JP2005218301A

JP2005218301A - Method for base sequencing of nucleic acid

Info

Publication number: JP2005218301A
Application number: JP2002060634A
Authority: JP
Inventors: Jun Tomono; 潤友野; Osamu Takeda; 理武田; Masashige Kitagawa; 正成北川; Kiyozou Asada; 起代蔵浅田; Ikunoshin Kato; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2002-03-06
Filing date: 2002-03-06
Publication date: 2005-08-18
Also published as: WO2003074698A1; AU2003213377A1

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method that is suitable for a through-put system and affords the efficient sequencing of a gap region in which the sequencing cannot be carried out after performing most of base sequencing by conducting shotgun sequencing of a wide region such as the genomic sequence without preparing for a large amount of a DNA and without receiving restrictions because the DNA is modified. <P>SOLUTION: The method for analyzing the base sequence of the whole gap region with high accuracy is suitable for the high through-put system and characterized as follows. A primer selected from a primer pool composed of a plurality of primers having a specific base sequence is combined with a template-specific primer and nucleic acid amplification is carried out. The resultant amplified fragment is sequenced. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【本発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子工学分野で有用な、核酸の塩基配列決定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、主としてキャピラリータイプのゲルを用いた塩基配列決定装置の自動化が急速に進展し、９６サンプル、またはその４倍の３８４サンプルのＤＮＡ塩基配列を一台の装置で同時に決定することが可能になってきた。その結果、大量の塩基配列情報を容易に得ることができるようになり、数メガ塩基長の細菌のゲノムから、数ギガ塩基長のヒトのゲノムに至るまで、その配列が決定されるに至っている。このゲノム配列決定においては、ショットガンシークエンシング（ＳｈｏｔｇｕｎＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法と称される方法が主として用いられている。このショットガンシークエンシング法は、
（１）まずゲノムDNAを物理的手法、または適当な制限酵素を用いてランダムに切断して適当なサイズに断片化する。
（２）断片を大腸菌のシークエンス用ベクターに組み込んでクローン化する。
（３）クローン化されたそれぞれの断片の配列（通常数百塩基長）を、自動シークエンサーを用いて、該断片に隣接するベクター上のプライマーより決定する。
（４）得られた断片の塩基配列データをすべてコンピュータに入力し、コンピュータの配列検出能力を利用して、部分配列情報を連続した一つの配列に繋ぎ合わせる。
というステップを経て全ゲノム配列を決定するものである。シークエンサーを用いて得られた断片の配列情報を順次コンピュータに入力していくと、断片配列のオーバーラップの検出が行われ、断片同士が繋ぎ合わさったもの、すなわち、コンティグが形成されていくことになる。この配列をアセンブルする初期の段階では、フラグメントの増加につれてコンティグの数も増え、個々のコンティグの大きさも増加していく。
【０００３】
しかし、フラグメントの重なりの程度、すなわち、冗長度が高くなるに従いコンティグ長さの合計の増加は鈍くなり、冗長度が５を超えるあたりからはほとんど増加しなくなる。この段階からは、コンティグとコンティグの間の配列が決定されていない領域（以下、ギャップ領域と称す）に関して、選択的にその配列を決定していくこと、いわゆるギャップ領域の塩基配列を埋めていくこと（ギャップクローズ）が重要となる。ショットガンシークエンシング法を継続してギャップ領域の塩基配列を埋めようとすると、さらに多くの断片の塩基配列決定が必要となり、時間、労力、および費用がさらに多く費やされることになる。従って、ゲノム塩基配列決定の最終的な段階では、ショットガンシークエンシング法から離れ、別の手法を用いる必要がある。しかし、ショットガンシークエンシング法によって断片配列が得られた後、コンピュータによってその配列のオーバーラップを検出して配列をアセンブルする工程に対しては、ＤＮＡアセンブラーと呼ばれるソフトが複数開発されている一方で、ギャップクローズの作業に関しては、まだその方法論は確立されているとは言えず、各研究機関がより効率のよい方法の確立をめざして、試行錯誤が繰り返されている状況にある。
【０００４】
上述のギャップ領域は（Ａ）リンククローンのあるギャップ領域の場合、あるいは（Ｂ）リンククローンのないギャップ領域の場合の２種類に大別することができる。例えば、上記（Ａ）は、１つのコンティグと別のコンティグの配列が1つのクローン、いわゆるリンククローンを介してつながっている場合である。また（Ｂ）は、1つのコンティグがどのコンティグとつながっているか（連結しているか）明らかでない場合である。（Ａ）の場合には、塩基配列を決定したい領域は、すでにクローニングされた断片として存在するので、通常のプライマープール法やトランスポゾンを利用した方法で塩基配列を決定することができる。一方、（Ｂ）の場合には、ギャップ領域の塩基配列の決定を行うのは困難である。すなわち上記（Ｂ）の場合、まず塩基配列が既知の１つのコンティグが他の塩基配列が既知のどのコンティグと連結するのかを明らかにし、当該コンティグ間をつなぐブリッジ断片を得る必要がある。そのための手法の一つとして、例えば、すべてのコンティグの両末端領域からその外側に向けたプライマーを設計し、得られたプライマーをすべての組合せで一対ずつ混合してＰＣＲを行い、コンティグ間の連結の橋渡しをするブリッジ断片を得るという方法が挙げられる。該方法において、ブリッジ断片が得られたならば、その断片の両末端よりシークエンシングを行い、ギャップ配列がなくなるまでプライマーウォークを繰り返す。
【０００５】
しかしながらこの方法では、例えばコンティグの数が５０の場合には、１００の外向けのプライマーを設計することになり、_１００Ｃ_２−５０＝４，４００通りの組合せのＰＣＲを行うことになる。また、上記のように多大な労力を費やして多くのＰＣＲを行ったとしても、２つのコンティグが離れすぎている場合には当然両プライマー間の距離も長くなり、ＰＣＲでブリッジ断片を得ることができないことが起こりうる。逆に、２つのコンティグが非常に隣接している場合にも、ＰＣＲで断片を増幅できないことや、増幅断片を電気泳動でうまく検出、または同定できない（例えば、プライマーダイマーと区別できない）という問題点がある。
【０００６】
さらに、ＰＣＲの労力をより少なくして同じ目的を達成できる手法として、ワンサイテッド（ｏｎｅ−ｓｉｔｅｄ）ＰＣＲやインバース（ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲを用いて、コンティグの末端に隣接するさらに外側の配列をＰＣＲにより増幅し、この増幅断片の塩基配列を決定することによってギャップクローズを行う方法が挙げられる。しかしこの手法においては、一回の操作でギャップが埋まらなければ、ギャップが埋まるまでこの操作を繰り返す必要がある。さらに、増幅断片をコンティグの外側にさらに延長させることが可能か否かは、必要な制限酵素サイトが配列未知の領域内の適した位置にあるかどうかに依存するという問題点がある。また、未知領域内のどの位置にどのような制限酵素サイトがあるかを予め調べることは可能であるが、そのためには別の複数の操作を組み合わせた実験を行う必要があり、ゲノム配列決定のような多数の試料を同時並行的に自動的に処理する系、いわゆるハイスループットシステム（ＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＳｙｓｔｅｍ）には適しない。また、制限酵素としては通常６塩基認識型のものが用いられるが、ゲノムＤＮＡがメチル化等の修飾を受けているために、任意に選択した制限酵素ではゲノムＤＮＡがまったく切断されない場合がある。さらに、この手法では多量のＤＮＡが必要であり、例えば培養することが困難、または不可能なために、少量のゲノムＤＮＡしかその生物材料から得ることができない場合には適用できないという問題点がある。
【０００７】
また別法として、ＰＣＲ法でランダムに増幅した断片の塩基配列を解析する方法があり、ＴｅｌｅｎｉｕｓらのＤＯＰ―ＰＣＲ（ＤｅｇｅｎｅｒａｔｅＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｐｒｉｍｅｄＰＣＲ）法［ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、第１３巻、第７１８〜７２５頁（１９９２）］のようなデジェネレートプライマーのみを用いてＰＣＲする方法や、ＷｏｎｇらのＴＲＨＡ（Ｔａｇｇｅｄｒａｎｄｏｍｈｅｘａｍｅｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法［ヌクレイックアシッドリサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）、第２４巻、第１９号、第３７７８〜３７８３頁（１９９６）］のようなタグ配列のついた３’末端側がランダムな塩基配列であるプライマーのみを用いてＰＣＲする方法が挙げられる。しかしながら、いずれもの方法もランダムな配列を含むプライマーのみを用いてＰＣＲを行い、増幅された複数のラダーを一つずつ単離、精製した後にシークエンシングする方法であり、操作が繁雑である。また、Ｙａｏ−ＧｕａｎｇＬｉｕらのＴＡＩＬ−ＰＣＲ（ＴｈｅｒｍａｌａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｉｎｔｅｒｌａｃｅｄＰＣＲ）法［ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、第２５巻、第６７４〜６８１頁（１９９５）］では、鋳型特異的なプライマーと複数のａｒｂｉｔｒａｒｙｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｐｒｉｍｅｒをもちいて複雑な温度条件のもとにｓｅｍｉ−ＮｅｓｔｅｄＰＣＲを行う必要があり、温度条件の設定が難しく、操作が煩雑である。
【０００８】
さらに、国際公開第００／６６７６８号パンフレット記載の塩基配列決定方法は、ベクターにクローニングされた核酸断片又はその両末端の塩基配列が既知の断片にのみ適用可能なプライマーウオーキング法の一種であり、既知の塩基配列から核酸増幅用プライマーを塩基配列決定ごとに選択する必要があり、操作が煩雑である。
このように、シークエンシング法で生じるギャップ領域の塩基配列を解析する方法は、いずれも問題点をかかえており、またハイスループットシステムには適しない。そこで、ハイスループットシステムに好適であり、ギャップクローズ解析において、迅速、低コストである核酸の塩基配列解析方法が求められていた。
【０００９】
【発明が解決使用する課題】
本発明の目的は、ハイスループットシステムに好適であり、ゲノム配列等広い領域に対してショットガンシークエンスを行ってその大部分の塩基配列を決定した後、配列を決定することができなかったギャップ領域について、多量のＤＮＡを準備することなく、またＤＮＡが修飾されているために制約を受けることなく、その配列を効率よく決定できる方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究の結果、ギャップ領域を含むゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、特定の塩基配列を有する複数のプライマーからなるプライマープールから選択されるプライマーと、すでに配列が決定された領域の末端付近の配列に相補的な配列を有するプライマーを組み合わせて核酸増幅を行い、該増幅断片をシークエンシングすることによって、ギャップ領域全域の塩基配列を高精度で解析できることを明らかにし、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明の第１の発明は、核酸中の塩基配列が既知である領域を連結させるために塩基配列未知の領域の塩基配列を決定する方法であって、
