物を直接添加する方法では、導電性高分子化合物を、例えば土中又は水中で物質分解中の微生物に対して直接又は肥料等と共に添加すればよい。 The conductive polymer compound only needs to exist in the growth / maintenance environment of microorganisms or cells, and the conductive polymer compound may be directly added alone. In the method of directly adding a conductive polymer compound, the conductive polymer compound may be added directly or together with a fertilizer or the like to microorganisms that are being decomposed in soil or water.
また導電性高分子化合物は、導電性高分子化合物と適当な担体とを含む生物活性化組成物として用いることができる。
ここで用いられる担体としては、例えば通常、微生物又は細胞の培養に用いられる成育培地を挙げることができる。この場合には、他の成分として、通常の培養に用いられる栄養源成分などを挙げることができる。これらの成分は、生物活性化組成物の利用形態に合わせて適宜選択される。
The conductive polymer compound can be used as a bioactivation composition containing a conductive polymer compound and a suitable carrier.
Examples of the carrier used here include a growth medium usually used for culturing microorganisms or cells. In this case, examples of other components include nutrient source components used in normal culture. These components are appropriately selected according to the utilization form of the bioactivation composition.
培養培地としては、培養対象となる生物の種類に応じて通常用いられる周知のものが含まれ、例えば、シュードモナス属などを含む多くの微生物の培養には、ＬＢ培地、ＮＮ培地、さらに最小培地（無機塩培地）などが好ましく用いられる。この培養培地は、液体に限らず、ゲル状などの半固体状のものも含むことができる。
栄養源成分しては、生物の成育・維持のために必要な一般的な栄養素を含むことができる。したがって、生物活性化組成物は、微生物の培養培地を基礎とすることが好ましい。
Examples of the culture medium include well-known culture media that are usually used according to the type of organism to be cultured. For example, many microorganisms including Pseudomonas are cultured in LB medium, NN medium, and minimum medium ( An inorganic salt medium) is preferably used. This culture medium is not limited to a liquid, but may include a semi-solid material such as a gel.
The nutrient component can include general nutrients necessary for the growth and maintenance of organisms. Accordingly, the bioactivation composition is preferably based on a microbial culture medium.
また生物の成育・維持環境下へ、散布などの適用形態で添加するためには水を担体としてもよい。この場合には、既に成育・維持している環境下へ水溶液又はコロイド形態として水と共に用いられる。或いは、マイクロカプセル化に必要な既知の賦形剤と組み合わせて用いてもよい。 In addition, water may be used as a carrier in order to add to the growth / maintenance environment of living organisms in an application form such as spraying. In this case, it is used together with water in the form of an aqueous solution or colloid in an already grown and maintained environment. Alternatively, it may be used in combination with known excipients necessary for microencapsulation.
導電性高分子化合物は、生物活性化組成物において、微生物が有効利用することができる量で配合することができる。使用時の最終濃度としては、生物種及び組成物の用途によって適宜変更することができるが、一般に、成育培地として用いる場合には、組成物全体の容量に対して０．００１〜５００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で配合される。導電性高分子化合物の量を多くすれば微生物による活性化効率は高くなるが、５００ｍｇ／ｍｌを超えると培地としての作用を損うことが予測されるため、好ましくない。 The conductive polymer compound can be blended in an amount that can be effectively used by microorganisms in the bioactivation composition. The final concentration at the time of use can be appropriately changed depending on the species and the application of the composition. In general, when used as a growth medium, 0.001 to 500 mg / ml with respect to the total volume of the composition, Preferably it is blended at a concentration of 0.001 to 10 mg / ml. If the amount of the conductive polymer compound is increased, the activation efficiency by microorganisms increases, but if it exceeds 500 mg / ml, it is predicted that the action as a medium is impaired, which is not preferable.
