JP2005245437A - 精神障害に対する感受性の診断または予測方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】Disrupted-in Schizophrenia-1 (DISC1)の精神障害への関与の解明。
【解決手段】個体からの細胞におけるDISC1の分子的多様性および／または細胞内分布を確認することを含む、個体における精神障害、例えば双極性障害、に対する脆弱性を診断または予測する方法を提供する。さらに、新規なDISC1の精神障害に対するリスクハプロタイプも提供する。
【効果】本発明は精神障害の治療用医薬のスクリーニングに利用できる。
【選択図】なし
【解決手段】個体からの細胞におけるDISC1の分子的多様性および／または細胞内分布を確認することを含む、個体における精神障害、例えば双極性障害、に対する脆弱性を診断または予測する方法を提供する。さらに、新規なDISC1の精神障害に対するリスクハプロタイプも提供する。
【効果】本発明は精神障害の治療用医薬のスクリーニングに利用できる。
【選択図】なし
Description
本発明は、精神障害、特に、統合失調症、双極性障害などに対する脆弱性を診断または予測する方法に関する。
現在の精神障害の鑑別診断は非常に現象学的である。診断は障害の症状および経過の特定のサブセットの観察に基づいている。The Diagnostic and Statistical Manual (DSM) of Mental Disorders (the American Psychiatric Association's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders、4th edition、1994)
が広く用いられている。精神障害の生物学的および生化学的評価を開発するためにかなりの研究努力が行われてきたにも拘わらず、その診断基準において客観的マーカーはほとんど利用されていない。
が広く用いられている。精神障害の生物学的および生化学的評価を開発するためにかなりの研究努力が行われてきたにも拘わらず、その診断基準において客観的マーカーはほとんど利用されていない。
DSM-IVによって定義されるように、統合失調症はもっとも重篤な精神障害の１つであり思考、情動および認知の障害をともなう精神病性症状によって特徴づけられる。
統合失調症は高血圧および糖尿病などのように世界的に起こる一般的な疾患である。その病因はいまだによくわかっていないが、多数の証拠が統合失調症に対する遺伝的素因を支持する。統合失調症についての連鎖解析により多数の染色体座が示され、その脆弱性因子として特定の候補遺伝子の存在が示唆された。脳撮像および神経病理学的評価により、統合失調症における異常には細胞骨格の障害を反映する異常な脳皮質発達が含まれることが示唆されている。
スコットランドの家族において、均衡のとれた染色体(1;11)(q42.1;q14.3)転座がオッズスコアの対数7.1にて主要な精神障害(統合失調症および気分障害)の発症にともなっている。この転座はDisrupted-in Schizophrenia-1 (DISC1)と称される転写産物のコード配列を破壊し、DISC1タンパク質のC-末端257アミノ酸の欠失を導く。
PC12細胞における、突然変異体DISC1タンパク質(mutDISC1)の一過性発現が、神経突起伸長を阻害するが、野生型DISC1タンパク質 (wtDISC1)は阻害しないことが報告された(PNAS vol.100、No.1、289-294、2003)。PC12細胞におけるwtDISC1の安定なトランスフェクションが神経突起伸長を促進することも報告された(Molecular Psychiatry vol.8、No.7、685-694、2003)。
wtDISC1は主に中心体で発現するのに対し、mutDISC1は細胞質に広く分布する(PNAS vol.100、No.1、289-294、2003、Human Molecular Genetics vol.12、No.13、1591-1608、2003)。
これら従来技術はDISC1の細胞内局在についての情報およびその機能の手がかりを提供しているにも拘わらず、wtDISC1が障害を受けた場合の病態生理についてはわかっていない。したがってDISC1の、より一般的な統合失調症およびスコットランドの家族において見いだされたDISC1の特有の突然変異(mutDISC1)の無い関連する精神病への関与は、未だに不明である。
（発明の概要）
本明細書および特許請求の範囲において「精神障害」には、これらに限定されないが、統合失調症、気分障害、例えば、双極性障害、物質乱用が含まれる。
本明細書および特許請求の範囲において「精神障害」には、これらに限定されないが、統合失調症、気分障害、例えば、双極性障害、物質乱用が含まれる。
本発明は、個体からの細胞におけるDISC1の細胞内分布および／または分子的多様性を確認することを含む個体における精神障害の脆弱性を診断または予測する方法を提供する。
本発明によると、DISC1の細胞内分布は、細胞の細胞成分分画および該画分の定量的または半定量的評価、または細胞中のタンパク質の可視化を含むいずれの公知の方法によって判定してもよい。DISC1またはそのアイソフォームの細胞内分布を、その核対細胞質比、即ち、粗核ペレット (P) 対核沈殿後の（postnuclear）上清(S)比によって評価するのが便利である。
本明細書および特許請求の範囲によると、「分子的多様性」の語は、mRNAレベルとタンパク質レベルの両方のDISC1の発現レベル、発現レベルおよび／または機能におけるDISC1の損傷の量を含む。分子的多様性は、ハプロタイプの多様性にも関連している。それゆえ、「DISC1の分子的多様性の確認」とは、発現レベルおよび／または機能でのDISC1における変化の確認を意味する。変化の機構の可能性のある例には、DISC1遺伝子のトランス活性化における欠陥、スプライシング(エキソンの利用)における異常、RNA安定性の変化、およびDISC1タンパク質の点突然変異が含まれる。
本発明によると、DISC1の細胞内分布および／または分子的多様性はDISC1に対する抗体を用いて判定できる。抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。DISC1上の様々なエピトープに対する抗体の例を図13に示す。本発明の方法を行うための抗体を含むキットも提供される。一つの態様では、キット中の抗体は二次抗体および検出可能なマーカーなどの試薬に結合している。
本発明に基づいて試験すべき個体およびコントロール対象からの標本は、血液、線維芽細胞、粘膜、嗅上皮およびリンパ芽球であってよい。
今日、ヒト線維芽細胞、嗅上皮細胞およびリンパ芽球は、遺伝子発現またはその他の細胞機能の研究のための一般的な細胞システムになってきている。その利点は神経組織と比較して容易な組織への到達性である(Arnold SE et al. 2001; Feron F et al 1999; Moberg PJ、et al. 1999; Taylor、M. S. et al. 2003; Farbman AI. 1994; Crews L et al 1994; Panov AV et al 2002)。
一つの態様において、双極性障害に対する脆弱性の診断または予測は、個体のリンパ芽球におけるDISC1の発現レベルを測定することによって行うことが出来る。
本発明の別の態様によると、精神障害に対する新規なリスクハプロタイプDISC1が提供される。該リスクハプロタイプは以下に示すSNPsの組み合わせからなる:
ここで、物理的位置はNCBIのビルド（build）34に基づく。db SNPはhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/から入手可能である。
本明細書において、リスクハプロタイプをHP1と称する。該ハプロタイプHP1は特に女性患者における、精神障害、例えば、双極性障害を患う個体に多く伝達される(over-transmitted)。
したがって、本発明はさらに、個体におけるハプロタイプHP1の存在または非存在を判定することを含む、個体における精神障害に対する脆弱性の診断または予測方法を提供する。個体におけるハプロタイプの存在または非存在を判定する手法は当該技術分野において周知である。
本発明のさらなる態様において、DISC1の分子的多様性および／または細胞内分布の確認は精神障害の治療用医薬のスクリーニングに利用できる。
（発明の詳細な説明）
本発明者はDISC1タンパク質が自己会合しうることを見いだした。かかる自己会合(self-association)はwtDISC1とwtDISC1の間、mutDISC1とmutDISC1の間、そしてwtDISC1とmutDISC1の間で起こる。
本発明者はDISC1タンパク質が自己会合しうることを見いだした。かかる自己会合(self-association)はwtDISC1とwtDISC1の間、mutDISC1とmutDISC1の間、そしてwtDISC1とmutDISC1の間で起こる。
さらに、本発明者はmutDISC1タンパク質がwtDISC1の細胞内局在を変化させることも見いだした。その結果、wtDISC1は中心体におけるその元々の細胞内分布を失い、mutDISC1とほぼ同じ分布を示す。この観察は、細胞染色とグリセロール勾配を用いた生化学的方法の両方により確認される。
これらの結果は、mutDISC1がドミナントネガティブとして機能することを示し、これは内在性wtDISC1機能を失わせることを意味する。
さらに、本発明者は、mtDISC1のドミナントネガティブ機能および／またはRNAiによるwtDISC1レベルの抑制により神経突起伸長が阻害されることを見いだした。
DISC1機能の喪失と神経突起伸長阻害の間の関係は、DISC1機能の障害と微小管作用に関係があることを示す。
統合失調症、双極性障害、および大うつ病患者の脳ならびに正常のコントロール脳を含むよく特徴づけられた一連の解剖脳におけるDISC1タンパク質を生化学的に分析したところ75-85kDaにおいてDISC1のアイソフォームが同定された。該アイソフォームはエキソン2および5を含むDISC1アイソフォームに対応する。
アイソフォームの細胞成分分画を調べたところ、SZの患者または物質乱用患者の脳からのDISC1の粗核画分(P画分)の核沈殿後の細胞質画分(S画分)に対する比が上昇していることが観察された。P画分には細胞基質、ミトコンドリア、およびシナプス後密度からのマーカータンパク質は含まれなかった。微小管を両方P画分には豊富でない細胞質と中心体画分から回収した。一方、核タンパク質であるヒストンH1はP画分においてもっぱら豊富であった。したがって、PのS画分に対する比の上昇は核におけるDISC1の上昇を反映すると結論することが出来る。
DISC1の総レベルは変化していないという事実を考慮すると、核DISC1のレベルの上昇により、DISC1のその他のプール、特に微小管における減少が示唆される。
本発明者は、双極性障害(以下「BP」と称する)対象におけるリンパ芽球中のmRNAとタンパク質レベルとの両方でのDISC1発現のレベルが、病気でない家族コントロールと比べて低いことを示した。DISC1に関する関連研究に基づくと、DISC1発現レベルがより低いBPを患う女性対象に多く伝達される（over-transmitted）ハプロタイプが同定された。さらに、病気である対象の臨床的特徴とDISC1発現レベルの相関が明らかとなった。
本発明の別の態様において、57の双極性家系におけるDISC1と双極性障害の家族に基づく関連研究を行った。さらに、ヒトリンパ芽球におけるmRNAレベルとタンパク質レベルの両方におけるDISC1発現を調べた。いくつかの臨床的特徴とDISC1発現レベルとの相関を研究した。
ハプロタイプ分析により、BP表現型に多く伝達された（overtransmitted）１つのハプロタイプ(HP1) (p=0.01)と多くは伝達されなかった（undertransmitted）第二のハプロタイプ(HP2)が同定された。病気である女性にHP1が伝達される（overtransmission）という伝達の偏向における性による影響の証拠があった(p=0.004)。HP2を有する病気でない対象由来の細胞株と比較して病気であるHP1群においてDISC1発現は有意に減少していた(p=0.006)。この差は女性においてより顕著であった(p=0.001)。さらに最初の躁病発症がより若年であることおよびより多数の躁病症状がより低いDISC1発現レベルと相関していることを示唆する証拠がある(p=0.008)。したがって、リスクハプロタイプに伴うDISC1発現レベルの減少は特に女性における双極性障害の病態生理と関係があると結論づけられる。
これらの結果から、DISC1機能またはレベルの減少または喪失により精神病が導かれるということが示唆される。
実施例１および２
材料および方法
試薬および抗体
すべての試薬は特に断りのない限り、Sigma、Invitrogenから得た。タンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイ試薬(PIERCE Biotechnology)を用いて測定した。DISC1に対する抗体の調製は以前に記載されている(Ozeki et al.、2003)。アフィニティー精製したGFP(Molecular Probe)に対するウサギ抗血清を用いて神経突起伸長アッセイにおいてGFP-をトランスフェクトしたPC12細胞の形態を可視化した。shRNA用のベクター系を用いて内在性DISC1タンパク質発現を抑制した(Brummelkamp et al.、2002; Yu et al.、2002)。
材料および方法
試薬および抗体
すべての試薬は特に断りのない限り、Sigma、Invitrogenから得た。タンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイ試薬(PIERCE Biotechnology)を用いて測定した。DISC1に対する抗体の調製は以前に記載されている(Ozeki et al.、2003)。アフィニティー精製したGFP(Molecular Probe)に対するウサギ抗血清を用いて神経突起伸長アッセイにおいてGFP-をトランスフェクトしたPC12細胞の形態を可視化した。shRNA用のベクター系を用いて内在性DISC1タンパク質発現を抑制した(Brummelkamp et al.、2002; Yu et al.、2002)。
本研究において、本発明者は7つのshRNAプラスミドを作成し、本研究用に以下の配列の代表的な２つのプラスミドを選択した:
RNAi#1（強い抑制）、5'-GGCAAACACTGTGAAGTGC-3';
RNAi#2（穏やかな抑制）、5'-CGGCTGAGCCAAGAGTTGG-3'。
siRNAのための対応するDISC1配列の合成用の小さいオリゴヌクレオチドはDharmacon RNA Technologiesから得た。
RNAi#1（強い抑制）、5'-GGCAAACACTGTGAAGTGC-3';
RNAi#2（穏やかな抑制）、5'-CGGCTGAGCCAAGAGTTGG-3'。
siRNAのための対応するDISC1配列の合成用の小さいオリゴヌクレオチドはDharmacon RNA Technologiesから得た。
細胞培養、染色および神経突起伸長アッセイ
PC12細胞を、10% 胎児ウシ血清 (FBS)および5% ウマ血清 (HS)を含むダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)）中で維持した。分化は、50 ng/mlの神経成長因子(NGF)の添加、そして1% FBSおよび1 % HSを含むDMEMに培地を変えることによって開始させた。NGFは分化後毎日追加した。COS-7およびHeLa細胞を10% FBS を含むDMEMで維持した。発現コンストラクトまたはRNAiコンストラクトによるトランスフェクションはPC12細胞およびCOS-7細胞については、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)、HeLa細胞についてはPolyfect Transfection Reagent (Qiagen)を用いて行った。細胞染色は以前に記載されているようにして行った(Sawa et al.、1999)。簡単に説明すると、細胞をPBS中3.7% パラホルムアルデヒドで固定し、0.1% Triton X-100で透過処理した。いつらかの染色については、-20℃の氷冷メタノールを固定液として用いた。
PC12細胞を、10% 胎児ウシ血清 (FBS)および5% ウマ血清 (HS)を含むダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)）中で維持した。分化は、50 ng/mlの神経成長因子(NGF)の添加、そして1% FBSおよび1 % HSを含むDMEMに培地を変えることによって開始させた。NGFは分化後毎日追加した。COS-7およびHeLa細胞を10% FBS を含むDMEMで維持した。発現コンストラクトまたはRNAiコンストラクトによるトランスフェクションはPC12細胞およびCOS-7細胞については、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)、HeLa細胞についてはPolyfect Transfection Reagent (Qiagen)を用いて行った。細胞染色は以前に記載されているようにして行った(Sawa et al.、1999)。簡単に説明すると、細胞をPBS中3.7% パラホルムアルデヒドで固定し、0.1% Triton X-100で透過処理した。いつらかの染色については、-20℃の氷冷メタノールを固定液として用いた。
神経突起伸長アッセイは以前に記載されているようにして行った(Ozeki et al.、2003) 。簡単に説明すると、神経突起伸長は、３つの細胞体の直径より長い突起を有する細胞のパーセンテージによって評価した。各神経突起担持細胞の最も長い突起の長さを測定した。本研究において、本発明者はわずかに改変を加えた:細胞形態のより鮮明な画像を得るために、様々な発現またはRNAiコンストラクトとGFPコンストラクトで共トランスフェクションした細胞を抗-GFP抗体で染色した。共焦点顕微鏡 (Zeiss LSM 410)を表面蛍光（epifluorescent）画像取得のために用いた。電荷結合素子(CCD)カメラ(Roper Scientific CoolSnap HQ cooled 12 bit、Roper Scientific、Trenton、NJ)を備えたZeiss Axiovert 135 顕微鏡を用いて神経突起伸長アッセイにおけるPC12細胞画像を得た。細胞形態は、略式（blinded manner）で分析した。統計分析は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用いて行った。
生化学
細胞抽出: 細胞は、氷冷溶解バッファー (0.32 M スクロース、50 mM HEPES、pH 7.4、5 mM MgCl2、5 mM 1，4-ジチオトレイトール (DTT)、1 mM フェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)、1 mM EDTA、1% Triton X-100、およびプロテアーゼ阻害剤混合物 (Roche))中でホモゲナイズまたは可溶化した。
細胞抽出: 細胞は、氷冷溶解バッファー (0.32 M スクロース、50 mM HEPES、pH 7.4、5 mM MgCl2、5 mM 1，4-ジチオトレイトール (DTT)、1 mM フェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)、1 mM EDTA、1% Triton X-100、およびプロテアーゼ阻害剤混合物 (Roche))中でホモゲナイズまたは可溶化した。
免疫沈降: 細胞はRIPAバッファー(50 mM HEPES、pH 7.4、150 mM NaCl、5 mM MgCl2、5 mM DTT、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton X-100、プロテアーゼ阻害剤混合物)中で溶解し、10,000 x g で15分の遠心分離後に得た上清画分を一次抗体およびタンパク質Aアガロース(Oncogene)とともにインキュベートした。免疫沈降物をSDS-PAGE、次いでウェスタンブロッティングで分析した。ProFoundTM Mammalian HA-Tag IP/Co-IP Kit およびProFoundTM Mammalian Co-Immunoprecipitation Kit (PIERCE)も免疫沈降に用いた。
インビトロ結合アッセイ: GSTおよびHis-タグ付加した組換えDISC1タンパク質断片(アミノ酸350-600)を50 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、および0.1 mg/ml ウシ血清アルブミン (BSA)中で1時間インキュベートした。GST-タグ付加したDISC1に結合したHis-タグ付加したDISC1をグルタチオンセファロースビーズによって沈降した。タンパク質沈殿をSDS-PAGE、次いでHis-タグに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングで分析した。
細胞成分分画は以前に記載されているようにして行った(Sawa et al.、1997).
グリセロール密度勾配遠心分離および中心体単離
HA-タグ付加したwtDISC1および／またはmyc-タグ付加したmutDISC1を含む細胞をバッファー (20 mM HEPES、pH 7.4、1% Triton X-100、1 mM EDTA、150 mM NaCl、1 mM DTT、およびプロテアーゼ阻害剤混合物)中で溶解し、3,000×gで10分間遠心分離した。上清画分を4 mlの10-25% 連続グリセロール勾配の上にローディングし、20,000 x gで24時間遠心分離した。各画分を抗-HAまたはmyc 抗体によるウェスタンブロッティングによって分析した。中心体単離は以前に記載されているようにして行った(Mohammed and Michel、1998)。
HA-タグ付加したwtDISC1および／またはmyc-タグ付加したmutDISC1を含む細胞をバッファー (20 mM HEPES、pH 7.4、1% Triton X-100、1 mM EDTA、150 mM NaCl、1 mM DTT、およびプロテアーゼ阻害剤混合物)中で溶解し、3,000×gで10分間遠心分離した。上清画分を4 mlの10-25% 連続グリセロール勾配の上にローディングし、20,000 x gで24時間遠心分離した。各画分を抗-HAまたはmyc 抗体によるウェスタンブロッティングによって分析した。中心体単離は以前に記載されているようにして行った(Mohammed and Michel、1998)。
統計分析は一元配置分散分析、次いで事後試験（post hot test)を用いて行った。
実施例１
DISC1タンパク質の細胞分布:mut DISC1タンパク質の存在下でのwtDISC1タンパク質の再分布およびmutDISC1のドミナントネガティブ機能
mutDISC1の効果を調べるために、wtおよびmutDISC1を別々にまたは共にCOS-7細胞で発現させた。wtDISC1は核周囲の領域において選択的にみられたのに対し、mutDISC1はより広く細胞質に分散して分布しており、本発明者および他者によって以前に示されたとおりであった(Morris et al.、2003; Ozeki et al.、2003)。wtDISC1の細胞内分布の有意な変化はmutDISC1との共発現の際に観察された:wtDISC1は細胞質により分散して分布するようになった(図1A)。一方、mutDISC1の分布はwtDISC1との共発現後も変化しなかった。この結果はmutDISC1がwtDISC1の正常な細胞内局在を乱すことを示唆する;即ち、それはwtDISC1の正常かつ重要な機能に干渉する。この観察は、グリセロール勾配方法(図1B)および細胞成分分画(データ示さず)によって確認された。
DISC1タンパク質の細胞分布:mut DISC1タンパク質の存在下でのwtDISC1タンパク質の再分布およびmutDISC1のドミナントネガティブ機能
mutDISC1の効果を調べるために、wtおよびmutDISC1を別々にまたは共にCOS-7細胞で発現させた。wtDISC1は核周囲の領域において選択的にみられたのに対し、mutDISC1はより広く細胞質に分散して分布しており、本発明者および他者によって以前に示されたとおりであった(Morris et al.、2003; Ozeki et al.、2003)。wtDISC1の細胞内分布の有意な変化はmutDISC1との共発現の際に観察された:wtDISC1は細胞質により分散して分布するようになった(図1A)。一方、mutDISC1の分布はwtDISC1との共発現後も変化しなかった。この結果はmutDISC1がwtDISC1の正常な細胞内局在を乱すことを示唆する;即ち、それはwtDISC1の正常かつ重要な機能に干渉する。この観察は、グリセロール勾配方法(図1B)および細胞成分分画(データ示さず)によって確認された。
DISC1は分子の中央部分にコイルドコイルドメインを含み、そのほとんどはmutDISC1にて保持されている。したがって、本発明者は、DISC1の自己会合がmutDISC1の細胞効果の原因であるという仮説を立てた。この仮説を試験するために、mycまたはHA-タグをつけたwtおよびmutDISC1タンパク質をHEK293細胞で発現させ、抗-myc 抗体による免疫沈降物を分析した。結果は実際にDISC1が自己会合しており、mutDISC1はwtDISC1に結合できることを示すものであった(図2A)。一連のDISC1欠失突然変異体により、よく保存されたコイルドコイルドメインを有する、アミノ酸403-536がDISC1自己会合に必須であることが明らかとなった(図2B)。分化したPC12細胞における外来性 mutDISC1は内在性DISC1と共免疫沈降された(追加的図2)。精製グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)- タグ付加およびHis-タグ付加したDISC1タンパク質を用いたインビトロ結合実験により確認したところ、自己会合はその直接的タンパク質相互作用の結果であった(図2C)。
これらの結果は、mutDISC1はwtDISC1と会合することによりドミナントネガティブに作用することを示唆する。
実施例２
「神経突起伸長アッセイ」を用いることによるDISC1の機能変化の確認
本発明者はすでにPC12細胞における突然変異体DISC1の一過性過剰発現により神経突起伸長が低下することを報告している。本発明において、本発明者はPC12細胞における内在性DISC1タンパク質の発現レベルの調節のために、RNA干渉(RNAi)技術を導入したところ、その発現を低下させることに成功した。DISC1の様々な部分に対する低分子ヘアピン（short hairpin）RNA(shRNA)をコードするプラスミドを試験し、２つの代表的なプラスミドを以下の機能研究のために選択した:強力なサプレッサー(RNAi#1)および軽度のサプレッサー(RNAi#2)。それらの能力をまずラットDISC1の発現コンストラクトと内在性ヒトDISC1には干渉しないDISC1 RNAi プラスミドを共トランスフェクションしたHeLa細胞におけるウェスタンブロッティングによって試験した。RNAi#1およびRNAi#2はそれぞれ関連のない配列を含む一連のコントロール RNAi プラスミドと比較してラットDISC1に対して90および40%の抑制を示した(図3A)。RNAi#1による内在性DISC1の顕著な抑制が分化したPC12細胞において、免疫蛍光細胞染色(図3B)およびウェスタンブロッティング(データ示さず)によって確認された。RNAi#1および#2に対応するDISC1配列を有する低分子干渉RNA (siRNA)の合成オリゴヌクレオチドによっても類似の結果が得られた(データ示さず)。本発明者は強力なサプレッサー、RNAi#1による、分化中のPC12細胞における劇的な神経突起伸長の阻害を観察した(図3C、D)。神経突起伸長の阻害は細胞死と関連しておらず、アポトーシスの核の徴候はRNAi細胞では観察されなかった(データ示さず)。RNAiの効果はDISC1抑制のレベルと相関しており、RNAi#1はRNAi#2より顕著な神経突起伸長の阻害を示した。wtDISC1の発現コンストラクトの共-トランスフェクションはRNAi#1による神経突起伸長の阻害を正常化したことから、DISC1 RNAiの効果はDISC1の直接の抑制に起因するようである(図2D)。DISC1の抑制またはmutDISC1の過剰発現はともに神経突起伸長を阻害し、これはmutDISC1機能がドミナントネガティブであるという考えと一致する(図2D)。
「神経突起伸長アッセイ」を用いることによるDISC1の機能変化の確認
本発明者はすでにPC12細胞における突然変異体DISC1の一過性過剰発現により神経突起伸長が低下することを報告している。本発明において、本発明者はPC12細胞における内在性DISC1タンパク質の発現レベルの調節のために、RNA干渉(RNAi)技術を導入したところ、その発現を低下させることに成功した。DISC1の様々な部分に対する低分子ヘアピン（short hairpin）RNA(shRNA)をコードするプラスミドを試験し、２つの代表的なプラスミドを以下の機能研究のために選択した:強力なサプレッサー(RNAi#1)および軽度のサプレッサー(RNAi#2)。それらの能力をまずラットDISC1の発現コンストラクトと内在性ヒトDISC1には干渉しないDISC1 RNAi プラスミドを共トランスフェクションしたHeLa細胞におけるウェスタンブロッティングによって試験した。RNAi#1およびRNAi#2はそれぞれ関連のない配列を含む一連のコントロール RNAi プラスミドと比較してラットDISC1に対して90および40%の抑制を示した(図3A)。RNAi#1による内在性DISC1の顕著な抑制が分化したPC12細胞において、免疫蛍光細胞染色(図3B)およびウェスタンブロッティング(データ示さず)によって確認された。RNAi#1および#2に対応するDISC1配列を有する低分子干渉RNA (siRNA)の合成オリゴヌクレオチドによっても類似の結果が得られた(データ示さず)。本発明者は強力なサプレッサー、RNAi#1による、分化中のPC12細胞における劇的な神経突起伸長の阻害を観察した(図3C、D)。神経突起伸長の阻害は細胞死と関連しておらず、アポトーシスの核の徴候はRNAi細胞では観察されなかった(データ示さず)。RNAiの効果はDISC1抑制のレベルと相関しており、RNAi#1はRNAi#2より顕著な神経突起伸長の阻害を示した。wtDISC1の発現コンストラクトの共-トランスフェクションはRNAi#1による神経突起伸長の阻害を正常化したことから、DISC1 RNAiの効果はDISC1の直接の抑制に起因するようである(図2D)。DISC1の抑制またはmutDISC1の過剰発現はともに神経突起伸長を阻害し、これはmutDISC1機能がドミナントネガティブであるという考えと一致する(図2D)。
実施例３
核に豊富であるDISC1の形態は統合失調症の脳において変化した細胞内分布を有する
材料および方法
脳：正常コントロールおよび統合失調症、双極性障害(BP)、および大うつ病(MD)患者かのヒト死後眼窩皮質をthe Stanley Foundation Brain Collectionから得た。各群は15の対象であった。元のセットの対象の詳細情報は以前に記載されている(Torrey et al 2000)。
核に豊富であるDISC1の形態は統合失調症の脳において変化した細胞内分布を有する
材料および方法
脳：正常コントロールおよび統合失調症、双極性障害(BP)、および大うつ病(MD)患者かのヒト死後眼窩皮質をthe Stanley Foundation Brain Collectionから得た。各群は15の対象であった。元のセットの対象の詳細情報は以前に記載されている(Torrey et al 2000)。
化学物質：特に断りのない限りすべての試薬はSigma (St. Louis、MO)から購入した。タンパク質濃度はビシンコニン酸タンパク質アッセイキット(Pierce、Rockford、IL)を用いて測定した。
抗体：免疫精製した抗-DISC1抗体の調製については以前に記載されている(Ozeki et al 2003)。簡単に説明すると、抗体はグルタチオン S-トランスフェラーゼにタグ付加したDISC1 (601-854 (C2))の部分に対するものであった。本研究に用いた抗体の希釈度は以下の通りであった: DISC1-C2、1: 250; ヒストンH1 (Santa Cruz biotechnology、Santa Cruz、CA)、1: 100; ポリ-ADPポリメラーゼ(PARP) (BD Biosciences Pharmingen、San Diego、CA)、1:250; PSD95 (Zymed Laboratories、South San Francisco、CA)、1:500;γ-チューブリン (Sigma、St、Louis、MO)、1: 10,000; α-チューブリン (Sigma、St、Louis、MO)、1:4,000; チトクロームcオキシダーゼ (Molecular Probes、Eugene、OR)、1: 50;およびグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(Sawa et al 1997)、1: 2,000。
質量分析：HeLa細胞を、プロテアーゼ阻害剤(CompleteTM) (Roche Applied Sciences、Indianapolis、IN)、混合物を含有するRIPAバッファー(150 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、pH 7.5、1% Nonidet P-40、0.1% SDS、および0.5% デオキシコール酸ナトリウム)に溶解した。可溶化したタンパク質を以前に記載(Sudoh et al 1998)されているようにして抗-DISC1-C2 抗体 (11)を用いる免疫沈降に供し、沈降したタンパク質をSDS-PAGEにかけた。75-85 kDaにおけるDISC1のメジャーバンドをクーマシー染色によって可視化した。75-85 kDaにおけるゲルで精製したDISC1をトリプシン消化し、Johns Hopkins University School of Medicine の質量分析設備におけるMALDI-TOF 質量分析(Voyger DE STR、Applied Biosystems)によって分析した。ペプチド質量をプログラム、Peptide Mass (http://au.expasy.org/tools/ Peptide Mass.html)および、MS-Digest (http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msdigest.htm)を用いて分析した。
細胞成分分画：解剖したヒト脳およびHeLa細胞について細胞成分分画の古典的方法を用いた(Sawamura et al 2001、Gu et al 2001)。簡単に説明すると、0.1 gの組織または細胞を電動式テフロンホモゲナイザーを用いて氷冷バッファー(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、プロテアーゼ阻害剤(CompleteTM））中でホモゲナイズした。等量のタンパク質を含有するホモジネートを800 x g で10分間４℃で遠心分離して、粗核ペレット(P)および核沈殿後の(postnuclear)上清(S)を得た。
核画分のさらなる分析のために、本発明者は標準的プロトコール(Andrews et al 1991、Hua et al 1996)をわずかに改変して用いて、転写因子を豊富化した。HeLaおよびSH-SY5Y細胞からの細胞ホモジネートをバッファーA(10 mM HEPES、pH 7.9、1.5 mM MgCl2、10 mM KCl、1 mM DTT、およびプロテアーゼ阻害剤 (CompleteTM)）中で溶解し、2,300 x gで2分間4℃で遠心分離した。ペレットを0.1% Nonidet-Pを含有するバッファーAに再懸濁し、1,500 x gで遠心分離し、細胞質の上清を収集した。ペレットをバッファー C (20 mM HEPES、25%グリセロール、420 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、1 mM DTT、およびプロテアーゼ阻害剤(CompleteTM)）に再懸濁し、16,000 x gで15分間4℃で遠心分離した。最後の上清は転写因子が豊富になった核画分であると考えられる(Andrews et al 1991、Hua et al 1996)。
ウェスタンブロッティング：以前に記載された標準的プロトコール (Sawamura et al 2004)をわずかに改変して用いた。タンパク質は Novex トリス-グリシン・ゲル(Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いて分離し、ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)メンブレン(Millipore、Bedford、MA)にトランスファーした。非特異的結合を0.1% Tween 20を含有するリン酸緩衝食塩水中の5%脱脂粉乳でブロッキングした。ブロットを次いで一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。モノクローナルとポリクローナル抗体の両方の検出のために、適当なペルオキシダーゼ結合二次抗体と増強化学発光(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)とを用いてフィルムに記録した画像を得た。
統計分析：統計分析は Stat View コンピュータソフトウェア(Macintosh、version 5.0; Abacus Concepts Inc.、Berkeley、CA)を用いて行った。一元配置分散分析(one-fatcor-ANOVA)を群間の最初の評価に用いた。有意差が得られると、Bonferroni-Dunn試験との事後比較を用いて特定の群差を同定した。
人口統計およびStanley Foundation からの脳からのその他の変動のDISC1への影響を連続型変数についてはピアソン相関係数によって、カテゴリ変数については両側スチューデントｔ検定または1元配置分散分析によって調べた。Tukey-Kramer 検定と両側スチューデントｔ検定との事後比較を用いて特定の群間の差を調べた。確率値(p値)0.05未満を統計的有意差有りとした。すべての値は平均及び標準偏差(SD)として記載した。
結果
3.1 ヒトの解剖脳におけるDISC1タンパク質
ヒトの解剖脳におけるDISC1のタンパク質発現をウェスタンブロッティングによって分析し、HeLaおよびSH-SY5Y細胞のヒト細胞株における発現と比較した(図4a)。DISC1はヒト脳において95-100 kDaと70-85 kDaの２つの分かれたバンドにて発現しており、これは本発明者らが以前に報告したげっ歯類の脳におけるプロファイルと似ている(Miyoshi et al 2003、Ozeki et al 2003、Brandon et al 2004)。げっ歯類の脳と同様に、70-85 kDaのシグナルは95-100 kDaよりもかなり強かった。95-100 kDaのシグナルはDISC1に対する複数の抗体によって検出されたことから、DISC1オープンリーディングフレームから推定される854または832アミノ酸の予測タンパク質サイズを有する真正の全長DISC1を表すと考えられる(Miyoshi et al 2003、Ozeki et al 2003、James 2004)。一方、70-85 kDa シグナルの分子は未だ同定されていない。
3.1 ヒトの解剖脳におけるDISC1タンパク質
ヒトの解剖脳におけるDISC1のタンパク質発現をウェスタンブロッティングによって分析し、HeLaおよびSH-SY5Y細胞のヒト細胞株における発現と比較した(図4a)。DISC1はヒト脳において95-100 kDaと70-85 kDaの２つの分かれたバンドにて発現しており、これは本発明者らが以前に報告したげっ歯類の脳におけるプロファイルと似ている(Miyoshi et al 2003、Ozeki et al 2003、Brandon et al 2004)。げっ歯類の脳と同様に、70-85 kDaのシグナルは95-100 kDaよりもかなり強かった。95-100 kDaのシグナルはDISC1に対する複数の抗体によって検出されたことから、DISC1オープンリーディングフレームから推定される854または832アミノ酸の予測タンパク質サイズを有する真正の全長DISC1を表すと考えられる(Miyoshi et al 2003、Ozeki et al 2003、James 2004)。一方、70-85 kDa シグナルの分子は未だ同定されていない。
70-85 kDaからのシグナルはさらに３つのカテゴリーに分けられた(図4a、5)。75-85 kDaの中央のメジャーバンドはヒト脳、HeLa、およびSH-SY5Y細胞にみられる。上方のシグナルはHeLa細胞において観察され、下方のマイナーシグナルはHeLa細胞とヒト脳においてみられた。本研究において、本発明者は75-85 kDaのメジャーシグナルの分析に焦点を絞った。75-85 kDaのシグナルを直接特徴づけるために、本発明者はHeLa細胞抽出物を用いて免疫沈降と質量分析を組み合わせたタンパク質化学を行った。抗-DISC1抗体によるHeLa細胞の免疫沈降はクーマシー染色によって検出可能なレベルまで75-85 kDa シグナルの豊富化を導いた(データ示さず)。豊富化されたタンパク質をSDS-PAGEで分析し、ゲルから切り出し、トリプシンで消化した。得られた断片を質量分析によって分析した。本発明者は質量分析プロファイルからDISC1配列由来の５つの別々の断片を見いだした(図4b)。免疫沈降のために免疫前血清を用いた場合DISC1に対応するシグナルは得られなかった(データ示さず)。
3.2 DISC1のある形態の核における豊富化
以前の報告により、DISC1は複数の細胞内プールを有することが示唆されている(Miyoshi et al 2003、Ozeki et al 2003、Morris et al 2003、James et al 2004)。DISC1はオープンリーディングフレームにおいて進化の過程でよく保存された核局在化シグナルを含み(Ma et al 2002)、核におけるその潜在的役割が示唆される。したがって、本発明者は細胞成分分画を行い、その可能性のある核プールに特に注目した。
以前の報告により、DISC1は複数の細胞内プールを有することが示唆されている(Miyoshi et al 2003、Ozeki et al 2003、Morris et al 2003、James et al 2004)。DISC1はオープンリーディングフレームにおいて進化の過程でよく保存された核局在化シグナルを含み(Ma et al 2002)、核におけるその潜在的役割が示唆される。したがって、本発明者は細胞成分分画を行い、その可能性のある核プールに特に注目した。
細胞成分分画の古典的方法(Sawamura et al 2001、Gu et al 2001)を最初の評価に用いた。ヒトの解剖脳において、95-100 kDaのDISC1 シグナルはもっぱら核沈殿後の上清(S)において豊富であったが、75-85 kDaのシグナルは粗核ペレット(P)とS画分の両方にみられた(図5a)。75-85 kDaのDISC1はPとS画分との両方にある。本発明者はさらに様々なオルガネラマーカーによって、ヒトの解剖脳からのSおよびP画分を特徴づけた(図6)。細胞質、ミトコンドリア、およびシナプス後密度についてのマーカーはほとんどもっぱらS画分にみられる。一方、ヒストンH1はもっぱらP画分において豊富である。γ-チューブリンはSおよびP画分からほぼ等量回収された。結論として、P画分は豊富化された核画分であり、いくらか中心体の汚染物を含んでいる。これらの結果は75-85 kDaにおけるDISC1のある（複数の）形態は核に存在していることを示唆する。
核DISC1に関するさらなる情報を得るために、本発明者は核内転写因子の豊富化の確立したプロトコールを用いた(Andrews et al 1991、Hua et al 1996)。HeLaおよびSH-SY5Y細胞において、75-85 kDaのDISC1のある形態の実質的な豊富化が核画分において観察された(図5b)。
3.3 主要な精神障害患者からの脳におけるDISC1の異常な細胞内分布
ヒト脳、特に精神病患者の脳からのDISC1の性質を分析するため、本発明者はStanley Foundation Brtain Collection (Torrey et al 2000)からのよく特徴づけられた脳のセットを用いた。該脳のセットは15名の正常対象、15名のSZ患者、15名の双極性障害(BP)患者、および15名の大うつ病(MD)患者からの４群の脳を含むものであった。
ヒト脳、特に精神病患者の脳からのDISC1の性質を分析するため、本発明者はStanley Foundation Brtain Collection (Torrey et al 2000)からのよく特徴づけられた脳のセットを用いた。該脳のセットは15名の正常対象、15名のSZ患者、15名の双極性障害(BP)患者、および15名の大うつ病(MD)患者からの４群の脳を含むものであった。
まず最初に、本発明者は全脳ホモジネートにおけるDISC1タンパク質レベルを調べた。４つの群間で95-100 kDaシグナルおよび75-85 kDa シグナルのいずれにおいてもDISC1タンパク質の総レベルの有意差は観察されなかった(それぞれ、p=0.5093および0.2409、1元配置分散分析) (図7)。
次に本発明者はこれら脳におけるDISC1の細胞内分布に注目した。粗核におけるDISC1の画分を半定量的に評価するために、本発明者は75-85 kDaのDISC1のS画分由来に対するP画分由来のシグナル比(P:S比)を先に特徴づけた細胞成分分画において調べた(図5aおよび図6)。興味深いことに、P:S比における有意差が４つの群間で観察された(p=0.0398、1元配置分散分析)。Bonferoni-Dunn試験を用いることによる事後比較により、SZおよびMD群におけるP:S比がコントロール群と比較して有意に高いことが明らかになった(それぞれ、p=0.018および0.009) (図8)。
死後遅延、脳pH、および凍結した脳の貯蔵時間の効果が無いことによって証明されるように、解剖脳を得るための工程によってP:S比が影響されないようである(図9)。サンプル収集時の年齢、神経遮断薬の生涯の用量および脳の相対質量も比に影響はない(図9)。
3.4 解剖脳におけるDISC1の細胞内分布に対する物質乱用の影響
さらに、DISC1のこのP:S比は物質乱用の経歴と有意に関連している(p=0.0005) (表1)。SZおよびMD群における比の上昇が物質乱用の経歴によって影響を受けるかを調べるために、４群すべてについてTukey事後試験を行った。SZにおける比の上昇は、この物質乱用と関連していないが、BPにおける比の上昇は物質乱用と関係している(p<0.05)。
さらに、DISC1のこのP:S比は物質乱用の経歴と有意に関連している(p=0.0005) (表1)。SZおよびMD群における比の上昇が物質乱用の経歴によって影響を受けるかを調べるために、４群すべてについてTukey事後試験を行った。SZにおける比の上昇は、この物質乱用と関連していないが、BPにおける比の上昇は物質乱用と関係している(p<0.05)。
P:S比はまた、物質乱用の重症度とも有意に関連している(p=0.002) (表1)。物質乱用の重症度のP:S比に対する影響力を対応のないｔ検定で試験した。SZにおいては比に対する重症度の影響はないが、MDにおいては有意に影響がある(p=0.433)。
実施例４
双極性障害におけるDISC1の異なる発現:性別の効果の証拠
対象
本研究の研究対象は、大規模に行われているBPの連鎖研究(McInnis et al 2003)から得た。簡単に説明すると、これらの多様な系統(Hopkins/Dana 系統)を、2名の疾患である一等親血縁者を伴う治療されたBPI発端者の存在、疾患段階、例えば、BPI、BPII、再発性大うつ病、および分裂情動性障害、躁病型について確認した。最近のこれら系統のゲノム全体のスキャンにより、1q41に感受性座位が同定され、ピークマーカー、D1S549 は12 Mb DISC1遺伝子からセントロメア側であったが、重要な領域は広く、DISC1遺伝子を含んでいた。同様に、Macgregor et al (Macgregor et al 2004)によって同定された1q42ピークもDISC1からセントロメア側であった。
双極性障害におけるDISC1の異なる発現:性別の効果の証拠
対象
本研究の研究対象は、大規模に行われているBPの連鎖研究(McInnis et al 2003)から得た。簡単に説明すると、これらの多様な系統(Hopkins/Dana 系統)を、2名の疾患である一等親血縁者を伴う治療されたBPI発端者の存在、疾患段階、例えば、BPI、BPII、再発性大うつ病、および分裂情動性障害、躁病型について確認した。最近のこれら系統のゲノム全体のスキャンにより、1q41に感受性座位が同定され、ピークマーカー、D1S549 は12 Mb DISC1遺伝子からセントロメア側であったが、重要な領域は広く、DISC1遺伝子を含んでいた。同様に、Macgregor et al (Macgregor et al 2004)によって同定された1q42ピークもDISC1からセントロメア側であった。
より大きい集団から、57のBP系統が遺伝子型同定のために選択された。この選択は、両親のいずれかが存在している系統、または疾患でない兄弟と2名の疾患である兄弟を含む系統を含むように行った[疾患状態はBPI、BPII、SABPおよびRUPに基づいて決定した]。それゆえ、各家族から同定された5名までの対象があった。全サンプルは遺伝子型同定された297名の対象からなり、表2に詳細に記載する。
直接配列決定
10名の双極性の対象からのDNAを選択してDISC1遺伝子における多型を同定した。彼らはGENEHUNTERからの結果に基づき染色体1q42に対する連鎖の強い証拠を示す系統から選択した。50 bpのイントロンが隣接するDISC1の各コードエキソンを表3Aに記載のプライマーを用いて増幅した。エキソン2は１回のPCR反応では増幅できないほど大きく、引き続いて3回の反応にて配列決定した。ほとんどのPCR条件は以下の通り: 80 ngのゲノムDNA、0.4 μMの各プライマー、400μM dNTPs、1.5 mM MgCl2、1ユニットのTaqDNAポリメラーゼ(invitrogen)、2.5μlのPCR バッファー(200 mM Tris-HCl、500 mM KCl)および25μlの滅菌水。最初の変性工程94℃7分、次いで40サイクルの94℃45秒、55℃30秒および72℃30秒。増幅についての詳細情報は所望により提供する。その結果得られたPCR産物をスピンカラム(QIAGEN)で精製し、BigDye Terminatorサイクルシークエンシングキット(Applied Biosystems)を使用して行った。精製産物をABI PRISM 370 DNAシークエンサー(Applied Biosystems)で配列決定した。配列をSequencher (Gene Codes Corporation)を用いてアラインさせた。
10名の双極性の対象からのDNAを選択してDISC1遺伝子における多型を同定した。彼らはGENEHUNTERからの結果に基づき染色体1q42に対する連鎖の強い証拠を示す系統から選択した。50 bpのイントロンが隣接するDISC1の各コードエキソンを表3Aに記載のプライマーを用いて増幅した。エキソン2は１回のPCR反応では増幅できないほど大きく、引き続いて3回の反応にて配列決定した。ほとんどのPCR条件は以下の通り: 80 ngのゲノムDNA、0.4 μMの各プライマー、400μM dNTPs、1.5 mM MgCl2、1ユニットのTaqDNAポリメラーゼ(invitrogen)、2.5μlのPCR バッファー(200 mM Tris-HCl、500 mM KCl)および25μlの滅菌水。最初の変性工程94℃7分、次いで40サイクルの94℃45秒、55℃30秒および72℃30秒。増幅についての詳細情報は所望により提供する。その結果得られたPCR産物をスピンカラム(QIAGEN)で精製し、BigDye Terminatorサイクルシークエンシングキット(Applied Biosystems)を使用して行った。精製産物をABI PRISM 370 DNAシークエンサー(Applied Biosystems)で配列決定した。配列をSequencher (Gene Codes Corporation)を用いてアラインさせた。
遺伝子型同定
すべてのサンプルを5' エキソヌクレアーゼアッセイ(TaqMan)およびABI 7900HT 配列検出システム(Applied Biosystems)を用いて遺伝子型同定した。6つの一塩基多型(SNPs)(rs1538975、rs1954175、rs1407598、rs1000731、rs821653、rs3524)について、本発明者はAssays-on-Demandキットを用い、残りの6つのSNPsについて本発明者は特別のAssays-by-Designキットを注文した。このアッセイにおけるプライマーとプローブの配列情報を表3Bに記載する。アッセイ(25μl)を約10 ngのゲノムDNAについて製造業者の指示に従って行った。PCR反応は GeneAmp PCR system 9700で行い、蛍光シグナルはABI 7900HTで検出した。
すべてのサンプルを5' エキソヌクレアーゼアッセイ(TaqMan)およびABI 7900HT 配列検出システム(Applied Biosystems)を用いて遺伝子型同定した。6つの一塩基多型(SNPs)(rs1538975、rs1954175、rs1407598、rs1000731、rs821653、rs3524)について、本発明者はAssays-on-Demandキットを用い、残りの6つのSNPsについて本発明者は特別のAssays-by-Designキットを注文した。このアッセイにおけるプライマーとプローブの配列情報を表3Bに記載する。アッセイ(25μl)を約10 ngのゲノムDNAについて製造業者の指示に従って行った。PCR反応は GeneAmp PCR system 9700で行い、蛍光シグナルはABI 7900HTで検出した。
遺伝分析および統計
マーカー間(Inter-marker)LDおよびハプロタイプブロック構造をプログラムHaploviewを用いて調べた。関連試験を次いでコンピュータプログラム FBAT (Family Based Assosiation Test) (Horvath et al 2001)を用いて行った。FBATを選んだのは、それが様々な構造の家族から複数の疾患を有する兄弟を用いた場合であっても連鎖の存在下での関連の有効な試験を提供するからである。個々のマーカーについての関連の試験を行うだけでなく、FBAT により不明瞭相のハプロタイプの関連の試験も可能となる。
マーカー間(Inter-marker)LDおよびハプロタイプブロック構造をプログラムHaploviewを用いて調べた。関連試験を次いでコンピュータプログラム FBAT (Family Based Assosiation Test) (Horvath et al 2001)を用いて行った。FBATを選んだのは、それが様々な構造の家族から複数の疾患を有する兄弟を用いた場合であっても連鎖の存在下での関連の有効な試験を提供するからである。個々のマーカーについての関連の試験を行うだけでなく、FBAT により不明瞭相のハプロタイプの関連の試験も可能となる。
発現分析
患者からのリンパ芽球をエプスタインバーウイルス(Sawa et al 1999)の感染により確立した。細胞を10 % 胎児ウシ血清を含有するRPMI1640培地で維持し、2週間以内に発現分析に使用した(細胞分裂の4周期)。
患者からのリンパ芽球をエプスタインバーウイルス(Sawa et al 1999)の感染により確立した。細胞を10 % 胎児ウシ血清を含有するRPMI1640培地で維持し、2週間以内に発現分析に使用した(細胞分裂の4周期)。
DISC1の発現をまず２セットのプライマーによるRT-PCRにより確認した。ゲノムDNAからの増幅の汚染を避けるため、各ペアは２つの別々のエキソンから選択した(Sawa et al 1997)。プライマー配列を表3Cに記載する。
リンパ芽球におけるDISC1の発現レベルをRNAカウンターキット(TrimGen、Sparks、MD)によって測定した。このキットは等尺性プライマー伸長技術を用いる。エキソン6と7との両方を含むDISC1の部分(NCBI AF22980においてヌクレオチド1627-1647)をトータルRNAから増幅した。２つの異なるエキソンをわたる増幅によりゲノムDNAからの汚染シグナルが避けられる。増幅領域は、これが遺伝的変異性またはSNPを含まないために選択した。アクチンを発現の内部標準として用いた。
ウェスタンブロッティングを以前に記載されているようにして行った(Ozeki et al 2003)。DISC1の異なる部分に対する２つの抗体(一方はアミノ酸354-597、他方は598-854) を用いた(Ozeki et al 2003)。
臨床データ分析
統計ソフトウェア、STATAを用いて、疾患の対象の臨床的特徴とDISC1発現データを分析した。広い疾患状態モデル(BPI、BPII、再発性大うつ病、および分裂情動性障害躁病型を含む)を用いて疾患を定義した。直線回帰を用いて疾患の対象の様々な臨床的特徴に対する従属変数としてDISC1発現レベルをモデリングした。
統計ソフトウェア、STATAを用いて、疾患の対象の臨床的特徴とDISC1発現データを分析した。広い疾患状態モデル(BPI、BPII、再発性大うつ病、および分裂情動性障害躁病型を含む)を用いて疾患を定義した。直線回帰を用いて疾患の対象の様々な臨床的特徴に対する従属変数としてDISC1発現レベルをモデリングした。
結果
4.1 家族に基づく関連研究
ほとんど連鎖の証拠を有する10名の発端者からの系統からのエキソンを配列決定したところ、１つの新規なSNPが同定された(図10A、B)。このSNPを58のBP系統のサブセットにおいてタイピングした。Haploview に装備されているGabriel et al (Gabriel et al 2002)のアルゴリズムを用いたところ、およそ200 kbにわたって広がっているこの遺伝子における3つのハプロタイプブロックがあった。個々のマーカーの分析によっては、BP 障害との有意な関連は同定されなかった。FBATおよびすべての12のマーカーを用いるハプロタイプ分析により、頻度0.11 (H1)および0.10 (H2)の２つのハプロタイプが同定された。本発明者は可能性のあるハプロタイプについて、いくつかの個々のSNPsおよび様々なSNPsの組み合わせを試験したところ、すべての12のマーカーのハプロタイプからのみ有意性を得た。H1は疾患である対象に多く伝達され（overtransmitted）(p=0.01)、H2はあまり伝達されない（undertransmitted）。疾患対象を性別によりみた場合、多く伝達されたのは疾患を有する女性であり(p=0.004)(表4)、H1が疾患を有する男性へ多く伝達されるとする証拠は無かった。
4.1 家族に基づく関連研究
ほとんど連鎖の証拠を有する10名の発端者からの系統からのエキソンを配列決定したところ、１つの新規なSNPが同定された(図10A、B)。このSNPを58のBP系統のサブセットにおいてタイピングした。Haploview に装備されているGabriel et al (Gabriel et al 2002)のアルゴリズムを用いたところ、およそ200 kbにわたって広がっているこの遺伝子における3つのハプロタイプブロックがあった。個々のマーカーの分析によっては、BP 障害との有意な関連は同定されなかった。FBATおよびすべての12のマーカーを用いるハプロタイプ分析により、頻度0.11 (H1)および0.10 (H2)の２つのハプロタイプが同定された。本発明者は可能性のあるハプロタイプについて、いくつかの個々のSNPsおよび様々なSNPsの組み合わせを試験したところ、すべての12のマーカーのハプロタイプからのみ有意性を得た。H1は疾患である対象に多く伝達され（overtransmitted）(p=0.01)、H2はあまり伝達されない（undertransmitted）。疾患対象を性別によりみた場合、多く伝達されたのは疾患を有する女性であり(p=0.004)(表4)、H1が疾患を有する男性へ多く伝達されるとする証拠は無かった。
4.2 ヒトリンパ芽球におけるDISC1発現
まず、本発明者はヒトリンパ芽球におけるDISC1の発現を調べた。DISC1 mRNAは逆転写酵素を組み合わせたPCR (RT-PCR)によって評価した。２セットのプライマー対をDISC1遺伝子のエキソン4と5およびエキソン8と9から選択した(表3C)。２つの異なるエキソンからプライマーを選択することによってゲノムDNAからの汚染シグナルを排除できる。両方の増幅において、HeLa細胞およびヒトリンパ芽球から特異的シグナルが得られ、リンパ芽球からは常に低い強度のシグナルが得られた(図11A)。DISC1タンパク質を異なるエピトープに対するよく特徴づけられた抗-DISC1抗体を用いてウェスタンブロッティングにて分析した(Ozeki et al 2003)。本発明者はおよそ70-80 kDaのメジャーシグナル、より弱い90-95 kDaのシグナルを得(図11B)、発現パターンはラットおよびヒト成人脳と類似していた(Brandon et al 2004; Miyoshi et al 2003; Ozeki et al 2003)。
まず、本発明者はヒトリンパ芽球におけるDISC1の発現を調べた。DISC1 mRNAは逆転写酵素を組み合わせたPCR (RT-PCR)によって評価した。２セットのプライマー対をDISC1遺伝子のエキソン4と5およびエキソン8と9から選択した(表3C)。２つの異なるエキソンからプライマーを選択することによってゲノムDNAからの汚染シグナルを排除できる。両方の増幅において、HeLa細胞およびヒトリンパ芽球から特異的シグナルが得られ、リンパ芽球からは常に低い強度のシグナルが得られた(図11A)。DISC1タンパク質を異なるエピトープに対するよく特徴づけられた抗-DISC1抗体を用いてウェスタンブロッティングにて分析した(Ozeki et al 2003)。本発明者はおよそ70-80 kDaのメジャーシグナル、より弱い90-95 kDaのシグナルを得(図11B)、発現パターンはラットおよびヒト成人脳と類似していた(Brandon et al 2004; Miyoshi et al 2003; Ozeki et al 2003)。
第二にリンパ芽球におけるDISC1の発現プロファイルが成人脳のものと類似していることに基づき、本発明者は、DISC1ハプロタイプとその発現レベルの関係を調べた。リスクハプロタイプ(HP1)を有する疾患対象(16ケース)からのリンパ芽球におけるDISC1の発現を多くは伝達されなかったハプロタイプ(HP2)(11コントロール)を有する疾患でない家族メンバーの発現と比較した。DISC1のレベルはHP2を有する疾患でない対象と比べてHP1を有する双極性対象における方が有意に低かった(p=0.006) (図12A)。伝達において観察されるように、一貫して性による影響が存在し、女性においてより顕著に抑制されていた(p=0.001) (図12B)。リアルタイムPCRおよびウェスタンブロッティングによるDISC1の半定量的評価によりこの観察が確認された(データ示さず)。
4.3 臨床データ分析
すべての臨床的特徴のなかで、躁病発症数がもっともDISC1発現レベルの低下とよく相関していた(相関係数、-0.41; p=0.008) (表5)。最初の躁病発症がより若年であることもまたより低いDISC1発現と相関していた。さらに、初めての入院年齢もその他の因子を同じにした場合DISC1発現と負の相関にあるようであった。その他の特徴、例えば、精神病は、その他の全ての因子を同じにした場合有意な相関を示さなかった。
すべての臨床的特徴のなかで、躁病発症数がもっともDISC1発現レベルの低下とよく相関していた(相関係数、-0.41; p=0.008) (表5)。最初の躁病発症がより若年であることもまたより低いDISC1発現と相関していた。さらに、初めての入院年齢もその他の因子を同じにした場合DISC1発現と負の相関にあるようであった。その他の特徴、例えば、精神病は、その他の全ての因子を同じにした場合有意な相関を示さなかった。
参考文献
以下の文献を引用により本出願に含める。
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Claims (19)
- 個体からの細胞におけるDISC1の分子的多様性および／または細胞内分布を確認することを含む、個体における精神障害に対する脆弱性を診断または予測する方法。
- 個体からの細胞におけるDISC1またはそのアイソフォームの細胞内分布を確認する、請求項１の方法。
- 個体からの細胞におけるDISC1またはそのアイソフォームの細胞内分布を、DISC1タンパク質に対する抗体によって確認する、請求項２の方法。
- 個体からの細胞におけるDISC1またはそのアイソフォームの細胞内分布を、該タンパク質またはそのアイソフォームの核対細胞質比によって確認する、請求項２の方法。
- DISC1の分子的多様性を、細胞におけるDISC1の発現レベルを測定することにより確認する、請求項１の方法。
- DISC1の発現レベルを、細胞におけるDISC1 mRNAレベルによって確認する、請求項５の方法。
- DISC1の発現レベルを、細胞におけるDISC1タンパク質レベルによって確認する、請求項５の方法。
- DISC1の発現レベルを、抗- DISC1抗体を用いて確認する、請求項５の方法。
- 精神障害が、統合失調症、気分障害、物質乱用および双極性障害からなる群から選択される、請求項１の方法。
- 精神障害が統合失調症または物質乱用である、請求項２の方法。
- 細胞が、線維芽細胞、嗅上皮細胞およびリンパ芽球からなる群から選択される、請求項１の方法。
- 細胞がリンパ芽球である、請求項１１の方法。
- 精神障害が双極性障害である、請求項１２の方法。
- 個体が女性である、請求項１３の方法。
- 以下に示すSNPsからなる精神障害についてのDISC1のリスクハプロタイプ:
- 精神障害が双極性障害である、請求項１５のDISC1のリスクハプロタイプ。
- 個体における請求項１５のハプロタイプの存在または非存在を判定することを含む、個体における精神障害に対する感受性を診断または予測する方法。
- 個体が女性である、請求項１７の方法。
- 精神障害が双極性障害である、請求項１７の方法。
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