（１）タグ配列を有する少なくとも２個のプライマーそれぞれと、鋳型核酸に特異的なプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下、鋳型核酸を増幅する工程、ここで該タグ配列を有するプライマーはプライマーの５'末端側にタグ配列を有し、３'末端側に３ヌクレオチド以上の特定の塩基配列を有し；該鋳型核酸に特異的なプライマーは、当該塩基配列が既知である領域にアニーリング可能なプライマーであり；および
（２）上記（１）工程で得られた増幅断片をシークエンシングする工程；
を包含することを特徴とする核酸の塩基配列決定方法に関する。
【００１２】
本発明の第２の発明は、核酸中の塩基配列が既知である領域を連結させるために塩基配列未知の領域の塩基配列を決定する方法に使用できるプライマープールであって、該プライマープールはタグ配列を有する少なくとも２個のプライマーを含有し、該タグ配列を有するプライマーは５'末端側にタグ配列を有し、３'末端側に３ヌクレオチド以上の特定の塩基配列を有し、前記塩基配列未知の領域の塩基配列決定方法が、
（１）タグ配列を有する少なくとも２個のプライマーそれぞれと、鋳型核酸に特異的なプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下、鋳型核酸を増幅する工程、ここで該タグ配列を有するプライマーはプライマーの５'末端側にタグ配列を有し、３'末端側に３ヌクレオチド以上の特定の塩基配列を有し；該鋳型核酸に特異的なプライマーは、当該塩基配列が既知である領域にアニーリング可能なプライマーであり；および
（２）上記（１）工程で得られた増幅断片をシークエンシングする工程；
を包含することを特徴とするプライマープールに関する。
【００１３】
本発明の第３の発明は、核酸中の塩基配列が既知である領域を連結させるために塩基配列未知の領域の塩基配列を決定する方法に使用できるプライマープールを含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定用キットであって、該プライマープールはタグ配列を有する少なくとも２個のプライマーを含有し、該タグ配列を有するプライマーは５'末端側にタグ配列を有し、３'末端側に３ヌクレオチド以上の特定の塩基配列を有し、該核酸の塩基配列決定方法が、
（１）タグ配列を有する少なくとも２個のプライマーそれぞれと、鋳型核酸に特異的なプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下、鋳型核酸を増幅する工程、ここで該タグ配列を有するプライマーはプライマーの５'末端側にタグ配列を有し、３'末端側に３ヌクレオチド以上の特定の塩基配列を有し；該鋳型核酸に特異的なプライマーは、当該塩基配列が既知である領域にアニーリング可能なプライマーであり；および
（２）上記（１）工程で得られた増幅断片をシークエンシングする工程；
を包含することを特徴とする核酸の塩基配列決定用キットに関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を、鋳型核酸を増幅するためにポリメラーゼチェーンリアクション（Polymerase Chain Reaction；ＰＣＲ）を使用する場合について説明する。しかし、本発明において使用される増幅方法はＰＣＲに限定されるものではなく、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、２つのプライマーによって規定される鋳型核酸の領域を特異的に増幅できるいずれもの方法を使用することができる。そのような方法としては例えば、国際公開第００／５６８７７号パンフレット記載のＩＣＡＮ法、日本国特許２０８７４９７号記載のＳＤＡ法、米国特許５８５４０３５号記載のＲＣＡ法などが挙げられる。
【００１５】
本明細書において、ギャップ領域とは、１つのコンティグと別のコンティグの配列が1つのクローン、いわゆるリンククローンを介して連結している場合、あるいは１つのコンティグがどのコンティグと連結しているか明らかでない場合のいずれの場合において、１つのコンティグと別のコンティグの塩基配列を連結するために塩基配列決定が必要な塩基配列未知の領域のことを言う。当該ギャップ領域は、単数でも複数であってもよい。
【００１６】
本明細書において鋳型核酸に特異的なプライマーとは、鋳型となる核酸中の塩基配列が既知の異なる２種類以上の領域を連結するための塩基配列未知の領域（ギャップ領域）に隣接した当該塩基配列既知の領域にアニーリング可能なプライマーのことを言う。従って、該プライマーは、その核酸伸長方向にギャップ領域が位置するように上記塩基配列既知の領域にアニーリング可能なものであれば、鋳型核酸の２本鎖のうちのいずれの鎖にアニーリングしても良い。
【００１７】
本明細書において、冗長度とは、ショットガンシークエンシング法により得られた塩基配列の総塩基数を、求めるべき配列の塩基数で割ることにより得られる値のことを言う。
【００１８】
本明細書において、コンティグとは、ショットガンシークエンシング法により得られた断片の塩基配列データをコンピューターを用いてアセンブルし、その配列のオーバーラップからつなぎ合わされて得られた連続した配列情報群のことを言う。
【００１９】
本明細書において、シークエンシングとは、ダイレクトシークエンシングあるいは適当なベクターに挿入されたＤＮＡ断片のシークエンシングのいずれもが含まれる。
【００２０】
本明細書においてプライマーとは、デオキシリボヌクレオチドあるいはリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのことをいい、アデニンヌクレオチド（Ａ）、グアニンヌクレオチド（Ｇ）、シトシンヌクレオチド（Ｃ）、チミンヌクレオチド（Ｔ）及びウラシルヌクレオチド（Ｕ）が例示される。また、該デオキシリボヌクレオチドは、ＰＣＲに使用できるものであれば非修飾あるいは修飾デオキシリボヌクレオチドのいずれを含んでいてもよい。
【００２１】
本明細書において３'末端側とは、核酸、例えば、プライマーにおいて、その中央より３'末端にかけての部分を示す。同様に、５'末端側とは、核酸においてその中央より５'末端にかけての部分を示す。
【００２２】
本明細書においてタグ配列とは、上記プライマーの５'末端側に配置された、あるいは該プライマーの中央より５'末端側に配置された、特定のプライマープールに含有される各プライマーに共通の塩基配列、あるいは各プライマーごとに異なる塩基配列のことをいい、特に限定はされないが、チェーンターミネーター法によるシークエンシング用プライマーがアニーリングするための配列やさらに制限エンドヌクレアーゼの酵素認識部位を含んでいてもよい。また、該タグ配列は、鋳型核酸にアニーリングしにくい塩基配列を選択することが好ましいが、鋳型ＤＮＡの配列によっては該塩基配列を構築することが困難な場合もあるので特に限定はされない。該タグ配列は、ダイレクトシークエンス用のプライマー配列として利用できる。
【００２３】
本発明の核酸の塩基配列決定方法は、特に限定はされないが、例えば、ショットガンシークエンシング法において生じるギャップ領域の塩基配列解析において有用である。本発明の方法は、特に限定はされないが、例えば、該ギャップ領域の鎖長が５０ｋｂ〜０．０５ｋｂの範囲、好ましくは１５ｋｂ〜０．０５ｋｂの範囲、特に好ましくは３ｋｂ〜０．０５ｋｂの範囲で好適に実施することができる。
【００２４】
本発明の方法で用いるプライマープールは、５'末端にタグ配列を有し、任意の塩基配列にアニーリングしうるプライマーのライブラリーである。特に、核酸の増幅方法におけるプライマープールから選択されるプライマーからのＤＮＡ鎖の伸長には、主に当該プライマーの３'末端側の配列が重要である。また、タグ配列には、鋳型にアニーリングしにくい塩基配列を選択することが本発明の方法における特異的増幅に効果的である。本発明の方法に使用されるプライマーのプールに包含されるプライマーは、鋳型核酸中の任意の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、その３'末端よりＤＮＡ鎖の伸長が可能である。すなわち、当該プライマーの３'末端側の塩基配列と鋳型ＤＮＡとが完全に相補的でない場合でもＤＮＡ鎖を伸長することが可能である。当該プライマーは通常、プール中の各プライマーが任意の塩基配列の鋳型核酸にほぼ均等に分散してアニーリングしうるように設計されることが好ましい。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配列」とは、使用される反応条件において鋳型となるＤＮＡにアニーリング可能な塩基配列を意味する。このようなプライマーの設計は、例えば、ラボマニュアルＰＣＲ（宝酒造発行、第１３頁〜第１６頁、１９９６年）を参考に設計することができる。また、市販のプライマー設計ソフト、例えば、ＯＬＩＧＯ^TM ＰｒｉｍｅｒＡｎａｌｙｓｉｓｓｏｆｔｗａｒｅ（宝酒造社製）を使用することができる。
【００２５】
本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、特に限定はされないが約１５ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの長さのものが好ましい。さらに好ましくは、約１８ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの長さのプライマーである。その塩基配列は使用される反応条件において鋳型核酸にアニーリングするように、実質的に鋳型核酸に相補的な配列であることが好ましい。本発明を何ら限定するものではないが、例えば、下記一般式で表す構造を持つオリゴヌクレオチドを本発明のプライマーとして使用することができる。
一般式：５'−タグ配列―Ｓ_a―３'
［式中、ＳはＧ、Ａ、ＴおよびＣからなる群より選択される１個の塩基または２個以上の塩基の混合物を表し、ａは３以上の整数を示す。ただし、Ｓ_ａ中少なくとも３個のＳはＧ、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＵからなる群より選択される１個の塩基を表す］。
【００２６】
まずプライマーの５’末端側のタグ配列としては、例えば、好ましくは１０ヌクレオチド以上、特に好ましくは、１５ヌクレオチド以上の塩基配列が配置される。該配列には、特に限定はないが、２次構造やダイマー構造を形成しない配列が好ましく、また、鋳型中の塩基配列と相補性のないものが特に好ましい。鋳型となる核酸の塩基配列に関する情報がある場合には、これを参考にして設計することができ、例えば鋳型核酸中の最も少ない６塩基の配列を組み合わせた約５０種類から選択することができる。次に、プライマーの３’末端側の特定の塩基配列（すなわちそれぞれの塩基が４種類の塩基から選択される１種の塩基のみからなる配列）については、鋳型核酸にアニーリングする必要があることから、少なくとも３ヌクレオチド以上、特に７ヌクレオチド以上が好ましい。さらに、該特定の塩基配列中には、その位置に特に限定はないが、例えば、特定の塩基配列の３’末端側、５'末端側あるいは内部にランダムな組み合わせ、Ｎ（Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃの混合）部分を含んでもよい。特該ランダムな塩基配列は、０から５ヌクレオチドであることが好ましい。また、該特定の塩基配列中の塩基をＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれかに固定したプライマープールであってもよく、例えば、特定の塩基配列が７ヌクレオチドの場合、３’末端側から１番目と７番目の塩基をＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれかに固定した場合が挙げられる。さらに、該塩基配列中のＧＣ含量は、５０％〜７０％であることが好ましく、例えば、特定の塩基配列が７ヌクレオチドの場合、４ヌクレオチドから５ヌクレオチドがＧ及び／又はＣになる場合が挙げられる。この場合、プライマー全体で２次構造をとらない、プライマーダイマーを形成しないということを指標にすることが好ましい。
【００２７】
特定の塩基配列を有するプライマーの鋳型にアニーリングするための特異的配列は、３ヌクレオチド以上、さらに好ましくは７ヌクレオチド以上にすることにより、後のＰＣＲにおいて効率的にシングルバンドを生成することができる。また、該プライマー中にランダムな塩基配列の部分を含んでもよい。特に、該プライマーにタグ配列を含むことが重要である。
本発明のプライマープールは、上記一般式に示す構造及び特定の塩基配列を有することにより、後のＰＣＲにおいて実質的にシングルバンドの増幅断片を生成し、また、いろいろな鎖長の増幅断片を得ることができる。
【００２８】
本発明のプライマープールの一つの態様としては、例えば、表１に示したような鋳型特異的な塩基配列が７ヌクレオチドであるもの、あるいは表２に示した鋳型特異的な塩基配列が６ヌクレオチドであるものが挙げられる。
また、本発明のプライマープールにおいて、例えば、鋳型特異的な塩基配列が７ヌクレオチドである場合、鋳型核酸への特異的アニーリングには、上記プライマーの特定の塩基配列７ヌクレオチド中、６ヌクレオチド以上が鋳型核酸にアニーリングすることが好ましい。特に限定はされないが、例えば上記特定の塩基配列が３'末端側にある場合において、特に該特定の配列の３'末端の６ヌクレオチドの配列のバリエーションが重要であり、プライマープールの各プライマー間で６ヌクレオチド中２ヌクレオチド以上異なることが好ましい。
【００２９】
本発明のプライマープール中のプライマーのそれぞれと鋳型特異的なプライマーを組み合わせてＰＣＲすることにより、全反応の少なくとも１０％以上の割合でいろいろなサイズのシングルバンドの増幅断片を得ることができ、該増幅断片をダイレクトシークエンスすることにより、目的の核酸の全塩基配列を決定する事ができる。
【００３０】
本発明のプライマープールは、特定の塩基配列、タグ配列そしてランダムな塩基配列の各部分を持つように、例えばアプライドバイオシステムズ社（ＡＢＩ社、Applied Biosystems Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであっても良い。