本発明の生物活性化組成物を微生物又は細胞の培養方法に適用する場合には、通常の培養条件をそのまま適用することができる。培養対象となる微生物の数が充分でない場合には、生物活性化組成物による培養を開始する前に、前培養工程を設けてもよい。これにより、充分な数の微生物を効率よく活性化することができる。 When the bioactive composition of the present invention is applied to a microorganism or cell culture method, normal culture conditions can be applied as they are. When the number of microorganisms to be cultured is not sufficient, a pre-culturing step may be provided before starting the culture with the bioactive composition. Thereby, a sufficient number of microorganisms can be activated efficiently.
導電性高分子化合物は、一般に、生物活性化組成物中に可溶化形態で含まれるが、コロイド（微粒子）状で分散させることが好ましい。この場合には、微生物との接触面積を増加させることができるため、より効率よく微生物を活性化することができる。導電性高分子化合物のコロイド化は、導電性高分子自体の特性に応じて適宜選択される。
例えば、ポリアニリン（上記式（Ｉ）の化合物）の場合には、界面活性剤、アニリン又はアニリン誘導体の塩酸塩を溶解し、これをペルオキソ二硫酸アンモニウムで化学酸化重合することによって、重合時にコロイド化する方法が挙げられる。また、得られた高分子化合物に界面活性剤を加えて強く攪拌することによって均一分散水溶液として、コロイド化することもできる。
また他の導電性高分子化合物では、溶媒に溶解させてポリマー溶液を作製し、強く攪拌した水溶液中にゆっくりと滴下することにより、容易にコロイド化することができる。この際に界面活性剤が存在すると、より効率よく微粒子を得ることができるため、好ましい。
In general, the conductive polymer compound is contained in the biologically activated composition in a solubilized form, but is preferably dispersed in a colloid (fine particle) form. In this case, since the contact area with the microorganism can be increased, the microorganism can be activated more efficiently. The colloidalization of the conductive polymer compound is appropriately selected according to the characteristics of the conductive polymer itself.
For example, in the case of polyaniline (compound of the above formula (I)), a surfactant, aniline or hydrochloride of aniline derivative is dissolved, and this is colloidalized during polymerization by chemical oxidative polymerization with ammonium peroxodisulfate. A method is mentioned. In addition, a surfactant can be added to the resulting polymer compound and stirred vigorously to form a colloidal solution as a uniformly dispersed aqueous solution.
Other conductive polymer compounds can be easily colloided by dissolving in a solvent to prepare a polymer solution and slowly dropping it into a strongly stirred aqueous solution. In this case, the presence of a surfactant is preferable because fine particles can be obtained more efficiently.
更に、導電性高分子化合物のうち加工可能なものについては特定の形態の活性化部材に成形して、これを微生物の成育・維持環境下に配置することができる。これにより、培養組成や培養形態等に制限されずに、また繰り返し使用して、微生物の活性化に適用することができる。 Furthermore, what can be processed among conductive polymer compounds can be formed into an activated member of a specific form and placed in a growth / maintenance environment for microorganisms. Thereby, it is not restrict | limited to a culture composition, a culture form, etc., It can be used repeatedly and can be applied to activation of microorganisms.
導電性高分子化合物を活性化部材として用いる場合には、導電性高分子化合物の種類に応じて一般に行われている方法に従って加工すればよい。導電性高分子化合物の加工形態としては、層状、フィルム状、板状、ブロック状等、特に制限されない。また活性化部材の配置方法としては、塗布や貼り付けなど通常行われている方法をそのまま用いることができる。選択された導電性高分子化合物を活性化部材として用いる場合には、当業者であればどのような方法を用いて設置すればよいか容易に理解できる。例えば、導電性高分子化合物のフィルムを作製してその上で直接生物を培養したり、バイオリアクターの内壁、チューブ若しくはパイプの内壁を導電性高分子化合物でコートして、その内部で培養を行うことができる。 When a conductive polymer compound is used as an activating member, it may be processed according to a generally performed method according to the type of the conductive polymer compound. The processing form of the conductive polymer compound is not particularly limited, such as layered, film-like, plate-like, or block-like. In addition, as a method for arranging the activating member, a conventional method such as coating or pasting can be used as it is. When using the selected conductive polymer compound as an activation member, those skilled in the art can easily understand what method should be used for installation. For example, a film of a conductive polymer compound is produced and a living organism is directly cultured on the film, or the inner wall of a bioreactor, the inner wall of a tube or a pipe is coated with a conductive polymer compound, and culturing is performed inside the film. be able to.
