JP2005245440A - Method for analyzing intracellular metabolic flux with substrate labeled with isotope - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は代謝フラックス（流束）を解析する方法、すなわち代謝フラックス解析方法、プログラムおよび記録媒体に関する。更に詳しくは、同位体標識物質を用いる代謝フラックス解析方法、プログラムおよび記録媒体に関する。 The present invention relates to a method for analyzing metabolic flux (flux), that is, a metabolic flux analysis method, a program, and a recording medium. More specifically, the present invention relates to a metabolic flux analysis method, program, and recording medium using an isotope-labeled substance.
代謝フラックス解析方法は、細胞内での代謝物質や同位体標識化合物のバランスを解析すること、より具体的には、核磁気共鳴法（NMR）あるいは質量分析（MS）などの分析手法を用いて、同位体化合物のトレース実験を行うことによって、定量的に細胞内の代謝フラックスの決定を行う方法であって、対象細胞の代謝反応経路中での各代謝物の量比（カーボンバランス）を化学量論的に解析する手法として近年注目されている（非特許文献１）。 Metabolic flux analysis methods analyze the balance of metabolites and isotope-labeled compounds in cells, more specifically, using analytical techniques such as nuclear magnetic resonance (NMR) or mass spectrometry (MS). This is a method of quantitatively determining intracellular metabolic flux by conducting trace experiments of isotope compounds, and quantifying the amount ratio (carbon balance) of each metabolite in the metabolic reaction pathway of the target cell. In recent years, it has attracted attention as a method for quantitative analysis (Non-patent Document 1).
代謝フラックス解析に適用する、正確な解析手法を開発すべく、種々の研究が行われている。同位体標識をした基質を用いた代謝フラックス解析に関する理論については、多くの研究報告があり、確立してきている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。代謝フラックス解析法の確立のために多くの実験が行われているが、正確な解析精度を得るため、理想的条件である合成培地を使用した連続培養法による研究が一般的である（非特許文献６）。また、より実用的な培養法である回分培養で代謝フラックス解析をしている例も一部には報告されているが、培地中に排出された幾つかの物質の同位体分布の測定が行われているのみであり、菌体内物質の同位体分布測定に基づく計算は全くなされていない（非特許文献７）。一般的に同位体基質は高価であり、従来の方法で実験を実施すると実験費用が著しく高価になるという問題点があった（非特許文献８、非特許文献９）。
これまでの同位体標識化合物を用いて行う代謝フラックス解析は、同位体標識化合物を基質として多量に使用するため非常に高価になるという欠点があり、また、主に連続培養のように全体が定常状態の培養の解析には適しているが、回分培養や流加培養には適当ではないという問題がある。実際の研究開発あるいは生産においては、より安価で、解析する培養時期や培養法を選ばない代謝フラックス解析手法が望まれている。 The metabolic flux analysis performed using conventional isotope-labeled compounds has the disadvantage that it is very expensive because it uses a large amount of isotope-labeled compound as a substrate, and the whole is mainly steady like continuous culture. Although it is suitable for analysis of state culture, it is not suitable for batch culture or fed-batch culture. In actual research and development or production, a metabolic flux analysis method is desired that is cheaper and does not select the culture period and culture method to be analyzed.
本発明者らは、上記問題点に鑑み、鋭意検討を行った結果、同位体標識化合物を用いて行う代謝フラックス解析において、代謝フラックス解析に必要な、同位体で標識された化合物における同位体分布比率を、少量の同位体標識化合物を用いて算出する方法を見出した。すなわち、代謝フラックス解析の対象とする状態まで培養した後、炭素源として同位体で標識された基質を少量添加した培地中で培養した細胞の代謝物を経時的に分析することにより得られる測定値に対して、特定の回帰分析を実行することにより、代謝フラックス解析の対象とする状態における、同位体で標識された化合物の同位体分布比率を算出することが可能であることを見出した。 As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventors have found that isotope distributions in isotope-labeled compounds required for metabolic flux analysis in metabolic flux analysis using isotope-labeled compounds. We have found a method for calculating the ratio using a small amount of isotope-labeled compound. That is, measured values obtained by analyzing over time metabolites of cells cultured in a medium supplemented with a small amount of a substrate labeled with an isotope as a carbon source after culturing to a state to be subjected to metabolic flux analysis On the other hand, it has been found that by executing a specific regression analysis, it is possible to calculate the isotope distribution ratio of the compound labeled with an isotope in the target state of metabolic flux analysis.
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、下記のものを提供する。
（１）細胞における代謝フラックスの解析方法であって、
（ａ）同位体で標識された基質を含まない培地で、代謝フラックス解析の対象とする状態となるまで細胞を培養する工程、
（ｂ）同位体で標識された基質を培地に添加し、培養を継続するとともに経時的に培養液から試料を採取する工程、
（ｃ）経時的に採取された試料に含まれる細胞内代謝物における同位体分布を測定する工程、
（ｄ）測定されたデータに対して回帰分析を実行し、
定常状態の同位体分布比率を算出する工程、および、
（ｅ）算出された同位体分布比率を用いて培養細胞の代謝フラックスを解析する工程、を有することを特徴とする方法。
This invention is made | formed based on the said knowledge, and provides the following.
(1) A method for analyzing metabolic flux in cells,
(A) a step of culturing cells in a medium that does not contain an isotope-labeled substrate until the target state for metabolic flux analysis is obtained;
(B) adding a substrate labeled with an isotope to the medium, continuing the culture and collecting a sample from the culture solution over time;
(C) a step of measuring an isotope distribution in intracellular metabolites contained in a sample collected over time;
(D) performing regression analysis on the measured data;
Calculating a steady state isotope distribution ratio; and
(E) analyzing the metabolic flux of cultured cells using the calculated isotope distribution ratio.
（２）添加される基質の量が、試料を採取する時間内に全てが分解されない量である、（１）記載の方法。 (2) The method according to (1), wherein the amount of the substrate to be added is an amount that does not completely decompose within the time when the sample is collected.
（３）回帰分析が、下記一般式（Ｉ）で示される特異関数を用いて実行される、（１）または（２）記載の方法。 (3) The method according to (1) or (2), wherein the regression analysis is performed using a singular function represented by the following general formula (I).
（４）代謝フラックスの解析が最適化アルゴリズムの実行を含む方法により行われる（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。 (4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the analysis of metabolic flux is performed by a method including execution of an optimization algorithm.
（５）最適化アルゴリズムが進化アルゴリズムである（４）に記載の方法。 (5) The method according to (4), wherein the optimization algorithm is an evolution algorithm.
（６）代謝フラックスの解析が、解析する細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデルを用いる方法であり、細胞内代謝フラックスモデルを表す関数に、菌体構成成分の物質と菌体内プールの同物質間の交換係数を含む（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。 (6) Metabolic flux analysis is a method using an intracellular metabolic flux model constructed with respect to the intracellular metabolic flux to be analyzed. The method according to any one of (1) to (5), comprising an exchange coefficient between the same substances.
（７）細胞が、有用化合物の生産能を保持する微生物である、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。 (7) The method according to any one of (1) to (5), wherein the cell is a microorganism that retains the ability to produce useful compounds.
（８）有用化合物がアミノ酸および／または有機酸である、（７）記載の方法。 (8) The method according to (7), wherein the useful compound is an amino acid and / or an organic acid.
（９）培養が回分培養または流加培養である、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の方法。 (9) The method according to any one of (1) to (8), wherein the culture is batch culture or fed-batch culture.
（１０）細胞内代謝物がアミノ酸および／もしくは有機酸並びに／またはその主要代謝中間体である、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法。 (10) The method according to any one of (1) to (9), wherein the intracellular metabolite is an amino acid and / or an organic acid and / or a main metabolic intermediate thereof.
（１１）同位体分布が質量分析により測定される、（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。 (11) The method according to any one of (1) to (10), wherein the isotope distribution is measured by mass spectrometry.
（１２）細胞における代謝フラックス解析方法に用いるプログラムであって、
（Ｉ）下記（ａ）〜（ｃ）の工程により測定された同位体分布のデータを記憶する手段、（ａ）同位体で標識された物質を含まない培地で、代謝フラックス解析の対象とする状態となるまで細胞を培養する工程、
（ｂ）同位体で標識された基質を培地に添加し、培養を継続すると共に経時的に培養液から試料を採取する工程、および、
（ｃ）経時的に採取された試料に含まれる細胞内代謝物における同位体分布を測定する工程、
（II）記憶されたデータに対して回帰分析を実行し、定常状態の同位体分布比率を算出する手段、並びに、
（III）算出された同位体分布比率を用いて培養細胞の代謝フラックスを解析する手段、としてコンピューターを機能させるためのプログラム。
(12) A program used for a method of analyzing metabolic flux in cells,
(I) Means for storing data of isotope distribution measured by the following steps (a) to (c), (a) A medium not containing a substance labeled with an isotope and subject to metabolic flux analysis Culturing the cells until the state is reached,
(B) adding a substrate labeled with an isotope to the medium, continuing the culture and collecting a sample from the culture solution over time; and
(C) a step of measuring an isotope distribution in intracellular metabolites contained in a sample collected over time;
(II) means for performing regression analysis on the stored data, calculating a steady-state isotope distribution ratio, and
(III) A program for causing a computer to function as a means for analyzing metabolic flux of cultured cells using the calculated isotope distribution ratio.
（１３）（１２）記載のプログラムを記録したことを特徴とするコンピュータ読み取り可能な記録媒体。 (13) A computer-readable recording medium on which the program according to (12) is recorded.
この方法によれば、同位体標識化合物基質の使用量が少ないため、安価に代謝フラックスを解析できる。また、短時間で同位体分布の動的変化を解析して代謝フラックスを算出
することができるため、回分培養や流加培養などにおける非定常状態の培養解析にも有効である。
According to this method, since the amount of isotope-labeled compound substrate used is small, metabolic flux can be analyzed at low cost. Moreover, since the metabolic flux can be calculated by analyzing the dynamic change of the isotope distribution in a short time, it is also effective for non-steady state culture analysis in batch culture, fed-batch culture, and the like.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における代謝フラックスとは、細胞内の化学反応の化学量論モデルと代謝物間の質量作用則から導かれる細胞内の代謝物の流速（フラックス）である。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The metabolic flux in the present invention is a flow rate (flux) of a metabolite in a cell derived from a stoichiometric model of a chemical reaction in the cell and a mass action law between metabolites.
本発明における解析対象となる細胞としては、どのようなものも対象となるが、とりわけ物質生産に用いられる細胞、例えば、各種培養細胞、カビ、酵母、各種バクテリア等が挙げられる。好ましくは、有用化合物、例えばアミノ酸、核酸、または有機酸を産生する能力を保持する微生物である。アミノ酸、核酸、または有機酸の生産能を保持する微生物としては、例えば、大腸菌、バチルス属細菌、コリネ型細菌などが好適に用いられる。 The cell to be analyzed in the present invention is any cell, and in particular, cells used for substance production, such as various cultured cells, mold, yeast, various bacteria and the like. Preferred are microorganisms that retain the ability to produce useful compounds such as amino acids, nucleic acids, or organic acids. As microorganisms that retain the ability to produce amino acids, nucleic acids, or organic acids, for example, Escherichia coli, Bacillus bacteria, coryneform bacteria, and the like are preferably used.
以下、工程（ａ）〜（ｅ）について工程毎に説明する。
工程（ａ）は、同位体で標識された物質を含まない培地で、代謝フラックス解析の対象とする状態となるまで細胞を培養する工程である。代謝フラックス解析の対象とする状態とは、細胞内の代謝が停止していない状態である。回分培養や流加培養などにおける定常状態、非定常状態にかかわらず、培養の如何なるフェーズでも解析の対象となる。中でも流加培養が好ましい対象である。
Hereinafter, steps (a) to (e) will be described for each step.
Step (a) is a step of culturing cells in a medium that does not contain an isotope-labeled substance until the target state for metabolic flux analysis is reached. The state targeted for metabolic flux analysis is a state in which intracellular metabolism is not stopped. Regardless of the steady state or unsteady state in batch culture or fed-batch culture, any phase of the culture is subject to analysis. Of these, fed-batch culture is a preferred target.
同位体で標識された基質における同位体とは、工程（ｂ）において用いられる同位体である。同位体で標識された基質とは、その同位体により、自然に存在する物質と区別できる物質、すなわち、自然に存在する同位体比率と異なる同位体比率で同位体を含む物質を意味する。したがって、同位体で標識された基質を含まない培地とは、工程（ｂ）において添加される基質が添加前の培地に含まれる場合に、当該基質が自然に存在する同位体比率と同じ同位体比率でその同位体を含む基質のみである培地を意味する。 The isotope in the substrate labeled with an isotope is an isotope used in step (b). The substrate labeled with an isotope means a substance that can be distinguished from a naturally occurring substance by the isotope, that is, a substance containing an isotope at an isotope ratio different from the naturally occurring isotope ratio. Therefore, a medium that does not contain an isotope-labeled substrate means an isotope that is the same as the isotope ratio in which the substrate naturally exists when the substrate added in step (b) is contained in the medium before addition. It means a medium that is only a substrate containing its isotopes in proportions.
培地および培養条件は、培養する細胞、および、代謝フラックス解析の対象とする状態に合わせて適宜選択するが、例えば使用される培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養源を含有する通常の培地が挙げられる。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、でんぷん加水分解物などの糖類、グリセロール、ソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素源、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。無機イオン又はその源としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。これらの他に、有機微量栄養源として、ビタミンＢ1、または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。培養は、通常好気的条件下で行い、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜９に制御する。尚、ｐＨ調整には無機または有機の酸性またはアルカリ性物質、例えばアンモニアガス等を使用することが出来る。これにより、代謝フラックス解析の対象とする状態となるまで細胞を培養することができる。 The medium and culture conditions are appropriately selected according to the cells to be cultured and the state to be analyzed for metabolic flux. For example, the medium to be used includes a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other as required. A normal medium containing an organic micronutrient source may be mentioned. As the carbon source, sugars such as glucose, lactose, galactose, fructose and starch hydrolysate, alcohols such as glycerol and sorbitol, and organic acids such as fumaric acid, citric acid and succinic acid can be used. As the nitrogen source, inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate, organic nitrogen sources such as soybean hydrolysate, ammonia gas, aqueous ammonia, and the like can be used. As inorganic ions or their sources, small amounts of potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ions, manganese ions and the like are added. In addition to these, it is desirable to contain an appropriate amount of vitamin B 1 or yeast extract as an organic trace nutrient source. The culture is usually carried out under aerobic conditions, and the culture temperature is controlled to 25 ° C to 45 ° C, and the pH is controlled to 5 to 9 during the culture. In addition, an inorganic or organic acidic or alkaline substance such as ammonia gas can be used for pH adjustment. Thereby, a cell can be cultured until it will be in the state made into the object of metabolic flux analysis.
工程（ｂ）は、同位体で標識された基質を、工程（ａ）の培養の培地に添加し、培養を継続するとともに経時的に培養液から試料を採取する工程である。 Step (b) is a step of adding a substrate labeled with an isotope to the culture medium of step (a), continuing the culture and collecting a sample from the culture solution over time.
この工程は、工程（ａ）の培養により、代謝フラックス解析の対象とする状態が達成されている時に行う。培養液からの試料の採取は、工程（ｃ）で同位体分布を測定するのに必要な量採取すればよい。通常、質量分析器で分析を行う場合は、一検体あたり菌体量として１００ｍｇ程度あればよく、この量は分析する化合物の数に応じて調節する。 This step is performed when the state to be subjected to metabolic flux analysis is achieved by the culture in step (a). The sample from the culture solution may be collected in an amount necessary for measuring the isotope distribution in step (c). Usually, when analyzing with a mass spectrometer, about 100 mg is sufficient as the amount of cells per specimen, and this amount is adjusted according to the number of compounds to be analyzed.
本発明における同位体とは、通常には安定同位体であるが、放射性の同位体も同様の目的に使用することができる。同位体で標識された基質としては、同位体で標識されたグルコース、シュクロース、フルクトース、酢酸、各種アミノ酸などが挙げられる。同位体で標識された基質が炭素源として用いられる場合の基質としては、一位の炭素が安定同位体で標識されたグルコースおよび／またはすべての炭素が安定同位体で標識されたグルコースが挙げられる。同位体としては、13Ｃ、14Ｃ、17Ｏ、18Ｏ、15Ｎ、32Ｐ、33Ｐ、33Ｓ、34Ｓ、35Ｓ、36Ｓ、2Ｈ、3Ｈなどが挙げられる。グルコースなどの炭素源を基質として用いる場合は、13Ｃや18Ｏの使用が好ましい。 The isotope in the present invention is usually a stable isotope, but a radioactive isotope can be used for the same purpose. Examples of the substrate labeled with an isotope include glucose, sucrose, fructose, acetic acid and various amino acids labeled with an isotope. When an isotope-labeled substrate is used as the carbon source, the substrate may be glucose in which the carbon at the first position is labeled with a stable isotope and / or glucose in which all carbons are labeled with a stable isotope. . Examples of isotopes include 13 C, 14 C, 17 O, 18 O, 15 N, 32 P, 33 P, 33 S, 34 S, 35 S, 36 S, 2 H, and 3 H. When a carbon source such as glucose is used as a substrate, use of 13 C or 18 O is preferable.
標識に用いる同位体、及び、標識の態様は、工程（ｅ）における解析方法に合わせて適宜選択する。代謝フラックス解析方法が解析モデルを用いるものである場合、解析モデルの感度分析を行って、同位体で標識された基質の条件（標識部位や、標識部位の異なる基質の混合比等）を決定することが好ましい。感度分析の方法としては、例えばMollney, M., W. Wiechert, D. Kowanatzki, and A. A. de Graaf. Biotechnology and Bioengineering 66, 86-103に記載の方法が挙げられるが、基質の条件検討が出来るものである限り、特にこれに限定されない。 The isotope used for labeling and the mode of labeling are appropriately selected according to the analysis method in step (e). If the metabolic flux analysis method uses an analysis model, sensitivity analysis of the analysis model is performed to determine the conditions of the substrate labeled with an isotope (such as the labeling site and the mixing ratio of substrates with different labeling sites). It is preferable. Examples of sensitivity analysis methods include those described in Mollney, M., W. Wiechert, D. Kowanatzki, and AA de Graaf. Biotechnology and Bioengineering 66, 86-103. As long as it is, it is not limited to this.
同位体で標識された基質の添加量は、工程（ｄ）で回帰分析を行うのに十分なデータが工程（ｃ）で測定されるのに十分な量であればよい。好ましくは、添加量は、試料を採取する時間内に全てが分解されない量である。 The amount of the isotope-labeled substrate added may be an amount sufficient to measure sufficient data for performing regression analysis in step (d) in step (c). Preferably, the addition amount is an amount that does not completely decompose within the time when the sample is taken.
同位体で標識された基質を添加する際には、培地中の基質における同位体で標識された基質の割合が高く（例えば９０モル％以上に）なるように、添加前に培地中の基質を枯渇に近い量まで減少させることが好ましい。例えば、流加培養のように基質を培養中に加える培養の場合には、基質の添加を停止することにより基質の量を減少させることができる。 When adding an isotope-labeled substrate, the substrate in the medium is added before the addition so that the ratio of the isotope-labeled substrate in the substrate in the medium is high (eg, 90 mol% or more). It is preferable to reduce to an amount close to depletion. For example, in the case of culture in which a substrate is added during the culture, such as fed-batch culture, the amount of the substrate can be decreased by stopping the addition of the substrate.
基質を枯渇させてしまうと、細胞の状態が変化し、目的の状態について代謝フラックスの解析ができなくなるので、基質量を直接的または間接的にモニターすることが好ましい。例えば、基質が枯渇すると培地中の溶存酸素濃度が上昇するので、溶存酸素濃度の変化をモニターすることにより、枯渇直前の時点を決定することができる。 If the substrate is depleted, the state of the cells changes, and the metabolic flux cannot be analyzed for the target state. Therefore, it is preferable to monitor the substrate mass directly or indirectly. For example, since the dissolved oxygen concentration in the medium increases when the substrate is depleted, the time immediately before depletion can be determined by monitoring the change in the dissolved oxygen concentration.
試料を採取する時間および回数は、工程（ｄ）の回帰分析で信頼性のある値が算出されるのに十分なものであればよい。添加基質の種類、回帰分析の方法、培養条件等に合わせて適宜選択すればよいが、通常には、添加後０〜６０分間に、３〜５回という条件が挙げられる。また、添加直後の採取間隔をその後の採取間隔より短くすることが好ましい。 The time and number of times of collecting the sample may be sufficient so that a reliable value can be calculated by the regression analysis in the step (d). Although it may be appropriately selected according to the kind of the substrate to be added, the method of regression analysis, the culture conditions, etc., the conditions are usually 3 to 5 times in 0 to 60 minutes after the addition. Moreover, it is preferable that the collection interval immediately after the addition is shorter than the subsequent collection interval.
工程（ｃ）は、工程（ｂ）で経時的に採取された試料に含まれる細胞内代謝物における同位体分布を測定する工程である。 Step (c) is a step of measuring the isotope distribution in the intracellular metabolites contained in the sample collected over time in step (b).
本発明における細胞内代謝物とは、基質が細胞内で代謝されてできる最終産物又は中間体である。細胞内代謝物については、その生化学反応とともに多くの知見が得られており、データベース化されている（例えば、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）を参照のこと（http://www.genome.ad.jp/kegg/）。 The intracellular metabolite in the present invention is an end product or an intermediate formed by a substrate being metabolized in a cell. As for intracellular metabolites, a lot of knowledge has been obtained along with their biochemical reactions, and it has been databased (see, for example, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (http: //www.genome .ad.jp / kegg /).
同位体分布としては、アイソトポマー分布ベクトル（Biotechnology and Bioengineering 55, 831-840）、重量分布ベクトル（Biotechnology and Bioengineering 62, 739-750）などが挙げられる。質量分析（マススペクトロメトリー）で測定できる点では、重量分布ベクトルが好ましい。測定方法としては、高速液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ−Ｍ
Ｓ）、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ−ＭＳ）等の質量分析、核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）等が挙げられ、質量分析が特に好ましい。
Isotope distribution includes isotopomer distribution vector (Biotechnology and Bioengineering 55, 831-840), weight distribution vector (Biotechnology and Bioengineering 62, 739-750), and the like. A weight distribution vector is preferable in that it can be measured by mass spectrometry (mass spectrometry). As a measurement method, high performance liquid chromatograph mass spectrometry (LC-M
S), mass spectrometry such as gas chromatograph mass spectrometry (GC-MS), nuclear magnetic resonance spectrum (NMR) and the like, and mass spectrometry is particularly preferable.
試料に含まれる細胞内代謝物における同位体分布の測定は通常の方法によって行うことができ、例えば、重量分布ベクトルの場合には、試料から細胞内代謝物を抽出し、抽出物を質量分析により分析する方法が挙げられる。試料からの細胞内代謝物の抽出方法としては、超音波破砕や酸による菌体内物質抽出などの、通常用いられる手法が挙げられる。 Measurement of isotope distribution in intracellular metabolites contained in a sample can be performed by an ordinary method. For example, in the case of a weight distribution vector, intracellular metabolites are extracted from a sample, and the extract is analyzed by mass spectrometry. The method of analysis is mentioned. Examples of methods for extracting intracellular metabolites from a sample include commonly used techniques such as ultrasonic disruption and extraction of intracellular substances with acid.
測定においては、天然に存在する同位体による影響を補正することが好ましい。補正の方法としては、WittmannとHeinzleの方法（Biotechnology and Bioengineering 62, 739-750）が挙げられるが、天然に存在する同位体の存在比率を利用し、分析データを補正することの出来る手法であれば、特にこれに限定されない。 In the measurement, it is preferable to correct the influence of a naturally occurring isotope. The correction method includes the method of Wittmann and Heinzle (Biotechnology and Bioengineering 62, 739-750), but any method that can correct the analysis data using the abundance ratio of naturally occurring isotopes. For example, it is not limited to this.
工程（ｄ）は、工程（ｃ）で測定されたデータに対して回帰分析を実行し、定常状態の同位体分布比率を算出する工程である。 Step (d) is a step of performing regression analysis on the data measured in step (c) and calculating a steady-state isotope distribution ratio.
回帰分析の方法は、定常状態の同位体分布比率を算出できる限り、特に限定されず、非線形回帰分析などの方法が挙げられる。好ましくは、一般式（Ｉ）で示される特異関数を用いる回帰分析である。この特異関数を用いる回帰分析では、測定されたデータからの回帰により定数ａ、ｂ、ｃ及びｄを求め、定数の求められた一般式（Ｉ）においてｔを無限大にすることにより算出された同位体分布比率が定常状態の同位体分布比率となる。一般式（Ｉ）において、ηおよびλは、測定されたデータにより回帰誤差が最小となるように選択する。ｔは、同位体基質を添加した時点をゼロとし、各測定時までの経過時間を表す。 The method of regression analysis is not particularly limited as long as the steady-state isotope distribution ratio can be calculated, and examples thereof include nonlinear regression analysis. The regression analysis using a singular function represented by the general formula (I) is preferable. In the regression analysis using this singular function, the constants a, b, c and d were obtained by regression from the measured data, and calculated by making t infinite in the general formula (I) where the constant was obtained. The isotope distribution ratio is the steady-state isotope distribution ratio. In the general formula (I), η and λ are selected so that the regression error is minimized by the measured data. t represents the elapsed time up to the time of each measurement, with the time when the isotope substrate was added as zero.
工程（ｅ）は、工程（ｄ）で算出された同位体分布比率を用いて培養細胞の代謝フラックスを解析する工程である。 Step (e) is a step of analyzing the metabolic flux of the cultured cells using the isotope distribution ratio calculated in step (d).
工程（ｅ）は、同位体分布比率を用いて培養細胞の代謝フラックスを解析する工程であれば、特に限定されないが、通常には、解析する細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデルに基づいて、炭素原子、窒素原子、酸素原子、水素原子、リン原子、硫黄原子等が同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の分析値から細胞内代謝フラックスを解析する方法により行われる。 The step (e) is not particularly limited as long as it is a step of analyzing the metabolic flux of the cultured cells using the isotope distribution ratio. Usually, the intracellular metabolic flux model constructed with respect to the intracellular metabolic flux to be analyzed is used. Method for analyzing intracellular metabolic flux from analysis values of cells cultured in a medium containing isotope-labeled substrates of carbon atoms, nitrogen atoms, oxygen atoms, hydrogen atoms, phosphorus atoms, sulfur atoms, etc. Is done.
細胞内代謝フラックスモデルは、解析する代謝フラックスに関して構築されたものであれば、特に限定されず、通常の構築方法に従って構築された細胞内代謝フラックスモデルでよい。代謝フラックスに関して構築されるとは、解析する代謝フラックスの反応（反応経路）が、構築された細胞内代謝フラックスモデルに含まれることを意味する。 The intracellular metabolic flux model is not particularly limited as long as it is constructed with respect to the metabolic flux to be analyzed, and may be an intracellular metabolic flux model constructed according to a normal construction method. Constructed with respect to metabolic flux means that the metabolic flux reaction (reaction path) to be analyzed is included in the constructed intracellular metabolic flux model.
代謝フラックスに関する細胞内代謝フラックスモデルの構築方法の例としては、Metabolic Engineering 3, 265-283, 2001（非特許文献１）、Wiechert, W. and de Graaf, A. A. Biotechnology and Bioengineering 55, 101-117, 1997（非特許文献２）、Metabolic
Engineering 3, 195-205, 2001（非特許文献９）、Metabolic Engineering 3, 173-191,
2001、Biotechnology and Bioengineering 55, 831-840, 1997等の方法が挙げられる。
Examples of a method for constructing an intracellular metabolic flux model relating to metabolic flux include
2001, Biotechnology and Bioengineering 55, 831-840, 1997 and the like.
代謝フラックスを解析する反応経路としては、細胞内主要代謝経路であればいずれでもよいが、とりわけ、糖代謝経路、TCA回路、ペントースリン酸経路、各種アミノ酸合成固有経路については微生物醗酵による有用化合物生産の実用性から重要であることから、これらを含めることが好ましい。 The reaction pathway for analyzing the metabolic flux may be any of the major intracellular metabolic pathways. In particular, the sugar metabolic pathway, TCA cycle, pentose phosphate pathway, and various amino acid synthesis specific pathways are used to produce useful compounds by microbial fermentation. These are preferably included because they are important for practical use.
細胞内代謝フラックスモデルの構築においては、分岐のない一連の反応を一つの反応として扱う、代謝速度の速い反応により変換される反応前後の代謝物を一つの代謝物として扱うなど、反応経路の簡略化を行ってもよい。 In the construction of an intracellular metabolic flux model, the reaction pathway is simplified, such as treating a series of reactions without branching as one reaction, and treating metabolites before and after the reaction converted by a reaction with a high metabolic rate as one metabolite. May also be performed.
細胞の分析値とは、炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の測定可能な分析値であり、例えば、代謝物における同位体分布の分析値の他、菌体生成速度、有用物質生産速度などが挙げられる。同位体分布の分析値は、同位体分布を反映する分析値であればよく、例えば、アイソトポマー分布ベクトル（Biotechnology and Bioengineering 55, 831-840）、重量分布ベクトル（Biotechnology and Bioengineering 62,
739-750）などが挙げられる。質量分析で測定できる点では、重量分布ベクトルが好ましい。
The analysis value of a cell is a measurable analysis value of a cell cultured in a medium containing a substrate labeled with an isotope as a carbon source. For example, in addition to an analysis value of an isotope distribution in a metabolite, a bacterial cell Examples include production rate and production rate of useful substances. The analysis value of the isotope distribution may be an analysis value that reflects the isotope distribution. For example, an isotopomer distribution vector (Biotechnology and Bioengineering 55, 831-840), a weight distribution vector (Biotechnology and Bioengineering 62,
739-750). A weight distribution vector is preferable in that it can be measured by mass spectrometry.
炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の分析値から細胞内代謝フラックスを決定する工程は、通常に用いられる決定方法に従って決定することができる。分析値が同位体分布の分析値を含む場合には、通常には、アイソトポマーのバランス式を用いて決定が行われる（例えば、Biotechnology and Bioengineering 66, 69-85, 1999（非特許文献４）参照）。 The step of determining the intracellular metabolic flux from the analytical value of cells cultured in a medium containing a substrate labeled with an isotope as a carbon source can be determined according to a commonly used determination method. When the analysis value includes an analysis value of an isotope distribution, the determination is usually performed using an isotopomer balance equation (see, for example, Biotechnology and Bioengineering 66, 69-85, 1999 (Non-patent Document 4)). ).
細胞の分析値が、代謝フラックスモデルにおける変数を計算する（代謝フラックスモデルが化学量論行列で表されるときには解を得る）のに十分な場合には、細胞の分析値に基づき代謝フラックスモデルにおける変数を決定し、これにより代謝フラックスを決定することができる。細胞の分析値が、代謝フラックスモデルにおける変数を計算するのに十分でない場合には、通常、代謝フラックスモデルにおける同位体分布の他の変数の一部を自由変数とする。次に、自由変数、同位体分布の分析値以外の細胞の分析値、および、用いた基質における標識の様式（同位体の位置および数ならびにこれらが異なる複数の基質を用いる場合にはそれら基質の割合）に基づいて代謝フラックスモデルから同位体分布を計算する。次に、同位体分布の分析値と前記計算値の比較に基づく最適化を行い、代謝フラックスモデルにおける変数を決定し、これにより代謝フラックスを決定することができる。このような最適化の方法の例としては、Metabolic Engineering 3, 265-283, 2001（非特許文献１）、Biotechnology and Bioengineering 55, 118-135, 1997（非特許文献３）、Biotechnology and Bioengineering 66, 69-85, 1999（非特許文献４）等に記載された方法が挙げられる。
If the analysis value of the cell is sufficient to calculate the variables in the metabolic flux model (to obtain a solution when the metabolic flux model is represented by a stoichiometric matrix), Variables can be determined, thereby determining metabolic flux. If the analytical value of the cells is not sufficient to calculate the variables in the metabolic flux model, usually some of the other variables of the isotope distribution in the metabolic flux model are free variables. Next, free variables, analysis values of cells other than the analysis value of isotope distribution, and the manner of labeling on the substrate used (the position and number of isotopes and when using a plurality of substrates different from each other) The isotopic distribution is calculated from the metabolic flux model based on the ratio). Next, optimization based on the comparison between the analysis value of the isotope distribution and the calculated value is performed, variables in the metabolic flux model are determined, and thereby the metabolic flux can be determined. Examples of such optimization methods include
炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞における代謝物の同位体分布の分析値から細胞内代謝フラックスを決定する工程における、基質の標識パターンの決定は通常の方法により行うことができる（例えば、Biotechnology and Bioengineering 66, 86-103, 1999（非特許文献５）参照）。 Determination of the labeling pattern of the substrate in the process of determining the intracellular metabolic flux from the analysis value of the isotope distribution of the metabolite in cells cultured in a medium containing the substrate labeled with an isotope as a carbon source is performed by a conventional method. (See, for example, Biotechnology and Bioengineering 66, 86-103, 1999 (Non-patent Document 5)).
解析する細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデルに基づいて、炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の分析値から細胞内代謝フラックスを解析する方法においては、下記の（ｅ-ａ）〜（ｅ-ｃ）の条件の少なくとも一つを満たすことが好ましい。 In a method for analyzing intracellular metabolic flux from analysis values of cells cultured in a medium containing a substrate labeled with an isotope as a carbon source, based on an intracellular metabolic flux model constructed for the intracellular metabolic flux to be analyzed Preferably satisfies at least one of the following conditions (e-a) to (e-c).
（ｅ-ａ）細胞の分析値は、細胞内代謝フラックスモデルに含まれる細胞内代謝物の同位体分布の分析値を含み、細胞内代謝物の同位体分布の分析値は、細胞内代謝物と細胞内代謝物が取り込まれて生じる細胞構成成分との間の合成と分解の度合いにより補正される。 (Ea) The analysis value of the cell includes the analysis value of the isotope distribution of the intracellular metabolite included in the intracellular metabolic flux model, and the analysis value of the isotope distribution of the intracellular metabolite is the intracellular metabolite And the degree of synthesis and decomposition between the cellular components produced by the uptake of intracellular metabolites.
（ｅ-ｂ）細胞内代謝フラックスモデルは、有用化合物および／またはその主要代謝中間体を含み、細胞の分析値は、培地中の、細胞内代謝物と同じ化合物であって、同位体で標識されていない化合物の細胞への取り込み速度、並びに、有用化合物および／またはその
主要代謝中間体の同位体分布の分析値を含み、有用化合物および／またはその主要代謝中間体の同位体分布の分析値は、取り込み速度から細胞構成成分に取り込まれる速度を減じた速度を代謝経路への速度と仮定し、その代謝経路への速度による有用化合物および／またはその主要代謝中間体の同位体分布に及ぼす影響により補正される。
(Eb) The intracellular metabolic flux model includes a useful compound and / or its main metabolic intermediate, and the analysis value of the cell is the same compound as the intracellular metabolite in the medium, and is labeled with an isotope The analysis value of the useful compound and / or its main metabolic intermediate is included, including the rate of uptake of the untreated compound into the cell and the analysis value of the useful compound and / or its main metabolic intermediate. Supposes the rate of uptake from the rate of uptake into cellular components as the rate of metabolic pathways and the effect of the rate of metabolic pathways on the isotope distribution of useful compounds and / or their major metabolic intermediates It is corrected by.
（ｅ-ｃ）細胞内代謝フラックスモデルは、二酸化炭素の固定反応および二酸化炭素の発生反応を含み、固定反応で使用される二酸化炭素を、発生反応で発生した二酸化炭素と仮定する。 (Ec) The intracellular metabolic flux model includes a carbon dioxide fixation reaction and a carbon dioxide generation reaction, and the carbon dioxide used in the fixation reaction is assumed to be carbon dioxide generated in the generation reaction.
この好ましい態様における細胞構成成分とは、細胞を構成する物質であって、細胞内代謝物が取り込まれて生じる物質である。例えば、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質等の物質である。また、細胞構成成分の分解物とは、それに取り込まれる細胞内代謝物と同じレベルの分解物を意味する。例えば、細胞構成成分が、アミノ酸が取り込まれて生じるタンパク質である場合には分解物はアミノ酸である。本明細書においては、細胞構成成分が、アミノ酸が取り込まれて生じるタンパク質である場合、特に、それを細胞タンパク質ともいう。また、細胞タンパク質の分解物であるアミノ酸を細胞タンパク質加水分解アミノ酸ともいう。 The cell component in this preferred embodiment is a substance that constitutes a cell, and is a substance that is produced by taking up an intracellular metabolite. For example, substances such as proteins, carbohydrates, nucleic acids and lipids. Moreover, the degradation product of a cell component means the degradation product of the same level as the intracellular metabolite taken in by it. For example, when the cell constituent is a protein produced by taking up amino acids, the degradation product is an amino acid. In the present specification, when the cell constituent component is a protein produced by incorporating an amino acid, it is also referred to as a cell protein. An amino acid that is a degradation product of cellular protein is also referred to as cellular protein hydrolyzed amino acid.
以下、各条件について説明する。
（ｅ-ａ）は、代謝フラックスの計算に際して、細胞内代謝物（例えばアミノ酸）の同位体分布を、細胞生育期に構成された細胞内構成成分（例えば細胞タンパク質）の分解により生成される細胞内代謝物から受ける影響、すなわち、細胞内代謝物プールと細胞内構成成分の分解により生成される細胞内代謝物との交換反応を考慮して補正するものである。補正の方法は、細胞内代謝物の同位体分布の分析値を交換反応に基づき補正したものとしてもよいし、細胞内代謝フラックスモデルに交換反応を含ませてもよい。細胞内代謝フラックスモデルに交換反応を含ませる場合には、細胞内代謝フラックスモデルは、細胞内代謝物とその細胞内代謝物が取り込まれて生じる細胞構成成分との交換反応を含み、細胞の分析値は、細胞内代謝物および細胞構成成分の分解物の同位体分布の分析値を含む。細胞内代謝フラックスモデルに交換反応を含ませる場合には、細胞内代謝物の同位体分布の分析値の補正値を直接的に使用するものではないが、代謝フラックスモデルに基づいて細胞内代謝フラックスを決定することにより、結果として細胞内代謝物の同位体分布の分析値が補正されたことになる。交換反応は、菌体構成成分の物質と菌体内プールの同物質間の交換係数(例えばタンパク質分解係数Pex)により表すことができる。また、この交換係数は、各物質ごとに独立に設定して計算した方が解析精度の向上が見込まれる。
Hereinafter, each condition will be described.
(E-a) is a cell generated by decomposing intracellular components (for example, cellular proteins) formed during the cell growth phase, by calculating isotope distribution of intracellular metabolites (for example, amino acids) when calculating metabolic flux. The correction is made in consideration of the influence received from the internal metabolites, that is, the exchange reaction between the intracellular metabolite pool and the intracellular metabolites generated by the decomposition of the intracellular components. As a correction method, the analysis value of the isotope distribution of the intracellular metabolite may be corrected based on the exchange reaction, or the exchange reaction may be included in the intracellular metabolic flux model. When an exchange reaction is included in the intracellular metabolic flux model, the intracellular metabolic flux model includes an exchange reaction between an intracellular metabolite and a cellular component generated by the incorporation of the intracellular metabolite. Values include analytical values of isotope distribution of intracellular metabolites and cell component degradation products. When an exchange reaction is included in the intracellular metabolic flux model, the correction value of the analysis value of the isotope distribution of the intracellular metabolite is not directly used, but the intracellular metabolic flux is based on the metabolic flux model. As a result, the analytical value of the isotope distribution of the intracellular metabolite is corrected. The exchange reaction can be represented by an exchange coefficient (for example, proteolysis coefficient Pex) between the substance constituting the bacterial cell component and the same substance in the bacterial cell pool. In addition, it is expected that the accuracy of analysis will be improved if the exchange coefficient is calculated by setting each substance independently.
細胞内代謝物の同位体分布の補正の方法の具体例としては、細胞内代謝フラックスモデルを、細胞内代謝物とその細胞内代謝物が取り込まれて生じる細胞構成成分との交換反応を含むものとし、細胞の分析値に、細胞内代謝物および細胞構成成分の分解物の同位体分布の分析値を含ませることが挙げられる。 As a specific example of a method for correcting the isotope distribution of intracellular metabolites, an intracellular metabolic flux model includes an exchange reaction between an intracellular metabolite and a cellular component produced by the incorporation of the intracellular metabolite. The analysis value of the cell includes the analysis value of the isotope distribution of the intracellular metabolite and the decomposition product of the cell component.
また、１）細胞内代謝物の同位体分布と細胞構成成分の分解物の同位体分布を測定する工程、２）工程１）で得られた結果から最適化アルゴリズムを用いて、細胞内代謝物と細胞構成成分との合成と分解との度合いを最適化する工程により補正することが挙げられる。この態様においては、合成と分解の度合いを交換反応係数で定義される変数として表現することが好ましい。また、最適化の方法としては、線形計画法、焼きなまし法、遺伝的アルゴリズム（"Genetic Algorithms in Search, Optimization and Machine Learning",
Addison Wesley(1989)）、進化アルゴリズム（Journal of theoretical Biology 199, 45-61, 1999）等が挙げられるが、遺伝的アルゴリズムや進化アルゴリズムの使用が好ましい。この態様では、細胞内代謝物がアミノ酸および／または有機酸であり、かつ細胞構成成分がタンパク質であることが好ましい。
In addition, 1) the step of measuring the isotope distribution of intracellular metabolites and the isotope distribution of decomposition products of cellular components, and 2) the intracellular metabolites using the optimization algorithm from the results obtained in step 1) And a step of optimizing the degree of synthesis and decomposition of the cell constituents. In this embodiment, the degree of synthesis and decomposition is preferably expressed as a variable defined by an exchange reaction coefficient. Optimization methods include linear programming, annealing, genetic algorithms ("Genetic Algorithms in Search, Optimization and Machine Learning",
Addison Wesley (1989)), evolutionary algorithms (Journal of theoretical Biology 199, 45-61, 1999), etc. are mentioned, but the use of genetic algorithms and evolutionary algorithms is preferred. In this embodiment, it is preferable that the intracellular metabolite is an amino acid and / or an organic acid, and the cell component is a protein.
細胞構成成分の分解物の同位体分布の分析値を用いる態様においては、細胞構成成分の分解物の同位体分布の分析値を、培地中の、細胞内代謝物と同じ化合物であって、同位体で標識されていない化合物の細胞構成成分への取り込みの影響を考慮して補正することが好ましい。例えば、細胞構成成分がタンパク質である場合には、細胞タンパク質加水分解アミノ酸の同位体分布の分析値を用いて代謝フラックスを計算する際に、培地中の、同位体で標識されていないアミノ酸の細胞タンパク質への取り込みを補正する。 In the embodiment using the analysis value of the isotope distribution of the degradation product of the cell component, the analysis value of the isotope distribution of the degradation product of the cell component is the same compound as the intracellular metabolite in the medium. It is preferable to correct in consideration of the influence of incorporation of a compound that is not labeled with the body into a cell constituent. For example, when the cell component is a protein, cells of amino acids not labeled with isotopes in the medium when calculating metabolic flux using the isotope distribution analysis value of cell protein hydrolyzed amino acids. Correct for protein uptake.
（ｅ-ｂ）は、培地中に、同位体で標識されていない、細胞内代謝物と同じ化合物が含有されるときに、それらが細胞に取り込まれる速度を分析し、取り込み速度から細胞構成成分に使用される速度を差し引いた残りの速度が分解経路に流れる流束であると仮定して、細胞内の有用化合物および／または主要代謝中間体の同位体分布に及ぼす影響を補正するものである。補正の方法は、細胞内代謝物の同位体分布の分析値を分解経路に流れる流束に基づき補正したものとしてもよいし、細胞内代謝フラックスモデルに上記流速を含ませてもよい。この態様では、同位体で標識されていない化合物がアミノ酸（好ましくはイソロイシン）であることが好ましい。 (Eb) analyzes the rate at which they are taken into cells when the medium contains the same compound as an intracellular metabolite that is not labeled with an isotope. Assuming that the remaining velocity minus the velocity used in the process is the flux that flows into the degradation pathway, it corrects the effect on the isotopic distribution of useful compounds and / or major metabolic intermediates in the cell . As a correction method, the analysis value of the isotope distribution of the intracellular metabolite may be corrected based on the flux flowing in the decomposition path, or the flow rate may be included in the intracellular metabolic flux model. In this embodiment, the compound that is not labeled with an isotope is preferably an amino acid (preferably isoleucine).
（ｅ-ｃ）は、培養液中の二酸化炭素分圧は全てが、細胞が同位体標識基質を消費して排出した二酸化炭素に由来すると仮定してカーボンバランスを算出するものである。 (Ec) calculates the carbon balance on the assumption that the partial pressure of carbon dioxide in the culture solution is derived from carbon dioxide exhausted by the cells consuming the isotope-labeled substrate.
本発明の好ましい態様では、以上のような条件を満たすことにより補正または仮定が行われる。これにより、同位体標識化合物を用いて行う代謝フラックス解析における解析誤差を小さくすることができる。 In a preferred embodiment of the present invention, correction or assumption is performed by satisfying the above conditions. Thereby, the analysis error in the metabolic flux analysis performed using the isotope-labeled compound can be reduced.
代謝フラックスが解析される細胞は、有用化合物の生産能を保持する微生物であることが好ましい。このような細胞としては、大腸菌、コリネ型細菌、バチルス属細菌が挙げられる。有用化合物とは、調味料や食品添加物、医薬品などとして有用な化合物であって、アミノ酸、有機酸、核酸などが挙げられる。 The cell whose metabolic flux is analyzed is preferably a microorganism that retains the ability to produce useful compounds. Examples of such cells include Escherichia coli, coryneform bacteria, and Bacillus bacteria. Useful compounds are compounds useful as seasonings, food additives, pharmaceuticals, and the like, and include amino acids, organic acids, nucleic acids, and the like.
また、主要代謝中間体とは、代謝フラックス解析モデルに含まれるすべての代謝中間体を意味し、ピルビン酸、グルコース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸、オキザロ酢酸等が挙げられる。 The main metabolic intermediate means all metabolic intermediates included in the metabolic flux analysis model, and examples thereof include pyruvic acid, glucose-6-phosphate, fructose-6-phosphate, oxaloacetate and the like.
細胞の培養は回分培養または流加培養であることが好ましい。回分培養とは、培養系において注入培地と最終培地量が一致している培養法であり、流加培養とは、培養系において注入培地に連続的または間欠的に基質を添加する培養法である。本発明の解析方法は、培養が回分培養または流加培養である場合であっても適用が可能である。 The cell culture is preferably batch culture or fed-batch culture. Batch culture is a culture method in which the amount of the injection medium and the final medium are the same in the culture system, and fed-batch culture is a culture method in which the substrate is added continuously or intermittently to the injection medium in the culture system. . The analysis method of the present invention can be applied even when the culture is batch culture or fed-batch culture.
同位体分布が測定される細胞内代謝物はアミノ酸および／もしくは有機酸並びに／またはその主要代謝中間体であることが好ましい。 The intracellular metabolites whose isotope distribution is measured are preferably amino acids and / or organic acids and / or their main metabolic intermediates.
本発明は、本発明の解析方法を実施するためのプログラムも提供する。本発明のプログラムは、
（Ｉ）下記（ａ）〜（ｃ）の工程により測定された同位体分布のデータを記憶する手段、（ａ）同位体で標識された物質を含まない培地で、代謝フラックス解析の対象とする状態となるまで細胞を培養する工程、
（ｂ）同位体で標識された基質を培地に添加し、培養を継続すると共に経時的に培養液から試料を採取する工程、および、
（ｃ）経時的に採取された試料に含まれる細胞内代謝物における同位体分布を測定する工程、
（II）記憶されたデータに対して回帰分析を実行し、定常状態の同位体分布比率を算出する手段、並びに、
（III）算出された同位体分布比率を用いて培養細胞の代謝フラックスを解析する手段、としてコンピューターを機能させることを特徴とする。
The present invention also provides a program for implementing the analysis method of the present invention. The program of the present invention
(I) Means for storing data of isotope distribution measured by the following steps (a) to (c), (a) A medium not containing a substance labeled with an isotope and subject to metabolic flux analysis Culturing the cells until the state is reached,
(B) adding a substrate labeled with an isotope to the medium, continuing the culture and collecting a sample from the culture solution over time; and
(C) a step of measuring an isotope distribution in intracellular metabolites contained in a sample collected over time;
(II) means for performing regression analysis on the stored data, calculating a steady-state isotope distribution ratio, and
(III) A computer is caused to function as a means for analyzing the metabolic flux of cultured cells using the calculated isotope distribution ratio.
（ａ）〜（ｃ）の工程（ラベル基質パルス添加系）により測定された同位体分布のデータは、通常には、キーボード等のデータ入力手段、または、記憶媒体からもしくは伝送媒体を介して転送する手段により入力される。 The data of isotope distribution measured by the steps (a) to (c) (label substrate pulse addition system) is usually transferred from a data input means such as a keyboard, or from a storage medium or via a transmission medium. It is input by the means to do.
記憶されたデータに対して回帰分析を実行し、定常状態の同位体分布比率を算出する手段は、本発明の解析方法に関して説明した算出の工程を行うのに適した手段であればよい。 The means for executing the regression analysis on the stored data and calculating the steady-state isotope distribution ratio may be any means suitable for performing the calculation process described with respect to the analysis method of the present invention.
算出された同位体分布比率を用いて培養細胞の代謝フラックスを解析する手段は、本発明の解析方法に関して説明した解析の工程を行うのに適した手段であればよい。解析の結果は、通常には、ディスプレイ等の表示手段、または、記憶媒体へまたは伝送媒体を介して転送する手段により出力される。 The means for analyzing the metabolic flux of the cultured cells using the calculated isotope distribution ratio may be any means suitable for performing the analysis process described with respect to the analysis method of the present invention. The result of the analysis is usually output by a display means such as a display or a means for transferring to a storage medium or via a transmission medium.
好ましい態様のプログラムは、上記（Ｉ）〜（III）の手段に加えて、解析する細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデルを記憶する手段、炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の分析値を入力する手段、細胞内代謝フラックスモデルおよび細胞の分析値に基づき細胞内代謝フラックスモデルの変数を決定し、細胞内代謝フラックスを決定する手段、ならびに、決定された細胞内代謝フラックスを出力する手段としてもコンピューターを機能させるためのプログラムであって、上記（ｅ-ａ）〜（ｅ-ｃ）の少なくとも一つを満たすように、細胞内代謝フラックスモデルが構築され、および／または、細胞内代謝フラックスモデルの変数が算出されることを特徴とする。 In addition to the means (I) to (III) described above, the program according to a preferred embodiment includes means for storing an intracellular metabolic flux model constructed with respect to the intracellular metabolic flux to be analyzed, a substrate labeled with an isotope as a carbon source. A means for inputting an analysis value of a cell cultured in a medium containing, an intracellular metabolic flux model, a variable for the intracellular metabolic flux model based on the analytical value of the cell, a means for determining an intracellular metabolic flux, and A program for causing a computer to function also as a means for outputting the determined intracellular metabolic flux, and an intracellular metabolic flux model so as to satisfy at least one of the above (ea) to (ec) Is constructed and / or a variable of an intracellular metabolic flux model is calculated.
解析する細胞内代謝フラックスに関して構築された細胞内代謝フラックスモデル、および、炭素源として同位体で標識された基質を含む培地中で培養した細胞の分析値については本発明の解析方法に関し説明した通りである。細胞内代謝フラックスモデルは、通常には、細胞内代謝フラックスモデルの表現に通常に使用されるデータの形式で記憶される。例えば、代謝フラックスモデルが化学量論行列で表されるときには、モデルのデータは行列として記憶される。分析値を入力する手段は、記憶媒体からまたは伝送媒体を介して転送する手段を包含する。 The intracellular metabolic flux model constructed for the intracellular metabolic flux to be analyzed, and the analysis value of the cells cultured in the medium containing the isotope-labeled substrate as the carbon source are as described for the analysis method of the present invention. It is. The intracellular metabolic flux model is usually stored in the form of data normally used to represent the intracellular metabolic flux model. For example, when a metabolic flux model is represented by a stoichiometric matrix, the model data is stored as a matrix. The means for inputting the analysis value includes means for transferring from the storage medium or via the transmission medium.
細胞内代謝フラックスモデルおよび細胞の分析値に基づき細胞内代謝フラックスモデルの変数を決定し、細胞内代謝フラックスを決定する手段は、本発明の解析方法に関して説明した決定の工程を行うのに適した手段であればよい。 The means for determining the intracellular metabolic flux model based on the intracellular metabolic flux model and the analysis value of the cell and determining the intracellular metabolic flux is suitable for performing the determination process described with respect to the analysis method of the present invention. Any means may be used.
決定された細胞内代謝フラックスを出力する手段は、記憶媒体へまたは伝送媒体を介して転送する手段を包含する。細胞内代謝フラックスの出力は、代謝フラックスモデルが構築された代謝ネットワークを図で示し、図中の代謝ネットワークの各反応に対応する位置にフラックスの値を表示するものであってもよい。 The means for outputting the determined intracellular metabolic flux includes means for transferring to a storage medium or via a transmission medium. The output of the intracellular metabolic flux may be a graph showing a metabolic network in which a metabolic flux model is constructed, and displaying the flux value at a position corresponding to each reaction in the metabolic network in the figure.
本発明のプログラムのフローチャートを図７に示す。上記（I）の（ａ）〜（ｃ）およびそれらの好ましい態様については、本発明の解析方法について工程（ａ）〜（ｃ）に、上記（II）およびその好ましい態様については、本発明の解析方法について工程（ｄ）に、上記（III）およびその好ましい態様については、本発明の解析方法について工程（ｅ）に、それぞれ、説明した通りであり、これらを満たすように、細胞内代謝フラックスモ
デルが構築され、および／または、細胞内代謝フラックスモデルの変数が算出されるようにする他は、通常のプログラム化の方法に従って本発明のプログラムを作成することができる。
A flowchart of the program of the present invention is shown in FIG. Regarding (a) to (c) of (I) above and preferred embodiments thereof, steps (a) to (c) in the analysis method of the present invention, and (II) and preferred embodiments thereof are described in the present invention. The analysis method is as described in step (d), the above (III) and preferred embodiments thereof are as described in step (e) of the analysis method of the present invention, and the intracellular metabolic flux is satisfied so as to satisfy these. The program of the present invention can be created according to a normal programming method except that a model is constructed and / or a variable of an intracellular metabolic flux model is calculated.
また、本発明の別の態様は上記プログラムを記録したことを特徴とするコンピューター読み取り可能な記録媒体に関する。すなわち、本発明にかかるプログラムを、コンピューター読み取り可能な記録媒体に格納することができる。ここで、この「記録媒体」は、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤ等の任意の「可搬用の物理媒体」や、各種コンピュータシステムに内蔵されるＲＯＭ、ＲＡＭ、ＨＤ等の任意の「固定用の物理媒体」、あるいは、ＬＡＮ、ＷＡＮ、インターネットに代表されるネットワークを介してプログラムを送信する場合の通信回線や搬送波のように、短期にプログラムを保持する「通信媒体」を含むものとする。 Another embodiment of the present invention relates to a computer-readable recording medium characterized by recording the above program. That is, the program according to the present invention can be stored in a computer-readable recording medium. Here, the “recording medium” is built in an arbitrary “portable physical medium” such as a flexible disk, a magneto-optical disk, a ROM, an EPROM, an EEPROM, a CD-ROM, an MO, and a DVD, or in various computer systems. A program can be executed in a short period of time such as a communication line or a carrier wave when a program is transmitted via any “fixed physical medium” such as ROM, RAM, HD, or a network represented by LAN, WAN, or the Internet. It shall include the “communication medium” to be retained.
また、「プログラム」は、任意の言語や記述方法にて記述されたデータ処理方法であり、ソースコードやバイナリコード等の形式を問わない。なお、「プログラム」は必ずしも単一的に構成されるものに限られず、複数のモジュールやライブラリとして分散構成されるものや、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）に代表される別個のプログラムと協働してその機能を達成するものをも含む。なお、実施の形態に示した各装置において記録媒体を読みとるための具体的な構成、読み取り手順、あるいは、読み取り後のインストール手順等については、周知の構成や手順を用いることができる。 The “program” is a data processing method described in an arbitrary language or description method, and may be in any form such as source code or binary code. The “program” is not necessarily limited to a single configuration, but is distributed in the form of a plurality of modules and libraries, or in cooperation with a separate program represented by an OS (Operating System). Including those that achieve the function. Note that a well-known configuration and procedure can be used for a specific configuration for reading the recording medium in each device described in the embodiment, a reading procedure, an installation procedure after reading, and the like.
以下に示す菌株および培地を使用した。
（ａ）大腸菌株とプラスミド
菌株：WYK050（Escherichia coli野生株W3110のS-(2-アミノエチル)システイン耐性かつリジン分解系遺伝子ldcおよびcadA遺伝子欠損株（Kikuchi, Y. et al. J. Bacteriol. 179, 4486-4492, 1997））。
プラスミド：pCAB1（ベクターRSF1010にE. coli由来lysC、dapA、dapB 遺伝子を搭載）
培養には、WYK050にpCAB1を導入した菌株を使用した。
The following strains and media were used.
(A) Escherichia coli strain and plasmid strain: WYK050 (Escherichia coli wild strain W3110 S- (2-aminoethyl) cysteine resistant and lysine degradation gene ldc and cadA gene deficient strain (Kikuchi, Y. et al. J. Bacteriol. 179, 4486-4492, 1997)).
Plasmid: pCAB1 (equipped with lysC, dapA and dapB genes from E. coli in vector RSF1010)
For the culture, a strain obtained by introducing pCAB1 into WYK050 was used.
（ｂ）培地
LB寒天培地：1.0％バクトトリプトン、0.5％バクトイーストエキストラクト、1％NaCl、1.5％寒天。必要に応じてストレプトマイシンを20μg/ml添加した。
主培養培地：硫酸アンモニウム 16g/L、リン酸二水素一カリウム 3g/L、酵母抽出物 4g/L、硫酸鉄七水和物 10mg/L、硫酸マンガン五水和物 10mg/L、イソロイシン 400mg/L、グルコース 40g/L、硫酸マグネシウム七水和物 1g/L。pHは、水酸化カリウムで7.0に調整した。必要に応じてストレプトマイシンを20μg/ml添加した。主培養培地は大腸菌の液体培養に使用した。
流加溶液：グルコース 500g/L、硫酸アンモニウム 80g/L
(B) Medium
LB agar: 1.0% bactotryptone, 0.5% bacto yeast extract, 1% NaCl, 1.5% agar. Streptomycin was added at 20 μg / ml as necessary.
Main culture medium: ammonium sulfate 16g / L, monopotassium dihydrogen phosphate 3g / L, yeast extract 4g / L, iron sulfate heptahydrate 10mg / L, manganese sulfate pentahydrate 10mg / L, isoleucine 400mg / L , Glucose 40g / L, magnesium sulfate heptahydrate 1g / L. The pH was adjusted to 7.0 with potassium hydroxide. Streptomycin was added at 20 μg / ml as necessary. The main culture medium was used for liquid culture of E. coli.
Fed-batch solution: glucose 500g / L, ammonium sulfate 80g / L
（１）代謝フラックス解析モデルの構築
細胞内代謝中間体の擬定常状態を仮定して、代謝フラックスを計算する化学量論式を構築した(Savinell and Palsson, Journal of Theoretical Biology 154, 421-454, 1992; Vallino and Stephanopoulos, Biotechnology and Bioengineering 41, 633-646, 1993)。このモデルに含まれる反応式は、第２表に示した通りであり、各略号の説明については第１表に記載する。分岐のないいくつかの反応は、式を単純化するため一つにまとめた。ペントースリン酸経路は複雑なため、２つの式にまとめて表記した。バイオマスの構成比率については以前報告されているデータを使用した(Neidhardt et al., Physiology of the Bacterial Cell, 1990)。また、細胞内タンパク質のアミノ酸の構成比は、実際に細胞内タンパク質を加水分解して得たアミノ酸の濃度比より求めた。このモデルの化学量論行
列は自由度が８であり、解を得るためには、糖消費速度のほかに７つのフラックスを決めなければならない。７つのフリーフラックスとして、次のものを定義した。菌体生成速度、リジン生産速度、酢酸生成速度、蟻酸生成速度、ICLフラックス、G6PDHフラックス、リンゴ酸酵素(Malic Enzyme)フラックスである。菌体生成速度および各種生成速度については、培養実験より結果を得た。そして、残りの３つのフラックスについては、アミノ酸などの同位体分布の測定値を元に最適化アルゴリズムにより決定した。また、構築したモデルは１４の可逆反応を含む。その可逆性は、０から１の数値を取りうる交換係数として定義した(Dauner et al., Biotechnology and Bioengineering 76, 144-156, 2001; Wiechert and de Graaf, Biotechnology and Bioengineering 55, 101-117, 1997)。これらの交換係数もまた、先の３つのフリーフラックスと同様に同位体分布の測定値を元に決定する変数である。解糖系、ペントースリン酸経路、TCAサイクルの隣り合う反応の可逆性は簡便性のため等しいと仮定した。感度分析の結果、第２表の反応リスト中の反応９，２８，２９については、同位体分布に影響をほとんど与えないことが明らかとなったため、０と仮定した。以上より、決定しなければならない可逆反応は６つとなった。
(1) Construction of metabolic flux analysis model Assuming a quasi-steady state of intracellular metabolic intermediates, a stoichiometric formula for calculating metabolic flux was constructed (Savinell and Palsson, Journal of Theoretical Biology 154, 421-454, 1992; Vallino and Stephanopoulos, Biotechnology and Bioengineering 41, 633-646, 1993). The reaction formulas included in this model are as shown in Table 2, and explanation of each abbreviation is shown in Table 1. Several unbranched reactions have been combined into one to simplify the equation. Since the pentose phosphate pathway is complicated, it is expressed in two formulas. Previously reported data were used for biomass composition ratios (Neidhardt et al., Physiology of the Bacterial Cell, 1990). The composition ratio of amino acids in the intracellular protein was determined from the concentration ratio of amino acids obtained by actually hydrolyzing the intracellular protein. The stoichiometric matrix of this model has 8 degrees of freedom, and in order to obtain a solution, 7 fluxes must be determined in addition to the sugar consumption rate. The following were defined as seven free fluxes. Cell production rate, lysine production rate, acetic acid production rate, formic acid production rate, ICL flux, G6PDH flux, malic enzyme (Malic Enzyme) flux. About the cell production rate and various production rates, the result was obtained from the culture experiment. The remaining three fluxes were determined by an optimization algorithm based on measured values of isotopic distribution of amino acids and the like. The constructed model also contains 14 reversible reactions. Its reversibility was defined as an exchange coefficient that can take values from 0 to 1 (Dauner et al., Biotechnology and Bioengineering 76, 144-156, 2001; Wiechert and de Graaf, Biotechnology and Bioengineering 55, 101-117, 1997 ). These exchange coefficients are also variables that are determined based on the measured values of the isotope distribution as in the previous three free fluxes. The reversibility of adjacent reactions in the glycolysis, pentose phosphate pathway, and TCA cycle was assumed to be equal for simplicity. As a result of the sensitivity analysis, it was clarified that the reactions 9, 28, and 29 in the reaction list of Table 2 hardly affect the isotope distribution. From the above, there were six reversible reactions that had to be determined.
モデル内のすべての物質の アイソトポマー分布ベクトル(Isotopomer Distribution Vector:IDV)を計算するために、フリーフラックスと交換係数および基質のアイソトポマー分布の関数としてアイソトポマーバランス式を構築した。IDVという列ベクトルは、アイソトポマーの割合を表し、要素の合計は１となるものである(Schmidt et al., Biotechnology and Bioengineering 55, 831-840, 1997; Wittmann and Heinzle, Biotechnology and Bioengineering 62, 739-750, 1999)。アイソトポマーバランス式は、Schmitらにより詳細に説明されているアイソトポマーマッピングマトリックス（IMM）を用いて記述されている(Schmidt, et al., Biotechnology and Bioengineering 55, 831-840, 1997)。アトムマッピングマトリックス（AMM）は、反応物から生成物への炭素原子の移動を表記した行列で、これを元に、数値計算ソフトであるMATLAB(The MathWorks, Natick, MA)を用いて、反応物から生成物へのアイソトポマーの移動を表記する行列であるアイソトポマーマッピングマトリックス（IMM）を計算する。 To calculate the isotopomer distribution vector (IDV) for all substances in the model, an isotopomer balance equation was constructed as a function of the free flux and exchange coefficient and the isotopomer distribution of the substrate. The column vector IDV represents the proportion of isotopomers and the sum of the elements is 1 (Schmidt et al., Biotechnology and Bioengineering 55, 831-840, 1997; Wittmann and Heinzle, Biotechnology and Bioengineering 62, 739- 750, 1999). The isotopomer balance equation has been described using the isotopomer mapping matrix (IMM) described in detail by Schmit et al. (Schmidt, et al., Biotechnology and Bioengineering 55, 831-840, 1997). The atom mapping matrix (AMM) is a matrix that describes the movement of carbon atoms from a reactant to a product. Based on this matrix, MATLAB (The MathWorks, Natick, MA) is used as a reactant. An isotopomer mapping matrix (IMM), which is a matrix describing the transfer of isotopomers from to the product, is calculated.
アイソトポマーのバランス式は、フリーフラックスと交換係数を入力としてGause-Seidelの繰り返し法を用いて解くことができる。 The isotopomer balance equation can be solved using the Gause-Seidel iteration method with free flux and exchange coefficient as inputs.
グルコースの消費に加えて、微生物細胞は二酸化炭素を取り込み、生育の途中で酢酸を消費する。二酸化炭素は、同位体標識グルコースの代謝からも発生するため何割かは13C-二酸化炭素である。この割合は、二酸化炭素を発生するすべての反応を考慮した二酸化炭素のバランス式により計算された。正確な値は細胞内代謝フラックス分布に依存して異なるが、概して32%程度であった。この計算をするにあたり、大気中からの二酸化炭素を消費することはないと仮定した。なぜならば、細胞が同位体標識グルコースを消費して発生した二酸化炭素の濃度は非常に高く（実験では、排出二酸化炭素の濃度は、４〜５％に及んだ）、発酵槽中の二酸化炭素分圧はすべて細胞が排出した二酸化炭素と考えて差し支えないからである。 In addition to glucose consumption, microbial cells take up carbon dioxide and consume acetic acid during growth. Since carbon dioxide is also generated from the metabolism of isotope-labeled glucose, some percent is 13 C-carbon dioxide. This ratio was calculated by a carbon dioxide balance equation that takes into account all reactions that generate carbon dioxide. The exact value varies depending on the intracellular metabolic flux distribution, but is generally around 32%. For this calculation, it was assumed that no carbon dioxide was consumed from the atmosphere. This is because the concentration of carbon dioxide generated by the cells consuming isotope-labeled glucose is very high (in the experiment, the concentration of exhausted carbon dioxide ranged from 4 to 5%), and the carbon dioxide in the fermenter This is because all partial pressures can be considered as carbon dioxide exhausted by cells.
マススペクトロメトリーによる分析から各物質すべてのアイソトポマー分布を求めることはできないが、重量の分布は求めることができる。この情報は、重量分布ベクトル（MDV）として表すこととし、各要素は同じ重量からなるアイソトポマーを含んでいる（Wittman and Heinzle, Biotechnology and Bioengineering 62, 739-750, 1999）。従って、炭素数nの物質には、MDVの要素数はn+1個存在することとなる。MDVは、IDVから同じ重量の要素を合計して計算することができる。こうして計算されたMDVは、実験よりもとめたMDVと比較することにより、モデルの結果がどれだけ実験値とあっているかを評価することができる。 Although it is not possible to determine the isotopomer distribution of each substance from the analysis by mass spectrometry, the distribution of weight can be determined. This information will be expressed as a weight distribution vector (MDV), and each element contains isotopomers of the same weight (Wittman and Heinzle, Biotechnology and Bioengineering 62, 739-750, 1999). Therefore, there are n + 1 elements of MDV in a substance having n carbon atoms. MDV can be calculated by summing elements of the same weight from IDV. By comparing the MDV calculated in this way with the MDV obtained from the experiment, it can be evaluated how much the result of the model matches the experimental value.
（２）天然に存在する炭素、水素、窒素、酸素、各原子の同位体による影響の補正
Heizleらの論文(Wittman and Heinzle, Biotechnology and Bioengineering 62, 739-750, 1999)に従い、プログラムを作成して全分析データに対して水素、炭素、窒素、酸素の自然同位体による影響の補正を実施した。
(2) Correction of the effects of naturally occurring carbon, hydrogen, nitrogen, oxygen and atomic isotopes
According to the paper by Heizle et al. (Wittman and Heinzle, Biotechnology and Bioengineering 62, 739-750, 1999), a program was created to correct the influence of natural isotopes of hydrogen, carbon, nitrogen and oxygen on all analytical data. did.
天然に存在する水素、炭素、窒素、酸素の同位体の比率はそれぞれ、1H=0.99985、2H=0.015、12C=0.98893、13C=0.01107、14N=0.99634、15N=0.00366、16O=0.99759、17O=0.00037、18O=0.00204として計算した。αを低質量同位体の存在比率、βを高質量同位体の存在比率とし（α+β=1を満たす）、ρniを対応する二項係数とすると、水素、炭素、窒素の自然同位体補正行列は以下のように記述できる。E1は物質名とする。 The ratios of naturally occurring hydrogen, carbon, nitrogen, and oxygen isotopes are 1 H = 0.99985, 2 H = 0.015, 12 C = 0.98893, 13 C = 0.01107, 14 N = 0.99634, 15 N = 0.00366, 16 The calculation was performed with O = 0.99759, 17 O = 0.00037, and 18 O = 0.00204. Natural isotopic correction of hydrogen, carbon, and nitrogen, where α is the abundance ratio of low-mass isotopes, β is the abundance ratio of high-mass isotopes (α + β = 1 is satisfied), and ρni is the corresponding binomial coefficient The matrix can be described as follows: E1 is the substance name.
（３）代謝フラックス最適化
アイソトポマーのバランス式を用いてフリーフラックスと交換反応のフラックスを入力値としてMDVを計算し、実験で得たMDVとの差の2乗和が最小となるように先に入力したフリーフラックスと交換反応のフラックスの値を進化的アルゴリズム(Stephani et al, Journal of theoretical Biology 199, 45-61, 1999)により最適化するというプログラムを構築した。このプログラム中において、比較対照とした同位体基質初期添加系については
、最適化の対象とする変数は、ICL、Malic Enzyme、ペントースリン酸経路（G6PDH）のフラックス、6つの交換反応の値並びにタンパク質と細胞内アミノ酸プールとの交換反応を表すPexである。
(3) Metabolic flux optimization MDV is calculated using the isotopomer balance equation with the free flux and exchange reaction flux as input values, so that the sum of squares of the difference from the MDV obtained in the experiment is minimized. A program was developed to optimize the input free flux and exchange reaction flux values by an evolutionary algorithm (Stephani et al, Journal of theoretical Biology 199, 45-61, 1999). In this program, for the initial addition system of the isotope substrate used as a control, the variables to be optimized are ICL, Malic Enzyme, pentose phosphate pathway (G6PDH) flux, six exchange reaction values, protein and Pex representing an exchange reaction with an intracellular amino acid pool.
同位体基質パルス添加系では、上記プログラムにおいて、Pexをすべてのアミノ酸に固有の変数として設定し、上記の（１）に記載のアイソトポマーバランス式内に組み込んだ。菌体収率、リジン収率については、入力値に対して20%の誤差を許容するように設定した。これは、実験の際の測定誤差を加味するためである。計算時間を短縮するために、一般的な進化的アルゴリズムに対していくつかの変更を加えた。種々検討した結果、解の空間内で最小値を探索するには要素数が50000、世代数が200という設定が最適であることがわかったので、解析にはそれらの設定値を用いた。 In the isotope substrate pulse addition system, Pex was set as a variable unique to all amino acids in the above program, and incorporated in the isotopomer balance equation described in (1) above. The cell yield and lysine yield were set so as to allow an error of 20% with respect to the input value. This is to take into account measurement errors in the experiment. Some changes were made to the general evolutionary algorithm to reduce computation time. As a result of various investigations, it was found that the setting of 50000 elements and 200 generations was optimal for searching the minimum value in the solution space, and those setting values were used for the analysis.
（４）感度分析
フリーフラックスの信頼区間は、各測定値の分散だけでなくヤコビアン行列にも依存する。ヤコビアン行列とは、最適値付近でフリーフラックスが変化したときの各IDVの変化しやすさを表現するものである。構築した代謝解析モデルを元にヤコビアン行列を作成し、Mollneyら(Biotechnology and Bioengineering 66, 86-103)の方法に従って、ラベルグルコースの最適な混合比を見つけるために感度解析を実施した。使用ラベルグルコースは1-13C-GlcとU-13C-Glcに限定して計算した結果、それぞれ50%(mol%)ずつの混合比が最適であるという結果を得た。
(4) Sensitivity analysis The confidence interval of the free flux depends not only on the variance of each measured value but also on the Jacobian matrix. The Jacobian matrix expresses how easily each IDV changes when the free flux changes near the optimum value. A Jacobian matrix was created based on the constructed metabolic analysis model, and sensitivity analysis was performed to find the optimal mixing ratio of labeled glucose according to the method of Mollney et al. (Biotechnology and Bioengineering 66, 86-103). As a result of calculating the use label glucose limited to 1-13C-Glc and U-13C-Glc, it was found that a mixing ratio of 50% (mol%) was optimum.
（５）培養実験
LB寒天培地上にWYK050/pCAB1菌株溶液を塗布し、37℃で24時間静置培養した。その静置培養プレート2枚の細胞を種培地に植菌した。種培養は初糖を完全に消費した時点で終了とし、その培養液を主培地に植菌して主培養を行った。種培地および主培地の組成は同じであり、上記の主培養培地の通りである。培養には1Lジャーファーメンターを使用し、同位体標識基質パルス添加系では、基質には非標識のグルコースを使用した。同位体基質初期添加系は、標識グルコースを使用した（1-13C-Glc：U-13C-Glc＝５：５）。培養の初発液量は300mlで、温度、pHはそれぞれ37℃、6.7に制御した。pHの制御には、アンモニアガスを使用した。通気は、300ml/minに制御した。培養液の溶存酸素濃度は常に5%以上を維持するように撹拌数を適宜制御した。糖液（流加溶液）の流加は、培養17時間に開始した。流加速度は、培地の糖濃度が5g/L以下になるように適宜調節した。発酵サンプルの取得は、培養17時間目と培養25時間目に実施した。比較対照である同位体基質初期添加系では、補正用に菌体タンパク質加水分解アミノ酸の測定も各サンプルで実施した。同位体基質パルス添加系では、サンプルを取得する時間直前に、非標識のグルコースの流加を停止し糖の枯渇を待機した。糖が枯渇して溶存酸素濃度が上昇に転じる瞬間に、予め準備していた標識グルコース（1-13C-Glc：U-13C-Glc＝５：５）を2 g添加し、添加時を0分として、1分後、5分後、10分後、30分後にサンプリングを実施した。サンプルは、サンプリング後、直ちに菌体内アミノ酸の抽出を行った。各アミノ酸の同位体分布測定は、LC-MSを用いて行った。
(5) Culture experiment
The WYK050 / pCAB1 strain solution was applied on LB agar medium and statically cultured at 37 ° C. for 24 hours. Cells from the two stationary culture plates were inoculated into a seed medium. The seed culture was terminated when the initial sugar was completely consumed, and the culture was inoculated into the main medium for main culture. The composition of the seed medium and the main medium is the same as described above for the main culture medium. A 1 L jar fermenter was used for the culture, and unlabeled glucose was used as the substrate in the isotope-labeled substrate pulse addition system. For the initial isotope substrate addition system, labeled glucose was used (1-13C-Glc: U-13C-Glc = 5: 5). The initial volume of the culture was 300 ml, and the temperature and pH were controlled at 37 ° C. and 6.7, respectively. Ammonia gas was used for pH control. Aeration was controlled at 300 ml / min. The number of agitation was appropriately controlled so that the dissolved oxygen concentration in the culture solution was always maintained at 5% or more. The feeding of the sugar solution (feeding solution) was started at 17 hours of culture. The flow acceleration was appropriately adjusted so that the sugar concentration of the medium was 5 g / L or less. Fermentation samples were obtained at 17 hours of culture and 25 hours of culture. In the isotope substrate initial addition system as a comparison control, the measurement of bacterial protein hydrolyzed amino acids was also performed for each sample for correction. In the isotope substrate pulse addition system, the feeding of unlabeled glucose was stopped immediately before the sample was obtained, and the depletion of sugar was awaited. 2 g of labeled glucose (1-13C-Glc: U-13C-Glc = 5: 5) prepared in advance is added at the moment when the sugar is depleted and the dissolved oxygen concentration starts to increase. Sampling was performed after 1 minute, 5 minutes, 10 minutes, and 30 minutes. The sample was subjected to extraction of amino acids in the cell immediately after sampling. The isotopic distribution of each amino acid was measured using LC-MS.
（６）パルス添加実験系における同位体定常状態のアミノ酸同位体比率の予測
同位体基質をパルス添加した後の各時間のアミノ酸の同位体分布比のMS分析データをもとに、
(6) Prediction of isotope steady-state amino acid isotope ratio in pulsed experimental system Based on MS analysis data of amino acid isotope distribution ratio at each time after pulsed isotope substrate
す。このとき、物質ξの炭素数をnとするとｉは０からｎの整数値からなり、ΣMDV (Mi)=1を満たす。外部パラメータλ及びηは、探索範囲をそれぞれ０．１刻みで０．１から２までと１刻みで１から２０までの合計４００個で実施し、アミノ酸ごとに非線形回帰誤差が最小となる回帰パラメータを計算により求めた。その結果を第３表に示す。代表例として、アラニンとグリシンについて、得られた回帰パラメータを使用した培養１７時間目と培養２５時間目の回帰分析結果を図１に示す。非線形回帰分析により得られた回帰パラメータａ、ｂ、ｃ、ｄより、時間ｔを無限大としたときのMDV (Mi)ξを計算して、同位体分布が定常状態の各アミノ酸MDVを予測した。その結果得られた同位体分布定常状態のアミノ酸MDV実験値を第６表に示す。
（７）代謝フラックス解析
上述した（６）の方法により求めた各アミノ酸のMDVを用いて、前述の（３）の方法で代謝フラックスの計算を実施した。代謝フラックス最適化の際に使用した、菌体外のリジン生成速度および酢酸生成速度並びに菌体生成速度を糖消費速度で規格化した値を第４表に示す。
(7) Metabolic flux analysis Using the MDV of each amino acid determined by the method (6) described above, the metabolic flux was calculated by the method (3) described above. Table 4 shows values obtained by normalizing the extracellular lysine production rate and acetic acid production rate and the bacterial cell production rate with the sugar consumption rate, which were used in the metabolic flux optimization.
同位体標識グルコース初期添加系および同位体標識グルコースパルス添加系における培養１７時間と培養２５時間目の解析の結果得られた自由フラックスを第５表に示し、その自由フラックスを基に計算したすべての代謝フラックス分布を図２〜５に示す。代謝フラックス解析により得られた各アミノ酸のMDV計算値を第６表に示す。ＭＤＶ計算値は、前記（６）で得られたＭＤＶ実験値とよく符合した。 The free flux obtained as a result of the analysis at 17 hours and 25 hours of culture in the isotope-labeled glucose initial addition system and the isotope-labeled glucose pulse addition system is shown in Table 5, and all calculations calculated based on the free flux Metabolic flux distribution is shown in FIGS. Table 6 shows the MDV calculated values of each amino acid obtained by metabolic flux analysis. The MDV calculated value was in good agreement with the MDV experimental value obtained in (6) above.
（８）同位体基質初期添加系と同位体基質パルス添加系の解析結果の比較
同位体基質初期添加系の解析結果と、本発明の同位体基質パルス添加系の解析結果のフリーフラックスの値を比較したグラフを図６に示す。培養１７時間及び培養２５時間の解析データは、それぞれ相関係数０．９７及び０．９９と良い相関を示した。従って、同位体基質パルス添加系での解析においても初期添加系と同様の傾向の結果を得ることができたと考えられる。
(8) Comparison of analysis results of isotope substrate initial addition system and isotope substrate pulse addition system The free flux value of the analysis result of the isotope substrate initial addition system and the analysis result of the isotope substrate pulse addition system of the present invention The compared graph is shown in FIG. Analyzed data for 17 hours of culture and 25 hours of culture showed good correlations with correlation coefficients of 0.97 and 0.99, respectively. Therefore, it is considered that the same trend results as in the initial addition system could be obtained in the isotope substrate pulse addition system.
Claims (13)
（ａ）同位体で標識された基質を含まない培地で、代謝フラックス解析の対象とする状態となるまで細胞を培養する工程、
（ｂ）同位体で標識された基質を培地に添加し、培養を継続するとともに経時的に培養液から試料を採取する工程、
（ｃ）経時的に採取された試料に含まれる細胞内代謝物における同位体分布を測定する工程、
（ｄ）測定されたデータに対して回帰分析を実行し、
定常状態の同位体分布比率を算出する工程、および
（ｅ）算出された同位体分布比率を用いて培養細胞の代謝フラックスを解析する工程、を有することを特徴とする方法。 A method for analyzing metabolic flux in cells,
(A) a step of culturing cells in a medium that does not contain an isotope-labeled substrate until the target state for metabolic flux analysis is obtained;
(B) adding a substrate labeled with an isotope to the medium, continuing the culture and collecting a sample from the culture solution over time;
(C) a step of measuring an isotope distribution in intracellular metabolites contained in a sample collected over time;
(D) performing regression analysis on the measured data;
A method comprising: calculating a steady-state isotope distribution ratio; and (e) analyzing a metabolic flux of cultured cells using the calculated isotope distribution ratio.
（Ｉ）下記（ａ）〜（ｃ）の工程により測定された同位体分布を記憶する手段、
（ａ）同位体で標識された物質を含まない培地で、代謝フラックス解析の対象とする状態となるまで細胞を培養する工程、
（ｂ）同位体で標識された基質を培地に添加し、培養を継続すると共に経時的に培養液から試料を採取する工程、および、
（ｃ）経時的に採取された試料に含まれる細胞内代謝物における同位体分布を測定する工程、
（II）記憶されたデータに対して回帰分析を実行し、定常状態の同位体分布比率を算出する手段、並びに、
（III）算出された同位体分布比率を用いて培養細胞の代謝フラックスを解析する手段、
としてコンピューターを機能させるためのプログラム。 A program used for analyzing metabolic flux in cells,
(I) Means for storing an isotope distribution measured by the following steps (a) to (c):
(A) a step of culturing cells in a medium not containing an isotope-labeled substance until a state for metabolic flux analysis is reached;
(B) adding a substrate labeled with an isotope to the medium, continuing the culture and collecting a sample from the culture solution over time; and
(C) a step of measuring an isotope distribution in intracellular metabolites contained in a sample collected over time;
(II) means for performing regression analysis on the stored data, calculating a steady-state isotope distribution ratio, and
(III) Means for analyzing metabolic flux of cultured cells using the calculated isotope distribution ratio,
As a program to make the computer function as.
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