JP2005249573A - Target molecule detecting method and labelling agent therefor - Google Patents
Target molecule detecting method and labelling agent therefor Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005249573A JP2005249573A JP2004060219A JP2004060219A JP2005249573A JP 2005249573 A JP2005249573 A JP 2005249573A JP 2004060219 A JP2004060219 A JP 2004060219A JP 2004060219 A JP2004060219 A JP 2004060219A JP 2005249573 A JP2005249573 A JP 2005249573A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- molecule
- electron
- target
- electron donor
- target molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Description
本発明は、生体分子等の分子を標識して検出する方法及びそれに用いられる標識剤に関する。本発明は、また、生体分子等の分子に結合させ、標的分子の操作又は接着方法並びにそれに用いられる分子操作剤及び分子接着剤に関する。 The present invention relates to a method for labeling and detecting a molecule such as a biomolecule and a labeling agent used therefor. The present invention also relates to a method for manipulating or adhering a target molecule by binding to a molecule such as a biomolecule, a molecular manipulation agent and a molecular adhesive used therefor.
従来より、２種類の標識分子間のエネルギー移動を利用して分子の挙動の観察や検出を行なう方法として、２種類の蛍光色素間のエネルギー移動を利用した方法が知られている。これは、蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)と呼ばれる方法で、ドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素が約10nm程度以下の距離に近づくと、ドナー蛍光色素からアクセプター蛍光色素に蛍光エネルギーが移動し、ドナー蛍光色素単独の場合とは異なる波長の蛍光がアクセプター蛍光色素から発せられたり、ドナー蛍光色素の発光がアクセプター蛍光色素へのエネルギー移動により消光する現象を利用して、標識した標的分子の検出や、２種の標的分子間の相互作用の測定が行なわれている。 Conventionally, a method using energy transfer between two types of fluorescent dyes is known as a method for observing or detecting the behavior of a molecule using energy transfer between two types of labeled molecules. This is a method called Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). When the donor fluorescent dye and the acceptor fluorescent dye approach a distance of about 10 nm or less, the fluorescence energy moves from the donor fluorescent dye to the acceptor fluorescent dye. However, the fluorescence of a wavelength different from the case of the donor fluorescent dye alone is emitted from the acceptor fluorescent dye, or the emission of the donor fluorescent dye is quenched by the energy transfer to the acceptor fluorescent dye. Detection and measurement of the interaction between two target molecules are performed.
しかしながら、従来のFRETでは、ドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素が約10nmの距離に近づくとエネルギー移動が起きるので、解像度は理論的に約10nmが限度である。従って、生体分子の挙動を分子レベルで観察することは困難である。また、FRETでは、ドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素の間に強い引力が働くというわけではないので、標識を利用して標的分子に外力を働かせ、分子を操作したり接着したりすることはできない。 However, in the conventional FRET, energy transfer occurs when the donor fluorescent dye and the acceptor fluorescent dye approach a distance of about 10 nm, so the resolution is theoretically limited to about 10 nm. Therefore, it is difficult to observe the behavior of biomolecules at the molecular level. In addition, in FRET, a strong attractive force does not work between a donor fluorescent dye and an acceptor fluorescent dye, and therefore, an external force cannot be applied to a target molecule using a label to manipulate or attach the molecule.
本発明の目的は、従来のFRETよりも高い解像度で標的分子の観察や検出を行うことができる、標的分子の検出又は観察方法及びそれに用いられる標識剤を提供することである。また、本発明の目的は、標的分子に外力を加えることにより、分子を操作したり接着したりする方法及びそれに用いられる分子操作剤及び分子接着剤を提供することである。 An object of the present invention is to provide a method for detecting or observing a target molecule and a labeling agent used therefor, which can observe and detect a target molecule with higher resolution than conventional FRET. Another object of the present invention is to provide a method for manipulating and adhering a molecule by applying an external force to the target molecule, and a molecular manipulation agent and a molecular adhesive used therefor.
本願発明者らは、鋭意研究の結果、電荷移動錯体の形成能を有する電子供与体分子と電子受容体分子を標識剤として利用することにより、従来のFRETよりも高い解像度で標的分子の観察や検出を行うことができることに想到し、本発明を完成した。また、電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方又は両方を、同一又は異なる標的分子に結合させ、電子供与体分子と電子受容体分子の間に引力を作用させることにより、分子の形態や位置を操作することができ、また、分子同士を接着することができることに想到し、本発明を完成した。 As a result of diligent research, the inventors of the present application have made it possible to observe target molecules with higher resolution than conventional FRET by using an electron donor molecule and an electron acceptor molecule having the ability to form a charge transfer complex as a labeling agent. The present invention was completed by conceiving that detection can be performed. In addition, either or both of an electron donor molecule and an electron acceptor molecule are bonded to the same or different target molecules, and an attractive force is applied between the electron donor molecule and the electron acceptor molecule, thereby forming a molecular form. The present invention has been completed by conceiving that the position can be manipulated and the molecules can be bonded to each other.
すなわち、本発明は、電荷移動錯体を形成する電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方で標的分子を標識し、他方をプローブとして用い、電子供与体分子と電子受容体分子との間の電荷移動に起因する発光を利用して標的分子の検出を行なうことを含む、標的分子の検出方法を提供する。また、本発明は、電子供与体分子及び電子受容体分子を用いて、同一又は異なる分子を標識し、電子供与体分子と電子受容体分子間の電荷移動に起因する発光を利用して単一の標的分子又は２種類の標的分子間の挙動を観察することを含む、標的分子の挙動の観察方法を提供する。さらに、本発明は、電荷移動錯体の電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方、又は両方を同一又は異なる標的分子に結合させ、電子供与体分子と電子受容体分子との間に引力を作用させることを含む、標的分子の操作又は接着方法を提供する。さらに、本発明は、電荷移動錯体を形成する電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方、又は両方から成る分子標識剤を提供する。さらに、本発明は、電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方、又は両方から成る分子操作剤又は分子接着剤を提供する。 That is, in the present invention, the target molecule is labeled with one of the electron donor molecule and the electron acceptor molecule forming the charge transfer complex, and the other is used as a probe. There is provided a method for detecting a target molecule, which comprises detecting the target molecule using light emission resulting from the charge transfer of the target molecule. In addition, the present invention uses the electron donor molecule and the electron acceptor molecule to label the same or different molecules, and uses the light emission resulting from the charge transfer between the electron donor molecule and the electron acceptor molecule. There is provided a method for observing the behavior of a target molecule, which comprises observing the behavior of a target molecule or two types of target molecules. Furthermore, the present invention provides an attractive force between an electron donor molecule and an electron acceptor molecule by binding either or both of an electron donor molecule and an electron acceptor molecule of a charge transfer complex to the same or different target molecules. A method for manipulating or attaching a target molecule is provided. Furthermore, the present invention provides a molecular labeling agent comprising either or both of an electron donor molecule and an electron acceptor molecule that form a charge transfer complex. Furthermore, the present invention provides a molecular manipulation agent or molecular adhesive comprising either one or both of an electron donor molecule and an electron acceptor molecule.
本発明の方法によれば、従来のFRETの1/10以下の数オングストロームの距離に電子供与体分子と電子受容体分子が接近した際に電荷移動が起こり、発光が観察される。従って、本発明の方法により、標的分子の検出や観察を数オングストロームの解像度で行うことができる。また、電荷移動錯体の電子供与体分子と電子受容体分子の間には引力が働くので、本発明の方法により分子の位置や形態を操作したり分子同士を接着したりすることが可能になる。 According to the method of the present invention, when an electron donor molecule and an electron acceptor molecule approach a distance of a few angstroms of 1/10 or less of conventional FRET, charge transfer occurs and light emission is observed. Therefore, the detection and observation of the target molecule can be performed with a resolution of several angstroms by the method of the present invention. In addition, since an attractive force acts between the electron donor molecule and the electron acceptor molecule of the charge transfer complex, the position and form of the molecule can be manipulated or the molecules can be adhered to each other by the method of the present invention. .
本発明の方法では、電荷移動錯体を用いる。電荷移動錯体とは、電子供与体分子と電子受容体分子が数オングストロームの距離に接近した場合に、電子供与体分子から電子受容体分子に電子が移動して形成される錯体分子対を意味する。電子供与体分子から電子受容体分子に電子が移動すると、それらの分子の組み合わせに固有の蛍光を発するようになるので、それらの蛍光を検出することにより、電子供与体分子と電子受容体分子が数オングストロームの距離にまで近づいたことを確認することができる。 In the method of the present invention, a charge transfer complex is used. A charge transfer complex means a complex molecule pair formed when electrons move from an electron donor molecule to an electron acceptor molecule when the electron donor molecule and the electron acceptor molecule are close to a distance of several angstroms. . When an electron moves from an electron donor molecule to an electron acceptor molecule, it emits fluorescence inherent to the combination of those molecules. Therefore, by detecting the fluorescence, the electron donor molecule and the electron acceptor molecule are It can be confirmed that a distance of several angstroms has been approached.
電子供与体分子としては、電子供与性基を有する、ベンゼン誘導体、ナフタレン誘導体、アントラセン誘導体、その他ピレン、ペリレン等の多環式芳香族化合物の誘導体が好ましい。電子受容体分子としては、テトラシアノベンゼンに代表される芳香族シアノ化合物、ジニトロベンゼン、トリニトロベンゼン等の芳香族ニトロ化合物等の誘導体を例示することができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。これらの電子供与体分子、および電子受容体分子は、上記の化学構造に加えて、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、スルホン酸基、水酸基等の反応性に富む官能基を有する。但しテトラシアノベンゼンのような反応性に富む官能基を持たない化合物も、ポリマー等のマトリックス中に均一に分散させることにより、プローブとして使用することが出来る。本発明に係わる電荷移動錯体は、上記の電子供与体分子と電子受容体分子の任意の組み合わせに基づいて、それらの分子間相互作用によって形成される。 As the electron donor molecule, benzene derivatives, naphthalene derivatives, anthracene derivatives, and other derivatives of polycyclic aromatic compounds such as pyrene and perylene having an electron donating group are preferable. Examples of the electron acceptor molecule include aromatic cyano compounds represented by tetracyanobenzene, derivatives of aromatic nitro compounds such as dinitrobenzene and trinitrobenzene, but are not necessarily limited thereto. . These electron donor molecules and electron acceptor molecules have functional groups rich in reactivity, such as amino groups, aldehyde groups, carboxyl groups, sulfonic acid groups, and hydroxyl groups, in addition to the chemical structures described above. However, a compound having no reactive functional group such as tetracyanobenzene can also be used as a probe by uniformly dispersing it in a matrix such as a polymer. The charge transfer complex according to the present invention is formed by an intermolecular interaction based on any combination of the above electron donor molecule and electron acceptor molecule.
本発明の方法において、検出又は観察される標的分子は、何ら限定されるものではなく、有機分子でも無機分子でもよい。本発明の方法では、数オングストロームという極めて高い解像度での検出又は観察が可能になるので、生体分子を標的分子にした場合に特に威力を発揮する。すなわち、特定の生体分子の細胞内や細胞小器官内での分布状態や、２種類の生体分子の相互作用が細胞内又は細胞内小器官内のどの部位で、どのような時期に起きるのか、さらには、単一の生体分子の形態変化等を調べることができる。 In the method of the present invention, the target molecule to be detected or observed is not limited at all, and may be an organic molecule or an inorganic molecule. In the method of the present invention, detection or observation with a very high resolution of several angstroms becomes possible, so that it is particularly effective when a biomolecule is used as a target molecule. That is, the state of distribution of specific biomolecules in cells and organelles, the interaction between two types of biomolecules, at which site in the cell or organelle, and when, Furthermore, the morphological change of a single biomolecule can be examined.
本発明の方法では、電子供与体分子又は電子受容体分子は、標的分子と化学的に結合させて用いる。例えば、タンパク質については、アミノ基、水酸基等の官能基を有する電子供与体分子、電子受容体分子とタンパク質のC末端のカルボキシル基との反応により、あるいはカルボキシル基、スルホン基等の官能基を有する電子供与体分子、電子受容体分子とタンパク質のN末端のアミノ基との反応により、目的とする化学構造を生じる。核酸については、吸収波長の異なる電子供与体分子で化学修飾した、塩基が異なる４種類のヌクレオチドを合成し、標的の１本鎖DNAを鋳型として、これらのヌクレオチドを用いて２本鎖DNAを合成し、標的DNAの塩基配列の解析に供することが出来る。但し、テトラシアノベンゼンのような官能基を持たない化合物を選択する場合には、ポリマーマトリックス等に分散させて探針の先端を被覆し、走査型のプローブとして使用する。 In the method of the present invention, an electron donor molecule or an electron acceptor molecule is used by being chemically bound to a target molecule. For example, protein has an electron donor molecule having a functional group such as an amino group or a hydroxyl group, a reaction between an electron acceptor molecule and a carboxyl group at the C-terminal of the protein, or a functional group such as a carboxyl group or a sulfone group. Reaction of the electron donor molecule, electron acceptor molecule, and amino group at the N-terminus of the protein yields the desired chemical structure. For nucleic acids, four types of nucleotides with different bases, chemically modified with electron donor molecules with different absorption wavelengths, are synthesized, and double-stranded DNA is synthesized using these nucleotides with the target single-stranded DNA as a template. And can be used for analysis of the base sequence of the target DNA. However, when a compound having no functional group such as tetracyanobenzene is selected, the tip of the probe is coated by being dispersed in a polymer matrix or the like and used as a scanning probe.
本発明の第１の方法では、標的分子を電荷移動錯体を形成する電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方で標識し、他方をプローブとして用いる。例えば、特定の生体高分子を電子供与体分子で標識し、電子受容体分子の溶液で細胞を処理することにより、細胞内での標的分子の分布をイメージ化することができる。また、連続的又は経時的にイメージ化を行なうことにより、標的分子の挙動を測定することができる。また、化学反応性の官能基を持たない、例えばテトラシアノベンゼンをプローブとする場合には、原子間力顕微鏡(AFM)のカンチレバーのような探針の先端部に付着させて被観察面を走査し、測定された蛍光と、その時の探針の位置から、被観察面中の標的分子の分布をイメージ化することができる。 In the first method of the present invention, the target molecule is labeled with one of an electron donor molecule and an electron acceptor molecule that form a charge transfer complex, and the other is used as a probe. For example, by labeling a specific biopolymer with an electron donor molecule and treating the cell with a solution of the electron acceptor molecule, the distribution of the target molecule in the cell can be imaged. Moreover, the behavior of the target molecule can be measured by imaging continuously or with time. In addition, when using tetracyanobenzene as a probe, which does not have a chemically reactive functional group, it is attached to the tip of a probe such as a cantilever of an atomic force microscope (AFM) and the surface to be observed is scanned. Then, from the measured fluorescence and the position of the probe at that time, the distribution of target molecules in the observation surface can be imaged.
蛍光測定時の励起波長は、用いる電子供与体分子と電子受容体分子の組み合わせにより異なるが、例えば、アントラセンとテトラシアノベンゼンの場合には、励起波長は532nmが好ましく、測定波長は580〜650nmが好ましい。なお、好ましい励起波長と測定波長は、用いる電子供与体分子と電子受容体分子の組み合わせに対して、常法によりスペクトル測定することにより容易に決定することができる。 The excitation wavelength at the time of fluorescence measurement varies depending on the combination of the electron donor molecule and the electron acceptor molecule used. For example, in the case of anthracene and tetracyanobenzene, the excitation wavelength is preferably 532 nm, and the measurement wavelength is 580 to 650 nm. preferable. In addition, a preferable excitation wavelength and a measurement wavelength can be easily determined by measuring a spectrum by a conventional method for a combination of an electron donor molecule and an electron acceptor molecule to be used.
標的分子が十分なサイズを有する場合、例えばタンパク質や核酸のような生体高分子の場合には、単一の標的分子の異なる部位を、蛍光波長の異なる複数種類の電子供与体分子又は電子受容体分子で標識することも可能である。その結果、標的分子の単なる位置だけではなく、その立体構造も推測することが可能になる。さらに、例えば、核酸を構成する各ヌクレオチドを、蛍光波長が異なる電子供与体分子で標識しておくと、電子受容体分子をプローブとして核酸の塩基配列を決定することも可能である。すなわち、それぞれ異なる電子供与体分子で化学修飾した４種類のヌクレオチドを用いて、塩基配列を決定したいDNAの１本鎖を鋳型として、合成した２本鎖の核酸（DNA）を基体上に固定し、先端にプローブ（電子受容体分子）を付着させた探針で走査することによって行うこともできる。あるいは周縁部にプローブ（電子受容体分子）を配置した透孔を作製し、線状の核酸をその中に通過させ、通過時の蛍光波長を順次測定することにより行うこともできる。核酸は、例えば、溶液を流通させる等により、プローブ間の透孔を通過させることができる。なお、これらの測定方法に用いられる核酸試料は、予めそれぞれ異なる電子供与体分子で化学修飾されたヌクレオチドを原料として用いて、PCR等の核酸増幅法を行なうことにより、容易に調製することができる。 When the target molecule has a sufficient size, for example, in the case of a biopolymer such as a protein or a nucleic acid, a plurality of types of electron donor molecules or electron acceptors having different fluorescence wavelengths are represented by different sites of a single target molecule. It is also possible to label with a molecule. As a result, it is possible to estimate not only the position of the target molecule but also its three-dimensional structure. Furthermore, for example, when each nucleotide constituting a nucleic acid is labeled with an electron donor molecule having a different fluorescence wavelength, the base sequence of the nucleic acid can be determined using the electron acceptor molecule as a probe. That is, using four types of nucleotides chemically modified with different electron donor molecules, using a single strand of DNA whose base sequence is to be determined as a template, a synthesized double-stranded nucleic acid (DNA) is immobilized on a substrate. Alternatively, scanning can be performed with a probe having a probe (electron acceptor molecule) attached to the tip. Alternatively, it is also possible to prepare a through hole in which a probe (electron acceptor molecule) is arranged at the peripheral part, pass a linear nucleic acid through the hole, and sequentially measure the fluorescence wavelength at the time of passage. The nucleic acid can be passed through the through holes between the probes, for example, by circulating a solution. In addition, the nucleic acid sample used for these measuring methods can be easily prepared by performing a nucleic acid amplification method such as PCR using nucleotides chemically modified with different electron donor molecules as raw materials in advance. .
本発明の第２の方法では、電荷移動錯体を形成する電子供与体分子及び電子受容体分子の両者で、同一又は異なる分子を標識する。単一の分子の形態変化を観察する場合等には、単一の分子の２つの異なる部位を電子供与体分子及び電子受容体分子でそれぞれ標識する。例えば、ある立体構造をとるタンパク質のN末端を電子供与体分子で標識し、C末端を電子受容体分子で標識する。N末端とC末端が離れている時には、蛍光は観察されないが、タンパク質が三次元的に折りたたまれてN末端とC末端が数オングストロームの距離に接近した場合には、蛍光が観察される。このように、単一の分子中の２箇所の標識部位が数オングストロームの距離まで接近したか否かを測定することができる。この方法により得られる知見は、タンパク質や核酸等の生体高分子の形態変化やその時期の予測等に大いに役立つ。 In the second method of the present invention, both the electron donor molecule and the electron acceptor molecule forming the charge transfer complex are labeled with the same or different molecules. For example, when observing a change in the shape of a single molecule, two different sites of the single molecule are labeled with an electron donor molecule and an electron acceptor molecule, respectively. For example, the N-terminus of a protein having a certain three-dimensional structure is labeled with an electron donor molecule, and the C-terminus is labeled with an electron acceptor molecule. Fluorescence is not observed when the N- and C-termini are separated, but fluorescence is observed when the protein is folded three-dimensionally and the N- and C-termini approach a distance of several angstroms. In this way, it can be determined whether or not two labeling sites in a single molecule have approached a distance of several angstroms. The knowledge obtained by this method is very useful for predicting the morphological change and timing of biopolymers such as proteins and nucleic acids.
２種の標的分子の一方を電子供与体分子で標識し、他方を電子受容体分子で標識することにより、２種の標的分子の相互作用を高解像度で測定することが可能になる。例えば、遺伝子調節タンパク質等のタンパク質を電子供与体分子で標識し、調節を受けるDNAを電子受容体分子で標識し、蛍光を観察することにより、両者の相互作用の状態や、相互作用が起きる時期等を調べることが可能になる。あるいは、酵素と基質、抗原と抗体のように、互いに結合して相互作用することが知られている分子のペアにおいて、一方を、電子供与体分子で、他方を電子受容体分子で標識し、蛍光を観察する。蛍光が観察されない場合には、標識部位を変えて繰返し行なう。あるいは、蛍光波長が異なる複数種類の標識で、単一分子の異なる部位を標識しておいてもよい。これにより、一方の標的分子のどの部位と、他方の標的分子のどの部位とが接近しているのかを知ることができる。これは、どの部位とどの部位が相互作用しているのかの推測に役立ち、ひいては、例えば、酵素タンパク質の活性中心の同定や、抗原のエピトープの決定等に役立つ。 By labeling one of the two target molecules with an electron donor molecule and labeling the other with an electron acceptor molecule, the interaction between the two target molecules can be measured with high resolution. For example, by labeling a protein such as a gene regulatory protein with an electron donor molecule, labeling the regulated DNA with an electron acceptor molecule, and observing fluorescence, the state of interaction between the two and the time when the interaction occurs Etc. can be examined. Alternatively, in a pair of molecules known to bind and interact with each other, such as an enzyme and a substrate, an antigen and an antibody, one is labeled with an electron donor molecule and the other is labeled with an electron acceptor molecule, Observe fluorescence. If no fluorescence is observed, repeat the procedure while changing the labeling site. Alternatively, different sites of a single molecule may be labeled with a plurality of types of labels having different fluorescence wavelengths. Thereby, it is possible to know which part of one target molecule is close to which part of the other target molecule. This is useful for estimating which part and which part are interacting, and, for example, is useful for identifying an active center of an enzyme protein and determining an epitope of an antigen.
電荷移動錯体を形成する電子供与体分子と電子受容体分子は、近接して電荷移動が生じた場合に、両者の間に引力が働くことが知られている。本発明の第３の方法は、これを利用した、分子の操作又は接着方法に関するものである。すなわち、電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方、又は両方を同一又は異なる標的分子に結合させ、電子供与体分子と電子受容体分子との間に引力を作用させることを含む、標的分子の操作又は接着方法である。例えば、ある立体構造をとるタンパク質のN末端に電子供与体分子を結合させ、C末端に電子受容体分子を結合させる。電子供与体分子と電子受容体分子の間に引力が作用するので、N末端とC末端が接近するようにタンパク質が折りたたまれることを促進することができる。あるいは、異なる２種類の標的分子にそれぞれ電子供与体分子と電子受容体分子を結合させ、２種類の標的分子同士を接着させることができる。 It is known that an electron donor molecule and an electron acceptor molecule forming a charge transfer complex are attracted to each other when charge transfer occurs in the vicinity. The third method of the present invention relates to a molecular manipulation or adhesion method utilizing this. That is, a target comprising binding one or both of an electron donor molecule and an electron acceptor molecule to the same or different target molecules, and applying an attractive force between the electron donor molecule and the electron acceptor molecule Molecular manipulation or adhesion method. For example, an electron donor molecule is bonded to the N terminus of a protein having a certain three-dimensional structure, and an electron acceptor molecule is bonded to the C terminus. Since an attractive force acts between the electron donor molecule and the electron acceptor molecule, the protein can be promoted to be folded so that the N terminus and the C terminus are close to each other. Alternatively, an electron donor molecule and an electron acceptor molecule can be bonded to two different types of target molecules, respectively, and the two types of target molecules can be adhered to each other.
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
参考例１ 孤立電荷移動錯体分子対の単一分子分光
ポリスチレン1gあたりのアントラセン、およびテトラシアノベンゼンの濃度が、それぞれ10-5〜10-8moleであって、しかもアントラセンとテトラシアノベンゼンの比率が等モルであるポリスチレンのトルエン溶液を調製した。スピンコーターを用いて、このポリマー溶液をガラス基板上に展開し、風乾により固化して、厚み100nmの薄膜を形成した。
この薄膜試料を用いて、レーザー走査顕微分光を行った結果、アントラセンとテテラシアノベンゼンの相互作用で形成された、単一分子状に孤立化した電荷移動錯体分子対からの発光スペクトルを捉えることに成功した。レーザー走査顕微分光は、具体的に次のようにして行なった。波長532nmのYAG-SHGレーザ光を開口数1.3の油浸対物レンズを通して錯体分子対を含む試料薄膜にスポット照射し、単一錯体分子対からの蛍光を再び対物レンズで集光した。蛍光のみをバンドパスフィルターで選択的に通過させ、アバランシェフォトダイオードにてその光子数を計測する。試料薄膜をピエゾ素子で走査することにより、単一の錯体分子対が２次元的に分布する蛍光イメージが得られた。また、発光スペクトルの測定は、具体的に次のようにして行なった。対物レンズで集光した蛍光をバンドパスフィルター通過後、分光器へと導き、冷却CCDカメラによってマルチチャンネル計測をおこなった。
Reference Example 1 Single molecule spectroscopy of isolated charge-transfer complex molecule pair The concentration of anthracene and tetracyanobenzene per gram of polystyrene is 10 -5 to 10 -8 mole, respectively, and the ratio of anthracene and tetracyanobenzene is An equimolar polystyrene toluene solution was prepared. Using a spin coater, the polymer solution was spread on a glass substrate and solidified by air drying to form a thin film having a thickness of 100 nm.
As a result of laser scanning microspectroscopy using this thin film sample, the emission spectrum from the charge-transfer complex molecule pair isolated by a single molecule formed by the interaction of anthracene and teteracyanobenzene was captured. Successful. Specifically, laser scanning microspectroscopy was performed as follows. A sample thin film containing a complex molecule pair was spot-irradiated with a YAG-SHG laser beam having a wavelength of 532 nm through an oil immersion objective lens with a numerical aperture of 1.3, and the fluorescence from the single complex molecule pair was again condensed by the objective lens. Only the fluorescence is selectively passed through a bandpass filter, and the number of photons is measured with an avalanche photodiode. By scanning the sample thin film with a piezo element, a fluorescence image in which a single complex molecule pair was two-dimensionally distributed was obtained. Further, the emission spectrum was specifically measured as follows. Fluorescence collected by the objective lens was passed through a bandpass filter, guided to a spectrometer, and multichannel measurement was performed with a cooled CCD camera.
参考例１の知見に基づいて、アントラセンを単独でポリスチレンマトリックス中に分散させて調製した薄膜試料を、先端にテトラシアノベンゼンを付着させた石英製プローブ、あるいは金属探針で走査し、電荷移動現象に起因する蛍光を測定した。石英製プローブ、あるいは金属探針の先端にテトラシアノベンゼンを付着させることは、具体的に次のようにして行った。 Based on the knowledge of Reference Example 1, a thin film sample prepared by dispersing anthracene alone in a polystyrene matrix was scanned with a quartz probe or a metal probe with tetracyanobenzene attached to the tip, and the charge transfer phenomenon Fluorescence due to was measured. Specifically, the attachment of tetracyanobenzene to the tip of a quartz probe or a metal probe was performed as follows.
の参考例１に記した、ポリスチレンの1gあたり、10-5〜10-8moleのテトラシアノベンゼンを均一に分散させたポリマー溶液を調製し、この溶液に石英製プローブ、あるいは金属探針を浸漬し、引き上げる操作を行うことにより、プローブ、あるいは探針の先端部を、テトラシアノベンゼンを含むポリマー薄膜で被覆した。必要に応じて、ブローブ、あるいは探針は、前もってアミノトリエトキシシラン等の、所謂シランカップリング剤で処理することがある。
蛍光の測定は、具体的に次のようにして行なった。アントラセンを含むポリスチレン薄膜の表面とプローブ先端との距離を相互に働く原子間力によって制御しながら、プローブを薄膜表面上でピエゾ素子によって走査した。プローブを通して、あるいは外部のレンズ光学系にて波長532nmのYAG-SHGレーザ光を常時照射した。走査の過程でアントラセンとテトラシアノベンゼンが数オングストロームまで接近したとき、これらの分子が錯体を形成し、レーザ光の吸収と蛍光の発光が生じた。この蛍光をNA1.3の対物レンズで集光し、バンドパスフィルター通過後、アバランシェフォトダイオードで光子数を計測した。上記により、マトリックス中のアントラセンの位置に蛍光スポットが検出された。
Prepare a polymer solution in which 10 -5 to 10 -8 moles of tetracyanobenzene are uniformly dispersed per 1 g of polystyrene, as described in Reference Example 1, and immerse a quartz probe or metal probe in this solution. Then, the tip of the probe or the probe was covered with a polymer thin film containing tetracyanobenzene by performing an operation of pulling up. If necessary, the probe or probe may be previously treated with a so-called silane coupling agent such as aminotriethoxysilane.
Specifically, the fluorescence was measured as follows. The probe was scanned on the thin film surface with a piezo element while controlling the distance between the surface of the polystyrene thin film containing anthracene and the tip of the probe by an interatomic force. A YAG-SHG laser beam having a wavelength of 532 nm was constantly irradiated through a probe or an external lens optical system. When anthracene and tetracyanobenzene approached several angstroms during the scanning process, these molecules formed a complex, resulting in absorption of laser light and emission of fluorescence. The fluorescence was collected with an NA1.3 objective lens, passed through a bandpass filter, and the number of photons was measured with an avalanche photodiode. As described above, a fluorescent spot was detected at the position of anthracene in the matrix.
(1) アントラセンによるタンパク質の標識
タンパク質をアントラセンで標識する。これは、具体的に次のようにして行なう。タンパク質を、例えばジオキサン等の極性溶媒の割合が30％以下の濃度である水溶液に溶解し、37〜40℃の温度で、水溶性カルボジイミドの存在下で、カルボキシル基を有するアントラセン誘導体と反応させた。カルボキシル基は、例えば9-アントラセンカルボン酸のように、アントラセン環に直結していてもよく、あるいは9-アントラセン酪酸のようにメチレン鎖等のスペーサーを介して結合していてもよい。この方法により、タンパク質のN末端にアミド結合を介してアントラセンを導入することが出来た。
(1) Labeling proteins with anthracene Label proteins with anthracene. This is specifically performed as follows. The protein was dissolved in an aqueous solution having a concentration of a polar solvent such as dioxane of 30% or less, and reacted with an anthracene derivative having a carboxyl group in the presence of water-soluble carbodiimide at a temperature of 37 to 40 ° C. . The carboxyl group may be directly bonded to the anthracene ring such as 9-anthracenecarboxylic acid, or may be bonded via a spacer such as a methylene chain such as 9-anthracenebutyric acid. By this method, anthracene could be introduced into the N terminus of the protein via an amide bond.
(2) 電子供与体分子によるヌクレオチドの標識、およびDNAの塩基配列の解析への応用
アデニン、グアニン、シトシン及びチミンが核酸塩基であるヌクレオチドを、それぞれアントラセン、9−メチルアントラセン、ピレン、アントラセン等の吸収波長の異なる電子供与体分子で化学修飾をして標識化した。電子供与体分子のヌクレオチドへの結合は、電子供与体が有するカルボキシル基、スルホン酸基等の反応性の官能基と、塩基のプリン環あるいはピリミジン環のアミノ基等との反応、あるいは糖の水酸基との反応で形成される。このようにして調製した４種類の化学修飾されたヌクレオチドを用いて、一方の末端をビオチンで修飾した１本鎖DNAを鋳型として、DNAポリメラーゼにより、２本鎖DNAを合成した。ビオチン基を末端に有する２本鎖DNAは、アビジンで被覆したビーズ、あるいは基板に結合させて固定化することにより、電子受容体分子をプローブとして電荷移動錯体の発光を測定し、塩基配列を逐次、解読することが出来た。
(2) Labeling of nucleotides with an electron donor molecule and application to analysis of DNA base sequence Nucleotides of adenine, guanine, cytosine and thymine are nucleobases such as anthracene, 9-methylanthracene, pyrene and anthracene They were labeled by chemical modification with electron donor molecules having different absorption wavelengths. The electron donor molecule is bonded to the nucleotide by reacting a reactive functional group such as a carboxyl group or sulfonic acid group possessed by the electron donor with an amino group of a purine ring or pyrimidine ring of a base, or a hydroxyl group of a sugar. It is formed by reaction with. Using the four types of chemically modified nucleotides thus prepared, double-stranded DNA was synthesized by DNA polymerase using single-stranded DNA whose one end was modified with biotin as a template. Double-stranded DNA with a biotin group at the end is immobilized by binding to avidin-coated beads or substrates, and then measuring the luminescence of the charge transfer complex using the electron acceptor molecule as a probe, and the nucleotide sequence is sequentially determined. I was able to decipher it.
(3) 電子供与体分子と電子受容体分子間の引力を用いる分子操作
タンパク質のN末端に電子受容体であるトリニトロベンゼン誘導体を結合させる。これは具体的に次のようにして行なう。タンパク質を4％の炭酸水素ナトリウム水溶液に溶かし、37〜40℃の温度でトリニトロベンゼンスルホン酸を加えてアミノ基との反応を行った。タンパク質への電子受容体分子の導入は、C末端とジニトロアニリン等のアミノ化合物との反応であってもよい。電子供与体分子をタンパク質に導入する方法としては、タンパク質のN末端と、9−アントラセンカルボン酸、ピレン酪酸等を水溶性カルボジイミドの存在下で反応させて、所期の目的に適した化合物が得られた。
実施例３の方法に準じて蛍光スポットを観察する。次にアントラセンとテトラシアノベンゼンの間に引力を作用させる。この状態で、前記と同様に蛍光スポットを観察する。蛍光スポットの数が有意に増え、タンパク質分子が折りたたまれてN末端とC末端が接近したことがわかる。
(3) Molecular manipulation using attractive force between electron donor molecule and electron acceptor molecule An electron acceptor trinitrobenzene derivative is bound to the N-terminus of the protein. This is specifically performed as follows. The protein was dissolved in 4% aqueous sodium hydrogen carbonate solution, and trinitrobenzenesulfonic acid was added at a temperature of 37 to 40 ° C. to react with the amino group. The introduction of the electron acceptor molecule into the protein may be a reaction between the C-terminus and an amino compound such as dinitroaniline. As a method for introducing an electron donor molecule into a protein, a compound suitable for the intended purpose is obtained by reacting the N-terminus of the protein with 9-anthracenecarboxylic acid, pyrenebutyric acid or the like in the presence of water-soluble carbodiimide. It was.
Fluorescent spots are observed according to the method of Example 3. Next, an attractive force is applied between anthracene and tetracyanobenzene. In this state, the fluorescent spot is observed as described above. It can be seen that the number of fluorescent spots increased significantly, and the protein molecule was folded and the N- and C-termini were close together.
Claims (9)
A molecular manipulation agent or molecular adhesive comprising either or both of an electron donor molecule and an electron acceptor molecule of a charge transfer complex.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004060219A JP2005249573A (en) | 2004-03-04 | 2004-03-04 | Target molecule detecting method and labelling agent therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004060219A JP2005249573A (en) | 2004-03-04 | 2004-03-04 | Target molecule detecting method and labelling agent therefor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005249573A true JP2005249573A (en) | 2005-09-15 |
Family
ID=35030182
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004060219A Pending JP2005249573A (en) | 2004-03-04 | 2004-03-04 | Target molecule detecting method and labelling agent therefor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2005249573A (en) |
-
2004
- 2004-03-04 JP JP2004060219A patent/JP2005249573A/en active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6661154B2 (en) | Sub-diffraction limit image resolution and other imaging techniques | |
| US20220373543A1 (en) | Surface-immobilized bistable polynucleotide devices for the sensing and quantification of molecular events | |
| US20220195421A1 (en) | Bistable polynucleotide devices for the sensing and quantification of molecular events | |
| Ferguson et al. | High-density fiber-optic DNA random microsphere array | |
| CA2707600C (en) | Alternate labeling strategies for single molecule sequencing | |
| WO2010087121A1 (en) | Device for analyzing nucleic acids and apparatus for analyzing nucleic acids | |
| JP2008104463A (en) | Polynucleotide sequencing method | |
| JP2001510339A (en) | Multiplexed molecular analyzer and method | |
| CA3128275A1 (en) | Surface-immobilized bistable polynucleotide devices for the sensing and quantification of molecular events | |
| EP4387979A1 (en) | Single-molecule protein and peptide sequencing | |
| WO2013011611A1 (en) | Nucleic acid analysis method and analysis apparatus | |
| JP5309092B2 (en) | Nucleic acid analysis device, nucleic acid analysis device, and method of manufacturing nucleic acid analysis device | |
| KR20120126459A (en) | High sensitive combined-nanobiochip for simultaneous detection of multi-biomolecule markers and using the same information providing method of disease diagnosis | |
| JP2005249573A (en) | Target molecule detecting method and labelling agent therefor | |
| JP6034261B2 (en) | Manufacturing method of biomolecule detection chip | |
| US20230287480A1 (en) | Analyte detection systems and methods of use | |
| Nienhaus | Single-molecule fluorescence studies of protein folding | |
| Shahmuradyan et al. | Optical Methods of Single Molecule Detection and Applications in Biosensors | |
| US20230108258A1 (en) | Antibody-free rapid detection of sars-cov-2 proteins using corona phase molecular recognition (cophmore) | |
| JP2007178439A (en) | Method of detecting biochemical reactant and biochip | |
| Wu et al. | Analytical Approaches for Monitoring DNA–Protein Interactions | |
| Stickelman et al. | Systematic expansion of Riboglow-FLIM by varying the RNA tag | |
| Zhu et al. | Quantitative Fluorescence Correction Incorporating Forster Resonance Energy Transfer and Its Use for Measurement of Hybridization Efficiency on Microarrays | |
| JP5233296B2 (en) | Target evaluation method and apparatus | |
| Guo | Single Molecule Optical Magnetic Tweezers Microscopy Studies of Protein Dynamics |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061221 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20091110 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100309 |