【００３１】
本発明の方法は、上記のプライマープールのそれぞれと鋳型特異的プライマーを組み合わせてギャップ領域もしくはその一部について核酸増幅を行い、得られた増幅断片の塩基配列を決定することにより実施される。
本発明の方法において、ＰＣＲで使用するＤＮＡポリメラーゼは、ｐｏｌＩ型、α型又は非ｐｏｌＩ非α型ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは混合型ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち複数のＤＮＡポリメラーゼの混合物）を用いることができる。特に限定はされないが、例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌＩ型）、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼあるいはＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（いずれもα型）等が好適に使用できる。さらに、例えば、タカラＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、タカラＬＡ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、タカラＺ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼあるいはＫＯＤｄａｓｈＤＮＡポリメラーゼ（いずれも混合型）等が好適に使用できる。
【００３２】
当該方法では、伸長反応となる基質となるヌクレオチド３リン酸には、ＰＣＲ法等に用いられるｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物が好適に使用できる。当該ｄＮＴＰは、使用されるＤＮＡポリメラーゼの基質となる限りにおいては、ｄＮＴＰのアナログ、例えば７−デアザ−ｄＧＴＰ等を含んでもよい。
本発明の方法において、鋳型となる核酸、すなわちその塩基配列を解析しようとするギャップ領域を含む核酸を鋳型とし、上記のプライマープールのそれぞれと鋳型特異的プライマーを組み合わせてＰＣＲすることにより、鋳型特異的プライマーを起点として、いろいろな鎖長の増幅断片を得ることができる。従って、該増幅断片をシークエンスすることにより、鋳型核酸の全塩基配列を解析することができる。
【００３３】
本発明の方法において、鋳型となる核酸は、生物のゲノムであってもよく、該ゲノムを物理的手段で切断した断片あるいは制限酵素で消化した断片、あるいは該断片をプラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ＢＡＣあるいはＹＡＣベクターに挿入したものも好適に使用できる。あるいは、逆転写反応で得られたｃＤＮＡであってもよい。
【００３４】
本発明の方法において鋳型となる核酸、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡは、当該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から調製、あるいは単離したものでもよい。さらに、上記試料を直接、本発明の核酸増幅反応に使用してもよい。このような核酸を含む試料には特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等）のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料（食品、生物学的製剤等）、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物であっても良い。該調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の核酸、あるいは特定の核酸分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が本発明に使用できる。さらに上記試料中に含まれる核酸が公知方法で増幅されたＤＮＡあるいはＲＮＡ等の核酸等も好適に使用できる。これら材料からの核酸含有調製物の調製方法には特に限定はなく、例えば、界面活性剤による溶解処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌、フレンチプレスの使用等により行うことができる。幾つかの例においては、さらに操作を加えて核酸を精製することが有利である（例えば、内在性ヌクレアーゼが存在するとき）。これらの例において、核酸の精製はフェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施される。
また、本発明の方法においては、鋳型となる核酸の由来に応じて使用するプライマープールを選択する工程を含んでいてもよい。
【００３５】
ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を鋳型としたい場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として本発明の方法を実施すればよい。本発明の方法に適用することができるＲＮＡには、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能なものであれば特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡの他、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、あるいは特定のＲＮＡ分子種が挙げられる。
上記の逆転写反応に使用されるプライマーは、使用される反応条件において鋳型ＲＮＡにアニールするものであれば特に限定されるものではない。該プライマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマー（特異的プライマー）の他、オリゴｄＴ（デオキシチミン）プライマーやランダムな配列を有するプライマー（ランダムプライマー）であっても良い。逆転写用プライマーの長さは、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは９ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。
上記の逆転写反応に使用される酵素としては、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が好適であり、例えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ（Thermus thermophilus）ＤＮＡポリメラーゼ等あるいは好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。特に限定はないが、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼが好ましく、Ｂ．ｓｔ（Bacillus stearothermophilus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ）、さらにＢｃａ(Bacillus caldotenax)由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ）が好ましい。例えば、ＢｃａＤＮＡポリメラーゼは、逆転写反応にマンガンイオンを必要とせず、また、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することができる。上記の逆転写酵素活性を有する酵素も、当該活性を有している範囲において天然体、変異体のいずれもが使用できる。
【００３６】
本発明の方法においてＰＣＲが好適に使用できる。該方法においては、目的とするＤＮＡ領域を増幅させるために例えば、二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つのステップからなる反応により、もしくは、“シャトルＰＣＲ”（『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白質核酸酵素」別冊、第４１巻、第５号、４２５頁〜４２８頁（１９９６））と呼ばれる、前述の３ステップ反応のうちプライマーのアニーリングおよび伸長のステップを同一温度で行なう２ステップ反応により実施することができる。また、本発明の方法におけるＰＣＲ条件は、国際公開第００／１４２１８号パンフレット等に記載の高速ＰＣＲ法の条件で実施してもよい。さらに、反応液中に国際公開第９９／５４４５５号パンフレット記載の酸性物質あるいは陽イオン錯体を含有させても良い。
【００３７】
上記のＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡ断片を適切なＤＮＡ塩基配列決定操作、例えばチェーンターミネーター法に供することにより、当該ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することができる。さらに、同様に決定された各ＰＣＲの増幅断片の塩基配列を総合し、解析することにより、鋳型に用いた核酸の塩基配列を広い範囲にわたって決定することができる。
本発明の方法においては、ＰＣＲ産物は、適当な精製方法、例えば、マイクロコン−１００（ミリポア社製）のようなＰＣＲ産物精製用の分子ふるいに供して、精製したのちにシークエンシングに供してもよい。
【００３８】
本発明において、塩基配列の解析は、ダイレクトシークエンシング法でも良いし、適当なベクターにクローニングした後シークエンシングする方法であってもよい。
特に限定はされないが、例えば適当なベクターにクローニングした後シークエンシングする方法においては、ギャップ領域をカバーする増幅断片をクローニングすることにより、後のシークエンシング解析において解析精度を向上させることができる。該クローニングの方法は、特に限定はされないが例えば、あらかじめ増幅断片の両端に制限酵素サイトを設けて、制限酵素処理を行い、５’突出あるいは３’突出末端化するかあるいは平滑末端化することにより、適当なベクターにライゲーションすることができる。該ベクターは、市販のベクターの何れもが好適に使用できる。特に限定はされないが、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８あるいはｐＵＣ１１９等が使用できる。また、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどの酵素を用いて得られたＰＣＲ産物では、該産物の３’末端にアデニン塩基が付加しており、これを利用してチミン塩基が付加されたベクターにライゲーションすることができる。該ベクターは、特に限定されないが例えば、ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−ｖｅｃｔｏｒが使用できる。
【００３９】
また、別法としてはダイレクトシークエンシング法が挙げられる。すなわち、上記の核酸増幅により増幅されたＤＮＡ断片は、その末端にプライマープールから選択されたプライマー由来のタグ配列を有している。従って、タグ配列と同じ塩基配列を有するプライマーを使用することにより、当該増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することができる。
【００４０】
本明細書においてダイレクトシークエンシングとは、増幅された核酸断片をベクターにクローン化することなく鋳型として使用して核酸の塩基配列を決定することをいう。従って、ダイレクトシークエンシングは、ＰＣＲなどの核酸増幅方法によって得られた断片を鋳型とし、この断片に相補的な配列を有するプライマー、例えばタグ配列と同じ塩基配列を有するプライマーを使用して、ジデオキシ法のような通常の塩基配列決定方法によって実施される。
さらに、上記のＰＣＲで得られた増幅断片を全てシークエンシング反応に供することにより、実質的にシングルバンドのＰＣＲ増幅断片が得られた反応については、バックグラウンドとして、プライマー同士の増幅断片がある場合においてもその塩基配列が解読される。すなわち、本発明において、実質的にシングルバンドの増幅断片とは、後のシークエンス解析において、その塩基配列を解析しうる程度に単一な増幅断片のことをいう。従って、本発明の方法においては、実質的にシングルバンドの増幅断片を得ることができる核酸増幅方法、特に限定はされないが、例えばＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法、ＲＣＡ法等のいずれもが好適に使用できる。この結果を総合的に解析することにより、元の鋳型核酸の全塩基配列を決定することができる。なお、ＰＣＲで増幅される領域の偏り等により、鋳型核酸の一部の領域で塩基配列を決定できない場合もある。その場合は、該領域について本発明の方法を再度実施するか、あるいは公知の方法を組み合わせて、例えば、得られた塩基配列情報に基づいて新たに合成したプライマー等を用いて該領域の塩基配列を決定することは当然のことである。
当該ダイレクトシークエンシング法は、上記ベクターへのクローニングが何らかの理由によりできない場合でも、核酸増幅で用いたプライマーのタグ配列を利用したダイレクトシークエンシングを行うことができることから、目的のギャップ領域の塩基配列を解析することができる。
【００４１】
本発明のギャップ領域の塩基配列の決定は、市販のシークエンサー例えば、ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を使用することができる。また、市販のシークエンシングキット、例えばＢｃａＢＥＳＴ^TM ＤｉｄｅｏｘｙＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（宝酒造社製）等を用いてもよい。
【００４２】
さらに好ましい態様としては、特に限定するものではないが、上記のＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動等に供して、増幅産物を分析したうえで、実質的にシングルバンドの増幅断片が得られている反応並びに本発明の塩基配列決定方法に適切な鎖長の反応を選択し、その反応生成物をダイレクトシークエンシングするかあるいは適当なベクターにクローニングした後にシークエンシングに供してもよい。上記工程を加えることにより、シークエンシングに供する増幅断片の数を減らし、塩基配列決定に要するコストを低減することができる。また、実質的にシングルバンドである反応を選択することにより、目的の増幅断片の分子（モル）数が他の増幅断片に比べて十分に多い場合、タグ配列を利用してシークエンス反応を行っても、ノイズが少なく信頼できるシークエンスデータを得ることができる。このように実質的にシングルバンドの増幅断片が得られている反応を選択するには、増幅断片の量を分子数に換算して評価することが重要である。特に限定するものではないが、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（宝酒造社製）の電気泳動装置等を有効に利用することができる。該装置では、増幅断片の量とその分子量を測定して、その値から各断片の量を分子数に換算して表示することができる。また、塩基配列を決定したい全領域に渡って重複が少なくできる限り均等に分散した塩基配列データが得られるよう、適切な鎖長の反応を選択することも配列決定の経済効率を上げるという観点から重要である。このような２つの選択の工程を自動化したシステムをコンピューターに組み込んで構築することにより、塩基配列決定に要する労力、および時間を飛躍的に低減させることができる。
【００４３】
さらに、前記の増幅産物の分析において、複数の増幅断片が認められた場合であっても、公知の方法によって１種の増幅断片、例えば最も増幅量の多い断片を単離し、これをシークエンシングに供することもできる。
【００４４】
また、プライマープールのプライマー全てと、既知の配列に特異的なプライマーとでＰＣＲ反応を行った場合に、全てのＰＣＲ反応に特異的なプライマー同士で増幅したサイズのバンドが現れることがある。この増幅断片はタグ配列を含まないため、目的の増幅断片にバックグラウンドとして含まれていても塩基配列を決定することができる。ただし、上記の特異的なプライマー同士での増幅は、目的とする核酸の増幅効率を低下させるため、このような増幅が生じないようなプライマー配列を設計することが好ましい。特に限定はされないが、鋳型となる配列によっても異なるが、一般にプライマーの３’末端がＡＴリッチであることが好ましい。
【００４５】
本発明の方法において使用するプライマープールは、上記のプライマーを含むプールである。これらのプライマーの全てと鋳型核酸中の既知配列に特異的なプライマーの組み合わせを用いて個々にＰＣＲを行うことができる。
【００４６】
さらに本発明は、前述のプライマープールを用いたギャップ領域の塩基配列を決定する方法を実施するためのキットを提供する。１つの実施態様において、該キットは、パッケージされた形態において、本発明のプライマープールの仕様及び、該プールを用いたＰＣＲ法のための指示書を含むことを特徴とする。さらに、本発明のプライマープール、ＤＮＡポリメラーゼ並びに該ポリメラーゼ用バッファーを含むキットは本発明の方法に好適に使用できる。また、本発明のプライマープール、市販のＤＮＡポリメラーゼ及びＰＣＲ用試薬を指示書に従って選択し、使用してもよい。さらに、鋳型がＲＮＡの場合の逆転写反応用試薬を含んでもよい。ＤＮＡポリメラーゼは、上記のＤＮＡポリメラーゼから選択することができる。また、ＰＣＲ用試薬は、市販のＰＣＲ用試薬であってもよく、実施例記載のバッファーを使用してもよい。さらに、塩基配列決定用試薬、例えばシークエンス用プライマーあるいはシークエンス用ポリメラーゼを含んでもよい。
【００４７】
本明細書において、本発明の方法を記載した指示書とは、本発明の方法を、当該キットの使用方法、推奨されるプライマープールの仕様、推奨される反応条件等に関する情報を第３者に提供するものの事を言い、該内容を記載した印刷物、例えばパンフレット又はリーフレット形式の取り扱い説明書のほか、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通じて、開示提供された情報も含まれる。
【００４８】
本発明の方法の核酸増幅工程において得られた増幅断片は、ｄＮＴＰ等を除いてシークエンシング反応を阻害しないレベルまで適度に純化した後、そのままダイレクトシークエンシングに供してもよいし、また、一旦適当なシークエンス用ベクターにクローニングしてプラスミド、またはファージＤＮＡを調製した後、それをシークエンシング反応に供してもよい。増幅断片をダイレクトシークエンシングによって塩基配列を決定する場合には、予めアガロース電気泳動等を行い、反応液中に生成している増幅産物が（複数ではなくて）一種類である反応液を選択することによって、シークエンシングの歩留りを高めることができる。もちろんこのような選択をせずに全ての反応液をシークエンサーにかけ、シークエンサーから出力されてきた段階で、クウォリティの高いシークエンスデータのみを選択するということもできる。
【００４９】
すでに配列が決定された領域から配列未知の領域に向けて塩基配列を決定する場合には、反応液を混合し、配列が決定された領域の末端付近の配列に相補的な配列を有する配列未知領域方向のプライマーを用いて、その方向で配列決定することができる。また、すでに配列が決定された領域側のみ、末端付近の配列に相補的な配列を有するプライマー２種を順次用いてＳｅｍｉ−ＮｅｓｔｅｄＰＣＲを行い、得られた増幅産物について上記と同様に塩基配列を解析してもよい。この場合には、すでに配列が決定された領域から配列未知の領域に向けてのシークエンシングにおいて、通常のＰＣＲ産物を用いる場合よりもクウォリティの高いデータが得えられることが期待できる。
【００５０】
増幅断片を一旦適当なシークエンス用ベクターにクローニングする場合には、反応液中に生成している増幅産物が（複数ではなくて）一種類である反応液を予め選択しておく必要はない。また、Ｓｅｍｉ−ＮｅｓｔｅｄＰＣＲで得られた増幅断片をクローニングしてもよく、この場合には、目的のギャップ領域を含んだ断片を増幅できる確度が通常のＰＣＲ増幅産物を用いる場合よりも高くなり、それに応じて、目的のギャップ領域をシークエンシングできる。当該クローニングは、必ずしも、特定の塩基配列を有する複数のプライマーからなるプライマープールから選択されるプライマーと、すでに配列が決定された領域の末端付近の配列に相補的な配列を有するプライマーを組み合わせて得られるそれぞれのＰＣＲ増幅産物ごとに行う必要はない。異なった組合せのプライマー対を用いて得られた増幅産物を混合し、これをシークエンシングべクターにクローニングしてクローンを得てもよい。このようにすると、ギャップ領域選択的なクローンライブラリーを得ることが可能になり、得られたクローンをショットガンシークエンシングの最終段階でのシークエンシングに用いることによって、ギャップクローズの達成を早めることができる。無細胞系でトランスポゾン配列をランダムに増幅断片に挿入した後、ベクターに増幅断片をクローニングすることもできる。このようにすると、シークエンシングの起点となるクローン内のプライマー配列が増加するため、シークエンシングの冗長度を高めることができる。
【００５１】
以上のように本発明を用いることにより、ハイスループットシステムに好適であり、ゲノム配列等広い領域に対してショットガンシークエンスを行ってその大部分の塩基配列を決定した後、配列を決定することができなかったギャップ領域について、多量のＤＮＡを準備することなく、またＤＮＡが修飾されているために制約を受けることなく、その塩基配列を効率よく決定することができる。
【００５２】
【実施例】
以下に本発明を実施例をもって具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
【００５３】
実施例１
ギャップ領域モデル系における本発明の方法を用いた大腸菌のゲノム配列の解析について検討した。まず、配列表の配列番号１および２に記載の大腸菌ゲノム増幅用ＥＳＰ−１およびＥＳＰ−２プライマーをＤＮＡ合成機を用いて合成した。当該プライマー対を使用して、大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行うと、２ｋｂｐの増幅断片が得られる。この領域をギャップ領域と想定して、上記ＥＳＰ−１およびＥＳＰ−２プライマーのそれぞれと表１に記載のプライマープールＩの各９２通りのプライマーのそれぞれとの組み合わせでＰＣＲを行った。
【００５４】
【表１】

【００５５】
上記プライマープールＩは、GGCACGATTCGATAACをタグ配列として持ち、
一般式（Ｉ）
５'−タグ配列-G-NN-SSSSSSS-３'
(Ｎ：Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃのミックス、Ｓ：ＧまたはＡまたはＴまたはＣから選択された特定の塩基配列である。)
で表されるプライマープールである。また、当該プールは、プライマーの３'末端７ヌクレオチドの特定の塩基配列、４⁷＝１６３８４通りの塩基配列の組み合わせよりＴｍ値、プライマーの２次構造、プライマーダイマーの形成の可能性を考慮して選択した、特定の９２種類の塩基配列を有するプライマープールである。
【００５６】
同様に、上記ＥＳＰ−１およびＥＳＰ−２プライマーのそれぞれと表２に記載のプライマープールＩＩの各９４通りのプライマーのそれぞれとの組み合わせでＰＣＲを行った。
【００５７】
【表２】

【００５８】
上記プライマープールＩＩは、GGCACGATTCGATAACをタグ配列として持ち、一般式（ＩＩ）
５'−タグ配列-G-NN-G-SSSSSS-３'
(Ｎ：Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃのミックス、Ｓ：ＧまたはＡまたはＴまたはＣから選択された特定の塩基配列である。)
で表されるプライマープールである。また、当該プールは、プライマーの３'末端６ヌクレオチドの特定の塩基配列、４^６＝４０９６通りの塩基配列の組み合わせよりＴｍ値、プライマーの２次構造、プライマーダイマーの形成の可能性を考慮して選択した、特定の９４種類の塩基配列を有するプライマープールである。
【００５９】
ＰＣＲ反応液組成を以下に示す。すなわち、タカラＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液（宝酒造社製）、各２００μＭｄＮＴＰ混合物、１０ｎｇの大腸菌ＪＭ１０９ゲノム（宝酒造社製）、それぞれ５ｐｍｏｌのプライマー、０．２５単位のタカラＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む反応液１０μｌを調製した。この反応液をＴａＫａＲａＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＧＰ（宝酒造社製）を用いて、９８℃ １秒、３８℃ １秒、７２℃ ３分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った後、該反応液１μｌを１％のアガロース電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって反応産物の確認を行った。確認を行った後、９２通りあるいは９４通りの反応液をそれぞれ一つにまとめ、反応産物をイソプロパノール沈澱で回収した。
【００６０】
回収した反応産物を再度３０μｌの滅菌蒸留水で懸濁し、このうち５μｌをＴａＫａＲａＢＫＬＫｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端化および５’末端のリン酸化を行なった。こうして調製した反応物混合液をｐＵＣ１１８ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰベクター（宝酒造社製）とともにＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてライゲーション反応を行い、その反応液でコンピテントセルＤＨ５α（宝酒造社製）を形質転換した。形質転換後、ＬａｃＺのアルファ相補性から外来遺伝子が挿入されたプラスミドを有する大腸菌を、それぞれのプライマーの組から２４個ずつランダムに拾い上げ、それぞれを液体培地で培養した後プラスミドを調製した。得られたプラスミドをｐＵＣ１１８上のプライマーを用いて両方向からその塩基配列についてＭｅｇａＢａｃｅ１０００を用いて、常法に従って決定した。
【００６１】
次に得られた配列情報をＤＮＡＳＩＳソフトウェア（宝酒造社製）を用いて解析し、ＥＳＰ−１およびＥＳＰ−２に挟まれた大腸菌ゲノム２ｋｂｐの塩基配列を決定した。この配列をＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｄ１０４８３に記載されている配列と比較したところ、両者は一致した。以上のことから本発明の方法が、ギャップ領域の塩基配列を解析するための方法として有用であることが示唆された。
【００６２】
【発明の効果】
本発明により、ハイスループットシステムに好適であり、ゲノム配列等広い領域に対してショットガンシークエンスを行ってその大部分の塩基配列を決定した後、配列を決定することができなかったギャップ領域について、多量のＤＮＡを準備することなく、またＤＮＡが修飾されているために制約を受けることなく、その配列を効率よく決定できる核酸の塩基配列決定方法、該方法のためのプライマープールならびに該方法のためのキットが提供される。
【００６３】
配列表フリーテキスト
SEQ ID NO:１:Designed oligonucleotide primer designated as ESP-1 to amplify a portion of Escherichia coli.
SEQ ID NO:2:Designed oligonucleotide primer designated as ESP-2 to amplify a portion of Escherichia coli.
【００６４】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Takara Shuzo Co., Ltd.
<120> The nucleotide sequence determination method of nucleic acids
<130> T-1739
<160> 2
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide primer designated as ESP-1 to amplify a portion of Escherichia coli.
<400> 1
gagccagaca tgaagctgat acgcggcata cataa 35
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide primer designated as ESP-2 to amplify a portion of Escherichia coli.
<400> 2
tccaggccgt atttctgacc gatcacatag tcgtc 35[0001]
[Technical field to which the present invention pertains]
The present invention relates to a nucleic acid base sequencing method useful in the field of genetic engineering.
[0002]
[Prior art]
In recent years, automation of a base sequence determination apparatus mainly using a capillary type gel has rapidly progressed, and it becomes possible to simultaneously determine the DNA base sequences of 96 samples, or 384 samples that are four times as large as that, with one apparatus. I came. As a result, a large amount of base sequence information can be easily obtained, and the sequence has been determined from the genome of a bacterium with a length of several megabases to the human genome with a length of several gigabases. . In this genome sequencing, a method called “Shotgun Sequencing” is mainly used. This shotgun sequencing method
(1) First, genomic DNA is randomly cut using a physical technique or an appropriate restriction enzyme and fragmented into an appropriate size.
(2) The fragment is incorporated into an E. coli sequencing vector and cloned.
(3) The sequence of each cloned fragment (usually several hundred bases long) is determined from primers on the vector adjacent to the fragment using an automatic sequencer.
(4) All the base sequence data of the obtained fragments are input to a computer, and the partial sequence information is connected to one continuous sequence using the sequence detection capability of the computer.
The whole genome sequence is determined through these steps. When the sequence information of the fragments obtained using the sequencer is sequentially input to the computer, the overlapping of the fragment sequences is detected, and the fragments are joined together, that is, the contig is formed. Become. In the initial stage of assembling this sequence, the number of contigs increases as the number of fragments increases, and the size of individual contigs also increases.
[0003]
However, as the degree of fragment overlap, that is, the redundancy increases, the increase in the total contig length becomes dull, and hardly increases after the redundancy exceeds 5. From this stage, for the region where the sequence between contigs is not determined (hereinafter referred to as gap region), the sequence is selectively determined, so-called gap region base sequence is filled. (Gap closing) is important. Continuing the shotgun sequencing method to fill in the base sequence of the gap region requires more base sequencing of the fragments, which consumes more time, effort, and expense. Therefore, in the final stage of genome sequencing, it is necessary to move away from the shotgun sequencing method and use another method. However, after a fragment sequence is obtained by the shotgun sequencing method, a software called DNA assembler has been developed for the process of detecting sequence overlap by a computer and assembling the sequence. As for the gap closing work, the methodology has not been established yet, and each research institution is in a situation where trial and error are repeated with the aim of establishing a more efficient method.
[0004]
The above gap regions can be broadly classified into two types: (A) a gap region with a linked clone, or (B) a gap region without a linked clone. For example, (A) is a case where the sequences of one contig and another contig are connected via one clone, so-called linked clone. (B) is a case where it is not clear to which contig one contig is connected (connected). In the case of (A), the region whose base sequence is desired to be determined exists as a cloned fragment, so that the base sequence can be determined by a normal primer pool method or a method using a transposon. On the other hand, in the case of (B), it is difficult to determine the base sequence of the gap region. That is, in the case of (B), first, it is necessary to clarify which contig with one known base sequence is linked to which other contig is known, and to obtain a bridge fragment that connects the contigs. As one of the techniques for this purpose, for example, primers are designed from both end regions of all contigs to the outside, PCR is performed by mixing the obtained primers in pairs in all combinations, and linking between contigs There is a method of obtaining a bridge fragment that bridges. In this method, if a bridge fragment is obtained, sequencing is performed from both ends of the fragment, and the primer walk is repeated until there is no gap sequence.
[0005]
However, in this method, for example, when the number of contigs is 50, 100 outward primers are designed, ₁₀₀ C ₂ −50 = 4,400 combinations of PCRs are performed. In addition, even if a large amount of labor is spent as described above, if the two contigs are too far apart, the distance between the two primers will naturally increase, and a bridge fragment can be obtained by PCR. Things that can't be done can happen. On the other hand, even when two contigs are very adjacent to each other, it is impossible to amplify the fragment by PCR, or the amplified fragment cannot be detected or identified well by electrophoresis (for example, cannot be distinguished from the primer dimer). There is.
[0006]
Furthermore, as a technique that can achieve the same purpose with less PCR effort, one-sit PCR and inverse PCR are used to amplify the outer sequence adjacent to the end of the contig by PCR. In addition, there is a method of performing gap closing by determining the base sequence of this amplified fragment. However, in this method, if the gap is not filled by one operation, it is necessary to repeat this operation until the gap is filled. Furthermore, whether or not the amplified fragment can be further extended to the outside of the contig has a problem that it depends on whether or not the necessary restriction enzyme site is at a suitable position in the region of unknown sequence. In addition, it is possible to examine in advance what kind of restriction enzyme site is located in the unknown region, but for that purpose, it is necessary to conduct an experiment combining a plurality of different operations, Such a system that automatically processes a large number of samples simultaneously in parallel, that is, a so-called High Throughput System is not suitable. As a restriction enzyme, a 6-base recognition type is usually used. However, since genomic DNA is modified such as methylation, genomic DNA may not be cleaved at all by an arbitrarily selected restriction enzyme. Furthermore, this method requires a large amount of DNA, and is difficult to cultivate, for example, and therefore cannot be applied when only a small amount of genomic DNA can be obtained from the biological material. .
[0007]
As another method, there is a method for analyzing the base sequence of a fragment randomly amplified by the PCR method, and the DOP-PCR (Degenerate Oligonide-primed PCR) method [Genomics, Vol. 13, Vol. 725 (1992)], a method of PCR using only a degenerate primer, such as the TRHA (Tagged random hexamer amplification) method [Nucleic Acids Research, Vol. 24, No. 19, No. 19 3778-3783 (1996)], a method of performing PCR using only a primer having a random base sequence on the 3 ′ end side with a tag sequence. However, any of these methods is a method in which PCR is performed using only a primer containing a random sequence, and a plurality of amplified ladders are isolated and purified one by one and then sequenced, and the operation is complicated. In addition, the TAIL-PCR (Thermal asymmetry interlaced PCR) method [Genomics, Vol. 25, pages 674-681 (1995)] of Yao-Guang Liu et al. Therefore, it is necessary to perform semi-Nested PCR under complicated temperature conditions, and it is difficult to set the temperature conditions and the operation is complicated.
[0008]
Furthermore, the base sequence determination method described in International Publication No. 00/66768 is a kind of primer walking method that can be applied only to a nucleic acid fragment cloned into a vector or a fragment whose base sequence at both ends is known. From this base sequence, it is necessary to select a primer for nucleic acid amplification for each base sequence determination, and the operation is complicated.
Thus, any method for analyzing the base sequence of the gap region generated by the sequencing method has problems and is not suitable for a high-throughput system. Therefore, there has been a demand for a nucleic acid base sequence analysis method that is suitable for a high-throughput system and that is quick and low-cost in gap close analysis.
[0009]
[Problems to be solved and used by the invention]
The object of the present invention is suitable for a high-throughput system, and after performing a shotgun sequence on a wide region such as a genome sequence to determine most of its base sequence, a gap region where the sequence could not be determined Is to provide a method capable of efficiently determining the sequence without preparing a large amount of DNA and without being restricted because the DNA is modified.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent research, the present inventors have used a genomic DNA containing a gap region as a template, a primer selected from a primer pool consisting of a plurality of primers having a specific base sequence, and a region already sequenced. The present invention was completed by clarifying that the base sequence in the entire gap region can be analyzed with high accuracy by performing nucleic acid amplification by combining primers having a sequence complementary to the sequence near the end and sequencing the amplified fragment. I let you.
[0011]
That is, the first invention of the present invention is a method for determining the base sequence of a region whose base sequence is unknown in order to link the regions of the nucleic acid whose base sequence is known,
(1) A step of amplifying a template nucleic acid in the presence of each of at least two primers having a tag sequence, a primer specific for the template nucleic acid and a DNA polymerase, wherein the primer having the tag sequence is the 5 ′ end of the primer A tag sequence on the side and a specific base sequence of 3 nucleotides or more on the 3 ′ end side; a primer specific for the template nucleic acid is a primer that can be annealed to a region where the base sequence is known ;and
(2) a step of sequencing the amplified fragment obtained in the step (1);
The present invention relates to a method for determining a nucleotide sequence of a nucleic acid.
[0012]
According to a second aspect of the present invention, there is provided a primer pool that can be used in a method for determining a base sequence of a region whose base sequence is unknown in order to connect regions having a known base sequence in a nucleic acid. At least two primers having a sequence, the primer having the tag sequence has a tag sequence on the 5 ′ end side, a specific base sequence of 3 nucleotides or more on the 3 ′ end side, and the base sequence How to determine the base sequence of an unknown region
(1) A step of amplifying a template nucleic acid in the presence of each of at least two primers having a tag sequence, a primer specific for the template nucleic acid and a DNA polymerase, wherein the primer having the tag sequence is the 5 ′ end of the primer A tag sequence on the side and a specific base sequence of 3 nucleotides or more on the 3 ′ end side; a primer specific for the template nucleic acid is a primer that can be annealed to a region where the base sequence is known ;and
(2) a step of sequencing the amplified fragment obtained in the step (1);
It relates to a primer pool characterized by including.
[0013]
A third invention of the present invention comprises a primer pool that can be used in a method for determining a base sequence of a region whose base sequence is unknown in order to link regions having a known base sequence in the nucleic acid. A kit for determining a base sequence, wherein the primer pool contains at least two primers having a tag sequence, the primer having the tag sequence has a tag sequence on the 5 ′ end side and 3 on the 3 ′ end side. A method for determining the base sequence of a nucleic acid having a specific base sequence of nucleotides or more,
(1) A step of amplifying a template nucleic acid in the presence of each of at least two primers having a tag sequence, a primer specific for the template nucleic acid and a DNA polymerase, wherein the primer having the tag sequence is the 5 ′ end of the primer A tag sequence on the side and a specific base sequence of 3 nucleotides or more on the 3 ′ end side; a primer specific for the template nucleic acid is a primer that can be annealed to a region where the base sequence is known ;and
(2) a step of sequencing the amplified fragment obtained in the step (1);
The present invention relates to a kit for determining the base sequence of a nucleic acid characterized by comprising:
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in the case where a polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify a template nucleic acid. However, the amplification method used in the present invention is not limited to PCR, and any method capable of specifically amplifying a template nucleic acid region defined by two primers in the presence of DNA polymerase should be used. Can do. Examples of such a method include the ICAN method described in International Publication No. 00/56877, the SDA method described in Japanese Patent No. 2087497, and the RCA method described in US Pat. No. 5,854,035.
[0015]
In this specification, the gap region is not clear when the sequence of one contig and another contig is linked via one clone, so-called linked clone, or to which contig one contig is linked. In any case, it refers to a region of unknown base sequence that requires base sequence determination in order to link the base sequences of one contig and another contig. The gap region may be singular or plural.
[0016]
In the present specification, a primer specific for a template nucleic acid is a base adjacent to a region (gap region) whose base sequence is unknown for linking two or more different regions with known base sequences in the template nucleic acid. A primer that can be annealed to a region of known sequence. Therefore, the primer can be annealed to any one of the two strands of the template nucleic acid as long as the primer can be annealed to the known base sequence so that the gap region is located in the nucleic acid extension direction. good.
[0017]
In this specification, redundancy refers to a value obtained by dividing the total number of base sequences obtained by the shotgun sequencing method by the number of bases to be determined.
[0018]
In this specification, a contig is a group of continuous sequence information obtained by assembling the base sequence data of fragments obtained by the shotgun sequencing method using a computer and joining them from the overlap of the sequences. Say.
[0019]
In this specification, the sequencing includes both direct sequencing and sequencing of a DNA fragment inserted into an appropriate vector.
[0020]
In the present specification, the primer refers to deoxyribonucleotide or an oligonucleotide containing ribonucleotide, and includes adenine nucleotide (A), guanine nucleotide (G), cytosine nucleotide (C), thymine nucleotide (T) and uracil nucleotide (U ) Is exemplified. Further, the deoxyribonucleotide may contain either unmodified or modified deoxyribonucleotide as long as it can be used for PCR.
[0021]
In the present specification, the 3 ′ end side indicates a portion from the center to the 3 ′ end of a nucleic acid, for example, a primer. Similarly, the 5 ′ terminal side indicates a part from the center to the 5 ′ terminal in the nucleic acid.
[0022]
In this specification, the tag sequence is a base common to each primer contained in a specific primer pool, which is arranged on the 5 ′ end side of the primer or arranged on the 5 ′ end side from the center of the primer. A sequence or a different base sequence for each primer, which is not particularly limited, but may contain a sequence for annealing a primer for sequencing by the chain terminator method and an enzyme recognition site for a restriction endonuclease. . In addition, it is preferable to select a base sequence that is difficult to anneal to the template nucleic acid, but the tag sequence is not particularly limited because it may be difficult to construct the base sequence depending on the sequence of the template DNA. The tag sequence can be used as a primer sequence for direct sequencing.
[0023]
The method for determining the nucleotide sequence of the nucleic acid of the present invention is not particularly limited, but is useful, for example, in analyzing the nucleotide sequence of the gap region generated in the shotgun sequencing method. The method of the present invention is not particularly limited. For example, the chain length of the gap region is in the range of 50 kb to 0.05 kb, preferably in the range of 15 kb to 0.05 kb, particularly preferably in the range of 3 kb to 0.05 kb. It can implement suitably.
[0024]
The primer pool used in the method of the present invention is a library of primers having a tag sequence at the 5 ′ end and capable of annealing to an arbitrary base sequence. In particular, for the extension of a DNA chain from a primer selected from a primer pool in a nucleic acid amplification method, the sequence on the 3 ′ end side of the primer is mainly important. For the tag sequence, it is effective for the specific amplification in the method of the present invention to select a base sequence that is difficult to anneal to the template. The primer included in the primer pool used in the method of the present invention has a base sequence that is substantially complementary to any base sequence in the template nucleic acid, and can extend the DNA strand from its 3 'end. It is. That is, even when the base sequence on the 3 ′ end side of the primer and the template DNA are not completely complementary, the DNA strand can be extended. In general, the primer is preferably designed so that each primer in the pool can be annealed by being dispersed almost evenly in a template nucleic acid having an arbitrary base sequence. Here, the “substantially complementary base sequence” means a base sequence that can be annealed to DNA as a template under the reaction conditions used. Such primers can be designed with reference to, for example, a laboratory manual PCR (Takara Shuzo, pages 13 to 16, 1996). Also, commercially available primer design software such as OLIGO ^TM Primer Analysis software (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) can be used.
[0025]
The oligonucleotide primer used in the method of the present invention is not particularly limited, but preferably has a length of about 15 nucleotides to about 100 nucleotides. More preferably, the primer is about 18 to about 40 nucleotides in length. The base sequence is preferably a sequence that is substantially complementary to the template nucleic acid so that it anneals to the template nucleic acid under the reaction conditions used. Although this invention is not limited at all, For example, the oligonucleotide which has a structure represented with the following general formula can be used as a primer of this invention.
General formula: 5′-tag sequence-S _a ―3 '
[Wherein S represents one base selected from the group consisting of G, A, T and C or a mixture of two or more bases, and a represents an integer of 3 or more. However, S _a Of which at least three S represent one base selected from the group consisting of G, A, T, C and U].
[0026]
First, as a tag sequence on the 5 ′ end side of the primer, for example, a base sequence of preferably 10 nucleotides or more, particularly preferably 15 nucleotides or more is arranged. The sequence is not particularly limited, but a sequence that does not form a secondary structure or dimer structure is preferable, and a sequence that is not complementary to the base sequence in the template is particularly preferable. If there is information on the base sequence of the nucleic acid to be used as a template, it can be designed with reference to this, and for example, it can be selected from about 50 types combining the sequence of the least 6 bases in the template nucleic acid. Next, a specific base sequence on the 3 ′ end side of the primer (that is, a sequence consisting of only one base selected from four types of each base) needs to be annealed to the template nucleic acid. , Preferably at least 3 nucleotides or more, particularly 7 nucleotides or more. Further, the position of the specific base sequence is not particularly limited. For example, a random combination of N (G, A, T, 3 ′ end side, 5 ′ end side or the inside of the specific base sequence , C) portion. The random base sequence is preferably 0 to 5 nucleotides. Further, it may be a primer pool in which the base in the specific base sequence is fixed to any one of A, G, C, and T. For example, when the specific base sequence is 7 nucleotides, 1 from the 3 ′ end side And the seventh and seventh bases are fixed to any one of A, G, C, and T. Furthermore, the GC content in the base sequence is preferably 50% to 70%. For example, when the specific base sequence is 7 nucleotides, 4 to 5 nucleotides may be G and / or C. It is done. In this case, it is preferable to use as an index that the entire primer does not take a secondary structure and does not form a primer dimer.
[0027]
By setting the specific sequence for annealing to the template of the primer having a specific base sequence to 3 nucleotides or more, more preferably 7 nucleotides or more, a single band can be efficiently generated in later PCR. Further, the primer may contain a portion of a random base sequence. In particular, it is important to include a tag sequence in the primer.
The primer pool of the present invention has a structure shown in the above general formula and a specific base sequence, so that it generates a substantially single-band amplified fragment in subsequent PCR and obtains amplified fragments of various chain lengths. be able to.
[0028]
As one embodiment of the primer pool of the present invention, for example, the template-specific base sequence shown in Table 1 has 7 nucleotides, or the template-specific base sequence shown in Table 2 has 6 nucleotides. Some are listed.
In the primer pool of the present invention, for example, when the template-specific base sequence is 7 nucleotides, the specific annealing to the template nucleic acid requires 6 nucleotides or more in the specific nucleotide sequence 7 nucleotides of the primer. It is preferred to anneal to the nucleic acid. Although there is no particular limitation, for example, when the specific base sequence is on the 3 ′ end side, the variation of the 6 nucleotide sequence at the 3 ′ end of the specific sequence is particularly important. It is preferable that 2 or more nucleotides differ among 6 nucleotides.
[0029]
By combining each primer in the primer pool of the present invention with a template-specific primer and performing PCR, single-band amplified fragments of various sizes can be obtained at a rate of at least 10% of the total reaction, By directly sequencing the amplified fragment, the entire base sequence of the target nucleic acid can be determined.
[0030]
The primer pool of the present invention has, for example, a DNA synthesizer type 394 of Applied Biosystems Inc. (ABI, Applied Biosystems Inc.) so as to have a specific base sequence, a tag sequence, and a random base sequence. It can be synthesized by the phosphoramidite method. As another method, there are a phosphoric acid triester method, an H-phosphonate method, a thiophosphonate method, and the like, but they may be synthesized by any method.
[0031]
The method of the present invention is carried out by combining each of the above primer pools with a template-specific primer, performing nucleic acid amplification on the gap region or a part thereof, and determining the base sequence of the obtained amplified fragment.
In the method of the present invention, a pol I type, α type or non-pol I non α type DNA polymerase, or a mixed DNA polymerase (that is, a mixture of a plurality of DNA polymerases) can be used as a DNA polymerase used in PCR. Although not particularly limited, for example, Taq DNA polymerase (pol I type), KOD DNA polymerase, Pfu DNA polymerase (all of which are α type) or the like can be preferably used. Furthermore, for example, Takara ExTaq DNA polymerase, Takara LA-Taq DNA polymerase, Takara Z-Taq DNA polymerase or KOD dash DNA polymerase (all of which are mixed types) can be preferably used.
[0032]
In this method, dNTPs used for PCR and the like, that is, a mixture of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP can be suitably used for the nucleotide triphosphate serving as a substrate for the extension reaction. The dNTP may contain a dNTP analog such as 7-deaza-dGTP as long as it is a substrate for the DNA polymerase used.
In the method of the present invention, a template-specific nucleic acid is obtained by PCR using a template nucleic acid, that is, a nucleic acid containing a gap region whose base sequence is to be analyzed, as a template and combining each of the above primer pools with a template-specific primer. Amplified fragments of various chain lengths can be obtained starting from specific primers. Therefore, the entire base sequence of the template nucleic acid can be analyzed by sequencing the amplified fragment.
[0033]
In the method of the present invention, the template nucleic acid may be a genome of an organism, a fragment obtained by cleaving the genome with physical means, a fragment digested with a restriction enzyme, or the fragment, a plasmid, phage, phagemid, cosmid. Those inserted into a BAC or YAC vector can also be preferably used. Alternatively, it may be cDNA obtained by reverse transcription reaction.
[0034]
The nucleic acid that serves as a template in the method of the present invention, that is, DNA or RNA, may be prepared or isolated from any sample that may contain the nucleic acid. Furthermore, the above sample may be directly used for the nucleic acid amplification reaction of the present invention. The sample containing such nucleic acid is not particularly limited, and examples thereof include whole blood, serum, buffy coat, urine, feces, cerebrospinal fluid, semen, saliva, tissue (eg, cancer tissue, lymph node, etc.), cell, and the like. Biological samples such as cultures (eg mammalian cell cultures and bacterial cultures), nucleic acid containing samples such as viroids, viruses, bacteria, molds, yeasts, plants and animals, microorganisms such as viruses or bacteria May be contaminated or infected (food, biological preparations, etc.), or samples that may contain organisms such as soil and wastewater. Moreover, the nucleic acid containing preparation obtained by processing the said sample etc. by a well-known method may be sufficient. As the preparation, for example, a cell disrupted product, a sample obtained by fractionating the same, a nucleic acid in the sample, or a specific nucleic acid molecule group, for example, a sample enriched with mRNA can be used in the present invention. Furthermore, a nucleic acid such as DNA or RNA obtained by amplifying the nucleic acid contained in the sample by a known method can be suitably used. The method for preparing a nucleic acid-containing preparation from these materials is not particularly limited, and can be carried out by, for example, dissolution treatment with a surfactant, ultrasonic treatment, shaking and stirring using glass beads, use of a French press, or the like. In some instances, it may be advantageous to further manipulate and purify the nucleic acid (eg, when an endogenous nuclease is present). In these examples, nucleic acid purification is performed by known methods such as phenol extraction, chromatography, ion exchange, gel electrophoresis, or density gradient centrifugation.
In addition, the method of the present invention may include a step of selecting a primer pool to be used depending on the origin of the nucleic acid to be a template.
[0035]
When it is desired to use a nucleic acid having a sequence derived from RNA as a template, the method of the present invention may be carried out using a cDNA synthesized by a reverse transcription reaction using the RNA as a template as a template. The RNA that can be applied to the method of the present invention is not particularly limited as long as the primer used for the reverse transcription reaction can be prepared. In addition to the total RNA in the sample, mRNA, tRNA, rRNA, etc. An RNA molecule group or a specific RNA molecular species can be mentioned.
The primer used for the reverse transcription reaction is not particularly limited as long as it anneals to the template RNA under the reaction conditions used. The primer may be a primer having a base sequence complementary to a specific template RNA (specific primer), an oligo dT (deoxythymine) primer, or a primer having a random sequence (random primer). The length of the primer for reverse transcription is preferably 6 nucleotides or more, more preferably 9 nucleotides or more from the viewpoint of specific annealing, and preferably 100 nucleotides or less from the viewpoint of oligonucleotide synthesis. More preferably, it is 30 nucleotides or less.
The enzyme used in the reverse transcription reaction is not particularly limited as long as it has cDNA synthesis activity using RNA as a template. For example, avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase (AMV RTase), Moloney murine Examples include reverse transcriptases of various origins such as leukemia virus-derived reverse transcriptase (MMLV RTase) and rous-associated virus 2 reverse transcriptase (RAV-2 RTase). In addition, a DNA polymerase having reverse transcription activity can also be used. For the purpose of the present invention, an enzyme having reverse transcription activity at high temperature is suitable. For example, a DNA polymerase derived from a Thermus bacterium, a Tth (Thermus thermophilus) DNA polymerase, or a DNA polymerase derived from a thermophilic Bacillus bacterium. Can be used. Although not particularly limited, for example, a DNA polymerase derived from a thermophilic Bacillus bacterium is preferable. A DNA polymerase (Bst DNA polymerase) derived from st (Bacillus stearothermophilus) and a DNA polymerase (Bca DNA polymerase) derived from Bca (Bacillus caldotenax) are preferred. For example, Bca DNA polymerase does not require manganese ions for reverse transcription reaction, and can synthesize cDNA while suppressing secondary structure formation of template RNA under high temperature conditions. As for the enzyme having the above-mentioned reverse transcriptase activity, either a natural body or a mutant can be used as long as it has the activity.
[0036]
PCR can be suitably used in the method of the present invention. In this method, in order to amplify a target DNA region, for example, dissociation (denaturation) of a double-stranded template DNA into a single strand, annealing of a primer into a single-stranded template DNA, synthesis of a complementary strand from a primer (Elongation) by a reaction consisting of three steps, or “shuttle PCR” (“PCR method forefront”, “Protein Nucleic Acid Enzyme” separate volume, Vol. 41, No. 5, pages 425 to 428 (1996)) Among the above-described three-step reactions called “priming”, the primer annealing and extension steps can be performed by a two-step reaction at the same temperature. Moreover, you may implement PCR conditions in the method of this invention on the conditions of the high-speed PCR method as described in international publication 00/14218 pamphlet etc. Further, an acidic substance or a cation complex described in WO99 / 54455 pamphlet may be contained in the reaction solution.
[0037]
By subjecting the amplified DNA fragment obtained by the above PCR to an appropriate DNA base sequence determination operation such as the chain terminator method, the base sequence of the DNA fragment can be determined. Furthermore, the base sequence of the nucleic acid used as the template can be determined over a wide range by synthesizing and analyzing the base sequences of the amplified fragments of PCR determined in the same manner.
In the method of the present invention, the PCR product is subjected to an appropriate purification method, for example, a molecular sieve for PCR product purification such as Microcon-100 (manufactured by Millipore), purified, and then subjected to sequencing. Also good.
[0038]
In the present invention, the analysis of the base sequence may be a direct sequencing method or a method of sequencing after cloning into an appropriate vector.
Although there is no particular limitation, for example, in the method of sequencing after cloning into an appropriate vector, the accuracy of analysis can be improved in subsequent sequencing analysis by cloning an amplified fragment covering the gap region. The cloning method is not particularly limited. For example, a restriction enzyme site is previously provided at both ends of the amplified fragment and treated with a restriction enzyme to form a 5 ′ overhang, a 3 ′ overhang, or a blunt end. Can be ligated into an appropriate vector. Any commercially available vector can be suitably used as the vector. Although not particularly limited, pUC18, pUC19, pUC118, or pUC119 can be used. In addition, in a PCR product obtained using an enzyme such as Taq DNA polymerase, an adenine base is added to the 3 ′ end of the product, and this can be used for ligation to a vector having a thymine base added. it can. The vector is not particularly limited, and for example, pT7 Blue T-vector can be used.
[0039]
Another method is a direct sequencing method. That is, the DNA fragment amplified by the nucleic acid amplification has a tag sequence derived from a primer selected from the primer pool at its end. Therefore, the base sequence of the amplified DNA fragment can be determined by using a primer having the same base sequence as the tag sequence.
[0040]
In the present specification, direct sequencing refers to determining the nucleotide sequence of a nucleic acid using the amplified nucleic acid fragment as a template without cloning it into a vector. Therefore, direct sequencing uses a fragment obtained by a nucleic acid amplification method such as PCR as a template, and uses a primer having a sequence complementary to this fragment, for example, a primer having the same base sequence as the tag sequence, and the dideoxy method. It is carried out by a usual base sequencing method such as
Furthermore, in the case of a reaction in which a single-band PCR amplified fragment was obtained by subjecting all the amplified fragments obtained by the above PCR to a sequencing reaction, there is an amplified fragment between primers as a background. The base sequence is also deciphered. That is, in the present invention, a substantially single-band amplified fragment refers to an amplified fragment that is single enough to analyze its base sequence in a subsequent sequence analysis. Therefore, in the method of the present invention, a nucleic acid amplification method capable of obtaining a substantially single-band amplified fragment is not particularly limited, but for example, any of PCR method, ICAN method, SDA method, RCA method and the like are suitable. Can be used for By comprehensively analyzing this result, the entire base sequence of the original template nucleic acid can be determined. In some cases, the base sequence cannot be determined in a partial region of the template nucleic acid due to the bias of the region amplified by PCR. In that case, repeat the method of the present invention for the region, or combine known methods, for example, using a newly synthesized primer or the like based on the obtained base sequence information. It is natural to decide.
The direct sequencing method can perform direct sequencing using the tag sequence of the primer used in nucleic acid amplification even when cloning into the above vector is impossible for some reason. Can be analyzed.
[0041]
The base sequence of the gap region of the present invention can be determined using a commercially available sequencer such as Mega BACE 1000 (Amersham Pharmacia Biotech). Commercially available sequencing kits such as BcaBEST ^TM A Didioxy Sequencing kit (Takara Shuzo) may be used.
[0042]
Although it is not particularly limited as a preferred embodiment, the above PCR amplification product is subjected to agarose electrophoresis or the like, and the amplification product is analyzed to obtain a substantially single-band amplified fragment. In addition, a reaction having an appropriate chain length may be selected for the nucleotide sequence determination method of the present invention, and the reaction product may be subjected to direct sequencing or may be subjected to sequencing after cloning into an appropriate vector. By adding the above steps, the number of amplified fragments to be subjected to sequencing can be reduced, and the cost required for base sequence determination can be reduced. In addition, by selecting a reaction that is substantially a single band, if the number of molecules (mole) of the target amplified fragment is sufficiently large compared to other amplified fragments, a sequence reaction is performed using the tag sequence. However, reliable sequence data with less noise can be obtained. In order to select a reaction in which a substantially single-band amplified fragment is obtained in this way, it is important to evaluate the amount of amplified fragment in terms of the number of molecules. Although not particularly limited, for example, an electrophoresis apparatus of Agilent 2100 Bioanalyzer (Takara Shuzo Co., Ltd.) can be used effectively. In this apparatus, the amount of the amplified fragment and its molecular weight can be measured, and the amount of each fragment can be converted into the number of molecules from the value and displayed. In addition, from the viewpoint of increasing the economic efficiency of sequencing, it is also possible to select a reaction with an appropriate chain length so that base sequence data can be obtained as evenly dispersed as possible with less overlap over the entire region where the base sequence is to be determined. is important. By building a system that automates these two selection steps into a computer, it is possible to dramatically reduce the labor and time required for base sequence determination.
[0043]
Further, even when a plurality of amplified fragments are observed in the analysis of the amplification product, one kind of amplified fragment, for example, the fragment with the largest amplification amount is isolated by a known method and used for sequencing. Can also be provided.
[0044]
In addition, when a PCR reaction is performed using all the primers in the primer pool and a primer specific to a known sequence, a band having a size amplified by primers specific to all PCR reactions may appear. Since this amplified fragment does not contain a tag sequence, the base sequence can be determined even if it is contained as a background in the target amplified fragment. However, amplification with the above-mentioned specific primers reduces the amplification efficiency of the target nucleic acid, so it is preferable to design a primer sequence that does not cause such amplification. Although not particularly limited, it is generally preferable that the 3 ′ end of the primer is AT-rich, although it varies depending on the template sequence.
[0045]
The primer pool used in the method of the present invention is a pool containing the above primers. PCR can be performed individually using a combination of all of these primers and a primer specific for a known sequence in the template nucleic acid.
[0046]
Furthermore, the present invention provides a kit for carrying out the method for determining the base sequence of the gap region using the aforementioned primer pool. In one embodiment, the kit is characterized in that it includes, in a packaged form, specifications of the primer pool of the present invention and instructions for a PCR method using the pool. Furthermore, the primer pool of the present invention, a DNA polymerase and a kit containing the polymerase buffer can be suitably used for the method of the present invention. In addition, the primer pool of the present invention, a commercially available DNA polymerase and a PCR reagent may be selected and used according to the instructions. Furthermore, a reagent for reverse transcription reaction when the template is RNA may be included. The DNA polymerase can be selected from the DNA polymerases described above. The PCR reagent may be a commercially available PCR reagent, or the buffers described in the examples. Furthermore, a base sequence determination reagent such as a sequencing primer or sequencing polymerase may be included.
[0047]
In the present specification, the instructions describing the method of the present invention refer to the method of the present invention by providing information on how to use the kit, recommended primer pool specifications, recommended reaction conditions, etc. to a third party. This refers to what is provided, and includes printed matter that describes the contents, such as brochures or instruction manuals in the form of leaflets, as well as labels attached to kits, packages that contain kits, and the like. Furthermore, information disclosed and provided through an electronic medium such as the Internet is also included.
[0048]
The amplified fragment obtained in the nucleic acid amplification step of the method of the present invention may be subjected to direct sequencing as it is after being appropriately purified to a level that does not inhibit the sequencing reaction except for dNTP or the like. After cloning into an appropriate sequencing vector to prepare a plasmid or phage DNA, it may be subjected to a sequencing reaction. When determining the base sequence of the amplified fragment by direct sequencing, agarose electrophoresis or the like is performed in advance, and a reaction solution in which a single amplification product (not a plurality) is generated in the reaction solution is selected. Thus, the yield of sequencing can be increased. Of course, it can be said that all the reaction solutions are applied to the sequencer without such selection, and only the sequence data with high quality is selected at the stage of output from the sequencer.
[0049]
When determining the base sequence from the region where the sequence has already been determined toward the region where the sequence is unknown, the reaction solution is mixed and the sequence having a sequence complementary to the sequence near the end of the region where the sequence has been determined is unknown A region-oriented primer can be used to sequence in that direction. In addition, Semi-Nested PCR was performed using two types of primers having sequences complementary to the sequence near the end only in the region where the sequence was already determined, and the nucleotide sequence of the obtained amplification product was determined in the same manner as above You may analyze. In this case, it can be expected that in the sequencing from the region where the sequence has already been determined to the region where the sequence is unknown, higher quality data can be obtained than when a normal PCR product is used.
[0050]
When the amplified fragment is once cloned into an appropriate sequencing vector, it is not necessary to select in advance a reaction solution in which a single amplification product (not a plurality) is generated in the reaction solution. In addition, the amplified fragment obtained by Semi-Nested PCR may be cloned, and in this case, the accuracy with which a fragment containing the target gap region can be amplified is higher than when a normal PCR amplification product is used, Accordingly, the target gap region can be sequenced. The cloning is not necessarily obtained by combining a primer selected from a primer pool consisting of a plurality of primers having a specific base sequence and a primer having a sequence complementary to the sequence near the end of the already sequenced region. There is no need to do this for each PCR amplification product produced. Amplification products obtained using different combinations of primer pairs may be mixed and cloned into a sequencing vector to obtain clones. In this way, it becomes possible to obtain a clone library selective to the gap region, and by using the obtained clone for sequencing at the final stage of shotgun sequencing, it is possible to accelerate the gap closure. it can. It is also possible to clone the amplified fragment into the vector after randomly inserting the transposon sequence into the amplified fragment in a cell-free system. In this way, since the number of primer sequences in the clone that is the starting point for sequencing increases, the redundancy of sequencing can be increased.
[0051]
As described above, by using the present invention, it is suitable for a high-throughput system, and it is possible to determine a sequence after performing a shotgun sequence on a large region such as a genome sequence to determine most of its base sequence. The gap region that could not be prepared can be efficiently determined without preparing a large amount of DNA and without being restricted because the DNA is modified.
[0052]
【Example】
The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the scope of the following examples.
[0053]
Example 1
The analysis of the genome sequence of E. coli using the method of the present invention in the gap region model system was examined. First, ESP-1 and ESP-2 primers for Escherichia coli genome amplification described in SEQ ID Nos. 1 and 2 in the sequence listing were synthesized using a DNA synthesizer. When PCR reaction is performed using the primer pair and Escherichia coli genomic DNA as a template, an amplified fragment of 2 kbp is obtained. Assuming this region as a gap region, PCR was carried out using a combination of each of the ESP-1 and ESP-2 primers and each of the 92 primers of the primer pool I described in Table 1.
[0054]
[Table 1]

[0055]
The primer pool I has GGCACGATTCGATAAC as a tag sequence,
Formula (I)
5'-tag sequence-G-NN-SSSSSSS-3 '
(N: G, A, T, C mix, S: G or A or a specific base sequence selected from T or C.)
It is a primer pool represented by. In addition, the pool has a specific base sequence of 7 nucleotides at the 3 ′ end of the primer, 4 ⁷ = A primer pool having specific 92 types of base sequences selected in consideration of the Tm value, the secondary structure of the primer, and the possibility of forming primer dimers from combinations of 16384 base sequences.
[0056]
Similarly, PCR was carried out using a combination of each of the above ESP-1 and ESP-2 primers and each of the 94 primers of the primer pool II described in Table 2.
[0057]
[Table 2]

[0058]
The primer pool II has GGCACGATTCGATAAC as a tag sequence and has the general formula (II)
5'-tag sequence-G-NN-G-SSSSSS-3 '
(N: Mix of G, A, T, C, S: Specific base sequence selected from G or A or T or C.)
It is a primer pool represented by. In addition, the pool has a specific nucleotide sequence of 6 nucleotides at the 3 ′ end of the primer, 4 ⁶ = A primer pool having 94 specific base sequences selected from 4096 combinations of base sequences in consideration of the Tm value, the secondary structure of the primer, and the possibility of primer dimer formation.
[0059]
The PCR reaction solution composition is shown below. That is, Takara ExTaq DNA polymerase buffer (Takara Shuzo), each 200 μM dNTP mixture, 10 ng E. coli JM109 genome (Takara Shuzo), 5 pmol primer, 0.25 unit Takara ExTaq DNA polymerase (Takara Shuzo) 10 μl of a reaction solution containing was prepared. This reaction solution was subjected to 30 cycles of PCR using TaKaRa Thermal Cycler GP (Takara Shuzo Co., Ltd.) at 98 ° C. for 1 second, 38 ° C. for 1 second, 72 ° C. for 3 minutes, and then 1 μl of the reaction solution was added. The sample was subjected to 1% agarose electrophoresis, and the reaction product was confirmed by ethidium bromide staining. After confirmation, 92 or 94 reaction solutions were combined into one, and the reaction product was recovered by isopropanol precipitation.
[0060]
The collected reaction product was suspended again in 30 μl of sterile distilled water, 5 μl of which was blunt-ended and phosphorylated at the 5 ′ end using TaKaRa BKL Kit (Takara Shuzo). The reaction mixture thus prepared was combined with the pUC118 HincII / BAP vector (Takara Shuzo) and DNA Ligation Kit ver. Ligation reaction was performed using 2 (Takara Shuzo), and competent cell DH5α (Takara Shuzo) was transformed with the reaction solution. After transformation, 24 Escherichia coli having a plasmid into which a foreign gene was inserted due to alpha complementation of LacZ was randomly picked up from each of the primer sets, and each was cultured in a liquid medium to prepare a plasmid. The obtained plasmid was determined according to a conventional method using Mega Base 1000 for the base sequence from both directions using primers on pUC118.
[0061]
Next, the obtained sequence information was analyzed using DNASIS software (Takara Shuzo Co., Ltd.), and the base sequence of the E. coli genome 2 kbp sandwiched between ESP-1 and ESP-2 was determined. This sequence is referred to as GenBank accession No. When compared with the sequence described in D10483, they matched. From the above, it was suggested that the method of the present invention is useful as a method for analyzing the base sequence of the gap region.
[0062]
【The invention's effect】
According to the present invention, it is suitable for a high-throughput system, and after performing a shotgun sequence on a wide region such as a genome sequence and determining most of its base sequence, the gap region where the sequence could not be determined, Nucleic acid base sequence determination method capable of efficiently determining the sequence without preparing a large amount of DNA and without restriction due to DNA modification, primer pool for the method, and the method Kits are provided.
[0063]
Sequence listing free text
SEQ ID NO: 1: Designed oligonucleotide primer designated as ESP-1 to amplify a portion of Escherichia coli.
SEQ ID NO: 2: Designed oligonucleotide primer designated as ESP-2 to amplify a portion of Escherichia coli.
[0064]
[Sequence Listing]
SEQUENCE LISTING
<110> Takara Shuzo Co., Ltd.
<120> The nucleotide sequence determination method of nucleic acids
<130> T-1739
<160> 2
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide primer designated as ESP-1 to amplify a portion of Escherichia coli.
<400> 1
gagccagaca tgaagctgat acgcggcata cataa 35
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide primer designated as ESP-2 to amplify a portion of Escherichia coli.
<400> 2
tccaggccgt atttctgacc gatcacatag tcgtc 35

Claims

A method for determining a base sequence of a region whose base sequence is unknown in order to link regions having a known base sequence in a nucleic acid,
(1) A step of amplifying a template nucleic acid in the presence of each of at least two primers having a tag sequence, a primer specific for the template nucleic acid and a DNA polymerase, wherein the primer having the tag sequence is the 5 ′ end of the primer A tag sequence on the side and a specific base sequence of 3 nucleotides or more on the 3 ′ end side; a primer specific for the template nucleic acid is a primer that can be annealed to a region where the base sequence is known And (2) sequencing the amplified fragment obtained in step (1) above;
A method for determining the base sequence of a nucleic acid, comprising:

A primer pool that can be used in a method for determining the base sequence of a region whose base sequence is unknown in order to link regions having a known base sequence in a nucleic acid, the primer pool comprising at least two primers having a tag sequence And a primer having the tag sequence has a tag sequence on the 5 ′ end side, a specific base sequence of 3 nucleotides or more on the 3 ′ end side, and a base sequence determination method for the region of unknown base sequence ,
(1) A step of amplifying a template nucleic acid in the presence of each of at least two primers having a tag sequence, a primer specific for the template nucleic acid and a DNA polymerase, wherein the primer having the tag sequence is the 5 ′ end of the primer A tag sequence on the side and a specific base sequence of 3 nucleotides or more on the 3 ′ end side; a primer specific for the template nucleic acid is a primer that can be annealed to a region where the base sequence is known And (2) sequencing the amplified fragment obtained in step (1) above;
A primer pool characterized by comprising:

A nucleic acid base sequence determination kit comprising a primer pool that can be used in a method for determining a base sequence of a region whose base sequence is unknown in order to link regions having a known base sequence in a nucleic acid, The primer pool contains at least two primers having a tag sequence. The primer having the tag sequence has a tag sequence on the 5 ′ end side and a specific base sequence of 3 nucleotides or more on the 3 ′ end side. A method for determining the base sequence of the nucleic acid,
(1) A step of amplifying a template nucleic acid in the presence of each of at least two primers having a tag sequence, a primer specific for the template nucleic acid and a DNA polymerase, wherein the primer having the tag sequence is the 5 ′ end of the primer A tag sequence on the side and a specific base sequence of 3 nucleotides or more on the 3 ′ end side; a primer specific for the template nucleic acid is a primer that can be annealed to a region where the base sequence is known And (2) sequencing the amplified fragment obtained in step (1) above;
A kit for determining a nucleotide sequence of a nucleic acid, comprising: