JP2005229870A - Parenchymatous stem cell of human cornea and method for preparing the same - Google Patents
Parenchymatous stem cell of human cornea and method for preparing the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005229870A JP2005229870A JP2004041894A JP2004041894A JP2005229870A JP 2005229870 A JP2005229870 A JP 2005229870A JP 2004041894 A JP2004041894 A JP 2004041894A JP 2004041894 A JP2004041894 A JP 2004041894A JP 2005229870 A JP2005229870 A JP 2005229870A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- stem cell
- culture
- corneal
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 63
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 title abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 152
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 claims abstract description 26
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 7
- 101000801254 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102100033725 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims abstract description 3
- 102100035071 Vimentin Human genes 0.000 claims description 26
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 claims description 17
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 claims description 16
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 16
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 claims description 15
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 14
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 14
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 claims description 14
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 13
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 12
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 claims description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 6
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 claims description 6
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 claims description 6
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 claims 1
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 abstract 1
- 102000053171 Glial Fibrillary Acidic Human genes 0.000 description 15
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 15
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 210000003683 corneal stroma Anatomy 0.000 description 10
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 9
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 9
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 8
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 8
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 8
- 102100023055 Neurofilament medium polypeptide Human genes 0.000 description 7
- 101710109612 Neurofilament medium polypeptide Proteins 0.000 description 7
- 238000002507 cathodic stripping potentiometry Methods 0.000 description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 5
- 210000003027 ear inner Anatomy 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 5
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 4
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 4
- 102100025759 Keratin, type II cytoskeletal 3 Human genes 0.000 description 4
- 108010065086 Keratin-12 Proteins 0.000 description 4
- 108010070918 Keratin-3 Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 4
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000399 corneal endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 210000003560 epithelium corneal Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 3
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102100023967 Keratin, type I cytoskeletal 12 Human genes 0.000 description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 102100028465 Peripherin Human genes 0.000 description 2
- 108010003081 Peripherins Proteins 0.000 description 2
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 2
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 210000002555 descemet membrane Anatomy 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000001232 limbus corneae Anatomy 0.000 description 2
- 210000000933 neural crest Anatomy 0.000 description 2
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 210000005047 peripherin Anatomy 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100189945 Arabidopsis thaliana PER63 gene Proteins 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101150057182 GFAP gene Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000007339 Nerve Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- WDVSHHCDHLJJJR-UHFFFAOYSA-N Proflavine Chemical compound C1=CC(N)=CC2=NC3=CC(N)=CC=C3C=C21 WDVSHHCDHLJJJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical class O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 101150071739 Tp63 gene Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102100027881 Tumor protein 63 Human genes 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004045 bowman membrane Anatomy 0.000 description 1
- GEHJBWKLJVFKPS-UHFFFAOYSA-N bromochloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Br GEHJBWKLJVFKPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 208000021921 corneal disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003792 cranial nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 108010059354 cysteine string protein Proteins 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000871 endothelium corneal Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- 230000023105 myelination Effects 0.000 description 1
- 210000000651 myofibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004129 prosencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
本発明は、多分化能及び自己再生能（自己複製能）を有するヒト角膜実質幹細胞及びその作製方法に関する。 The present invention relates to a human keratocyte stem cell having pluripotency and self-renewal ability (self-replication ability) and a method for producing the same.
重篤な角膜疾患に対する従来の治療方法は、提供角膜による角膜移植である。しかし、少なくとも日本国内では、角膜ドナ−および提供が極端に不足しているという現状がある。またさらに、他人から移植になるため、拒絶反応の問題もあり、角膜移植による治療は、万全な治療法とは言い難い。 A conventional treatment method for severe corneal diseases is corneal transplantation using a donated cornea. However, at least in Japan, there is an extremely shortage of corneal donors and donations. Furthermore, since transplantation is performed from another person, there is also a problem of rejection, and treatment with corneal transplantation is not a perfect treatment.
角膜１は、図５に示すように、複数の層状構造で形成されており、それらは、角膜上皮２、ボーマン膜３、角膜実質４、デスメ膜５及び角膜内皮細胞６からである。最表層にある角膜上皮２は、厚さ約５０μｍの５〜６層の非角化重層扁からなり、角膜実質４は、密な間隔で整然と配列したコラーゲン組織と実質細胞からなり、高い透明性を有している。角膜内皮細胞６は、角膜の最内層に配列する一層の細胞である。角膜内皮細胞は、ポンプ機能を有し、角膜内の水分含有率を適切に維持する機能を有する。 As shown in FIG. 5, the cornea 1 is formed of a plurality of layered structures, which are composed of a corneal epithelium 2, a Bowman membrane 3, a corneal stroma 4, a Descemet's membrane 5, and a corneal endothelial cell 6. The corneal epithelium 2 on the outermost layer is composed of 5 to 6 layers of non-keratinized lamellae having a thickness of about 50 μm, and the corneal stroma 4 is composed of collagen tissues and parenchymal cells regularly arranged at close intervals, and has high transparency. have. The corneal endothelial cell 6 is a single layer cell arranged in the innermost layer of the cornea. Corneal endothelial cells have a pump function and a function of appropriately maintaining the water content in the cornea.
角膜移植に代わる方法の１つとして、角膜細胞の細胞を用いた角膜の再生が試みられている。中でも、角膜上皮幹細胞を用いた再生は、臨床応用も行われている。具体的には、患者自身の健康な角膜輪部の一部の角膜上皮細胞を採取し、羊膜上で培養し、それを移植し再生を促す方法である。 As one alternative to corneal transplantation, corneal regeneration using corneal cells has been attempted. In particular, regeneration using corneal epithelial stem cells has been clinically applied. Specifically, it is a method of collecting a part of corneal epithelial cells of a patient's own healthy corneal limbus, culturing it on amniotic membrane, transplanting it, and promoting regeneration.
しかし、角膜実質細胞については、幹細胞の存在が現状では確認されておらず、かつその培養法についても知られていない。従って、角膜実質が損傷を受けた場合には、依然として同種移植に頼るしかなく、上記のような問題（ドナー不足及び拒絶反応）が未解決である。多分化能及び自己再生能を有する角膜実質幹細胞の存在が確認され、かつその培養法が確立され、それを入手できれば、培養して、移植することも可能になる。また、幹細胞を培養物として入手できれば、増殖も容易に行えるし、長期間の保存も可能になると考えられる。 However, regarding corneal parenchymal cells, the presence of stem cells has not been confirmed at present, and the culture method is not known. Therefore, when the corneal stroma is damaged, there is still no choice but to rely on allotransplantation, and the above problems (donor shortage and rejection) are still unresolved. If the existence of corneal parenchymal stem cells having pluripotency and self-renewal ability is confirmed and a culture method thereof is established and can be obtained, it can be cultured and transplanted. In addition, if stem cells can be obtained as a culture, they can be easily proliferated and stored for a long period of time.
そこで、本発明の目的は、これらの問題を解決するために、多分化能及び自己再生能を有する角膜実質幹細胞の分離及びその作製方法を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing corneal parenchymal stem cells having pluripotency and self-renewal ability and a method for producing the same in order to solve these problems.
