【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、透析アミロイド線維重合核の製造方法及び透析アミロイド−シス治療剤のスクリーニング方法並びに透析アミロイド−シス治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミロイドーシスはアルツハイマー病、腎症、リウマチ、炎症、糖尿病、神経毒性疾患などの要因となっており、アミロイドーシスにより引き起こされる線維の形成及び沈着を抑制することによりそれに起因する症状を改善することができる。透析アミロイドーシスはβ2−ミクログロブリンの線維形成及びその沈着によって引き起こされることが知られている。アミロイド沈着における臓器病変としては、手根管症候群、破壊性脊椎関節症、骨嚢胞などの透析合併症がある。それらの病変、症状を改善するための透析アミロイドーシスを抑制する薬剤を創出するためのスクリーニング方法としてβ2−ミクログロブリンの線維伸長反応の抑制試験が試みられている。
【０００３】
β2−ミクログロブリンによる線維伸長反応では、透析アミロイドーシス患者由来のアミロイドーシス組織から抽出した重合核と、尿又は血液から精製したβ2−ミクログロブリンとを反応させることが知られている（Amyloid:Int.J.Exp.Clin.Invest.,4,223〜232,1997）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
これらの反応に用いる材料は人体の組織、尿、血液などの生体試料を用いることから、それらの入手やバイオハザードの環境整備が必要なことなどの問題点がある。
【０００５】
従来の透析アミロイド線維重合核とβ2−ミクログロブリンとの伸長反応は、重合核が透析アミロイドーシス患者組織から採取されたものである。そのため１回の反応にのみ使用され、かつその入手も困難であるという課題がある。また、β2−ミクログロブリンについても尿及び血液から精製する必要があるという不便さがある。従って、大量生産が可能であり、かつβ2−ミクログロブリン線維伸長反応に使用できるヒト組織を用いない透析アミロイド線維重合核の生産が望まれ、しかも簡便に入手できるβ2−ミクログロブリンを用いた線維伸長反応の実現が望まれる。
【０００６】
透析アミロイド線維重合核を多量に生産することにより、透析アミロイドーシス治療剤のスクリーニングに貢献することができる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、透析アミロイド線維重合核の製造方法を提供する。
【０００８】
また、本発明は透析アミロイドーシス治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は上記スクリーニング方法によって得られる透析アミロイド−シス治療剤を提供する。
【００１０】
さらにまた、本発明はグリコサミノグリカン若しくはその塩、フコイダン、硫酸基を持つジアゾ系色素化合物又はグリコサミノグリカン若しくはフコイダンの置換基として硫酸基を持つジアゾ系色素化合物が結合した高分子化合物を有効成分とする透析アミロイド−シス治療剤を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の透析アミロイド線維重合核は、透析アミロイド線維重合核とリコンビナントβ2−ミクログロブリンとを反応させてアミロイド線維を形成する。ここで得られたアミロイド線維を超音波処理することにより断片化し、得られた断片の一部をアミロイド線維重合核として用いることにより上記と同様に反応、断片化の操作を継代的に繰り返すことにより製造することができる。この継代的反復操作をＸ回(Ｘは１以上の整数を示す。)繰り返して得られたアミロイド線維重合核（Ｓｘ）は、β2−ミクログロブリンとの親和性が高まり、伸長反応の初速度が上昇した。従って、無限回数の継代的反復操作（Ｓ∞）が可能であり、それによって重合核の多量製造が実現できる。
【００１２】
出発材料となる透析アミロイド線維重合核（Ｓ０）は、ヒト組織由来のものであり、透析アミロイド−シス患者由来のアミロイド沈着組織よりＰｒａｓらの方法（J.Exp.Med.,130,777〜791,1969）で抽出して得ることができる。
【００１３】
伸長線維の構成物質であるβ2−ミクログロブリンは、ヒトの尿、血液から入手するものの代わりに、商業的に販売されている市販のリコンビナントβ2−ミクログロブリンを用いることができることも本発明の特徴である。
【００１４】
透析アミロイド線維重合核とリコンビナントβ2−ミクログロブリンとの反応によって形成されたアミロイド線維を断片化するための超音波処理は、超音波破砕機によって行うことができる。
【００１５】
超音波処理によって得られた断片を継代的伸長反応の重合核（Ｓｘ）に用いる量としては２．５〜１００μg/mlであり、好ましくは重合核１０μg/mlである。用いるリコンビナントβ2−ミクログロブリンの量としては１０μg/ml〜１０mg/ml（１：１〜１：１０００）が好ましい。
１１回目の継代的反復断片化によって得られた重合核（Ｓ１１）はβ2−ミクログロブリン以外の分子を含まない。このＳ１１とリコンビナントβ2−ミクログロブリンの親和性は高まり、伸長反応の初速度が上昇した。
【００１６】
本発明の透析アミロイドーシス治療剤のスクリーニング方法は、被験薬剤を酸性の緩衝液に溶解し、透析アミロイド線維重合核を２５〜１００μg/ml及びリコンビナントβ2−ミクログロブリンを５〜１００μM添加することによりアミロイド線維伸長反応を行う。反応液を内木らのチオフラビンＴ（ＴｈＴ）蛍光法（Amyloid:Int.J.Exp.Clin.Invest.,4,223〜232,1997）により測定し、蛍光強度の増加をアミロイド線維伸長の指標とする。あるいは、反応液を遠心分離し、遠心上清中の蛋白量（β2−ミクログロブリン量）を測定し、該蛋白量の減少をアミロイド線維伸長の指標とする。ＴｈＴ蛍光法では、アミロイド線維の形成が抑制されることにより蛍光強度の増加が減少するので、蛍光強度の増加の弱い薬剤ほどアミロイドーシスを抑制することになり、透析アミロイドーシス治療剤として優れている。また、遠心上清中の蛋白量（β2−ミクログロブリン量）の定量では、アミロイド線維の形成が抑制されることにより遠心上清中の蛋白量の減少が抑制されるので、遠心上清中の蛋白量の減少が少ない薬剤ほどアミロイドーシスを抑制することになり、透析アミロイドーシス治療剤として優れている。
【００１７】
本発明は、上記スクリーニング方法によって得られた透析アミロイドーシス治療剤を包含する。上記のスクリーニング方法によって透析アミロイドーシス治療剤を探索したところ、細胞結合組織の主要構成成分であるグリコサミノグリカン又はその塩が優れた透析アミロイドーシス抑制作用を有することを見出した。グリコサミノグリカンとしては、コンドロイチン硫酸Ｃ、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン又はヒアルロン酸が好ましく、それらの塩としては生理学的に許容できるものであり、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩が挙げられる。
【００１８】
また、フコイダン（Fucoidan）が優れた透析アミロイドーシス抑制作用を有することを見出した。フコイダンとしてはガゴメフコイダン、モズクフコイダン、フトモズクフコイダン、ネバリモフコイダン、イシゲフコイダン、イロロフコイダンが挙げられる。
【００１９】
さらにまた、本発明のスクリーニング方法によって透析アミロイドーシス治療剤を探索したところ、硫酸基を持つジアゾ系色素化合物又はグリコサミノグリカン若しくはフコイダンの置換基として硫酸基を持つジアゾ系色素化合物が結合した高分子化合物が優れた透析アミロイドーシス抑制作用を有することを見出した。硫酸基を持つジアゾ系色素化合物としてはコンゴーレッド（Congo red）、ダイレクトレッド７５（Direct Red 75）、ダイレクトレッド８０（Direct Red 80）、ダイレクトレッド８１（Direct Red 81）、ブリリアントイエロー（Brilliant Yellow）、ブリリアントクロセンモー（Brilliant Crocein ＭＯＯ）又はアシッドバイオレット５（Acid Violet 5）が挙げられる。
【００２０】
本発明の透析アミロイドーシス治療剤は、透析アミロイドーシス患者の治療に有効であり、その投与量は、症状、投与方法、投与期間などにより異なるが、通常、経口投与の場合には１００〜１００００mg/日、好ましくは９００〜１８００mg/日の投与範囲で１日１〜３回の範囲で投与する。また、１〜１００μg/mlの溶液の注射剤として、直接患部に注入したり静脈内投与することができる。これらの治療剤は、人体に投与するとき毒性、副作用を発現しない投与量とする。
【００２１】
グリコサミノグリカンは、製薬上許容され、かつ通常使用される担体や添加剤を配合して、経口投与用製剤あるいは非経口投与用製剤とすることができる。経口投与用製剤としては錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などであり、非経口投与用製剤としては注射剤が挙げられる。
【００２２】
【実施例】
以下に本発明を実施例をあげて詳述するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２３】
実施例１（透析アミロイド線維重合核の製造方法）
（１）基となるアミロイド線維重合核（Ｓ１）の形成
・ヒト由来の透析アミロイド線維重合核（Ｓ０）の調製
手根管症候群患者の関節滑膜よりＰｒａｓらの方法（前掲）で粗抽出後、ショ糖密度勾配超遠心法により精製し、０．０５％アジ化ナトリウム水溶液中に懸濁させ、使用時まで４℃で保管した。
・リコンビナントβ2−ミクログロブリンの調製
リコンビナントβ2−ミクログロブリン（オリエンタル酵母（株）製）を精製水で透析して脱塩し、凍結乾燥した。次いで、５０mMの塩化ナトリウム水溶液に３００〜５００μMの濃度で溶解し、使用時まで−８０℃で保管した。
【００２４】
Ｓ０重合核１０μg/ml、２５μＭリコンビナントβ2−ミクログロブリン、５０mMクエン酸緩衝液（ｐＨ２．５）及び１００mM塩化ナトリウムからなる反応液１mlを３７℃で２４時間反応させた。本反応により形成されたアミロイド線維を１５０００rpm、４℃で２時間遠心して沈渣を得た。この沈渣を０．０５％アジ化ナトリウム水溶液０．５mlで軽く洗浄後、０．０５％アジ化ナトリウム水溶液３００μlに懸濁し、超音波破砕機（Ultrasonic Disruptor、ＴＯＭＹ ＵＤ−２０１型）を用いて破砕して、破砕断片１００μgを得た。これをＳ１重合核とした。
【００２５】
（２）継代的な透析アミロイド線維重合核の形成
上記で得たＳ１重合核を初代重合核として用い、以下の方法を繰り返し行うことにより継代的重合核（Ｓ２〜Ｓｘ）（ｘは１以上の整数を示す。）を形成した。
【００２６】
反応液は、５０mMクエン酸緩衝液（ｐＨ２．５）と１００mM塩化ナトリウム水溶液の混合液に重合核（Ｓｘ）及びリコンビナントβ2−ミクログロブリンがそれぞれ最終濃度１０μg/ml及び２５μMになるように調整したものを用いた。反応液調製後、オイル−フリーＰＣＲチューブ（０．５ml用）内に反応液を氷冷下で３０μlずつ分注し、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＰＪ４８０、Perkin Elmer Cetus）にセットし、４℃から３７℃へ最高速で温度を上昇させた。反応開始１０分後に氷冷下で反応を停止させ、ＴｈＴ法で蛍光強度を測定した。
【００２７】
各経過時間の反応溶液５μlを、５μMのＴｈＴを含む５０mMグリシン／水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）１mlに添加し、攪拌混和後、直ちに分光蛍光光度計（日立Ｆ−３０１０）を用い、励起波長４５５nm、蛍光波長４８５nmで測定した。蛍光測定は同一サンプルで３回実施した。
【００２８】
重合核（Ｓ０〜Ｓ１０）の反応初速度は表１の通りであった。
【００２９】
【表１】
【００３０】
表１から明らかなように、継代を重ねるごとに反応初速度が上昇し、Ｓ１０の反応初速度はＳ０の４倍を示した。
【００３１】
実施例２（グリコサミノグリカンを用いた透析アミロイドーシスのスクリーニング。アミロイド線維伸長反応の阻害作用）
グリコサミノグリカンとしては、コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム塩（サメ関節由来、Sigma社製）、デルマタン硫酸ナトリウム塩（ブタ腸粘膜由来、Sigma社製）、ヘパラン硫酸ナトリウム塩（ブタ腸粘膜由来、Sigma社製）、ヘパリンナトリウム塩（ブタ腸粘膜由来、Sigma社製）又はヒアルロン酸ナトリウム塩（ヒトヘソ緒由来、ナカライテスク（株）製）を使用した。
【００３２】
上記グリコサミノグリカンは１mg/mlとなるように精製水に溶解し、希釈により３００μg/mlの濃度とした。
７５μlの精製水に０．５Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ２．５）を１５μl、及び９５０mMの塩化ナトリウム水溶液を１５μl添加した。次に、３００μg/mlに調製した上記グリコサミノグリカン水溶液（ヘパリンナトリウムは１mg/ml）を１５μl添加し、さらに、２５０μMのリコンビナントβ2−ミクログロブリン（オリエンタル酵母（株）製）１５μl及び実施例１で得られた１００μg/mlのアミロイド線維重合核（Ｓ１１）を１５μl添加した。なお、上記の操作は氷冷下で行った。
反応液はＰＣＲチューブ（０．５ml用）に５０μlずつ分注し、３７℃に加温することによりアミロイド線維伸長反応を開始した。アミロイド線維の伸長はＴｈＴ法で測定し、反応開始前から反応２時間もしくは４時間後の蛍光強度の増加を指標とした。
なお、対照群は上記グリコサミノグリカン水溶液の代わりに精製水を添加したものとした。
【００３３】
ＴｈＴ法の測定法は次の通りに行った。
５μMのＴｈＴを含む５０mMのグリシン／水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）１mlに、反応液５μlを添加、混和した。その直後に蛍光強度（励起波長４５５nm、蛍光波長４８５nm）を測定した。この操作を３回行い、３回の蛍光強度の平均値を算出した。
【００３４】
グリコサミノグリカンの蛍光強度の抑制効果を表２に示す。
【００３５】
【表２】
【００３６】
表２から明らかなように、グリコサミノグリカンは透析アミロイド線維伸長反応を強力に抑制するので透析アミロイドーシス治療剤として有用である。
【００３７】
実施例３（フコイダンを用いた透析アミロイドーシスのスクリーニング。アミロイド線維伸長反応の阻害作用）
フコイダンは、採集した以下の海藻を古川らの方法（比治山大学短期大学紀要 Bul.Hijiyama Univ.Jun.Col.,34,81〜87,1999）により精製したものを使用した。
ガゴメ（Kjellmaniella、北海道産の市販品）
モズク（Nemacystus decipiens）
フトモズク（Tinocladia crassa）
ネバリモ（Leathesia difformis）
イシゲ（Ishige okamurai）
イロロ（Ishige foliacea）
【００３８】
精製した上記のフコイダンは１mg/mlとなるように精製水に溶解した。
７５μlの精製水に０．５Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ２．５）を１５μl、及び９５０mMの塩化ナトリウム水溶液を１５μl添加した。次に、１mg/mlの上記フコイダン水溶液を１５μl添加し、さらに、２５０μMのリコンビナントβ2−ミクログロブリン（オリエンタル酵母（株）製）１５μl及び実施例１で得られた１００μg/mlのアミロイド線維重合核（Ｓ１１）を１５μl添加した。なお、上記の操作は氷冷下で行った。
反応液はＰＣＲチューブ（０．５ml用）に５０μlずつ分注し、３７℃に加温することによりアミロイド線維伸長反応を開始した。アミロイド線維の伸長はＴｈＴ法で測定し、反応開始前から反応４時間後の蛍光強度の増加を指標とした。なお、対照群は上記フコイダン水溶液の代わりに精製水を添加したものとした。
【００３９】
各フコイダンの蛍光強度の抑制効果を表３に示す。
【００４０】
【表３】
【００４１】
表３から明らかなように、各フコイダンは透析アミロイド線維伸長反応を強力に抑制するので透析アミロイドーシス治療剤として有用である。
【００４２】
実施例４（コンゴーレッドを用いた透析アミロイドーシスのスクリーニング。アミロイド線維伸長反応の阻害作用）
コンゴーレッド（Sigma社製）は１０mMとなるように精製水に溶解し、希釈により３００μMの濃度に調製した。
７５μlの精製水に０．５Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ２．５）１５μl及び９５０mMの塩化ナトリウム水溶液１５μlを添加した。次に、３００μMのコンゴーレッド水溶液１５μlを添加し、さらに２５０μMのリコンビナントβ2−ミクログロブリン（オリエンタル酵母（株）製）１５μl及び実施例１で得られた１００μg/mlのアミロイド線維重合核（Ｓ１１）１５μlを添加した。なお、上記の操作は氷冷下で行った。
反応液はＰＣＲチューブ（０．５ml用）に５０μlずつ分注し、３７℃に加温することによりアミロイド線維伸長反応を開始した。アミロイド線維の伸長は遠心上清蛋白量により測定し、反応開始前及び反応４時間後の遠心上清蛋白量の減少をアミロイド線維伸長の指標とした。
なお、対照群は上記コンゴーレッドの代わりに精製水を添加したものとした。
【００４３】
遠心上清中の蛋白の定量は次の通り行った。
反応液を１４５００rpm、４℃で２０分間遠心してアミロイド線維を沈殿させ、その上清の蛋白量をMicro ＢＣＡ蛋白定量キット（Pierce社製）により測定した。
結果を表４に示す。
【００４４】
【表４】
【００４５】
表４から明らかなように、コンゴーレッドは透析アミロイド線維伸長反応を強力に抑制するので透析アミロイドーシス治療剤として有用である。
【００４６】
実施例５（コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム塩含有の錠剤の調製）
コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム塩２０ｇ、乳糖１００ｇ、トウモロコシデンプン３６ｇ、結晶セルロース３０ｇ、カルボキシメチルセルロースカルシウム１０ｇ及びステアリン酸マグネシウム４ｇを均一に混合し、単発打錠機にて直径７．５mmの杵で１錠２００mgの錠剤とした。
【００４７】
実施例６（コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム塩含有の注射剤の調製）
コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム塩０．１mgをとり、注射用水を加えて溶解し１００mlとし、０．２μmのメンブランフィルターを用いてろ過し、無菌的にバイアル瓶に充填して注射剤とした。
【００４８】
【発明の効果】
本発明は、透析アミロイド線維重合核を大量に製造することができるため、工業的に有用であり、また、得られた透析アミロイド線維重合核はそのまま透析アミロイドーシス治療剤のスクリーニングに使用することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a dialysis amyloid fibril polymerization nucleus, a screening method for a dialysis amyloid-cis therapeutic agent, and a dialysis amyloid-cis therapeutic agent.
[0002]
[Prior art]
Amyloidosis is a cause of Alzheimer's disease, nephropathy, rheumatism, inflammation, diabetes, neurotoxic diseases and the like, and by suppressing the formation and deposition of fibers caused by amyloidosis, symptoms caused thereby can be improved. Dialysis amyloidosis is known to be caused by fibril formation and deposition of β 2 -microglobulin. Organ lesions in amyloid deposition include dialysis complications such as carpal tunnel syndrome, destructive spondyloarthropathy, and bone cysts. As a screening method for creating a drug that suppresses dialysis amyloidosis in order to improve those lesions and symptoms, an inhibition test of β 2 -microglobulin fiber elongation reaction has been attempted.
[0003]
beta 2 - The fiber elongation reaction by-microglobulin, a polymerization nucleus extracted from the dialysis amyloidosis from patients amyloidosis tissue, 2 beta was purified from urine or blood - It is known that the reaction of microglobulin (Amyloid: Int J. Exp. Clin. Invest., 4, 223-232, 1997).
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Since the materials used for these reactions use biological samples such as human tissues, urine, blood, etc., there are problems such as the need to obtain them and to prepare a biohazard environment.
[0005]
In the conventional elongation reaction between dialysis amyloid fiber polymerized nuclei and β 2 -microglobulin, the polymerized nuclei are collected from dialysis amyloidosis patient tissue. Therefore, there is a problem that it is used only for one reaction and is difficult to obtain. In addition, β 2 -microglobulin also has the inconvenience of being purified from urine and blood. Therefore, production of dialyzed amyloid fibril polymerized nuclei without using human tissue which can be mass-produced and can be used for β 2 -microglobulin fiber elongation reaction is desired, and β 2 -microglobulin which can be easily obtained is used. Realization of a fiber elongation reaction is desired.
[0006]
By producing a large amount of dialysis amyloid fibril polymerization nuclei, it is possible to contribute to screening for dialysis amyloidosis therapeutic agents.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present invention provides a method for producing dialyzed amyloid fibril polymerization nuclei.
[0008]
The present invention also provides a screening method for a therapeutic agent for dialysis amyloidosis.
[0009]
Furthermore, the present invention provides a therapeutic agent for dialysis amyloidosis obtained by the above screening method.
[0010]
Furthermore, the present invention provides a polymer compound in which a glycosaminoglycan or a salt thereof, fucoidan, a diazo dye compound having a sulfate group, or a diazo dye compound having a sulfate group as a substituent of glycosaminoglycan or fucoidan is bound. A dialysis amyloidosis therapeutic agent as an active ingredient is provided.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The dialysis amyloid fibril nuclei of the present invention react with dialysis amyloid fibril nuclei and recombinant β 2 -microglobulin to form amyloid fibrils. The amyloid fibrils obtained here are fragmented by sonication, and a part of the obtained fragments are used as amyloid fibril polymerization nuclei to repeat the reaction and fragmentation operations in the same manner as above. Can be manufactured. The amyloid fibril polymerization nucleus (Sx) obtained by repeating this passaging repeated operation X times (X represents an integer of 1 or more) has an increased affinity with β 2 -microglobulin and is the first in the elongation reaction. Increased speed. Accordingly, an infinite number of successive passage operations (S∞) can be performed, whereby a large amount of polymerization nuclei can be realized.
[0012]
The starting material, dialyzed amyloid fibril polymerization nucleus (S0), is derived from human tissue, and the method of Pras et al. (J. Exp. Med., 130, 777 to 791, 1969) from amyloid deposited tissue derived from a patient with dialysis amyloidosis. ) To obtain.
[0013]
As the β 2 -microglobulin, which is a constituent of the elongated fiber, commercially available recombinant β 2 -microglobulin can be used instead of one obtained from human urine or blood. It is a feature.
[0014]
The ultrasonic treatment for fragmenting the amyloid fibrils formed by the reaction between the dialysis amyloid fibril polymerization nucleus and the recombinant β 2 -microglobulin can be performed by an ultrasonic crusher.
[0015]
The amount of the fragment obtained by sonication used for the polymerization nuclei (Sx) of the passage elongation reaction is 2.5 to 100 μg / ml, preferably 10 μg / ml. The amount of recombinant β 2 -microglobulin used is preferably 10 μg / ml to 10 mg / ml (1: 1 to 1: 1000).
The polymerization nucleus (S11) obtained by the 11th passage repetitive fragmentation does not contain molecules other than β 2 -microglobulin. The affinity between S11 and recombinant β 2 -microglobulin increased, and the initial rate of the elongation reaction increased.
[0016]
In the screening method for a therapeutic agent for dialysis amyloidosis of the present invention, the test drug is dissolved in an acidic buffer, and 25-100 μg / ml of dialysis amyloid fibril polymerization nucleus and 5-100 μM of recombinant β 2 -microglobulin are added. Perform fiber elongation reaction. The reaction solution was measured by Uchigi et al.'S thioflavin T (ThT) fluorescence method (Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest., 4,223-232, 1997), and an increase in fluorescence intensity was used as an indicator of amyloid fiber elongation. . Alternatively, the reaction solution is centrifuged, the amount of protein (β 2 -microglobulin amount) in the centrifugal supernatant is measured, and the decrease in the amount of protein is used as an index of amyloid fiber elongation. In the ThT fluorescence method, since the increase in fluorescence intensity is reduced by suppressing the formation of amyloid fibrils, a drug with a weak increase in fluorescence intensity suppresses amyloidosis and is excellent as a therapeutic agent for dialysis amyloidosis. In addition, in the determination of the amount of protein (β 2 -microglobulin amount) in the centrifugal supernatant, the decrease in the amount of protein in the centrifugal supernatant is suppressed by suppressing the formation of amyloid fibrils. A drug with less decrease in the amount of protein suppresses amyloidosis and is excellent as a therapeutic agent for dialysis amyloidosis.
[0017]
The present invention includes a dialysis amyloidosis therapeutic agent obtained by the above screening method. When a therapeutic agent for dialysis amyloidosis was searched by the above screening method, it was found that glycosaminoglycan or a salt thereof, which is a main component of cell connective tissue, has an excellent dialysis amyloidosis inhibitory action. As glycosaminoglycan, chondroitin sulfate C, dermatan sulfate, heparan sulfate, heparin or hyaluronic acid is preferable, and salts thereof are physiologically acceptable and include sodium salts, potassium salts, and calcium salts.
[0018]
It was also found that fucoidan has an excellent dialysis amyloidosis inhibitory action. Examples of fucoidan include gagomefucoidan, mozukufucoidan, ftmozukufucoidan, nebarimovfucoidan, ishigefucoidan, and irolofucoidan.
[0019]
Furthermore, when a therapeutic agent for dialysis amyloidosis was searched for by the screening method of the present invention, a polymer having a diazo dye compound having a sulfate group or a diazo dye compound having a sulfate group as a substituent of glycosaminoglycan or fucoidan was bound. It was found that the compound has an excellent dialysis amyloidosis inhibitory action. Diazo dye compounds with sulfate groups include Congo red, Direct Red 75, Direct Red 80, Direct Red 81, and Brilliant Yellow. , Brilliant Crocein MOO or Acid Violet 5.
[0020]
The therapeutic agent for dialysis amyloidosis of the present invention is effective for the treatment of patients with dialysis amyloidosis, and its dosage varies depending on symptoms, administration methods, administration periods, etc., but usually 100 to 10,000 mg / day in the case of oral administration, Preferably, the dose is 900 to 1800 mg / day and is administered in the range of 1 to 3 times a day. Further, it can be directly injected into an affected area or intravenously administered as an injection of 1 to 100 μg / ml solution. These therapeutic agents are dosed so as not to cause toxicity and side effects when administered to the human body.
[0021]
Glycosaminoglycan can be formulated into a preparation for oral administration or a preparation for parenteral administration by blending pharmaceutically acceptable carriers and additives that are usually used. Examples of the preparation for oral administration include tablets, powders, granules and capsules, and examples of the preparation for parenteral administration include injections.
[0022]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
[0023]
Example 1 (Method for producing dialyzed amyloid fibril polymerization nucleus)
(1) Formation of underlying amyloid fibril polymerization nucleus (S1) Preparation of human-derived dialysis amyloid fibril polymerization nucleus (S0) After rough extraction by the method of Pras et al. (Supra) from joint synovium of carpal tunnel syndrome patients The solution was purified by sucrose density gradient ultracentrifugation, suspended in 0.05% aqueous sodium azide solution, and stored at 4 ° C. until use.
· Recombinant beta 2 - microglobulin Preparation recombinant beta 2 - microglobulin (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) was desalted and dialyzed with purified water and freeze-dried. Subsequently, it melt | dissolved in the density | concentration of 300-500 micromol in 50 mM sodium chloride aqueous solution, and it stored at -80 degreeC until use.
[0024]
1 ml of a reaction solution consisting of 10 μg / ml S0 polymerization nucleus, 25 μM recombinant β 2 -microglobulin, 50 mM citrate buffer (pH 2.5) and 100 mM sodium chloride was reacted at 37 ° C. for 24 hours. The amyloid fibril formed by this reaction was centrifuged at 15000 rpm and 4 ° C. for 2 hours to obtain a sediment. The precipitate is gently washed with 0.5 ml of 0.05% sodium azide aqueous solution, suspended in 300 μl of 0.05% sodium azide aqueous solution, and crushed using an ultrasonic crusher (Ultrasonic Disruptor, model TOMY UD-201). As a result, 100 μg of crushed fragments were obtained. This was designated as S1 polymerization nucleus.
[0025]
(2) Formation of passage dialysis amyloid fibril polymerization nuclei Using the S1 polymerization nuclei obtained above as primary polymerization nuclei, by repeating the following method, passage polymerization nuclei (S2 to Sx) (x is 1 The above integers are shown.).
[0026]
The reaction solution was adjusted to a mixture of 50 mM citrate buffer (pH 2.5) and 100 mM sodium chloride aqueous solution so that the polymerization nuclei (Sx) and recombinant β 2 -microglobulin had final concentrations of 10 μg / ml and 25 μM, respectively. Things were used. After preparing the reaction solution, dispense 30 μl each of the reaction solution into an oil-free PCR tube (for 0.5 ml) under ice-cooling, set on a DNA thermal cycler (PJ480, Perkin Elmer Cetus), and 4 ° C. to 37 ° C. The temperature was raised at the highest speed. Ten minutes after the start of the reaction, the reaction was stopped under ice cooling, and the fluorescence intensity was measured by the ThT method.
[0027]
5 μl of the reaction solution at each elapsed time was added to 1 ml of 50 mM glycine / sodium hydroxide buffer (pH 8.5) containing 5 μM ThT, and after stirring and mixing, immediately using a spectrofluorometer (Hitachi F-3010), Measurement was performed at an excitation wavelength of 455 nm and a fluorescence wavelength of 485 nm. The fluorescence measurement was performed three times on the same sample.
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The initial reaction rates of the polymerization nuclei (S0 to S10) were as shown in Table 1.
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[Table 1]
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As is clear from Table 1, the initial reaction rate increased with successive passages, and the initial reaction rate of S10 was 4 times that of S0.
[0031]
Example 2 (Screening of dialysis amyloidosis using glycosaminoglycan. Inhibitory action of amyloid fibril elongation reaction)
As glycosaminoglycan, chondroitin sulfate C sodium salt (from shark joint, manufactured by Sigma), dermatan sulfate sodium salt (derived from porcine intestinal mucosa, manufactured by Sigma), heparan sulfate sodium salt (derived from porcine intestinal mucosa, manufactured by Sigma) ), Heparin sodium salt (derived from porcine intestinal mucosa, manufactured by Sigma) or hyaluronic acid sodium salt (derived from human umbilical cord, manufactured by Nacalai Tesque).
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The glycosaminoglycan was dissolved in purified water to 1 mg / ml and diluted to a concentration of 300 μg / ml.
To 75 μl of purified water, 15 μl of 0.5 M citrate buffer (pH 2.5) and 15 μl of 950 mM aqueous sodium chloride solution were added. Next, 15 μl of the above glycosaminoglycan aqueous solution prepared at 300 μg / ml (heparin sodium is 1 mg / ml) is added, and further 15 μl of 250 μM recombinant β 2 -microglobulin (produced by Oriental Yeast Co., Ltd.) and Examples 15 μl of 100 μg / ml amyloid fibril polymerization nucleus (S11) obtained in 1 was added. In addition, said operation was performed under ice-cooling.
50 μl each of the reaction solution was dispensed into a PCR tube (for 0.5 ml) and heated to 37 ° C. to initiate the amyloid fiber elongation reaction. The elongation of amyloid fibrils was measured by the ThT method, and the increase in fluorescence intensity 2 hours or 4 hours after the start of the reaction was used as an index.
In the control group, purified water was added in place of the glycosaminoglycan aqueous solution.
[0033]
The ThT method was measured as follows.
To 1 ml of 50 mM glycine / sodium hydroxide buffer (pH 8.5) containing 5 μM ThT, 5 μl of the reaction solution was added and mixed. Immediately thereafter, fluorescence intensity (excitation wavelength: 455 nm, fluorescence wavelength: 485 nm) was measured. This operation was performed three times, and the average value of the three fluorescence intensities was calculated.
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Table 2 shows the effect of suppressing the fluorescence intensity of glycosaminoglycan.
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[Table 2]
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As is apparent from Table 2, glycosaminoglycan is useful as a therapeutic agent for dialysis amyloidosis because it strongly suppresses dialysis amyloid fibril elongation reaction.
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Example 3 (Screening of dialysis amyloidosis using fucoidan. Inhibitory action of amyloid fibril elongation reaction)
As the fucoidan, the following collected seaweed was purified by the method of Furukawa et al. (Bul.Hijiyama Univ.Jun.Col., 34, 81-87, 1999).
Gagome (Kjellmaniella, a commercial product from Hokkaido)
Mozuku (Nemacystus decipiens)
Foxtail (Tinocladia crassa)
Nebarimo (Leathesia difformis)
Ishige okamurai
Ishige foliacea
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The above-mentioned purified fucoidan was dissolved in purified water so as to be 1 mg / ml.
To 75 μl of purified water, 15 μl of 0.5 M citrate buffer (pH 2.5) and 15 μl of 950 mM aqueous sodium chloride solution were added. Next, 15 μl of the above 1 mg / ml fucoidan aqueous solution was added, and further 15 μl of 250 μM recombinant β 2 -microglobulin (produced by Oriental Yeast Co., Ltd.) and 100 μg / ml amyloid fibril polymerization nucleus obtained in Example 1 were used. 15 μl of (S11) was added. In addition, said operation was performed under ice-cooling.
50 μl each of the reaction solution was dispensed into a PCR tube (for 0.5 ml) and heated to 37 ° C. to initiate the amyloid fiber elongation reaction. The elongation of amyloid fibrils was measured by the ThT method, and the increase in fluorescence intensity after 4 hours from the start of the reaction was used as an index. In the control group, purified water was added in place of the fucoidan aqueous solution.
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Table 3 shows the effect of suppressing the fluorescence intensity of each fucoidan.
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[Table 3]
[0041]
As is clear from Table 3, each fucoidan is useful as a therapeutic agent for dialysis amyloidosis because it strongly suppresses dialysis amyloid fiber elongation reaction.
[0042]
Example 4 (Screening of dialysis amyloidosis using Congo Red. Inhibitory action of amyloid fibril elongation reaction)
Congo red (manufactured by Sigma) was dissolved in purified water to a concentration of 10 mM and diluted to a concentration of 300 μM.
To 75 μl of purified water, 15 μl of 0.5 M citrate buffer (pH 2.5) and 15 μl of 950 mM sodium chloride aqueous solution were added. Next, 15 μl of 300 μM Congo red aqueous solution was added, and further 15 μl of 250 μM recombinant β 2 -microglobulin (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) and 100 μg / ml amyloid fibril polymerization nucleus (S11) obtained in Example 1 were used. 15 μl was added. In addition, said operation was performed under ice-cooling.
50 μl each of the reaction solution was dispensed into a PCR tube (for 0.5 ml) and heated to 37 ° C. to initiate the amyloid fiber elongation reaction. The elongation of amyloid fibrils was measured by the amount of centrifugal supernatant protein, and the decrease in the amount of centrifugal supernatant protein before the start of reaction and 4 hours after the reaction was used as an index of amyloid fibril elongation.
In the control group, purified water was added instead of Congo Red.
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The protein in the centrifugal supernatant was quantified as follows.
The reaction solution was centrifuged at 14500 rpm at 4 ° C. for 20 minutes to precipitate amyloid fibrils, and the amount of protein in the supernatant was measured with a Micro BCA protein quantification kit (Pierce).
The results are shown in Table 4.
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[Table 4]
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As can be seen from Table 4, Congo Red is useful as a therapeutic agent for dialysis amyloidosis because it strongly suppresses the dialysis amyloid fiber elongation reaction.
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Example 5 (Preparation of tablets containing chondroitin sulfate C sodium salt)
Chondroitin sulfate C sodium salt 20 g, lactose 100 g, corn starch 36 g, crystalline cellulose 30 g, carboxymethylcellulose calcium 10 g and magnesium stearate 4 g are mixed uniformly, and one tablet 200 mg with a punch of 7.5 mm in diameter with a single tableting machine. It was set as a tablet.
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Example 6 (Preparation of injection containing chondroitin sulfate C sodium salt)
0.1 mg of chondroitin sulfate C sodium salt was taken, dissolved by adding water for injection to 100 ml, filtered through a 0.2 μm membrane filter, and aseptically filled into a vial.
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【The invention's effect】
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is industrially useful because it can produce dialysis amyloid fibril polymerization nuclei in large quantities, and the dialysis amyloid fibril polymerization nuclei obtained can be used for screening dialysis amyloidosis therapeutic agents as they are. .