本発明による生物活性化の効果は、対象となる微生物の活性を通常の方法に従って測定することにより、容易に確認することができる。微生物の活性化の場合には、窒素分解活性や、生分解性プラスチックの残留試験等を挙げることができ、細胞による物質産生能の場合には、目的とする物質量の測定を挙げることができる。これらの測定方法については周知のものをそのまま用いることができ、当業者は容易に実施することができる。 The effect of bioactivation according to the present invention can be easily confirmed by measuring the activity of the target microorganism according to a normal method. In the case of microbial activation, nitrogen decomposition activity, residual test of biodegradable plastics, etc. can be mentioned. In the case of substance production ability by cells, measurement of the target substance amount can be mentioned. . About these measuring methods, a well-known thing can be used as it is, and those skilled in the art can implement easily.
本発明によれば、導電性高分子化合物を微生物又は細胞の成育・維持環境下に単に存在させることによって生物の活性を高めることができるので、生物の活性に基づくあらゆる分野に利用することができる。 According to the present invention, since the activity of a living organism can be enhanced simply by allowing the conductive polymer compound to exist in the growth / maintenance environment of the microorganism or cell, it can be used in any field based on the activity of the organism. .
例えば、土中の微生物による分解活性を高めるためには、導電性高分子化合物又は生物活性化組成物若しくは活性化部材を、微生物を含む対象の土に適当な濃度で散布又は埋設する。これにより、土中に浸透した導電性高分子化合物と微生物とが接触して微生物が活性化され、分解活性が高まって、散布領域の土中分解を促進することができる。 For example, in order to increase the degradation activity by microorganisms in the soil, the conductive polymer compound or the bioactivation composition or activation member is sprayed or embedded at an appropriate concentration in the soil of the target containing microorganisms. As a result, the conductive polymer compound that has penetrated into the soil comes into contact with the microorganism to activate the microorganism, the decomposition activity is increased, and the decomposition of the sprayed area in the soil can be promoted.
一方、廃水処理に本組成物を使用する場合には、廃水と微生物との混合液に、例えば、処理量に応じた導電性高分子化合物濃度となるように導電性高分子化合物又は生物活性化組成物若しくは活性化部材を添加又は配置する。或いは、予め生物を本組成物によって培養し、適切な数に到達又は適切な程度に活性化した後に、生物散布を行うこともできる。 On the other hand, when this composition is used for wastewater treatment, the conductive polymer compound or biological activation is performed in the mixed solution of wastewater and microorganisms, for example, so that the concentration of the conductive polymer compound depends on the treatment amount. Add or place the composition or activation member. Alternatively, the organism can be sprayed after the organism has been cultured with the present composition in advance and has reached an appropriate number or activated to an appropriate degree.
また、導電性高分子化合物を他の生分解性プラスチックとブレンドして、高い生分解性が付与されたポリマーアロイを得ることができる。また、ポリマーの一部に高い生分解性部分を盛り込んで、導電性高分子化合物と生分解性高分子とのポリマーを得ることもできる。これらの高生分解性部分は、周囲の分解菌の分解活性を高める部分及び／又は分解菌に対する吸引性を有する部分となって、ポリマー全体の分解性を高めることができる。このように、生分解活性がより高められた新規の高生分解性プラスチックを開発することができる。 In addition, a polymer alloy imparted with high biodegradability can be obtained by blending a conductive polymer compound with another biodegradable plastic. Moreover, a polymer of a conductive polymer compound and a biodegradable polymer can be obtained by incorporating a high biodegradable part into a part of the polymer. These highly biodegradable portions can be portions that enhance the degrading activity of the surrounding degrading bacteria and / or portions that have absorptivity to the degrading bacteria, and can improve the degradability of the entire polymer. In this way, a novel highly biodegradable plastic having a higher biodegradation activity can be developed.
更には、微生物又は細胞に対する吸引性の高い導電性高分子化合物を選択した場合には、体内において浮遊又は浸潤細胞を効果的に引き付けることができるので、既存のシステムと組み合わせて又は新規に、効果的なドラッグ・デリバリー・システムを構築することができる。 Furthermore, when a conductive polymer compound with high absorptivity to microorganisms or cells is selected, floating or infiltrating cells can be effectively attracted in the body, so it is effective in combination with a new system or newly. A practical drug delivery system.
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量基準である。 Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited thereto. In the examples, “%” is based on weight unless otherwise specified.
（１）導電性高分子化合物の合成
１．ポリアニリン（式Ｉの化合物）の合成
A. G. MacDiarmid, C. J. Chiang, M. Halpern, W. S. Huang, S. L. Mu, M. L. D. Somasiri, W. Wu, and S. I. Yaniger, Molecular Crystals and Liquid Crystals, 121, 467 (1985)及びAndretta, Y. Cao, J. Chiang, A.J. Heeger, P. Smith, Synthetic Metals, 26, 383-389 (1988) の方法により合成した。これを簡単に説明すれば、１３．３ｍｌの蒸留したアニリンを、１．３３Ｍに調製した１５０ｍｌの塩酸に溶かし、これを−５℃に冷やした。別に２６．７ｍｌの蒸留水に１５．３３ｇの（ＮＨ4）2Ｓ2Ｏ8 (ペルオキソ二硫酸アンモニウム)を溶かした。この溶液を、攪拌したアニリン塩酸溶液に１時間かけてゆっくり滴下した。滴下終了後さらに一晩攪拌した。得られた沈殿物をろ過した後、これをｐＨが６〜７になるまで蒸留水で洗浄し、さらにメタノールで洗浄し、真空乾燥して中性ポリアニリンを得た（収率３６%）。これをヒドラジンで処理し、還元型のポリアニリンを合成した。
(1) Synthesis of conductive polymer compound Synthesis of polyaniline (compound of formula I)
AG MacDiarmid, CJ Chiang, M. Halpern, WS Huang, SL Mu, MLD Somasiri, W. Wu, and SI Yaniger, Molecular Crystals and Liquid Crystals, 121, 467 (1985) and Andretta, Y. Cao, J. Chiang, AJ Heeger, P. Smith, Synthetic Metals, 26, 383-389 (1988). In brief, 13.3 ml of distilled aniline was dissolved in 150 ml of hydrochloric acid prepared to 1.33 M and cooled to -5 ° C. Separately, 15.33 g of (NH 4 ) 2 S 2 O 8 (ammonium peroxodisulfate) was dissolved in 26.7 ml of distilled water. This solution was slowly added dropwise to the stirred aniline hydrochloric acid solution over 1 hour. After completion of dropping, the mixture was further stirred overnight. After the obtained precipitate was filtered, it was washed with distilled water until the pH reached 6-7, further washed with methanol, and vacuum dried to obtain neutral polyaniline (yield 36%). This was treated with hydrazine to synthesize reduced polyaniline.
２．ポリ（２，６−ピリジンビニレン−コ−アゾベンゼン）（式ＩＩの化合物）の合成
アルゴン雰囲下中、５ｍｌのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）、２２ｍｇのＰｄ2（ｄｂａ）3（０．０２４ｍｍｏｌ）及び２４ｍｇのトリ（２−フリル）ホスフィン［Ｐ（フリル）3］（０．１ｍｍｏｌ）を加え、室温にて攪拌した。反応溶液は速やかに赤褐色から黄色へと変化した。ここに、１ｍｌのＴＨＦに溶かした２，５−ジブロモピリジン０．３ｇ（１．２８ｍｍｏｌ）を加え、さらに１時間後に、１ｍｌのＴＨＦに溶かしたトリブチルビニルスタナン０．８ｇ（２．５ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、これを５０℃で１時間攪拌した。反応液は黒褐色に変化した。８０℃に加熱して攪拌を続けＴＨＦを除去した。ここにジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）を１０ｍｌ加えた後、５６ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）のパラジウム（ＩＩ）アセテート［Ｐｄ（ＯＡｃ）2］と０．４ｇ（１．３ｍｍｏｌ）のトリ（ｏ−トリル）ホスフィン及びジブロモアゾベンゼン（合成法はO. H.Wheeler, D. Gonzalez, Tetrahedron, 20, 189, (1964) による）０．４３ｇ（１．２８ｍｍｏｌ）を加えた。これにトリエチルアミン［ＮＥｔ3］を５ｍｌ加え、１００℃で５日間攪拌した。トリエチルアミンは蒸発するので２４ｈ時間ごとに２ｍｌ加えた。その後攪拌を停止し、メタノール／塩酸混合溶液にて洗浄を２回行なった。沈殿物をガラスフィルターで回収し、オレンジ色のポリマーを得た（収量０．２９ｇ、収率７５％）。
2. Synthesis of poly (2,6-pyridinevinylene-co-azobenzene) (compound of formula II) In an argon atmosphere, 5 ml of tetrahydrofuran (THF), tris (dibenzylideneacetone) dipalladium (0), 22 mg of Pd 2 (Dba) 3 (0.024 mmol) and 24 mg of tri (2-furyl) phosphine [P (furyl) 3 ] (0.1 mmol) were added and stirred at room temperature. The reaction solution quickly changed from reddish brown to yellow. To this, 0.3 g (1.28 mmol) of 2,5-dibromopyridine dissolved in 1 ml of THF was added, and after 1 hour, 0.8 g (2.5 mmol) of tributylvinylstannane dissolved in 1 ml of THF was added. Slowly added and stirred at 50 ° C. for 1 hour. The reaction liquid turned blackish brown. The mixture was heated to 80 ° C. and stirring was continued to remove THF. 10 ml of dimethylformamide (DMF) was added thereto, and then 56 mg (0.25 mmol) of palladium (II) acetate [Pd (OAc) 2 ] and 0.4 g (1.3 mmol) of tri (o-tolyl) phosphine. And 0.43 g (1.28 mmol) of dibromoazobenzene (according to OH Wheeler, D. Gonzalez, Tetrahedron, 20, 189, (1964)). To this, 5 ml of triethylamine [NEt 3 ] was added and stirred at 100 ° C. for 5 days. Since triethylamine evaporates, 2 ml was added every 24 h. Thereafter, stirring was stopped, and washing was performed twice with a methanol / hydrochloric acid mixed solution. The precipitate was collected with a glass filter to obtain an orange polymer (yield 0.29 g, yield 75%).
３．ポリ（ピリジンビニレン）（式ＩＶの化合物）の合成
アルゴン雰囲気下、３ｍｌのＤＭＦに、１１ｍｇのＰｄ2（ｄｂａ）3（０．０１２ｍｍｏｌ）及び１１ｍｇのＰ（フリル）3（０．０４８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて攪拌した。ここに０．３ｇの２，５−ジブロモピリジン（１．３ｍｍｏｌ）を加え、さらに１時間後に、１ｍｌのＴＨＦに溶かした１，２−ビス（トリブチルスタニルエチレン）０．７３ｇ（１．２ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、これを５０℃で１時間攪拌した。反応液は黒褐色に変化した。８０℃に加熱して３日間攪拌した。メタノール／塩酸の混合溶液で２回洗浄し、ガラスフィルターで回収し、黄土色のポリマーを得た（収量：８１．８ｍｇ、収率６１％）。
3. Synthesis of poly (pyridine vinylene) (compound of formula IV) In an argon atmosphere, 11 mg of Pd 2 (dba) 3 (0.012 mmol) and 11 mg of P (furyl) 3 (0.048 mmol) were added to 3 ml of DMF. And stirred at room temperature. To this was added 0.3 g of 2,5-dibromopyridine (1.3 mmol), and after 1 hour, 0.73 g (1.2 mmol) of 1,2-bis (tributylstannylethylene) dissolved in 1 ml of THF. Was slowly added and stirred at 50 ° C. for 1 hour. The reaction liquid turned blackish brown. The mixture was heated to 80 ° C. and stirred for 3 days. The extract was washed twice with a mixed solution of methanol / hydrochloric acid and collected with a glass filter to obtain an ocher polymer (yield: 81.8 mg, 61% yield).
４．式Ｖの化合物の合成
イソチアナフテン及び（Ｒ）−（−）−４−（３，７−ジメチル）オクチルオキシベンズアルデヒドの０．１Ｍ１，４−ジオキサン溶液に２０ｖｏｌ％のオキシ塩化リンをゆっくり加え、これを８０℃で２４時間還流させた。沈殿物をガラスフィルターで回収し、ソックスレー抽出器を用いてメタノールで洗浄し、さらにアンモニアで洗浄した後、ろ別することにより真空乾燥してポリマーを得た。
4). Synthesis of a compound of formula V Slowly add 20 vol% phosphorus oxychloride to a 0.1 M 1,4-dioxane solution of isothianaphthene and (R)-(−)-4- (3,7-dimethyl) octyloxybenzaldehyde. This was refluxed at 80 ° C. for 24 hours. The precipitate was collected with a glass filter, washed with methanol using a Soxhlet extractor, further washed with ammonia, and then filtered to obtain a polymer by vacuum drying.
（２）脱窒活性測定
シュードモナス・エアロジノーザ（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１株をＬＢ培地（ＬＢ培地；nacalai tesque社製、表１参照）４ｍｌ入り中試験管に植菌した。これを、３７℃、１６５ｒｐｍで１２時間培養し、前培養とした。得られた前培養液２００μｌを、ＮＮ培地（ＫＮＯ3 -１００ｍＭ）（表１参照）２ｍｌ入りハンゲートチューブ（１６ｍｌ容）へ植菌した。ハンゲートチューブ中には、上記のようにして作製された導電性高分子化合物のうちポリアニリン（式Ｉ）及びポリ(２，６−ピリジンビニレン−コ−アゾベンゼン）（式ＩＩ）を予め添加した。導電性高分子化合物の種類及び添加条件は表２に示す。ハンゲートチユーブをゴム栓及び、スクリューキャップにより密封し、３７℃，１６５ｒｐｍで７時間培養した。その後、生育量、培地中の硝酸濃度、及びヘッドスペースのＮ2Ｏ濃度を定量し、脱窒活性とした。
生育は、BECKMAN COULTER社製 DU640の吸光光度計を用いて、吸光度６６０ｎｍにより測定した。
(2) Denitrification activity measurement Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain was inoculated into a medium test tube containing 4 ml of LB medium (LB medium; manufactured by nacalai tesque, see Table 1). This was cultured at 37 ° C. and 165 rpm for 12 hours to prepare a preculture. The preculture 200μl obtained, NN medium - was inoculated to (KNO 3 100 mM) (see Table 1) 2 ml containing Hungate tubes (16 ml capacity). In the Hangate tube, polyaniline (formula I) and poly (2,6-pyridinevinylene-co-azobenzene) (formula II) among the conductive polymer compounds prepared as described above were added in advance. Table 2 shows the types of conductive polymer compounds and the addition conditions. The Hangate tube was sealed with a rubber stopper and a screw cap, and cultured at 37 ° C. and 165 rpm for 7 hours. Thereafter, the amount of growth, the concentration of nitric acid in the medium, and the N 2 O concentration in the headspace were quantified to obtain denitrification activity.
Growth was measured at an absorbance of 660 nm using a DU640 absorptiometer manufactured by BECKMAN COULTER.
硝酸はブルシン・スルファニル酸法により測定した。検水１００μｌに、ブルシン・スルファニル酸溶液（１％ブルシン、０．１％スルファニル酸、３％（ｖ／ｖ）ＨＣｌ）５０μｌを加えて室温で５分放置した。その後、硫酸溶液（８０％Ｈ2ＳＯ4）を５００μｌを加えて室温で１０分放置した。蒸留水後、５００μｌを加えて室温で３０分放置した後、吸光度４１０ｎｍで測定した。
Ｎ2Ｏ濃度はガスクロマトグラフィー（SHIMADZU社製 GC-8A ）により測定した。
結果を表３に示す（実施例１〜３）。
一方、導電性高分子化合物をいずれも含まない以外は同様にして培養したものを、比較例とした。結果を表３に示す。
Nitric acid was measured by the brucine sulfanilic acid method. To 100 μl of test water, 50 μl of brucine sulfanilic acid solution (1% brucine, 0.1% sulfanilic acid, 3% (v / v) HCl) was added and left at room temperature for 5 minutes. Thereafter, 500 μl of a sulfuric acid solution (80% H 2 SO 4 ) was added and left at room temperature for 10 minutes. After distilled water, 500 μl was added and left at room temperature for 30 minutes, and the absorbance was measured at 410 nm.
The N 2 O concentration was measured by gas chromatography (GC-8A manufactured by SHIMADZU).
The results are shown in Table 3 (Examples 1 to 3).
On the other hand, what was cultured similarly except not containing any conductive polymer compound was made into the comparative example. The results are shown in Table 3.
表３に示されるように、導電性高分子化合物を含まないＮＮ培地で生育させた場合（比較例）と比較して、導電性高分子化合物を含むＮＮ培地で生育させた場合（実施例１〜３）では、増殖の程度には差がないにも拘らず、Ｎ2Ｏの排出量が増加していた。特に、導電性高分子化合物を組み合わせて使用した場合には、Ｎ2Ｏは約２割上昇しており、残存硝酸量も１割程度低かった。 As shown in Table 3, when grown on a NN medium containing a conductive polymer compound (Example 1), compared to when grown on a NN medium containing no conductive polymer compound (Comparative Example). In ~ 3), the amount of N 2 O emission increased despite the fact that there was no difference in the degree of proliferation. In particular, when the conductive polymer compound was used in combination, N 2 O increased by about 20%, and the residual nitric acid amount was about 10% lower.
このことから、本発明によれば、導電性高分子化合物を微生物の成育・維持環境下に単に存在させることによって、導電性高分子化合物が微生物と電子的な相互作用から、同一種類の微生物であっても且つ特別な処理を行うことなく脱窒素反応を顕著に高めることができることが明らかである。このような電子的な相互作用は、微生物以外の細胞であっても、また窒素呼吸に限らない反応においても生じるため、あらゆる生物活性に対しても、導電性高分子化合物によって同様に高まることが示された。 Therefore, according to the present invention, the conductive polymer compound is simply present in the growth / maintenance environment of the microorganism, so that the conductive polymer compound can interact with the microorganism from the same type of microorganism. It is clear that the denitrification reaction can be significantly enhanced even without any special treatment. Such electronic interactions occur in cells other than microorganisms and in reactions that are not limited to nitrogen respiration, and are therefore similarly enhanced by conductive polymer compounds for all biological activities. Indicated.
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