上記課題を解決するための本発明は以下の通りである。
（１）ヒト角膜実質細胞由来であり、ネスチン及びビメンチンに対する免疫反応性を有し、ｐ７５ＮＴＲに対する免疫反応性を有さない幹細胞。
（２）前記幹細胞は、β−チューブリン及びGFAPに対する免疫反応性を有する（１）に記載の幹細胞。
（３）前記幹細胞は、ウシ胎児血清（FBS）を含む培地内での接着培養において、ネスチンを発現しなくなり、ビメンチン陽性間葉線維芽細胞ならびにニューロンおよびグリアに分化する、（１）または（２）に記載の幹細胞。
（４）前記幹細胞は、直径２００マイクロメータ未満の球状物である（１）〜（３）のいずれかに記載の幹細胞。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の幹細胞を含有する培養物。
（６）ヒト角膜実質細胞を、増殖因子を含有する培地中で浮遊培養することを含む、ヒト角膜実質幹細胞培養物の作製方法。
（７）前記増殖因子が、Ｂ２７、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、及び塩基性線維芽増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む、（６）に記載の作製方法。
（８）前記培地がメチルセルロースゲルマトリクスを含有する、（６）または（７）に記載の作製方法。
（９）前記ヒト角膜実質細胞が、コラーゲンを含有する細胞分離用培地に角膜輪部組織を溶解させ、ＥＤＴＡ／ＰＤＳ溶液で細胞を分散させて単離されたものである（６）〜（８）のいずれかに記載の作製方法。
（１０）前記単離された実質細胞が、角膜上皮細胞の混入のないものである（９）に記載の作製方法。
The present invention for solving the above problems is as follows.
(1) Stem cells derived from human corneal stromal cells, having immunoreactivity with nestin and vimentin, and not having immunoreactivity with p75NTR.
(2) The stem cell according to (1), wherein the stem cell has immunoreactivity with β-tubulin and GFAP.
(3) The stem cells do not express nestin and are differentiated into vimentin-positive mesenchymal fibroblasts and neurons and glia in an adhesion culture in a medium containing fetal bovine serum (FBS). (1) or (2 ) Stem cells.
(4) The stem cell according to any one of (1) to (3), wherein the stem cell is a sphere having a diameter of less than 200 micrometers.
(5) A culture containing the stem cell according to any one of (1) to (4).
(6) A method for producing a human corneal stromal stem cell culture, comprising suspension culture of human corneal stromal cells in a medium containing a growth factor.
(7) The production method according to (6), wherein the growth factor comprises B27, epidermal growth factor (EGF), and basic fibroblast growth factor (bFGF).
(8) The production method according to (6) or (7), wherein the culture medium contains a methylcellulose gel matrix.
(9) The human corneal stromal cells are isolated by dissolving corneal limbal tissue in a cell separation medium containing collagen and dispersing the cells with an EDTA / PDS solution (6) to (8) ).
(10) The production method according to (9), wherein the isolated parenchymal cells are free of corneal epithelial cells.
本発明によれば、多分化能及び自己再生能を有する角膜実質幹細胞を提供することができ、角膜移植によらずに角膜の再生が可能となる。 According to the present invention, a corneal parenchymal stem cell having multipotency and self-renewal ability can be provided, and the cornea can be regenerated without corneal transplantation.
本発明は、ヒト角膜実質細胞由来の幹細胞及びこの幹細胞を含む培養物であり、この幹細胞は、ネスチン及びビメンチンに対する免疫反応性を有し、ｐ７５ＮＴＲに対する免疫反応性を有する。 The present invention is a stem cell derived from human corneal stromal cells and a culture containing the stem cell, and the stem cell has immunoreactivity to nestin and vimentin and has immunoreactivity to p75NTR.
ネスチンは、脳神経幹細胞のマーカーであり、最近では組織幹細胞においても検出されている。本発明の幹細胞を分化誘導すると、ネスチンに対する免疫反応性を有するようになる。このことは、本発明の幹細胞が脳神経幹細胞に分化つまり、多分化能を有していることを示す。 Nestin is a marker for cranial nerve stem cells and has recently been detected in tissue stem cells. When the stem cells of the present invention are induced to differentiate, they have immunoreactivity to nestin. This indicates that the stem cells of the present invention differentiate into brain neural stem cells, that is, have multipotency.
また、ビメンチンは、間葉系細胞に現れる非特異的なフィラメントであり間葉系細胞のマーカーである。本発明の幹細胞を分化誘導すると、ビメンチンを発現する。このことは、本発明の幹細胞が間葉系細胞に分化つまり、多分化能を有していることを示す。 Vimentin is a non-specific filament that appears in mesenchymal cells and a marker for mesenchymal cells. When differentiation of the stem cell of the present invention is induced, vimentin is expressed. This indicates that the stem cells of the present invention differentiate into mesenchymal cells, that is, have multipotency.
さらに、p75 NTRは、神経栄養因子ニューロトロフィンの受容体である。ニューロトロフィンは、末梢神経系のミエリン形成の重要な調節因子である。本発明の幹細胞を分化誘導すると、p75 NTRに対する免疫反応性を有さないということは、本発明の幹細胞が、末梢神経系のミエリン形成しないことを示す。 In addition, p75 NTR is a receptor for the neurotrophic factor neurotrophin. Neurotrophins are important regulators of myelination in the peripheral nervous system. When differentiation of the stem cells of the present invention is induced, the absence of immunoreactivity to p75 NTR indicates that the stem cells of the present invention do not form myelin in the peripheral nervous system.
さらに本発明の幹細胞は、β−チューブリン及びGFAP（glial fibrillary acidic protein）に対する免疫反応性を有する。これらは神経細胞のマーカーであり、本発明の幹細胞がこれらに対する免疫反応性を有するということは、本発明の幹細胞が、多分化能を有していることを示す。 Furthermore, the stem cell of the present invention has immunoreactivity with β-tubulin and GFAP (glial fibrillary acidic protein). These are markers of nerve cells, and the fact that the stem cells of the present invention have immunoreactivity to them indicates that the stem cells of the present invention have pluripotency.
本発明の幹細胞は、ウシ胎児血清（FBS）を含む培地内で接着培養すると、ネスチンを発現しなくなり、ビメンチ陽性の間葉線維芽細胞ならびにニューロンおよびグリアに分化する。このことは、本発明の幹細胞が、多分化能を有していることを示す。 When the stem cells of the present invention are adherently cultured in a medium containing fetal bovine serum (FBS), they do not express nestin and differentiate into vimenti-positive mesenchymal fibroblasts and neurons and glia. This indicates that the stem cells of the present invention have pluripotency.
本発明の幹細胞は、後述する実施例で示すように、１次スフェアをばらばらにして、培養したところ、２次スフェアが形成されたことから、自己再性能（自己複製能）がある細胞である。 The stem cells of the present invention are cells that have self-re-performance (self-replicating ability) because secondary spheres were formed when the primary spheres were dissociated and cultured as shown in the examples described later. .
本発明の幹細胞は、直径２００マイクロメータ未満のニューロスフェアと言う球状細胞塊である。 The stem cell of the present invention is a spherical cell cluster called a neurosphere having a diameter of less than 200 micrometers.
以下に本発明のヒト角膜実質幹細胞の分離、作製方法について説明する。
本発明のヒト角膜実質幹細胞培養物の作製方法は、ヒト角膜実質細胞を、増殖因子を含有する培養液中で浮遊培養する。増殖因子は、Ｂ２７、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、及び塩基性線維芽増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むものである。
The method for isolating and preparing human corneal parenchymal stem cells of the present invention will be described below.
In the method for producing a human keratocyte stem cell culture of the present invention, human keratocytes are cultured in suspension in a culture solution containing a growth factor. Growth factors include B27, epidermal growth factor (EGF), and basic fibroblast growth factor (bFGF).
B27はもともと海馬、その他の中枢神経系ニュ−ロンを長期安定、培養するために開発された血清の代替え添加物である。無血清でなければ細胞が未分化な状態を保てないという点から、本細胞培養は無血清で行う必要がある。このため血清の代替であるB27を必要とする。 B27 is a serum replacement additive originally developed for long-term stable culture of hippocampus and other central nervous system neurons. This cell culture needs to be performed in the absence of serum since the cells cannot be kept undifferentiated unless serum-free. This requires B27, a serum replacement.
前記培養液には、細胞の再凝集を防ぐために、メチルセルロースゲルマトリクスを含有することが好ましい。 The culture solution preferably contains a methylcellulose gel matrix in order to prevent reaggregation of cells.
培養に用いるヒト角膜実質細胞は、ヒト角膜実質より、コラ−ゲンをコラゲナ−ゲで酵素処理し、さらにＥＤＴＡ／ＰＤＳ溶液で細胞を単離されたものであることが好ましい。このように単離された実質細胞は、角膜上皮細胞の混入のないものである必要がある。角膜上皮細胞の混入の有無を調べるには、分化した角膜上皮細胞に特異的なマーカー、サイトケラチン３および１２遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによって確認できる。 The human keratocytes used for the culture are preferably those obtained by treating collagen with collagenage from human keratocytes and further isolating the cells with an EDTA / PDS solution. The isolated parenchymal cells must be free of corneal epithelial cells. In order to examine the presence or absence of contamination of corneal epithelial cells, it can be confirmed by RT-PCR of cytokeratin 3 and 12 genes specific to differentiated corneal epithelial cells.
以下、本発明を実施例によりさらに説明する。
［角膜実質細胞の単離］
本研究は、ヘルシンキ宣言に基づいて行われた。死亡直後に摘出されたヒト提供眼から、眼球後極、水晶体、および毛眼体を注意深く除去したものを、セントラル・フロリダ・ライオンズ・アイ・ティシュー・バンク(Central Florida Lions Eye Tissue Bank)から得た。それらは死後７〜８日経過していた。ドナーの年齢は、４１〜７８歳だった。まず角膜から、角膜上皮を注意深く除去した。次に微細なセッシを用いて、デスメ膜ごと角膜内皮を、角膜の内面の周辺部から中心へ向かって、シート状に剥ぎ取った（サカイ(Sakai) 2002）。その後、角膜輪部上皮細胞の混入を回避するために、角膜輪部含む周辺角膜を切除し、直径約１０ｍｍの実質片を作製した。実質片をさらに小片に細断し、０．０２％のコラゲナーゼ（シグマ(Sigma)、セントルイス(St.Louis)、MO）を含む基礎培地（以下に記載）中で、３７℃で一晩インキュベートした。その後PBSによって洗浄し、それら組織を、０．２％ ＥＤＴＡ中で、３７℃で５分間インキュベート、粉砕することによって単一細胞に分けた。遠心分離（１２００ｒｐｍ）後、細胞を、基礎培地中に再懸濁した。細胞の生存を、トリパンブルー（ワコー(Wako)、大阪、日本）によって評価したところ、８０％を超えていた（>８０％）。角膜上皮細胞および内皮細胞の混入なしに、実質細胞のみが単離されたかを調べるために、培養前に、逆転写酵素ポリメラーゼチェーン反応（RT-PCR）によって、角膜上皮マーカーのサイトケラチン(cytokeratin)３および１２の、発現を調べた。
Hereinafter, the present invention will be further described by examples.
[Isolation of keratocytes]
This study was based on the Helsinki Declaration. A human eye that was removed immediately after death was obtained from the Central Florida Lions Eye Tissue Bank with careful removal of the retroocular pole, lens, and trichomes. . They were 7-8 days old after death. The donor's age was 41-78. First, the corneal epithelium was carefully removed from the cornea. Next, the corneal endothelium along with the Descemet's membrane was peeled off into a sheet shape from the peripheral portion of the inner surface of the cornea toward the center using a fine scissors (Sakai 2002). Thereafter, in order to avoid contamination of corneal limbal epithelial cells, the peripheral cornea including the corneal limbus was excised to produce a substantial piece having a diameter of about 10 mm. The parenchyma was further chopped into small pieces and incubated overnight at 37 ° C. in basal medium (described below) containing 0.02% collagenase (Sigma, St. Louis, MO). . They were then washed with PBS and the tissues were split into single cells by incubating in 0.2% EDTA for 5 minutes at 37 ° C. and grinding. After centrifugation (1200 rpm), the cells were resuspended in basal medium. Cell viability was assessed by trypan blue (Wako, Osaka, Japan) and exceeded 80% (> 80%). To investigate whether only parenchymal cells were isolated without contamination of corneal epithelial cells and endothelial cells, the corneal epithelial marker cytokeratin was analyzed by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) prior to culture. The expression of 3 and 12 was examined.
［初代培養；角膜実質細胞からの球状コロニーの単離］
本研究のために使用した、初代細胞培養技術は、ニューロスフェア法（レイノルド（Reynold）およびワイス（Weiss） 1992）であった（トーマ（Toma） 2001）。培養液には、既に記載されているように（グリッティ(Gritti) 1999）、細胞の再凝集を防ぐために、メチルセルロースゲルマトリックスを添加したものを使用した。本研究で使用した基礎培地は、既に記載されているように(ref)、B27（インビトロゲン（Invitrogen）、サンディエゴ、CA）、20ng/mLの上皮増殖因子（EGF、シグマ（Sigma））、および40ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂFGF、シグマ（Sigma））を添加した、DMEM/F12(１：１、シグマ(Sigma))であった。未被覆の２４穴培養プレート（ファルコン(Falcon)）中で、初代組織を、５０Cells/μｌの細胞（1ウェル当たり50,000細胞）播種した。この条件下では、細胞の再凝集は起こらない（グリッティ（Gritti） 1999および我々の未発表報告）。CO2濃度は５％であった。
[Primary culture; Isolation of spherical colonies from keratocytes]
The primary cell culture technique used for this study was the neurosphere method (Reynold and Weiss 1992) (Toma 2001). As previously described (Gritti 1999), the culture broth was used with a methylcellulose gel matrix added to prevent cell reaggregation. The basal media used in this study were as previously described (ref), B27 (Invitrogen, San Diego, CA), 20 ng / mL epidermal growth factor (EGF, Sigma), and DMEM / F12 (1: 1, Sigma) supplemented with 40 ng / mL basic fibroblast growth factor (bFGF, Sigma). Primary tissues were seeded at 50 Cells / μl cells (50,000 cells per well) in an uncoated 24-well culture plate (Falcon). Under these conditions, cell reaggregation does not occur (Gritti 1999 and our unpublished report). The CO 2 concentration was 5%.
培養７日後に、細胞が成長して細胞塊、即ち、球状細胞塊、が形成された。それら球状コロニ−を、固定するまえに、１０μM／ｍＬのブロモデオキシウリジン（BrdU、シグマ（Sigma））をラベルするために一晩処理した。さらに免疫染色およびRT-PCRを用いて、ネスチン、ビメンチン、β−チューブリン、ニューロフィラメントM（NFM）、グリア線維性酸性蛋白質（GFAP）、およびBrdUの発現の有無を観察した。 After 7 days of culture, the cells grew to form a cell mass, ie, a spherical cell mass. The globular colonies were treated overnight to label 10 μM / mL bromodeoxyuridine (BrdU, Sigma) before fixation. Furthermore, the presence or absence of expression of nestin, vimentin, β-tubulin, neurofilament M (NFM), glial fibrillary acidic protein (GFAP), and BrdU was observed using immunostaining and RT-PCR.
培養７日後に、初代球状細胞塊数を数えた。生きの悪い細胞塊から増殖し球状細胞塊と区別するために、５０μｍを超える直径を有する細胞集団のみを数えた。継代は、初代球状細胞塊（培養7日後）を、０．５％のEDTAによってばらばらにし、50細胞／μｌの濃度で、２４穴培養プレ−ト内に播種した。培養液はメチルセルロースゲルマトリックスを含む基礎培地中で、７日間培養し、初代細胞から増殖した、２世代目のスフェア数を数えた。 Seven days after culturing, the number of primary spherical cell masses was counted. Only cell populations with a diameter greater than 50 μm were counted in order to proliferate and differentiate from globular cell masses from viable cell masses. For passage, primary spherical cell masses (after 7 days in culture) were dissociated with 0.5% EDTA and seeded in 24-well culture plates at a concentration of 50 cells / μl. The culture solution was cultured for 7 days in a basal medium containing a methylcellulose gel matrix, and the number of second-generation spheres grown from primary cells was counted.
［生成された球状コロニーの接着(adherent)培養］
単離された球状コロニーの多分化能を評価するために、各ウェル中に５０μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ、シグマ(Sigma)）および１０μｇ／ｍＬのフィブロネクチン（ＢＤバイオサイエンス(Biosciences)、サンホセ、CA）を被覆したカバーガラス入れ、個々の初代球状細胞塊（７ DIV）を播種した。分化を促進するために、１％のウシ胎児血清（FBS）を、基礎培地（トロペペ(Tropepe) 2000）へ添加し、を日間培養した。それぞれの実験では、固定前に、１０μＭ／ｍＬのＢｒｄＵ（シグマ(Sigma)）によって、次世代を処理した。その後、ネスチン、ビメンチン、β−チューブリン、NF-M、GFAP、およびBrdUの発現を調べた。
[Adherent culture of generated spherical colonies]
To assess the pluripotency of isolated spherical colonies, 50 μg / mL poly-L-lysine (PLL, Sigma) and 10 μg / mL fibronectin (BD Biosciences) in each well. , San Jose, CA) and coverslips with individual primary globular cell mass (7 DIV). To promote differentiation, 1% fetal bovine serum (FBS) was added to basal medium (Tropepe 2000) and cultured for days. In each experiment, the next generation was treated with 10 μM / mL BrdU (Sigma) prior to fixation. Subsequently, the expression of nestin, vimentin, β-tubulin, NF-M, GFAP, and BrdU was examined.
RT-PCRでは、球状細胞塊を大量に培養、即ち、３０個の球状細胞塊を、PLL／フィブロネクチンで被覆した、６０ｍｍの培養皿に播種し培養、培養７日後に、これら細胞から、ｍRNAを抽出し、ネスチン、ビメンチン、β−チューブリン、NF-M、およびGFAPの発現を調べた。 In RT-PCR, a large amount of spherical cell mass is cultured, that is, 30 spherical cell masses are seeded and cultured in a 60 mm culture dish coated with PLL / fibronectin. Extracts were examined for expression of nestin, vimentin, β-tubulin, NF-M, and GFAP.
［免疫組織化学］
カバーガラス上で、７日間培養した、細胞塊およびそれらから分裂した次世代を用いて、免疫組織化学分析を行った。PBSを用いて４％濃度にしたパラホルムアルデヒド（ワコー(Wako)）を用いて、培養細胞を１０分間固定した。PBSで洗浄した後、非特異反応を防ぐために３％のウシ血清アルブミン（BSA；シグマ（Sigma））、３０分間反応させ、さらに０．０３％のツイ−ン（Tween） ２０（BSA/PBST）で賦活化し、それぞれの一次抗体と室温で２時間反応させた。
[Immunohistochemistry]
Immunohistochemical analysis was performed using cell clusters and the next generation divided from them cultured on cover glass for 7 days. Cultured cells were fixed for 10 minutes with paraformaldehyde (Wako) at a concentration of 4% using PBS. After washing with PBS, 3% bovine serum albumin (BSA; Sigma) was reacted for 30 minutes to prevent non-specific reactions, followed by 0.03% Tween 20 (BSA / PBST) And reacted with each primary antibody at room temperature for 2 hours.
使用した抗体は：
マウスモノクローナルアンチビメンチン抗体（１：３００；ダコ（Dako））、
マウスモノクローナルアンチネスチン抗体（１：２００；BD）、
マウスモノクローナルアンチニューロフィラメント１４５抗体（NFM、１：４００；ケミコン（Chemicon）、テメキュラ、CA）、
ウサギポリクローナルアンチβ−IIIチューブリン抗体（１：５００；コバンス（Covance））、
ウサギポリクローナルアンチGFAP抗体（１：４００；ダコー（Dako））、
マウスモノクローナルアンチO4抗体（１：１０；ケミコン（Chemicon））、
マウスモノクローナルアンチｐ６３抗体（１：１０００、イムゲネクス（Imgenex））、
マウスモノクローナルアンチサイトケラチン３／１２抗体（１：４０００；プロゲン（Progen））、
ウサギポリクローナルアンチｐ７５NTR抗体（１：１０００；プロメガ（Promega））、
ウサギポリクローナルアンチペリフェリン(peripherin)抗体（１：１００；ケミコン（Chemicon））、
マウスモノクローナルアンチαＳＭＡ抗体（１：２５０；シグマ(Sigma)）、
マウスモノクローナルアンチBrdUフルオレセイン抗体（１：１００；ロシュ・ダイアグノスティクス（Roch Diagnostics、ベイサル（Basal）、スイス）
であった。
The antibodies used were:
Mouse monoclonal anti-vimentin antibody (1: 300; Dako),
Mouse monoclonal antinestin antibody (1: 200; BD),
Mouse monoclonal anti-neurofilament 145 antibody (NFM, 1: 400; Chemicon, Temecula, CA),
Rabbit polyclonal anti-β-III tubulin antibody (1: 500; Covance),
Rabbit polyclonal anti-GFAP antibody (1: 400; Dako),
Mouse monoclonal anti-O4 antibody (1:10; Chemicon),
Mouse monoclonal anti-p63 antibody (1: 1000, Imgenex),
Mouse monoclonal anticytokeratin 3/12 antibody (1: 4000; Progen),
Rabbit polyclonal anti-p75NTR antibody (1: 1000; Promega),
Rabbit polyclonal antiperipherin antibody (1: 100; Chemicon),
Mouse monoclonal anti-αSMA antibody (1: 250; Sigma),
Mouse monoclonal anti-BrdU fluorescein antibody (1: 100; Roche Diagnostics, Basal, Switzerland)
Met.
１次抗体との反応終了の後、PBSで洗浄、室温で１時間、BSA/PBSTで希釈した二次抗体と、細胞を反応させた。使用した二次抗体は：標識化ヤギアンチマウスIgG抗体（アレクサ・フロー(Alexa Flour) ４８８、１：２００；モレキュラー・プローブズ(Molecular Probes)）、標識化ヤギアンチウサギIgG抗体（アレクサ・フロー(Alexa Flour) ５９４、１：２００；モレキュラー・プローブズ(Molecular Probes)）。対比染色はヘキスト(Hoechst) ３３３４２（１：２０００、モレキュラー・プローブズ(Molecular Probes)）を用いて行った。その後PBSで洗浄し、レーザー走査型共焦点顕微鏡（フルオビュー(Fluoview) FV300 オリンパス Ver 4.2）によって、染色の程度を見た。アンチO4抗体およびp75NTR抗体を使用した場合、細胞の浸透処理は省略した。BrdUおよび神経マーカーβ−IIIチューブリンによる二重免疫染色は、最初にβ−IIIチューブリンによって染色し、赤色蛍光色素（アレキサ(Alexa) ５９４）によって可視化した。次いで、２M HCｌによって６０分間処理した後、FITC標識アンチBrdU抗体反応させた。倍率２００倍で、対比染色のみ陽性細胞と細胞とそれぞれの抗体陽性細胞の数を数えることによって、定量化した。1ウェル当たりの合計細胞数は、約５００であった。１実験当たり、２つの球状細胞塊を分析した（n=2の実験）。 After completion of the reaction with the primary antibody, the cells were reacted with the secondary antibody washed with PBS and diluted with BSA / PBST for 1 hour at room temperature. Secondary antibodies used were: labeled goat anti-mouse IgG antibody (Alexa Flour 488, 1: 200; Molecular Probes), labeled goat anti-rabbit IgG antibody (Alexa Flow (Alexa Flow Flour) 594, 1: 200; Molecular Probes). Counterstaining was performed using Hoechst 33342 (1: 2000, Molecular Probes). After washing with PBS, the degree of staining was observed with a laser scanning confocal microscope (Fluoview FV300 Olympus Ver 4.2). When anti-O4 antibody and p75NTR antibody were used, cell permeabilization treatment was omitted. Double immunostaining with BrdU and the neuronal marker β-III tubulin was first stained with β-III tubulin and visualized with a red fluorescent dye (Alexa 594). Then, after treatment with 2M HCl for 60 minutes, FITC-labeled anti-BrdU antibody was reacted. Quantification was performed by counting the number of positive staining cells and cells and their respective antibody positive cells at 200 × magnification. The total number of cells per well was about 500. Two globular cell masses were analyzed per experiment (n = 2 experiments).
［ＲＮＡの調製およびＲＴ−ＰＣＲ］
ＲＮＡの抽出は市販のキット（ＩＳＯＧＥＮ；ニッポンジーン、東京、日本）を用いて、初代球状細胞塊およびそれらから分裂した次世代を用いて行った。その後逆転写システム（プロメガ社(Promega Corporation)、東京、日本）を用いて、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。２０ｍｌ容量中の全ＲＮＡから、１ｍｇのｃＤＮＡを合成することができた。ＰＣRの反応液は、全量５０ｍｌとし、アンプリ・タック・ゴールド(Ampli Taq Gold)（パーキン・エルマー・セタス(Perkin Elmer Cetus)、エメリービル(Emeryville)、ＣＡ）を用いて行った。ＰＣＲは、まず、９５℃での９分間反応させDNAを一本鎖にした、その後９４℃で３０秒間の変性、次いで、６０℃で３０秒間の伸展を、サーマルサイクラー（Ｉ−サイクラー（Ｃｙｃｌｅｒ）；バイオラドラボラトリーズ(Bio Lad Laboratories)、ハーキユリーズ(Hercules)、ＣＡ）を用いて行った。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動し増幅を確認した。Semiquantitative ＲＴ−ＰＣＲは、オプティカルスキャナーを使用して、バンド密度を測定し、ＰＣＲ生成物中のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を定量した。３サイクル間隔で、各試料のＰＣＲ生成物の増幅率を調べた。増幅の線形範囲内で、適当な循環条件下、６組のＰＣＲ生成物を調製し、バンド密度を比較した。逆転写酵素をいれなかった試料は、生成物をまったく生成しなかった。このことは、ゲノムＤＮＡの汚染がないことを示唆する。使用したプライマーの塩基配列を表１に示す。
[Preparation of RNA and RT-PCR]
RNA extraction was performed using a commercially available kit (ISOGEN; Nippon Gene, Tokyo, Japan) using the primary spherical cell mass and the next generation divided from them. Subsequently, single-stranded cDNA was synthesized using a reverse transcription system (Promega Corporation, Tokyo, Japan). From total RNA in 20 ml volume, 1 mg cDNA could be synthesized. The PCR reaction was made up to a total volume of 50 ml and was performed using Ampli Taq Gold (Perkin Elmer Cetus, Emeryville, CA). PCR was performed by first reacting at 95 ° C. for 9 minutes to make the DNA single-stranded, followed by denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, followed by extension at 60 ° C. for 30 seconds, with a thermal cycler (I-Cycler) BioLad Laboratories, Hercules, CA). PCR products were electrophoresed on a 2% agarose gel to confirm amplification. Semiquantitative RT-PCR used an optical scanner to measure band density and quantify glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) in the PCR product. At three cycle intervals, the amplification rate of the PCR product of each sample was examined. Within the linear range of amplification, six sets of PCR products were prepared and compared for band density under appropriate cycling conditions. Samples that did not contain reverse transcriptase produced no product. This suggests that there is no contamination of genomic DNA. Table 1 shows the base sequences of the primers used.
結果
［角膜実質からの球状コロニーの単離］
ＥＧＦおよびｂＦＧＦ応答性前駆細胞を角膜実質から単離するために、我々は、神経幹細胞を分離する為に考案された技術、sphere forming assayを使用した。またこれらは多分化能角膜上皮幹細胞、多分化能皮膚前駆細胞、および内耳からの多分化能幹細胞の分離も可能である。（トロペペ(Tropepe) 2000、トーマ（Toma） 2001）。角膜実質から実質細胞を単離し、細胞密度（ミリリッター当たり５０個の生存細胞）を、未被覆ウェルで培養した。培養液には再凝集を防ぐために、メチルセルロースゲルマトリックス含有基礎培地を使用した。サイトケラチン３および１２遺伝子のＲＴ−ＰＣＲの結果から、角膜上皮細胞の混入なく、実質細胞が単離された（図１Ａ）。完全に単一細胞化されたことを、２細胞塊および３細胞塊の割合を数えることによって確認した。これにより、９９％を超える細胞が、単一細胞であることが示唆された（図１Ｂ）。培養3日後、小さな球状の浮遊細胞塊が形成された（図１Ｃ）。培養7日後、球状細胞塊はより大きく成長したのに対し、他の非増殖細胞は死滅した（図１Ｃ）。同一培養条件下において、ほとんどの球状細胞塊は、もともとあった細胞の凝集によるものではなく、増殖によって得られることが示唆された（グリッティ（Ｇｒｉｔｔｉ）ら １９９６、およびイノウエ(Inoue) Yら、未公表の観察）。また、細胞塊の大きさの増加が、増殖によるものであることを確認するために、培養期間の６日目と７日目の間に、ＢｒｄＵ、チミジンアナログを標識し、７日後に、大きくなった細胞塊内で、いくつかの細胞が、ＢｒｄＵの発現を確認した（図１Ｃ）。このことは、細胞が細胞塊に分かれたことを示す。同時に、これらの結果は、この方法で単離された、個々のＥＧＦおよびｂＦＧＦ応答性球状細胞塊のほとんどが、単一角膜実質細胞由来であったことを示唆する。
Results [Isolation of spherical colonies from corneal stroma]
In order to isolate EGF and bFGF responsive progenitor cells from corneal stroma, we used a sphere forming assay, a technique designed to isolate neural stem cells. They can also separate multipotent corneal epithelial stem cells, multipotent skin progenitor cells, and multipotent stem cells from the inner ear. (Tropepe 2000, Toma 2001). Parenchymal cells were isolated from corneal stroma and cell density (50 viable cells per milliliter) was cultured in uncoated wells. In order to prevent reaggregation, a basal medium containing methylcellulose gel matrix was used for the culture solution. From the results of RT-PCR of cytokeratin 3 and 12 genes, parenchymal cells were isolated without contamination of corneal epithelial cells (FIG. 1A). Complete single cell confirmation was confirmed by counting the proportions of 2-cell mass and 3-cell mass. This suggested that over 99% of the cells were single cells (FIG. 1B). After 3 days of culture, a small spherical floating cell mass was formed (FIG. 1C). After 7 days in culture, the spherical cell mass grew larger, while the other non-proliferating cells died (FIG. 1C). It has been suggested that under the same culture conditions, most globular cell masses are not due to the original cell aggregation but to be obtained by proliferation (Gretti et al. 1996, and Inoue Y et al. Observation of publication). In addition, in order to confirm that the increase in the size of the cell mass is due to proliferation, BrdU and thymidine analog were labeled between day 6 and day 7 of the culture period, and after 7 days, Within the resulting cell mass, several cells confirmed the expression of BrdU (FIG. 1C). This indicates that the cells have divided into cell clumps. At the same time, these results suggest that most of the individual EGF and bFGF responsive globular cell masses isolated in this way were derived from single keratocytes.
角膜実質から単離することができた球状細胞塊数を、培養物７日後に、数えた（図１Ｂ）。それにより、１ウェル当たり、１２５８±３５８個の球状細胞塊が生成されたことが分かった（５０，０００細胞）。一般的に１０ｍｍ径の角膜実質から、１．８×１０5個の細胞が単離され、それらは培養７日後には、合計で約５０００個の球状細胞塊を生成出来る。またこれらの球状細胞塊の直径は、おおよそ２００μｍ未満（<２００μｍ）であった。 The number of globular cell masses that could be isolated from the corneal stroma was counted after 7 days of culture (FIG. 1B). Thereby, it was found that 1258 ± 358 spherical cell clusters were generated per well (50,000 cells). In general, 1.8 × 10 5 cells are isolated from a corneal stroma having a diameter of 10 mm, and they can produce a total of about 5000 spherical cell clusters after 7 days of culture. The diameter of these spherical cell clusters was approximately less than 200 μm (<200 μm).
［球状コロニーおよびそれらの子孫における未成熟間葉細胞に対するマーカーの発現］
ネスチンは、脳、皮膚、網膜、および内耳由来の多分化能球状コロニー内の未成熟細胞に特異的ではないにもかかわらず、そのような未成熟細胞中で発現されるので、我々は、その後、ネスチンに対して、球状物を免疫染色した（レンダール(Lendahl) 1990、ゲージ(Gage) 2002）。更に、角膜実質細胞は、神経冠間葉線維芽細胞から得られるので、ビメンチン、間葉細胞に対するマーカー（図２B）、および、ｐ７５ニューロトロフィンレセプター（ｐ７５ ＮＴＲ）、神経冠幹細胞（ＮＣＳＣ類）に対するマーカー、の発現を、免疫細胞化学によって調べた。それらの結果から、球状物中のほとんどの細胞が、ネスチンおよびビメンチンに対する免疫反応性を有していたが、ｐ７５ポジティブではなかったことが示された。更に、５０個を超える球状コロニーを、ネスチンおよびビメンチンに対する免疫細胞化学分析に付したところ、それらの結果から、すべての球状コロニー中で、ネスチンおよびビメンチンが検出されたことが示された。ネスチンおよびビメンチンの発現も、ＲＴ−ＰＣＲによって検出されたのに対し、ｐ７５ ＮＴＲの発現は、球状物では検出されず、免疫細胞化学分析の結果が確認された。
[Expression of markers for immature mesenchymal cells in spherical colonies and their progeny]
Since nestin is not specific for immature cells within pluripotent globular colonies from the brain, skin, retina, and inner ear, we then expressed in such immature cells, Spheroids were immunostained against Nestin (Lendahl 1990, Gage 2002). Further, since keratocytes are obtained from neural crest mesenchymal fibroblasts, vimentin, a marker for mesenchymal cells (FIG. 2B), and p75 neurotrophin receptor (p75 NTR), neural crest stem cells (NCSCs) The expression of the marker for was examined by immunocytochemistry. The results showed that most cells in the spheroids had immunoreactivity for nestin and vimentin but were not p75 positive. Furthermore, when more than 50 globular colonies were subjected to immunocytochemical analysis for nestin and vimentin, the results showed that nestin and vimentin were detected in all globular colonies. Nestin and vimentin expression was also detected by RT-PCR, whereas p75 NTR expression was not detected in spheroids, confirming the results of immunocytochemical analysis.
球状細胞物から分裂した次世代が、間葉細胞の特徴を有するかを調べるために、培養７後の球状細胞塊を、ＰＬＬ／フィブロネクチンコ−トカバーガラスをひいた２４ウェルプレート中に播種し、１％ＦＢＳを含む分化培養液中で培養した。７日後、多くの細胞が、球状コロニーから伸展した。球状細胞塊から伸展した細胞の約９０％は、ビメンチン標識された。ビメンチン陽性細胞は、形態学的には、線維芽細胞の特徴を有していた。このことは、この条件下で、球状細胞塊が間葉線維芽細胞に分化誘導された事を示す（図３）。これに対して、分化７日後には、球状物から伸展した、ごくわずかな分化細胞だけが、ネスチン陽性であった（図３）。間葉系細胞のその他の特徴は、筋線維芽細胞を生じることであり、それらは、αＳＭＡによって免疫染色される。しかし、今回の条件下では、球状細胞塊およびそれらの次世代細胞は、それらは観察できなかった。Semiquantitative ＲＴ−ＰＣＲの結果から、ネスチンｍＲＮＡは、球状細胞塊中に十分あったが、分化した次世代では減少した。これに対し、ビメンチン遺伝子の発現は、次世代中では増加したことが免疫細胞化学の結果から確認された。まとめると、未成熟細胞のマーカーは、球状細胞塊中で、それらの次世代と比べて高レベルで発現されるのに対し、間葉細胞マーカーは、球状細胞塊中よりも、それらの子孫において、より高レベルで発現される。 In order to examine whether the next generation divided from the spherical cell material has the characteristics of mesenchymal cells, the spherical cell mass after the culture 7 is seeded in a 24-well plate ground with a PLL / fibronectin coat cover glass, The cells were cultured in a differentiation culture medium containing 1% FBS. After 7 days, many cells extended from the spherical colonies. About 90% of the cells that extended from the globular cell mass were labeled with vimentin. Vimentin positive cells were morphologically characteristic of fibroblasts. This indicates that the spherical cell mass was induced to differentiate into mesenchymal fibroblasts under these conditions (FIG. 3). In contrast, after 7 days of differentiation, only a few differentiated cells extended from the spheroids were nestin positive (FIG. 3). Another feature of mesenchymal cells is the generation of myofibroblasts, which are immunostained with αSMA. However, under these conditions, spherical cell clusters and their next generation cells could not be observed. From the results of Semiquantitative RT-PCR, nestin mRNA was sufficient in the spherical cell mass, but decreased in the differentiated next generation. In contrast, immunocytochemistry confirmed that vimentin gene expression increased in the next generation. In summary, immature cell markers are expressed at higher levels in the globular cell mass compared to their next generation, whereas mesenchymal cell markers are present in their progeny than in the globular cell mass. Expressed at higher levels.
［個々の球状細胞塊の子孫は、線維芽細胞、ニューロンおよびグリアに分化する］
次いで、我々は、球状細胞塊が、神経系細胞に分化するか否かを調べた。ＦＢＳを添加した培養液中で分裂した次世代を用いて培養した、球状細胞塊およびそれらの子孫を免疫細胞化学検索することにより、いくつかの細胞が、ニューロン、β-ＩＩＩチューブリンのマーカーに反応することが確認された（図３）。球状細胞塊および接着性子孫を、NF-M、成熟神経マーカーおよびペリフェリン、末梢神経中のニューロンのマーカーで免疫染色したところ、球状細胞塊の細胞の小さな部分、および、 1.0％の接着性子孫は、ＮＦ−Ｍに対して免疫反応陽性であったが（図３）、ペリフェリンに対しては陰性であった。予想したように、扁平な形態を有する、球状細胞塊内のいくつかの細胞および次世代細胞は、グリア細胞マーカーＧＦＡＰ陽性であった（図３）。球状コロニーおよび接着性子孫中には、Ｏ４、稀突起膠細胞に対するマーカー、に対して免疫反応性を有する細胞はなかった。我々は、１０個を超える球状細胞塊を分析することにより、個々の球状細胞塊のすべてが、ビメンチン陽性細胞、β-ＩＩＩチューブリンＮＦ−Ｍ陽性細胞、およびＧＦＡＰ陽性細胞を分化することが出来、これらのマーカー陽性細胞の割合は同様であったことを見出した。このことは、球状細胞塊間では、分化能の相違ないことを示唆する。
[The progeny of individual globular cell mass differentiate into fibroblasts, neurons and glia]
Next, we examined whether the spherical cell mass differentiates into nervous system cells. By immunocytochemical search of globular cell mass and their progeny cultured with the next generation divided in culture medium supplemented with FBS, some cells became markers for neurons, β-III tubulin A reaction was confirmed (FIG. 3). Spherical cell masses and adherent progeny were immunostained with NF-M, mature neuronal marker and peripherin, markers of neurons in peripheral nerves, and a small portion of cells in the spherical cell mass and 1.0% adherent progeny The immunoreactivity was positive for NF-M (FIG. 3), but negative for peripherin. As expected, some cells and next generation cells within the globular cell mass with a flat morphology were positive for the glial cell marker GFAP (FIG. 3). None of the spherical colonies and adherent progeny were immunoreactive to O4, a marker for oligodendrocytes. By analyzing more than 10 globular cell masses, we can differentiate all individual globular cell masses from vimentin positive cells, β-III tubulin NF-M positive cells, and GFAP positive cells. We found that the proportion of these marker positive cells was similar. This suggests that there is no difference in differentiation ability between spherical cell masses.
Semiquantitative ＲＴ−ＰＣＲにより、球状細胞塊および接着性子孫中で、β-ＩＩＩチューブリン遺伝子が同レベルで発現され、ＮＦ−ＭおよびＧＦＡＰ遺伝子は、接着性子孫と比べて、球状コロニー中で高レベルで発現されたことが示された。また、角膜輪部上皮細胞中で発現され、特に、インビボで、角膜輪部前駆体中に豊富に含まれる、Ｐ６３、サイトケラチン３、サイトケラチン１２分子に対する遺伝子は、ＲＴ−ＰＣＲでは検出されなかった(図4)。 Semiquantitative RT-PCR expressed the same level of β-III tubulin gene in globular cell mass and adherent progeny, while NF-M and GFAP genes were at higher levels in globular colonies compared to adherent progeny. It was shown that Also, RT-PCR does not detect genes for P63, cytokeratin 3, and cytokeratin 12 molecules that are expressed in corneal limbal epithelial cells and are particularly abundant in corneal limbal precursors in vivo. (Fig. 4).
上記の結果から、角膜実質細胞は、インビトロで単離した場合、ＥＧＦおよびｂＦＧＦに応答して球状細胞塊を形成する、細胞の分離した亜集団（角膜実質前駆細胞；ＣＳＰ類）を含むことが示された。球状細胞塊は、ネスチンおよびビメンチンの発現を特徴とする。ＦＢＳの存在下での培養では、球状細胞塊は、ネスチンを発現しなくなり、ビメンチン陽性間葉線維芽細胞ならびにニューロンおよびグリアに分化した。総合すると、我々の結果から、単離した角膜実質細胞は、ＥＧＦおよびｂＦＧＦ反応性細胞を含み、インビトロで間葉線維芽細胞およびニューロンに分化できる、球状細胞塊を生成することが示された。 From the above results, corneal parenchymal cells contain a separated subpopulation of cells (corneal parenchymal progenitor cells; CSPs) that, when isolated in vitro, form a spherical cell mass in response to EGF and bFGF. Indicated. The globular cell mass is characterized by the expression of nestin and vimentin. In culture in the presence of FBS, the globular cell mass no longer expressed nestin and differentiated into vimentin-positive mesenchymal fibroblasts and neurons and glia. Taken together, our results showed that isolated corneal parenchymal cells produce spherical cell masses that contain EGF and bFGF responsive cells and can differentiate into mesenchymal fibroblasts and neurons in vitro.
ＣＳＰ類は、多分化能を有していた。即ち、単一ＣＰＳ類に由来する、すべての球状細胞塊またはそれらの接着性子孫は、線維芽細胞およびニューロンに分化出来る。他の成体組織幹細胞の多分化能は、大人の脳、皮膚、角膜リンバル上皮および内耳からの、ＥＧＦおよびｂＦＧＦ反応性多分化能細胞の単離を示した研究に報告されている。ＣＰＳ類および角膜輪部縁の上皮から単離された神経前駆細胞（チャオ（Zhao）ら、2002）の性質は類似しているものの、多少相違点もあった。球状細胞塊は、ｐ６３を発現しなかった。このことは、CSP類は幹細胞とは異なることを示す。 CSPs had pluripotency. That is, all globular cell masses or their adherent progeny derived from a single CPS can differentiate into fibroblasts and neurons. The pluripotency of other adult tissue stem cells has been reported in studies showing the isolation of EGF and bFGF-responsive pluripotent cells from adult brain, skin, corneal limbal epithelium and inner ear. Although the properties of CPSs and neural progenitor cells isolated from the epithelium of the limbal rim (Zhao et al., 2002) are similar, there are some differences. The globular cell mass did not express p63. This indicates that CSPs are different from stem cells.
いくつかの研究は、成体の脳、皮膚、角膜リンバル上皮、および内耳からの、ニューロンおよびグリアを生成する能力を有する多数の子孫を生み出し得る、EGFおよびｂFGF反応性細胞の単離を報告している。単離した球状細胞塊は、未成熟細胞、系統制限(lineage restricted)前駆細胞、および分裂終了細胞を含む、その他の細胞からなると考えられる。例えば、近年の研究により、成体のネズミの前脳から単離した球状細胞塊が、成熟アストログリア(astroglial)マーカー、GFAPを発現することが示された。また、ヒトの脳から単離した球状細胞塊は、成熟ニューロンおよびグリアマーカーの免疫細胞化学によって示されるように、成熟ニューロンを含むその他細胞種を含むことが示された。このことは、培養中に、ヒトの組織から分離された球状細胞塊は、未成熟状態を維持するよりもむしろ、分化する傾向を有することを示唆する。球状細胞塊内の未成熟細胞は、娘コロニーを生じるので、CSP類が、二次球状細胞塊を生じなかったという事実は、ヒトＣＳＰ類の球状細胞塊は、系統関連(lineage-committed)細胞または分裂終了細胞からなることを示唆する。成熟神経細胞マーカーは、球状細胞塊と比べて、ビメンチンを高レベルで発現し、ＮＦ−ＭおよびＧＦＡＰを低レベルで発現する、分裂した次世代においても検出される。このことは、線維芽細胞は、神経細胞よりも、接着培養物中で、顕著に成長することを示唆する。総合的には、これらの結果は、ＣＳＰ類からの球状コロニーが、比較的低い増殖能を有する系統関連ニューロンまたは成熟ニューロンおよび強い増殖能を有する線維芽細胞を含むことの根拠となる。 Several studies have reported the isolation of EGF and bFGF responsive cells from adult brain, skin, corneal limbal epithelium, and inner ear that can produce a large number of progeny with the ability to generate neurons and glia. Yes. Isolated globular cell mass is thought to consist of other cells, including immature cells, lineage restricted progenitor cells, and cells that have completed division. For example, recent studies have shown that globular cell mass isolated from adult murine forebrain expresses the mature astroglial marker, GFAP. In addition, globular cell mass isolated from human brain was shown to contain other cell types including mature neurons, as shown by immunocytochemistry of mature neurons and glial markers. This suggests that during culturing, the globular cell mass isolated from human tissue has a tendency to differentiate rather than maintain an immature state. Since the immature cells within the globular cell mass give rise to daughter colonies, the fact that CSPs did not produce secondary globular cell masses is due to the fact that human CSPs globular cell masses are lineage-committed cells. Or suggests that it consists of cells that have completed division. Mature neuronal markers are also detected in the divided next generation, which expresses vimentin at high levels and NF-M and GFAP at low levels compared to globular cell mass. This suggests that fibroblasts grow significantly in adherent cultures more than neurons. Overall, these results provide evidence that globular colonies from CSPs contain lineage-related or mature neurons with relatively low proliferative capacity and fibroblasts with strong proliferative capacity.
我々の結果は、ＣＳＰ類は、それらのニッチ(niche)から除去し、ミトゲンの存在下で培養すると、角膜実質から分化転換し、そして、いくつかの理由で、多分化能を有するようになることを示唆する。第一に、CSP類の次世代は、神経マーカーニューロフィラメントおよびグリアマーカーGFAPによって免疫標識化された。重要なことには、近年の研究により、成体ヒト角膜（の切片）は、ニューロフィラメントおよびGFAPによっては、免疫染色されないことが示された（ハヤシ（Hayashi）ら、１９８６）。第二に、角膜（切片）がこれらのマーカーによって染色されなかったにもかかわらず、球状細胞塊は、ネスチンを発現した。単離した角膜実質細胞は、FBSの存在下で培養すると、ビメンチンを発現するが神経マーカーには反応しない。このことは、単一角膜間葉実質細胞は分裂して、FBSの存在下でより多くの間葉細胞を生み出すことを示唆する。よって、ニュ−ロスフェア法によって増殖された前駆細胞は、次世代の角膜間葉線維芽細胞とは、完全に相違している。 Our results show that when CSPs are removed from their niche and cultured in the presence of mitogens, they transdifferentiate from the corneal stroma and become pluripotent for several reasons. I suggest that. First, the next generation of CSPs was immunolabeled with the neuronal marker neurofilament and the glial marker GFAP. Importantly, recent studies have shown that adult human cornea is not immunostained by neurofilament and GFAP (Hayashi et al., 1986). Second, the globular cell mass expressed nestin even though the cornea (section) was not stained with these markers. Isolated keratocytes express vimentin but do not respond to neuronal markers when cultured in the presence of FBS. This suggests that single corneal mesenchymal cells divide and produce more mesenchymal cells in the presence of FBS. Therefore, progenitor cells grown by the neurosphere method are completely different from the next generation corneal mesenchymal fibroblasts.
中枢神経系（レイノルズ(Reynolds) 1992；ゲージ（Gage） 2000；ゲージ（Gage） 2002）、骨髄（ウッドバリー（Woodbury） 2000；サンチェス−ラモス(Sanchez-Ramos) 2000）、網膜（トロペペ（Tropepe） 2000、アハマド(Ahmad) 2000）、消化管（クルーガー(Kruger) 2002）、および内耳から単離された幹細胞が、生体神経幹細胞であることが報告された。しかし、 分離や入手が困難であるという問題は、依然として解明されないままである。トーマ（Toma）らは、皮膚は、その分離や入手が容易なことから、成体幹細胞の供給源となり得ることを示した。成体のヒト角膜は、神経幹細胞よりはるかに分離や入手が容易である（ゲージ（Gage） 2002）。更に、ヒト角膜実質細胞の使用は、ヒト胎児組織の使用を取り巻く多くの倫理的な問題を回避出来る可能性がある。従って、角膜実質からの前駆細胞の分離は、神経変性疾患のための、興味深い代替供給源である。 Central nervous system (Reynolds 1992; Gage 2000; Gage 2002), bone marrow (Woodbury 2000; Sanchez-Ramos 2000), retina (Tropepe 2000) Ahmad 2000), the digestive tract (Kruger 2002), and stem cells isolated from the inner ear were reported to be living neural stem cells. However, the problem of difficulty in separation and acquisition remains unclear. Toma et al. Have shown that skin can be a source of adult stem cells because of its ease of isolation and availability. Adult human cornea is much easier to isolate and obtain than neural stem cells (Gage 2002). Furthermore, the use of human corneal parenchymal cells may avoid many ethical issues surrounding the use of human fetal tissue. Therefore, the separation of progenitor cells from the corneal stroma is an interesting alternative source for neurodegenerative diseases.
本発明のヒト角膜実質幹細胞の培養物及びその調製方法は、移植可能なヒト角膜実質幹細胞の培養物を提供するものである。 The culture of human keratocyte stem cells and the method for preparing the same according to the present invention provide a transplantable culture of human keratocyte stem cells.
Claims (10)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004041894A JP4478477B2 (en) | 2004-02-18 | 2004-02-18 | Human corneal parenchymal stem cells and method for producing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004041894A JP4478477B2 (en) | 2004-02-18 | 2004-02-18 | Human corneal parenchymal stem cells and method for producing the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005229870A true JP2005229870A (en) | 2005-09-02 |
| JP4478477B2 JP4478477B2 (en) | 2010-06-09 |
Family
ID=35013456
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004041894A Expired - Lifetime JP4478477B2 (en) | 2004-02-18 | 2004-02-18 | Human corneal parenchymal stem cells and method for producing the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4478477B2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010138002A1 (en) * | 2009-05-29 | 2010-12-02 | Auckland Uniservices Limited | Methods for producing neuronal cells and uses thereof |
-
2004
- 2004-02-18 JP JP2004041894A patent/JP4478477B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010138002A1 (en) * | 2009-05-29 | 2010-12-02 | Auckland Uniservices Limited | Methods for producing neuronal cells and uses thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4478477B2 (en) | 2010-06-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10407663B2 (en) | Obtaining multipotent amnion-derived stem cell (ADSC) from amniotic membrane tissue without enzymatic digestion | |
| Yokoo et al. | Human corneal endothelial cell precursors isolated by sphere-forming assay | |
| AU2017216594B2 (en) | Culture method to obtain and maintain a pure or enriched population of mammalian neural stem cells and/or neural progenitor cells that are prone to differentiate into oligodendrocyte-lineage cells in vitro | |
| Yoshida et al. | Serum-free spheroid culture of mouse corneal keratocytes | |
| Bae et al. | Hypoxia enhances the generation of retinal progenitor cells from human induced pluripotent and embryonic stem cells | |
| EP2470645B1 (en) | Substantially pure human retinal progenitor, forebrain progenitor, and retinal pigment epithelium cell cultures and methods of making the same | |
| CN110396499B (en) | Method for inducing neural stem cells and application thereof | |
| Uchida et al. | Sphere formation and expression of neural proteins by human corneal stromal cells in vitro | |
| JP4439396B2 (en) | Method for producing neural cells | |
| US7901936B2 (en) | Method for stimulating self-renewal of neural stem cells and enhancing neurogenesis | |
| Li et al. | Engraftable neural crest stem cells derived from cynomolgus monkey embryonic stem cells | |
| KR20180062631A (en) | Composition for cell regeneration comprising cells that hypersecreate growth factors, and at least one of a neural stem cells, neurons and GABAergic neurons | |
| KR101690759B1 (en) | A Method for Obtaining Mesenchymal Stem Cells from Pluripotent Stem Cells | |
| JP4478477B2 (en) | Human corneal parenchymal stem cells and method for producing the same | |
| CN109852587B (en) | Preparation method of human Kekan syndrome specific adult stem cells | |
| US7572630B2 (en) | Method for differentiating primate embryonic stem cell into vascular cell | |
| US20240110151A1 (en) | Laminin Culture Protocol | |
| WO2022265086A1 (en) | Method for producing cerebral cortical cell preparation derived from human pluripotent stem cells | |
| CN115340982A (en) | Method for separating and purifying oligodendrocyte precursor cells in cortical region of newborn mouse | |
| Penton | Brown vs. White Adipose Tissue: Brown Adipose Tissue is a Source of Multipotent Stem Cells with Greater Propensity for Neurogenesis | |
| Slabá | Neurogenetický potenciál kmenových buněk u myší | |
| NZ712598B2 (en) | Culture method to obtain and maintain a pure or enriched population of mammalian neural stem cells and/or neural progenitor cells that are prone to differentiate into oligodendrocyte-lineage cells in vitro | |
| NZ611902B2 (en) | Culture method to obtain and maintain a pure or enriched population of mammalian neural stem cells and/or neural progenitor cells that are prone to differentiate into oligodendrocyte-lineage cells in vitro |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20061220 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070209 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091208 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100201 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100302 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100315 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4478477 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130319 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130319 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140319 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |